Die Rolle des p38 - Signalweges bei Ras

Die Rolle des p38 - Signalweges bei Ras - vermittelten
Tumorinvasionsprozessen
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Eberhard Karls Universität
zu Tübingen
vorgelegt von
Konrad Arnulf Otto BINDER
2016
Dekan:
Professor. Dr. B. Autenrieth
1. Berichterstatter:
Professor Dr. M. Knipper
2. Berichterstatter:
Professor Dr. H - P. Rodemann
1
Widmung
Meiner Familie
2
Inhaltsverzeichnis
Widmung
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
1.0
Einleitung
1.1
Epidemiologie der Tumorsterblichkeit und Rolle des Ras-Onkogens
1.2
Übersicht über den physiologischen Ras-/MAPK-Signalweg
1.2.1 Rolle der MAPK JNK in der Zellregulation
1.2.2 Rolle der MAPK ERK in der Zellregulation
1.2.3 Rolle der MAPK p38 in der Zellregulation
1.3
Übersicht über den pathologischen MAPK/SAPK p38 Signalweg nach
onkogener Ras-Transformation
1.4
Fragestellung
2.0
Material und Methoden
2.1
Zell-Linien zur Analyse der Ras-/MAPK-Signaltransduktion
2.1.1 Nicht transfizierter NIH-3T3 Klon
2.1.2 Stabil mit H-Ras-transfizierter NIH-3T3 Klon
2.2
Handhabung von Mausfibroblasten
2.2.1 Mausfibroblasten in Kultur nehmen
2.2.2 Einfrieren der Mausfibroblasten
2.2.3 Splitting und Auszählen der Mausfibroblasten
2.2.4 Zell-Lysierung zur Gewinnung der Ras-/MAPK-Signalproteine
2.2.5 Analyse der Konzentration von Ras-/MAPK-Signalproteinen
2.2.6 Proteinkonzentration der der Ras-/MAPK-Signalproteine
2.3
Transfektionen von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des Ras-/
MAPK-Signalweges
2.3.1 Transiente Transfektion von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des
Ras-/ MAPK-Signalweges
3
2.3.2 Stabile Transfektion von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des Ras/ MAPK-Signalweges
2.4
Plasmide und Vektoren zur Transfektion von NIH-3T-Zellen
2.4.1 Verwendete Plasmide zur Transfektion von NIH-3T3-Zellen
2.4.2 Verwendete Vektoren zur Transfektion von NIH-3T3-Zellen
2.5
Immunoblot zur Analyse des Ras-/ MAPK-Signalweges
2.5.1 Immunoblot
2.5.2 verwendete Puffer
2.5.3 Herstellung von Acrylamidgel
2.5.4 Durchführung der Elektrophorese
2.5.5 Western Blot zum Nachweis von Urokinase in NIH-3T3-Zellen
2.5.6 Western Blot zum Nachweis von p38 in NIH-3T3-Zellen
2.5.7 Immunopräzipitation von p38 in NIH-3T3-Zellen
2.5.8 Immunopräzipitation von Ras in NIH-3T3-Zellen
2.6
In-vitro Invasionsassay zur Analyse der invadierter NIH-3T3-Zellen
2.6.1 Funktionsprinzip
2.6.2 Auswertung der Invasionsaktivität von NIH-3T-Zellen mittels MTT-Test
2.6.3 Auswertung der Invasionsaktivität von NIH-3T3-Zellen mittels konfokaler
Laserscanmikroskopie
3.0
Ergebnisse
3.1
Etablierung eines Verfahrens zur Detektion der Ras-/p38- Signalkaskade
in immortalisierten NIH-3T3-Zellen (Mausfibroblasten)
3.1.1 Analyse der Rolle von p38 für das Invasionsverhalten von immortalisierten
NIH-3T3 Zell-Linien
3.2
Analyse und des Ras- /p38-vermittelten Signalweges in immortalisierten
NIH-3T3 Zellen
3.2.1 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels Ras-Immunopräzipitation
3.2.2 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels p38-Western Blot
3.3.3 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels p38-Immunopräzipitation
3.3.4 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels u-PA Western Blot
3.3.5 Analyse der Ras-vermittelten Induktion des u-PA-CAT-Promoters auf
mRNA-Ebene (Fremdergebnis innerhalb der Arbeitsgruppe)
4
3.3
Analyse des Ras-/ p38-vermittelten Signalweges in immortalisierten NIH3T3 Zellen im in-vitro-Invasionsassay:
4.0
Diskussion
4.1
Die Isoform p38α MAPK vermittelt eine Ras-induzierte UrokinaseExpression in NIH-3T3 Zellen
4.2
Die Invasionspotenz von Mausfibroblasten wird über eine Ras-/p38αinduzierte u-PA-Aktivierung erhöht
4.3
Die Invasionspotenz infiltrierender Mausfibroblastenzellen Auswertung
kann im in-vitro-Invasionsassays verfolgt werden
5.0
Zusammenfassung
6.0
Literaturverzeichnis
7.0
Erklärung zum Eigenanteil
8.0
Veröffentlichung
9.0
Danksagung
5
Abkürzungsverzeichnis
Ala:
AP-1:
APS:
ARF:
ATF:
Arg:
Asn:
BAC:
CAM:
CAT:
CDK:
CHOB:
CIP:
CKI:
CRE:
CREB:
CSF:
Cys:
DMSO:
ECL:
EGF(R):
Egr-1:
ERK:
EZM:
FAK:
GAP:
GEF:
GFP:
Gln:
Glu:
Gly:
GRB 2:
FOXM1:
HAEC:
His:
IGF:
Ile:
INK 4:
JNK(K):
Lasp 1:
Leu:
LPS:
MMAC:
MAPK:
MEK:
Met:
Alanin
Activating Protein 1
Ammoniumpersulfat
Alternative reading frame
Activating Transcription Factor
Arginin
Asparagin
Bacterial Artificial Chromosome
Cell Adhesion Molecule
Chloramphenicol Transferase
Cyclin dependant kinase
CREB homologous Protein
CDK interacting protein
Cyclin dependant kinase inhibitors
CAMP responsive element
cAMP Response Element Binding Protein
Colony Stimulating Factor
Cystein
Dimethylsulfoxide
Chemiluminescence Detection Kit
Epidermal Growth Factor (Receptor)
Early growth response 1 Transkriptionsfaktor
Extracellular regulated Kinase
Extrazellulärmatrix
Focal Adhesion Kinase
GTP’ase activating Protein
Guanine exchanging Factor
Green Fluorescent Protein
Glutamin
Glutaminsäure
Glycin
Growth Factor Receptor - bound Protein 2
Forkhead box M1
Human Artificial Episomal Chromosome
Histidin
Insulin like Growth Factor
Isoleucin
Inhibitors of CDK 4
C - Jun terminale Kinase (Kinase)
Lim, Actin and SH3 Domain Protein
Leucin
Lipopolysaccharide
Mutated in multiple advanced cancers
Mitogen activated Protein Kinase
MAPK Kinase
Methionin
6
MKK:
MKKK:
MLB:
MT1 - MMP:
MTT:
NFB:
LSM:
PAC:
PAI:
PBS:
PDGF(R):
Phe:
PP5:
Pro:
PTEN:
RBD:
SAPK:
SDS-Page:
Ser:
SOS:
TEMED:
Thr:
TNF:
TPA:
TRE:
Trp:
Tyr:
u-PA :
u-PAR:
Val:
VCAM:
YAC:
MAPK Kinase
MAPK Kinase Kinase
Mg - Lysis/Wash buffer
Membrane - type 1 Matrixmetalloproteinase
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide
Nuclear transcription factor B
Laserscanmikroskop
P1 artificial chromosome
Plasminogen activator inhibitor
Phosphate buffered saline
Platelet Derived Growth Factor (Receptor)
Phenylalanin
Serin/Threonin Protein Phosphatase type 5
Prolin
Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosom ten
Ras binding domain
Stress activated Protein Kinase
Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Serin
Son of Sevenless
N,N,N’,N’ - Tetramethylethylenediamine
Threonin
Tumornekrosefaktor
Phorbol 12-tetradecanoate 13-acetate
TPA responsive element
Tryptophan
Tyrosin
Urokinase Plasminogen Activator (= Urokinase)
Urokinase Plasminogen Activator Receptor
Valin
Vascular cell adhesion molecule
Yeast Artificial Chromosome
7
1.0 Einleitung
1.1
Epidemiologie der Tumorsterblichkeit und Rolle des Ras-Onkogens
Nach Angabe des Bundesamtes für Statistik der Bundesrepublik Deutschland
belief sich der Mortalitätsanteil bösartiger Neubildungen im Jahr 2014 auf 25,8%
(223 758 Menschen) der Gesamtmortalität und stellte die zweitgrößte Gruppe
der Todesursachen (Abb. 1). Dabei bewegt sich der Anteil der Tumorsterblichkeit
mit 25% seit Jahren auf stabilem Niveau. Vor diesem Hintergrund ist die molekulare Aufschlüsselung der mutagenen Signaltransduktion mit ihren pleiotropen Effekten weiterhin ein aktuelles Ziel.
Die maligne Transformation ist plei-
A
otrop bedingt und führt über eine modifizierte Signalkaskade zu intra- und
extrazellulären Veränderungen des
Mitosezyklus, der Proteolyse oder
der Kontaktinhibition. Dabei spielen
die Inaktivierung rezessiver Tumorsupressorgene, die Aktivierung dominanter Proto-Onkogene durch Mutation zu Onkogenen oder Mutationen
B
Sterbefälle insgesamt 2014
ICD-10
C34
C50
C18
C25
C80
C16
C22
C20
C71
C67
Bösartige Neubildung
der Bronchien und der Lunge (Lungen- und Bronchialkrebs)
der Brustdrüse (Brustdrüsenkrebs (Mamma))
des Kolons (Dickdarmkrebs)
des Pankreas (Bauchspeicheldrüsenkrebs)
ohne Angabe der Lokalisation
des Magens
der Leber und der intrahepatischen Gallengänge
des Rektums (Mastdarm oder Enddarm)
des Gehirns
der Harnblase
Gestorbene Anteil in %
45 049
17 804
16 899
16 615
9 665
9 610
7 686
7 605
6 001
5 692
19,5
7,7
7,3
7,2
4,2
4,2
3,3
3,3
2,6
2,5
Abb. 1: Angabe des Statistischen Bundesamtes Wiesbaden von 2015, Aufgliederung der
Todesursachen (A) und Tumorart (B)
8
der DNS wie Translokation, Punktmutation, Deletion, Amplifikation oder Demethylierung eine Rolle. Diese Zusammenhänge wurden bereits früh erkannt und
werden bis heute in der aktuellen Literatur aufgegriffen (Uemara et al.,
2003;Simin et al., 2004;Nasr et al., 2003;Sangrar et al., 2015).
Als biologischer Endpunkt findet sich über die akquirierte metastatische Kompetenz die Fähigkeit zur Migration, Adhäsion und Invasion. Hernández-Alcoceba
und Kollegen veranschaulichten die sequentiellen Schritte (abgewandeltes Modell siehe Abb. 2), auch in der neueren Literatur wurde das Modell 2014 von Capp
und Kollegen erneut benannt (Hernández et al., 2000, Capp et al., 2014).
Dabei hat sich eine prominente Rolle des Ras-Onkogens mit nachfolgend aktivierter MAPK-Signalkaskade für Tumorinvasionsprozesse gezeigt: So wird aktuell eine Tumorassoziation in 30% der Gesamttumoren postuliert. Dabei spielt die
onkogene Transformation von N-Ras, K-Ras und H-Ras in absteigender Relevanz eine Rolle (Zhang et al., 2016).
Abb. 2: Multifaktorielle Tumorgenese und Erwerb metastatischer Kompetenz nach Hernández
- Alcoceba, R. und Mareel, M. et al., 2000, eigenständig modifiziertes Schaubild
9
1.2
Übersicht über den physiologischen Ras-/MAPK-Signalweges
Das Ras-Protein ist ein kleines, membranassoziiertes, monomeres Guaninnucleotid-bindendes Protein (G-Protein)
mit einer Molekularmasse von 21 kDa.
Kennzeichen
ist
seine
intrinsische
GTP’ase Aktivität, die durch Hydrolyse
das aktive GTP in seine inaktive Form
(GDP) überführt (Bourne et al., 1991). Um
eine dreidimensionale Vorstellung des inaktiven und aktiven Ras-Proteins zu ermöglichen, ist unter der Abbildung 3 ein 3-
Abb. 3: Darstellung des inaktiven und
aktiven Ras-Proteins, Karnoub et al.
2008
D Modell von der Arbeitsgruppe Karnoub und Kollegen dargestellt (Karnoub and
Weinberg RA, 2008). Das Ras-Protein ist verantwortlich für die intrazelluläre
mitogene Aktivierung der Proteinkinasewege (MAPK). Zu diesen zählen die
Signalproteine ERK (extrazellulär regulierte Kinase), JNK (c-Jun-terminale
Kinase) und p38 (Lei et al., 2014), die an der physiologischen Zellregulation
beteiligt sind. Der MAPK-Signalweg ist bereits lange im Fokus der Forschung und
kann mitogen oder stress-assoziiert aktiviert werden (Cano und Mahadevan,
1995; Han et al., 1995).
Den MAPK und SAPK Signalwegen ist die kaskadenartige Phosphorylierung
nachgeordneter Signalproteine durch Threonin- und Serinkinasen („Downstream
Targets“) mit Aktivierung von Transkriptionsfaktoren gemein (Cobb and
Goldsmith, 1995). Sie erfahren einen unterschiedlichen Aktivierungsweg: Für die
MAPK bedarf es mitogener Stimuli wie EGF, PDGF, Insulin, Phorbolester bis hin
zu Thrombin, die zu einer Phosphorylierung des Tyrosinrezeptor führen (Ray and
Sturgill, 1988;Denhardt, 1996). Die mitogene Aktivierung zeigt nur eine geringe
Induktion SAPK vermittelter Aktivität (Kyriakis et al., 1994). Als adäquater
Stimulus der stress-aktivierten Proteinkinase zählen inflammatorische Cytokine
wie TNF oder Interleukin 1 (Kyriakis and Avruch, 1996;Alam et al., 2015) ebenso
wie Osmoseschwankung, Anwesenheit von toxischem LPS (Han et al., 1995)
oder UV-Licht (Widmann et al., 1999;Dérijard et al., 1994). Deaktivierung der
10
Vereinfachtes
Mitogener Stimulus
Schaubild
EGF/ PGF
Stress - Stimulus
UV-Licht, Osmose, TNF, Hitzeschock
Zellmembran
GRB 2
Ras
Rac1 / Cdc 42
MEKK 1-4 / TAK 1
Raf (MKKK)
MKK 4, 7
MEK 1, 2
MAPK
ERK
Zellkern
MAPK / SAPK
JNK
Proliferative Geninduktion
z. B. via Transkriptionsfaktor
Jun, Fos, c-myc, FOXM1
MKK 3, 6
MAPK / SAPK
p38
Stress-induzierte Geninduktion
z. B. via Transkriptionsfaktor
AP-1
Abb. 4: schematische Übersicht über die Regulation der MAP, eigene Übersicht
phosphorylierten Kinasen erfolgt über Einzel- oder Dualphosphatasen mit Serinund Threoninspezifität oder Threonin- und Tyrosinspezifität, die als MAP Kinase
Phosphatasen bezeichnet werden (Keyse, 2000;Hunter, 1995). Darüber hinaus
können die Kinasen über ihre Aktivität stimulierenden oder inhibierenden Einfluß
den Signalfluß modulieren (Denhardt, 1996). Eine Übersicht über die drei
MAPK/SAPK Signalwege sind in Abbildung 4 aufgeführt.
Durch die MAPK-Kinasen, namentlich MAPK p38, wurde eine Regulation für
Apoptose, Adhäsion und Migration sowie Proliferation und Angiogenese über
eine abhängige Aktivierung von Wachstumsfaktoren beschrieben (Lin et al.,
2016).
Zu den MAPK-abhängig regulierten Transkriptionsfaktoren zählen c-jun, fos, AP1, SAP 1, Elk 1 und c-myc und FOXM1 oder CHOP (Denhardt et al., 1996;
Widmann et al, 1999; Behren et al., 2010; Iurlaro et al., 2015). Hierüber werden
Zellwachstum, Zellproliferation und der Zellzyclus reguliert. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass ein Regelkreis zwischen der MAP Kinasen und „upstream“
11
Regulatoren wie beispielsweise dem Tyrosinkinasenrezeptor oder dem SOS
Protein, dem Raf-1 Protein oder den MEK’s besteht (Seger and Krebs, 1995).
Die
Stuktur
der
MAP-Kinasen
wurde bereits fühzeitig aufgedeckt.
Dabei zeigte sich für die MAPK
ERK und p38 eine hohe strukturelle
Homologie, wie in Abbildung 5
dargestellt (Wang et al., 1997).
Zwischenzeitlich konnte durch das
Verfahren der Kernspinresonanzspektroskopie eine weiterführende
Bewertung der dreidimensionalen
Struktur
erreicht
werden.
Die
Substrat-Bindungszone wird als D-
Abb. 5: Gegenüberstellung von der MAPK ERK 2
mit der MAPK/SAPK p38, Aufsicht auf die
Bindungsdomäne des Substrates: Nachweis
deutlicher Homologie nach Wang, Z. et al., 1997
(„Docking“) oder KIM- („kinase interacting motif“) Motiv benannt. Durch das
wachsende Verständnis der dreidimensionalen Struktur der MAP-Kinasen wird
eine über das D-Motiv hinausgehende Bedeutung einer Konformationsänderung
im Hinblick auf die Bindungsspezifität postuliert (Peti und Page, 2013).
A
B
B
A
Abb. 6: A links MAPK p38 (braun) mit D-Motiv (grün), A Mitte unten links mit Bindung an STEP
(STEP=Striatal-Enriched protein tyrosine Phosphatase) und Mitte unten rechts DUSP 16
(DUSP= dual spezifische Phosphatase), B rechts MAPK ERK (beige) mit D-Motiv (grün), B
Mitte oben links Bindung HePTP (HePTP= Protein tyrosine phosphatase non-receptor type),
B Mitte oben rechts ETS-1 (ETS= E Twenty Six Transkriptionsfaktor), Peti und Page, 2013
12
Beispielhaft ist in Abbildung 6 die Konformationsänderung von der MAPK 38 und
der MAPK ERK in Abhängigkeit von den Bindungspartnern dargestellt, wie von
Peti und Page 2013 beschrieben.
1.2.1 Rolle der MAPK JNK in der Zellregulation
Die MAPK JNK (c-Jun-terminal kinase) wird durch die zweifache Phosphorylierung an ihrem Motiv T-P-Y (Thr183-Pro-Tyr185) aktiviert (Shun et al., 2005) und
phosphoryliert ihrerseits die Transkriptionsfaktoren bevorzugt an ihrer SH2 Domäne. Es konnte ein regulativer Einfluß auf die Tumorsupressorgene DPC4 und
p53 (Phosphorylierung an Thr-83) sowie die Transkriptionsfaktoren NFAT, ATF2, c-myc und c-Jun nachgewiesen werden (Sabatini et al., 2005;Widmann et al.,
1999;Buschmann et al., 2001). Dabei zeigen die aus den drei Genen JNK 1, 2
und 3 resultierenden bislang bekannten 10 Isoformen, die durch unterschiedliches „Splicing“ entstehen, divergierende Substratspezifität (Yoshida et al.,
2004;Dong et al., 2001). Die MAPK JNK wird überwiegend durch stressassoziierte Stimuli wie Osmoseschwankung, Bestrahlung oder durch Cytokine
wie TNFα und Interleukin über eine Phosphorylierung aktiviert. Neben einer
Stressinduktion kommt es ebenfalls Ras-abhängig zu einer Aktivierung der
MAPK JNK und seiner Isoformen (Widmann et al., 1999;Dérijard et al., 1994).
Biologischer Endpunkt ist neben Apoptose und Cytokininduktion der Einfluss auf
Zellwachstum und Zelldifferenzierung. Es hat sich gezeigt, dass die biologische
Funktion
der
MAPK
JNK
je
nach
Isoform
und
Gewebevorkommen
unterschiedliche Effektor moduliert (Takaesu et al., 2000;Seki et al., 2012).
1.2.2 Rolle der MAPK ERK in der Zellregulation
Die MAPK ERK („extracellular regulated kinase“) wird vom Ras-Protein reguliert
und über eine duale Phosphorylierung aktiviert. Über abhängige Transkriptionsfaktoren, z. B. AP-1, Elk 1 oder c-Jun/c-Fos, wird die Zellproliferation und der
Zellzyklus reguliert (Denhardt et al., 1996, Widmann et al., 1999; Kidger et al.,
2016). Es ist bekannt, dass ein Regelkreis zwischen der MAPK ERK und
übergeordneten Signalebenen wie dem Tyrosinkinasenrezeptor, dem SOS
Protein, dem Raf-1 Protein oder den MEK’s besteht (Seger and Krebs, 1995).
13
Wie bei der MAPK JNK beschrieben, ist ein wesentlicher Unterschied die
führende mitogene Aktivierung.
1.2.3 Rolle der MAPK p38 in der Zellregulation
Das Signalprotein p38 zählt zu den mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK),
die einer Regulation des Ras-Proteins unterliegen. Die Proteinkinase besteht aus
zwei Domänen: Die N-terminale überwiegend aus -Faltblattstruktur, die Cterminale überwiegend aus -helikaler Struktur. Ihre Aktivierung erfolgt über
einzelne oder duale Phosphorylierung. Das Phosphorylierungsmotiv (Thr180 - Gly
- Tyr182) sitzt zwischen beiden Domänen (Raingeaud et al., 1995; Wang et al.,
1997; Peti und Page, 2013). Über transkriptionale Einbindung, beispielsweise cJun/C-Fos, CHOBB, CREB (Kyriakis and Avruch, 2001), wird Einfluss auf die
Migration oder den Zellzyklus bis hin zur Apoptose vermittelt.
Es wurden bislang vier Isoformen der MAPK p38 gefunden (Shi et al, 2002): Es
handelt sich um die Isoformen p38, p38, p38 und p38. Bekannt ist ein ubiquitäres Vorkommen der p38-Isoformen  und , p38 hingegen wird muskelspezifischer, p38 betont in Haut-, Nieren- und Intestinalgewebe beschrieben (Grossi
et al., 2014).
1.3
Übersicht über den pathologischen MAPK/SAPK p38 Signalweg nach
onkogener Ras-Transformation
Das Ras-Protein ist ein Proto-Onkogen, das nach mutagener Transformation in
einer Vielzahl von gewebeübergreifenden Tumoren nachgewiesen wird
(Mekkawy et al., 2014). Ras liegt in drei Isoformen, H-Ras, K-Ras und N-Ras vor
(Takai et al., 2001), für die auch virale (vRas) Onkogene mit hoher Homologie
zum zellulären Onkogen existieren (Parada et al., 1982).
Eine onkogene Transformation, z. B. Punktmutationen, führt durch konstitutive
Hochregulierung der Ras-Aktivität zu einer fehlenden Funktionskontrolle (Stacey
and Kung, 1984;Calvert et al., 1996).
Als eine der Ursachen wurden mehrere beteiligte Mutationen in 3 Kodons - Kodon
12, 13 und 61- identifiziert, die zu einer konstitutionellen Hochregulation als Ras14
Onkogen führen (Herreros-Villanueva et al., 2014;Jeong et al., 2015;Wei et al.,
2005;Zhang et al., 1994).
Es konnte belegt werden, dass eine onkogene Transformation von Ha-Ras durch
Austausch von Glycin an Kodon 12 mit jeder beliebigen Aminosäure mit Ausnahme von Prolin induzierbar ist. Ferner wurde früh erkannt, dass neben der
Punktmutation auch über Amplifikation oder über eine abnorme GDP Bindung
des Ras-Proteins eine Hochregulation erfahren kann (Seeburg et al.,
1984;Barbacid, 1987;Lowy and Willumsen, 1993). Es resultiert eine RasOnkogen vermittelte Aktivierung der MAPK ERK, JNK und p38 (Marshall et al.,
1996).
Für eine vollendete mutagene Transformation ist, neben einem Einfluss auf die
Adhäsion, Migration und Invasion, ebenfalls eine Proteolyse erforderlich.
So wurde bereits gezeigt, dass ein Tumor erst eine metastatische Kompetenz
erwerben muss (Hernández et al, 2000; Mareel et al., 2003; Yilmaz und
Christofori, 2010): Dazu zählen die Auflösung interzellulärer Adhäsionsverbindungen, Proteolyse der Extrazellulärmatrix und Neovaskularisierung (Porte et al.,
1998) sowie am Ort der Fernmetastasierung Extravasation und Invasion
(Gaßmann et al., 2004).
Adhäsionsproteine dienen dem Zusammenhalt von Zellen und sind evolutionär
über die Arten hinweg konservativ exprimiert worden. Dabei lassen sich die Adhäsionsproteine in die Gruppe der Zell-Zell adhäsiven sowie die Zell-Matrix
adhäsiven Proteine unterscheiden (Hynes and Zhao, 2000;Yamada, 1991). Ein
wichtiger Vertreter sind die Cadherine: Eine Beteiligung des Cadherins E bei der
interzellulären Adhäsion und Cadherin N bei Adhäsionsprozessen mit der
Extrazellulärmatrix beschrieben ist belegt (Cavarello und Christofori, 2004).
Cadherine sind kalziumabhängige transmembranäre Proteine, die über dimere
Aggregation mit ihren extrazellulären Anteilen als Adhäsionspartner dienen.
Intrazellulär besteht eine Anbindung an das Cytoskelett (Troyanovsky, 2005).
Differenziert wird zwischen den klassischen Cadherinen (E-, N- und P-Cadherin)
mit ihrer transmembranären Proteinstruktur sowie einem untypischen TCadherin, das bei identischer extrazellulärer Domäne keinen cytosolischen und
transmembranären Anteil aufweist (Zhou et al., 2002). Cadherine sind strukturell
für Desmosomen und „Tight-Junctions“ von Bedeutung (Garrod et al.,
15
2002;Schneeberger and Lynch, 2004).
Ein weiteres Beispiel für adhäsives
Potential ist die MAPK p38 abhängige
Expression der VCAM-1 (Ju et al.,
2002), die physiologischerseits eine
endovaskuläre Adhärenz von Leukozyten ermöglicht. VCAM konnte unter spe-
Tab. 1: Übersicht über Zell- und Matrix
adhäsive Proteine (Yamada et al,
1991; Hynes et al, 2000)
Zell-Zell adhäsive Proteine
Cadherine, Connexine und
Immunglobulin - Superfamilie
die
Zell-Matrix adhäsive Proteine
Integrine,
Laminine,
Entactine,
Fibronectine, oder Thrombospondin
und Proteoglycane, Cadherine
zifischer Inhibition des MAPK p38
Signalweges unterdrückt werden konnte (Ju et al., 2002). Die klinische Relevanz
einer VCAM-vermittelte Metastasierung wurde für Brustkrebszellen belegt
(Huang et al, 2016). Beispielhafte Vertreter der Adhäsionsproteine sind in Tabelle
1 aufgeführt.
Die MAPK p38-vermittelte Modifikation der Zelladhäsion wird von Walsh und Kollegen in humanen Kolonkarzinomzellen beschrieben: Unter phosphoryliertem
p38-Protein lag die FAK („Focal Adhesion Kinase“) vermehrt in ihrer
dephosphorylierten inaktiven Form vor, was in einer reduzierten adhäsiven
Kompetenz der Tumorzelle resultierte (Walsh et al., 2003).
Neben dem zelladhäsiven Verlust spielt die Migration der Zellen eine weitere
Rolle bezüglich der metastatischen Kompetenz.
Die Migration ist auch ein physiologischer Prozess, der zum Beispiel in der Wundheilung oder von Immunzellen genutzt wird (Franz et al, 2002). Sie beruht auf der
Funktion der Aktinfilamente, im Zusammenspiel mit der Tyrosinkinase FAK (fokale Adhäsionskinase) für eine cytoskelettale Bewegung zu sorgen. Neben den
Aktinfilamenten zählen Intermediärfilamente ebenfalls zum Cytoskelett. Sie sind
für die mechanische Stabilität der Zelle verantwortlich und sind ebenso wie die
Mikrotubuli ein zentrales Element des Cytoskelettes (Etienne-Manneville,
2004;Strelkov et al., 2003).
Für die Invasion von Zellen ist die cytoskelettale Kontraktion für die Beweglichkeit
ebenfalls bedeutsam. In-vitro konnte eine FAK-assoziierte Migration auf Kollagen
Typ IV Fasern nachgewiesen werden. Die FAK-Aktivität ist über den Ras-/ERK
Signalweg reguliert (Franitza et al., 2000; Staff et al., 2001; Friedl et al., 2000;
Crowe et al., 2004) und führt durch chemotaktische Reize zur Zellmigration. Für
kolorektale Adenokarzinomzellen erfolgte über Interleukin 17 eine Expression
16
von Chemokinrezeptoren (Chien et al., 2015). Die Migration ist in Abbildung 7
beispielhaft bebildert.
Mit Ausnahme der Immunzellen, ist eine Invasion solider Tumorzellen in umgebenes Gewebe ohne proteolytische Degradierung der extrazellulären Matrix nicht
möglich. Die Proteasen untergliedern sich entsprechend der Affinität des katalytischen Zentrums in Obergruppen von Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteinasen und können nach pathogener Zelltransformation zu einer hydrolytischen Spaltung der Matrixproteine führen (Stetler-Stevenson and Yu, 2001). Die
Urokinase (u-PA) zählt zu den Serinkinasen und reguliert physiologisch die Proteolyse von Plasminogen zu Plasmin. Sie verhält sich zu dem „plasminogen activator inhibitor type“ (PAI-1 und PAI-2) antagonistisch. Beteiligt ist u-PA an der
Chemotaxis, Migration oder Angiogenese, aber auch bei Tumorinvasion. Eine
hohe Urokinase-Aktivität korreliert mit einem geringeren Überleben bei Brustkrebs (Lampeli et al., 2015; Rouch et al., 2016).
Neben dem klinischen Aspekt, wird u-PA häufig bei Fragen nach proteolytischer
Aktivität in Westernblots eingesetzt.
Lamellipodien
Aktinreiche
Zone
Mikrotubuli
Filopodien
Zentrosom
Fokales
Adhäsionsprotein
Streßfilamente
A
B
Abb. 7: Schematische Darstellung von aktininduzierter Migration (A) sowie von Filo- und
Lamellipodien (B) nach Etienne-Manneville et al, 2004 und Lauffenburger et al, 1996
17
1.4
Fragestellung
Janulis und Kollegen hatten immortalisierte Mausfibroblasten (NIH-3T3 Zellen)
auf ihr Verhalten einer Urokinase-Expression (u-PA) unter konstitutionell hochreguliertem Ras-/MAPK ERK/JNK Signalweg untersucht (Janulis et al., 1999). Im
Ergebnis war eine durch Ras-/MAPK ERK vermittelte Expression an Urokinase
und Cathepsin in Mausfibroblasten nachgewiesen worden. Für die MAPK JNK
zeigte sich dieser Zusammenhang nicht und für die p38-Isoformen war der Sachverhalt noch nicht geklärt.
Die Dissertation widmete sich die Frage, ob in immortalisierten Mausfibroblasten
eine Ras-/p38 MAPK vermittelte Urokinase-Expression erfolgt und ob diese mit
einer bestimmten p38 Isoform korreliert werden kann. Ergänzend sollte in in-vitroInvasionsassays das assoziierte Invasionsverhalten untersucht werden.
18
2.0
2.1
Material und Methoden
Zell-Linien zur Analyse der Ras-/MAPK-Signaltransduktion
2.1.1 Nicht transfizierter NIH-3T3 Klon
Bei den verwendeten NIH-3T3-Zellen handelte es sich um Mausfibroblasten (von
ATCC, Molsheim, Frankreich). Sie dienten einerseits mit ihrer nativen Ras-Aktivität als Negativkontrolle bei Invasionsassays und andererseits als Substrat für
transiente Transfektionen. Sie wurden in Medium aus „McCoys 5A Modified Medium“ mit einem Zusatz von 5 ml Ab/Am sowie 50 ml „fetal calf serum“ inkubiert.
Als Transfektionsmedium wurde zusatzfreies Medium verwendet. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C unter 5% CO2 Zusatz in Kultur gehalten.
2.1.2 Stabil Ras-transfizierter NIH-3T3 Klon
Bei den stabil mit EJ vH-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen (Dr. Matthias Simon,
Universitätsklinik Bonn) war die Aktivität von H-Ras konstitutiv hochreguliert.
Sie wurden inkubiert in “Dulbeccos Mod Eagle Medium” mit einem Zusatz von
5ml Ab/Am sowie 50 ml FCS. Das Transfektionsmedium entsprach zusatzfreiem
Medium. Die Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C unter 5% CO 2 Zusatz in
Kultur gehalten.
2.2
Handhabung der Mausfibroblasten
2.2.1 Mausfibroblasten in Kultur nehmen
Die aufgetaute Zellsuspension wurde mit dem zellspezifischen Medium auf ca.
10ml aufgefüllt, durchmischt und in eine Petrischale überführt. Nach 24 Stunden
erfolgte ein Mediumwechsel, um überschüssiges DMSO zu entfernen.
Nach Ausbildung eines Zellrasens wurden die trypsinierten Zellen in Kulturflaschen überführt.
2.2.2 Einfrieren der Mausfibroblasten
Nach Abzentrifugieren wurden die Zellen in frischem zellspezifischem Medium
re-suspendiert und anschließend mit einer Gabe von 500µl DMSO versetzt und
bei -80 Grad Celsius eingefroren
19
2.2.3 Splitting und Auszählen der Mausfibroblasten
Bei konfluiertem Zellrasen wurde der Mediumüberstand abgesaugt und verworfen. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit Trypsin gewaschen, um die
Bodenadhäsion der Zellen aufzuheben und restliches FBS zur
Neutralisierung von Trypsin auszuwaschen. Die im Trypsin- und
Mediumgemisch
suspendierten
Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen
überführt
und
bei
Abb. 8: Zählkammer Neubauer improved mit
zwei Zählgittern (oben) und Großaufnahme
(unten)
3500U/min über 5 Minuten abzentrifugiert. Nach Absaugen des über
dem Zellbodensatz überstehenden
Mediums war dieses bis auf zu einem Volumen von 10ml durch frisches zu ersetzen. Nach letztmaliger Resuspension der Zellen wurden ca. 100µl in eine neue Kultur1 mm
flasche überführt, in die zuvor 25ml
des zellspezifischen Mediums pipettiert worden war.
Bei Ausplatieren (Aussaat) definierter Zellzahlen wurde die Zählkammer
(Neubauer improved, 2 Zählnetze, beispielhaft Abb. 8) mit 10µl der Zellsuspension beschickt und ausgezählt. Der jeweilige Verdünnungsfaktor wurde
dabei berücksichtigt.
2.2.4 Zell-Lysierung zur Gewinnung der Ras-/MAPK-Signalproteine
Für die Proteingewinnung fand der aus 10 ml RIPA-Puffer, 10µl Aprotinin und
20µl Pepstadin A bestehende Lysatpuffer Verwendung. Nach Absaugen des Mediums aus der Petrischale und nach einmaligem Waschen mit PBS wurde auf
den Zellrasen 1ml des Lysatpuffers pipettiert und anschließend 30Minuten im
Kühlschrank inkubiert. Sodann wurden die Zellen mittels eines Zellschabers abgelöst; das so erhaltene Zell-Lysate wurde für 10 Minuten bei 14.000rpm
20
abzentrifugiert. Der Überstand
enthielt
das
Proteingemisch
Tab. 3: Transfektionsplan für den u-PA-CatPromoter Versuch
und wurde für alle weiteren Ver-
Ansatz
1.
2.
Kontrolle
suche genutzt.
p38 (µg)
0,1
1,0
0
p38 (µg)
0,1
1,0
0
p38 (µg)
0,1
1,0
0
p38 (µg)
0,1
1,0
0
H - Ras (µg)
5,0
5,0
0
pcDNA3 (µg)
0,9
0
1,0
pSV2neo (µg)
0
0
4,0
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)
u-PA Konstrukt (µg)
3
3
3
mit
Total (µg)
9
9
8
Lipofectamin (µl)
27
27
24
2.2.5 Analyse
der
Konzen-
tration von Ras-/MAPK-Signalproteinen
Die
Proteinbestimmung
der
Proben wurde nach der TPRO562
Prozedur
einer
von
Sigma
Mischung
aus
Bicinchoninc Acid Solution und
Kupfer (II)-Sulfat Pentahydrat
im Verhältnis 55:1 durchgeführt. Dieser Mischung wurde Protein im Verhältnis
1:100 zugeführt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 370 Celsius folgte eine
photometrische Auswertung des Substrates bei 570nm im Quantitativtest gegen
eine Standardgerade.
2.2.6 Proteinkonzentration der RAS-/MAPK-Signalproteine
Zur Anreicherung des Proteingehaltes in den Proben wurden die Zell-Lysate in
Zentrifugenröhrchen (überführt und durch 25 Minuten Zentrifugation bei 5000g
aufkonzentriert.
2.3
Transfektionen von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des Ras-/
MAPK-Signalweges
2.3.1 Transiente Transfektion von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des
Ras-/MAPK-Signalweges
Als Versuchsanordnung wurden Fibroblasten in sechs verschiedenen Variationen transient transfiziert. Dazu zählten die vier negativen Isoform-Mutanten
p38, p38, p38 und p38, H-Ras sowie als Leervektoren zur Kontrolle pcDNA3
gemeinsam mit pSV2neo.
21
Tab. 2: Transfektionsplan für transient mit p38 Isoform-Mutanten transfizierte NIH-3T3
Zellen. pSV2neo ist der Leervektor für H-Ras
1
p38 (µg/µl)
µg
µl
2
3
5
6
1,75
4
2,28
1,805
4
2,22
p38 (µg/µl)
µg
µl
1,335
4
3,0
p38 (µg/µl)
µg
µl
1,59
4
2,52
p38 (µg/µl)
µg
µl
H - Ras (µg/µl)
µg
µl
4
0,5
4
8,0
0,5
4
8,0
0,5
4
8,0
0,5
4
8,0
pcDNA3 (µg/µl)
µg
µl
0,5
4
8,0
1,54
4
2,60
pSV2neo (µg/µl)
µg
µl
1,54
4
2,60
0,495
4
8,6
GFP (µg/µl)
µg
µl
1,465
1,5
1,03
1,465
1,5
1,03
1,465
1,5
1,03
1,465
1,5
1,03
1,465
1,5
1,03
1,465
1,5
1,03
Total (µg)
9,5
9,5
9,5
9,5
9,5
9,5
Lipofectamin (µl)
28,5
28,5
28,5
28,5
28,5
28,5
Bei den Negativmutanten handelte es sich um Proteine ohne aktivierbare Domäne mit der Struktur von p38-Isoformen. Nach Kotransfektion mit der H-RasMutante, lassen sich Rückschlüsse über Bedeutung der einzelnen p38-Isoformen
für das Invasionsverhalten der Zellen ziehen. Als Kontrolle wurden die gleichen
Zelllinien mit den Leervektoren für H-Ras (pSV2neo) und p38 (pcDNA3)
kotransfiziert, um die basale Invasionsaktivität ohne Beeinflussung durch die
eingesetzten codierten Vektoren darzustellen.
Für die transiente Transfektion wurde Lipofectamin und DNA im Verhältnis 3:1
(Transfektionsplan siehe Tab. 2) eingesetzt. Dafür wurden NIH-3T3 Zellen am
Vortag der Transfektion je 300.000 Zellen ausplatiert. Lipofectamin (und die
22
einzusetzende DNS-Menge wurden in je 100µl serumfreies Medium (SFM) überführt und über 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mit 800µl SFM aufgefüllt, wurde dieser Transfektionsansatz auf die zuvor zweifach mit SFM gewaschenen Zellen pipettiert und nach einer fünfstündigen Inkubationszeit durch 2 ml
10% FBS-haltiges Zellkulturmedium ersetzt und für weitere 48h Stunden im Brutschrank inkubiert.
2.3.2 Stabile Transfektion von NIH-3T3-Mausfibroblasten zur Analyse des Ras/-MAPK-Signalweges
Bei stabilen Transfektionen (siehe Tab. 3) wurde analog zu den transienten verfahren. Darüber hinaus folgte die Inkubation jedoch in Selektionsmedium mit
Geneticin (G 418 Sigma-Aldrich). Anschließend wurden einzelne Zellnester mit
„Cloning Zylinder“ (Sigma-Aldrich) isoliert, nach Waschen mit PBS und mit
Trypsin gelöst sowie in jeweils eine neue Petrischale mit Selektionsmedium überführt. Wiederum wurden angewachsene Zellnester wie beschrieben isoliert und
überführt. Da die Lebensdauer transient transfizierter Zellen ohne Selektionsdruck bereits auf ca. 100 Stunden begrenzt ist, selektierten sich über mehrere
Passagen hinweg stabile Klone.
2.4
Plasmide und Vektoren zur Transfektion von NIH-3T3-Zellen
2.4.1 Verwendete Plasmide zur Transfektion von NIH-3T3-Zellen
Plasmide sind ringförmige, extrazelluläre DNS oder RNS Basenstränge, die codierte Eigenschaften unter einer Spezies sowie verschiedenen Speziesgruppen
in Pro- und Eukaryonten in die DNS des Wirtorganismus integrieren können.
Neben retroviralen Vektoren gibt es Phagozytose-basierte Transfektionen und
die Lipofektion (Felgner et al., 1987;Loyter et al., 1982;Cone and Mulligan, 1984).
Die Transfektionen erfolgten mit Lipofectamin.
23
Tab. 4: Übersicht über verwendete Konstrukte und Vektoren sowie deren Bezugsquelle
Mutation / Protein
EJH-Ras
Austausch
von
Leervektor
Glycin pSV2neo
Bezugsquelle
Literatur
Dr. Tainsky
(Nicolson et
(M.D. Ander-son al., 1990)
gegen Valin auf Codon 12
Cancer Center,
Housten, TX)
p38-Isoform
Dominante Negativmutan- pcDNA3
Dr. Han
(Jiang et al,
Negativ-
te durch Austausch von
(Scripps Re-
1996 ; Huang
mutanten
Thre gegen Ala und Tyr
search Institute,
et al, 2000; Li
gegen Phe an Phosphory-
La Jolla, CA)
et al, 1996;
lierungs-motiven
(entspr.
Wang et
TGY Sequenz)
u-PA-Cat-
CAT
al,2000)
PSV0
Dr. Blasi
(Nerlov et al,
Promotor
(University of
1992; Sidenius
(Fremdlei-
Milan, Italy)
et al, 2003)
Dr. Lauer
(Wybranietz et
(University of
al, 1999)
stung)
GFP Protein
Green fluorescent protein
pcDNA3
Tuebingen,
Germany)
2.4.2 Verwendete Vektoren zur Transfektion von NIH-3T3-Zellen
Vektoren definieren sich als transmembranäres Transportvehikel der fremden
Nucleinsäuren. Neben Plasmiden fallen Viren, Bakteriophagen, oder Cosmide (Phage mit zwei cos-sites) und BAC’s, YAC’s, oder HAEC’s (Vorteil: große Abschnitte von Fremd DNS bis 300kb transfizierbar) unter die Vektordefinition
(Zhang et al., 2001; Murray et al., 1983; Shizuya et al., 1992; Ioannou et al., 1994;
Sun et al., 1994).
Die als Negativmutanten und Reporter codierten Konstrukte sowie die eingesetzten Vektoren wurden käuflich erworben und sind in Tabelle 4 aufgeführt.
24
2.5
Immunoblot zur Analyse des Ras-/MAPK-Signalweges
2.5.1 Immunoblot
Die Proben wurden auf ihren Proteingehalt normalisiert und zu gleichen Anteilen
mit 2-fachem Laemmli Puffer versetzt, 45 Sekunden aufgekocht, abzentrifugiert
und auf 10%ges SDS Gel aufgetragen.
2.5.2 Verwendete Puffer
Als Lysepuffer wurde der RIPA Puffer (50mM Tris HCL mit pH 7,4, 1% NP4O
40%, 0,25% NaDoc, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM
NaF) verwendet, ferner der Transferpuffer (25mM Tris (pH 6,8), 0,2M Glycin, 80%
dH2O, 20% Methanol, vor Gebrauch auf 40 Celsius abkühlen), Elektrophoresepuffer (0,2M Glycin, 25mM Tris in d H2O) sowie als Blockpuffer PBS (80% NaCl,
15% Na2HPO4, 2% KCl, 3% KH2PO4, zu lösen in zweifach destilliertem H2O, anschließend zu autoklavieren).
2.5.3 Herstellung von Acrylamidgel
Verwendung fanden zwei Acrylamidgele: Das Sammelgel (3,48ml Acrylamid
(30%, Bio-Rad), 3,6ml dH2O, 2,5ml Tris 100µl SDS, 100µl APS (Ammoniumpersulfat, 10%), 10 µl TEMED (Fluka Biochemika) und das Trenngel (1,32ml Acrylamid (30%), 6ml dH2O, 2,5ml Tris (0,5 M, pH 6,8), 100µl SDS (Moreira-Carboni
et al., 2015), 27µl APS (Moreira-Carboni et al., 2015), 9µl TEMED).
Die Gele wurden in die vorbereiteten Blotkammern gegossen.
Durch einen eingesetzten Kamm entstanden nach Aushärten Probentaschen.
Die Gele polymerisierten abhängig von der Umgebungstemperatur nach bis zu
30 Minuten aus.
2.5.4 Durchführung der Elektrophorese
Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte über 1 Stunde bei 150
Volt, der Proteintransfer auf die PVDF Membran bei 100 Volt über 45 Minuten.
Zum Transfer der Proteine wurde das Acrylamidgel auf eine Methanol- und
Transferpuffer-exponierte Nitrocellulosemembran luftblasenfrei aufgelegt und mit
transferpuffergetränktem Filterpapier zu jeder Seite gegen die Anoden-respektive
Kathodenmembran abgedeckt.
25
2.5.5 Western Blot zum Nachweis von Urokinase in NIH-3T3-Zellen
Nach erfolgter Auftrennung des Proteingemisches und dem Transfer auf die
PDVF Membran wurde diese in 5%igem PBST für 12h bei 4°C inkubiert. Der
primäre Antikörper („goat polyclonal IgM antibody“, Santa Cruz Biotechnology)
wurde in einer Verdünnung von 1:500 zugegeben und nach 12h durch wiederholtes Waschen mit PBST entfernt. Nach Inkubation mit dem sekundären AK
(„antimouse polyclonal IgG antibody“, Santa Cruz Biotechnology Antikörper) über
1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Proteinbanden mittels ECL
(Amersham) nach Herstellerangaben visualisiert.
2.5.6 Western Blot zum Nachweis von p38 in NIH-3T3-Zellen
Verfahren wie beschrieben mit primärer p38 Antikörperinkubation („goat polyclonal IgG“, Santa Cruz Biotechnology, Katalognummer: sc-535-G) 1:500 und
weiterer Exposition mit dem sekundären Antikörper mit einer Verdünnung von
1:5000 über 1 Stunde. Visualisierung mittels ECL-System.
2.5.7 Immunopräzipitation von p38 in NIH-3T3-Zellen
Im Unterschied zum Western Blot wurde bei der Immunopräzipitation als vorgeschalteter Schritt in der eingesetzten Probe das zu untersuchende Protein mit
Antikörpern über einen definierten Zeitraum inkubiert. Die über ihre Antigendomäne an den phosphorylierten Anteil des aktivierten Proteins gebundenen
Antikörper wurden durch zeitgleiche Exposition mit 30 µl Protein-G-Agarose
(Roche) an diese mit ihrem Fc-Teil gebunden, und als Komplex aus Zielprotein,
gebundenem Antikörper sowie Agarose ausgefällt. Nach diesem Schritt folgte ein
Western-Blot (siehe oben).
Aktivität des Proteins p38: phosphoryliertes p38-Protein (pp38)
Die Immunopräzipitation mit p38 Antikörpern („goat polyclonal IgG“, Santa Cruz,
Katalognummer: sc-535-G) erfolgte bei 40 Celsius über Nacht, Blockpuffer in
4%igem Milchpulver in Kombination mit PBST über 1 Stunde bei 40 Celsius, pp38
Antikörper („mouse monoclonal IgM antibody“, Santa Cruz Biotechnology,
Katalognummer sc-7973 (1:200)), über Nacht bei 40 Celsius, anschließend
sekundärer Antikörper (1:5000) über 1 Stunde. Visualisierung via ECL-System.
26
2.5.8
Immunopräzipitation von Ras in NIH-3T3-Zellen
Die Bestimmung erfolgte mittels Ras-Analyse-Kit und erforderte eine andere
Acrylamidgelkonzentration für die Immunopräzipitation: Um eine optimale
elektrophoretische Auftrennung zu gewährleisten, enthielt das Trenngel eine höhere Acrylamidkonzentration (Wybranietz et al., 1999), um den Proteinkomplex
durch ein dichteres Acrylamidnetzwerk durch modifizierte Elektrophoresewanderung optimal darzustellen.
Das Ras-Assay wurde gemäß der Anleitung (des „Ras Activation Assay Kit“
(Upstate Biotechnology) durchgeführt: Nach Lyse mit 5xMLB (RAS Assay Kit:
125mM HEPES mit pH 7,5, 750mM NaCl, 5 % Igepal CA - 630, 50mM MgCl2,
5mM EDTA, 10% Glycerol) und Präzipitation mit 5µg Raf-1 RBD Agarose wurde
der Komplex aus Ras-GTP und RAF-RBD-Agarose („agarose beads“) nach zweimaligem Waschen mit Laemmli Puffer über 2 Stunden bei 25 0 Celsius mit PBS
geblockt. Anschließende Inkubation mit dem primären Antikörper (1:500) über
Nacht bei 40 Celsius sowie mit dem sekundären Antikörper (1:3000) über 2,5
Stunden bei Raumtemperatur. Nach erfolgter SDS Gelelektrophorese erfolgte die
Proteinvisualisierung mit Hilfe des ECL-Systems. Belichtet wurde zwischen 0,54 Minuten.
2.6
In-vitro-Invasionsassay zur Analyse der invadierten NIH-3T3-Zellen
Mit den bisher aufgeführten Methoden war es nicht möglich, den biologischen
Effekt von Ras und p38 vermittelter Invasionshemmung nachzuweisen.
Diese biologische Auswirkung des beeinflussten Ras-/MAPK-Signalweges
musste
durch
Invasions-
assays in Form der unterschiedlichen
Infiltrations-
kapazität der Zellen nachgewiesen werden. Die Invasions-
bzw.
Boydenkam-
Abb. 9: Boydenkammer mit Invasionskammer
(Chipperfield et al., 1985), Porenmembran (Membrane)
und Vertiefung für die Invasionskammer (Plate Well)
mern (Abb. 9) sowie das
Matrigel stammten von Becton Dickenson™. Die Auswertung der Invasionsversuche erfolgte mittels MTT-Test, die mikroskopische Auszählung der transient
27
transfizierten NIH-3T3-Zellen in der Boydenkammer erfolgte mit einem
konfokalen Laserscanmikroskop (LSM).
2.6.1
Funktionsprinzip
NIH-3T3-Zellen wurden in Boydenkammern auf Matrigel in definierter Zellzahl
gekühlt ausplatiert, da das Matrigel bei Raumtemperatur polymerisiert. Diese Invasionskammern verfügen über eine Membran, die eine Vielzahl an Poren von
8 µm Durchmesser aufweisen.
Anschließende Inkubation der Boydenkammern erfolgte über 60 Stunden im
Brutschrank bei 37° Celsius und 5% CO2-Anteil.
Die Verdünnung und die Menge des eingesetzten Matrigels sowie die Inkubationszeit des Ansatzes sind neben der biologischen Fähigkeit der Zelle weitere
konditionell beeinflussbare Größen auf das Invasionsverhalten. Spezifische
Versuchsbedingungen der beiden unterschiedlichen Invasionsassay-Ansätze
werden unter den verschiedenen Auswertungen abgehandelt.
2.6.2 Auswertung der Invasionsaktivität von NIH-3Z3-Zellen mittels MTT-Test
Die Auswertung erfolgte mittels des MTT (=3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5Diphenyltetrazoliumbromide) Tests und mithilfe eines Laserscanmikroskops.
Der MTT-Test beruht auf der Eigenschaft, dass vitale Zellen mit intakter
Atmungskette durch ihre Mitochondrien-Dehydrogenasen das Tetrazoliumsalz
MTT reduzieren und in einen photometrisch bei 570nm nachweisbaren, wasserunlöslichen MTT-Formazankomplex überführen, der in DMSO löslich ist.
Auf eine je nach Versuch variierend mit bis zu 50 µl Matrigel beschichtete Porenmembran eines „Control-Inserts“ wurden je Ansatz bis zu 100.000 stabil mit EJ
vH-Ras
transfizierte oder nicht-transfizierte Fibroblasten ausplatiert mit einer
Matrigelmenge von 50µl bei einem Verdünnungsfaktor von 1:20 nachfolgend
18,5 Stunden unter Brutschrankbedingungen inkubiert.
Zur gezielten Beeinflussung des Ras-/MAP-Kinasenweges konnte mit SB
203580 (Calbiochem) einem spezifischen Hemmstoff von p38 und p38, sowie
mit SB 202474 (Negativkontrolle: Calbiochem) ein verändertes Invasionsverhalten der Zellen beobachtet werden.
Anschließend folgte eine Auswertung der Zellverteilung im unteren sowie oberen
Kompartiment des „well-plates“ mittels MTT-Test (Sigma-Aldrich, 5 mg/ml).
28
Hierfür wurde in PBS gelöstes MTT (5mg/ml) 1:10 mit NIH-3T3-Medium verdünnt.
Nach Absaugen des Mediums wurden in das Körbchen 500 µl und in das „well“
1000 µl der MTT-Lösung pipettiert und über 45 Minuten im Brutschrank inkubiert
und anschließend wieder entfernt. Der Anteil der nicht invadierten Zellen wurde
gemeinsam mit dem Matrigel mit Wattestäbchen aufgenommen und in eine 1000
µl DMSO enthaltende Küvette überführt. Mit der Porenmembran der
Boydenkammer wurde nach Heraustrennen mit einem Skalpell gleichermaßen
verfahren.
Photometrisch wurden die Ansätze nach Durchmischen (vortexen) bei 570nm
gegen DMSO als Leerwert gemessen und die Zellen unterhalb der Membran als
Prozentsatz der Gesamtzellmenge angegeben.
2.6.3 Auswertung der Invasionsaktivität von NIH-3T3-Zellen mittels konfokaler
Laserscanmikroskopie
Das konfokale Laserscanmikroskop ist ein Lichtmikroskop, das mit einem Laserund Scannermodul gekoppelt ist.
Durch seine konfokale Eigenschaft sowie die Verarbeitungssoftware bietet es die Möglichkeit,
Proben dreidimensional auszuwerten. Dieses Merkmal beruht
auf der Fähigkeit, nicht nur eine
Fläche in der X- und Y-Achse
darzustellen, sondern zusätzlich
über eine Reduktion der Lichtreflexion auch aus darüber- und
darunterliegenden Schichten auf
eine Schnittebene fokussieren zu
können. Aufnahmen in der vertikalen Achse (Z-Achse) werden als
Z-Scan bezeichnet.
Abb. 9: Schematische Darstellung des
Funktionsprinzips eines konfokalen LSM nach
dem Onlinemanual von Zeiss
29
Die Invasionsversuche anhand der hier vorgenommenen Zellauszählung auszuwerten, ist zwar zeitintensiv, gleichwohl aber wegen weitaus größerer Genauigkeit dem MTT-Nachweisverfahren überlegen.
Für die Auswertung der Invasionsassays stellte das Anatomische Institut der
Universität Tübingen das Laserscanmikroskop 410 von Zeiss zur Verfügung
(Abb. 9).
Fibroblasten wurden transient mit EJ cH-Ras (in Codonposition 12 war das Glycin
durch Valin ersetzt) und dominanten p38 Isoform-Negativmutanten sowie den
entsprechenden Leervektoren für die Kontrolle transfiziert. Da bei transienter
Transfektion die Transfektionseffizienz lediglich zwischen 5-10% liegt, wurden
die Zellen zusätzlich mit Grün-fluoreszierendem Protein kotransfiziert, um bei der
Auswertung unter dem Laserscanmikroskop transfizierte Zellen identifizieren zu
können. Nach der Transfektion wurden die Zellen im Brutschrank über 60 Stunden inkubiert. Vor Aussaat der Zellen (50.000 je Ansatz) wurde die Membran des
„Control Inserts“ mit 5 µl Matrigel (Verdünnung 1:5) zwecks Porenverschluss beschichtet und über eine Stunde unter Brutschrankbedingungen inkubiert, nach
Aussaat weitere 24 Stunden.
Im Anschluss an die Inkubationszeit verblieben die unterschiedlichen Ansätze
zum Auszählen in ihrer Boydenkammer
im Inkubationsmedium. Um standardisiert
auszählen zu können, wurde die Kammer
auf dem Objekttisch im durchfallenden
Lichtstrahl zentriert und 100 Quadrate je
oberhalb
und
unterhalb
der
Poren-
membran ausgezählt (Abb. 10). Die sich
in diesen Quadraten befindenden Zellen
wurden sowohl oberhalb wie auch unterhalb der Porenmembran ausgezählt und
in einen prozentualen Infiltrationswert umgerechnet worden.
30
Abb. 10: Auszählung der Zellen in zwei
Ebenen oberhalb und unterhalb der
Porenmembran, jeweils 100 Quadrate
Durch transiente Transfektion der Mausfibroblasten mit H-Ras als Positivkontrolle
und der Kotransfektion mit den p38 Isoform Negativmutanten ergab sich eine differenzierte Aussage über die jeweilige Isoform assoziierte, invasionshemmende
Komponente. Dieser Versuch wurde in gleicher Konstellation zweimal durchgeführt.
Die Auswertung erfolgte nicht über den MTT-Test, da die mikroskopische Auszählung invadierter sowie nicht invadierter Zellen eine präzisere Auswertung ermöglichte. Die Zuordnung transfizierter NIH-3T3 und nicht transfizierter wurde durch
Kotransfektion mit GFP gewährleistet: Nur erfolgreich mit GFP kotransfizierte Zellen wurden in die Auswertung mit einbezogen.
31
3.0 Ergebnisse
3.1
Etablierung eines Verfahrens zur Detektion der Ras-/p38- Signalkaskade
in immortalisierten NIH-3T3-Zellen (Mausfibroblasten)
Stand der Forschung zu Beginn der Arbeit war, dass Ras-abhängige Tumorinvasionsprozesse in immortalisierten Mausfibroblasten (Zhao et al., 2016) über eine
ERK-vermittelte Expression von Urokinase und Cathepsin ausgelöst werden
(Janulis et al., 1999). Es war unklar, ob dieser über eine p38 Signalkaskade
vermittelt wird.
Um eine Ras-/p38-assoziierte Signaltransduktion zu untersuchen, wurden in der
vorliegenden Studie immortalisierte Mausfibroblasten-Linien herangezogen, die
bereits in unserer Arbeitsgruppe für stabile Transfektionen mit H-Ras sowie transiente Transfektionen mit H-Ras und p38 Isoform-Negativmutanten generiert
worden waren (Simon et al., 2001).
In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass die Invasionspotenz
von immortalisierten Mausfibroblasten über eine Signalkaskade vermittelt wird,
die eine vermehrte Urokinase-Aktivität während des Invasionsprozesses der
Zellen mit einschließt. Diese neuen Erkenntnisse wurden 2005 veröffentlicht
(Behren, Binder et al., Experimental Cell Research, 303 (2005) 321–330).
3.1.1 Analyse der Rolle von p38 für das Invasionsverhalten von immortalisierten
NIH-3T3 Zell-Linien
Primär sollte der Zusammenhang zwischen dem Ras-Protein, und der nachgeschalteten p38-MAPK-Signalkette auf die Tumorinvasion geprüft werden. Explizit
galt es hierbei auch zu klären, inwieweit eine Urokinase-Aktivität bei der Invasion
von Tumorzellen, über Ras- und p38- vermittelt, eine Rolle spielt.
Um die nachfolgenden Ergebnisse übersichtlich einzuordnen, sind die Analysen
nach biologischem und methodischem Aspekt in Abbildung 11 aufgeführt.
Es konnte auf eine Zell-Linie zurückgegriffen werden (NIH-3T3 von ATCC), die
nicht transfiziert als Kontrolle dienten (Negativkontrolle) und nach transienter
oder stabiler H-Ras-Transfektion als Positivkontrolle verwendet werden konnten
und bereits in unserer Arbeitsgruppe etabliert waren (Simon et al., 2001).
32
Fibroblasten wurden hierzu kultiviert und präpariert, wie unter Material und Methoden beschrieben. Anhand von Western Blots erfolgte der Nachweis der
Kaskadenproteine mit Hilfe der Immunopräzipitation. Hierbei wurden explizit solche Proteine präzipitiert, die durch Phosphorylierung nach Stimulation aktiviert
wurden.
Darüber hinaus wurde proteolytisches Korrelat im Western Blot eine UrokinaseExpression nachgewiesen. Diese Spezifität wurde unter Hemmung der Isoform
p38α validiert.

Ras-Immunopräzipitation

p38-Immunopräzipitation und Western Blot

Urokinase (u-PA) Western Blot und Promoter-Aktivität

In-vitro-Invasionsassay
Ras

Raf-1

MEK

p38

AP-1

Urokinase

Invasion
A
Abb. 11: Analysenübersicht zum Nachweis der Ras- und p38-abhängigen Induktion von
Tumorinvasion unter biologischem (A) und methodischem (B) Aspekt, Begriffserklärungen sind im Abkürzungsverzeichnis aufgeführt
B


Analyse mittels in-vitro Invasionsassays
o
Zellkulturen mit NIH-3T3-Zellen (Mausfibroblasten)
o
Quantifizierung der Invasionspotenz mittels konfokaler Mikroskopie
o
Quantifizierung der Invasionspotenz mittels Photometrie
Analyse mittels Immunoblot
o
Nachweis der Ras-/p38-Signalkaskade und Urokinase auf Proteinebene
mittels Western Blot oder Immunopräzipitation
o
Ras-vermittelte
Induktion
auf
mRNA-Ebene:
(Fremdergebnis innerhalb der Arbeitsgruppe)
33
u-PA-CAT-Promoter
Ergänzend erfolgte der Nachweis einer Ras-assoziierten Induktion einer u-PACAT-Promoter-Aktivität durch unsere Arbeitsgruppe, die erhobenen Untersuchungsergebnisse wurden mir zur Verfügung gestellt.
Der biologische Endpunkt einer möglichen vermehrten Invasionsrate wurde mit
in-vitro-Invasionsassays, wie in Material und Methoden beschrieben, überprüft.
In Folge sind die einzelnen Ergebnisse einer Ras-/p38-vermittelten Invasionspotenz in immortalisierten Mausfibroblasten durch Immunoblots und in-vitroInvasionsassays dargestellt.
3.2
Analyse des Ras-/p38-vermittelten Signalweges in immortalisierten NIH3T3-Zellen
3.2.1 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels Ras-Immunopräzipitation
Wesentliche Voraussetzung für die Fragestellung Ras-abhängiger Invasionsprozesse war ein Nachweis der induzierbaren Ras Aktivität in NIH-3T3 Zellen. Um
eine vergleichende Aussage über
vorliegendes phosphoryliertes Ras-
A
B
21 kDa
Protein in normalen wie transfizierten Zellpopulationen treffen zu kön-
Abb. 12:
nen, wurden stabil H-Ras transfi-
Ras-NIH-3T3
NIH-3T3
Ras-Immunopräzipitation, n=3
zierte Klone und nicht transfizierte Klone auf das Ras-/GTP Protein untersucht.
Die Expression von Ras wurde mit Hilfe eines Antikörpers im Western Blot Verfahren, wie in Material und Methoden beschrieben, nachgewiesen. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt. Eine Quantifizierung des Bandensignals wurde
nicht durchgeführt.
Wie in Abbildung 12 exemplarisch abgebildet, fällt nach Transfektion das Signal
des aktivierten Ras-Proteins in den mit H-Ras transfizierten Mausfibroblasten
(Abb. 12 A) im Vergleich zu dem nicht transfizierten Klon (Abb. 12 B) deutlich
stärker aus.
Zusammenfassend zeigte der mit Ras transfizierte Klon im Vergleich zu den nicht
transfizierten Fibroblasten eine visuell erhöhte Banden-Aktivität des phosphorylierten Ras-Proteins an.
34
3.2.2 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels p38 Western Blot
Zur Analyse der Ras-abhängigen
und p38-vermittelten Signalkette,
A
B
38 kDa
wurden nicht transfizierte sowie
stabil H-Ras transfizierte Fibroblas-
Abb.13:
ten mit Hilfe von Immunoblots auf
NIH-3T3
Ras NIH-3T3
p38 Western Blot, n=5
die Expression von inaktivierten nicht phosphorylierten MAPK 38 hin untersucht,
wie im Material- und Methodenteil beschrieben. Der Versuch wurde 5-mal durchgeführt, eine Quantifizierung des Bandensignals erfolgte nicht. Abbildung 13
zeigt exemplarisch die vergleichende Bande zwischen dem p38 Signal der nicht
mit H-Ras transfizierten Mausfibroblasten und dem transfizierten Klon.
Im Ergebnis konnte der Nachweis erbracht werden, dass die nicht aktivierte
MAPK 38 (p38) in beiden Klonen exprimiert wird. Auffallend waren dabei die im
nicht transfizierten Klon (Abb. 13 A) geringer ausfallenden MAPK 38 Signal als
diejenigen, die im H-Ras-transfizierten Klon (Abb. 13 B) nachweisbar waren.
Es läßt sich postulieren, daß p38 bei den nicht transfizierten Mausfibroblasten
und bei dem mit H-Ras transfizierten Klon nachweisbar ist. Allerdings ist das
Bandensignal des mit H-Ras transfiziertem Klon deutlich stärker ausgebildet.
3.2.3 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels p38 Immunopräzipitation
Um eine Ras-abhängige Aktivierung der MAPK p38 zu studieren, erfolgte eine
Immunopräzipitation. Hiermit galt es, durch Antikörperbindung mit Hilfe von Western-Blots das Ausmaß der nach Aktivierung phosphoryliert vorliegenden pp38MAPK zu untersuchen. Der Versuch wurde 5 Mal gemäß der Beschreibung im
Material- und Methodenteil durchgeführt. Eine Quantifizierung des Ban-
A
B
38 kDa
densignales wurde nicht erhoben. In
Abbildung 14 läßt sich exemplarisch
Abb. 14:
NIH-3T3
Ras NIH-3T3
pp38 Immunopräzipitation, n=5
nachvollziehen, daß die nicht mit HRas transfizierten Mausfibroblasten (Abb. 14 A) im Vergleich zu den mit H-Ras
transfizierten Zellen (Abb. 14 B) ein schwächeres Signal ausbildeten.
35
Es läßt sich ableiten, daß eine Ras-assoziierte Aktivierung der MAPK p38 in den
Ras-transfizierten Mausfibroblasten besteht, die in der Kontrollgruppe des nicht
Ras-transfizierten Klons nicht nachgewiesen werden konnte.
3.2.4 Analyse der Ras-/p38-Signalkaskade mittels u-PA Western Blot
Ziel dieser Analyse war der Nachweis, dass bei ERK-vermittelter Urokinase-Induktion diese auch p38-assoziiert erfolgt. Daher wurden mit H-Ras transfizierte
Zellen im Vergleich zu nicht transfizierten auf ihre Urokinase-Expression untersucht. Die Untersuchung erfolgte gemäß den Angaben im Material- und Methodenteil. Eine Quantifizierung des Bandensignals ist nicht erfolgt.
Im Western Blot wurde mit Hilfe von Antikörpern, wie in Material und Methoden
beschrieben, die Urokinase-Expression in mit H-Ras transfizierten und nicht
transfizierten NIH 3T3 Zellen unter-
A
sucht. Hierbei konnte in Abbildung
B
50 kDa
15, exemplarisch für 5 UntersuchunAbb. 15:
gen, ein Ras-vermittelter Urokinase-
Ras NIH-3T3
NIH-3T3
u-PA Western Blot, n=5
Nachweis erbracht werden: So setzt
sich die Urokinase-Expression der mit H-Ras transfizierten Fibroblasten (Abb. 15
A) mit starker Signalbande im Vergleich zu den nicht transfizierten Fibroblasten
(Abb. 15 B) mit fehlender Signalbande deutlich ab.
In einer weiteren Versuchsanordnung ging es um die Reversibilität der Urokinase-Expression unter Einsatz eine p38 Inhibitors, wie in Material und Methoden
beschrieben. Eine Quantifizierung des Bandensignals erfolgte nicht.
In 3 Versuchen konnte gezeigt werden,
SB 203580
SB 202474
dass unter der spezifischen Hemmung
der
MAPK
Imidazolderivat
p38
durch
das
SB
203580
die
Urokinase-Expression
aufgehoben
wurde.
war
Dieser
Effekt
-
10µM
-
10µM
50 kDa
Abb. 16: u-PA Expression in Ras-NIH-3T3
unter SB 203580, n=3
unter
Verwendung der Negativkontrolle SB
202474-einem
inaktiven
Analogon
von
exemplarisch in Abb. 16 dargestellt.
36
SB
203580-reversibel
und
ist
Resultierend besteht zwischen einer Ras-induzierten und pp38 vermittelten Urokinase-Expression ein Zusammenhang. Diese Expression ist unter Gabe eines
p38-Inhibitors nicht nachweisbar.
3.2.5 Analyse der Ras-vermittelten Induktion des u-PA-CAT-Promoters auf
mRNA-Ebene (Fremdergebnis innerhalb der Arbeitsgruppe)
Ergänzend zum Urokinasenachweis im Western Blot auf Ebene des biologischen
Effektors der Invasion, wurde in unserem Labor ein Chloramphenicol-Transferase (CAT)-Elisa durchgeführt, mittels dessen geprüft werden sollte, ob die Urokinase-Expression ein spezifisches Ras-abhängiges Korrelat einer Reportergenaktivierung auf mRNA-Ebene ist.
In der Versuchsanordnung erfolgte eine Transfektion mit Negativmutanten der
p38 Isoform, die in Abhängigkeit der transfizierten Konzentration zu einer reduzierten Invasion führten. Demgegenüber wurde der transient mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Klon als Positivkontrolle eingesetzt. Die Fragestellung des Versuches bezog sich auf die potentielle Inhibition der u-PA-CAT-Promoter-Aktivität.
Das Experiment wurde in enger Kooperation mit Herrn Andreas Behren
aus unserer Arbeitsgruppe von Herrn
Dr. med. Simon durchgeführt. Das
Resultat ist in Abbildung 17 exemplarisch für 3 Versuchsdurchführungen
dargestellt: Dabei stehen die Balkendiagramme für eine prozentuale AktiAbb. 17: Nachweis der Induktionshemmung
des
Ras-/p38-abhängigen
u-Pa-CAT
Promoters mittels CAT-ELISA, Angabe in
Prozent, n=3
vität des u-PA-CAT-Promoters in mit
H-Ras (Abb. 17, roter Balken) und mit
Negativmutanten der p38-Isoformen
transfizierten NIH-3T3-Zellen, die mit einer unterschiedlichen Konzentration
transfiziert wurden (Abb. 17: dunkelblauer Balken 0,1µg, hellblauer Balken
1,0µg). Als Kontrolle dienten Leervektoren (pSV2neo für H-Ras und pcDNA3 für
Negativmutanten der p38-Isoformen), deren fehlender Einfluss auf die u-PACAT-Promoter-Aktivität als Nulllinie festgelegt wurde.
37
Durch die jeweils mit 2 Konzentrationen von p38 Isoform-Negativmutanten angesetzten Transfektionsansätze sollte die Frage bezüglich der dosisabhängigen uPA-CAT-Promoter-Aktivität beantwortet werden.
Im Ergebnis fiel auf, daß durch den Einsatz der p38 Isoform-Negativmutante
eine ausgeprägte konzentrationsabhängige Hemmung der H-Ras-vermittelten uPA-Promoter-Aktivität erfolgte (Abb17 dunkelblauer gegen hellblauer Balken).
3.3
Analyse des Ras-/ p38-vermittelten Signalweges in immortalisierten NIH3T3 Zellen im in-vitro-Invasionsassay:
Mit Hilfe der Westernblot-Verfahren wurden der Ras-/p38-Signalweg und die Urokinase auf Proteinebene in mit H-Ras transfizierten und nicht transfizierten Mausfibroblasten untersucht.
Zum Nachweis eines Urokinase-assoziierten in-vitro Infiltrationsverhaltens wurden zwei Versuchsbedingungen etabliert: Dabei war für die visuelle Auszählung
der Zellen wichtig, dass mit Hilfe des Laserscan-Mikroskops eine konfokale
Durchlichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie möglich war. Bei dem
Mikroskop handelte es sich um ein Lichtmikroskop, das mit einem Laser- und
Scannermodul gekoppelt ist. Durch seine konfokale Eigenschaft sowie die
Bildverarbeitungssoftware ließen sich dreidimensionale Auswertung der Proben
gewinnen.
A
B
8 µm
[
50 µm
Abb. 18: GFP transfizierte Zellen im Fluoreszenzlicht (A), Darstellung der Trennschärfe
mittels Farbcodierung in Tiefenabhängigkeit (B), jeweils exemplarische Darstellung
38
B
A
8µm
50µm
Abb. 19: differenzierte farbcodierte Zuordnung oberhalb und unterhalb der Porenebene
lichtmikroskopisch (A) und 3D-Rekonstruktion laserscanmikroskopisch (B) mit Darstellung
einer Pore, Porendurchmesser 8µm, exemplarische Darstellung (Behren et al., 2005)
Hierdurch resultierte eine gute Tiefenschärfe, über die eine zuverlässige dreidimensionale Identifizierung der Zellen ermöglicht wurde. Zusätzlich verbessert
wurde die Zuordnung durch farbige Belegung der Zellschichten und die Fluoreszenz, da damit eine Auszählung erfolgreich transfizierter Zellen einherging. In
Abbildung 18 und 19 sind Beispiele für die verschiedenen Funktionen des
Laserscan-Mikroskops aufgeführt, in Abbildung 20 Laserscanaufnahmen, um die
hohe Bildqualität beispielhaft darzustellen.
In der ersten Versuchsanordnung wurden mit H-Ras transient transfizierte NIH3T3-Zellen als Positivkontrolle und die mit p38 Isoform-Negativmutanten transient transfizierten NIH-3T3-Zellen auf ihren invasiven Phänotyp untersucht (Abb.
21). Als Kontrollreferenz dienten die Leervektoren für H-Ras und die p38Negativmutanten (pSV2neo/pcDNA3). Per definitionem galt der Anteil als invadiert, der ausgehend vom oberen Kompartiment durch das Matrigel und die Pore
in das untere Kompartiment der Boydenkammer infiltrierte. Die Fragestellung bezog sich auf das gehemmte Invasionsverhalten in Abhängigkeit der transfizierten
p38-Negativmutanten und wurde prozentual nach Auszählung der Zellen oberhalb und unterhalb der Porenmembran errechnet (siehe Abb. 21). Die Versuchsdurchführung erfolgte 2-mal, jeder Versuch ging mit einer Auszählung von ca.
5000 Zellen einher, jedes Versuchsergebnis ist mit einer anderen Farbe
hinterlegt.
39
B
A
50µm
Abb. 20: Zellen oberhalb (A) und unterhalb (B) der Porenmembran bei transient mit einer p38
Negativmutante (C) und mit H-Ras (D) transfizierten NIH-3T3, Größenangabe exemplarisch (B),
(Behren et al., 2005)
D
C
In der zweiten Versuchsanordnung wurden die NIH-3T3-Zellen stabil mit H-Ras
transfiziert als Positivkontrolle den nicht transfizierten Mausfibroblasten als
Negativkontrolle gegenübergestellt. Das Invasionsverhalten der stabil mit Rastransfizierten NIH-3T3-Zellen (Abb. 22, Ras-NIH-3T3 Balken blau, lila, gelb)
wurde dann auf das Ausmaß der Infiltration in Abhängigkeit des eingesetzten
p38-Inhibitors SB 203580 (Abb. 22, Menge SB 203580 5µg lila Balken und 10 µg
orangener Balken) untersucht. Ergänzend wurde DMSO als Negativkontrolle gegen SB 203580 eingesetzt (Abb. 22, türkiser Balken). Die Auswertung erfolgte
photometrisch, das Ergebnis bezüglich der Invasion wurde jeweils prozentual angegeben (siehe Tab. 5). Die Versuchsreihe wurde 4-mal durchgeführt.
40
Abb. 21: Invasionsverhalten des NIH-3T3-Klons mit Transfektion der Kontrolle
pSV2neo/pcDNA3, p38 Isoform Negativmutanten und H-Ras. Die Balkendiagramme
zeigen die im Vergleich zu H-Ras transfizierten NIH-3T3 eintretende Invasion
prozentual zur gesamten Zellzahl, jeder Balken repräsentativ für ein Invasions-Assay
mit Auszählung von jeweils 5000 Mausfibroblasten
Auf das Ergebnis der ersten Versuchsanordnung, in der die Rolle der p38 Isoformen in Abhängigkeit des hochregulierten H-Ras-Onkogens untersucht wurde,
wird nachfolgend eingegangen und bezieht sich auf Abbildung 21:
Die Positivkontrolle der mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen zeigte den
höchsten Anteil invadierter Zellen mit gemittelt 50% der Zellen. Die mit der
Negativmutante (damit keine bestehende Funktionalität als p38 Isoform) für p38
δ und γ transfizierten NIH-3T3-Zellen verhielten sich mit einer im Vergleich zur
Positivkontrolle anteiligen 35-40% etwas weniger infiltrativ. Auffallend war der mit
der p38α-Negativmutante transfizierte NIH-3T3-Klon. Dieser wies eine Invasionshemmung von mehr als 90% auf. Im Ergebnis lag die Inhibition der p38α-Negativmutante unter der Kontrolle, die durch die Transfektion mit den Leervektoren für
H-Ras und p38-Isoformen abgebildet wird. Das Ergebnis der p38β-Negativmutante war variabel, da die beiden Invasionsassays eine unterschiedliche
Invasionshemmung ausbilden. Während der erste Versuch einen im Vergleich
zum H-Ras transfizierten NIH-3T3-Klon auf 30% reduzierten Invasionsanteil aufweist, wird im zweiten in-vitro-Invasionsassay eine Reduktion auf <10% erreicht.
41
Abb. 22: Invasionsverhalten nicht transfizierter sowie stabil H-Ras-transfizierterNIH-3T3
Zellen unter konzentrationsdifferenter Exposition mit einem spezifischen p38α-Inhibitor.
DMSO entspricht der Negativ-Kontrolle, Referenzdaten für die Extinktionswerte sind in
Tabelle 9 aufgeführt, n=4
Das Ergebnis der zweiten Versuchsanordnung (Abb. 22, Tab. 5) erbrachte bei
den stabil mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen (Abb. 22, Ras-NIH-3T3, Balken
NIH-3T3
0 µM SB
5 µM SB
10 µM SB
1 µl DMSO
RAS NIH-3T3
0 µM SB
5 µM SB
10 µM SB
A
1 µl DMSO
oben
1
0.124
0.103
0.085
0.094
oben
1
0.126
0.138
0.140
0.164
2
0.116
0.093
0.133
0.114
2
0.101
0.173
0.191
0.122
3
0.111
0.25
0.212
0.091
3
0.101
0.373
0.171
0.254
4
0.164
0.104
0.173
0.183
unten
1
0.018
0.008
0.007
0.011
2
0.006
0.006
0.008
0.005
3
0.006
0.007
0.011
0.013
4
0.005
0.013
0.012
0.014
4
0.125
0.259
0.493
0.274
unten
1
0.012
0.015
0.016
0.015
2
0.009
0.030
0.016
0.030
3
0.014
0.018
0.020
0.016
4
0.018
0.016
0.021
0.049
Tab 5: photometrischer Extinktionswert nicht invadierter und invadierter Zellen (A) und
nachfolgend berechnete Mittelwerte mit Angabe eines prozentualen Invasionsanteils
(B), SB entspricht SB 203580, DMSO der Kontrolle, n=4
B
NIH-3T3
0 µM SB
5 µM SB
10 µM SB
1 µl DMSO
Mittelwert oben
0.129
0.138
0.151
0.121
Mittelwert unten
0.009
0.009
0.010
0.011
Invasion in %
6.9
6.5
6.6
9.1
Ras NIH-3T3
0 µM SB
5 µM SB
10 µM SB
1 µl DMSO
0.113
0.236
0.248
0.258
0.013
0.020
0.018
0.028
11.5
8.5
7.2
10.9
42
blau, lila, gelb) eine vom Hemmstoff dosisabhängige Reduktion der Invasion, während die nicht transfizierten Zellen (Abb. 22, NIH-3T3) von dem p38 Inhibitor SB
203580 unbeeinflusst waren.
Aus den in-vitro-Invasionsassays kann abgeleitet werden, daß p38 eine Rolle bei
Invasionsprozessen spielt. Insbesondere wird der Signalweg über die Isoform
p38α vermittelt. Die Bedeutung der Isoform p38β scheint einen, im Vergleich zu
p38α in deutlich geringerem Umfang, Einfluss auf Invasionsprozesse zu
vermitteln. Bei variablem Ausmaß der Invasionshemmung ist eine eindeutige
Bewertung nicht möglich. Für die Isoformen p38γ und p38δ ergab sich vergleichsweise kein inhibitorischer Einfluss. Es zeigte sich zusätzlich eine konzentrationsabhängige Reversibilität der Invasion von stabil H-Ras transfizierten NIH-3T3Zellen unter Exposition eines spezifischen Inhibitors von p38-Isoformen.
43
4.0
Diskussion
In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass p38 im Zellkulturmodell
mit Mausfibroblasten (NIH-3T3-Zellen) eine Ras-induzierte und Urokinase-abhängige Zunahme der Invasionspotenz von NIH-3T3-Zellen vermittelt.
Dabei spielte die Isoform p 38α MAPK eine maßgebliche Rolle. Unter Gabe eines
p38-Inhibitors oder alternativ dem Einsatz einer p38 Isoform Negativmutante, war
die initial induzierte Invasionspotenz reversibel. Damit konnte erstmals die Beteiligung von p38 MAPK und Urokinase an der Steigerung der Invasionspotenz von
Mausfibroblasten nachgewiesen werden.
Diese neuen Erkenntnisse wurden 2005 veröffentlicht (Behren A., Binder K. et
al.; 2005; „The p38 SAPK pathway is required for Ha-ras induced in vitro invasion
of NIH3T3 cells“; Experimental Cell Research, Vol. 303: 321–330).
Ausgangspunkt war die Frage nach der Rolle der MAPK p38 bei Tumorinvasionsprozessen am Modell von NIH-3T3-Zellen. Zuvor war ein MAPK/ERK, nicht aber
eine die p38 MAPK belegte Vermittlung Ras-induzierter und Urokinase-/
Cathepsin-vermittelter Migration von Tumorzellen dokumentiert (Janulis et al.,
1999). Explizit war die Beteiligung distinkter p38 Isoformen nicht untersucht. In
Kenntnis der bereits beschriebenen signifikanten Strukturhomologie zwischen
ERK und p38 (Wang et al., 1997) postulierten wir eine durch p38-assoziierte
Modulation der Invasionspotenz für Ras-assoziierte solide Tumoren: Die RasSignalkaskade wird nach onkogener Transformation für 30% der soliden
Tumoren verantwortlich gemacht (Yamouchi et al., 2016; Zhang und Cheong,
2016).
Dieser Sachverhalt wird im Kontext neuerer Ergebnisse nachfolgend diskutiert:
Zum Zeitpunkt der vorliegenden Studie war eine H-Ras-Transfektion von Mausfibroblasten als Modell etabliert (Stacey and Kung, 1984;Janulis et al., 1999). Im
Rahmen der Studie wurde die Transfektion von Mausfibroblasten mit dem RasOnkogen eingesetzt, um der Frage nach der Beteiligung einer nachgeschalteten
Protease, konkret der Urokinase, als „downstream“ Effektor der Zellinvasion
nachzugehen. So zeigten z. B. solide Tumoren, exemplarisch benannt seien
gastrointestinale, pankreatische, gynäkologische oder urogenitale Tumoren, eine
Aktivierung eines Ras-assoziierten Signalweges (Calvet et al., 1996; Hernández44
Alcoceba et al., 2000; Miyakura et al., 2002; Carcia-Rostan et al., 2003; Kim et
al., 2003). H-Ras, nicht aber K- Ras oder N-Ras wurde für die Ras-/MAPK-Signalinteraktion verantwortlich gemacht.
4.1
Die Isoform p38α MAPK vermittelt eine Ras-induzierte Urokinase-Expression in NIH-3T3 Zellen
In der vorliegenden Studie wurde erstmals ein Zusammenhang einer Ras-vermittelten und über p38 transduzierten Signalkaskade für die Invasion von Mausfibroblasten gestützt. Chen und Kollegen zeigte eine Aktivierung von 3 MAPK’s
ERK, JNK und p38 in mit H-Ras transfizierten Mausfibroblasten, ohne die p38
Isoformen zu spezifizieren (Chen et al., 2000). Auch wurde der Einfluss der
MAPK-Kaskade nicht explizit mittels in-vitro-Invasionsassays analysiert und
spezifiziert.
In der vorliegenden Studie gelang der Nachweis einer von H-Ras ausgehenden
und über die Isoform p38α vermittelten Signaltransduktion mit nachgeschalteter
Proteolyse in mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen. Dies bestätigt und spezifiziert vorherige Befunde der Beteiligung von α, β, γ und δ p38 Isoformen in Lungen- und Nierentumoren (Mayor et al., 2007;Grossi et al., 2014).
Neben der unmittelbaren Beteiligung von p38α an der Proteasen-Expression, ergeben sich darüber hinaus Hinweise auf einen Einfluss von p38 auf Adhäsionsund Migrationsprozesse. Im Anschluss an die Studie von Behren, Binder 2005,
konnte für die Isoformen p38α und p38β eine alternative Kaskadenaktivierung
über T-Zell-Rezeptoren mit resultierender Cytokinfreisetzung (z. B. TNF α) belegt
werden (Alam et al., 2015). Ferner konnte eine p38α- vermittelte SelektinExpression in CD4 T-Zellen nachgewiesen werden (Ebel et al., 2015).
4.2
Die Invasionspotenz von Mausfibroblasten wird über eine Ras-/p38αinduzierte u-PA-Aktivierung erhöht
Zur Bewertung der u-PA-Aktivität wurde das Westernblot-Verfahren herangezogen. In diesem konnte nachgewiesen werden, dass die Urokinase-Expression im
mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen im Vergleich zu der nicht transfizierten
45
Kontrolle deutlich gesteigert war. Diese Expression war unter Gabe eines p38Inhibitors (SB 203580) reversibel.
Der u-PA-CAT-ELISA (Fremdleistung von Herrn Andreas Behren aus der
Arbeitsgruppe Dr. med. Simon), der die p38 Isoformen auf Ihre unter H-Ras exprimierte u-PA-CAT-Promoter-Aktivität untersuchte, belegte im Ergebnis eine
konzentrationsabhängige Induktionshemmung der u-PA-CAT-Promoter-Aktivität
für die Negativmutante der Isoform p38α. Somit wurde eine führend über H-Ras
und p38α vermittelte u-PA-Expression nachgewiesen.
Ferner fiel, im Gegensatz zu dem Ergebnis der Negativmutanten p38γ und p38δ,
unter transfizierter p38β-Negativmutante ein unverändert diskreter Nachweis des
u-PA-CAT-Promoterkonstruktes auf. Dies wurde als Folge der hohen Homologie
zwischen p38α und p38β mit einer resultierenden Kreuzaktivierung bei stets submaximaler Transfektionspenetranz diskutiert.
Neuartig an dieser Studie war der erstmalige lückenlose Nachweis einer Rasassoziierten und führend über die Isoform p38α-vermittelten Urokinase-Expression in mit H-Ras transfizierten NIH-3T3-Zellen.
Auf Basis der Studiendaten dieser Dissertation, wurde der Nachweis einer Ras-/
p38-vermittelten Induktion von FOXM1 erbracht (Behren et al., 2010). FOX M1
ist als Transkriptionsfaktor an Tumorinvasion und Adhäsionsverlust beteiligt.
Ausgehend von dem nun etablierten Modell mit Mausfibroblasten, einen Urokinase-assoziierten invasiven Phänotyp zu untersuchen (Han et al., 2002, Lee et
al. 2003; Shin et al., 2003), wurde im Verlauf die Relevanz des u-PA-Systems
deutlich, da sich in zahlreichen Tumoren eine u-PA-Aktivität darstellte (Mekkawy
et al., 2014; Jiang et al., 1996). Diese zeigten bei nachweislicher Ras-abhängiger
Urokinase-Expression eine hohe Übereinstimmung mit den Entitäten der für die
Ras-Onkogene
beschriebenen
Tumorbeteiligungen
auf.
Angesichts
der
resultierenden breiten Spezifität, wird neuerdings ein Einsatz als Tumormarker,
beispielsweise bei dem Mammakarzinom, diskutiert (McMahon and Kwaan,
2015).
46
4.3
Die Invasionspotenz infiltrierender Mausfibroblastenzellen Auswertung
kann im in-vitro-Invasionsassays verfolgt werden
Neuartig war die Auszählung mit einem konfokalen Laserscanmikroskop additiv
zur klassischen Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie.
Als Modell wurde ein in vitro Invasionsassay unter Verwendung von mit p38 Isoform-Negativmutanten und H-Ras transfizierten Fibroblasten etabliert. Im Ergebnis wurde eine H-Ras-/p38-abhängige und Urokinase-vermittelte Zunahme an invadierenden NIH-3T3-Zellen nachgewiesen. Diese Signalweiterleitung erfolgte
offenbar über die Isoform p38α. So zeigte sich weder für die Isoformen p38γ und
p38δ noch für die p38β-Isoform eine zu p38α vergleichbare Invasionspotenz.
Daher war die Korrelation des in-vitro-Invasionsassay mit dem uPA-CatPromoterversuch wichtig, um das Ergebnis der CAT-Promoter-Aktivität gegenüberzustellen. Hierbei stellte sich keine vergleichbare Expressionsvariabilität von
p38β im ELISA dar. Daher wurde das variable Invasionsverhalten der p38β
Negativmutante im Invasionsassay nicht als Klasseneffekt gewertet.
Während die Photometrie als Routineverfahren etabliert ist, war für die Mikroskopie-basierte Auswertung von in-vitro-Invasionsassays zum Zeitpunkt der
Dissertationsarbeit kein vergleichbarer Standard eruierbar. Im weiteren Verlauf
etablierte sich der Einsatz der konfokalen Mikroskopie. Zuletzt dokumentierte die
Arbeitsgruppe um Yamauchi und Kollegen eine Beteiligung des Ras-/p38-Signalweges mit Nachweis einer reduzierten Lamellipodienformation unter Signalwegsuppression mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (Yamauchi et al., 2016).
Ferner wiesen die mit H-Ras transient transfizierten NIH-3T3-Zellen in der konfokalen Mikroskopie eine im Vergleich zu der nicht transfizierten NIH-3T3-Kontrolle (Negativkontrolle) morphologische Veränderung auf: Im Vergleich zur
Negativkontrolle zeigten sich, vereinbar mit einem malignen Phänotyp, vermehrt
Lamellipodien und ein vergrößerter Zellkörper mit einer Kern-Plasma-Relation
zugunsten des Nukleus.
47
Die klinische Relevanz der onkogenen Transformation bekannter Proto-Onkogene ist für viele Tumorarten bekannt, insbesondere ist das neoplastische Potential für den Ras-/MAPK-Signalweg belegt und seit dieser Zeit bestätigt (Lei et
al., 2014): Ein Zusammenhang mit pulmonalen, gastrointestinalen, gynäkologischen, urologischen und kutanen Malignomen ist beschrieben. Dabei wird bei
einer neoplastischen Transformation eine onkogene Ras-Beteiligung in 30% postuliert (Mason et al., 2016).
Bislang wurden die Tumorinvasionsprozesse als bewährte neoplastische Sequenz, ausgehend von der Genominstabilität über Migration und Adhäsion bis
zur Invasion, angesehen (Hernández et al, 2000; Mitra et al., 2006; Behren et al.,
2010; Mason et al., 2016). Im Verlauf traten weitere Erkenntnisse zutage, die eine
alternative Aktivierung des Ras-/p38-Signalweges über T-Zell-Rezeptoren belegten. Als Folge wurde eine sich aggravierende Tumorerkrankung durch induzierte
Freisetzung von Zytokinen (z. B. TNFα) nachgewiesen (Alam et al., 2015).
Neben der Bedeutung für Tumorinvasion wurde für die MAPK p38 eine alternative Aktivierung der Signalkaskade diskutiert: So konnte im Mausmodell eine
durch alternative Aktivierung der MAPK p38 resultierende systemische chronische Inflammation, eine autoimmune Encephalomyelitis und rheumatoide
Arthritis aufgezeigt werden (Alam et al., 2014;Jirmanova et al., 2011); diese
wurde nachweislich durch Cytokininduktion, z. B. TNFα und Interferon γ,
hervorgerufen. Die Folgekomplikationen waren unter Inhibition der alternativen
Aktivierung von p38 reversibel.
Parallel mit den neuen Erkenntnissen halten antikörperbasierte „targeted“ Therapien Einzug, die sich gegen Signalproteine auf jeder Ebene (Wachstumsrezeptor,
Kinasenproteine des SAPK-/MAPK- Signalweges) richten. Ein Teil der Antikörper
ist bereits zugelassen, zum Beispiel Trametinib (Mekinist®) bei Melanomerkrankungen. Der überwiegende Anteil der Produktklasse ist noch in der präklinischen Zulassungsphase (Uehling und Harris, 2015).
Als weiterer Ansatz wird bei Ras-assoziierten Pankreaskarzinomen eine Impfung
gegen Peptide des Ras-Proteins diskutiert (Bournet et al., 2015), wobei sich der
48
Erfolg trotz modifizierter Peptidmuster bislang nicht hatte signifikant darstellen
lassen.
Mittelfristig sind die Konzepte der „targeted“ Therapie als guter Kombinationsversuch einzustufen. Auch wenn sich aktuell noch kein kurativer Ansatz bei
Malignomen abzeichnet, so sind die modularen Konzepte, beispielsweise eine
Chemotherapie in Kombination mit der antikörperbasierten „targeted“ Therapie,
bereits ein wichtiger Schritt für die beste supportive Therapieplanung bei
Tumorpatienten.
49
5.0 Zusammenfassung
Tumorassoziierte Mortalität steht nach Angaben des Statistischen Bundesamtes
bundesweit nach wie vor an zweiter Stelle aller Todesursachen. Die
Tumorinvasion und Metastasierung gilt hier als primärer Faktor der hohen
Mortalität. Das Ras-Onkogen spielt für die Tumorerkrankungen eine führende
Rolle. Es blieb jedoch zunächst unklar, welche der p38-Isoformen an diesem
durch
Ras-Aktivierung
mediierten
und
die
Tumorinvasion
fördernden
Signalprozeß beteiligt waren. In der vorliegenden Studie wurde erstmals
nachgewiesen, daß eine Signaltransduktion mit erhöhter Urokinase-Expression
(u-PA), induziert durch ein aktiviertes Ras-Onkogen, überwiegend über die
Isoform p38α vermittelt wird.
Nach Gabe eines p38-Inhibitors (SB 203580) unter konstitutiv hochreguliertem
Ras-/p38α-Signalweg zeigte sich eine reversible u-PA-Expression, die Ausdruck
einer Invasionspotenz ist.
Das Ergebnis dieser Studie wurde 2005 veröffentlicht (Behren A, Binder K. et al.;
2005; „The p38 SAPK pathway is required for Ha-ras induced in vitro invasion of
NIH3T3 cells“; Experimental Cell Research, Vol. 303: 321–330).
Ausgehend von der über die Ras- und die Isoform p38α vermittelte
Proteaseninduktion bei Tumorinvasion, wurden nachfolgend Studien über die
Rolle der Isoform p38α bei kolorektalen Tumoren und Tumoren der Leber und
der
Lunge
aufgenommen.
Für
das
Mammakarzinom
ist
mit
hohem
Expressionsniveau der MAPK p38 eine begrenzte Prognose assoziiert. Eine
differenzierte Bewertung der an der Signalvermittlung beteiligten Isoformen steht
noch aus (Grossi et al., 2014;Wagner and Nebreda, 2009;Igea and Nebreda,
2015).
Damit zeigt sich, daß die in der Veröffentlichung von Behren und Kollegen 2005
beschriebene Beteiligung der MAPK Isoform p38α an einer induzierten
Invasionspotenz von Mausfibroblasten ein Signalweg ist, der nach wie in der
Tumorforschung bei abnormer Aktivierung im Hinblick auf die Induktion
metastatischer Kompetenz eine Rolle spielen wird.
50
6.0 Literaturverzeichnis
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58
7.0 Erklärung zum Eigenanteil
-
Die Fragestellung dieser Arbeit wurde von Herrn Dr. med. Simon entworfen
-
Die Versuche sowie die Auswertung wurden mit einer Ausnahme von mir erbracht: Daten bezüglich der Ras-vermittelten u-PA-Cat-Promoteraktivität
(Punkt 3.3.5) wurden mir von Andreas Behren zur Verfügung gestellt.
-
Die arbeitsbezogene Datenrecherche erfolgte via Medline / Pubmed von mir
über die Tübinger elektronische Zeitschriftenbibliothek.
-
Die Arbeit betreute initial Dr. med. Simon, im Verlauf Frau Prof. Dr. rer. nat.
Knipper.
-
Die Veröffentlichung anteiliger Ergebnisse im „Experimental Cell Research“
wurde von Herrn Andreas Behren mit den von mir erbrachten und zur
Verfügung gestellten Daten verfasst.
59
8.0 Veröffentlichung
Teile der Dissertationsschrift wurden bereits in der vorliegenden Publikation veröffentlicht:
Andreas Behren, Konrad Binder, Goran Vucelic, Stephan Herberhold, Bernhard
Hirt, Hubert Loewenheim, Serena Preyer, Hans Peter Zenner, Christian Simon –
„The p38 SAPK pathway is required for H-ras induced in vitro invasion of NIH3T3
cells“ - Expermiental Cell Research – 2005 – Vol. 303 – Seiten 321 - 330
9.0 Danksagung
Ich danke Herrn Dr. med. Simon für die Bereitstellung des Promotionsthemas
und meiner Arbeitsgruppe für die engagierte und freundliche Arbeitsatmosphäre.
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. rer. nat. Knipper, die sich altruistisch als
betreuende Doktormutter einbrachte, um meiner Dissertation nach langer Ruhephase Verwirklichung zu ermöglichen.
Weiterer Dank gilt der „Deutschen Forschungsgemeinschaft“, die diese Arbeit mit
einem Stipendium finanziert hat und die experimentelle Phase ermöglichte.
Nicht zuletzt und ganz herzlich danke ich meiner Frau und meiner Familie, die
mir zu jedem Zeitpunkt zur Seite standen.
60