vo translationskontrolle vo translationskontrolle
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VO TRANSLATIONSKONTROLLE Helmut Dolznig, Teil 2 1 Signaltransduktion zur Translation 2 Translationskontrolle und Krebs Helmut Dolznig Inst für Medizinische Genetik MedUniWien, Waehringer Srasse 10 Tel 4277 67502 | email [email protected] Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Translation and Cancer Definitionen: Growth / Protein Synthesis Division / Cell Cycle Erinnerung: Upstream Signalling to Translation Transformation PI3K, PKB/Akt mTOR eIF4E Andere Translationsfaktoren Klinische Studien Zusammenfassung Literatur Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Growth versus Proliferation Growth, Mass Increase Normaler Zellzyklus Maintain cell size Growth and division Proliferation Cell division Proliferation, di ision M Masse/Volume en Growth, Mass Increase Zeit Langzeitproliferation braucht Massenzunahme Growth: Massenzunahme / Zeit Protein / Makromolekülzunahme: =mehr Synthese als Abbau Konzentration von Proteinen/ oe e / Makromolekülzunahme pro Volumen ändert sich nicht Volumszunahme = Massenzunahme = Growth Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Growth = Prerequisite for Sustained Proliferation ansonsten: Masse / Volumen N Mass No M Increase I Zeit St ti Stetige Größenreduktion G öß d kti d der ZZellen ll b beii jjeder d TTeilung il ->Proteinsynthese notwendig in Krebszellen Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Cell Cycle S Gap 1 Replikation Synthese Phase G1 M G2 Gap 2 Mitose Mit Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Restriction Point Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 G1/S Transition Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Growth <-> Division Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Transformation Transformation: Zellen - immortal - anchorage independent proliferation (soft agar assays) - keine Kontaktinhibierung - erzeugen Tumoren in Tieren Expression von proto-Oncogenen und Tumor Suppressor Genen auf verschiedenen Ebenen reguliert Teil: Translation transformierte Zellen: mehr Proteinsynthese Cause or Consequence? ???? Ist Veränderung von Translationskomponenten ausreichend für Transformation ? Translationskontrolle stark verbunden mit Signaltransduktion, Expression von Oncogenen, Tumorsuppressorgenen Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Upstream Signalling of Translation: Key Players PKB P Akt PI3K mTOR S6K 4E-BP 4E BP T Translation l ti Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K Akt PI3K-Akt Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt PTEN P PKB PI3K Akt P P Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt PKB PAktP P P PI3K mTOR P PPS6K P P P 4E-BP in Zellkultur und Tiermodellen: PI3K Akt/PKB PTEN Onkogen Onkogen Tumorsuppressorgen in humanen Tumoren: PI3K aktivierende Mutationen, Amplifikationen Akt aktivierende Mutationen Amplifikationen mRNA Überexpression p PTEN LOH Mutationen Promotor Methylierung Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt PKB PAktP P P PI3K mTOR P PPS6K P P P 4E-BP PI3K p110 Hotspot Mutationen: erhöhen Kinase Aktivität Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt PKB PAktP P P PI3K mTOR P PPS6K P P P 4E-BP Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Different Inhibitors of RTK-PI3K-Akt-mTOR axis Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 PI3K-Akt-mTOR axis inhibitors Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 mTOR Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 mTOR signalling PKB FKBP12 Akt P Rapamycin P P P mTORC1 S6K RHEB Tsc2 Tsc1 P P P P 4E-BP Rib Ribosomenbiogenese bi verbesserte Translation von mRNAs mit regulatorischen Elementen in 5’UTR z. B. Cyclin D1, E ... Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Rapamycin, CCI-779 Rapamycin: i Fungizid i id isoliert aus Streptomyces hygroscopicus - antimicrobiell - immunosuppressiv - antiproliferativ, antitumor wurde erst als Immunosuppressant bei Organtransplantationen verwendet um allografte ll ft Abstoßung Ab t ß zu vermeiden id schlechte pharmakologische Eigenschaften: - bedingt wasserlöslich - schlechte chemische Stabilität Rapamycin-Esther: gut wasserlöslich, stabiler: CCI-779 (Wyeth, USA) P äkli i h St Präklinische Studien: di T Tumorzellinien: lli i Prostata-, P t t B t SCLungenkarzinom, Brust-, SCL k i Gliobalastom, Melanom, T-Zell Leukämien Humane Xenografts: erfolgreich, Tumorwachstum gestoppt Phase I Studien beendet: Ziel: Nebeneffekte: maximal tolerierbare Dosis Haut Hä Hämatopoiese: t i Thrombocytopenie Th b t i Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Rapamycin (Sirolimus, Rapamune), CCI-779 Tumoren: Renal Cell Carcinoma (häufigster Nierenkrebs) FDA approved N Non smallll Lung L Carcinoma C i Regression, Brustkrebs,, Weichteilsarcom,, Squamous q SkinCarcinoma,, NH-Lymphoma wenig Effekte Phase II PTEN, Akt Phosphorylierungsstatus p y g erhoben Prostatacarcinoma Brustkrebs wenig Effekte Phase III Brustkrebs: Kombinationstherapie ((CCI779+aromatase inhibitor)) Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 C1 inhibition n mTORC control Possible mechanism Rapamycin Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Erinnerung: eIF4E Aktivierung PKB PAktP P P PI mTOR 3 K P PPS6K P P P 4E-BP AS, Insulin, WF P 4EBP P PABP P 4EBP eIF4E eIF4E 40S eIF3 eIF4A eIF4G eIF4E Mnk-1 P Initiationskomplex 4EBP P 2 Aufgaben: - Disssoziation von 4E - Verhinderung der Wiederbindung Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E PKB PAktP P P PI mTOR 3 K P PPS6K P P P 4E-BP 4E ist rate limiting -> Kompetition von verschiedenen mRNAs um Translationsinitiation a.) mRNAs mit unstrukturierten, kurzen UTRs (alle House Keeping genes), leichte Bindung und Scanning durch Präinitiationskomplex, präferentiell translatiert (strong RNAs) b.) lange, strukturierte 5’UTRs, schlechte Cap dependent Translation enthalten oft IRESs (v.a. proto-Onkogene) (weak RNAs) wenn mehr eIF4E vorhanden ist: überproportional bessere Translation von langen 5’UTR messages verglichen mit kurzen: wenig Effekt -> Anreicherung von Proteinen, die von komplizierten, sekundärstrukturreichen mRNAs codiert werden im Vergleich zur Masse an Transkripten eIF4E IF4E overexpression i -> Synthese von c-Myc, cyclin D1, RNR2, ODC, FGF-2, und VEGF angedreht Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E PKB PAktP P P PI mTOR 3 K P PPS6K P P P 4E-BP Abhängigkeit der Translation von starken und schwachen mRNAs durch eIF4E levels eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti a, *, Adrian L. Harris b Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Induzierbares eIF4E in CHO Zellen Expression von 4E in COS Zellen -> uninduziert: 7x, induziert: 20x 30-50%mehr Proteinsynthese, bestimmte Proteine stärker synthetisiert (Pfeile) Vermutung: translational repressed genes (weak mRNAs, Repression aufgehoben durch mehr 4E) eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E FGF-2: fibroblast growth factor, mitogen und angiogen Wundheilung, Tumorvaskularisierung FGF-2 wird auch durch MMTV insertion angedreht eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies. Arrigo De Benedetti, Adrian L. Harris Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E PKB PAktP P P PI mTOR 3 K P PPS6K P P P 4E-BP Translational control: the cancer connection Michael J. Clemens , Ulrich-Axel Bommer The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999) Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E PKB PAktP P P PI mTOR 3 K P PPS6K P P P 4E-BP Translational control: the cancer connection Michael J. Clemens , Ulrich-Axel Bommer The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999) Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E ist ein Onkogen Transformationsassays - keine Kontaktinhibierung eIF4E NIH3T3 fibroblasts CHO REF - anchorage g independent proliferation (soft agar assays) - erzeugen Tumoren in Mäusen 4E verstärkt Transformation mit v-myc E1A Max Knock down von 4E durch antisense hemmt oncogene/metastatische Eigenschaften von ras transformierten REFs eIF4E ist ein Onkogen Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E in Tumoren Überexpression in Blasen-, Head/Neck-, Colon- und Brustkarzinomen Hypothese: bessere Translation von mRNAs mit langen g 5’UTR,, komplexen p Sekundärstrukturen Brustkrebs: 4E expression könnte als Tumormarker, Prognostischer Indikator genutzt werden Überexpression meist transkriptionell, oder durch Genamplifikation 4E antisense in human breast cancer cell line: angiogene und tumorigene Eigenschaften vermindert Head and neck squamous carcinomas (HNSC): Grenze Tumor / Normalgewebe schwer zu erkennen, 4E expression hilft Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4E Apoptose: 4E Expression reduziert Apoptose in serum arretierten Zellen bzw in Myc-überexprimierenden Zellen 4E antisense: mehr Apoptose bei Starvation oder Bleomycin Behandlung Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Summary Initiation Factors + Cancer Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Zusammenfassung Wachstum (growth) ist nicht gleich Zellteilung (Proliferation, cell division) Voraussetzung für Zellteilung ist Wachstum, Voraussetzung für Wachstum ist Translation d.h. ohne Translation keine Zellteilung daher ohne Translation kein Tumor daher Inhibition der Translation sehr interessant für Tumortherapie!!! PI3K-Akt-mTOR PI3K Akt mTOR pathway sehr häufig dereguliert in humanen Tumoren neben Rb und p53 am häufigsten Aktivierung von Proto-Onkogenen: PI3K Untereinheiten, PKB/Akt Familie durch aktivierende Mutationen, Amplifikationen, Überexpression Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen: PTEN, TSC1/2 durch LOH, Mutationen, Silencing (Methylierung) Komponenten der Translationsinitiationsmaschinerie impliziert in Krebs im Menschen eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4E, eIF4E (überexprimiert) eIF4E = Onkogen, transformiert Zellen und Überexpression resultiert in Tumoren im Tiermodell Transformierende Wirkung wahrscheinlich durch selektiv bessere Translation von „schwachen“ mRNAs (langer stark strukturierter 5‘ UTR, z.B. myc, Cyclin D1, VEGF..) Sehr viele therapeutische Ansätze um PI3K - PKB/Akt – mTOR pathway bei Krebserkrankungen zu blocken (präklinische Tests – Phase II Studien) Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Literatur Hildago et al. The rapamycin sensitive signal transduction pathway as a target for cancer therapy. Oncogene 19 (2000), 6680-86 Wyeth Homepage, www.wyeth.com Watkins and Norbury, Norbury Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, tumorigenesis BJCancer 86 (2002), 1023-27 Arrigo De Benedetti and Adrian L. Harris. eIF4E expression in tumors: its possible role in progression of malignancies., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31 (1999) Malumbres and Barbacid, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer. Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31 Garber, Rapamycin’s resurrection: a new way to target the cancer cell cycle. JNCI, 93 (2001), 1517-19 Averous J, Proud. When translation meets transformation: the mTOR story. Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6423-35. Mamane Y, Petroulakis E, LeBacquer O, Sonenberg. mTOR, translation initiation and cancer. Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6416-22. Corradetti MN, Guan KL. Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all roads pass through mTOR? Oncogene. 2006 Oct 16;25(48):6347-60. Crino PB, Nathanson KL, Henske EP. The tuberous sclerosis complex. N Engl g J Med. 2006 Sep p 28;355(13):1345-56. ( ) Hennessy BT, Smith DL, Ram PT, Lu Y, Mills GB. Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2005 Dec;4(12):988-1004. Samuels Y, Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in cancer. Curr Opin Oncol. Oncol 2006 Jan;18(1):77-82. Jan;18(1):77-82 Cully M, You H, Levine AJ, Mak TW. Beyond PTEN mutations: the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 2006 Mar;6(3):184-92 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4A 2 Isoformen I und II RNA Helicase Überexpression in Hepatocarcinomas, Melanoma Zellinien PABP 40S eIF3 eIF4A eIF4G eIF4E Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF2 P eIF2 GSK3 P eIF2 Kinases HRI, PKR, PERK inactive eIF2 GTP eIF2B GDP eIF2 GDP GTP eIF2 GTP M t RNA Met-tRNA Translation Initiation Erhöhte Expression von eIF2 in transformierten Zelllinien, NH-Lymphoma, Magen-,, Colon Magen Colon- und Rektaltumoren Überexpression von eIF2bzw. eIF2Mutante (keine P Stelle mehr)-> Transformation Verlust von eIF2 Kinases: HRI niedrig in epithelialen Ovarialtumoren PKR fraglich Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF3 11 Untereinheiten 5 UE überexprimiert in manchen Tumoren (Brust, Cervix, Ösophagus, Lunge, Testis, Prostata) Hypothese: Überexpression einer eIF3 UE-> mehr eIF3 PABP 40S eIF3 eIF4A eIF4G eIF4E eIF3 bindet direkt an manche IRESs (Growth advantage?) Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 eIF4G 2 Isoformen I und II PABP Ü Überexpression von I Transformation in NIH3T3 Fibroblasten Cap dependent und independent Translation erhöht in FM3A Zellen 40S eIF3 eIF4A eIF4G eIF4E Überexpression gefunden in 30% Non Small cell lung cancers Hypothese: Kompetition mit 4EBP um 4E Bindung -> Inhibitorischer Effekt von 4EBP aufgehoben bzw geschwächt Direkte IRES Bindung eIF4G mRNA hat selbst IRES, positiver Feedbackloop? Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 mRNAs with IRES Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Translation Initiation The rate of synthesis of any given protein is determined primarily by the level of translation initiation. In brief, a ternary complex is formed between eIF2, GTP and the initiator methionyl-tRNA (mettRNAi) while tRNAi), hil free f 40S ribosomal ib l subunits b it are bound b d to t eIF3, IF3 a large, l multi-subunit, lti b it iinitiation iti ti ffactor. t Free 60S ribosomal units are similarly bound to the monomeric eIF6. Together, eIF3 and eIF6 prevent premature association of the 60S and 40S ribosomal subunits. The ternary complex is transferred to eIF3/40S along with eIF1 and eIF1A, to form a 43S pre-initiation complex. eIF3 can now bind bi d to t the th eIF4F IF4F complex, l which hi h is i associated i t d with ith the th mRNA, RNA thus th linking li ki the th 40S ribosome ib to the mRNA and generating the 48S pre-initiation complex. eIF4F itself consists of three components: eIF4G, eIF4E, and eIF4A. eIF4G binds eIF3 and acts as a scaffold for eIF4E and eIF4A. eIF4E recognises and binds the 5' mRNA cap structure while the RNA d dependent d t ATPase ATP eIF4A IF4A is i thought th ht to t unwind i d secondary d structure t t i th in the 5' untranslated t l t d region i (UTR). eIF4B is an additional factor that may stimulate the eIF4A helicase activity and promote RNA binding. The poly(A) tail of the mRNA interacts with poly(A) binding protein (PABP), which in turn has a binding site on eIF4G allowing the mRNA to circularise. The 48S pre-initiation complex now scans downstream d t from f the th mRNA RNA 5' end d until til it encounters t an AUG initiation i iti ti codon. d Thi This process can only occur if the 43S complex has formed in the presence of eIF1 and eIF1A. With the Met-tRNAi positioned at the AUG codon, eIF5 interacts with the pre-initiation complex via EIF2 and eIF3. eIF2-bound GTP is hydrolysed and eIF2-GDP is released. The hydrolysis of a second GTP bound bo nd to the initiation factor eIF5B is activated acti ated b by the 60S ribosomal subunit. s b nit These two successive GTP hydrolysis events, and the simultaneous release of eIF3, are essential for the joining of the 60S subunit. A functional 80S ribosome is consequently formed and peptidyl transfer can now occur. Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008 Translation Initiation Regulation of ternary complex formation The protein kinases PKR, HRI and PERK can phosphorylate the alpha subunit of eIF2 and this results in an increased affinity for eIF2B, a guanine nucleotide exchange factor. Normally, eIF2B catalyses the exchange of eIF2-bound GDP with GTP so that a new interaction with met-tRNAi can take place and the ternary complex can re-form. re-form Phosphorylated eIF2a sequesters eIF2B, eIF2B preventing the formation of additional ternary complexes and inhibiting translation initiation. eIF2a has also been shown to be cleaved during apoptotic cell death, rendering eIF2 inactive and consequently disabling the ternary complex. Regulation of mRNA-binding mRNA binding to ribosomes is generally the rate limiting step in translation initiation and consequently is a major focus for regulatory pathways. Disruption of the eIF4F complex abolishes the link between the capped mRNA and the ribosomes and drastically inhibits translation. translation Formation of eIF4F complexes also depends upon the presence of active eIF4E which, while it is the least abundant of the translation initiation factors, is essential for binding the pre-initiation complex to the cap structure. Availability of eIF4E is regulated through the activities of 4E-BP/2/3. These exist in a hypophosphorylated state in quiescent cells and have the capacity to sequester eIF4E by competing with eIF4G for a common 4E-binding site. This in turn prevents assembly of the eIF4F complex and inhibits translation initiation. 4E-BP1 hyperphosphorylation at multiple amino acid residues occurs in response to growth factors such as insulin, IGF-1 and angiotensin-II and involves protein kinases including mTOR, mTOR MAP kinases, kinases PKC, PKC ATM and casein kinase II. II Hyperphosphorylated 4E-BP1 dissociates from eIF4E, leaving it free to participate in eIF4F formation. The activity of eIF4E may be regulated by phosphorylation (e.g. by the MAP kinasestimulated protein kinase, Mnk1). Low levels of eIF4E phosphorylation are correlated with reduced translation rates in quiescent and mitotic cells. cells Translation initiation and its deregulation during tumorigenesis, Watkins and Norbury, BJCancer 86 (2002), 1023-27 Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008