Protokoll

Mikrobiologiepraktikum von
Blatt 1 von 9
Mikrobiologisches Praktikum
des
Studiengang Chemieingenieurwesen
von:……………Stefan Bosse
geb. am:………18.08.1979
in:………………Schkeuditz
Eingereicht am: 25.03.2004
Betreuer: Prof. Ackermann ,HTW Dresden(FH)
Prof. Drewes-Alvarez, HTW Dresden(FH)
Mikrobiologisches Praktikum Prof. Drewes-Alvarez
14.05.2016
Mikrobiologiepraktikum von
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14.05.2016
Abkürzungsverzeichnis:
bzw………….beziehungsweise
PCA……Plate Count Agar
min…………..Minute
z………...Anzahl Kolonien
d.h…………...das heißt
Ps……….Petrischale
WaP…………Wasserprobe
z.B………zum Beispiel
AG……………Agar-Gelantine-Medium
A…………Agar-Medium
Definitionen:
Gram: Eine Eigenschaft von Bakterien ,welche abhängig vom grundsätzlichen
Aufbau der äußeren Zellwand ist. Es gibt grampositive und gramnegative.
Gewässergüteklassen nach HÖLL:
Güteklassen
I
II
III
IV
Humanpathogen: für den Menschen gefährlich.
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Kolonieanzahl/ml
<102
<104
<105
>106
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14.05.2016
Protokoll A1
Termin:09.03.2004
Gramfärbung von Bakterien siehe Arbeitsblatt 1
Einleitung:
Die Gramfärbung dient dem Kenntlichmachen und damit möglichen Unterscheiden
von Bakterien in grampositiv bzw. gramnegativ.
Material und Methode:
1. Auftragen eines Films von Bakterienkolonien auf einen Objektträger
mittels Impföse.
2. Hitzefixierung in Bunsenbrennerflamme.
3. Färben mit 0,5% Kristallviolett(1 min) ,Spülen mit Lugolscher Lösung.
4. 1 min in Lugolscher Lösung, Waschen mit Wasser.
5. Objektträger mit 95% Ethanol spülen, waschen mit Wasser.
6. Gegenfärbung mit 0,5% Safraninlösung (1 min),waschen mit Wasser
7. Trocknen unter Raumtemperatur.
Ergebnisse:
Von den zu untersuchenden 4 Kolonienarten waren 2 gramnegativ,
1 grampositiv und eine konnte den Hefen zugeordnet werden entfällt also bei der
Bewertung.
Kolonienbezeichnung
Xanthomonas
Clavibacter
Typ. B
Typ C
Zuordnung
gramnegativ
grampositiv
gramnegativ
Keine Bakterien
Interpretation:
Durch kleine Vergrößerungen des Lichtmikroskops war es meist nicht möglich eine
korrekte Unterscheidung zwischen grampositiv und negativ zu treffen. Zu
empfehlen ist hier eine relativ große Vergrößerung und ein Differenzieren in der
Dicke des aufgetragenen Films. (d.h. manche Bereiche können aufgrund ihrer
Dicke nicht zur Bewertung herangezogen werden)
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14.05.2016
Protokoll A2
Termin:09.03.2004-12.03.2004
Bestimmung Koloniezahl Wasserproben siehe Arbeitsblatt 2
Einleitung:
Die Bestimmung der Koloniezahl von Bakterien in Wasserproben, mittels
Kultivierung auf PCA, dient der Einschätzung der Wasserprobe hinsichtlich ihrer
mikrobiologischen Qualität.
Aufgrund dieser Bestimmung ist ein Einordnen in die jeweilige Gewässergüteklasse
möglich.
Material und Methode:
1. Probennahme: geschehen durch Labor (Elbe)
2. Nährbodenvorbereitung: Herstellen und Ausgießen von Nährböden gemäß
Arbeitsblatt. (pH auf 7,0±0,1)
3. Herstellen Verdünnungsreihe von Wasserproben mit steriler physiologischer
Kochsalzlösung (2,125 g NaCl/l[1:4]) durch 1ml Probe auf 9ml Lösung.
4. Aus allen 4 Verdünnungsstufen jeweils 2x0,1ml auf PCA Nährböden pipettiert
und mit Drigalsky-Spatel gleichmäßig verteilt.
5. Bei 20°c ca. 4 Tage bebrütet.
Ergebnisse:
Wertetabelle: Ausgezählte Kolonienanzahl.
Verdünnung
z von Ps 1
z von Ps 2
z Mittel
z/ml WaP
-1
2
6
4
4*102
-2
6
1
3,5
3.5*103
-3
0
0
0
0
-4
0
0
0
0
Interpretation:
Nach der hier ermittelten Anzahl von Bakterienkolonien pro ml Wasserprobe, lässt
sich diese Probe der Gewässergüteklasse II, nach HÖLL, zuordnen.
Allerdings ist davon auszugehen das durch mein erstmaliges Umgehen mit dem
Drigalsky-Spatel, dieser unzureichend abgekühlt war, wodurch Bakterien abgetötet
wurden.
In den Verdünnungsstufen -3 und -4 wurden keine Bakterien gefunden.
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Protokoll A3
Termin:09.03.2004-12.03.2004
Bestimmung Koloniezahl Wasserproben siehe Arbeitsblatt 3
Einleitung:
Die Bestimmung der Koloniezahl von Bakterien in Wasserproben, mittels
Kultivierung auf Nährböden, dient der Einschätzung der Wasserprobe hinsichtlich
ihrer mikrobiologischen Qualität.
Durch das Einstellen einer best. Bebrütungstemperatur und das Verwenden
verschiedener Nährböden lassen sich bestimmte spezifische Bakterienkolonien
auszählen. (z.B. humanpathogene bei 36°C)
Material und Methode:
1. 0,1ml der Wasserprobe auf jeweils 4 Ps des Mediums AG und A pipettiert.
(Wasserprobe: UV bestrahltes Brunnenwasser)
2. Jeweils 2 Ps von AG und A bei 20°C und jeweils 2 Ps bei 36°C bebrütet für ca.
4 Tage.
Ergebnisse:
Bei der Auszählung nach 4 Tagen ergab sich folgendes:
z Ps 1(AG)
z Ps 2(AG)
z mittelwert(AG)
z Ps 1(A)
z Ps 2(A)
z mittelwert(A)
z gesamtmittelwert
z pro ml
20°C
89
101
95
201
14
107,5
101,25
10125
36°C
119
23
71
295
313
304
187,83
18783
Interpretation:
1. Die kleinen Werte lassen sich wieder auf die gleichen Fehler wie oben
zurückführen.(siehe Protokoll A2)
2. Die Gewässerqualität des UV bestrahlten Brunnenwassers entspricht nicht den
Bedingungen für Trinkwasser. (20 Kolonien pro ml bei 20°C und 100 pro ml bei
36°C)
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Protokoll A4a
Termin:11.03.2004-12.03.2004
Isolation von Mikroorganismen aus Pflanzenmaterial
siehe Arbeitsblatt 4
Einleitung:
Die Kultivierung von oberflächensterilisierten befallenen Pflanzenteilen dient der
Identifizierung von Bakterien und Pilzen innerhalb des Teiles.(hier Lorbeerkirsche)
Material und Methode:
1. Sterilisation der Pflanzenteile in Natriumhypochlorid.
2. Kultivieren von frischen Anschnitten auf Nährboden.
3. bei ca. 36°C 1Tag bebrütet.
Ergebnisse:
Keine Veränderung feststellbar
Interpretation:
Mögliche Ursache: zu kurze Bebrütungszeit oder zu starke Sterilisierung.
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14.05.2016
Protokoll A4b
Termin:11.03.2004-12.03.2004
Isolation von Einzelsporen siehe Arbeitsblatt 4
Einleitung:
Die Isolation von Einzelsporen ist für Rasseuntersuchungen notwendig.(hier
befallene Rosenblätter)
Material und Methode:
1. Befallene Pflanzenteile in feuchte Kammer legen um Sporen neu zu bilden.
2. Kleine Sporenmassen in sterilen Wasser suspendiert und auf Wasseragar
ausplattiert.
3. Bebrüten bei 36°C für circa 1-2 Tage.
4. Überimpfen von Sporen auf Nährmedium.
Ergebnisse:
Unter Mikroskop sichtbare Bildung von Sporenteppichen.
Interpretation:
Eine Überimpfung scheint möglich.
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14.05.2016
Protokoll A5
Termin:11.03.2004
Zellzählung von Hefe siehe Arbeitsblatt 5(1,2,3)
Einleitung:
Die Zählung mittels Zählkammern von verschiedenen Verdünnungsstufen eines
Objekts, hier Bäckerhefe dient der Feststellung von Zellkonzentrationen oder dem
Einstellen von bestimmten Suspensionen.
Material und Methode:
1. Herstellen Hefesuspension (1g auf 100mg sterile NaCl Lösung)
2. Homogenisieren der Suspension durch Schütteln.
3. Herstellen Verdünnungsreihe der Suspension bis 10-5
4. Auszählen der Verdünnungsstufen unter Mikroskop, dabei wurde für -1 und -2
die Thoma-Kammer verwendet für die kleineren die Fuchs-Rosenthal Kammer.
Ergebnisse:
Das Auszählen erfolgte für die 5 Verdünnungsstufen durch Auszählen von 4
Großquadraten von 4 Kammern.
Verdünnung
-1
-2
-3
-4
-5
1.Kammer
33,43,54,45
1,3,6,5
9,13,18,14
0,1,0,1
0,0,0,0
2.Kammer
34,43,40,24
8,3,4,12
13,13,13,17
4,1,6,4
0,0,0,0
3.Kammer
43,41,29,35
5,3,0,3
17,11,8,14
2,2,2,2
0,0,0,0
Mittlere Zellzahl
/Großquadrat
39,5
4,5
12,75
2,25
0
Zellzahl pro
ml
9,875*106
1,125*106
6,375*104
1,125*104
0
4.Kammer
42,33,41,52
5,5,4,5
18,26,8,15
3,3,2,3
0,0,0,0
Daraus folgt:
Verdünnung
-1
-2
-3
-4
-5
Zellzahl pro
1g Hefe
9,875*109
---------------------
Interpretation:
Die Verdünnungsstufe 5 war nicht zählbar, d.h. es waren keine Zellen zu erkennen.
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14.05.2016
Protokoll A6
Termin:11.03.2004
Bestimmung Lebendzellzahl in Hefesuspensionen
siehe Arbeitsblatt 5(4)
Einleitung:
Durch Anfärben der Suspension mit Methylenblau ist zusätzlich zum feststellen der
Zellkonzentration ein Ermitteln des Lebendanteils möglich.
Dies geschieht dadurch dass der Farbstoff in tote Zellen eindringen kann und diese
dadurch blau erscheinen.
Material und Methode:
1. Von Verdünnungsstufe welche bei A5 gut zählbar war (-2) wird die
nächsthöhere für die Zählung verwendet.
2. 0,5ml dieser Stufe werden mit 0,5ml Methylenblau 5min inkubiert.
3. Danach mit sterilen Wasser auf 5ml aufgefüllt.
4. Die Auszählung erfolgt mittels der Thoma-Kammer mit Unterscheidung der
Zellen, aufgrund des Farbstoffes.
Ergebnisse:
Bei der Auszählung der neuen Verdünnungsstufe(-2) die wieder jene ist, welche gut
zählbar ist ergibt sich folgendes:
Gesamtzellenanzahl
Lebendzellenanzahl
1.Kammer
4,4,2,4
3,3,2,2
2.Kammer
1,3,2,2
1,3,2,1
3.Kammer
5,3,5,5
3,2,2,4
4.Kammer
2,5,2,7
1,5,1,5
Daraus ergibt sich eine mittlere Zellzahl von 3,5(8,75*105 pro ml) und eine mittlere
Lebendzellzahl von 2,5(6,25*105 pro ml).
Das entspricht wiederum 71% Anteil der lebenden Zellen am
Gesamtzellenvolumen.
Interpretation:
Durch den Anteil der Lebendzellen lässt sich entweder auf ein Alter der Hefe oder
eine fehlerhafte Behandlung beim Zählen schließen sowie einen natürlichen
Sterbeanteil.
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