Vergleichende tierexperimentelle Studie zur ossären
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Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie des Universitätsklinikums Erlangen Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam Vergleichende tierexperimentelle Studie zur ossären Einheilung oberflächenmodifizierter Implantate im diabetischen Schwein Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae dentariae der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Christian Seidl geb. am 21.07.1985 in Passau Erlangen, November 2011 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2011 Meiner Mutter, meinem verstorbenen Vater und meinem Bruder in aller Liebe und Dankbarkeit gewidmet. Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG / ABSTRACT .............................................................................................. 3 1.1 1.1.1 Hintergrund und Ziele ..................................................................................................... 3 1.1.2 Material und Methode.................................................................................................... 3 1.1.3 Ergebnisse ...................................................................................................................... 3 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen ........................................................................................ 4 1.2 2 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................... 3 ABSTRACT ................................................................................................................................... 5 1.2.1 Background and objective............................................................................................... 5 1.2.2 Material and methods .................................................................................................... 5 1.2.3 Results ............................................................................................................................ 5 1.2.4 Conclusion ...................................................................................................................... 6 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 7 2.1 HINTERGRUND ............................................................................................................................. 7 2.2 IMPLANTATEINHEILUNG ................................................................................................................. 9 2.2.1 Kollagen I...................................................................................................................... 10 2.2.2 Osteocalcin ................................................................................................................... 11 3 ZIELE DER STUDIE ....................................................................................................................... 14 4 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................................... 15 4.1 WAHL DER VERSUCHSTIERE........................................................................................................... 15 4.2 ANZAHL DER VORGESEHENEN TIERE ................................................................................................ 15 4.3 BILDUNG DER VERSUCHSGRUPPEN UND ZEITLICHER ABLAUF ................................................................. 16 4.4 VORSTELLUNG DER IMPLANTATSYSTEME .......................................................................................... 18 4.5 ART, DURCHFÜHRUNG UND DAUER DER EINGRIFFE ............................................................................ 18 4.5.1 Induktion des experimentellen Diabetes ....................................................................... 18 4.5.2 Ablauf des operativen Eingriffes ................................................................................... 19 4.5.3 Sektion und Entnahme der Knochenproben .................................................................. 20 4.6 AUFBEREITUNG DER KNOCHENPROBEN ............................................................................................ 21 4.7 MIKRORADIOGRAPHIE ................................................................................................................. 22 4.7.1 Herstellung der Mikroradiographien ............................................................................. 22 4.7.2 Auswertung der Mikroradiographien ............................................................................ 23 4.8 IMMUNHISTOCHEMIE .................................................................................................................. 25 4.8.1 Anfertigung der Mikrotomschnitte ............................................................................... 25 4.8.2 Labeled Streptavidin Biotin Methode ............................................................................ 26 4.8.3 Auswertung der immunhistologischen Schnitte............................................................. 28 4.9 5 STATISTIK ................................................................................................................................. 29 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 30 5.1 MIKRORADIOGRAPHIE ................................................................................................................. 30 5.1.1 Schädelkalotten ............................................................................................................ 30 5.1.2 Unterkiefer ................................................................................................................... 31 5.2 IMMUNHISTOLOGIE ..................................................................................................................... 33 5.2.1 5.2.1.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage ......................................................................... 33 5.2.1.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage ......................................................................... 34 5.2.1.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich .......................................................................................... 35 5.2.2 5.3 Kollagen I...................................................................................................................... 33 Osteocalcin ................................................................................................................... 36 5.2.2.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage ......................................................................... 36 5.2.2.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage ......................................................................... 37 5.2.2.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich .......................................................................................... 38 WERTETABELLE .......................................................................................................................... 39 6 DISKUSSION ............................................................................................................................... 40 7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................ 51 8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... 73 9 ANHANG .................................................................................................................................... 74 10 DANKSAGUNG ........................................................................................................................... 76 11 LEBENSLAUF............................................................................................................................... 77 3 1 Zusammenfassung / Abstract 1.1 1.1.1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Diabetes mellitus wird momentan als relative Kontraindikation für die Insertion dentaler Implantate angesehen, da beim Diabetiker im Vergleich zum gesunden Kollektiv höhere Verlustraten beobachtet werden. Ziel dieser Studie war es, die periimplantäre Knochenbildung anhand eines etablierten diabetischen Tiermodelles am Hausschwein zu untersuchen und die Auswirkungen oberflächenmodifizierter Implantate (SLActive®) auf die Osseointegration zu eruieren. 1.1.2 Material und Methode 15 Hauschweinen (11 diabetische Tiere und 4 gesunde Kontrolltiere) wurden oberflächenmodifizierte (SLActive®) und konventionelle (SLA®) Implantate in die Schädelkalotte und den Unterkiefer gesetzt. 30 und 90 Tage nach der Implantatinsertion wurde die periimplantäre Knochenmineralisation durch die Anfertigung von Mikroradiografien und die Expression von Kollagen I und Osteocalcin durch immunhistochemische Nachweisverfahren bestimmt. 1.1.3 Ergebnisse Die quantitative Evaluierung der Hartgewebe zeigte pathologische Veränderungen. Die periimplantäre Knochenmineralisationsrate der Schädelkalotten und Unterkiefer der diabetischen Versuchstiere war im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nach 30 und 90 Tagen verringert. Die SLActive ®Implantate zeigten im Vergleich zu den SLA®-Implantaten eine signifikant höhere periimplantäre Knochenmineralisationsrate in der Kalotte, wohingegen kein Unterschied bei den Unterkieferpräparaten beobachtet werden konnte. Die 4 Kollagen I-Expression war in der diabetischen Gruppe nach 30 und 90 Tagen erhöht, während die Osteocalcin-Expression im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe zu beiden Zeitpunkten erniedrigt war. 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen Im vorliegenden Modell führt Diabetes mellitus zu einer Abnahme der periimplantären Knochenmineralisation und beeinflusst die Expression ossärer Matrixproteine. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte Oberfläche (SLActive®) zu einer verbesserten Implantateinheilung bei den diabetischen Tieren führt. Die Oberflächenmodifizierung dentaler Implantate stellt damit einen vielversprechenden Ansatz dar, Heilungsvorgänge im kompromittierten Knochen zu verbessern. 5 1.2 1.2.1 Abstract Background and objective Diabetes mellitus is currently classified as a relative contraindication for implant treatment, due to higher failure rates which have been seen in diabetic patients compared to the general population. Aim of this study was to investigate periimplant bone formation in a diabetic animal model and to evaluate the effects of surface-modified implants (SLActive®) on the osseointegration. 1.2.2 Material and methods In 15 domestic pigs (11 diabetic and 4 healthy controls) surface-modified (SLActive®) and conventional (SLA®) implants were placed in the calvaria and lower jaw. 30 and 90 days after implant placement the peri-implant bone mineralization rate (BMR) and the expression of collagen type-I and osteocalcin were evaluated by microradiography and immunhistochemistry. 1.2.3 Results Quantitative evaluation of the hard tissue revealed pathological changes. BMR in the calvaria and lower jaw was reduced in the diabetic group after 30 and 90 days. SLActive®-implants showed a significant higher BMR in the calvaria compared to the SLA®-implants, whereas no difference could be observed in the lower jaw. Collagen type-I protein expression was higher in the diabetic group after 30 and 90 days, while protein expression of osteocalcin was reduced in the diabetic group at both time points. 6 1.2.4 Conclusion In this model Diabetes mellitus leads to a decreased peri-implant bone mineralisation and influences the expression of osseous matrix proteins. A modified surface (SLActive®) improves the implant healing in diabetic animals. The surface modification of dental implants displays an auspicious approach to enhance the healing processes in a compromised bone. 7 2 2.1 Einleitung Hintergrund Weltweit sind knapp 250 Millionen Menschen an Diabetes mellitus erkrankt. Schätzungen zu Folge wird sich die Zahl der Erkrankten in den nächsten 15 Jahren um mehr als die Hälfte erhöhen. Allein in Deutschland ist nach Angaben der International Diabetes Federation von ca. 7,5 Millionen Diabetikern auszugehen, wobei die Dunkelziffer undiagnostizierter Erkrankter auf bis zu 50% geschätzt wird. [40, 95, 129] Diabetes mellitus stellt damit die häufigste endokrine Stoffwechselerkrankung in Deutschland dar. Die hohe und weiter steigende Prävalenz lässt dieses Krankheitsbild zunehmend in den Fokus der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie rücken. Hier haben sich seit einigen Jahren dentale Implantate als effektive Methode zur Versorgung von teil- und unbezahnten Patienten etabliert [2, 97]. Diese weisen neben einem breitem Indikationsspektrum auch ein hohes Maß an Langzeitstabilität auf [32, 58]. Klinische Studien zeigen zwar, dass Implantate bei Diabetikern erfolgreich gesetzt werden können [7, 39, 56, 113], die Verlustrate im Vergleich zum gesunden Patienten aber erhöht ist [101, 113]. Morris et al. beobachteten in einem Dreijahreszeitraum eine etwas geringere Überlebensrate beim Typ 2-Diabetiker (7,8 % Implantatverluste im Vergleich zu 6,8 % bei der stoffwechselgesunden Kontrollgruppe) [101]. Die Fünfjahres-Überlebensrate bei Typ 2-Diabetikern beträgt 90% [113]. Diabetes wird daher als relative Kontraindikation für die Insertion von Implantaten angesehen [39, 73] und schränkt damit gerade bei den Patienten die Behandlungsmöglichkeiten ein, die aufgrund ihres Krankheitsbildes a priori eine höhere Inzidenz für Parodontopathien und Zahnverlust aufweisen [152]. In der Vergangenheit wurden zwar Tierversuchsstudien durchgeführt, die den Einfluss eines experimentell induzierten Diabetes auf die Osseointegration von Implantaten untersuchten, jedoch sind deren Ergebnisse und Schlussfolgerungen diskrepant. So beobachteten sowohl Deeb et al. [37] als auch Giglio et al. [50] eine Zunahme an Knochenvolumen im periimplantären Bereich diabetischer Ratten, wohingegen andere Forschungsgruppen eine Verringerung des 8 Knochenvolumens und einen niedrigeren Knochen-Implantat-Kontakt nachweisen konnten [70, 108, 114, 146]. Eine Studie an Kaninchen kam dagegen zu dem Ergebnis, dass der Diabetes keinen signifikanten Einfluss auf die Wundheilung des Weichgewebes und das Knochen-Implantat-Interface hat [48]. Die Diskrepanz der Ergebnisse mag sich durch die Tatsache erklären, dass diese Studien zwei grundlegende Probleme nicht berücksichtigt haben: Zum einen ist die Übertragbarkeit tierexperimenteller Ergebnisse auf den Menschen nur dann gewährleistet, wenn das Versuchstier in seinen morphologischen und physiologischen Charakteristika dem Menschen möglichst nahe kommt. Obwohl die Ratte in der Diabetesforschung das häufigste Versuchtier darstellt, weist sie im Vergleich zum menschlichen Organismus doch größere Unterschiede, u.a. im Knochenaufbau und im Knochenstoffwechsel, auf [111]. Das Schwein hingegen zeigt in den knochenspezifischen Parametern eine hohe Analogie zum humanen Stoffwechsel [65, 82]. Unsere Studie basiert daher auf einem von Wilmowsky et al. etablierten diabetischen Tiermodell am Hausschwein [163]. Das zweite grundsätzliche Problem liegt in dem kurzen Zeitfenster zwischen der experimentellen Diabetes-Induktion und der Implantatinsertion. In früheren Studien wurden die Implantate einige Tage bis Wochen nach der StreptozotocinGabe gesetzt [37, 48, 50]. Wie unsere eigenen Ergebnisse aber zeigen konnten, dauert es 6-12 Monate bis sich signifikante pathologische Veränderungen der Hartgewebe und Gefäße einstellen [88, 163]. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde in der vorliegenden Studie ein Zeitrahmen von 15 Monaten von der DiabetesInduktion bis zur Implantatinsertion gewählt, um sicher zu gehen, dass sich pathologische Veränderungen manifestiert hatten. Wie schon erwähnt ist die Verlustrate dentaler Implantate beim Diabetiker im Vergleich zum stoffwechselgesunden Kollektiv erhöht [101]. Wissenschaftlich belegt ist, dass Modifikationen des Implantatdesigns und der –oberfläche zu einer verbesserten Osseointegration und damit zu einer höheren Erfolgsrate beim gesunden Patienten führen [100, 112, 144, 149]. Der Erfolg moderner Implantatsysteme basiert dabei auf der Entwicklung einer Implantatoberfläche, welche die Bildung eines direkten Knochen-Implantat-Verbundes begünstigt [53, 55, 77, 100, 156, 162]. Um die Verbindung zwischen Implantat und Knochen zu optimieren, werden die Implantate auf viele Arten modifiziert: (Mikro-) 9 Maschinierung, Titan-Plasma-Beschichtung, Bestrahlung mit verschiedenen Molekülen unter Druck, chemische und elektrochemische Ätzung, Bestrahlung in Kombination mit Ätzung, elektrochemische Anodisierung oder pulsierende Abtragung mit einem Laser [25, 78, 117, 135, 158, 165, 175]. Die Auswirkungen dieser Oberflächenmodifikationen auf die Osseointegration dentaler Implantate beim diabetischen Patienten sind weitestgehend unerforscht. Hier setzt der zweite Grundgedanke unserer Studie an: Welchen Effekt hat eine modifizierte Oberfläche auf die Implantateinheilung und den periimplantären Knochenstoffwechsel bei einem diabetisch kompromittierten Knochen? 2.2 Implantateinheilung Das Setzen eines Implantates in den Knochen ist mit einem unvermeidbaren lokalen Knochentrauma verbunden [24]. Der anschließende Prozess der Implantateinheilung kann vereinfacht in folgende Schritte unterteilt werden [107]: Bildung eines Blutkoagulums mit lokaler Hypoxie und der Entstehung eines sauren Milieus Knochenresorption durch Osteoklasten Neovaskularisation Migration und Proliferation von Osteoprogenitorzellen Differenzierung zu Osteoblasten Osteoid-/Knochenmatrixbildung Mineralisation des Knochenmatrix Der Prozess der Knochenheilung wird dabei von einer Vielzahl an Faktoren wie etwa Hormonen, Zytokinen oder Wachstumsfaktoren beeinflusst und gesteuert. Obwohl der genaue Ablauf der ossären Heilung immer noch wenig verstanden ist, hat es in den letzten Jahren doch große Fortschritte gegeben, spezifische ossäre Marker zu identifizieren und in den zeitlichen Verlauf der Knochenentwicklung einzuordnen [116, 140, 147]. Hier haben sich insbesondere Knochenmatrixproteine als zuverlässige und gut nachweisbare Marker etabliert. Diese sind substanziell an Knochenregenerations- und -umbauprozessen beteiligt. Deren quantitativer Nachweis lässt somit Rückschlüsse auf ablaufende 10 Knochenstoffwechselprozesse zu. Im Rahmen dieser Studie wurden dabei zwei Proteine gewählt, die ihr Expressionsmaximum zu unterschiedlichen Zeitpunkten haben: Kollagen I, das zu Beginn der de novo Knochenformation exprimiert wird und Osteocalcin als Vertreter der Mineralisationsphase. Die Struktur und Bedeutung der beiden Proteine soll im folgenden Abschnitt dargestellt werden. 2.2.1 Kollagen I Die extrazelluläre Matrix (EZM) von Bindegeweben zeichnet sich durch eine komplexe Anordnung verschiedener Proteine aus und ist für die strukturelle Integrität und physiologische Funktion von Geweben unerlässlich. Die häufigsten Proteine der EZM sind die Kollagene. Das gemeinsame Strukturmerkmal aller Kollagene ist die Ausbildung einer charakteristischen Tripelhelix aus drei Polypeptidketten. Bis heute sind 26 verschiedene Kollagene identifiziert worden [47]. Kollagen I, das zur Gruppe der Fibrillen-bildenden Kollagene gehört, findet sich in nahezu allen Bindegewebsformen (Knochen, Haut, Sehnen, Bänder, Skleren, Gefäße) mit Ausnahme des hyalinen Knorpels [47, 160]. Im Knochen stellt es mit einem Anteil an der organischen Matrix von ca. 95% das quantitativ wichtigste Protein dar [41]. Das Typ-1-Kollagen ist ein Heterotrimer aus drei Polypeptidketten (zwei α1Ketten und eine α2-Kette). Die drei α-Ketten bilden für sich jeweils eine linksgängige Helix (Tropokollagen) aus; drei solcher linksgängiger Helices winden sich umeinander zu einer rechtsgängigen Tripel-Helix. Um diese Anordnung in eine Tripelhelix zu ermöglichen, besitzen Kollagenprotomere eine spezielle Primärstruktur. Die charakteristische Aminosäureabfolge der α-Ketten besteht aus einer sich monoton wiederholenden Triplet-Sequenz Gly-X-Y, wobei X und Y häufig für Prolin und Hydroxyprolin stehen. [83] Die Biosynthese der Kollagenfibrillen beginnt im rauen endoplasmatischen Retikulum (ER) der Osteoblasten. Hier wird das Vorläufermolekül Prokollagen gebildet, welches am N- und C-Terminus je ein Propeptid enthält. Das Prokollagen wird dann im ER und Golgi-Apparat durch Hydroxylierungen und 11 Glykosylierungen modifiziert. Nach der anschließenden Zusammenlagerung von drei α-Ketten zu einer Tripelhelix wird das Kollagenmonomer in den Extrazellularraum sezerniert. Hier werden die Propeptide abgespalten, wodurch Tropokollagen entsteht. Diese Tropokollagenmoleküle lagern sich nun zu Fibrillen zusammen und werden über Schiff´sche Basen quervernetzt. [47] Die Bildung von Knochen beginnt mit der Synthese und Anordnung eines Kollagengerüstes, welches hauptsächlich aus Kollagen I-Fasern besteht und ca. 10 Tage dauert [41]. Diese richten sich nach dem Wolff´schen Gesetz dabei entlang biomechanischer Kraftlinien aus [41]. Im Anschluss wird das Osteoid mineralisiert, indem sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der Kollagenfasern, die als Kristallisationszentrum dienen, anordnen [166]. Der Mineralisationsvorgang nimmt ca. zwei bis drei Monate in Anspruch [41]. Die Hauptfunktion des Kollagen I im Knochen besteht also in der Ausbildung einer geordneten Leitstruktur für die anschließende Mineralisation. Die Organisation und Struktur der Fibrillen limitiert zudem die Größe der Mineralisationskristalle und hat einen Einfluss auf deren Orientierung [160]. Interessanterweise konnten mehrere Studien zeigen, dass die Bruchfestigkeit bzw. Frakturresistenz zum großen Teil von der Kollagenmatrix beeinflusst wird [15, 164], wohingegen die Knochenhärte hauptsächlich vom Grad der Mineralisation abhängt [29-30]. Entgegen der früheren Meinung, dass Kollagen I auch die Mineralablagerung initiieren würde [96], weiß man heute, dass diese Aufgabe den nicht-kollagenen Proteinen (Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin etc.) zuzurechnen ist [13, 153]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kollagen I das Grundgerüst des sich neubildenden Knochens stellt und als wichtiger Marker der frühen Knochenentwicklung dient. 2.2.2 Osteocalcin Mitte der 1970er Jahre haben zwei Forschungsgruppen unabhängig voneinander ein neues Protein im Knochen entdeckt, welches reich an γ-Carboxyglutamat ist. Die komplette Primärstruktur des bovinen „γ-carboxyglutamic acid-containing 12 protein from bone“ wurde von denselben Autoren im Jahr 1976 veröffentlicht und später abgekürzt zu bone-GLA-protein (BGP) oder Osteocalcin (OC) [61, 124125]. Schon zum Zeitpunkt seiner Entdeckung wusste man, dass γCarboxglutamat essentiell für die Bindung von Prothrombin an Ca2+-Ionen ist und man vermutete, dass das neu entdeckte Osteocalcin eine wichtige Rolle im Stoffwechsel von mineralisierten Geweben spielt [106]. Das humane Gen, das für Osteocalcin codiert, wurde 1986 identifiziert und befindet sich auf dem distalen Arm von Chromosom 1 (1q25-q31) [127]. In den folgenden Jahren wurde das Protein aus verschiedenen Tieren wie dem Schwein [67], der Maus [33] , der Ziege [67], dem Hund [27] oder dem Frosch [23] isoliert und zeigt große Ähnlichkeiten im Vergleich zum humanen BGP. Die Primärstruktur des OC ist unter diesen Tieren v.a. in der zentralen γCarboxyglutamat-Domäne hochgradig konserviert [64, 66, 155]. Die evulotorische Konservierung zeigt sich darin, dass jedes Vertebraten-OC die Fähigkeit besitzt Ca2+-Ionen zu binden. Osteocalcin wird hauptsächlich von reifen Osteoblasten [69, 76] und zum Teil auch von Osteozyten [1], hypertrophen Chondrozyten [86], Zementoblasten [19] und Odontoblasten [52] gebildet. Ein Großteil des neu synthetisierten Proteins wird in die extrazelluläre Knochenmatrix inkorporiert, eine kleine Fraktion geht in die Zirkulation über und kann daher mit Immunoassays nachgewiesen werden [145]. Es gibt zudem Hinweise, dass auch nicht-osseoide Gewebe wie z.B. das Gehirn [76] oder Blutplättchen [154] OC sezernieren, wenngleich man aber anmerken muss, dass die Expressionsraten mehrere Größenordnungen unter denen der Knochenzellen liegen und BGP deshalb als Knochen-spezifisches Protein gilt [44]. Osteocalcin wird nicht während früher Stufen der Osteoblastenentwicklung gebildet, sondern ist ein Marker der späten, reifen Osteoblasten [11]. OC wird speziell in mineralisierter Knochenmatrix gefunden und nicht in neu geformtem, nichtmineralisiertem Osteoid [94]. Es ließ sich zudem eine positive Korrelation zwischen OC-Expression und dem Grad der Mineralisation zeigen [133]. BGP erscheint in calcifizierenden Geweben ca. zwei Wochen nach Mineralablagerung etwa zur der Zeit, in der die Mineralien zu Hydroxylapatit reifen [123]. OC ist dabei v.a. im Bereich der Mineralisationsfront lokalisiert [74, 105]. In vitro 13 Untersuchungen bestätigen die Tatsache, dass BGP zu Beginn der Mineralisation induziert wird, deutlich nach der Expression früher osteoblastischer Marker wie dem Kollagen I oder der Alkalischen Phosphatase [115]. Das hohe Vorkommen in der mineralisierten Knochenmatrix - es ist das häufigste nicht-kollagene Knochenmatrixprotein [75] - und die hoch konservierte Aminosäuresequenz lassen auf die Wichtigkeit des Proteins für den Knochenstoffwechsel schließen. Umso erstaunlicher ist es, dass die biologische Funktion noch immer unklar ist. Evident ist, dass Osteocalcin mit hoher Affinität über die γ-Carboxyglutamat-Seitenketten Hydroxylapatit bindet [120, 125]. In vitro ist nachgewiesen, dass Osteocalcin das Wachstum und die Formation von Hydroxylapatitkristallen inhibiert [14, 132]. Eine Experimentelle Studie an mit Warfarin (Vitamin K-Antagonist) vergifteten Ratten zeigte, dass es in Abwesenheit von OC zu einer überschießenden Mineralisation im Bereich der Epiphysenfuge kam [126]. Demnach könnte die Funktion darin liegen, eine überschießende Mineralisation des Knochens durch eine Verzögerung des Kristallisationsprozesses zu verhindern. Ducy et al. hingegen kam zu dem Schluss, dass Osteocalcin die Knochenformation limitiere, aber keinen inhibierenden Effekt auf die Knochenmineralisierung habe [35]. OC weist auch einen chemotaktischen Einfluss auf Osteoklasten auf, wobei aber die Auswirkungen auf knochenresorptive Prozesse weitgehend unverstanden sind [103]. So fand sich bei Knockout-Mäusen zwar eine erhöhte Zahl von Osteoklasten, aber keine gesteigerte Knochenresorption [35]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Osteocalcin eine wichtige Rolle bei der Regulation der Knochenmineralisation und -formation spielt und als wichtiger Marker der Osteoblastenaktivität und der späten Knochenreifung dient [26]. 14 3 Ziele der Studie Ziele dieser tierexperimentellen Studie waren: 1.) Die Gewinnung quantitativer Daten zur Einheilung dentaler Implantate im diabetischen Schwein unter besonderer Berücksichtigung der Knochenmineralisation und der Expression von Knochenmatrixproteinen (Kollagen I, Osteocalcin). 2.) Der Vergleich der Implantateinheilung zwischen diabetischen und stoffwechselgesunden Versuchstieren. 3.) Der Vergleich zweier unterschiedlicher Implantatoberflächen (SLA® und SLActive®, Straumann AG, Basel, Schweiz) und deren Einfluss auf die Implantateinheilung und den periimplantären Knochenstoffwechsel bei einer diabetischen Stoffwechsellage. 15 4 Material und Methoden 4.1 Wahl der Versuchstiere Als Versuchstier wurde das Hausschwein gewählt, da dessen anatomische, morphologische und physiologische Charakteristika eng mit denen des Menschen korrelieren. Gerade im Hinblick auf die Ähnlichkeiten im Knochenstoffwechsel gilt das Schwein als etabliertes und verlässliches Modell, welches die Übertragung experimentell gewonnener Daten auf den menschlichen Organismus erlaubt [65, 138, 167]. So ist die Knochenneubildungsrate mit 1,2 - 1,5 µm/Tag nur geringfügig höher als die des Menschen mit 0,8 – 1,0 µm/Tag [82]. Ebenso finden sich Gemeinsamkeiten im Aufbau des trabekulären Knochens [8]. Gewebedurchblutung, Frakturheilung und Heilungszeit sind mit den Vorgängen im menschlichen Organismus vergleichbar. In unserer Studie spielte speziell die Antwort des Organismus auf die Induktion des Diabetes eine entscheidende Rolle. So lassen sich beim Schwein einige Analogien zum Menschen aufzeigen wie eine ähnliche Pharmakokinetik nach Medikamentenverabreichung und eine vergleichbare gastrointestinale Funktion und Pankreasmorphologie [10, 85]. Es entwickeln sich Artherosklerosen in anatomisch relevanten Regionen wie der Aorta oder den Koronargefäßen und zeigen dabei die gleichen histopathologischen Veränderungen (Akkumulation von Plaque, Schaumzellen, Makrophagen, Lymphozyten etc.) wie beim Menschen [18, 49, 109, 121-122]. Darüber hinaus hat sich das Schwein mit Streptozotozin-induziertem Diabetes in verschiedenen tierexperimentellen Studien zu kardiovaskulären, renalen und opthalmologischen Fragestellungen durchgesetzt [5, 49, 54, 88, 104, 150, 173]. 4.2 Anzahl der vorgesehenen Tiere In die Studie wurden nach Genehmigung des Tierversuches (Genehmigungsnr. 54-2531-25/07) durch die zuständige Tierversuchskommision der Regierung von Mittelfranken, Ansbach, 15 Tiere aufgenommen. 16 4.3 Bildung der Versuchsgruppen und zeitlicher Ablauf Die 15 Versuchstiere wurden in zwei Gruppen unterteilt: Der einen Versuchstiergruppe wurde zur Induktion des Diabetes Streptozotocin infundiert, die andere Gruppe diente als stoffwechselgesunde Kontrollgruppe. 15 Monate nach der Streptozotocin-Gabe wurden die Implantate in die Schädelkalotte und den Unterkiefer inseriert. Es kamen dabei zwei unterschiedliche Oberflächenmodifikationen (SLA® und SLActive®, Straumann AG, Basel, Schweiz) zum Einsatz. Die Verteilung der Implantate erfolgte randomisiert. Nach einer postoperativen Phase von 30 Tagen wurden sieben der 15 Tiere geopfert. An Tag 90 p.o. folgten die restlichen acht Versuchstiere. Abbildung 1: Einteilung der Versuchsgruppen. Angegeben sind jeweils die Versuchstiernummer und die Anzahl der inserierten Implantate in der Schädelkalotte (gelb) und dem Unterkiefer (blau). 17 Abbildung 2: Zeitlicher Ablauf der Studie. Abbildung 3: Darstellung der Implantationsstellen im Unterkiefer und in der Schädelkalotte. Die Lokalisation der SLA®/SLActive®-Implantate wechselte durch Randomisierung innerhalb eines Untersuchungszeitpunktes. 18 4.4 Vorstellung der Implantatsysteme In dieser Studie wurden Standard-Schraubenimplantate (Bone Level) mit einem Durchmesser von 4,1 mm und einer Länge von 10 mm der Firma Straumann (Straumann AG, Basel, Schweiz) verwendet. Es kamen dabei mit SLA® und SLActive® zwei verschiedene Oberflächenmodifikationen zum Einsatz. SLA® zeichnet sich dadurch aus, dass das Titanimplantat mit grobem Korn (0,25 - 0,5 mm) sandgestrahlt und anschließend mit Säure (HCl/H2SO4) behandelt wird (Sandblasting with Large grit followed by Acid etching) [134]. Dies führt zu einer Vergrößerung der Oberfläche und zu einer verbesserten Topographie der Implantatoberfläche im Hinblick auf die Adhäsion von Knochenzellen [174]. SLActive® wird unter Reinraumbedingungen zusätzlich mit Stickstoff konditioniert und sofort in einer isotonen NaCl-Lösung konserviert, um eine Kontamination mit Molekülen aus der Umgebungsluft zu verhindern, welche sich in die Mikroporen des Implantats ablagern und so zu einer heterogenen, weniger benetzbaren Oberfläche führen [134]. Die chemische Behandlung erhöht die Benetzbarkeit und Oberflächenladung der Implantatoberfläche und beeinflusst den Kontakt mit dem umgebenden Gewebe [22, 134]. Es konnte gezeigt werden, dass die modifizierte SLActive®-Oberfläche stark hydrophil ist, eine hohe Oberflächenaktivität aufweist und damit bei der initialen Implantateinheilung zu einer raschen Adhäsion von Blut und ossären Zellen führt [42, 174]. 4.5 4.5.1 Art, Durchführung und Dauer der Eingriffe Induktion des experimentellen Diabetes Analog zu den Studien von Wilmowsky et al. und Koopmans et al. wurde Streptozotocin (Zanosar®, Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, USA) in einer physiologischen Kochsalzlösung auf 1g/10ml verdünnt und 90mg/kg Körpergewicht über einen intravenösen Zugang am Ohr über 30 min infundiert [79, 163]. Die Kanülenapplikation und Infusionsgabe fand nach Analgosedierung mit Midazolam (1mg/kg KG) (Dormicum®, Hoffmann-La Roche, GrenzachWyhlen, Deutschland) und Ketamin HCL (5mg/kg KG) (Ketavet®, Pharmacia, Erlangen, Deutschland) 4-5 Stunden nach der morgendlichen Fütterung statt. Um 19 eine Hypoglykämie zu vermeiden, wurde innerhalb der ersten fünf Tage nach der Diabetes-Induktion Futter ad libitum gewährt. Zweimal wöchentlich wurde der Blutzuckerspiegel gemessen und drei Monate nach der Streptozotocin-Gabe ein intravenöser Blutglucosetoleranztest (IvGTT) durchgeführt. Die Hausschweine erfüllten demnach die drei Diabetes-Kriterien der World Health Organization [169] und der American Diabetes Association [4]: 1.) Symptome wie Polydipsie, Polyurie und Polyphagie in Verbindung mit Blutzuckerwerten über 200 mg/dl 2.) Nüchternblutzucker mehr als 125 mg/dl 3.) Blutzuckerwerte über 200 mg/dl nach einer standardisierten GlucoseTestlösung 15 Monate nach der Diabetes-Induktion erfolgte die Insertion der Implantate in die Schädelkalotte und den Unterkiefer. 4.5.2 Ablauf des operativen Eingriffes Die Insertion der Implantate in die Schädelkalotte und den Unterkiefer fand unter Allgemeinanästhesie mit Ketamin HCL (5 mg/kg KG i.v) (Ketavet®, Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland) statt. Durch die Applikation von Articain mit Adrenalinzusatz (Ultracain DS forte®, Sanofi‐Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt a.M., Deutschland) erzielte man eine zusätzliche Vasokonstriktion im Operationsgebiet. Außerdem erhielten die Versuchstiere eine antibiotische Abschirmung eine Stunde präoperativ und drei Tage postoperativ mit Streptomycin (15mg/kg KG) (Streptomycin "Grünenthal" 1 g®, Grünethal, Stolberg, Deutschland). Zur Schmerzkontrolle wurde Buprenorphin (0,1mg/kg KG s.c.) (Temgesic®, Essex Pharma GmbH, München, Deutschland) alle zwölf Stunden für drei Tage verabreicht. Die randomisierte Implantation in die Schädelkalotte erfolgte über einen perkutanen Zugang. Dazu wurden die Haut im Bereich des Os frontale sagittal inzidiert und nach subperiostaler Lappenmobilisation ein Zugang zu den knöchernen Anteilen des Stirnbeins geschaffen. Nach der Markierung der 20 Insertionsstelle mit einem Rosenbohrer Ø 1,4 mm wurde das Implantatbett unter permanenter Wasserkühlung mit einem Pilotbohrer Ø 2.2 mm auf die endgültige Tiefe präpariert und mit einem weiteren Pilotbohrer auf 2,8 mm erweitert. Die grundlegende Präparation wurde mit einem Spiralbohrer Ø 3,5 mm abgeschlossen. Nach der anschließenden Gewindeschneidung wurde das Implantat (Ø 4,1 mm; Länge 10 mm) mit einer Ratsche inseriert und das Periost und Weichgewebe mit resorbierbaren Vicrylfäden (Vicryls 3.0®, Ethicon GmbH & Co. KG, Norderstedt, Deutschland) vernäht. Die Implantatsetzung in den Unterkieferkörper erfolgte nach submandibulärer Inzision und Aufklappen der Haut analog zu dem Vorgehen in der Kalotte. Die Implantate heilten auch hier subkutan ein. Abbildung 4: Intraoperative Bilder der Schädelkalotte (links) und des Unterkiefers (rechts) nach der Insertion der Implantate. 4.5.3 Sektion und Entnahme der Knochenproben Nach 30 bzw. 90 Tagen erfolgte die Opferung der Versuchstiere. Nach Prämedikation durch eine intramuskuläre Injektion von Azaperone (1mg/kg KG) (Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland) und Midazolam (1mg/kg KG) (Dormicum®, Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) wurden die Schweine durch eine intravasale Injektion von 20%iger Pentobarbitallösung in 21 die Ohrvene getötet. Im Anschluss wurden die Kalotten und Unterkiefer reseziert und bis zur Aufbereitung bei -80° C tiefgefroren. 4.6 Aufbereitung der Knochenproben Nach dem Auftauen der Kalotten und Unterkiefer wurden ca. 15 cm 3 große Knochenblöcke mit einer Diamantbandsäge (Exakt 310, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) so separiert, dass sich die Implantate möglichst zentral im jeweiligen Knochenblock befanden. Zur Lokalisation der Implantatposition wurden zuvor Röntgenaufnahmen mit einem Tischröntgengerät (Faxitron R®, Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA) (45kV, 0,25 mA, 5 min Belichtungszeit) angefertigt. Die Fixierung der Proben fand für 4 Tage in 1,4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei -4°C statt, um die Proteine in ihrer biologischen Aktivität zu konservieren und die organische Matrix zu insolubilisieren. Da Paraformaldehyd an Proteine bindet und somit verbraucht wird, wurde das Reagenz täglich erneuert. Die weitere Behandlung der Proben erfolgte nach dem von Heraeus‐Kulzer beschriebenen Immersionsverfahren für Technovit 9100 NEU® [63]. Dieses Kaltpolymerisat auf Methylmethacrylat-Basis hat sich v.a. im Hinblick auf den Erhalt von Antigenen und der Speicherung der Enzymaktivität als Polymerisationssystem in der histologischen Untersuchung von mineralisierten Geweben etabliert und erlaubt das nach Donath und Breuner beschriebene Trenn-Dünnschliffverfahren [34, 168, 170]. Im ersten Schritt wurden dabei die Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe im Entwässerungsautomaten (Shandon Citadel 1000®, Shandon GmbH, Frankfurt, Deutschland) bei Zimmertemperatur dehydriert. Nach dem Einsatz von Xylol als Intermedium erfolgte eine zweistufige Präinfiltration mit anschließender Infiltration der Prüfkörper durch Technovit 9100 NEU® in Kunststoffeinbettformen (Heraeus‐Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland). Die Auspolymerisation unter Sauerstoffausschluss bei -4°C im Gefrierschrank dauerte 72 Stunden. Nach Reduzierung der Kunststoffüberschüsse mit einer Diamantbandsäge (Exakt 310®, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) wurden die Proben 22 so gesägt, dass zwei Knochenhälften mit jeweils einem längshalbierten Implantat entstanden sind. Aus den einen Hälften wurden die Mikroradiografien angefertigt und aus den anderen die immunhistologischen Schnitte. 4.7 4.7.1 Mikroradiographie Herstellung der Mikroradiographien Die Knochenproben wurden an ihren Außenflächen plan angeschliffen und unter der Verwendung einer Klebepresse (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) mit Technovit 4000® (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim, Deutschland) auf zuvor angeraute Plexiglas-Objektträger fixiert. Im nächsten Schritt wurden die Probenoberflächen mithilfe einer Präzisions-Schleifmaschine (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) und Schleifpapier aufsteigender Körnung (320, 800, 1200 und 4000) unter Wasserkühlung hochglanzpoliert. Danach wurden die Knochenblöcke mit ihrer polierten Implantatseite mit Technovit 7200® (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim, Deutschland) auf planparellele Objektträger geklebt. Nach der Erstellung ca. 300 μm dünner Probenscheiben mit einer Diamantbandsäge (Exakt 310, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) wurden diese mit der Schleifmaschine auf eine Dicke von ca. 100 μm reduziert und anschließend mit einem Tischröntgengerät (Faxitron R®, Faxitron x- ray Corporation, Illinois, USA) (13,5 kV, 2,5 mA, 150s) belichtet. Um möglichst hohe Auflösungen zu erreichen, wurde der Objekt-Film-Abstand so klein wie möglich gehalten. Die Röntgenbilder wurden dann entwickelt, mit einem Flachbrettscanner (Epson 4990 Photo®, Epson GmbH, Meerbusch, Deutschland) in Graustufen (8bit, 1200dpi) digitalisiert und im unkomprimierten tiff-Format gespeichert. 23 Abbildung 5: Die Schliffpräparate wurden mit dem Tischröntgengerät Faxitron® geröntgt, mit einem hochauflösenden Scanner digitalisiert und mit einer Bildbearbeitungssoftware zugeschnitten und kontrastiert. 4.7.2 Auswertung der Mikroradiographien Die Auswertung der Mikroradiographien erfolgte mit dem Bildanalyse-Programm Bioquant Osteo® (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, USA). Mit dieser Software lassen sich gleiche Farbwerte bzw. Graustufen markieren, so dass es möglich ist, Knochenstrukturen quantitativ zu erfassen. Es wurde je eine gleich große region of interest (ROI) links und rechts des Implantates definiert und der mineralisierte Knochen markiert. Bioquant OSTEO errechnete daraus den prozentualen Flächenanteil der markierten Bereiche an der Gesamtfläche der ROI. Die ermittelten Werte geben die Knochenmineralisationsrate wieder [12]. 24 Abbildung 6: Darstellung der regions of interest (ROI) zur Auswertung der Mikroradiographien. Pro Implantatseite wurde eine ROI gleicher Größe definiert. Abbildung 7: Auswertung einer ROI mit Bioquant Osteo®. Nach der Festlegung der ROI (grünes Rechteck) wird der mineralisierte Knochen (rotgefärbter Bereich) und die Implantatfläche innerhalb der ROI (blaugefärbter Bereich) markiert. Das Bildanalyseprogramm errechnet daraus den prozentualen Flächenanteil des mineralisierten Knochens an der Gesamtfläche der ROI abzüglich der Implantatfläche. Die Knochenmineralisationsrate beträgt in diesem Beispiel 34,74 % (P3 BV/T-1). 25 4.8 Immunhistochemie Unter Immunhistochemie versteht man ein Verfahren zur spezifischen Markierung von Proteinen durch mono- oder polyklonale Antikörper, das mit einem Detektionssystem kombiniert wird [84]. Durch die Spezifität der verwendeten Antikörper lässt sich die Verteilung bestimmter Antigene im histologischen Schnitt Knochenmatrixproteine lichtmikroskopisch sind substanziell an sichtbar machen. Knochenregenerations- und Knochenumbauprozessen beteiligt. Die quantitative Detektierung dieser Proteine im Knochen lässt daher Rückschlüsse auf die ablaufenden Knochenstoffwechselprozesse zu. 4.8.1 Anfertigung der Mikrotomschnitte Um die Mikrotomschnitte herstellen zu können, mussten im ersten Schritt die Implantate aus den Knochenproben entfernt werden. Die Explantation erfolgte unter permanenter Wasserkühlung mithilfe eines chirurgischen Handstücks und einer Lindemannfräse, indem periimplantär vorsichtig Kunststoff und Knochen abgetragen wurde bis das Implantat soweit mobil war, dass es mit einer Flachspitzzange entnommen werden konnte. Die Knochenabtragung erfolgte dabei nur in den Probenbereichen, die für die Auswertung irrelevant waren. Im nächsten Schritt wurden die Hohlräume, die durch die Entfernung der Implantate entstanden sind, wieder mit Technovit 9100 NEU® aufgefüllt. Die Auspolymerisation des Kunststoffes im Gefrierschrank bei -4°C dauerte 72 Stunden. Die Resektate wurden dann mit einem Kaltpolymerisat (Technovit 3040®, Heraeus‐Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) auf einem Objekthalter (Simport®, Beloeil QC, Canada) befestigt, um anschließend am Rotationsmikrotom (Leica RM2165®, Leica Microsystems, Nussloch‐Heidelberg, Deutschland) Gewebeschnitte herstellen zu können. Mit dem Mikrotom wurden ca. 5 μm dünne Präparateschnitte hergestellt, mit 60%igem Alkohol auf Objektträger (SuperfrostPlus®, Menzel GmbH & CoKG, Braunschweig, Deutschland) geschwemmt und mit einer 0.025 mm dicken Polyethylenfolie abgedeckt. Die Gewebeschnitte wurden anschließend in einer Spindelpresse bei 26 57°C für 24 Stunden komprimiert. Nach dem Trocknen wurde die Polyethylenfolie entfernt und die Proben bis zur immunhistologischen Färbung in Präparatekästen aufbewahrt. 4.8.2 Labeled Streptavidin Biotin Methode Die Färbevorgänge in dieser Versuchreihe wurden mit dem Dako REAL® Detection System Peroxidase/AEC Rabbit/Mouse im Dako Autostainer Plus® (Dako GmbH, Glostrup, Dänemark) durchgeführt. Dieser Kit beruht auf der Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSAB), einem indirekten immunhistochemischen Nachweisverfahren. Hierbei bindet zunächst ein spezifischer, unkonjugierter Primärantikörper an das nachzuweisende Antigen der Probe. Danach gibt man einen spezifisch gegen die Tierspezies des Primärantikörpers gerichteten, mehrfach biotinylierten Sekundär- bzw. Brückenantikörper hinzu. Im nächsten Schritt wird meerrettichperoxidase-konjugiertes Streptavidin beigefügt, wobei man sich hier die Affinität von Streptavidin zu Biotin zunutze macht. Das aus dem Bakteriengattung Streptomyces avidinii isolierte Protein Avidin besitzt vier identische Untereinheiten, die jeweils ein Molekül Biotin irreversibel binden können. Dadurch, dass jeder der Brückenantikörper mehrfach biotinyliert ist und somit mehrere Bindungsstellen für das peroxidasekonjugierte Streptavidin aufweist, kommt es zu einer Amplifikation und Erhöhung der Empfindlichkeit des Detektionsverfahrens. Im letzten Schritt wird eine Chromogenlösung bestehend aus 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) und Wasserstoffperoxid zugegeben. AEC wird nun, unter der katalytischen Wirkung der an Streptavidin gebundenen Peroxidase, durch H2O2 in ein rotbraunes Farbprodukt umgesetzt. Damit sind im histologischen Schnitt die Bereiche des Zielgens (Kollagen I und Osteocalcin) rotbraun gefärbt. Nach der Detektierung des Zielgens erfolgte eine selektive Kernfärbung mit Haemalaun. [84, 110] Eine Negativkontrolle wurde für jede Probe Färbeprotokolle sind dem Anhang zu entnehmen. mitgeführt. Detaillierte 27 Antikörper Hersteller Typ Konzentr. monoklonal gewonnen Aus Maus Kollagen I (Col- I) Osteocalcin (OC 4-30) Abcam, Cambridge, USA Takara, Bio Inc., Japan monoklonal Maus 1:10´000 1:10´000 Tabelle 1: Beschreibung der verwendeten Antikörper. Abbildung 8: Schematische Darstellung der Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSAB-Methode). 28 4.8.3 Auswertung der immunhistologischen Schnitte Die ROIs der gefärbten Gewebeschnitte wurden unter dem Mikroskop (AX10®, Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) bei 20-facher Vergrößerung mit einer Digitalkamera (Axio Cam®, Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) fotografiert und im unkomprimierten tiff-Format gespeichert. Die Evaluierung der digitalen Bilder erfolgte, wie die der Mikroradiografien, mit Bioquant Osteo® (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, USA). Die gewählten Auswertungsbereiche und das Vorgehen sind den Abb. 9 und 10 zu entnehmen. Abbildung 9: Darstellung der regions of interest (ROI) zur Auswertung der immunhistochemischen Schnitte. Pro Implantatseite wurden zwei ROIs identischer Größe im Bereich des Knochen-Implantat-Interfaces definiert (ROI 1-4). Zusätzlich wurde ein weiterer Bereich im ortständigen Knochen gewählt, der zur Bestimmung der Standardexpression der Knochenmatrixproteine diente (ROI 5). 29 Abbildung 10: ROI-Auswertung einer Osteocalcin-Färbung mit Bioquant Osteo®. Immunhistologisch angefärbte Osteocalcin-Bereiche (rote Flächen) wurden mit Hilfe des Bildanalyseprogrammes markiert und daraus der prozentuale Flächenanteil der Osteocalcin-exprimierenden Bereiche an der Gesamtfläche der ROI berechnet. In diesem Beispiel liegt die Osteocalcin-Expressionsrate bei 20,38% (P3 BV/T-1). 4.9 Statistik Die Auswertung der Proben erfolgte durch zwei Untersucher, wobei die Werte für jede Probe aggregiert und mit arithmetischem Mittelwert und Standardabweichung angegeben wurden. Für die graphische Darstellung der gewonnenen Daten kam das Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2007® (Microsoft Corp., Redmond, USA) zur Anwendung. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurde der Wilcoxon-Rank-Test mit dem Programm AXUM® (MathSoftware, Cambridge, USA) durchgeführt. Ab einem p-Wert < 0.05 wurden die verglichenen Daten als signifikant betrachtet. 30 5 Ergebnisse 5.1 5.1.1 Mikroradiographie Schädelkalotten Abbildung 11: Periimplantäre Knochendichte [%] in der Schädelkalotte. Gesunde Stoffwechsellage: 30 Tage p.o. ließ sich bei den Schädelkalottenproben mit SLA®-beschichteten Implantaten eine Knochenmineralisationrate von 58,58% ± 7,09% und in der mit SLActive®-beschichteten Implantatgruppe von 69,30% ± 8,44% nachweisen. An Tag 90 zeigte die SLA®-Gruppe eine periimplantäre Knochendichte von 56,75% ± 14,23% und die SLActive®-Gruppe von 68,96% ± 12,20%. Diabetische Stoffwechsellage: 30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Knochendichte der SLA®-Gruppe 55,77% ± 7,15% und die der SLActive®-Proben 62,80% ± 8,91%. Nach 90 Tagen fiel die Knochenmineralisationsrate in der SLA®-Gruppe auf 48,86% ± 17,68% und in der SLActive ®-Gruppe auf 61,13% ± 18,43% ab. 31 Signifikante Unterschiede ergaben sich beim Vergleich von: SLA®, 30 Tage, gesund und SLActive®, 30 Tage, gesund (p= 0,0034) SLA®, 30 Tage, diabetisch und SLActive® 30 Tage, diabetisch (p=0,0443) SLA®, 90 Tage, gesund und SLActive®, 90 Tage, gesund (p= 0,0343) SLA®, 90 Tage, diabetisch und SLActive® 90 Tage, diabetisch (p=0,050) 5.1.2 Unterkiefer Abbildung 12: Periimplantäre Knochendichte [%] im Unterkiefer. Gesunde Stoffwechsellage: 30 Tage p.o. zeigten die Unterkieferproben mit SLA®-beschichteten Implantaten eine Knochenmineralisationrate von 74,94% ± 2,26% und die mit SLActive®beschichtete Implantatgruppe von 66,73% ± 8,67%. An Tag 90 ließ sich in der SLA®-Gruppe eine periimplantäre Knochendichte von 77,81% ± 9,31% und in der SLActive®-Gruppe von 75,06% ± 10,54% nachweisen. 32 Diabetische Stoffwechsellage: 30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Knochendichte der SLA®-Gruppe 71,52% ± 10,62% und die der SLActive®-Proben 62,78% ± 14,84%. Zum Opferungszeitpunkt nach 90 Tagen stieg die Knochenmineralisationsrate in der SLA®-Gruppe auf 73,31% ± 11,89% und in der SLActive® auf 74,59% ± 10,26% an. Signifikante Unterschiede ergaben sich beim Vergleich von: SLA®, 30 Tage gesund und SLActive®, 30 Tage, gesund (p=0,0248) SLA®, 30 Tage, diabetisch und SLActive®, 30 Tage, diabetisch (p=0,0386) SLActive®, 30 Tage, gesund und SLActive®, 90 Tage, gesund (p=0,0334) SLActive®, 30 Tage, diabet. und SLActive®, 90 Tage, diabet. (p=0,0038) Abbildung 13: Halbierte Schliffprobe mit korrespondierender Mikroradiografie. 33 5.2 5.2.1 Immunhistologie Kollagen I 5.2.1.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage Abbildung 14: Periimplantäre Kollagen I-Expression / Fläche [%] der Schädelkalotten nach 30 Tagen. 30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Kollagen I-Expression der Schädelkalotten der stoffwechselgesunden Versuchstiere in der SLA®-Gruppe 24,19% ± 9,94%. In der SLActive®-Gruppe belief sich der Wert für die Kollagen I-Expression auf 23,75% ± 9,89%. Bei den diabetischen Tieren lag der Mittelwert in der SLA®-Gruppe bei 28,26% ± 7,71% und in der SLActive®-Fraktion bei 22,54% ± 6,06%. Die StandardKollagen I-Expression der stoffwechselgesunden Tieren betrug im Mittel 23,75% ± 3,15% , die der diabetischen Tiere 25,63% ± 7,01%. Die diabetische SLA®-Gruppe zeigte im Vergleich zur SLActive®-Gruppe eine signifikant höhere Kollagen I-Expression (p=0,0189). 34 5.2.1.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage Abbildung 15: Periimplantäre Kollagen Typ I-Expression/Fläche [%] der Schädelkalotten nach 90 Tagen. 90 Tage p.o. betrug die periimplantäre Kollagen I-Expression der Schädelkalotten der stoffwechselgesunden Tiere in der SLA®-Gruppe 25,51% ± 2,77%. In der SLActive®-Fraktion ließ sich ein Mittelwert von 21,15% ± 5,43% nachweisen. Die Standard-Kollagen I-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren lag im Mittel bei 23,00% ± 2,80%. Bei den diabetischen Tieren zeigte sich in der SLA®-Gruppe ein Mittelwert von 25,81% ± 5,02% und in der SLActive ®-Fraktion von 21,97% ± 8,47%. Die Standardexpression der diabetischen Versuchstiergruppe nach 90 Tagen lag bei 23,18% ± 8,84%. Es konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der SLA ®- und SLActive®Beschichtung der gesunden Tiere nachgewiesen werden (p=0,0254). 35 5.2.1.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich Abbildung 16: Periimplantäre Kollagen Typ I-Expression/Fläche [%] der Schädelkalotten. Abbildung 17: Exemplarische Kollagen I-Färbung (20x Vergrößerung). Die Kollagen I-Fasern sind im immunhistologischen Schnitt als rotgefärbte Bereiche zu erkennen. 36 5.2.2 Osteocalcin 5.2.2.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage Abbildung 18: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der Schädelkalotten nach 30 Tagen. Am Opferungstag 30 betrug die periimplantäre Osteocalcin-Expression der Schädelkalotten der stoffwechselgesunden Versuchstiere in der SLA®-Gruppe 16,48% ± 5,24%. In der SLActive®-Gruppe belief sich der Mittelwert auf 19,94% ± 5,44%. Die Standard-Osteocalcin-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren im ortständigen Knochen lag im Mittel bei 17,75% ± 5,25%. Bei den diabetischen Versuchstieren ließ sich in der SLA ®-Gruppe eine Osteocalcin-Expression von 22,10% ± 3,44% und in der SLActive®-Fraktion von 17,64% ± 6,23% nachweisen. Die Standard-Expression bei den diabetischen Tieren betrug 14,06% ± 6,09%. Signifikante Unterschiede ließen sich nachweisen zwischen: SLA®, gesund und SLA®, diabetisch (p=0,0002) SLA®, diabetisch und SLActive® diabetisch (p=0,0189) 37 5.2.2.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage Abbildung 19: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der Schädelkalotten nach 90 Tagen. An Tag 90 betrug die periimplantäre Osteocalcin-Expression der Schädelkalotten der stoffwechselgesunden Tiere in der SLA®-Gruppe 25,36% ± 5,70%. In der SLActive®-Fraktion ließ sich ein Mittelwert von 20,80% ± 5,81% nachweisen. Die Standard-Osteocalcin-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren im ortständigen Knochen lag im Mittel bei 17,04% ± 5,76%. Bei den diabetischen Tieren zeigte sich in der SLA®-Gruppe ein Mittelwert von 20,21% ± 4,73% und in der SLActive ®-Fraktion von 20,79% ± 5,14%. Die Standard-Expression der diabetischen Tieren betrug 15,16% ± 5,11%. Es konnten keine Signifikanzen nachgewiesen werden. 38 5.2.2.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich Abbildung 20: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der Schädelkalotten. Beim Vergleich der beiden Opferungszeitpunkte ergab sich ein signifikanter Anstieg der Osteocalcin-Expression der SLA®-beschichteten Implantate der stoffwechselgesunden Tiere (p=0,023). Abbildung 21: Exemplarische Osteocalcin-Färbung (20x Vergrößerung). Osteocalcin-exprimierende Bereiche stellen sich im immunhistologischen Schnitt als Rotfärbung dar. 39 5.3 Wertetabelle Knochendichte [%] Kollagen I-Expr. [%] Osteocal.-Expr. [%] Kalotte Unterkiefer Kalotte Unterkiefer 55,77 ± 7,15 71,52 ± 10,62 28,26 ± 7,71 22,10 ± 3,44 SLActive® 62,79 ± 8,91 62,78 ± 14,84 22,54 ± 6,06 17,64 ± 6,23 SLA® 58,85 ± 7,09 74,94 ± 2,26 24,19 ± 9,94 16,48 ± 5,24 SLActive® 69,30 ± 8,43 66,73 ± 8,67 23,75 ± 9,89 19,94 ± 5,44 48,86 ± 17,63 73,31 ± 11,89 25,81 ± 5,02 20,21 ± 4,73 SLActive® 61,13 ± 18,43 74,59 ± 10,26 21,97 ± 8,47 20,79 ± 5,14 SLA® 56,75 ± 14,23 77,81 ± 9,31 25,51 ± 2,77 25,36 ± 5,70 SLActive® 68,96 ± 12,20 75,06 ± 10,54 21,15 ± 5,43 20,80 ± 5,81 30 Tage Diabetisch SLA® Gesund 90 Tage Diabetisch SLA® Gesund Tabelle 2: Wertetabelle zur Knochendichte und der Expression von Kollagen I und Osteocalcin. 40 6 Diskussion Diabetes mellitus ist eine endokrine Stoffwechselstörung mit dem Leitbefund einer chronischen Hyperglykämie, der ein relativer oder absoluter Insulinmangel zugrunde liegt [141]. Es wird dabei zwischen zwei Hauptformen unterschieden: Beim Diabetes mellitus Typ 1 können in Folge einer progredienten Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen in den Langerhansschen Inseln des Pankreas physiologische Insulinkonzentrationen nicht aufrecht erhalten werden. Die Ursache der autoimmunologischen Destruktion der β-Zellen des Pankreas ist noch nicht vollkommen verstanden, eine genetische Prädisposition gilt jedoch als gesichert [20, 28, 45, 119]. Zu Beginn der Erkrankung kommt es zu einer periinsulären Infiltration von Lymphozyten, die dann durch eine zytotoxische TZellreaktion eine entzündliche Reaktion der β-Zellen hervorrufen. Dieser als Insulitis bezeichnete Zustand führt im weiteren Verlauf zu einer Zerstörung der insulinproduzierenden Zellen [46, 60, 137]. Beim Typ 2-Diabetes kommt es zu keinem autoimmunologisch vermittelten Untergang der β-Zellen. Die Ursache für die Hyperglykämie liegt hier in einer Insulinresistenz der Zielgewebe (Muskulatur, Fettgewebe, Leber) und einer gestörten Insulinsekretion [38, 130, 157]. Als mögliche Ursachen werden genetische Defekte der Rezeptoren, eine verminderte Rezeptorendichte der Zielgewebe oder Störungen der intrazellulären Signaltransduktion diskutiert [141]. Diabetes mellitus gilt als relative Kontraindikation für die Insertion dentaler Implantate, da die Verlustrate im Vergleich zum gesunden Patienten erhöht ist [39, 73, 101]. Über die pathologischen Mechanismen, die beim Diabetiker zu einem erhöhten Implantatverlust-Risiko führen, wird in der Literatur zur Zeit kontrovers diskutiert [73, 80, 98, 131]. Dies mag an der Tatsache liegen, dass die tierexperimentellen Studien zu dieser Problematik bislang widersprüchlich sind und klinische Studien a priori nur eingeschränkte Möglichkeiten besitzen, die genauen pathologischen Ursachen für die veränderte biologische Reaktion auf die Implantatsetzung zu eruieren. Unser Versuchsaufbau basiert daher auf einem diabetischen Tiermodell, das die Diabetes-Kriterien der WHO [169] und ADA [4] einschließt und somit eine hohe Übertragbarkeit auf den Menschen gewährleistet. 41 Das Ziel dieser Studie war es, aufzuzeigen, welche Auswirkungen der Diabetes auf den periimplantären Knochenstoffwechsel hat. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer modifizierten Oberfläche auf die Osseointegration eines Implantates bei einem diabetisch veränderten Knochen untersucht. Die Auswertung Knochendichte der bei Mikroradiografien den zeigt, diabetischen dass Tieren im die periimplantäre Vergleich zur stoffwechselgesunden Kontrollgruppe zu beiden Opferungszeitpunkten verringert war. Dies deckt sich mit den Ergebnissen nach Gerritsen et al. und Takeshita et al., die an diabetischen Ratten ebenfalls signifikant geringere periimplantäre Knochendichtewerte nachgewiesen haben [48, 151]. Iyama et al. konnte in einer der ersten Studien an diabetischen Ratten, in der Hydroxylapatit-beschichtete Implantate gesetzt wurden, zeigen, dass Diabetes die Knochenbildung und Knochenmineralisierung deutlich einschränkt [70]. Neugebildeter periimplantärer Knochen wird zudem als unreif und weniger organisiert beschrieben [108]. Giglio et al. bestätigte in einer späteren Studie, dass Diabetes den periimplantären Knochenheilungsprozess verzögert und zu qualitativen und quantitativen Einschränkungen des neu gebildeteten Knochen führt [50]. So wurde bei den diabetischen Versuchstieren 14 Tage postoperativ immer noch Geflechtknochen und 30 Tage p.o. nur eine dünne Schicht lamellären Knochens gefunden. In der gesunden Kontrollgruppe hingegen konnte nach 14 Tagen fast ausschließlich lamellärer Knochen nachgewiesen werden [50]. Hauptursache für die klinischen Folgen des Diabetes ist die chronische Hyperglykämie [72], jedoch sind die Mechanismen auf molekularer Basis noch nicht vollständig verstanden. Nachgewiesen ist aber, dass sog. „advanced glycation endproducts“ (AGEs) pathophysiologisch eine Schlüsselrolle bei der Entstehung diabetischer Begleiterkrankungen einnehmen [3, 72, 118]. AGEs sind eine heterogene Gruppe von Molekülen, die bei der nicht-enzymatischen Reaktion von reduzierten Zuckern (Glucose) mit freien Aminogruppen von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren entstehen. Das Produkt dieser Reaktion ist eine Schiff´sche Base, welche sich spontan zu einem Amadori-Produkt umwandelt. Bekanntestes Beispiel dafür ist das Hämoglobin HbA1c, das aufgrund seiner schnellen Nachweisbarkeit als wichtiger diagnostischer Marker für die DiabetesErkrankung dient. In der letzten Phase der Glykierung entstehen aus diesen 42 Amadori-Produkten die irreversiblen und protease-resistenten Komplexe der AGEs. Der Überschuss an Glucose im Blut beim Diabetiker führt über die oben genannten Reaktionen zu einem irreversiblen Anstieg der AGEs [57, 118]. Der erhöhte Spiegel an AGEs führt nun zu einigen Veränderungen, wobei die Auswirkungen auf das Gefäßsystem am besten erforscht sind. Es gibt drei wesentliche wissenschaftliche Hinweise, die für die Beteiligung der advanced glycation endproducts an der Entstehung von Mikroangiopathien sprechen: Erstens ließ sich ein direkter Zusammenhang zwischen der Akkumulation von AGE-modifizierten Proteinen und dem Ausprägungsgrad der Mikroangiopathie bei diabetischen Tieren und Menschen nachweisen [9, 90]. Zweitens entwickelten nicht-diabetische Tiere nach Injektionen von AGEmodifizierten Proteinen Mikroangiopathien [161]. Drittens konnte gezeigt werden, dass der AGE-Inhibitor Aminoguanidin die Entwicklung und das Fortschreiten von mikrovaskulären Veränderungen verhindern kann [59, 148]. Die eingeschränkte Wundheilung beim Diabetiker ist zu großen Teilen auf eine gestörte Angiogenese zurückzuführen [89]. Da eine gute Vaskularisation die Grundvoraussetzung für eine regelrechte Knochenheilung und –mineralisation ist [21, 51], limitieren angiopathische Veränderungen somit auch die periimplantären Stoffwechselprozesse im Knochen und haben damit womöglich auch einen inhibierenden Effekt auf die Knochenmineralisierung. Dies deckt sich mit der Tierversuchsstudie von Quintero et al., die zu dem Schluss kamen, dass erhöhte AGE-Konzentration sowohl zu einem verringerten Knochenumsatz, als auch zu einer verzögerten Osseointegration führen [128]. Neben den Auswirkungen der AGEs auf das Gefäßsystem wird auch über den Einfluss auf die Expression von Knochenmatrixproteinen und Zytokinen diskutiert. So berichten Javed et al. in diesem Zusammenhang von einer Abnahme der Osteocalcin-Expression und einem Anstieg bestimmter proinflammatorischer Zytokine wie IL-1β oder IL-6 [73]. Die Idee, dass der Knochen eine inflammatorische Reaktion auf den Diabetes zeigt, wurde schon von Iacopino et al. formuliert [68]. Diese führen im Allgemeinen zu einer vermehrten Formation von Osteoklasten und einem erhöhten Knochenabbau [73]. 43 Neben der gestörten Angiogenese und der dadurch eingeschränkten Wundheilung [89], hat der Diabetes auch Auswirkungen auf den Osteoblasten. Die Hyperglykämie beeinflusst osteoblastäre Signalwege und behindert die Expression von Genen, die essentiell für die Osteoblastenreifung sind, dies führt zu einer verminderten Calciumaufnahme im Osteoblasten und dadurch zu einer geringeren Knochenmineralisation [6, 172]. Wie Lu et al. berichten, produzieren diabetische Mäuse zwar die selbe Menge an unreifem mesenchymalen Gewebe wie gesunde Tiere, jedoch sind sie nicht in der Lage, adäquat Gene zu exprimieren, die die Osteoblastenreifung regulieren [87]. Santana et al. konnten zeigen, dass Diabetes die Differenzierung von Osteoblasten inhibiert und negative Auswirkungen auf die Sezernierung des Parathormones hat, das den Kreislauf von Phosphat und Calcium reguliert [136]. Einhorn et al. wiesen in diesem Zusammenhang geringere Mengen an Phosphat und Calcium sowie eine gestörte Hydroxylapatit-Struktur nach [36]. Auch die oben beschriebenen AGEs scheinen direkt das Wachstum, die Differenzierung und die Aktivität von Osteoblasten zu beeinflussen. Eine entscheidende Rolle wird dabei speziellen osteoblastären Rezeptoren für AGEs (RAGEs) zugeschrieben [91, 131]. Es wird zudem darüber diskutiert, dass AGE-Modifikation des Kollagen I die Integrin-vermittelte Adhäsion von Osteoblasten an die Extrazelluläre Matrix behindern und somit die Knochenbildung beeinträchtigen [92-93]. Die Änderungen im Glukosestoffwechsel können beim Diabetiker zu einer erhöhten Laktat-Bildung führen. Jahr et al. und Brandao-Burch et al. konnten nachweisen, dass Osteoblasten pH-empfindliche Kanäle exprimieren, die auf einen pH-Abfall mit einer verminderten Genexpression und Mineralisation antworten [17, 71]. Dies könnte die Tatsache erklären, dass bei Experimenten mit diabetischen Tieren unter gleichzeitiger Insulingabe keine Unterschiede hinsichtlich der Implantateinheilung beschrieben wurden [81, 146]. Auch klinisch ist bei gut eingestellten Diabetikern keine erhöhte Verlustrate zu beobachten [73]. Insofern kann die Implantattherapie bei einem suffizient kontrollierten Diabetiker nicht als kontraindiziert gelten [99]. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die gestörte Differenzierung und Proliferation der Osteoblasten zu einer qualitativ und quantitativ eingeschränkten Knochenbildung führen und damit den Heilungsprozess verzögern. 44 Dass sich Diabetes negativ auf die Osteoid- und Knochenbildung als auch auf die Knochenmineralisation auswirkt, wurde bereits in einigen experimentellen Studien festgestellt [48, 50, 70, 108, 151]. Ob die Knochendichte in diesem Zusammenhang eine Rolle spielt, wurde unseres Wissens bis jetzt noch nicht erforscht. Der Knochen setzt sich histologisch aus zwei grundlegenden Knochenformen zusammen, der Spongiosa und der Kompakta [41]. Die Kalotte des Schweines ist mit ihrem hohen Anteil an spongiösem Knochen mit der Makrostruktur des menschlichen Oberkieferknochens vergleichbar und weist hinsichtlich der Knochenregeneration ein hohe Analogie zum menschlichen Oberkiefer auf [139]. In unserer Studie zeigte sich, dass die periimplantäre Knochendichte sowohl in der Kalotte als auch im Unterkiefer bei den diabetischen niedriger ist als bei den stoffwechselgesunden Tieren. Diabetes scheint also unabhängig von der Knochenmakrostruktur einen negativen Effekt auf die Knochenmineralisierung zu haben. Interessanterweise zeigten sich aber Unterschiede zwischen den SLA®- und SLActive®-Implantaten. In der Schädelkalotte weisen die SLActive ®-Implantate sowohl bei der diabetischen als auch bei der Kontrollgruppe eine signifikant höhere periimplantäre Knochendichte auf. Im Unterkiefer ist dieser Effekt nicht zu beobachten. Spongiöser Knochen, wie der der Schädelkalotte, zeichnet sich durch eine große Oberfläche, den Kontakt zu mensenchymalen Stammzellen und ein überdurchschnittlich gut ausgebildetes Gefäßsystem aus [31]. Während konventionelle Titanoberflächen wie SLA® hydrophob sind, ist die SLActive®Oberfläche durch ihre chemische Behandlung hydrophil. Die chemische Modifikation der Oberfläche erhöht u.a. die Benetzbarkeit des Implantates und beeinflusst damit den Kontakt zwischen der Implantatoberfläche und der biologischen Umgebung [22, 134]. Bei der initialen Implantateinheilung führen die hydrophilen Eigenschaften zu einer schnellen Adhäsion von Blut und ossären Zellen [22]. Ursache der erhöhten Knochendichte der SLActive®-Implantate in der Kalotte könnte demnach in der guten Durchblutung des spongiösen Knochens liegen. In Verbindung mit der hydrophilen Oberfläche des Implantates kommt es zu einer erhöhten Migration von Blut und Knochenzellen und damit zu einer vermehrten Knochenbildung. Das weniger gut differenzierte Gefäßsystem im kortikalen Knochen kann als Erklärung dienen, dass die SLActive ®-Oberfläche 45 im Unterkiefer nicht zu einer erhöhten Knochenmineralisation führt. Davies kam zudem zu dem Schluss, dass der spongiöse Knochen im Vergleich zum kortikalen Knochen eine deutlich schnellere Knochenheilungszeit und Remodelling-Geschwindigkeit Knochenmineralisationsrate aufweist in der [31]. Kalotte Dass vom kein ersten Anstieg zum der zweiten Opferungszeitpunkt zu beobachten war, könnte daran liegen, dass ein Großteil der Heilungsprozesse schon innerhalb der ersten 30 Tage stattgefunden hatten. Bei den SLActive®-Implantaten im Unterkiefer kam es dagegen zu einem signifikanten Anstieg der periimplantären Knochendichte nach 90 Tagen sowohl bei den diabetischen als auch bei den gesunden Schweinen. Die Einheilung der Implantate bzw. das Knochen-Remodelling ist hier anscheinend langsamer abgelaufen und somit ist auch ein Anstieg der Knochendichte zum zweiten Opferungszeitpunkt sichtbar. In der Dissertationsarbeit von Herrn Möst wurde zusätzlich lichtmikroskopisch der Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) bestimmt. Hier zeigte sich bei den diabetischen Versuchstieren analog zur niedrigeren Knochendichte auch ein geringerer Knochen-Implantat-Kontakt [102]. In einer Reihe von Studien an diabetischen Ratten wurde ebenfalls von einem geringeren Knochen-ImplantatKontakt berichtet. Siquera et al. konnten 30 Tage nach der Implantation einen um 50% geringeren Knochen-Implantat-Kontakt der diabetischen Ratten im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen [146]. In zwei weiteren Studien wurden ebenfalls signifikant geringere KIK-Werte nach 4 und 8 Wochen beobachtet [108, 114]. Auch zu einem späteren Opferungszeitpunkt nach 12 Wochen ließ sich ein verringerter KIK finden [48]. Die Abnahme des KnochenImplantat-Kontaktes deutet darauf hin, dass Diabetes die Osseointegration negativ beeinflusst [43]. Vergleicht man die beiden Opferungszeitpunkte, so ist im Unterkiefer sowohl bei den gesunden als auch bei den diabetischen Tieren ein deutlicher Anstieg des KIK vom ersten zum zweiten Opferungszeitpunkt zu beobachten, wohingegen sich die Werte in der Kalotte nur geringfügig ändern [102]. Ein ähnliches Verhalten wurde, wie oben beschrieben, auch bei der periimplantären Knochendichte beobachtet. Auch hier mag die schnellere Knochenheilung des spongiösen Kalottenknochens als Erklärung dienen. Die Osseointegration der Implantate 46 scheint hier zu großen Teil schon nach 30 Tagen abgeschlossen zu sein, so dass nur geringfügige Änderungen der KIK- und Knochendichte-Werte hin zum zweiten Opferungszeitpunkt festzustellen waren. Kotsovilis et al. kamen zu dem Schluss, dass Diabetes zwar den Einheilungsprozess eines Implantates verzögert, nach Abschluss der Osseointegration aber keine Unterschiede im KnochenImplantat-Interface erkennbar sind [80]. Diese Folgerung kann in unserer Studie nicht bestätigt werden, da die Knochenmineralisationsrate und der KnochenImplantat-Kontakt bei den diabetischen Tieren auch nach 3 Monaten noch deutlich verringert sind. Beim Vergleich der beiden Implantatmodifikationen zeigte sich ein signifikant höherer KIK der SLActive®-Oberfläche in der Schädelkalotte der diabetischen Tiere nach 90 Tagen. Wie bereits oben beschrieben, erklärt sich dies durch die ausgeprägte Hydrophilie der Implantatoberfläche im Zusammenspiel mit der guten Vaskularisation des spongiösen Knochens. Im Unterkiefer ließ sich nach 30 und 90 Tagen zwar auch ein höherer KIK der SLActive-Implantate bei den diabetischen Tieren nachweisen, jedoch waren diese statistisch nicht signifikant. Die positiven Einflüsse der SLActive ®-Oberfläche auf die Implantateinheilung bzw. auf das Knochen-Implantat-Interface konnten schon von Buser et al. gezeigt werden [22]. Sie berichteten von einem signifikant höheren KIK im Vergleich zur konventionellen SLA®-Oberfläche nach 2 und 4 Wochen Einheilungszeit und einer früheren Formation von reifem, mineralisiertem Knochen. Ebenso konnte eine vermehrte Knochenbildung und eine Proliferation vaskulärer Strukturen nachgewiesen werden [143]. Auch ließen sich bis 8 Wochen nach der Implantatsetztung höhere Ausdrehmomente bei den SLActive ®-Implantaten finden [42]. Eine weitere Studie zeigte bei Dehiszenz-Defekten signifikant mehr Knochen um SLActive®-Implantate als um SLA®-Implantate. Nach zwölf Wochen war der Defekt um die SLActive®-Implantate vollständig durch neuen Knochen aufgefüllt, während sich die Knochenneubildung um die SLA ®Implantate auf den apikalen Bereich des Defektes beschränkte [142]. Die immunhistochemische Untersuchung der Kalottenproben muss vor dem Hintergrund betrachtet werden, dass sowohl bei der Knochenmineralisationsrate als auch beim Knochen-Implantat-Kontakt nur geringe Veränderungen vom ersten zum zweiten Opferungszeitpunkt zu beobachten waren. Insofern waren auch bei 47 der immunhistologischen Untersuchung keine großen Änderungen der Expressionsraten festzustellen. Bei der Untersuchung der Proben zeigte sich eine höhere Kollagen I-Expression der diabetischen Tiere im Vergleich zu den stoffwechselgesunden Tieren bei den SLA®-Implantaten nach 30 und 90 Tagen und bei den SLActive®-Implantaten nach 90 Tagen. Dies kann durch die geringere Mineralisationsrate des diabetischen Knochens erklärt werden. Die Bildung von Knochen beginnt mit der Synthese und Anordnung eines Kollagen I-Gerüstes. Im Anschluss wird das Osteoid mineralisiert, indem sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der Kollagenfasern anordnen. Immunhistologisch anfärbbar sind v.a. die KollagenFasern, die noch nicht durch die Hydroxylapatitkristalle maskiert sind, d.h. es werden die Kollagenfasern detektiert, die noch nicht von mineralisierter Substanz umschlossen sind. In der Studie von Wilmowsky et al. konnte durch TrichromGoldner-Färbungen gezeigt werden, dass der diabetische Knochen im Vergleich zum gesunden Knochen größere, unmineralisierte, aber kollagenreiche Bereiche aufweist [163]. Dies korreliert mit den Ergebnissen der mikroradiographischen Untersuchung, bei der sich ebenfalls eine geringere Knochenmineralisation des diabetischen Knochens zeigte. Der Abfall der Kollagen I-Expression zum zweiten Opferungszeitpunkt lässt sich dadurch erklären, dass Kollagen I einen frühen Marker des Knochenstoffwechsels darstellt. Beim Vergleich der Implantatoberflächen zeigten sich nach 30 Tagen signifikant höhere Kollagen I-Werte bei der SLA®-Oberfläche ggü. der SLActive®Modifikation. Analog dazu ließ sich eine signifikant geringere periimplantäre Knochenmineralisation der SLA®-Implantate nachweisen. Der höher mineralisierte Knochen bei den SLActive ®-Implantaten hat wahrscheinlich auch hier zu einer geringeren Nachweisbarkeit von Kollagen I geführt. Zu diesem frühen Zeitpunkt der Implantateinheilung scheint die SLActive®-Oberfläche also Vorteile hinsichtlich der Knocheneinheilung zu haben. Eine weitere Erklärung für die geringere Kollagen I-Expression der SLActive®-Implantate könnte die beschleunigte Osseointegration der SLActive-Oberfläche® liefern. Die hohe Hydrophilie dieser Oberfläche führt zu einer schnellen Migration von Blut und ossären Zellen und stabilisiert dadurch das Blutkoagulum nach der Implantatinsertion [143]. Dadurch kommt es zu einer beschleunigten initialen 48 Implantateinheilung [112, 143]. Insofern ist auch eine frühere Expression von Knochenmatrixproteinen wie z.B. dem Kollagen I zu erwarten. Womöglich lag das Expressionsmaximum bei den SLActive®-Implantaten schon vor dem 30. Tag, so dass zu diesem Untersuchungszeitpunkt aufgrund der schnelleren Heilungszeit nur noch geringere Kollagen I-Werte gemessen werden konnten. Zum Opferungszeitpunkt nach 90 Tagen ließ sich sowohl bei den gesunden als auch bei den diabetischen Tieren eine höhere Kollagen I-Expression der SLA®-Implantate im Vergleich zu den SLActive®-Implantaten finden. Die höheren Kollagen IWerte lassen sich durch den langsameren Heilungsprozess der SLA-Oberfläche erklären, wodurch es zu einer länger anhaltenden Kollagen I-Expression kommt. In unserer Studie zeigte sich bei den diabetischen Tieren mit SLActive ®Beschichtung nach 30 Tagen und mit SLA®-Beschichtung nach 90 Tagen eine ggü. der Kontrollgruppe verringerte Osteocalcin-Expression. He et al. konnten in einer Studie an diabetischen Mäusen ebenfalls eine reduzierte OsteocalcinExpression nachweisen [62], wohingegen Verhaeghe et al. zwar von verminderten Serum-Osteocalcin-Werten berichteten, aber keine Änderungen des KnochenOsteocalcins beobachteten [159]. Die verminderte Osteocalcin-Expression des diabetischen Knochens lässt sich auf eine reduzierte osteoblastäre Aktivität rückführen [131], die sich in unserer Studie auch bei der periimplantären Knochendichte und dem Knochen-Implantat-Kontakt angedeutet hat. Lu et al. konnten in diesem Zusammenhang eine verminderte Osteocalcin-mRNAExpression nachweisen [87]. Als mögliche Ursache der verminderten Osteocalcin-Expression könnten auch die anfangs beschriebenen AGEs in Frage kommen [131]. So konnten Zayzafoon et al. und Botolin & McCabe zeigen, dass osteoblastäre Zellen unter hyperglykämischen Bedingungen eine veränderte Genexpression zeigen, die u.a. in einer Reduktion der Osteocalcin-Expression resultiert [16, 171-172]. Betrachtet man die zeitliche Expression von Osteocalcin, so ließ sich bis auf die diabetische SLA®-Gruppe ein Anstieg der Osteocalcin-Expression zum zweiten Opferungszeitpunkt finden. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Osteocalcin ein Marker der späten Osteoblastenaktivität ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Osteocalcin-Expression mit dem Mineralisationgrad des Knochens korreliert [133]. Insofern war aufgrund der höheren Mineralisation zum zweiten 49 Opferungszeitpunkt auch eine erhöhte Osteocalcin-Expression festzustellen. Beim Vergleich der beiden Implantatoberflächen ergibt sich ein uneinheitliches Bild. Die SLActive®-Oberfläche weist nach 90 Tagen im diabetischen Knochen eine annähernd gleiche Osteocalcin-Expression auf wie in der gesunden Kontrollgruppe, was auf den hohen Mineralisationsgrad des periimplantären Knochens zurückzuführen ist. Zudem ist ein Anstieg der Osteocalcin-Expression bei der SLActive®-Oberfläche sowohl bei den gesunden als auch bei den diabetischen Tieren zu beobachten, was vor dem Hintergrund, dass Osteocalcin einen späten osteoblastären Marker darstellt, nachvollziehbar ist. Demgegenüber stehen zwei signifikante Unterschiede in der Osteocalcin-Expression, die sich nur schwer erklären lassen. Zum einen sind das die erhöhten Osteocalcin-Werte der SLA-Oberfläche der diabetischen Tiere ggü. der gesunden Kontrollgruppe nach 30 Tagen. Zum anderen ließ sich eine signifikant höhere Osteocalcin-Expression der SLA-Implantate ggü. der SLActive-Implantate bei den diabetischen Tieren nach 30 Tagen finden. In beiden Fällen wäre eigentlich mit verminderten Osteocalcin-Werten zu rechnen gewesen. Die Ursache für die erhöhte Osteocalcin-Expression konnte in unserem Arbeitskreis nicht geklärt werden. Hierbei muss angemerkt werden, dass die Regulation der Knochenbildung auf molekularer Ebene bislang nur wenig verstanden ist, da diese Prozesse von einer Vielzahl an Faktoren beeinflusst werden [147]. Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass der Diabetes im vorliegenden Modell die Osseointegration dentaler Implantate negativ beeinflusst. Dies zeigt sich sowohl in einer verminderten periimplantären Knochenmineralisation als auch in einem verringerten Knochen-Implantat-Kontakt. Pathologische Veränderungen sind dabei auch auf der Ebene der Knochenmatrixproteine zu beobachten. Die steigende Zahl an Diabetikern wird den implantologisch tätigen Zahnarzt in Zukunft immer mehr vor die Frage stellen, wie sich die Implantattherapie und der Implantaterfolg bei diesen Patienten verbessern lässt. Wie unsere Daten zeigen, hat die neue SLActive ®-Oberfläche einen positiven Effekt auf die Implantateinheilung im diabetischen Knochen. Die Oberflächenmodifizierung stellt dabei einen vielversprechenden Ansatz dar, Heilungsvorgänge unkomplizierte im kompromittierten Knochen zu verbessern. Die Herstellung und Anwendung könnte dieser Form der 50 Verbesserung der Implantateinheilung in Zukunft einen hohen Stellenwert einräumen. 51 7 [1] Literaturverzeichnis Aarden EM, Wassenaar AM, Alblas MJ, Nijweide PJ. (1996) Immunocytochemical demonstration of extracellular matrix proteins in isolated osteocytes. Histochem Cell Biol. 106(5):495-501. [2] Adell R, Lekholm U, Rockler B, Brånemark PI. (1981) A 15-year study of osseointegrated implants in the treatment of the edentulous jaw. International Journal of Oral Surgery. 10(6):387-416. [3] Ahmed N, Thornalley PJ. (2007) Advanced glycation endproducts: what is their relevance to diabetic complications? Diabetes Obes Metab. 9(3):233-245. 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PBS PMMA ROI SLA Tiff WHO American Diabetes Association 3-Amino-9-Ethylcarbazol advanced glycation endproduct bone gamma carboxyglutamate protein binary digit bone volume/tissue volume ratio dots per inch Ethylendiamintetraacetat Extrazellularmatrix Interleukin 1β Interleukin 6 Labeled-Streptavidin-Biotin Methoxyethylacetat messenger Ribonucleinsäure Osteocalcin post operationem Potassium buffered salt solution Polymethacrylmethacrylat region of interest sandblasting with large grit followed by acid etching tagged image file format World Health Organization 74 9 Anhang Färberezept Kollagen I manuell: 3 x 20 min 5 x 3min 3 min 20 min 10 min 3 x 2 min 3 x 2 min 25 min 25 min 3 x 2min im Autostainer: 15 min 15 min 20 min 60 min 15 min 15 min 8 min 4 min 10 min Entacrylierung in MEA absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%) Aqua dest Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung Ausspülen unter fließendem Leitungswasser Aqua dest DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4 Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 95°C Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0 DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4 Avidin (DAKO X0590) Spülen mit Aqua dest Biotin (DAKO X0590) Spülen mit Aqua dest Proteinblock (DAKO X 0909) Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent Spülen mit Aqua dest biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A) Spülen mit Aqua dest Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B) Spülen mit Aqua dest Chromogen RED (DAKO K5005) Spülen mit Aqua dest Chromogen RED (DAKO K5005) Spülen mit Aqua dest manuell: 5 min 5 min 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) Ausspülen unter fließendem Leitungswasser Aqua dest Mit Aquatex eindecken 75 Färberezept Osteocalcin manuell: 3 x 20 min 5 x 3min 3 min 20 min 10 min 3 x 2 min 3 x 2 min 25 min 25 min 3 x 2min im Autostainer: 15 min 15 min 30 min 60 min 15 min 15 min 8 min 6 min 10 min Entacrylierung in MEA absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%) Aqua dest Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung Ausspülen unter fließendem Leitungswasser Aqua dest DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4 Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 100°C Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0 DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4 Avidin (DAKO X0590) Spülen mit Aqua dest Biotin (DAKO X0590) Spülen mit Aqua dest Proteinblock (DAKO X 0909) Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent Spülen mit Aqua dest biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A) Spülen mit Aqua dest Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B) Spülen mit Aqua dest Chromogen RED (DAKO K5005) Spülen mit Aqua dest Chromogen RED (DAKO K5005) Spülen mit Aqua dest manuell: 5 min 5 min 5 min Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301) Ausspülen unter fließendem Leitungswasser Aqua dest Mit Aquatex eindecken 5 min Aqua dest Mit Aquatex eindecken wasser 76 10 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dr. Karl Andreas Schlegel für die freundliche Überlassung des Themas und für die Unterstützung bei der Verfassung der Dissertation bedanken. Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam möchte ich für die Möglichkeit danken, die Doktorarbeit an der Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgischen Klinik der FAU Erlangen - Nürnberg durchführen zu können. Ein besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn Dr. med. dent. Cornelius von Wilmowsky für die engagierte Betreuung und die fachliche Unterstützung. Mein ganz persönlicher Dank gilt meinem Projektpartner Tobias Möst für die freundschaftliche und erfolgreiche Zusammenarbeit. Ich danke Frau S. Schönherr, Frau H. Heider und Frau E. Diebel für die wertvolle Einarbeitung und die tatkräftige Unterstützung im Labor. Darüber hinaus möchte ich all jenen danken, die mit Rat und persönlicher Unterstützung zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben. Ganz besonders danke ich meinen lieben Eltern, die mir mein Studium und damit auch diese Arbeit ermöglicht haben. Meiner Mutter bin ich für die liebevolle Unterstützung in jeglicher Hinsicht sehr verbunden. 77 11 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Christian Seidl Geburtsdatum und -ort: 21.07.1985 in Passau Wohnort: Rosenstr. 1, 91781 Weißenburg in Bayern Eltern: Markus Seidl, Schreinermeister Erika Seidl, geb. Freier, Schneiderin Geschwister: Florian Seidl, Donauhof-Werkstätten Passau (Werkstatt für Behinderte / WfB) Staatsangehörigkeit: deutsch Schulbildung 1992-1996: Grundschule Haselbach 1996-2005: Auersperg Gymnasium Passau-Freudenhain 06/2005: Allgemeine Hochschulreife Berufsausbildung 2005-2006: Wirtschaftsingenieurwesen-Studium 2006-2011: Studium der Zahnmedizin 03/2007: Naturwissenschaftliche Vorprüfung 08/2008: Zahnärztliche Vorprüfung 10/2009 - 06/2011: Anstellung als studentische Hilfskraft in der Zahnklinik 1 – Zahnerhaltung und Parodontologie 03-04/2010: Famulatur am Addis Ababa College of Dental Sciences und am Zewditu Memorial Hospital in Addis Ababa / Äthiopien 07/2011: Staatsexamen und Approbation als Zahnarzt 08-09/2011: Famulatur am Department of Oral and Maxillofacial Surgery und am Department of Maxillofacial Prosthetics der Mahidol University in Bangkok / Thailand seit 10/2011: Vorbereitungsassistent Praxis Dr. Schönwälder in Weißenburg in Bayern
