Dr_Ingo _2 - TiHo Bibliothek elib - Stiftung Tierärztliche Hochschule

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
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1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-14-8
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
[email protected]
www.dvg.net
Tierärztliche Hochschule Hannover
In vitro Expressions-Analyse von Transkriptionsfaktoren
muriner Astrozyten und Mikrogliazellen nach Infektion mit
dem Theiler-Enzephalomyelitis-Virus
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med vet.)
vorgelegt von
Ingo Gerhauser
Jülich
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.;
Institut für Pathologie
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
2. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Gerd Bicker
Tag der mündlichen Prüfung:
22.06.2009
Für meine Frau
in großer Liebe und Dankbarkeit
Darin besteht das Wesen der Wissenschaft.
Zuerst denkt man an etwas, das wahr sein könnte.
Dann sieht man nach, ob es der Fall ist
und im Allgemeinen ist es nicht der Fall.
Bertrand Russell (1872-1970)
britischer Philosoph und Mathematiker
1950 Nobelpreis für Literatur
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Kapitel 1
Einleitung…................................................................................1
Kapitel 2
Literaturübersicht.......................................................................3
2.1 Experimentell induzierte und spontan auftretende
demyelinisierende Erkrankungen...............................................................3
2.1.1
Staupevirusenzephalitis des Hundes...........................................4
2.1.2
Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis...........................5
2.1.3
Multiple Sklerose..........................................................................6
2.1.4
Theilervirus-Enzephalomyelitis...................................................10
2.2 Matrix-Metalloproteinasen.........................................................................18
2.3 Transkriptionsfaktoren...............................................................................20
2.3.1
Definition und Funktion...............................................................20
2.3.2
Die ETS-Transkriptionsfaktorfamilie...........................................25
2.3.3
Die Aktivator Protein (AP)-1-Transkriptionsfaktorfamilie............27
2.3.4
Die NF-κB/Rel-Transkriptionsfaktorfamilie.................................30
Kapitel 3
Material und Methoden............................................................35
3.1 Allgemeiner Versuchsaufbau....................................................................35
3.2 Mäuse...........................................................................................................35
3.3 Zellkulturelle Untersuchungen..................................................................36
3.3.1
Herstellung eines Theilerviruspools zur Infektion der
primären Gehirnzellen................................................................36
3.3.1.1
Kultur und Passage des Theilervirus in BHK-21-Zellen..........36
3.3.1.2
Plaquetest …...........................................................................36
3.3.1.3
3.3.2
3.3.2.1
Inaktivierung des TMEV mittels UV-Licht-Bestrahlung............37
Isolierung der murinen Gehirnzellen...........................................38
Protokoll zur Isolierung der murinen Gehirnzellen..................38
II
Inhaltsverzeichnis
3.3.3
Auftrennung von Mikroglia/Makrophagen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten.....................................40
3.3.3.1
Protokoll zur Aufreinigung der Mikroglia/Makrophagen...........40
3.3.3.2
Protokoll zur Beseitigung der Oligodendrozytenvorläuferzellen................................................................41
3.3.3.3
3.3.4
Protokoll zur Aufreinigung der Astrozyten…...........................42
Kokulturen von Astrozyten und Mikroglia/Makrophagen
im Transwellsystem....................................................................42
3.3.5
Infektion der Gehirnzellkulturen……...........................................43
3.3.6
Immunfluoreszenz…...................................................................43
3.3.6.1
Primärantikörper/Proteine.......................................................43
3.3.6.2
Darstellung der Mikroglia/Makrophagen mittels DiI-ac-LDL....45
3.3.6.3
Nachweis der Antigene TMEV, GFAP,
Iba1 und “cleaved“ Caspase-3................................................45
3.3.6.4
Färbung der Zellkerne.............................................................45
3.3.6.5
Negativkontrollen.....................................................................46
3.3.6.6
3.3.7
Auswertung und Dokumentation der Ergebnisse…................46
BrdU-Test...................................................................................46
3.4 Molekularbiologische Untersuchungen....................................................47
3.4.1
RNS-Isolierung und DNase-Behandlung....................................47
3.4.2
Reverse Transkription................................................................50
3.4.3
Primerauswahl……….................................................................51
3.4.4
Konventionelle PCR...................................................................51
3.4.5
Gelelektrophorese......................................................................52
3.4.6
PCR-Kontrollen...........................................................................53
3.4.7
Herstellung der Standardreihen ………......................................53
3.4.8
Quantitative PCR........................................................................54
3.4.9
Transfektion von primären Astrozyten mit siRNS.......................56
3.5 Statistische Auswertung............................................................................57
Inhaltsverzeichnis
Kapitel 4
4.1
III
Ergebnisse................................................................................59
Herstellung eines Theilerviruspools.................................................59
4.1.1
Vermehrung................................................................................59
4.1.2
Titration.......................................................................................60
4.1.3
Nachweis....................................................................................60
4.2
Herstellung primärer Gehirnzellkulturen..........................................61
4.2.1
Herstellung einer Mischkultur.....................................................61
4.2.2
Herstellung der primären Astrozyten- und Mikrogliakulturen......62
4.3
Infektion der primären Astrozyten- und Mikrogliakulturen.............63
4.3.1
Nachweis von TMEV-Antigen und infektiösem Virus
in der Monokultur........................................................................65
4.3.2
Nachweis von TMEV-Antigen und infektiösem Virus
in der Kokultur............................................................................70
4.3.3
Zellzahlen der primären Astrozyten und Mikrogliazellen............72
4.3.4
BrdU-Test von primären Astrozyten...........................................74
4.3.5
4.4
Apoptoserate von primären Astrozyten......................................78
Molekularbiologische Untersuchungen............................................81
4.4.1
RT-qPCR....................................................................................81
4.4.1.1
RT-qPCR der Astrozyten in der Monokultur............................82
4.4.1.2
RT-qPCR der Mikroglia in der Monokultur..............................88
4.4.1.3
RT-qPCR der Astrozyten in der Kokultur................................93
4.4.1.4
4.4.2
4.4.2.1
RT-qPCR der Mikroglia in der Kokultur...................................98
Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten..............................103
Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten
in der Monokultur...................................................................103
4.4.2.2
Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten
in der Kokultur.......................................................................106
4.4.3
Vergleich der Genexpression zwischen
Astrozyten und Mikroglia..........................................................109
4.4.4
RT-qPCR der mit siRNS behandelten Astrozyten....................112
4.4.5
Quantifizierung von TMEV-Minus-Strang-RNS in Mikroglia.....116
IV
Inhaltsverzeichnis
Kapitel 5
Diskussion.............................................................................119
5.1
Geringe Replikation des Theilervirus in Mikroglia…….................120
5.2
Proliferationshemmung und Apoptose/Nekrose
durch TMEV in Astrozyten...............................................................122
5.3
Unterschiede zwischen nicht infizierten Astrozyten
und Mikroglia in der basalen Genexpression von
Transkriptionsfaktoren, MMPs und Zytokinen...............................123
5.4
Beeinflussung der Genexpression von Transkriptionsfaktoren, Zytokinen und MMPs durch die TMEV-Infektion...........124
5.4.1
Die Rolle der Transkriptionsfaktoren und Zytokine
im Verlauf der TMEV-Infektion.................................................125
5.4.1.1
Bedeutung von p50 für die TMEV-induzierte
5.4.1.2
Expression von Max im Verlauf der TME.................................127
5.4.1.3
Bedeutung von Ets-1 und p53 für die
5.4.1.4
Interaktionen der untersuchten Transkriptionsfaktoren............129
Transkription von TNF..............................................................125
Pathogenese der TME.............................................................129
5.4.2
5.5
Die Rolle der MMPs im Verlauf der TMEV-Infektion................132
Schlussbetrachtung..........................................................................136
Kapitel 6
Zusammenfassung..........................................................139
Kapitel 7
Summary..............................................................................143
Kapitel 8
Literaturverzeichnis.........................................................147
Kapitel 9
Anhang.................................................................................165
9.1
Bezugsquellen für Reagenzien und Einmalartikel….....................165
9.2
Bezugsquellen für Geräte.................................................................170
9.3
Lösungen und Puffer........................................................................174
9.3.1
Lösungen und Puffer in der Molekularbiologie.....................174
Inhaltsverzeichnis
9.3.2
V
Medien und Puffer in der Zellkultur........................................175
9.4
Danksagung.......................................................................................184
9.5
Erklärung............................................................................................185
VI
Inhaltsverzeichnis
Liste der Abkürzungen
VII
Abkürzungen
Abb.
Abbildung
AP-1
Aktivator Protein-1
APC
Antigen-präsentierende Zellen
bZIP-Domäne
basische DNA-Bindungsdomäne kombiniert mit einer LeucinZipper-Region
CAMK II
Kalzium/Kalmodulin-abhängige Proteinkinase II
CBP
”CREB-binding protein“
CREB
“cyclic AMP response element-binding protein”
CTL
CD8+ zytotoxische T-Zellen
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNS
Desoxyribonukleinsäure
ds
doppelsträngig
EAE
Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
EBS
ETS-Bindungsstelle
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ERK
Extrazellulär-signalregulierte Kinase
ETS
“E26 transformation specific sequence”
EZM
Extrazelluläre Matrix
FasL
Fas-Ligand
FKS
Fetales Kälberserum
GAPDH
Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
GZ
Galaktozerebrosid
GdF Gesellschaft der Freunde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
h
Stunde
HDAC
“Histon-Deacetylase“
HE
Hämatoxylin-Eosin
HGF
“Hepatocyte growth factor”
HIF-1
“Hypoxia-inducible factor-1”
HPRT
Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase
VIII
Liste der Abkürzungen
IEG
“Immediate early gene”
IFN-γ
Interferon-γ
IκB
Inhibitor von NF-κB
IKK
IκB Kinase
IL
Interleukin
IP-10
Interferon-induzierbares Protein 10
IRES
“N-terminal internal ribosome entry site”
JNK
c-JUN N-terminale Kinase
LFB-CV
Luxol Fast Blue-Kresylviolett
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MBP
Basisches Myelinprotein
MCP-1
Monozyten-Chemoattraktives Protein-1
MEK
MAPK-Kinase
MEKK
MEK-Kinase
min
Minute
MHC
Haupthistokompatibilitätskomplex
MLCK
Myosin-Leichtketten-Kinase
MMP
Matrix-Metalloproteinase
MOG
Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
MOI
“Multiplicity of Infection”
mRNS
Boten-RNS
NEMO
NF-κB essentieller Modulator
NF-κB
“Nuclear factor that binds the kappa light chain enhancer in B
cells”
NIK
NF-κB induzierende Kinase
MS
Multiple Sklerose
ORF
“Open reading frame”
p38
38 kDa Mitogen-aktivierte Proteinkinase
PCR
Polymerase-Ketten-Reaktion
PDGF
“Platelet-derived growth factor”
PFU
“Plaque-forming unit“
Liste der Abkürzungen
IX
p.i.
nach der Infektion (post infectionem)
PKR
ds-RNS-abhängige Proteinkinase
PLP
Myelin-Proteolipid-Protein
PP
Primär-progressiv
RANTES
“Regulated on activation, normal T lymphocytes expressed and
RHD
Rel-Homologie-Domäne
RNS
Ribonukleinsäure
secreted”
RPA
”Ribonuclease protection assay“
RSZ
Reaktive Sauerstoffzwischenprodukte
RT-qPCR
quantitative Reverse Transkription Echtzeit-PCR
RR
Rezidivierend-remittierend
RT
Raumtemperatur
s
Sekunde
SAPK
Stress-aktivierte Proteinkinase
SDHA
Succinate Dehydrogenase Komplex Untereinheit A (katalytische
SP
Sekundär-progressiv
STAT-1α
”Signal transducer and activator of transcription“-1α
SUMO
“Small ubiquitin-related modifier”
Domäne)
Tab.
Tabelle
TH1
T-Helferzelle vom Typ 1
TIMP
“Tissue inhibitor of metalloproteinase”
TME
“Theiler’s murine encephalomyelitis”
TMEV
"Theiler’s murine encephalomyelitis virus"
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
TNF-R1
TNF-Rezeptor 1
TO
Theiler’s Original
TRADD
TNF-R assoziierte Todesdomäne
TRAF-2
TNF-R assoziierter Faktor-2
TRAIL
“TNF-related apoptosis-inducing ligand”
X
Liste der Abkürzungen
VP
Virusprotein
ZNS
Zentrales Nervensystem
Liste der Abbildungen und Tabellen
XI
Liste der Abbildungen und Tabellen
Abb. 2.1:
Klinischer Verlauf der Muliplen Sklerose...................................................8
Abb. 2.2:
Signalweg der Aktivierung von “Immediate Early Genes“.......................22
Abb. 2.3:
NF-κB- und MAPK-Signaltransduktionkaskaden nach einer
Aktivierung durch TNF.............................................................................24
Abb. 2.4:
Aktivierung von c-jun durch Phosphorylierung und
Azetylierung verschiedener Aminosäurereste.........................................29
Abb. 3.1:
Abb. 4.1:
Herstellung der Mischkultur glialer Zellen................................................39
TMEV-infizierte BHK-21-Zellen (A,B) und L2-Zellen (C,D)
72 h nach der TMEV-Infektion.................................................................59
Abb. 4.2:
Plaquetest................................................................................................60
Abb. 4.3:
Nachweis des TMEV in L2-Zellen mittels Immunfluoreszenz
72 h nach der TMEV-Infektion.................................................................61
Abb. 4.4:
Mischkultur glialer Zellen 7 Tage nach der Isolation aus
neonatalen SJL/J-Mäusen.......................................................................62
Abb. 4.5:
Abb. 4.6:
Auftrennung glialer Zellen neonataler SJL/J-Mäuse................................63
Primäre Mikroglia 6 (A,B), 48 (C,D), 72 (E,F) und 240 (G,H)
Stunden nach der TMEV-Infektion..........................................................64
Abb. 4.7:
Prozentsatz GFAP- und TMEV-positiver primärer Astrozyten
und Anzahl an PFU/ml Zellkulturüberstand in der Monokultur................65
Abb. 4.8:
Primäre Astrozyten 6 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur......66
Abb. 4.9:
Primäre Astrozyten 12 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur....67
Abb. 4.10: Primäre Astrozyten 24 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur....67
Abb. 4.11: Primäre Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur....68
Abb. 4.12: Primäre Astrozyten 72 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur....68
Abb. 4.13: Primäre Astrozyten 240 h nach der TMEV-Infektion
in der Monokultur.....................................................................................69
Abb. 4.14: Primäre Mikroglia 240 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.....69
Abb. 4.15: Prozentsatz GFAP- und TMEV-positiver primärer Astrozyten
und Anzahl an PFU/ml Zellkulturüberstand in der Kokultur.....................70
XII
Liste der Abbildungen und Tabellen
Abb. 4.16: Primäre Astrozyten 72 h nach der TMEV-Infektion in der Kokultur.........71
Abb. 4.17: Primäre Mikroglia und L2-Zellen 72 h nach der TMEV-Infektion
in der Kokultur.........................................................................................72
Abb. 4.18: Zellzahl der primären Astrozyten (A) und Mikroglia (B)
in der Monokultur.....................................................................................73
Abb. 4.19: Zellzahl der primären Astrozyten (A) und Mikroglia (B)
in der Kokultur.........................................................................................75
Abb. 4.20: Proliferationsrate von primären Astrozyten.............................................76
Abb. 4.21: Proliferation von primären Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion.....77
Abb. 4.22: Zellzahl von primären Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion...........78
Abb. 4.23: Apoptoserate von primären Astrozyten...................................................79
Abb. 4.24: Apoptose von primären Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion.........80
Abb. 4.25: Relative Genexpression von NF-κB (p50/p65) und AP-1
(c-jun/c-fos) in nicht infizierten und TMEV-infizierten
primären Astrozyten (Monokultur)...........................................................84
Abb. 4.26: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht
infizierten und TMEV-infizierten primären Astrozyten (Monokultur)........85
Abb. 4.27: Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in nicht infizierten und TMEV-infizierten
primären Astrozyten (Monokultur)...........................................................87
Abb. 4.28: Relative Genexpression von NF-κB (p50/p65) und AP-1
(c-jun/c-fos) in nicht infizierter und TMEV-infizierter
primärer Mikroglia (Monokultur)...............................................................90
Abb. 4.29: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht
infizierter und TMEV-infizierter primärer Mikroglia (Monokultur).............91
Abb. 4.30: Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in nicht infizierter und TMEV-infizierter
primärer Mikroglia (Monokultur)...............................................................93
Abb. 4.31: Relative Genexpression von NF-κB (p50/p65) und AP-1
(c-jun/c-fos) in nicht infizierten und TMEV-infizierten
primären Astrozyten (Kokultur)................................................................95
Liste der Abbildungen und Tabellen
XIII
Abb. 4.32: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht
infizierten und TMEV-infizierten primären Astrozyten (Kokultur).............96
Abb. 4.33: Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in nicht infizierten und TMEV-infizierten
primären Astrozyten (Kokultur)................................................................98
Abb. 4.34: Relative Genexpression von NF-κB (p50/p65) und AP-1
(c-jun/c-fos) in nicht infizierter und TMEV-infizierter
primärer Mikroglia (Kokultur).................................................................100
Abb. 4.35: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht
infizierter und TMEV-infizierter primärer Mikroglia (Kokultur)................101
Abb. 4.36: Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in nicht infizierter und TMEV-infizierter
primärer Mikroglia (Kokultur).................................................................103
Abb. 4.37: Vergleich der Genexpression zwischen Astrozyten und Mikroglia........111
Abb. 4.38: Normalisierte Genexpression von p50 in nicht
und TMEV-infizierten Astrozyten...........................................................113
Abb. 4.39: Normalisierte Genexpression von c-jun in nicht
und TMEV-infizierten Astrozyten...........................................................114
Abb. 4.40: Normalisierte Genexpression von TNF in nicht
und TMEV-infizierten Astrozyten...........................................................115
Abb. 4.41: Normalisierte TMEV-RNS-Expression in Mikroglia 6, 48, 72
und 240 Stunden nach der Infektion mit TMEV.....................................117
Abb. 5.1:
Einfluss des Myc/Max/Mad-Netzwerks auf
die Proliferation und Differenzierung von Zellen....................................128
Abb. 5.2:
Hemmung der Transkription von MMP-9 durch IFN-γ...........................134
XIV
Liste der Abbildungen und Tabellen
Tab. 2.1:
Tiermodelle demyelinisierender Erkrankungen.......................................3
Tab. 2.2:
Morphologische Varianten der Demyelinisierung
bei Multipler Sklerose..............................................................................9
Tab. 3.1:
Liste der verwendeten Primärantikörper...............................................44
Tab. 3.2:
Produktname, Katalog-Nr. und Zielsequenz der für p50
Tab. 4.1:
TMEV-RNS-Expression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
und c-jun spezifischen und der unspezischen siRNSs.........................56
in primären Astrozyten und primärer Mikroglia
6, 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion......................................81
Tab. 4.2:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1,
p53, Max und TNF in primären Astrozyten 6, 48 und
240 Stunden nach der Infektion (Monokultur).......................................83
Tab. 4.3:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in primären Astrozyten 6, 48, 72 und
240 Stunden nach der Infektion (Monokultur).......................................86
Tab. 4.4:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1,
p53, Max und TNF in primärer Mikroglia 6, 48 und
240 Stunden nach der Infektion (Monokultur).......................................89
Tab. 4.5:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in primärer Mikroglia 6, 48, 72 und
240 Stunden nach der Infektion (Monokultur).......................................92
Tab. 4.6:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1,
p53, Max und TNF in primären Astrozyten 6, 48 und
240 Stunden nach der Infektion (Kokultur)............................................94
Tab. 4.7:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in primären Astrozyten 6, 48, 72 und
240 Stunden nach der Infektion (Kokultur)............................................97
Tab. 4.8:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1,
p53, Max und TNF in primärer Mikroglia 6, 48 und
240 Stunden nach der Infektion (Kokultur)............................................99
Liste der Abbildungen und Tabellen
Tab. 4.9:
XV
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in primärer Mikroglia 6, 48, 72 und
240 Stunden nach der Infektion (Kokultur)..........................................102
Tab. 4.10:
Korrelation der Genexpression von TMEV, p50, p65, c-jun,
c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und
MMP-12 in primären Astrozyten (Monokultur).....................................104
Tab. 4.11:
Korrelation der Genexpression von TMEV, p50, p65, c-jun,
c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und
MMP-12 in primärer Mikroglia (Monokultur)........................................105
Tab. 4.12:
Korrelation der Genexpression von TMEV, p50, p65, c-jun,
c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und
MMP-12 in primären Astrozyten (Kokultur).........................................107
Tab. 4.13:
Korrelation der Genexpression von TMEV, p50, p65, c-jun,
c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und
MMP-12 in primärer Mikroglia (Kokultur).............................................108
Tab. 4.14:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1,
p53, Max, TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
nicht infizierter Monokultur und Kokultur.............................................110
Tab. 9.1:
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in nicht infizierten
Astrozyten (Monokultur)......................................................................176
Tab. 9.2:
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in TMEV-infizierten
Astrozyten (Monokultur)......................................................................177
Tab. 9.3:
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in nicht infizierter
Mikroglia (Monokultur).........................................................................178
Tab. 9.4:
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in TMEV-infizierter
Mikroglia (Monokultur).........................................................................179
XVI
Tab. 9.5:
Liste der Abbildungen und Tabellen
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in nicht infizierten
und TMEV-infizierten Astrozyten (Kokultur)........................................180
Tab. 9.6:
Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS)
von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen in nicht infizierter
und TMEV-infizierter Mikroglia (Kokultur)............................................181
Einleitung
1
1
Einleitung
Die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis ("Theiler’s murine encephalomyelitis",
TME) wird durch das "Theiler’s murine encephalomyelitis virus" (TMEV), ein
Cardiovirus
aus
der
Familie
Picornaviridae,
verursacht
(THEILER,
1934;
RACANIELLO, 2001). Da zahlreiche pathogenetische Merkmale, wie z. B.
Autoimmunität und genetisch bedingte Empfänglichkeit, sich sowohl bei der TME als
auch bei der Multiplen Sklerose (MS) finden, stellt die TME eines der wichtigsten
Tiermodelle für humane demyelinisierende Erkrankungen dar (LIPTON et al., 2005;
OLESZAK et al., 2004). Die Initiation und Progression der TME beruht auf einer
Viruspersistenz, die zu einer Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV)
gegen das Virus- und im Verlauf der Erkrankung auch gegen Myelinepitope führt.
Grundsätzlich werden hoch- und schwachvirulente TMEV-Stämmen unterschieden.
Die hochvirulenten Virusstämme, GDVII und FA rufen eine akute tödliche
Polioenzephalomyelitis im zentralen Nervensystem (ZNS) von Mäusen hervor. Im
Gegensatz dazu wird nach einer intrazerebralen Infektion mit den schwachvirulenten
BeAn- und DA-Virusstämmen in empfänglichen SJL/J-Mäusen ein biphasischer
Krankheitsverlauf mit Viruspersistenz induziert (LIPTON, 1980; OLESZAK et al.,
2004; WELSH et al., 1989). Dieser ist durch eine akute milde Polioenzephalomyelitis
und
eine
späte
chronische
progrediente
Phase
mit
demyelinisierender
Leukoenzephalomyelitis charakterisiert (LIPTON et al., 1994). Die chronische
demyelinisierende TME stellt ein anerkanntes Tiermodell für die primär progressive
Verlaufsform der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen dar (HAFLER, 1999;
HAFLER u. WEINER, 1995; TSUNODA u. FUJINAMI, 1996).
Astrozyten und Mikroglia/Makrophagen sind am Prozess der Demyelinisierung
beteiligt, in dem sie Zytokine, reaktive Sauerstoffradikale und unterschiedliche
Proteasen, wie z. B. Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), ausschütten (GERHAUSER,
2007; LIPTON et al., 2005; OLESZAK et al., 2004; SATO et al., 1997; ULRICH et al.,
2006). MMPs sind Zink-abhängige Enzyme, die Moleküle der extrazellulären Matrix
abbauen und dadurch die Blut-Hirn-Schranke zu öffnen vermögen, das Einströmen
von Entzündungszellen begünstigen, die Freisetzung von Tumor-Nekrose-Fakor
2
Einleitung
(TNF) katalysieren und Myelin abbauen können. Die molekularen Mechanismen, die
die Expression dieser krankheitsauslösenden Proteine kontrollieren, sind bisher
kaum erforscht. NF-κB (p50/p65), AP-1 (c-jun/c-fos), Ets-1, Max und p53 stellen sich
gegenseitig beeinflussende Transkriptionsfaktoren dar, die im Verlauf einer
Entzündung aktiviert werden (CAAMAÑO u. HUNTER, 2002; ROSENBERG, 2002).
Zellkulturstudien haben gezeigt, dass diese Transkriptionsfaktoren in Astrozyten
durch TMEV induziert werden und dadurch die Produktion von Zytokinen
einschließlich TNF veranlasst wird (KWON et al., 2004; PALMA et al., 2003; RUBIO
et al., 1996; RUBIO u. MARTIN-CLEMENTE, 1999). In vivo Experimente an SJL/JMäusen deuten ebenfalls auf eine wichtige Funktion von NF-κB, Ets-1 und c-jun für
die Expression von TNF und IFN-γ in Astrozyten hin (GERHAUSER et al., 2007a;
GERHAUSER
et
al.,
2007b).
Der
jeweilige
Beitrag
der
untersuchten
Transkriptionsfaktoren an der Expression dieser Zytokine in Astrozyten und
Mikrogliazellen konnte jedoch in vivo nicht geklärt werden.
Das Ziel dieser Studie ist die Ermittlung des Expressionsprofils verschiedener
Transkriptionsfaktoren in mono- und kokultivierten Astrozyten und Mikrogliazellen
nach der Infektion mit dem BeAn TMEV-Stamm. Die Zellkulturbedingungen in einer
Kokultur sind eher mit einer physiologischen Umgebung zu vergleichen als die
Verhältnisse in einer Monokultur, da sich kokultivierte Zelllinien gegenseitig bei der
Expression von Zytokinen beeinflussen können (ALOISI et al., 1997). Durch die
geplanten Untersuchungen kann der jeweilige Beitrag der einzelnen Zellen zu dem
Expressionsprofil der untersuchten Transkriptionsfaktoren und ein wechselseitiger
Einfluss von Astrozyten und Mikroglia im Verlauf der TME näher geklärt werden.
Hierdurch sollen weitere Erkenntnisse zur Beteiligung von Astrozyten und Mikroglia
an Entmarkungsprozessen gewonnen werden.
Literaturübersicht
2
3
Literaturübersicht
2.1 Experimentell induzierte und spontan auftretende demyelinisierende
Erkrankungen
Zahlreiche
entzündliche
und
metabolische
Erkrankungen
des
zentralen
Nervensystems (ZNS) können zu Schäden an den Myelinscheiden und daraus
folgenden Symptomen wie Sprach- und Sehstörungen und Paralysen führen. Obwohl
das ZNS normalerweise durch die Blut-Hirn-Schranke von dem Immunsystem
abgeschottet wird, tritt hierbei häufig eine Infiltration des ZNS durch verschiedene
Immunzellen auf. Diese Immunzellinfiltration kann die primäre Ursache einer
Demyelinisierung darstellen. Im Gegensatz hierzu können sich Immunzellen
insbesondere Makrophagen im Bereich vorbestandener Läsionen im Rahmen einer
Abräumreaktion ansammeln und dort zu sekundären Schäden des umliegenden
Parenchyms
führen.
Die
Multiple
Sklerose
(MS)
stellt
die
wichtigste
demyelinisierende Erkrankung des ZNS beim Menschen dar (ERCOLINI u. MILLER,
2006). Daher wurde eine große Anzahl an Tiermodellen entwickelt, um die
pathogenetischen Mechanismen des Demyelinisierungsprozesses der MS zu
untersuchen (Tab. 2.1).
Tab. 2.1: Tiermodelle demyelinisierender Erkrankungen.
Infektiöse
Ursachen
Toxische
Substanzen
Kanine
Staupevirus
Lysolezithin
Murine Theilerenzephalomyelitisvirus
Ethidiumbromid
Murine
Hepatitisvirus
Cuprizone
Semliki-ForestVirus
.
Autoimmune
Reaktionen
Experimentelle
Autoimmune
Enzephalomyelitis
Bacillus Calmette-Guérin
induzierte
Hypersensitivitätsreaktion
vom verzögerten Typ
Injektion von Antikörpern
gegen Galactocerebrosid
und Serumkomplement
.
Genetischer
Hintergrund
MBP Mutation
(“Shiverer“ Maus)
PLP Mutation
(“Rumpshaker”
und “Jimpy”
Maus)
GCase Mutation
(“Twitcher“ Maus)
.
Legende: GCase, Galakto-Zerebrosidase; MBP, basisches Myelinprotein; PLP,
Myelin-Proteolipid-Protein.
4
Literaturübersicht
Eine Demyelinisierung kann durch verschiedene Viren und toxische Substanzen
induziert werden (LAVI u. CONSTANTINESCU, 2005; RODRIGUEZ 2007; WELSH
et al. 1990). Außerdem verursachen einige experimentell induzierte autoimmune
Reaktionen und genetische Mutationen Schäden an der Myelinscheide (ANDREWS
et al., 2006; DELASSALLE et al., 1981; KEIRSTEAD u. BLAKEMORE, 1997;
KONDO et al., 2005; MATYSZAK, 1998; SCHNEIDER et al., 1992).
2.1.1 Staupevirusenzephalitis des Hundes
Die Ursache der Staupevirusenzephalitis des Hundes stellt das kanine Staupevirus,
ein Morbillivirus der Familie Paramyxoviridae, dar (BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER,
2005). Das Wirtsspektrum dieses Virus umfasst zahlreiche marine Säuger und alle
Familien terrestrisch lebender Karnivoren: Canidae, Felidae, Hyaenidae, Mustelidae,
Procyonidae, Ursidae, and Viverridae (ALLDINGER et al., 1993a; BAUMGÄRTNER
et al., 2003; DEEM et al., 2000). Das Staupevirus infiziert überwiegend gliale Zellen
und verursacht vermutlich aufgrund eines biphasischen Erkrankungsprozesses
sowohl akute als auch chronische Läsionen im ZNS (ALLDINGER et al., 1993b;
ORLANDO et al., 2008; SEEHUSEN et al., 2007). Während bei den akuten Läsionen
eine große Menge an Staupevirusantigen im ZNS gefunden wird, findet man in
chronischen Läsionen eine Verringerung oder sogar einen totalen Verlust an viralen
Proteinen (ALLDINGER et al., 1993b; BAUMGÄRTNER et al., 1989). Aufgrund des
fortschreitenden Demyelinisierungsprozesses und Fehlens viraler Proteine, wird als
Ursache dieser chronischen Läsionen eine immunpathologische Pathogenese
vermutet. ALLDINGER et al. (1996) zeigten die starke Hochregulation des
Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II (MHC II), die von einer massiven
Infiltration
von
Lymphozyten
begleitet
wird.
Verschiedene
Studien
zur
Immunphänotypisierung dieser Lymphozyten zeigten, dass sich im Neuroparenchym
überwiegend CD8+-T-Zellen befinden, während sich CD4+-T-Zellen und B-Zellen im
perivaskulären Bereich ansammeln (BEINEKE et al., 2009; VAN MOLL et al., 1995).
Im Blut vieler an einer Staupevirusenzephalitis erkrankter Hunde scheinen pro- und
anti-inflammatorische Zytokinen gleichzeitig aufzutreten (FRISK et al., 1999; GRÖNE
et
al.,
1998).
Weiterhin
wiesen
mehrere
Studien
im
Verlauf
einer
Literaturübersicht
5
Staupevirusenzephalitis im Gehirn das Überwiegen von pro- gegenüber antiinflammatorischen Zytokinen insbesondere von TNF und IL-6, -8, und –12 nach
(BEINEKE et al. 2008; GRÖNE et al., 2000; MARKUS et al., 2002). Mittels
Immunhistologie
wurde
die
Rolle
der
extrazellulären
Matrix
(EZM)
im
Erkrankungsprozess untersucht. Dabei zeigte sich eine markante Hochregulation des
CD44-Antigens, welcher in akuten Läsionen auf Astrozyten gefunden wurde
(ALLDINGER et al., 2000). Die Aktivierung dieses Hyaluronsäurerezeptors könnte zu
einer Expression von Zytokinen und Chemokinen führen und dadurch den
Entzündungsprozess auslösen und aufrechterhalten. Weiterführende Studien zeigten
eine Hochregulation verschiedener Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und ihrer
Inhibitoren (“tissue inhibitors of metalloproteinases”, TIMPs) im Verlauf der
Demyelinisierung der Staupevirusenzephalitis (ALLDINGER et al., 2006; GRÖTERS
et al., 2005; MIAO et al., 2003). MMPs sind an einer großen Anzahl physiologischer
und pathologischer Prozesse im Organismus von Säugetieren beteiligt, in dem sie
EZM-Moleküle abbauen und Oberflächenrezeptoren, extrazelluläre Enzyme, Zytokine
und Hormone spalten (MC CAWLEY u. MATRISIAN, 2001; STAMENKOVIC, 2003).
In akuten und subakuten nicht-entzündlichen Staupevirusläsionen wurde mittels
Doppelfärbungen nachgewiesen, dass diese Proteine überwiegend durch Astrozyten
und Gehirnmakrophagen/Mikrogliazellen exprimiert
werden. Zusätzlich waren
einwandernde perivaskuläre mononukleäre Zellen MMP- und TIMP-positiv (MIAO et
al., 2003). Die Entstehung und das Fortschreiten der Läsionen scheint also auf eine
gesteigerte
Freisetzung
von
proinflammatorischen
Zytokinen
und
einem
Ungleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs zurückzugehen.
2.1.2 Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
Viele Tiermodelle sind bisher benutzt worden, um die Vielfalt der klinischen
Erscheinungsformen
einer
Demyelinisierung
des
ZNS
beim
Menschen
zu
untersuchen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient seit
1930 als ein Tiermodell in Mäusen, Ratten und Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus)
zur
Erforschung
der
schubförmig
remittierenden
Form
der
MS,
welches
ausschließlich den immunpathologischen Teil der Pathogenese der Demyelinisierung
6
Literaturübersicht
abdeckt (ERCOLINI u. MILLER, 2006; SWANBORG, 2001; ‘T HART et al., 2004).
Die EAE wird durch eine Verabreichung von verschiedenen Myelinproteinen, wie das
“myelin proteolipid protein“ (PLP) und das “myelin basic protein“ (MBP), oder
einzelner Myelinepitope unter Verwendung unterschiedlicher Adjuvanzien oder durch
die Übertragung von CD4+-T-Zellen, die gegen spezifische Myelinproteine gerichtet
sind, hervorgerufen. Diese Studien haben wichtige Informationen über die
Interaktionen der T-Zellen und ihren Beitrag zur Entwicklung autoimmuner
Krankheiten geliefert. Ein grundlegendes Merkmal der EAE ist das Phänomen des
“epitope
spreading”.
Hierbei
führen
die
mit
der
Zeit
sich
entwickelnden
Immunreaktionen gegen endogene Bestandteile des ZNS zu einer Auffächerung der
anfänglichen Immunantwort und sekundär zu einer akuten Zerstörung der
Myelinscheide (ERCOLINI u. MILLER, 2006). Eine rezidivierend-remittierende
Erkrankung bei SJL/J-Mäusen, die durch eine Verabreichungvon PLP139-151 induziert
werden kann, ist beispielsweise durch einen ersten gegen PLP178-191 und einen
zweiten gegen MBP84-104 gerichteten Rückfall gekennzeichnet, die beide durch eine
TH1-Immunantwort ausgelöst werden (ERCOLINI u. MILLER, 2006). Ebenso nimmt
die Anzahl an Myelinepitopen, die T-Zellen bei an MS erkrankten Patienten
erkennen, im Verlauf der Erkrankung zu. Dennoch scheint es keinen direkten
Zusammenhang zwischen der Anzahl an Epiotpen, die von T-Zellen erkannt werden,
und der Krankheitsdauer zu geben (DAVIES et al., 2005).
2.1.3 Multiple Sklerose
Die Multiple Sklerose (MS) ist in den Industrieländern die häufigste neurologische
Erkrankung bei jungen Erwachsenen und führt sowohl zu
Kombinationen
von
motorischen,
sensorischen,
visuellen
verschiedenen
und
kognitiven
Beeinträchtigungen als auch zu unterschiedlichen Symptomen wie Müdigkeit und
Funktionsstörungen des Urogenitaltraktes (ACHIRON u. BARAK, 2003; ROSCHE et
al., 2003). Diese Erkrankung wurde ursprünglich als eine Entzündung der weißen
Substanz des ZNS betrachtet, die durch große, multifokale, demyelinisierte Herde
(„plaques)“ mit reaktiver glialer Narbenbildung, Axonschädigung und Verlust
neurologischer Funktionen charakterisiert ist (BAR-OR et al., 1999; LASSMANN et
Literaturübersicht
al.,
2001).
7
Der
Prozess
der
Demyelinisierung
wird
von
einer
Entzündungszellinfiltration begleitet, die überwiegend aus T-Zellen und Makrophagen
besteht (BRÜCK et al., 1996). Eine Demyelinisierung im Bereich des Kortex und
tiefer gelegener Kerngebiete des Hirnstamms und diffuse Schäden der normal
erscheinenden weißen Substanz erweitert das Spektrum der MS-Pathologie
(LASSMANN et al., 2007). In Deutschland leiden etwa 100.000 Menschen und in den
USA ungefähr 350.000 Menschen unter MS (BAR-OR et al., 1999). Diese Krankheit
tritt typischerweise zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr auf, wobei Frauen doppelt
so häufig erkranken wie Männer (ROSCHE et al., 2003). Es wird vermutet, dass das
Zusammenspiel zahlreicher genetischer und umweltbedingter Faktoren zum
Ausbruch der autoimmunen Demyelinisierung führt. So erkranken Kaukasier öfter an
MS als Afrikaner oder Asiaten, da bei Ihnen spezifische DR-Haplotypen der
Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse II gehäuft auftreten (ROSCHE et al.,
2003). Außerdem werden über 20 verschiedene Bakterien und Viren, unter anderem
Chlamydia pneumoniae, humanes Herpesvirus 6, Epstein-Barr-Virus, kanines
Staupevirus und Masenvirus, mit der Krankheit in Zusammenhang gebracht (CEPOK
et al., 2005; SIPS et al., 2007; SWANBORG et al., 2003).
Die MS wird in eine rezidivierend-remittierende (RR)- und eine primär-progressive
(PP)-Form eingeteilt, unter der ca. 80-90 % bzw. 10-20% aller MS-Patienten leiden
(ROSCHE et al., 2003; Abb. 2.1). Die RR-Form der Erkrankung wird durch eine
Aufeinanderfolge von sogenannten Schüben charakterisiert, die den Patienten
verschieden stark beeinträchtigen. Nach einer partiellen oder vollständigen
Genesung und einer Ruhephase unterschiedlicher Zeitdauer schließt sich häufig ein
weiterer Schub an. Dieser Verlauf der Erkrankung wandelt sich letztendlich in den
Mehrheit der RR-Patienten (ungefähr 80%) zu der sekundär-progressiven (SP)-Form
der MS (RAMSARANSING u. DE KEYSER, 2006; VUKUSIC u. CONFAVREUX,
2003). Die akuten Schübe fehlen den progressiven Formen der Erkrankung.
Stattdessen sind sie typischerweise durch eine stetige klinische Verschlechterung
gekennzeichnet. Während die irreversiblen neurologischen Schäden durch die
Abnahme in der Neuritendichte vermittelt werden, die in chronischen Läsionen bis zu
50-70% betragen kann, werden die funktionellen Beeinträchtigungen in RR-Patienten
8
Literaturübersicht
überwiegend durch die Entzündung und Demyelinisierung verursacht (BAR-OR et al.,
1999). Interessanterweise wurde auch ein „gutartiger“ Verlauf der MS beschrieben,
der nur eine geringe oder keine Progression im Schweregrad der Erkrankung zeigt
(Abb. 2.1). Dennoch ist es immer noch schwierig zu prognostizieren, ob der Verlauf
von Beginn an gutartig ist oder bis zu einer schweren klinischen Behinderung
fortschreiten wird. Die Häufigkeit des “gutartigen“ Verlaufs der MS schwankt je nach
Definition und Studie zwischen 6% und 64%. Jedoch scheint die Aufrechterhaltung
oder Wiederherstellung des neuronalen Leitvermögens innerhalb von Läsionen des
ZNS entscheidend für einen “gutartigen“ Verlauf zu sein (RAMSARANSING u. DE
KEYSER, 2006).
Abb. 2.1:
Klinischer Verlauf der Muliplen Sklerose (LUBLIN u. REINGOLD,
1996; modifiziert).
„Gutartige“ Multiple Sklerose
(Keine Behinderung, Gesundung zwischen
den Schüben)
Rezidivierend-remittierende Multiple
Sklerose
Behinderung
(Keine neue Behinderung zwischen den Schüben)
Sekundär-progressive Multiple Sklerose
(Keine neue Behinderung zwischen den Schüben
gefolgt von einem unaufhörlichen Ansteigen der
Behinderung)
Primär-progressive Multiple Sklerose
(Unaufhörliches Ansteigen der Behinderung ohne
Auftreten von Schüben oder Phasen der Gesundung)
Zeit
MS wird herkömmlicherweise als eine chronische durch T-Helferzellen von Typ 1
vermittelte autoimmune Erkrankung angesehen. Primär scheint sich die autoimmune
Reaktion
gegen
das
Myelin
(Myelinopathy)
oder
gegen
Oligodendrozyten
(Oligodendrogliopathy) zu richten, wodurch sekundäre axonale Schäden entstehen.
Literaturübersicht
9
Gleichwohl wurde spekuliert, dass primäre axonale Schäden zu einer sekundären
Demyelinisierung
führen
können,
da
beschädigte
Axone
auch
in
normal
erscheinender weißer Substanz auftreten (TSUNODA u. FUJINAMI, 2002). Auf jeden
Fall können Myelinscheiden und Oligodendrozyten in unterschiedlichen Personen
durch verschiedene Mechanismen zerstört werden. Anhand von morphologischen
Gesichstpunkten wurden vier deutlich voneinander abgrenzbare Varianten der
Demyelinisierung bei MS beschrieben (LASSMANN et al., 2001; LUCCHINETTI et
al., 2000; Tabelle 2.2).
Tab. 2.2:
Morphologische Varianten der Demyelinisierung bei Multipler
Sklerose (LASSMANN et al., 2001; modifiziert).
Variante
Pathogenetischer Mechanismus der Demyelisierung
I
Makrophagen und ihre toxischen Produkte inklusive TNF, RSZ und
Proteinasen (Makrophagen-vermittelte Demyelinisierung)
II
Spezifische demyelinisierende Antikörper inklusive Anti-MOG und AntiGZ Antikörper (Antikörper-vermittelte Demyelinisierung)
Degenerative Veränderungen in distalen Ausläufern (ausgelöst durch
Ischämie, toxische Substanzen oder Viren), insbesondere denen
von periaxonalen Oligodendrozyten, mit nachfolgender Apoptose
(distale Oligodendrogliopathy und Apoptose)
Primäre Degeneration von Oligodendrozyten mit nachfolgender
Zerstörung des Myelins, möglicherweise durch einen metabolischen
Defekt verursacht (primäre Oligodendrogliale Degeneration)
III
IV
Legende: GZ,
Galaktozerebrosid;
MOG,
Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein;
RSZ, Reaktive Sauerstoffzwischenprodukte; TNF, Tumor-Nekrose-Faktor.
Während die Demyelinisierung bei der Variante I auf Makrophagen und/oder ihren
toxischen Produkten inklusive TNF, reaktiven Sauerstoffzwischenprodukten und
Proteinasen
beruht,
verursachen
Myelin-spezifische
Antikörper
und
Komplementfaktoren die Veränderungen bei der Variante II. Ischämie, toxische
Substanzen oder virale Infektionen können zu degenerativen Veränderungen an
periaxonalen Oligodendrozyten mit nachfolgender Apoptose führen, die die Ursache
der Demyelinisierung bei der Variante III darstellen. Die Zerstörung der
Myelinscheide bei der Variante IV geht auf eine primäre Degeneration von
Oligodendrozyten zurück, die häufig auf einem metabolischen Defekt beruht
10
Literaturübersicht
(LASSMANN et al., 2001). Folglich muss eine individuelle Therapie von MSPatienten
diese
heterogenen
Pathomechanismen
der
Läsionsentstehung
berücksichtigen. Die Entwicklung von paraklinischen Markern zur Unterscheidung
dieser
MS-Varianten
stellt
hierfür
eine
entscheidende
Vorraussetzung
dar
(LASSMANN et al., 2001).
2.1.4 Theilervirus-Enzephalomyelitis
Genom, Stämme und Rezeptoren des Theilervirus
Die TME stellt ein wichtiges Tiermodell demyelinisierender Erkrankungen dar, z. B.
der Hundestaupe oder der chronisch-progressiven Form der humanen Multiplen
Sklerose (MS; DAL CANTO u. RABINOWITZ, 1982; STOHLMANN u. HINTON,
2001). Das Theilervirus gehört wie das Enzephalomyokarditisvirus zu dem Genus der
Cardioviren der Familie Picornaviridae (THEILER, 1934). Die auf genetischer Ebene
sehr eng miteinander verwandten Theilervirus-Stämme werden in eine hoch- (GDVII,
FA) und eine schwachvirulente Untergruppe (DA, BeAn, To, Yale, WW) eingeteilt
(DANIELS et al., 1952; MICHIELS et al., 1995; MONTEYNE et al., 1997; PEVEAR et
al., 1988; ROZHON et al., 1983; THEILER u. GARD, 1940). Eine natürliche Infektion
durch das Theilervirus führt meist zu Entzündungen im Bereich des Intestinaltrakts
und betrifft nur gelegentlich das ZNS (WELSH et al., 1990). Allerdings entwickelt sich
nach einer intrazerebralen Infektion je nach Virus- und Mausstamm eine akute fatal
verlaufende Polioenzephalomyelitis mit einer Virusvermehrung in Neuronen (GDVII,
FA) oder ein biphasisches Krankheitsbild mit milder akuter Polioenzephalomyelitis
und chronischer, progredienter, demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis (BeAn,
DA;
LIPTON,
1975).
Der
zellkulturadaptierte
WW-Stamm
verursacht
eine
remittierende demyelinisierende Enzephalomyelitis (DAL CANTO u. BARBANO,
1984). Interessanterweise, geht aus den Infektionsversuchen mit chimären TMEVViren von FU et al. (1990) und RODRIGUEZ u. ROOS (1992) hervor, dass alle
Substämme des Theilervirus die Fähigkeit haben, in empfänglichen Mäusestämmen
eine Demyelinisierung hervorzurufen. Dies kommt bei den hochvirulenten Stämmen
Literaturübersicht
11
allerdings auf Grund der hohen Neurovirulenz und mangelnden Persistenz nicht zum
Ausdruck (DRESCHER et al., 1997).
Die Grundeinheit des Kapsids besteht aus jeweils einem Molekül der vier
Strukturproteine VP1-4, wobei VP1-3 an der Oberfläche liegen und VP4 in der Tiefe.
Das Kapsid setzt sich aus insgesamt 60 dieser Grundeinheiten zusammen und weist
20 dreieckige Flächen und 12 Ecken auf (LUO et al., 1992; RACANIELLO, 2001). Auf
Grund der verschiedenartigen Kapsidstruktur zwischen den Untergruppen des TMEV
kommt es vermittelt über unterschiedliche Virusrezeptoren zu einem veränderten
Zelltropismus, welcher die Infektion von Neuronen durch die hochvirulenten Stämme
und die Infektion von Makrophagen sowie anderer glialer Zellen durch die
schwachvirulenten Stämme begünstigt (BRAHIC et al., 2005; DRESCHER et al.,
1997; FU et al., 1990; JAROUSSE et al., 1996; JAROUSSE et al., 1998; MC
CRIGHT et al., 1999; O´SHEA et al., 1997; SATO et al., 1996).
Das virale Genom hat eine positive Polarität und eine Länge von ca. 8100
Nukleotiden. Es enthält keine subgenomische mRNS und ähnelt dem Genom des
Poliovirus (BRAHIC et al., 2005; OHARA et al., 1988; PEVEAR et al., 1987). Ein
großer offener Leserahmen (“open reading frame”, ORF) kodiert für ein 2303
Aminosäuren langes Polyprotein, dass in die 12 reifen Proteine L, VP4, VP2, VP3,
VP1, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, und 3D gespalten wird (BRAHIC et al., 2005;
OLESZAK et al., 2004). Die Translation des Polyproteins wird durch eine “internal
ribosome entry site“ (IRES) gesteuert, welche sich im nicht-kodogenen 5’-Bereich
des Virusgenoms befindet und kovalent an das Protein 3B gebunden ist. Dieser
Bereich unterscheidet das Theilervirus von allen anderen Viren der Familie
Picornaviridae (PEVEAR et al., 1987). Die viralen Proteine 2A und 3C sind die
Proteasen, welche die Spaltung des viralen Polyproteins katalysieren, und Protein 2C
ist eine Nukleosid-Triphosphatase (NTPase). 3D stellt die virale RNS-abhängige
RNS-Polymerase dar. Die genaue Funktion der viralen Proteine 2B und 3A ist noch
unbekannt (BRAHIC et al., 2005; DRESCHER et al., 1997; MONTEYNE et al., 1997;
RACANIELLO, 2001).
Das Protein L ist ein kleines Zink-Finger Protein und hemmt die Genexpression von
anti-viralen Zytokinen in infizierten Zellen, wie z. B. Interferon (IFN)-α und-β. Hierfür
12
Literaturübersicht
behindert es den Transport von zytoplasmatischen für die Transkription notwendigen
Proteinen in den Zellkern (BRAHIC et al., 2005; CHEN et al., 1995; DELHAYE et al.,
2004; VAN PESCH et al., 2001). Das Protein L* wird von einem alternativen ORF im
Bereich von L, VP4 und VP2 kodiert. Außerdem wird es mit der Persistenz des Virus
im ZNS in Verbindung gebracht, da es die über CD8+-T-Zellen vermittelte
Zytotoxizität verhindert und nur von Theilervirusstämmen exprimiert wird, die eine
biphasische Erkrankung verursachen (BRAHIC et al. 2005; CHEN et al., 1995; Lin et
al., 1999). Dieses Protein wird für die Vermehrung des Virus in Mikrogliazellen
benötigt, erleichtert die Infektion und hemmt die Apoptose von Makrophagen und
begünstigt daher das Überleben von persistent infizierten Makrophagen (BRAHIC et
al. 2005; GHADGE et al., 1998; OHARA et al., 2002; OLESZAK et al., 2004).
Theilervirusstämme werden in zwei Neurovirulenzgruppen eingeteilt. GDVII- und FAStämme sind hochvirulente Stämme, die in Zelkultur große “Plaques” und in vivo eine
fatal verlaufende Polioenzephalomyelitis mit massiver Apoptose von infizierten
Neuronen verursachen (TSUNODA et al., 1997). Die zweite Gruppe (“Theiler’s
original”, TO) beinhaltet die schwachvirulenten Stämme DA, BeAn, To, Yale und
WW, die in Zellkultur zu kleinen “Plaques“ führen und deren Zelltropismus auch gliale
Zellen und Makrophagen umfasst (OLESZAK et al., 2004). Diese Stämme
verursachen eine biphasische Erkrankung, die in der Frühphase aus einer milden
Polioenzephalomyelitis und in der Spätphase aus einer demyelinisierenden
Leukoenzephalomyelitis besteht (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975; LIPTON,
1980; TSUNODA u. FUJINAMI, 1996; YAMADA et al., 1991; ZOECKLEIN et al.,
2003). Klinische Anzeichen der Spätphase umfassen eine progressive Ataxie,
verminderte
Stellreflexe,
spastische
Paresen,
verstärkte
Beugereflexe
mit
Aufrechterhaltung des Schmerzempfindens und in schweren Fällen ein schlechtes
allgemeines
Erscheinungsbild
mit
einer
deutlichen
Einschränkung
der
physiologischen Verhaltensweisen (ULRICH et al., 2006).
Das Theilervirus ist prinzipiell in der Lage alle Mäusestämme zu infizieren (OLESZAK
et al., 1995). Während jedoch resistente C57BL/6- und Balb/c-Mäuse das Virus
schnell aus dem ZNS eliminieren, entwickeln SJL/J-Mäuse zu nahezu 100% und
CBA-Mäuse zu ca. 70% eine fortschreitende demyelinisierende Erkrankung
Literaturübersicht
13
(OLESZAK et al., 1995; WELSH et al., 1989). Neben dem Virus- und Mausstamm
spielen das Alter und das Geschlecht der Tiere eine entscheidende Rolle für den
Ausgang der Erkrankung. In Neonaten führt eine Infektion zu einer tödlich
verlaufenden Polioenzephalomyelitis. Demgegenüber sind Mäuse, die ein Alter von
10 Wochen überschritten haben, resistent gegen eine Demyelinisierung (WELSH et
al., 1989). In SJL/-Mäusen sind die weiblichen Tiere empfänglicher als die
Männlichen und sprechen eher auf eine Behandlung mit Zytokinen an (HILL et al.,
1998). Im Gegensatz dazu zeigen weibliche C57L/J-Mäuse eine stärkere initiale
antivirale Immunantwort im Vergleich zu männlichen Mäusen, durch die die
Persistent des Virus und die daraus folgende Krankheit verhindert wird (FULLER et
al., 2005).
Der Rezeptor, der für die Infektion einer Zelle mit dem Theilervirus verantwortlich ist,
wurde
bisher
nicht
Neurovirulenzgruppen
identifiziert.
Dennoch
des
unterschiedliche
Virus
zeigte
sich,
dass
die
zwei
Kohlenhydratkorezeptoren
benutzen, das Proteoglykan Heparansulfat bei hochvirulenten Stämmen und α2,3Sialinsäuren bei schwach virulenten Stämmen (LIPTON et al., 2005). Das
Bindevermögen der TO-Stämme an Sialinsäurekorezeptoren scheint für ihre
Persistenz im ZNS verantwortlich zu sein. Einerseits könnte die Sialinsäure eine
Bindung an und Infektion von Makrophagen durch das Theilervirus erklären.
Andererseits
könnten
die
Interaktionen
zwischen
Theilervirus-spezifischen
Antikörpern oder T-Zellen und dem an Sialinsäure gebundenen Theilervirus sterisch
behindert werden. Außerdem könnte eine Sialinsäurebindung zu einem axonalen
Transport des Virus führen, der die Ursache der Ausbreitung der Infektion aus den
Vorderhornzellen der grauen Substanz in die myelinisierten Axone der weißen
Substanz darstellen könnte (LIPTON et al., 2005).
Pathogenese der Theilervirusenzephalomyelitis
Zelltropismus, Viruspersistenz und Immunpathologie stellen wichtige Bestandteile der
Pathogenese der Demyelinisierung dar. Obwohl das Theilervirus alle Zelltypen in
vivo infizieren kann, gibt es eine beachtliche Verschiebung des Zelltropismus in den
ersten 2 bis 3 Wochen der Infektion. Zu Beginn sind die meisten infizierten Zellen
14
Literaturübersicht
Neurone, welche sich überwiegend im Ammonshorn, Kortex und dem Ventralhorn
des Rückenmarks befinden. Zwei Wochen nach der Infektion gleichzeitig mit dem
Höhepunkt der spezifischen Immunantwort verschwindet das Virus aus den
Neuronen und persistiert bei genetisch empfänglichen Mäusen in glialen Zellen der
weißen Substanz (BRAHIC et al., 2005). Die Persistenz des Virus stellt die
Vorraussetzung für die Auslösung und das Fortschreiten der Demyelinisierung dar
(RODRIGUEZ et al., 1997). “Real-time” PCR-Analysen der BeAn-Viruskopien wiesen
eine Abfall der Persistenz vom Rückenmark über den Hirnstamm, das Kleinhirn und
den Liquor bis letztendlich zu den Großhirnhemisphären nach (TROTTIER et al.,
2002). Unter den glialen Zellen scheinen die Makrophagen, welche von
infiltrierenden Monozyten und nicht Mikrogliazellen abstammen, das wichtigste
Reservoir des Virus zu sein, da eine Depletion der Monozyten mit ClodronateLiposomen
zu
einer
einschneidenden
Verringerung
der
Viruslast
und
Demyelinisierung führt (BRAHIC et al., 2005; LIPTON et al., 1995; LIPTON et al.,
2005). Trotz allem werden noch andere Zellen als Hauptvirusreservoir diskutiert. In
DA-infizierten C.B-17-Mäusen wurde virale RNS in 65% der Oligodendrozyten,
25.6% der Astrozyten und 9,3% der MiKrogliazellen/Makrophagen gefunden
(NJENGA et al., 1997). Außerdem zeigte ZHENG et al. (2001), dass sich die
Virusreplikation in BeAn-infizierten SJL/J-Mäusen eher in Astrozyten als in
Mikrogliazellen/Makrophagen abspielt. Daher stellen die großen Mengen viralen
Antigens in Makrophagen vermutlich lediglich phagozytierte Virusbestandteile und
nicht vollständige Viren dar (ZHENG et al., 2001). Diese sich teilweise
widersprechenden Ergebnisse der genannten Studien gehen vermutlich auf die
großen Unterschiede zwischen einer BeAn- und DA-induzierten Demyelinisierung
zurück, die trotz einer 93%igen Homologie in den Aminosäuren der zwei Stämme
vorliegen (ZOECKLEIN et al., 2003). So induziert der BeAn- gegenüber dem DAStamm einen deutlich schwächeren Verlauf der frühen Polioenzephalomyelitis,
obwohl BeAn-infizierte Mäusen viel schneller klinische Symptome z. B. einen
watschelnden Gang oder eine Hinterhandparalyse entwickeln (OLESZAK et al.,
2004).
Literaturübersicht
15
Im ZNS mit dem Theilervirus infizierte Makrophagen begrenzen in hohem Maße die
Produktion von infektiösen Viruspartikeln (LIPTON et al., 2005). Gleichermaßen
produzieren BeAn-infizierte myelomonozytäre Vorläuferzellen nur ungefähr 1
“plaque-forming unit“ (PFU) des infektiösen Virus pro Zelle. Demgegenüber erzeugen
Neurone oder Oligodendrozyten etwa 500 PFU pro Zelle (JELACHICH u. LIPTON,
2001; LIPTON et al., 2005). Eine hochgradige Begrenzung der Virusproduktion
zeigte sich auch in BeAn-infizierten peritonealen Makrophagen, die mit einer
massiven Apoptose einherging (JELACHICH et al., 2004). Interessanterweise
entstehen in in vitro kultivierten Makrophagen und Oligodendrozyten große
Kopienzahlen viraler RNS (TROTTIER et al., 2001). Der Zusammenbau viraler
Viruspartikel scheint durch die Apoptose Theilervirus-infizierter Makrophagen
verhindert zu werden. Hierbei kann die Apoptose einerseits direkt durch die
Replikation viraler RNS in nicht-aktivierten Makrophagen induziert werden.
Andererseits kann eine Bindung von TNF oder “TNF-related apoptosis-inducing
ligands” (TRAIL) an Rezeptoren von IFN-γ-aktivierten Makrophagen zu einer
Apoptose führen (LIPTON et al., 2005). SCHLITT et al. (2003) zeigten in BeAninfizierten SJL/J-Mäusen zahlreiche apoptotische Zellen in Läsionen der weißen
Substanz. 74% der apoptotischen Zellen waren T-Zellen, 8% waren Makrophagen,
0,6% waren Astrozyten und ungefähr 17% konnten nicht eindeutig identifiziert
werden. Folglich bilden T-Zellen die Mehrheit der apoptotischen Zellen in
Entzündungszellinfiltraten. Demgegenüber fanden OLESZAK et al. (2003) bei DAinfizierten Mäusen in der Spätphase der Erkrankung nur sehr wenige apoptotische
Zellen. Eine mangelhafte Apoptose von T-Zellen könnte zu einer Anreicherung dieser
potenziell autoimmunen Zellen in späten Läsionen der weißen Substanz führen und
damit zu einer Demyelinisierung beitragen (OLESZAK et al., 2003). Die
gegensätzlichen Ergebnisse dieser zwei Studien beruhen höchstwahrscheinlich
ebenfalls auf den Unterschieden zwischen den benutzten Virusstämmen und/oder
der Gabe einer etwa zehnfach größeren Virusmenge des BeAn- im Vergleich zum
DA-Stamm (LIPTON et al., 2005).
In den letzten Jahrzehnten wurde zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um die
pathogenetischen
Mechanismen
des
biphasischen
Krankheitsverlaufes
einer
16
Literaturübersicht
Theilervirusinfektion in empfänglichen Mäuse aufzuklären (LIPTON et al., 2005).
TSUNODA et al. (2003) schlugen die folgende Hypothese der Entwicklung der
Läsionen vor. Das Theilervirus infiziert zuerst Neurone in der grauen Substanz,
breitet sich anschließend axonal aus und infiziert dabei die umgebenden
Myelinscheiden
Degeneration
und
auch
Oligodendrozyten.
ein
vorteilhafter
Demgemäß
Mechanismus
könnte
zur
eine
axonale
Begrenzung
der
Virusverbreitung sein (TSUNODA et al., 2007; TSUNODA, 2008). Die infizierten
Neurone werden überwiegend durch Apoptose zerstört. Die Axone werden im
Rahmen einer Wallerschen Degeneration und/oder durch aktivierte Mikrogliazellen
und einwandernde Makrophagen und T-Zellen beschädigt. Makrophagen leisten
einen bedeutenden Beitrag an der Zerstörung der Myelinscheiden, da sie Myelin
direkt phagozytieren und durch die Freisetzung von zytotoxischen Substanzen wie
Zytokinen, Komplement, Stickstoffmonoxid, Sauerstoffradikalen und Proteasen
schwere Sekundärschäden im Gewebe verursachen können (TSUNODA u.
FUJINAMI, 1996; ULRICH et al., 2006).
Somit können die Entzündung, eine Infektion und ein Verlust axonaler trophischer
Substanzen zum Tod der Oligodendrozyten und letztendlich zur Demyelinisierung
beitragen.
Bruchstücke
des
Myelins
und
Virusantigen
werden
von
Mikrogliazellen/Makrophagen und Astrozyten phagozytiert und T-Zellen präsentiert.
Folglich agieren beide Zelltypen im Verlauf der Theilervirusinfektion als Antigenpräsentierende Zellen und rufen sowohl eine virusspezifische als auch eine
myelinspezifische Immunreaktion hervor (MACK et al., 2003; ZHENG et al., 2001).
Diese zweite gegen das Myelin gerichtete Immunantwort verschlimmert die axonalen
Schäden und verursacht die Aufrechterhaltung autoimmuner Prozesse (TSUNODA et
al., 2003). In der Spätphase der Erkrankung tritt eine starke Expression von TNF und
IFN-γ in SJL/J- im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen auf, die auf eine Beteiligung dieser
Zytokine an der fortschreitenden Demyelinisierung hindeutet (CHANG et al., 2000;
TROTTIER et al., 2004). Astrozyten können zahlreiche Zytokine und Chemokine wie
Interleukin-1, - 6, -12, TNF, und MCP-1 sezernieren (GRÖNE et al., 2000; PALMA et
al., 2003). Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle in der Homeostase des ZNS,
der synaptischen Plastizität und der Aufrechterhaltung der Bluthirnschranke (DONG
Literaturübersicht
17
u. BENVENISTE, 2001). Folglich haben Astrozyten einen entscheidenden Anteil an
den pathogenetischen Prozessen im Verlauf einer Theilervirusenzephalomyelitis.
Die Immunopathologie der demyelinisierenden TME scheint in erster Linie auf einer
Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ IV) zu beruhen (DAL CANTO et
al., 2000). Hierbei werden insbesondere die CD4+ T-Helferzellen vom Typ 1 (TH1Zellen) benötigt, welche gegen das persistierende virale Antigen im ZNS gerichtet
sind. Im Rahmen der antiviralen Immunreaktion werden Myelinscheiden beschädigt
und Myelinbestandteile freigesetzt. Diese Prozesse führen über ein “epitope
spreading“ zu einer Entstehung von Myelin-spezifischen TH1-Zellen, die zur
chronischen progressiven Erkrankung beitragen (DAL CANTO et al., 2000; KATZLEVY et al., 2000; MILLER et al., 2001; TOMPKINS et al. 2002). TH1-Zellen
reagieren innerhalb von 1 Woche nach der Infektion mit einer antiviralen
Immunanwort, die über 300 Tage andauert. Eine Myelin-spezifische T-Zell-Antwort
wird ab dem 50.-60. Tag nach der Infektion beobachtet, die ebenfalls länger als die
oben genannte Zeitperiode anhält (KATZ-LEVY et al., 2000). Molekulare Mimikry
stellt einen weiteren Mechanismus dar, der zur Entwicklung einer Autoimmunreaktion
in Theilervirus-infizierten Mäusen beiträgt (CROXFORD et al., 2005; OLSON et al.,
2001). Dabei handelt es sich um das Auftreten von gemeinsamen Epitopen sowohl
auf Proteinen eines infizierten Wirtes als auch auf Mikroorganismen wie Viren und
Bakterien (OLESZAK et al., 2004; OLSON et al., 2001). Unter diesen Umständen
kann eine Immunantwort, welche zuerst gegen ein virales Epitop gerichtet war, auch
körpereigene Epitope bekämpfen, selbst wenn das ursprünglich auslösende Epitop
nicht mehr im Körper vorhanden ist. Dieser Prozess kann zur Entwicklung einer
autoimmunen Erkrankung führen und stellt auch eine Hypothese zur Entstehung der
MS durch eine Virusinfektion dar (OLESZAK et al., 2004).
Die herrausragende Bedeutung von CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs) in dem
Krankheitsprozess wurde von JOHNSON et al. (2001) gezeigt, der eine verminderte
motorische Dysfunktion nach Hemmung der gegen Viruspeptide gerichteten CTLs
fand. Aktivierte CTLs zerstören nicht nur virusinfizierte Zellen, sondern auch nichtinfizierte Oligodendrozyten, falls diese ein Selbstantigen mit molekularer Mimikry zu
einem Virusepitop in Verbindung mit einem MHC I-Molekül exprimieren (TSUNODA
18
Literaturübersicht
et al., 2006). CTLs benutzen zwei unabhängige Mechanismen zum Abtöten von
Zellen. Einerseits können sie Proteine wie das Perforin sezernieren, welche Poren in
Zellmembranen ausbilden und so zur Zelllyse führen. Andererseits sind sie in der
Lage auf ihrer Oberfläche den Fas-Liganden (FasL) zu exprimieren, der mit dem
Apoptose-induzierenden Fas-Molekül auf Ziellzellen interagieren kann (ROSSI et al.
1998). Außerdem führt eine Aktivierung von CTLs zur Produktion und Abgabe von
IFN-γ. Dieses Zytokin kann die Expression von Fas und dadurch eine Fas-vermittelte
Apoptose von Astrozyten induzieren, wodurch letztendlich die Integrität der
Bluthirnschranke beeinträchtigt werden kann. Nicht-infizierte Astrozyten sind
normalerweise resistent gegen einen Fas-vermittelte Zelltod, da sie ohne
vorhergehende Stimulation durch IFN-γ kein Selbstantigen, virales Antigen oder Fas
auf ihrer Zelloberfläche exprimieren (TSUNODA et al., 2006). Neuere Studien haben
gezeigt, dass SJL/J-Mäuse eine voll funktionsfähige CTL-vermittelte Immunantwort
entwickeln, die gegen eine dominanten und 2 subdominante Kapsidproteinepitope
gerichtet ist. Interessanterweise sind alle T-Zell vermittelten Immunantworten auf das
H-2Ks Molekül dieses Mausstamms beschränkt, während eine Resistenz gegen das
Theilervirus mit dem H-2D MHC I Genlocus assoziiert ist. Folglich kann diese
fehlgeleitete Immunantwort zumindest teilweise die Empfänglichkeit der SJL/J-Mäuse
für die Entwicklung einer demyelinisierenden Erkrankung erklären (KANG et al.,
2002; LIPTON u. MELVOLD, 1984; MONTEYNE et al., 1997; PATICK et al., 1990;
RODRIGUEZ u. DAVID, 1985; RODRIGUEZ et al., 1986).
2.2 Matrix-Metalloproteinasen
MMPs stellen eine sich stetig vergrößernde Famile von Zink-abhängigen Enzymen
dar, die Moleküle der extrazellulären Matrix (EZM) spalten (MATRISIAN, 1990;
STAMENKOVIC, 2003; WOESSNER, 1991). Je nach ihrer Substratspezifität können
sie in Kollagenasen (MMP-1, -8, 13), Gelatinasen (MMP-2, -9), Stromelysine (MMP3, -10, -11) einschließlich Matrilysin (MMP-7) und an Membranen gebundene MMPs
(MMP-14, -15, -16, -17) eingeteilt werden. MMP-12 oder Metalloelastase gehört
keiner spezifischen Gruppe an (MCCAWLEY u. MATRISIAN, 2001; ROSENBERG,
2002; YONG et al., 1998). Die Aktivität der MMPs wird durch so genannte “Tissue
Literaturübersicht
19
Inhibitors of Metalloproteinases“ (TIMPs) gehemmt (BREW et al., 2000). MMPs sind
an vielen physiologischen Prozessen im Organismus beteiligt. Dabei besteht ihre
Funktion im Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix, sowie in der Spaltung von
Zelloberflächenmolekülen, extrazellulären Enzymen, Zytokinen und Hormonen
(BIRKEDAL-HANSEN, 1995; KHASIGOV et al., 2001; MCCAWLEY u. MATRISIAN,
2001; ROMANIC u. MADRI, 1994; STAMENKOVIC, 2003). Andererseits spielen sie
eine bedeutende Rolle in der Pathogenese demyelinisierender Erkrankungen, da sie
die
Bluthirnschranke
schädigen,
die
Einwanderung
von
Entzündungszellen
begünstigen, die Freisetzung von TNF hervorufen und die Myelinscheide abbauen
können (CUZNER u. OPDENAKKER, 1999; HARTUNG u. KIESEIER, 2000; RIES u.
PETRIDES, 1995).
Die mRNS-Bildung der MMPs und TIMPs kann durch Wachstumsfaktoren, Zytokine,
chemische
Verbindungen,
physikalische
Einwirkungen,
Zelltransformation,
Glukokortikoide und andere Einflüsse in Abhängigkeit vom Zelltyp herauf- oder
herabreguliert werden (GOTTSCHALL u. DEB, 1996; HARKNESS et al., 2000;
NAGASE u. WOESSNER, 1999; ROSENBERG et al., 2002; STAMENKOVIC, 2003).
Bekannt ist, dass die Promotorregionen der induzierbaren Gene von MMP-3, -7, -9, 10 und von TIMP-1 und -3 Bindungsstellen für ETS- (PEA), NF-κB- und AP-1Transkriptionsfaktoren haben, um die Transkription zu starten. Das MMP-2-Gen
hingegen, hat eine AP-2-Bindungsstelle und wird genauso wie TIMP-2 und die
Membrantyp-MMPs
in
den
meisten
Organen
eher
konstitutiv
exprimiert
(ROSENBERG et al., 2002; YONG et al., 1998). Darüber hinaus erfolgt die
Regulation der Aktivität der MMPs noch auf weiteren Ebenen, welche die
posttranslationale Glykosylierung der Enzyme, Degranulation aus Speichervesikeln,
die Aktivierung der Proenzyme in Proteasekaskaden und die spezifische Inhibition
durch die TIMPs sowie α2-Makroglobulin beinhalten (GOTTSCHALL u. DEB, 1996;
CUZNER u. OPDENAKKER, 1999; HARKNESS et al., 2000; NAGASE u.
WOESSNER, 1999; YONG et al., 1998).
Viele neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die MMPs eine Schlüsselrolle
bei der Initiation und Progression von demyelinisierenden Erkrankungen wie z.B. der
MS spielen (BAR-OR et al., 2003; LEPPERT et al., 2001; LINDBERG et al., 2001; LO
20
Literaturübersicht
et al., 2002; YONG et al., 2001). Bei MS-Patienten kommt es vor allem zu einer
verstärkten Expression von MMP-2, -3, -7, -9, -12 und TIMP-1 in den akut
demyelinisierenden Läsionen (ANTHONY et al., 1997; COSSINS et al., 1997;
CUZNER et al.,1996; LINDBERG et al., 2001; MAEDA u. SOBEL, 1996; VOS et al.,
2003). Es wurde ein Ungleichgewicht in der MMP/TIMP-Balance beschrieben, das für
die Entmarkung verantwortlich sein könnte (AVOLIO et al., 2003; LINDBERG et al.,
2001; WAUBANT et al., 2003). Hierbei scheinen Monozyten die stärkste MMPExpression in MS-Patienten aufzuweisen (BAR-OR et al., 2003). In einer
experimentell induzierten Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV wurde im Gehirn von
Ratten eine Hochregulation der MMP-12-mRNS und -Proteinexpression beobachtet
(ANTHONY et al., 1998). Weiterhin wurde in Ratten mit EAE eine Beteiligung von
MMPs an der Läsionsentstehung und ein 500facher Anstieg der MMP-7-Expression
nachgewiesen (CLEMENTS et al., 1997). Eine Verbindung zwischen der MMPExpression insbesondere der von MMP-12 und der Demyelinisierung im Verlauf der
TME konnte mittels Immunhistologie und RT-qPCR nachgewiesen werden
(ALLDINGER u. WELSH, 2003; ULRICH et al., 2006). Dementsprechend gibt es
ernsthafte Überlegungen MS-Läsionen mit MMP-Inhibitoren zu behandeln, mit denen
schon gute Ergebnisse in verschiedenen Tiermodellen des MS erreicht wurden
(LIEDTKE et al., 1998; MATYSZAK u. PERRY, 1996; ROSENBERG, 2001).
2.3 Transkriptionsfaktoren
2.3.1 Definition und Funktion
Der Begriff “immediate early gene” (IEG) oder “early response gene” wurde
ursprünglich in der Mitte der 70er und frühen 80er Jahre für virale Gene benutzt, die
schnell nach einer Infektion einer Wirtszelle transkribiert wurden (SIMON et al.,
2006).
Eine
Proteinsynthesehemmung
beispielsweise
eine
Behandlung
mit
Cycloheximid führt normalerweise zu keiner Beeinträchtigung der Expression dieser
Gene. Deswegen kann ausgeschlossen werden, dass neu synthetisierte Gene für
ihre Transkription verantwortlich sind. Die mRNS sowie die Proteine, die von IEGs
kodiert werden, akkumulieren zwar schnell nach einer Stimulation, besitzen aber
Literaturübersicht
21
auch eine kurze Halbwertszeit aufgrund einer geringen Stabilität der mRNS und
einem schnellen Abbau der Proteine. Viele IEGs fungieren als “third messengers” in
einer intrazellulären Signaltransduktionskaskade zwischen Zelloberflächenrezeptor,
zytoplasmatischen “second messengers“ und spezifischen Zielgenen im Zellkern
(KIESSLING u. GASS, 1993). Mit der Entdeckung von humanen Homologen zu
retroviralen
Onkogenen
wurde
erkannt,
dass
IEGs
häufig
wichtige
Transkriptionsfaktoren darstellen, die die Expression nachfolgender sogenannter
“late response genes” kontrollieren. Dadurch regulieren sie sowohl das Zellwachstum
als auch die Differenzierung von Zellen (SIMON et al., 2006). ”Late response genes”
werden erst nach der Herstellung von “immediate early genes“ transkribiert, die als
Transkriptionsfaktoren fungieren und im Bereich ihrer Promotorregionen binden.
Es hat sich gezeigt, dass IEGs auch eine Rolle bei posttranskriptionellen Prozessen
spielen. Hierzu gehört die zytoplasmatische Polyadenylierung, der Abbau von
Bindungsfaktoren, die an Adenosin- und Uracil-reiche DNS-Bereiche binden, und die
Expression von nicht-kodierenden RNS-Strängen, die die Trankription beeinflussen
(SIMON et al., 2006). Allerdings kodieren IEGs nicht nur für Transkriptionsfaktoren,
sondern auch für sezernierte Proteine, Wachstumsfaktoren, Enzyme und Proteine
des Zytoskeletts und der Signaltransduktion (LANAHAN u. WORLEY, 1998; SNG et
al., 2004 ; Abb. 2.2).
Transkriptionsfaktoren besitzen eine DNS-Bindungsdomäne, die regulatorische
Bereiche spezifischer Gene bindet, und eine zweite Domäne, die die Fähigkeit
aufweist, die Transkription dieser Gene zu iniitieren. Bisher sind mehr als 2000
Transkriptionsfaktoren und ungefähr 200 bis 300 Kofaktoren im humanen Genom
beschrieben worden (BRIVANLOU u. DARNELL, 2002). Außerdem sind etliche
Korepressoren, Histonazetylasen, Deazetylasen, Kinasen und Methylasen in einem
RNS-Polymerase-Komplex versammelt. Die Kombination von etwa sechs bis acht
verschiedenen Proteine aus dieser großen Auswahl scheint für die Aktivierung jedes
Gens einzigartig zu sein (BRIVANLOU u. DARNELL, 2002). Folglich stellt die
Bereitstellung der korrekten Menge der richtigen Proteine in der richtigen Zelle die
Vorraussetzung für alle physiologischen und pathologischen Vorgänge inklusive der
Entwicklung des ZNS und einer Entzündung dar.
22
Literaturübersicht
Abb. 2.2: Signalweg der Aktivierung von “Immediate Early Genes“.
Stimulus
Sezerniertes
Protein
Rezeptor
Zytoskelettprotein
Enzym
“Second Messenger”
Zellmembran
Immediate Early
“Immediate
EarlyGene
Gene”
Transkriptionsfaktor
Late Response
“Late
Response Gene
Gene”
Promoter
Promotor
Intensität,
Zeitdauer
und
DNS
Target
Zielgen
Gene
Art
der
verschiedenen
biophysikalischen
und
biochemischen Reize beeinflussen the transkriptionelle Aktivität der IEGs auf
Zielgene in jeder Zelle auf ihre eigene Weise (MURPHY u. BLENIS, 2006; SIMON et
al., 2006). Eine kurzfristige Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führt durch eine
Proteinneosynthese zu einer schnelle Adaptation einer Zelle an den initiierenden
Stimulus.
Demgegenüber
scheint
eine
langandauernde
Aktivierung
dieser
Transkriptionsfaktoren einen entscheidenden Einfluss auf Entwicklungsprozesse,
Zellzykluskontrolle,
Zellüberlebensrate,
synaptischer
Plastizität,
Lernen
und
Immunfunktionen zu haben (LANAHAN u. WORLEY, 1998; MURPHY u. BLENIS,
2006;
SIMON
et
al.,
2006).
Außerdem
ist
eine
Überexpression
einiger
Transkriptionsfaktoren, wie z. B. c-jun und c-fos, ein Kennzeichen verschiedener
bösartiger Tumore (MURPHY u. BLENIS, 2006). Interessanterweise scheinen in
Neuronen normalerweise lediglich 30 bis 40 IEGs aktiviert zu werden, von denen
ungefähr 10 bis 15 Transkriptionsfaktoren sind (LANAHAN u. WORLEY, 1998).
Verschiedene
physiologische
und
pathologische
Reize
einschließlich
somatosensorische Wahrnehmung, metabolischer und somatosensorischer Stress,
Literaturübersicht
23
freie Radikale, Hormone, Zytokine, Ischämie und epileptische Anfälle führen
abhängig von der Zellart und der Umgebung schnell zu einem unterschiedlichen und
spezifischen Expressionsmuster von IEGs (KIESSLING u. GASS, 1993; LANAHAN
u. WORLEY,
1998;
SIMON
et
al.,
2006).
Alle
diese
stark
miteinander
interagierenden Reize induzieren den Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)Signalweg in Verbindung mit anderen Signaltransduktionskaskaden, wie z. B. den
“Nuclear factor-κB“ (NF-κB)-Signalweg (PAHL, 1999; SIMON et al., 2006). Die
genaue Stärke und die Zeitdauer der Aktivierung jedes einzelnen Mitglieds der
MAPK-Gruppe, nämlich extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK), c-JUN Nterminale Kinase (JNK), und 38 kDa Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38), durch
einen Stimulus entscheidet über die spezifische Aktivierung bestimmter IEGs und
Ihrer Zielgene (MURPHY u. BLENIS, 2006). ERK aktiviert Ets-1 und c-fos, JNK
phosphoryliert c-jun and p53, und das Protein Max wird durch p38 angeschaltet
(Abb. 2.3). Das Protein Max spielt eine zentrale und entscheidende Rolle als
obligater Bindungspartner für Myc-Onkoproteine und Mad-Transkriptionsrepressoren,
die alle an die Erkennungssequenz CACGTG (E-Box) binden (AMATI et al., 1992;
BAUDINO u. CLEVELAND, 2001; BLACKWOOD u. EISENMAN et al., 1991;
BLACKWOOD et al., 1992; REDDY et al., 1992; VÄSTRIK et al., 1995). Bei all
diesen IEG-Proteinen handelt es sich um Trankriptionsfaktoren, die grundlegende
Prozesse
einschließlich
Zellproliferation,
-differenzierung
und
-wachstum,
Zytokinproduktion und Apoptose beeinflussen (DANG, 1999; ROSENBERG, 2002).
Interessanterweise gibt es zwei Rückkopplungsmechanismen zwischen dem ERKSignalweg und von IEG-kodierten Proteinen, die bei langandauernden Aktivierungen
greifen. Erstens erhöht eine Phosphorylierung am carboxy-terminalen Ende die
Stabilität einiger Proteine, wie z. B. c-fos, und erlaubt dadurch eine Bindung von ERK
an spezifische Proteininteraktionsdomänen dieser Proteine. Zweitens halten diese
stabilisierten Proteine aktiviertes ERK im Zellkern zurück und fördern damit Ihre
eigene fortdauernde Aktivierung durch ERK.
24
Literaturübersicht
Abb. 2.3:
NF-κ
κB-
und
MAPK-Signaltransduktionkaskaden
nach
einer
Aktivierung durch TNF.
TNFTNFα
Zellmembran
TNF-R1
TRADD
MEKK3
NIK
RIP
MEKK
TRAF-2
JNK
NEMO
IKK-α
IKKα
MEK
ERK
p38
IKKIKK-ß
IKKβ
p53
Ubiquitin
c-jun
c-fos
Ets-1
Max
IκB
IκB
NF-κB
NF-κB
p53
AP-1
EBS
E-box
DNS
Legende: AP-1, Aktivator Protein-1; EBS, ETS-Bindungsstelle; ERK, extrazellulärsignalregulierte Kinase; Iκ
κB, Inhibitor von NF-κB; IKK, IκB-Kinase; JNK, c-JUN Nterminale Kinase; MAPK, Mitogen-aktivierte Proteinkinase; MEK, MAPK-Kinase;
MEKK, MEK-Kinase; NEMO, NF-κB essentieller Modulator (IKKγ); p38, 38 kDa
MAPK; RIP, Rezeptor interagierendes Protein; TNF, Tumor-Nekrose-Faktor; TNFR1, TNF-Rezeptor 1; TRADD, TNF-R assoziierte Todesdomäne; TRAF-2, TNF-R
assoziierter Faktor-2.
Während die einer IEG-Expression nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden
hochgradige komplexe interagierende Netzwerke darstellen, scheinen die IEGExpressionsmuster nach einer Aktivierung selber ziemlich begrenzt zu sein (SIMON
et al., 2006). Bedeutende technische Probleme behindern nach wie vor die
Untersuchung des Transkriptoms. Daher könnte es momentan zweckmäßig sein,
sich auf die relativ einfache Ebene der Transkriptionsfaktoren zu konzentrieren
Literaturübersicht
25
(SIMON et al., 2006). Dennoch gibt es bisher kaum Studien, die die Expression von
Transkriptionsfaktoren in Entwicklungs- und Entzündungsprozessen und die
entsprechenden molekularen Mechanismen untersuchen.
2.3.2 ETS-Transkriptionsfaktorfamilie
Die ETS-Familie der eukaryotischen Transkriptionsfaktoren wurde nach einer
Sequenz aus dem aviären Erythroblastosisvirus E26 benannt. Hierbei handelt es sich
um die “E26 transformation specific sequence“, welche für die onkogenen
Eigenschaften dieses Virus verantwortlich ist (DITTMER, 2003). Sie stellt eine große
und schnell wachsende Gruppe flügelartiger “helix-turn-helix” DNS-Bindungsproteine
dar (BASSUK u. LEIDEN, 1997; DONALDSON et al., 1996; GALLANT u.
GILKESON, 2006). Bisher wurden in Säugetieren ungefähr 30 und in Drosophila 8
Proteine aus dieser Gruppe beschrieben, die in einer großen Anzahl embryonaler
und adulter Gewebe inklusive hämatopoetischer und lymphatischer Gewebe,
Gefäßen, Gehirn, Milchdrüse, Endometrium, Ovarien, Hoden, Nieren und Lunge
exprimiert
werden
(GALLANT
u.
GILKESON,
2006;
KOLA
et
al.,
1993;
MAROULAKOU u. BOWE, 2000; TOOTLE u. REBAY, 2005). ETS-Proteine
aktivieren meistens die Transkription ihrer Zielgene. Dennoch fungieren vier
Familienmitglieder (YAN, ERF, NET und TEL) überwiegend als transkriptionale
Repressoren (MAVROTHALASSITIS u. GHYSDAEL, 2000; TOOTLE u. REBAY,
2005). Einige ETS-Faktoren beeinflussen die Transkription als einzelnes Protein, die
meisten agieren aber in ternären Komplexen zusammen mit weiteren ETS-Proteinen
oder Mitgliedern aus anderen Transkriptionsfaktorfamilien beispielsweise der AP-1oder der NF-κB-Familie (LI et al., 2000). ETS-Transkriptionsfaktoren besitzen eine
hochkonservierte 85 Aminosäuren lange Proteindomäne, welche als ETS-Domäne
bezeichnet wird und an die Erkennungssequenz GGAA/T bindet. Dieser Abschnitt
der DNS liegt meistens im Promotor eines Gens und stellt somit die Bindungsstelle
für ETS-Proteine (ETS-Bindungsstelle, EBS) dar (GALLANT u. GILKESON, 2006;
SHARROCKS et al., 1997; WANG et al., 1992). Ein Drittel der ETSTranskriptionsfaktoren
besitzen
zusätzlich
eine
konservierte
aminoterminale
Domäne, die als “Pointed domain” (PD) bezeichnet wird. Diese Domäne wurde nach
26
Literaturübersicht
dem Drosophila-Protein Pointed-P2 benannt, welches mit Ets-1 verwandt ist, und
vermittelt Protein-Protein-Interaktionen. Außerdem wird die Aktivität der ETSProteine mittels MAPK reguliert, indem diese bestimmte Serin-(S)-, Threonin-(T)- und
Tyrosin-(Y)-Reste
in
der
PD-Domäne
phosphorylieren
(DITTMER,
2003).
Interessanterweise scheint eine Phosphorylierung von Ets-1 bei T38 durch ERKs zu
einer Verstärkung der transkriptionalen Aktivität
zu
führen, während
eine
Phosphorylierung durch die Kalzium/Calmodulin-abhänginge Proteinkinase II (CaMK
II) oder die Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK) eine Bindung von Ets-1 an DNA
hemmt und so Ets-1 zu einem Repressor verwandelt (TOOTLE u. REBAY, 2005).
Außerdem wurden in letzter Zeit weitere post-translationelle Modifikationen
beispielsweise Glykosylierung, Sumoylierung, Azetylierung und Ubiquitinierung
beschrieben, die die Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen, die subzellulare
Lokalisation, die Stabilität und die Aktivität der so veränderten Proteine modifizieren
(TOOTLE u. REBAY, 2005). Auf diese Art und Weise können unterschiedliche
Signalwege
gleichzeitig
Modifikationen
an
verschiedenen
Stellen
eines
Trankriptionsfaktors induzieren. Hierdurch entsteht ein leistungsfähiger Mechanismus
in der Zelle, mit dem einströmende Informationen an einem zentralen Protein
verarbeitet
werden
können.
Glykosylierung
und
Phosphorylierung
stellen
antagonistische Proteinmodifikationen dar, weil sie beide um Serin- und ThreoninReste konkurrieren. Gleichermaßen können Lysin-Reste azetyliert, sumoyliert und
ubiquitiniert werden und dadurch die Aktivität eines Transkriptionsfaktors stimulieren
oder inhibieren (FREIMAN u. TJIAN, 2003). Ubiquitin und SUMO (“small ubiquitinrelated modifier”) sind beide Polypeptide, die kovalent an ein Protein gebunden
werden. Dieser Prozess findet in mehreren Schritten statt und wird durch
verschiedene aktivierende und konjugierende Enzyme und Ligasen katalysiert
(CONAWAY et al., 2002; VERGER et al., 2003).
In den letzten zwei Dekaden wurde eine große Anzahl an ETS-Zielgenen identifziert.
Hierzu gehören MMPs, Zytokine, Wachstumsfaktoren und Gene, die einen Einfluss
auf
die
Expression
von
Zelloberflächenmolekülen,
die
Apoptose
und
die
Angiogenese haben (GALLANT u. GILKESON, 2006; SEMENTCHENKO u.
WATSON, 2000; WERNERT et al., 1992). Neun ETS-Proteine, Ets-1, Ets-2, GABP,
Literaturübersicht
27
Fli-1, Elf-1, MEF, ESE-1, PU.1 und SpiB, regulieren Gene, die in einem
Zusammenhang mit der Immunantwort stehen. Jedoch scheinen Ets-1 und PU.1 den
größten Einfluss auf die Entwicklung und Funktion von lymphoiden Zellen zu haben
(BORIES et al., 1995; GALLANT u. GILKESON, 2006; MUTHUSAMY et al., 1995).
Außerdem kann Ets-1 die Immunantwort von TH1-Zellen in eine pro- oder antiinflammatorische Richtung lenken (GRENNINGLOH et al., 2005). Die Synthese von
Ets-1 kann je nach Zelle durch unterschiedliche Stimuli beispielsweise “hypoxiainducible factor” (HIF)-1, “hepatocyte growth factor” (HGF), “platelet-derived growth
factor” (PDGF) und TNF über die Aktivierung verschiedener MAPK-Signalwege
induziert werden (DITTMER, 2003). Interessanterweise besitzt Ets-1 in seiner
Promotorregion eine Bindungsstelle für Ets-1/AP-1-Proteine, so dass dieses ETSProtein in der Lage ist seine eigene Transkription zu stimuliern (DITTMER, 2003).
2.3.3 Aktivator Protein (AP)-1-Transkriptionsfaktorfamilie
Der Transkriptionsfaktor AP-1 stellt eine Gruppe unterschiedliche Dimere dar, die aus
JUN (c-jun, JunB und JunD)- und FOS (c-fos, FosB, Fra-1 und Fra-2)-Proteinen
zusammengesetzt sind (JOCHUM et al., 2001). Diese Dimere binden in vitro mit der
höchsten Affinität an Promotorregionen, die nukleäre AP-1-Bindungsstellen (5’TGA(C/G)TCA-3’) besitzen. Außerdem können sie mit einer etwas geringeren
Affinität an das “cyclic AMP response element“ (CRE; 5’-TGACGTCA-3’) binden
(NAKABEPPU et al, 1988; RAUSCHER et al., 1988). Alle AP-1-Proteine besitzen
eine DNA-Bindungsdomäne, die mit einer Leucin-Zipper-Region (bZIP-Domäne)
kombiniert ist und dadurch Dimere bilden und eine Bindung mit der DNS eingehen
kann. Während FOS-Proteine lediglich Heterodimere bilden, sind JUN-Proteine in der
Lage untereinander zu homodimerisieren, um transkriptionell aktive Komplexe zu
formen (ANGEL u. KARIN, 1991; HALAZONETIS et al., 1988; KARIN et al., 1997;
LANDSCHULZ et al., 1988). Des Weiteren können JUN-Proteine Heterodimere mit
anderen Trankriptionsfaktoren bilden, die eine bZIP-Domäne beispielsweise CBP,
MyoD, NFat oder c-rel besitzen (HAI u. HARTMAN, 2001; HERDEGEN u. LEATH,
1998). AP-1-Proteine sind an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen,
wie z. B. der Expression von MMPs und Zytokinen, der Zellproliferation und -
28
Literaturübersicht
differenzierung, sowie der Apoptose und neoplastischen Transformation, beteiligt
(AMEYAR et al., 2003; EFERL u. WAGNER, 2003; JOCHUM et al., 2001;
KACZMAREK et al., 2002; SHAULIAN u. KARIN, 2001; SHAULIAN u. KARIN, 2002;
WAGNER u. EFERL, 2005). Außerdem wurde eine Hochregulation des Proteins cjun, welches den Hauptbestandteil des Transkriptionsfaktors AP-1 darstellt, im
Zusammenhang mit epileptiformen Anfällen (GASS et al., 1993), Kokain (FREEMAN
et al., 2001), Schmerz (NARANJO et al., 1991), Langzeit-Potenzierung und/oder Depression, neuronaler Plastizität und Gedächtnisbildung (ABRAHAM et al., 1993;
HERDEGEN u. WAETZIG, 2001; TISCHMEYER et al., 1994) beobachtet. Nicht
zuletzt spielt eine verstärkte c-jun-Aktivität eine entscheidende Rolle bei einer
zerebralen Ischämie und Schlaganfällen (KINDY et al., 1991; WESSEL et al., 1991),
Axotomie
(JENKINS u.
HUNT,
1991) und
posttraumatischer Regeneration
(CHAISUKSUNT et al., 2003; RAIVICH et al., 2004). Zahlreiche physiologische und
pathologische
Reize
beispielsweise
Zytokine,
Wachstumsfaktoren,
Stress,
Infektionen und onkogene Stimuli aktivieren den Transkriptionsfaktor AP-1 (HESS et
al., 2004). Die Aktivität von AP-1 wird durch Veränderungen in der Transkriptionsrate,
der Stabilität der mRNS und der Abbaurate des Proteins, post-translationelle
Modifikationen, sowie spezifische Interaktionen mit anderen AP-1-Proteinen und
weiteren Transkriptionsfaktoren und Kofaktoren reguliert (HESS et al., 2004). Hierbei
stellt die Phosphorylierung von Serin- und Threonin-Resten, die sich in für die JUNund
FOS-Proteine
spezifischen
Transaktivierungsdomänen
befinden,
durch
Mitglieder der MAPK-Superfamilie die bedeutendste Möglichkeit einer schnellen
Steigerung oder Verminderung der Aktivität dar (RAIVICH u. BEHRENS, 2006). Zur
Phosphorylierung der JUN-Proteine dienen die c-JUN N-terminale Kinasen (JNKs),
die auch als Stress-aktivierte Proteinkinasen (SAPKs) bezeichnet werden und als 3
Isoformen vorkommen: JNK1, JNK2 und JNK3 (DAVIS, 2000). Allerdings wurden
bisher 10 verschiedene Varianten beschrieben, die durch unterschiedliches Spleißen
entstehen (CASANOVA et al., 1996; GELDERBLOM et al., 2004).
Obwohl eine Phosphorylierung häufig zu einer Aktivierung des entsprechenden
Proteins führt, stellt die Phosphorylierung von c-jun am Threoninrest 239 eine
Möglichkeit der Inaktivierung dieses Transkriptionsfaktors dar. Hierbei führt ein über
Literaturübersicht
29
Phosphoinositid-3-Kinase
und
Glykogen
Synthase
Kinase
3
verlaufender
Signaltransduktionsweg zu einem verstärkten Abbau des c-jun Proteins über den
Ubiquitin-Proteasom-Weg. Eine weitere Möglichkeit der Aktivierung von c-jun stellt
die Azetylierung unterschiedlicher Lysinreste in einer basischen Region am
karboxyterminalen Ende des Proteins dar. Außerdem können JNKs die Aktivität des
Transkriptionsfaktorkomplexes (TFC) steigern, der für die Synthese der c-jun mRNS
verantwortlich ist, und dadurch indirekt zu der Aktivierung von c-jun beitragen
(RAIVICH, 2008; Abb. 2.4).
Abb. 2.4:
Aktivierung von c-jun durch Phosphorylierung und Azetylierung
verschiedener Aminosäurereste (RAIVICH, 2008; modifiziert)*.
MKK4/7
P
P
JBD
Thr91
Thr93
P
TAD
GSK3
P
P
p300
Ac
Lys268
Lys271
Lys273
N
Ser63
Ser73
jun-mRNS
P
P
Thr239
JNK1-3
JUN-TFC
ERK
PI3K
c-jun
BR
Ubiquitin
LZ
C
c-jun Abbau
Legende: BR, basische Region; ERK, extrazellulär-signalregulierte Kinase; GSK3,
Glykogen Synthase Kinase 3; JBD, JNK-Bindungsdomäne; JNK1-3, c-JUN Nterminale Kinase 1-3; LZ, Leucin-Zipper-Region; MKK4/7, Mitogen-activated protein
kinase kinase 4/7; p300, Transkriptionskofaktor p300; PI3K, Phosphoinositid-3Kinase; TAD, Transaktivierungsdomäne; TFC, Transkriptionsfaktorkomplex
*Der genaue Ablauf der Modifikationen wird im Text erläutert.
30
Literaturübersicht
JNKs, ERKs, die zuständig für die Phosphorylierung der FOS-Proteine sind, und p38
werden selber durch MAP Kinase Kinasen (MEKs/MKKs) aktiviert. MAP Kinase
Kinase
Kinasen
(MEKKs)
stellen
die
oberste
Ebene
dieser
Signaltransduktionskaskade dar (RAIVICH u. BEHRENS, 2006). Vor kurzem
entdeckte Adaptermoleküle stellen die Spezifität dieser Kaskade her und werden
“scaffolding proteins“ genannt. Sie binden gleichzeitig an aufeinanderfolgende
Proteine der Signaltransduktionskaskade, um die Interaktionen zwischen diesen
Proteinen zu vermitteln (MC DONALD et al., 2000; YASUDA et al., 1999). Einige
dieser Adaptermoleküle beispielsweise das JNK interagierende Protein 1 werden
insbesondere im Gehirn, Rückenmark und peripheren Neuronen exprimiert und üben
dort nicht-redundante Funktionen in verschiedenen frühen embryonalen Prozessen
aus (RAIVICH u. BEHRENS, 2006; THOMPSON et al., 2001).
Interessanterweise ist der letale Phenotyp einer globalen Deletion von c-jun, der
aufgrund einer erhöhten Apoptoserate von Hepatozyten und Missbildungen der
Herzausstrombahn besteht, zwar unabhängig von der Möglichkeit c-jun zu
phosphorylieren, aber abhängig von der Anwesenheit des Proteins selbst
(BEHRENS et al., 1999; EFERL et al., 1999). Eine Überexpression von c-jun und cfos nach einer TMEV-Infektion oder einer IFN-γ-Stimulation wurde schon in
verschiedenen glialen Zelllinien nachgewiesen (RUBIO et al., 1996; RUBIO, 1997;
RUBIO u. MARTIN-CLEMENTE, 1999).
2.3.4 NF-κ
κB/Rel-Transkriptionfaktorfamilie
Alle bisher genannten Familien interagieren auch mit dem Transkriptionfaktor NF-κB
(BASSUK et al., 1997; ELKELES et al., 1999; KWON et al., 2004). NF-κB wurde vor
ungefähr 20 Jahren als ein nukleärer Faktor entdeckt, der in B-Zellen an den
Enhancer der leichten Kappa-Kette bindet (SEN u. BALTIMORE, 1986). Daher
stammt auch der Name der NF-κB/Rel-Transkriptionfaktorfamilie, die in Säugetieren
aus fünf Mitgliedern p50 (NF-κB1), p52 (NF-κB2), p65 (Rel-A), c-Rel und Rel-B
besteht. Sie ist durch eine amino-terminale 300 Aminosäuren lange Rel-HomologieDomäne (RHD) gekennzeichnet, die für die Bindung an die DNS, die Dimerisierung
und die nukleäre Lokalisation verantwortlich ist (BAEUERLE u. HENKEL, 1994). Die
Literaturübersicht
31
allgegenwärtig exprimierten Proteine dieser Familie bilden unterschiedliche Homound Heterodimere, wobei p50/p65 Heterodimere überwiegen. Homodimere bestehen
insbesondere aus den Proteinen p50 und p52 und wirken überwiegend hemmend auf
die Trankription ein, da ihnen die spezifische Domäne zur Aktivierung der
Transkription fehlt. NFκB wird im inaktiven Zustand im Zytoplasma durch
inhibitorische Moleküle zurückgehalten, die als IκBs bezeichnet werden (CAAMAÑO
u. HUNTER, 2002; GHOSH u. KARIN, 2002; PAHL, 1999). Die IκB-Familie setzt sich
aus IκBα, IκBβ, IκB , IκBγ, IκBζ, Bcl-3, p105 und p100 zusammen. Die beiden
letztgenannten Proteine stellen Vorläuferformen von p50 bzw. p52 dar. Alle
Mitglieder der IκB-Familie besitzen mehrere Ankyrin-Wiederholungen, die ihre
Bindung an NF-κB vermitteln (MALEK et al., 2001; TERGAONKAR, 2006;
WHITESIDE u. ISRAEL, 1997; YAMAMOTO et al., 2004; YAMAZAKI et al., 2001).
Eine Besonderheit von IκBγ stellt die Tatsache dar, dass es einen internen Promotor
des Gens nf-kb1 zur Synthese benutzt und es damit identisch mit der carboxyterminalen Hälfte von p105 ist (INOUE et al., 1992).
Die nukleäre Translokation von NF-κB kann durch viele Stimuli beispielsweise
Entzündungen, Infektionen, Trauma, Wachstumsfaktoren und Stress induziert
werden (PAHL, 1999). So führt beispielsweise eine Stimulation einer Zelle durch TNF
zu einer Aktivierung des TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1). Hierdurch wird eine
Signaltransduktionskaskade über eine Rekrutierung der TNF-R assoziierten
Todesdomäne (TRADD), des TNF-R assoziierten Faktors-2 und des Rezeptor
interagierenden Proteins (RIP) ausgelöst, der über MEKK3 die Aktivierung des IκBKinase (IKK)-Komplexes bewirkt (YANG et al., 2001). Dieser Komplex setzt sich aus
zwei katalytischen Untereinheiten, IKKα und IKKβ, und der regulatorischen
Untereinheit
NF-κB
essentieller
Modulator
(NEMO)/IKKγ
zusammen.
Die
Phosphorylierung zweier amino-terminaler Serine innerhalb der IκBs durch IKKβ führt
anschließend zu einer Ubiquitinierung und Degradation dieses NF-κB-Inhibitors über
den Proteasom-Weg (GHOSH u. KARIN, 2002; MAY u. GHOSH, 1998). Die
freigesetzten NF-κB-Dimere können dann in den Kern wandern, wo sie an die
Konsensussequenz
GGGRNNYYCC
(N = irgendeine
Base,
R = Purin
und
32
Literaturübersicht
Y = Pyrimidin) in Promotor- oder Enhancer-Regionen von Zielgenen binden und
deren Transkription aktivieren (Abb. 1.3). In einem alternativen Weg der Aktivierung,
der vermutlich im Immunsystem angewandt wird, wird IKKα durch die NF-κBinduzierende Kinase (NIK) phosphoryliert. Hierdurch wird das Protein p100
gespalten, so dass Dimere, die p52 enthalten, freigesetzt werden (BONIZZI u.
KARIN, 2004). Ein dritter und atypischer Weg der NF-κB-Aktivierung wurde bisher
kaum untersucht, da er vor allem im Zusammenhang mit DNS-Schäden beschrieben
wurde (PERKINS, 2004). Obwohl die Aktivierung von NF-κB überwiegend durch den
Abbau und die Resynthese der IκBs kontrolliert, haben viele weitere Mechanismen
einen Einfluss auf die Feinabstimmung des NF-κB-Signaltransduktionswegs. Hierzu
gehören die Phosphorylierung, die Ubiquitinierung, die Azetylierung oder die
Sumoylierung von vor- oder nachgeschalteten Effektormolekülen, IKK-Untereinheiten
oder den NF-κB-Proteinen selbst (CHEN u. GREENE, 2004; CHEN, 2005; CHEN et
al., 2005; HAYDEN u. GHOSH, 2004; HUANG et al., 2003; KRAMER et al., 2006;
PASCUAL et al., 2005; SACCANI et al., 2004).
NF-κB initiiert hauptsächlich die Transkription von Chemokinen, Zytokinen,
Immunrezeptoren,
Adhäsionsmolekülen,
Apoptoseregulatoren,
Stress-Antwort-
Genen, Transkriptionsfaktoren, Wachstumsfaktoren, Enzymen und Regulatoren des
Zellzykluses. Außerdem wird NF-κB für die Transkription verschiedener Viren wie
HIV-1 und CMV benötigt (PAHL, 1999). Ebenso wurde eine stark verminderte
Replikation
von
TMEV
in
Astrozyten
p50-defizienter
Mäuse
beobachtet.
Interessanterweise wurde in Astrozyten von SJL/J- gegenüber C57BL/6-Mäusen
nach einer TMEV-Infektion eine stärkere Aktivierung von NF-κB beobachtet. Die
gleichzeitig festgestellte höhere Produktion viraler Partikel deutet somit auf eine
Beteilung von NF-κB an der Persistenz des Theilervirus in diesem empfänglichen
Mausstamm
hin
(KANG
et
al.,
2008).
Neuere
Microarray-Studien
und
Untersuchungen an transgenen Mäusen zeigten spezifische Funktionen von NF-κB
im Nervensystem. NF-κB scheint eine Rolle in der Ausbildung des Neuralrohrs, der
synaptischen Aktivität und Plastizität, der Wahrnehmung, des Verhaltens, der
Überlebensrate von Neuronen und der Myelinisierung von Schwann-Zellen zu
spielen (MÉMET, 2006).
Literaturübersicht
33
Eine große Anzahl von Stimuli kann den Transkriptionsfaktor NF-κB aktivieren, der
wiederum die Transkription von mindestens einer gleich großen Menge an Zielgenen
initiieren kann. Deshalb müssen zukünftige Studien aufklären, wie ein bestimmtes
Signal in diesem pleiotropen System eine spezifische Antwort hervorrufen kann. Die
Entwicklung spezifischer Hemmstoffe zur Therapie bestimmter Erkrankungen beruht
auf
dem
genauen
Verständnis
der
Signaltransduktionskaskade von NF-κB.
molekularen
Mechanismen
in
der
34
Literaturübersicht
Material und Methoden
3
35
Material und Methoden
3.1 Allgemeiner Versuchsaufbau
Vorherige in vivo Studien ergaben Unterschiede in der Expression verschiedener
Transkriptionsfaktoren im Rückenmark zwischen nicht infizierten und infizierten
SJL/J-Mäusen (GERHAUSER et al., 2007a; GERHAUSER et al., 2007b). Daher
sollte nun mittels dieser Studie der zelluläre Ursprung dieser Unterschiede untersucht
werden. Zunächst wurden Dissoziationskulturen aus neonatalen Mäusegehirnen
hergestellt. Aus diesen primären Mischkulturen wurden die Astrozyten- und
Mikroglia/Makrophagen-Populationen isoliert und danach entweder getrennt oder in
Kombination kultiviert. Der Grad der Aufreinigung wurde mit Hilfe von verschiedenen
etablierten Antikörpern kontrolliert. Zur Infektion der Mono- und Kokulturen von
primären Astrozyten und Mikroglia/Makrophagen diente der BeAn 8386-Stamm des
TMEV. Das Auftreten eines zytopathogenen Effektes (CPE) wurde lichtmikroskopisch
kontrolliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten, 0, 6, 12, 24, 48, 72 und 240 Stunden
nach der TMEV-Infektion (h.p.i.), wurde die Ets-1-, c-jun, c-fos-, p50-, p65-, Max- und
p53-Expression mittels quantitativer Echtzeit-PCR (RT-qPCR) untersucht.
Die in dieser Studie vorgestellten Zellkulturergebnisse wurden überwiegend von
Herrn Jirawat Kumnok erarbeitet. Ebenso führte er die RT-qPCR zur Untersuchung
der Genexpression von MMP-2, -3, -9 und MMP-12 durch (KUMNOK et al., 2008).
3.2 Mäuse
Zur Gewinnung der primären Gehirnzellkulturen wurden neonatale 1 bis 3 Tage alte
SJL/J-Mäuse verwendet, welche im Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule
gezüchtet
worden
waren.
Die
Elterntiere
wurden
von
einem
kommerziellen Züchter (Harlan Winkelmann) erworben und in FilterhaubenKäfigsystemen (Tecniplast) gehalten. Die Genehmigung zur Züchtung und Tötung
der Mäuse wurde vom Regierungspräsidium Hannover erteilt (Aktenzeichen
42500/1H).
36
Material und Methoden
3.3 Zellkulturelle Untersuchungen
3.3.1 Herstellung
eines
Theilerviruspools
zur
Infektion
der
primären
Gehirnzellen
3.3.1.1 Kultur und Passage des Theilervirus in BHK-21-Zellen
Der BeAn 8386-Stamm des TMEV wurde 1957 ursprünglich aus einer wildlebenden
Maus in Belem in Brasilien isoliert (ROZHON et al., 1983). Er wurde
freundlicherweise von Prof. H. Lipton von der North-Western Universität in Chicago
(Illinois, USA) und die BHK-21-Zelllinie (permanente Fibroblastenzellinie aus
Babyhamsterniere) von Prof. R. Roos von der Universität von Chicago (Illinois, USA)
zur Verfügung gestellt. Die BHK-21-Zelllinie wurde bei 37°C und 5% CO2 im
Brutschrank (Thermo Fisher Scientific) kultiviert. Als Wachstumsmedium wurde
“Dulbecco’s Modified Eagle Medium“ (DMEM) mit L-Glutamin, 4500 mg/l D-Glucose,
50 µg/ml Gentamicin und 10% fötalem Kälberserum (FKS) verwendet. Die
Zellkulturflaschen wurden alle 2-3 Tage unter dem Phasenkontrastmikroskop
(Olympus IX70) kontrolliert und mit frischem Medium versorgt. Eine Subkultivierung
fand ein- bis zweimal pro Woche bei 90-95% konfluentem Zellrasen statt. 90%
konfluente Zellrasen von BHK-21-Zellen wurden mit einer Multiplizität ("multiplicity of
infection", MOI) von 1,0 in DMEM + 2% FKS infiziert. Zur Virusadsorption wurden die
infizierten Zellrasen für eine Stunde auf einem Horizontalschüttler (New Brunswick
Scientific GmbH) bei 60 Umdrehungen pro Minute (U/min) und Raumtemperatur
inkubiert. Danach wurden die Zellrasen einmal mit DMEM ohne FKS gewaschen und
mit DMEM 2% FKS bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank (Thermo Fisher Scientific)
inkubiert. Das Virus wurde nach 12-14 Stunden, wenn ein zytopathischer Effekt
(ZPE) bei mehr als 95% der Zellen zu beobachten war, nach dreimaligem Gefrieren
und Auftauen geerntet, durch 10-minütige Zentrifugation bei 700 x g und 4°C
gereinigt und bei -80°C gelagert.
3.3.1.2 Plaquetest
Ein Plaquetest zur Virusdosismessung wurde nach Standardmethoden durchgeführt
(KUMNOK et al., 2008; LIPTON, 1980; MAYR et al., 1974; RUECKERT u.
Material und Methoden
PALLANSCH,
1981).
37
Die
L2-Zellen
(murine
Lungentumorzellen)
wurden
freundlicherweise von Prof. C. Jane Welsh von der Texas A&M Universität (Texas,
USA) zur Verfügung gestellt. Hierzu wurden in 6-Loch-Zellkulturplatten (Thermo
Fisher Scientific) jeweils 1,0 x 106 L2-Zellen pro Loch ausgesät und bei 37°C und 5%
CO2 im Brutschrank (Thermo Fisher Scientific) zu subkonfluenten Zellrasen
herangezüchtet. Die Zellrasen wurden daraufhin zweimal mit DMEM ohne FKS
gewaschen und anschließend mit jeweils 500 µl einer log10-Virusverdünnungsreihe
infiziert. Ein uninfiziertes Loch diente zur Kontrolle. Die Virusadsorption wurde für 60
Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler (New Brunswick
Scientific GmbH) bei 70 U/min durchgeführt. Danach wurde wiederum zweimal mit
DMEM ohne FKS gewaschen. Anschließend wurden die Zellrasen mit einem 45°C
warmen Methylzellulosegel aus DMEM mit 2% FKS, 0,4% Methylzellulose (SigmaAldrich Chemie GmbH) und 50 µg/ml Gentamicin überschichtet und bis zum
Erstarren bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die infizierten Zellen wurden für 3
Tage bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank (Thermo Fisher Scientific) inkubiert.
Nach dem Ablösen des Agarosegels wurden die Zellrasen mit 10%igem Formalin
fixiert und mit 1%igem Kristallviolett in 20%igem Ethanol gefärbt. Der Virustiter in
plaquebildenden Einheiten ("plaque-forming units", PFU) / ml wurde nach der Formel:
PFU / ml = Anzahl Plaques pro Loch x 2 x Verdünnungsfaktor der ausgezählten
Stufe, berechnet (LIPTON, 1980; MAYR et al., 1974; RUECKERT u. PALLANSCH,
1981). Der Plaquetest zur Bestimmung der PFU / ml wurde zweimal unabhängig
voneinander jeweils im Doppelansatz durchgeführt und das Ergebnis gemittelt.
3.3.1.3 Inaktivierung des TMEV mittels UV-Licht-Bestrahlung
Zur Infektion von Kontrollzellen wurde TMEV mittels UV-Licht (UV-C) inaktiviert.
Hierfür wurden 20 ml einer TMEV-Lösung in DMEM + 2% FKS in eine Petrischale
(Greiner Bio-One GmbH) mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Diese Lösung
wurde anschließend für 60 min von 4 Entkeimungslampen (Philips TUV, G15T8,
Holger Veith Handelsvertretung) mit einer Leistung von je 15 Watt bestrahlt. Der
Abstand zwischen der Petrischale und den Entkeimungslampen betrug ca. 20 cm.
Der Flüssigkeitsverlust durch die Behandlung wurde mit destilliertem Wasser
38
Material und Methoden
ausgeglichen. In einem Plaquetest zur Überprüfung der TMEV-Inaktivierung wurden
keine plaquebildenden Einheiten in der bestahlten Lösung nachgewiesen.
3.3.2 Isolierung der murinen Gehirnzellen
Die Isolierung der Gehirnzellen erfolgte direkt nach dem Tod der neonatalen Mäuse.
Angelehnt an die Präparationen von GIULIAN u. BAKER (1986) und MC CARTHY u.
DE
VELLIS
(1980)
wurden
zunächst
mechanisch,
danach
enzymatisch
Einzelzellsuspensionen hergestellt.
3.3.2.1 Protokoll zur Isolierung von murinen Gehirnzellen
1. Desinfektion der neonatalen Maus mit 70%igem Alkohol, Durchtrennung der
Wirbelsäule inklusive des Rückenmarks im Atlanto-Okzipitalgelenk, Entfernen der
Haut und Aufschneiden der Schädelkalotte.
2. Entnahme des Gehirns und Verbringung in eine mit Sato’s Medium ohne fetales
Kälberserum (FKS; BOTTENSTEIN u. SATO, 1979) gefüllte Petrischale (Thermo
Fisher Scientific), Verbringung der auf Eis gelagerten Schale unter eine S1Werkbank.
3. Sorgfältiges Entfernen der Meningen im Bereich der Großhirnhemisphären unter
Verwendung feiner Pinzetten und einer Stereolupe zur Minimierung einer
Kontamination mit Fibroblasten (Abb. 3.1).
4. Abtrennung der Großhirnhemisphären, Entsorgung der verbleibenden Gehirnareale (Hippokampus, Stamm- und Kleinhirn).
5. Zweimaliges Waschen der Großhirnhemisphären in Petrischalen mit frischem
Sato’s Medium ohne FKS.
6. Verbringung der Großhirnhemisphären in ein 50 ml Probengefäß gefüllt mit 10 ml
Dissoziationslösung (siehe Anhang).
7. Zerkleinerung des Gehirngewebes durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren
unter Verwendung von 10 ml, 5 ml und 1 ml Pipetten.
8. Inkubation des homogenisierten Gehirns in einem Wasserbad bei 37°C für 20-30
min, alle 5 min schütteln.
9. Zugabe von 2,5 ml DNase I und 2,5 ml FKS.
Material und Methoden
39
10. Zentrifugation bei 250 x g für 10 min und 4°C (Heraeus Multifuge 1 S-R, Thermo
Fisher Scientific), Abheben des Überstandes.
11. Zugabe von 2,5 ml DNase I und 2,5 ml Sato’s medium mit 10% FKS.
12. Zellsuspension zur weiteren Dissoziation durch Pasteurpipetten mit 3 unterschiedlichen Öffnungsweiten passieren und in ein neues 50 ml Probengefäß
verbringen.
13. Zugabe von 10 ml frischem Sato’s Medium mit 10% FKS und Resuspension der
Lösung.
14. Zentrifugation bei 250 x g für 10 min und 4°C, Abheben des Überstandes.
15. Zugabe von frischem Sato’s Medium mit 10% FKS (ca. 5-10 ml je nach Größe
des Pellets).
16. Mischen von 200 µl Zellsuspension mit 400 µl 0,36%igem Trypanblau und
Zellzählung mit einer Neubauer Zählkammer.
17. Aussaat der Zellen in Poly-L-Lysin (PLL)-beschichteten 75 cm2 großen (T75)Flaschen in Sato’s Medium mit 10%igem FKS (ca. 5 x 106 Zellen pro T75Flasche).
18. Mediumwechsel alle 24-48 h.
Abb. 3.1: Herstellung der Mischkultur glialer Zellen.
A
B
A. S1-Werkbank mit Stereolupe und Pinzetten zur Entfernung der Meningen im
Bereich der Großhirnhemisphären. B. Zwei Gehirne neonataler Mäuse in einer mit
Sato’s Medium gefüllten Petrischale vor Entfernung der Meningen.
40
Material und Methoden
3.3.3 Auftrennung von Mikroglia/Makrophagen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten
Das
Prinzip
der
Auftrennung
der
Mikroglia/Makrophagen
von
Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten beruht darauf, dass sich die
Mikroglia/Makrohagen in PLL-beschichteten Flaschen in einer Mischkultur locker
adhärent auf einem Zellrasen anderer Gehirnzellen befinden. Zudem wurde die
selektive Plastikadhärenz dieser Zellen genutzt (BASZLER et al., 1994). Die
Mischkulturen wiesen in den Flaschen 7-10 Tage nach der Isolierung einen
konfluenten Zellrasen mit darauf locker anhaftenden Zellen auf. Um einen hohen
Reinheitsgehalt der Mikroglia/Makrophagen-Kulturen zu erreichen, musste darauf
geachtet werden, dass der adhärente Zellrasen nicht hyperkonfluent wurde. Hierzu
wurden die Zellen zwischen dem 7. und 10. Tag täglich zur Bestimmung des
optimalen Schüttelzeitpunktes unter dem Auflichtmikroskop kontrolliert. Auf diese
Weise konnte ein Reinheitsgehalt von 90-95% bei den Astrozyten und über 95% bei
den Mikroglia/Makrophagen erreicht werden. Neben den angereicherten Zellen
konnten außerdem noch wenige Fibroblasten und andere gliale Zellen beobachtet
werden.
3.3.3.1 Protokoll zur Aufreinigung der Mikroglia/Makrophagen
1. Nach
Erreichung
eines
konfluenten
Zellrasens
mindestens
dreimaliges
Umwickeln der Verschlußkappen der T75-Flaschen mit Parafilm®M (SigmaAldrich Chemie GmbH).
2. Schütteln der Flaschen auf einem Plattformschüttler (Innova 2000, New
Brunswick Scientific GmbH) bei 37°C und 180 rpm für mindestens 45 min;
Kontrolle unter dem Mikroskop, ob die Zellen der oberen Schicht sich in
Suspension befinden.
3. Abheben des Zellkulturmediums; Verbringung in ein 50 ml Probengefäß.
4. Zugabe von 15 ml frischem Sato’s Medium mit 10% FKS in die T75-Flaschen;
Inkubation bei 37°C und 5% CO2 für mindestens drei Stunden vor der
anschließenden Isolation der Mikroglia; Kontrolle unter dem Mikroskop, ob ein
Großteil der auf dem Zellrasen haftenden Zellen abgelöst wurde.
Material und Methoden
41
5. Abheben des Zellkulturmediums; Verbringung in ein 50 ml Probengefäß.
6. Zentrifugation des 50 ml Probengefäßes mit den sich darin befindlichen Mikroglia/
Makrophagen bei 250 x g für 10 min bei 4°C; Abheben des Überstandes.
7. Resuspension der Zellen in frischem Sato’s Medium mit 10% FKS (ca. 1-2 ml je
nach Größe des Pellets).
8. Mischen von 200 µl Zellsuspension mit 400µl 0,36%igem Trypanblau und
Zellzählung mit einer Neubauer Zählkammer.
9. Aussaat der Zellen in Sato’s Medium mit 10%igem FKS in der gewünschten
Konzentration auf PLL-beschichteten Deckgläsern.
10. Inkubation bei 37°C und 5% CO2 für 20 min
11. Einmaliges Waschen der Zellen mit Sato’s Medium mit 10% FKS zur Entfernung
nicht-anhaftender kontaminierender Oligodendrozytenvorläuferzellen
12. Zugabe von frischem Sato’s Medium mit 10% FKS und 40 ng/ml Macrophage
Colony-Stimulating Factor (M-CSF; PeproTech GmbH).
13. Inkubation bei 37°C und 5% CO2.
3.3.3.2 Protokoll zur Beseitigung der Oligodendrozytenvorläuferzellen
1. Mindestens drei Stunden nach Abschluss der Aufreinigung von Mikroglia/
Makrophagen mindestens dreimaliges Umwickeln der Verschlußkappen der T75Flaschen mit Parafilm®M (Sigma-Aldrich Chemie GmbH).
2. Schütteln der Flaschen auf einem Plattformschüttler (Innova 2000, New
Brunswick Scientific GmbH) bei 37°C und 150 rpm für 14 h, Kontrolle unter dem
Mikroskop, ob die Zellen der oberen Schicht sich in Suspension befinden.
3. Abheben und verwerfen des Zellkulturmediums.
4. Waschen der T75-Flaschen mit 10 ml frischem Sato’s Medium mit 10% FKS;
Abheben und verwerfen des Zellkulturmediums.
5. Zugabe von 15 ml frischem Sato’s Medium mit 10% FKS in die T75-Flaschen;
Inkubation bei 37°C und 5% CO2 für die nachfolgende Aufreinigung der
Astrozyten.
42
Material und Methoden
3.3.3.3 Protokoll zur Aufreinigung der Astrozyten
1. Abheben
des
Zellkulturmediums
nach
Abschluss
der
Beseitigung
von
Oligodendrozytenvorläuferzellen.
2. Zweimaliges Waschen der T75-Flaschen mit Calcium und Magnesium-freiem
PBS (PBS-; 10 ml/T75-Flasche).
3. Zugabe von 1%igem Trypsin-EDTA (6-7 ml/T75-Flasche).
4. Mechanische Dissoziation der Zellen vom Untergrund der T75-Flaschen; nach 510 min Kontrolle unter dem Mikroskop, ob die Zellen sich in Suspension befinden.
5. Zugabe von 10 ml frischem Sato’s Medium mit 10% FKS in die T75-Flaschen.
6. Verbringung der Suspension in 50 ml Probengefäß.
7. Zentrifugation des 50 ml Probengefäßes mit den sich darin befindlichen
Astrozyten bei 250 x g für 10 min bei 4°C; Abheben des Überstandes.
8. Resuspension der Zellen in frischem Sato’s Medium mit 10% FKS (ca. 2-3 ml je
nach Größe des Pellets).
9. Mischen von 200 µl Zellsuspension mit 400µl 0,36%igem Trypanblau und
Zellzählung mit einer Neubauer Zählkammer (ca. 1-3 x 106 Zellen pro T75Flasche).
10. Aussaat der Zellen in Sato’s Medium mit 10%igem FKS in der gewünschten
Konzentration auf PLL-beschichteten Deckgläsern (50.000 Zellen/Deckglas oder
25.000 Zellen/cm2).
11. Inkubation bei 37°C und 5% CO2.
3.3.4 Kokulturen von Astrozyten und Mikroglia/Makrophagen im Transwellsystem
Nach der im vorangegangen Abschnitt beschriebenen Isolierung der Astrozyten und
Mikroglia/Makrophagen wurden diese Zellen einzeln oder in einem Transwellsystem
kultiviert. Zur Kultivierung im Transwellsystem wurden die Astrozyten in die PLL
beschichteten 12-Loch-Platten (100 ng/ml) mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2
ausgesät. Die aufgereinigten Mikroglia/Makrophagen wurden danach in einem
Zellkultureinsatz (12 mm Transwell® mit 0,4 µm Poren in Polyestermembran; Corning
Life Sciences) ebenfalls mit einer Dichte von 50.000 Zellen/cm2 ausgesät.
Material und Methoden
43
3.3.5 Infektion der Gehirnzellkulturen
Für die Infektion der Zellen wurde das Virus mit einem Titer von 5.5 × 108 PFU/ml
und
4,96
x
106
PFU/ml
benutzt.
Die
gereinigten
Astrozyten-
und
Mikroglia/Makrophagen-Kulturen wurden 24 Stunden nach Aussaat mit einer MOI
von 1 infiziert. Dazu wurden die Kulturen in den Zellkulturplatten (24 Vertiefungen)
vorsichtig mit Sato’s Medium ohne FKS gewaschen und mit der benötigten
Virusmenge in 500 µl Sato’s Medium ohne FKS pro Vertiefung bei 37°C und 5% CO2
inkubiert. Des Weiteren wurden Plazebo-infizierte Zellen nur mit Sato’s Medium ohne
FKS überschichtet. Das virushaltige Medium wurde nach einer Stunde mit der Pipette
abgenommen, die Zellen vorsichtig einmal mit Sato’s Medium ohne FKS gewaschen
und neues Sato’s Medium mit 10% FKS auf die Zellen gegeben. Die Färbung der
Zellen und die RNA-Isolierung erfolgten bei den Plazebo-infizierten und infizierten
Zellen 0, 6, 48, 72 und 240 Stunden p.i.
3.3.6 Immunfluoreszenz
Die Färbung der Kulturen wurde in Zellkulturplatten (24 Vertiefungen) durchgeführt.
Der Oberflächenmarker DiI-ac-LDL (Paesel & Lorei GmbH & Co Biochemika,
Diagnostika und Pharmazeutika) wurde auf die lebenden Zellen in der Kultur
gegeben, während die Zellen zur Darstellung der intrazellulären Antigene vor der
Permeabilisierung zunächst fixiert wurden (GIULIAN u. BAKER, 1986). Die Fixierung
erfolgte mit 4%igem Paraformaldehyd mit 4% Saccharose (Sigma-Aldrich Chemie
GmbH). Die Saccharose diente zur besseren Erhaltung der Zellstruktur nach
Fixierung. Zum Blockieren unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen wurde ZiegenNormalserum (ZS) verwendet.
3.3.6.1 Primärantikörper/Proteine
Zur Identifizierung von Astrozyten diente ein monoklonaler Antikörper aus der Maus
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH) und ein polyklonar Antikörper aus dem Rind
(DakoCytomation GmbH) gegen saures Gliafaserprotein (GFAP). Zur Identifizierung
der Mikroglia/Makrophagen wurden azetyliertes Low-Density-Lipoprotein konjugiert
mit 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate (DiI-ac-LDL)
44
Material und Methoden
und ein gegen das ionisierte kalziumbindende Adaptermolekül 1 (Iba1; Wako
Chemicals GmbH) gerichteter polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen verwendet
(IMAI et al., 1996). Ein monoklonaler Anti-TMEV-Antikörper war gegen das virale
Strukturprotein VP1 des DA-Stamms gerichtet und wurde freundlicherweise von Prof.
Raymond P. Roos (Department of Neurology, University of Chicago Medical Center,
Chicago, Illinois, USA) zur Verfügung gestellt. Des Weiteren wurde ein polyklonaler
Anti-TMEV-Antikörper aus dem Kaninchen zur Markierung des TMEV benutzt, der
freundlicherweise von Frau Maren Kummerfeld überlassen wurde (KUMMERFELD et
al., 2009). “Cleaved“ Caspase-3 wurde mit einem polyklonalen Antikörper aus dem
Kaninchen markiert (Cell Signaling Technology®). Die Verdünnung der primären
Antikörper und Proteine sind in der Tabelle 3.1 aufgeführt.
Tab. 3.1:
Liste der verwendeten Primärantikörper
Antigen,
Rezeptor, Protein
Saures
Gliafaserprotein
(GFAP)
Saures
Gliafaserprotein
(GFAP)
Ionisiertes,
Kalzium-bindendes
Adapter Molekül 1
(Iba1)
Murine TheilerEnzephalomyelitisVirus (TMEV)
Murine TheilerEnzephalomyelitisVirus (TMEV)
ScavengerRezeptor (SR)-A
und -B
“Cleaved“
Caspase-3
Antikörper /
Marker
Anti-GFAP
Klon G-A-5
monoklonal
aus der Maus
Anti-GFAP
polyklonal aus
dem Kaninchen
Anti-Iba1
polyklonal aus
dem Kaninchen
Anti-TMEV Klon
DAmAb2
monoklonal
aus der Maus
Anti-TMEV
polyklonal aus
dem Kaninchen
DiI-ac-LDL
Anti-“cleaved“
Caspase-3
polyklonal aus
dem Kaninchen
Lokalisiert
(an / in der
Zelle)
Antigenexprimierende
Zellart im ZNS
Verdünnung
intrazellulär
Strukturprotein
Astrozyten
1:400
intrazellulär
Strukturprotein
Astrozyten
1:400
intrazellulär
Makrophagen /
Mikroglia
1:400
entfällt
entfällt
1:100
entfällt
entfällt
1:400
Oberfläche
Makrophagen /
Mikroglia
1:20
intrazellulär
Astrozyten,
Makrophagen /
Mikroglia und
Neurone
1:100
Material und Methoden
45
3.3.6.2 Darstellung der Mikroglia/Makrophagen mittels DiI-ac-LDL
DiI-ac-LDL wurde nach einmaligem Waschen der Zellen mit Sato’s Medium ohne
FKS auf die Zellen gegeben, und für 4 Stunden in Sato’s Medium ohne FKS im
Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen
einmal mit PBS- und anschließend einmal mit Aqua dest gewaschen.
3.3.6.3 Nachweis der Antigene TMEV, GFAP, Iba1 und “cleaved“ Caspase-3
Die Fixierung der Zellen erfolgte mit 4%igem Paraformaldehyd in PBS- mit 4%iger
Saccharose. Anschließend wurden die Zellen mit Triton X-100 (Merck KGaA)
permeablisiert. Das folgende Protokoll wurde zur Darstellung der Antigene TMEV,
GFAP, Iba1 und “cleaved“ Caspase-3 in 24-Loch-Platten angewandt.
1. Waschen der Zellen mit 500 µl PBS- (5 min).
2. Fixierung mit 500 µl 4%igem PFA (15- 30 min., Raumtemp).
3. Waschen mit 500 µl 0,25% igem PBS--Triton X-100 (5 min, Raumtemp).
4. Blockierung mit 500 µl 5%igem ZS in PBS--Triton X-100 (15 min, Raumtemp).
5. Inkubation des 1. Antikörpers in 200 µl 3%igem ZS in PBS-Triton X-100 (über
Nacht, 4°C).
6. Waschen mit 500 µl 0,25% igem PBS--Triton X-100 (5 Min, Raumtemp).
7. Inkubation des Cy™2- oder Cy™3-gekoppelten 2. Antikörpers (Jackson
ImmunoResearch Europe Ltd.) in 200 µl 3%igem ZS in PBS--Triton X-100 (1 h,
Raumtemp).
8. Waschen mit 500 µl PBS- (5 min, Raumtemp).
9. Waschen mit 500 µl Aqua dest. (1 min, Raumtemp).
3.3.6.4 Färbung der Zellkerne
Die Darstellung der Kerne erfolgte mit dem fluoreszierenden Farbstoff Bisbenzimide
H 33258 (Bisbenzimide, Sigma-Aldrich Chemie GmbH). Bisbenzimide penetriert die
Zellmembran, bindet an Adenin- und Thymin-reiche DNA-Regionen und ermöglicht
somit eine Darstellung der Zellkerne. Zur Färbung wurden die Zellen im Anschluß an
die jeweilige Antigenmarkierung bzw. Fixierung für eine Minute mit 500 µl Aqua dest.
gewaschen und 10 Minuten mit 250 µl des verdünnten Farbstoffs (0,01%) unter
46
Material und Methoden
Lichtabschluß inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für eine Minute mit 500 µl
Aqua dest. gewaschen und in 500 µl PBS- bei 4°C dunkel aufbewahrt.
3.3.6.5 Negativkontrollen
Als Negativkontrolle zur Überprüfung der Spezifität der verschiedenen 2. Antikörper
diente bei jeder Färbung eine Inkubation mit 3%igem ZS in PBS--Triton X-100
anstelle des 1. Antikörpers. Die Spezifität der 1. Antikörper wurde in Mischkulturen
durch die negativen Zellen bestätigt.
3.3.6.6 Auswertung und Dokumentation der Ergebnisse
Die Auswertung der Zellen erfolgte unter dem Auflichtmikroskop IX 70 (Olympus
Optical)
mit
Hilfe
einer
eingesetzten
Netzmikrometerplatte
(U-OCMQ10/10,
Olympus). Diese Platte begrenzt bei der Verwendung eines 20fach Okulars ein
Zählfeld von 0,25 mm2 (0,05 mm x 0,05 mm). Es wurden in 5 zufällig ausgewählten
Zählfeldern zunächst die Kerne gezählt und anschließend erfolgte mit dem Blau-/
oder Grünfilter die Auszählung der positiven Zellen der jeweiligen Marker. Zur
Bestimmung der Zellzahl/cm2 wurde die mittels Kernfärbung ermittelte Zellzahl in den
ausgewählten Zählfeldern auf die Fläche umgerechnet. Die Färbung der Zellen
wurde mit Hilfe der Fotoeinrichtung PM-30 (Olympus Optical) und einem Farbfilm
ISO400 (Ektachrome 400X EPL135-36; Kodak) dokumentiert.
3.3.7 BrdU-Test
Die Proliferationsrate von primären Astrozyten wurde mit einem BrdU-Test getestet.
Bei diesem Verfahren werden Zellen über einen bestimmten Zeitraum mit 5-Brom-2desoxyuridin (BrdU) inkubiert, die dieses chemische Analogon des Nukleosids
Thymidin bzw. Desoxyuridin aufnehmen und während während der S-Phase des
Zellzyklus in die neu synthetisierte DNS einbauen. Anschließend wird die
stattgefundene DNS-Synthese immunhistochemisch nachgewiesen. Für die Bindung
des Antikörpers an das BrdU ist eine Denaturierung der DNS notwendig, die
üblicherweise mit Säuren oder Hitze durchgeführt wird. Zur Markierung der
Material und Methoden
47
proliferierenden Zellen wurde das “In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS“ (Roche
Applied Science) nach dem folgenden Protokoll benutzt:
1. Inkubation der Zellen in 24-Loch-Platten für 14 Stunden im Brutschrank mit 500 µl
BrdU-Lösung in Wachstumsmedium (Endkonzentration 10 µg/ml).
2. Entfernen der BrdU-Wachstumsmedium-Mischung und Waschen der Zellen mit
500 µl PBS-.
3. Fixierung der Zellen mit 500 µl Fixierungslösung (Herstellung: 35 ml 99,8%iger
Ethanol mit 15 ml 50 mM Glycinlösung mischen, pH = 2,0).
4. Waschen mit 500 µl PBS- (2 x 2 min, Raumtemp).
5. Denaturierung der DNS mit 4 M HCl (10-20 min, Raumtemp).
6. Waschen mit 500 µl PBS- (3 x 5 min, Raumtemp).
7. Waschen mit 500 µl Inkubationspuffer (3 x 5 min, Raumtemp).
8. Inkubation mit dem 200 µl FITC-gekoppelten Anti-BrdU-Antikörper (Anti-BrdUFLUOS, 1:20 in Inkubationspuffer; 30 min, 37°C).
9. Waschen mit 500 µl PBS- (3 x 2 min, Raumtemp).
10. Kernfärbung der Zellen (siehe 3.3.6.4 Färbung der Zellkerne).
Die Spezifität des FITC-gekoppelten Anti-BrdU-Antikörpers wurde mit Zellen
kontrolliert, die nicht mit BrdU inkubiert wurden.
3.4 Molekularbiologische Untersuchungen
3.4.1 RNS-Isolierung und DNase-Behandlung
Die Ribonukleinsäure (RNS) wurde mit dem "RNeasy Mini Kit" (Qiagen) aus den
primären Gehirnzellkulturen isoliert. Das nachfolgende Protokoll zur RNSIsolierung und DNase-Behandlung ist nach den Angaben des Herstellers
durchgeführt worden.
1. Lysis der Zellen mit RLT-Puffer (350 µl + 3,5 µl β-Mercaptoethanol) auf der
Zellkulturplatte; Verbringung der lysierten Zellen in ein 2 ml Eppendorfgefäß.
2. Homogenisierung der lysierten Zellen mit einem OMNI TH-Homogenisator mit
autoklavierbaren Wechselspitzen (Süd-Laborbedarf GmbH).
48
Material und Methoden
3. Zugabe von 70%igem Ethanol im Verhältnis 1:1 (350 µl); Vermischen der
Lösungen durch Auf- und Abpipettieren.
4. Verbringung der gemischen Lösungen (max. 700 µl) auf eine RNeasy Mini-Säule;
Zentrifugation bei ≥8000 x g für 15 s (Heraeus); Durchfluss verwerfen.
5. Zugabe von 350 µl RW1-Puffer auf Säule; Zentrifugation bei ≥8000 x g für 15 s
(Heraeus); Durchfluss verwerfen.
6. 10 µl DNase I-Stammlösung mit 70 µl RDD-Puffer (Qiagen) durch vorsichtges
Schwenken und Kippen vermischen und auf Säule geben; Inkubation für 15 min
bei Raumtemperatur (20-30°C).
7. Zugabe von 350 µl RW1-Puffer auf Säule; Zentrifugation bei ≥8000 x g für 15 s
(Heraeus); Durchfluss verwerfen.
8. Zugabe von 500 µl RPE-Puffer auf Säule; Zentrifugation bei ≥8000 x g für 15 s
(Heraeus); Durchfluss verwerfen.
9. Zugabe von 500 µl RPE-Puffer auf Säule; Zentrifugation bei ≥8000 x g für 2 min
(Heraeus); Durchfluss und das 2 ml Reaktionsgefäß zum Auffangen verwerfen.
10. Säule auf ein weiteres 2 ml Reaktionsgefäß setzen; Zentrifugation bei maximaler
Geschwindigkeit für 1 min (Heraeus); Durchfluss verwerfen.
11. Säule auf ein 1,5 ml Reaktionsgefäß setzen; 30-50 µl RNase-freies Wasser auf
die Membran der RNeasy Mini-Säule geben; RNS-Elution durch Zentrifugation bei
≥8000 x g für 1 min (Heraeus); Säule verwerfen.
12. Entnahme von 5 µl der RNS-Lösung zur Konzentrationsbestimmung; Einfrieren
des Restes in flüssigem Stickstoff; Lagerung bei -80°C.
Die 5 µl zur Konzentrationsbestimmung wurden mit 70 µl Diethylpyrokarbonat
behandeltem, zweifach destilliertem (DEPC)-Wasser durch mehrfaches Auf- und
Abpipettieren gemischt. Der RNS-Gehalt der Proben wurde anhand der Absorption
bei einer Wellenlänge von 260 nm mit dem Spektralphotometer GeneQuant™ pro
(GE Healthcare Europe GmbH) bestimmt. Mit Ausnahme des β-Mercaptoethanols
und des Ethanols waren alle verwendeten Lösungen im RNeasy Minikit™ enthalten.
Material und Methoden
49
Aus Zellkulturüberstand wurde die RNS mit dem "QIAamp® MinElute® Virus Spin
Kit" (Qiagen) isoliert. Das nachfolgende Protokoll zur RNS-Isolierung und DNaseBehandlung ist nach den Angaben des Herstellers durchgeführt worden.
1. Verbringung von 25 µl Protease in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß.
2. Zugabe von 200 µl Zellkulturüberstand.
3. Zugabe von 200 µl Puffer AL mit 28 µg/ml “Carrier RNA“.
4. 1,5 ml Eppendorfgefäß für 15 s vortexen (IKA-Labortechnik).
5. Inkubation der Lösung bei 56°C für 15 min im “Test Tube Shaker“ (Merck
Eurolab).
6. Kurze Zentrifugation (Heraeus) zur Entfernung von Wassertropfen am Deckel.
7. Zugabe von 250 µl 96-100%igem Ethanol.
8. 1,5 ml Eppendorfgefäß für 15 s vortexen (IKA-Labortechnik).
9. Kurze Zentrifugation (Heraeus) zur Entfernung von Wassertropfen am Deckel.
10. Verbringung der Lösung auf eine QIAamp MinElute Säule; Zentrifugation bei
maximaler Geschwindigkeit für 2 min (Heraeus); Durchfluss und das 2 ml
Reaktionsgefäß zum Auffangen verwerfen.
11. Säule auf ein weiteres 2 ml Reaktionsgefäß setzen; Zugabe von 500 µl
Waschpuffer AW2.
12. Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min (Heraeus); Durchfluss und
das 2 ml Reaktionsgefäß zum Auffangen verwerfen.
13. Säule auf ein weiteres 2 ml Reaktionsgefäß setzen; Zugabe von 500 µl 96100%igem Ethanol; Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 1 min
(Heraeus); Durchfluss und das 2 ml Reaktionsgefäß zum Auffangen verwerfen.
14. Säule auf ein weiteres 2 ml Reaktionsgefäß setzen; Zentrifugation bei maximaler
Geschwindigkeit für 5 min (Heraeus); Durchfluss verwerfen.
15. Säule auf ein weiteres 2 ml Reaktionsgefäß setzen; Inkubation der Säule im 2 ml
Reaktionsgefäß bei 56°C für 3 min bei geöffneten Deckel (Evaporation
zurückgebliebener Lösungen).
16. Säule auf ein 1,5 ml Reaktionsgefäß setzen; 20-150 µl Elutionspuffer AVE auf die
Membran der QIAamp MinElute Säule geben.
17. Inkubation der Säule bei RT für 1 min.
50
Material und Methoden
18. RNS-Elution durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min
(Heraeus); Säule verwerfen.
19. Entnahme von 5 µl der RNS-Lösung zur Konzentrationsbestimmung; Einfrieren
des Restes in flüssigem Stickstoff; Lagerung bei -80°C.
3.4.2 Reverse Transkription
Die Gesamt-RNS der Proben wurde mit dem “OmniscriptTM Reverse Transcriptase
Kit“ (Qiagen), 10 µM “Random Hexamers“ (Random Primers, Promega) und 0,5 U/µl
“RNase Inhibitor“ (RNase Out®, Invitrogen) wie vom Hersteller empfohlen zu cDNS
umgeschrieben.
Die
Reverse
Transkription
mit
spezifischen
Primern
erfolgte
in
einem
Reaktionsansatz von 10 µl. Hierfür wurde zuerst ein RNS-Primer-Mix bestehend aus
2 µl 3,75 µM Primer und 5 µl RNS hergestellt. Anschließend wurde diese Lösung für
5 min bei 70°C und 350 rpm im “Test Tube Shaker“ (Merck Eurolab) inkubiert, um
Sekundärstrukturen der RNS zu zerstören und die Bindung des Primers an die RNS
zu ermöglichen. Nach einer weiteren Inkubation der Lösung bei 0°C für 1 min wurden
3 µl RT-Master-Mix hinzugefügt, der 0,5 U/µl “RNase Inhibitor“ (RNase Out®,
Invitrogen), 0,2 U/µl “Reverse Transcriptase“ (Omniscript®, Qiagen), 500 nM dNTPs
und RT-Reaktionspuffer (1x) enthielt.
Die Reaktionsansätze mit einer RNS-Endkonzentration von 10 ng/µl wurden in einem
Multicycler®
PTC-200
(Biozym
Diagnostik
GmbH)
inkubiert.
Folgendes
Temperaturprofil wurde gewählt:
1. 10 min bei 25°C (Temperaturadaptation der Oligonucleotid-Hexamere).
2. 1 h bei 37°C (Binden und Elongation der Hexamere).
3. 5 min bei 93°C (Inaktivierung der reversen Transkriptase).
4. bei 4°C bis zur Entnahme der Proben.
Die cDNS wurde bis zur Durchführung der quantitativen PCR (qPCR) bei – 20 °C
gelagert.
Material und Methoden
51
3.4.3 Primerauswahl
Mit Hilfe des Computerprogrammes Primer3 Vers. 0.4.0 (SourceForge, Inc.,
Mountain View, CA, USA; http://frodo.wi.mit.edu/) wurden Primerpaare zum
Nachweis der mRNS der Transkriptionsfaktoren (Ets-1, p50, p65, c-jun, c-fos, Max,
p53), der Zytokine (TNF, IFN-γ) und des "housekeeping"-Gens Hypoxanthin-GuaninPhosphoribosyl-Transferase (HPRT) aus den bekannten Referenzsequenzen der
GenBankTM des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ausgesucht.
Die Synthese derPrimer wurde bei MWGBiotech in Auftrag gegeben (GERHAUSER
et al., 2005).
Die Primerpaare für die "housekeeping"-Gene ß-Aktin, Glyceraldehyd-3-PhosphatDehydrogenase (GAPDH) und Succinat-Dehydrogenase (SDHA), die MatrixMetalloproteinasen MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12, sowie zum Virusnachweis
wurden freundlicherweise von Herrn Dr. R. Ulrich, Institut für Pathologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover, zur Verfügung gestellt (ULRICH et al., 2005;
ULRICH et al., 2006). Die TMEV-Primer wurden für Sequenzen ausgesucht, welche
bei den TMEV-Stämmen BeAn, DA und GDVII vorkommen (PEVEAR et al., 1987;
PEVEAR et al., 1988; OHARA et al., 1988) und sich in dem Teil des
nichtkodierenden 5’Bereiches des Virusgenoms befinden, in dem sich das TMEV von
anderen Viren der Familie Picornaviridae unterscheidet (PEVEAR et al., 1987).
3.4.4 Konventionelle PCR
Die konventionelle PCR wurde mit dem Gene Amp® RNA PCR Core Kit (Perkin
Elmer, Applied Biosystems Deutschland GmbH), wie bei FRISK (2001), MARKUS
(2002) und GRÖTERS (2004) beschrieben, durchgeführt. Zum Funktionsnachweis
der RNS-Isolierung und der reversen Transkription wurde von jeder Probe parallel
GAPDH amplifiziert. Als Negativkontrolle für die PCR diente DEPC-Wasser, das
anstelle der zu untersuchenden cDNS in die PCR eingesetzt wurde. Es wurde jeweils
1 µl cDNS pro 50 µl Reaktionsansatz verwendet. Des Weiteren wurden eine
"annealing"-Temperatur von 60°C, eine Primerkonzentration von jeweils 300 nM
sowie eine MgCl2-Konzentration von 2,0 mM gewählt.
52
Material und Methoden
Die PCR-Reaktion fand in den folgenden Schritten in einem Multicycler® PTC-200
Thermocycler (Biozym Diagnostik GmbH) statt:
1. 1 min bei 94°C (Denaturierung).
2. 40 Zyklen:
•
1 min bei 94°C (Denaturierung)
•
2 min bei 60°C (Primeranlagerung)
•
1 min bei 72°C (Elongation).
3. 30 min bei 72°C (finale Elongation).
4. 4°C bis zur Probenentnahme.
Die RT-PCR-Amplifikate wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
Zur Sicherung der Spezifität wurden die Proben mit MontageTM PCR Filter Devices
(Millipore GmbH) und/oder dem “Nucleo Spin® Extract Kit II“ (Macherey-Nagel)
aufgereinigt und konzentriert und 500 ng der DNS von SeqLab sequenziert.
3.4.5 Gelelektrophorese
Die
Produkte
aus
ethidiumbromidhaltigen
der
RT-PCR
Agarosegel
wurden
in
in
einer
einem
mit
horizontalen
2%igen
Trisaminomethan-Borat-
Ethylendiamin-tetraessigsäure- (TBE) Puffer gefüllten Laufkammer elektrophoretisch
aufgetrennt, wie bei FRISK (2001) beschrieben. Von jeder Probe wurden 15 µl des
PCR-Produktes mit 3 µl Bromphenol-Laufpuffer (Thermo Fisher Scientific) gemischt
und in die Gel-Taschen pipettiert. Als Längenstandard wurde zusätzlich immer eine
100-1000 bp-DNS-Leiter (Thermo Fisher Scientific) auf dem Gel aufgetragen. Die
elektrophoretische Auftrennung erfolgte mit der Elektrophoresis Power Supply E425
(Consort N.V.) Spannungsquelle bei 120 V (6V/cm) und einer maximalen
Stromstärke von 250 mA für 60 Minuten. Die Visualisierung und Dokumentation
erfolgte mit dem BioDoc Analyse System (Biodoc) basierend auf der Wechselwirkung
von doppelsträngiger DNS mit Ethidiumbromid und dessen Fluoreszenz unter UVLicht bei einer Wellenlänge von 312 nm.
Material und Methoden
53
3.4.6 PCR-Kontrollen
Als
Positivkontrollen
wurde
RNS
aus
murinem
Uterusgewebe,
welches
bekanntermaßen die Zielsequenzen exprimiert, und als Negativkontrolle DEPCWasser verwendet.
3.4.7 Herstellung der Standardreihen
In Vorversuchen wurde für Ets-1, p65, c-jun, c-fos, Max, p53, HPRT, und TNF mit
dem Gene Amp® RNA PCR Core Kit (Perkin Elmer, Applied Biosystems Deutschland
GmbH) wie bei FRISK (2001), GRÖTERS (2004) und MARKUS (2002) beschrieben
aus murinem Uterusgewebe ein spezifisches RT-PCR-Produkt erzeugt. Als
Ausgangszellen für das RT-PCR-Produkt von p50 wurden murine Lewis-LungKarzinom-Zellen
(LL/2
cells,
CR-1642™,
ATCC®,
LGC
Standards
GmbH)
genommen. Zur Herstellung eines RT-PCR-Produktes von IFN-γ dienten mit
Concanavalin A (5 mg/l; Sigma-Aldrich Chemie GmbH) stimulierte Lymphozyten aus
der Milz einer adulten SJL/J-Maus (ATZPODIEN, 2003). Diese Produkte wurden im
Folgenden in einen pCR®4-TOPO®-Plasmid-Vektor eingebaut und in E. coli DH5αT1R-Zellen kloniert (TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing, Invitrogen™; GRÖTERS,
2004).
Das Plasmid wurde mit dem NucleoBond®-Kit (Macherey-Nagel) aufgereinigt. 1,0 ng
des Plasmids wurde im Folgenden in eine 50 µl PCR-Reaktion mit "M13up-" und
"M13downstream" Primern (Invitrogen™) eingesetzt und amplifiziert (dreifacher
Ansatz). Eine Elektrophorese von 15 µl des PCR-Produktes in einem 2%igen
Agarosegel wie unter 3.13 beschrieben zeigte die spezifische Bande, deren Länge
der Größe des Ur-PCR-Produktes +166 bp (zusätzliche Basen des Vektors zwischen
kloniertem Ur-PCR-Produkt und M13-Primerbindungsstellen) entspricht. 135 µl des
PCR-Produktes wurden daraufhin mit "MontageTM PCR Filter Devices" (Millipore
GmbH) und/oder dem „Nucleo Spin® Extract Kit II“ (Macherey-Nagel) aufgereinigt
und konzentriert und 500 ng der DNS von SeqLab mit einem T3- oder T7-Primer
sequenziert.
Die dsDNS-Konzentration der aufgereinigten, sequenzierten PCR-Produkte, die zur
Standardherstellung dienten, wurde mit dem Spektralphotometer GeneQuant™ pro
54
Material und Methoden
(GE Healthcare Europe GmbH) bei 260 nm gemessen. Die Anzahl an
doppelsträngigen DNS Kopien pro µl wurde nach folgender Formel berechnet:
Kopien = (dsDNS-Konzentration(ng/µl) x 10-9) x 6,02 x 1023 Teilchen/mol
µl
(660(g/mol) x Fragment(bp))
Aus dieser cDNS wurden anschließend log10 Verdünnungsreihen in Aqua depc. mit
108 bis 102 Kopien pro µl hergestellt, die als externer Standard für eine absolute
Quantifizierung in der quantitativen PCR verwendet wurden (LARIONOV et al., 2005;
RUTLEDGE u. CÔTÉ, 2003). Diese Standardreihen wurden in jedem qPCR
Experiment jeweils im Doppelansatz verwendet. Die Sequenzen der verwendeten
Standards wurden zum NCBI geschickt und wurden in der GenBank™ hinterlegt
(GERHAUSER, 2007; GERHAUSER et al., 2005).
3.4.8 Quantitative PCR
Die quantitative PCR (qPCR) wurde mit dem Brilliant® SYBR® Green QPCR Core
Reagent Kit (Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG) auf einem
Mx3005P® Multiplex Quantitative PCR System (Agilent Technologies Sales &
Services GmbH & Co. KG), mit 1 µl cDNS per 25 µl Reaktionsansatz durchgeführt.
Bei den qPCR-Experimenten wurden 5 Vertiefungen pro Gruppe und Zeitpunkt für
die Monokultur (fünffacher Ansatz) und 3 Vertiefungen pro Gruppe und Zeitpunkt für
die Kokultur gemessen (dreifacher Ansatz). Für jedes Primerpaar wurde in
Vorversuchen die optimale Anlagerungs- ("Annealing") Temperatur im Bereich von
50-65°C bestimmt. Hierzu wurden identische Reaktionsansätze bei verschiedenen
"Annealing"-Temperaturen in die qPCR eingesetzt und die Temperatur ausgewählt,
die bei spezifischem Schmelzpunkt den geringsten Ct-Wert zeigte (Ergebnisse nicht
dargestellt). Die weiteren variablen Reaktionsbedingungen der Primer-, MgCl2-,
Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glycerolkonzentration wurden bei GERHAUSER
(2007) und GERHAUSER et al. (2005) aufgeführt.
Material und Methoden
55
Die qPCR wurde in einem Mx3005P® Thermocycler (Agilent Technologies Sales &
Services GmbH & Co. KG) mit dem folgenden Temperaturprofil verwendet:
1. 10 min bei 95°C (Denaturierung und Aktivierung der "HotStart Taq").
2. 40 Zyklen:
•
30 s bei 95°C (Denaturierung)
•
1 min bei "Annealing"-Temperatur (Primeranlagerung)
•
30 s bei 72°C (Elongation).
3. 1 min bei 95°C (Denaturierung).
4. 55°C, +1°C alle 30 s bis 95°C (Schmelzkurvenanalyse).
5. Ende.
Die Fluoreszenz wurde in jedem Zyklus während der "Annealing"-Phase gemessen.
Zur Sicherung der Spezifität der mittels qPCR gemessenen Kopienzahlen wurde im
Anschluss an die exponentielle Amplifikation eine Schmelzkurvenanalyse wie bei
RIRIE et al. (1997) beschrieben durchgeführt. Hierbei wurde die Temperatur von
55°C angefangen alle 30 Sekunden um 1°C bis auf 95°C erhöht. Im Verlauf der
Schmelzkurvenanalyse wurde die Fluoreszenz auf jeder Stufe für jede Probe drei Mal
gemessen.
Die
MxProTM
Software
berechnet
aus
den
gemessenen
Fluoreszenzdaten automatisch das Maximum der negativen 1. Ableitung der
Fluoreszenz nach der Temperatur. Dieser als "Tm" bezeichnete Temperaturwert ist
der Punkt, bei dem eine maximale Anzahl von DNS-Doppelsträngen denaturiert. Der
Tm ist abhängig von der Länge, dem G/C-Gehalt und der Sequenz des PCRProduktes und somit spezifisch für ein bestimmtes qPCR-Produkt (RIRIE et al. 1997).
Es wurden nur solche qPCR-Produkte als spezifisch gewertet, deren Tm um nicht
mehr als 1,5°C von dem in Vorversuchen gemessenen Tm abwich.
Die Auswertung der Fluoreszenzdaten und Umrechnung in Kopienzahlen nach der
Standardkurvenmethode (LARIONOV et al., 2005; RUTLEDGE u. COTÉ, 2003)
erfolgte mit der Softwareversion 2.02 des Mx3005P® Multiplex Quantitative PCR
Systems (Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG). Die Ergebnisse
der quantitativen PCR wurden normalisiert, um unkontrollierbare Unterschiede der
RNS-Isolierung und reversen Transkription auszugleichen. Hierzu wurde für jede
56
Material und Methoden
Probe ein Normalisierungsfaktor aus den Kopienzahlen der vier "Housekeeping" Gene berechnet, wie von VANDESOMPELE et al. (2002) beschrieben.
3.4.9 Transfektion von primären Astrozyten mit siRNS
Zur Verminderung der Genexpression von p50 und c-jun mittels RNS Interferenz
wurden jeweils zwei für diese Gene spezifische siRNSs eingesetzt (Qiagen; Tab.
3.2). Eine unspezifische, mit Cy3 gekoppelte siRNS wurde als Negativkontrolle
benutzt (Qiagen; Tab. 3.2).
Tab. 3.2:
Produktname, Katalog-Nr. und Zielsequenz der für p50 und c-jun
spezifischen und der unspezischen siRNSs
Gen
p50
c-jun
-
Produktname
Katalog-Nr.
Zielsequenz
Mm_Nfkb1_5
SI02709805
TACCCTGAAATCAAAGACAAA
Mm_Nfkb1_6
SI02733990
TAAGTTGTGCATTCAAATTAA
Mm_Jun_1
SI01079855
AGCGTTCGTTATCACAATAAA
Mm_Jun_2
SI01079862
AAGCTGATTACTGTCAATAAA
AllStars Neg. siRNS
AF555
1027286
-
Die lyophilisierten siRNSs wurden mit siRNS-Suspensionspuffer (Qiagen) aufgelöst.
Die siRNS-Lösungen wurden auf eine Konzentration von 20 µmol/l eingestellt, 1 min
bei 90°C und 60 min bei 37°C im Wasserbad zur Spaltung
aggregierter
Lyophilisatbestandteile inkubiert, aliquotiert und bei -20°C gelagert.
Zur Transfektion der primären Astrozyten in 24-Loch-Platten (jeweils in 500 µl Sato’s
Medium mit 10% FKS pro Vertiefung) diente das HiPerFect Transfection Reagent
(Artikel-Nr. 301702, Qiagen) nach folgendem Protokoll.
1. Verdünnung von 187,5 ng siRNS in 100 µl Sato’s Medium ohne FKS (entspricht
einer Endkonzentration von 25 nmol/l siRNS).
2. Hinzugabe von 3 µl Transfektionsreagenz.
3. Inkubation der 103 µl Transfektionslösung bei RT für 5-10 min zur Bildung der
Transfektionskomplexe.
Material und Methoden
57
4. 103 µl Transfektionslösung tropfenweise auf die Zellen einer Vertiefung der 24Loch-Platte
geben
und
Platte
leicht
schwenken
zur
Verteilung
der
Transfektionskomplexe (603 µl Gesamtvolumen pro Vertiefung).
5. Inkubation der Zellen bei 37°C und 5% CO2.
3.5 Statistische Auswertung
Zur statischen Auswertung und Erzeugung der graphischen Darstellungen wurde das
Programm SPSS (“Superior Performing Software Systems“, Version 16.0) benutzt.
Da die Ursprungsdaten der RT-qPCR sich als überwiegend nicht normalverteilt
erwiesen, wurde die Zahl 0 durch den kleinsten gemessenen Wert (Nachweisgrenze)
geteilt durch 2 ersetzt und eine logarithmische Transformation (Logarithmus zur
Basis 10, log10) durchgeführt. Zur Darstellung der in den Zellen gemessenen
Genexpressionen wurde die relative Genexpression als das Verhältnis der
geometrischen Mittelwerte der normalisierten Kopien / 10 ng RNS der Gruppen
zueinander (TMEV-infizierte Zellen / nicht infizierte Zellen) mit oberem und unterem
95%-Konfidenzintervall bestimmt. Eine relative Genexpression >1 und ≤ 2 wurde als
geringgradig, ≤ 10 als mittelgradig, und > 10 als hochgradig aufreguliert bezeichnet.
Dementsprechend wurde eine relative Genexpression ≥ 0,5 und < 1 als geringgradig,
≥ 0,1 als mittelgradig und < 0,1 als hochgradig herunterreguliert bezeichnet. Für
diese quantitativen Daten erfolgte die Prüfung auf signifikante Unterschiede durch
paarweise Vergleiche der Gruppen mit t-Tests. Zur Untersuchung der Daten auf
Korrelationen wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman berechnet.
Hierbei
wurden
statistisch
signifikante
Korrelationen
mit
einem
absoluten
Rangkorrelationskoeffizient von ≤ 0,5 bzw. ≥ -0,5 als gering, ≤ 0,8 bzw. ≥ -0,8 als
mittelmäßig und > 0,8 bzw. < -0,8 als stark positiv bzw. negativ bezeichnet. Die
quantitativen Daten der Proliferations- und Apoptoserate in primären Astrozyten
wurden ebenfalls einer logarithmischen Transformation (Logarithmus zur Basis 10,
log10) unterzogen. Hierfür wurde wieder die Zahl 0 durch den kleinsten gemessenen
Wert geteilt durch 2 ersetzt. Anschließend wurden die Daten mit einer einfaktoriellen
Varianzanalyse und Post-Hoc-Tests nach Tukey zum Vergleich der Gruppen
analysiert. Für die quantitativen Daten der RNS Interferenz mittels siRNS in primärer
58
Material und Methoden
Mikroglia erfolgte die Prüfung auf signifikante Unterschiede mit einem gepaarten
Wilcoxon-Test. Der α-Fehler wurde bei allen statistischen Untersuchungen auf 0,05
festgelegt. Ergebnisse mit p ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse
4
59
Ergebnisse
4.1 Herstellung eines Theilerviruspools
4.1.1 Vermehrung
Das TMEV wurde siebenmal in BHK-21-Zellen passagiert und titriert. Bei der hierbei
verwendeten MOI wurde regelmäßig ein ZPE bei mehr als 95% aller BHK-21-Zellen
etwa 12 Stunden nach der Infektion beobachtet. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte die
Virusernte. Der ZPE wurde sowohl in BHK-21-Zellen als auch in L2-Zellen beurteilt
(Abb. 4.1).
Abb. 4.1: TMEV-infizierte BHK-21-Zellen (A,B) und L2-Zellen (C,D) 72 h nach der
TMEV-Infektion.
Zellrasen nach Infektion mit dem BeAn-Stamm des TMEV mit zahlreichen
abgerundeten Zellen (Plaques). Phasenkontrastaufnahmen. Balken = 100 µm (A,C).
Balken = 50 µm (B,D).
60
Ergebnisse
4.1.2 Titration
Die Passagen wurden mit einem Plaque-Assay titriert, wobei für die Passage 6 ein
Titer von 5,5 x 108 PFU/ml und für die Passage 7 ein Titer von 4,96 x 106 PFU/ml
erzielt wurde. Hierfür wurden 1,0 x 106 L2-Zellen in die Löcher einer 6-Loch-Platte
ausgesät. Subkonfluente Zellrasen wurden mit TMEV in log10-Verdünnungsstufen
infiziert und mit 0,4%iger Methylzellulose überschichtet. Nach drei Tagen wurden die
Zellrasen mit 10%igem Formalin fixiert und mit 1%igem Kristallviolett in 20%igem
Ethanol gefärbt (Abb. 4.2).
Abb. 4.2:
Plaquetest.
Neben dem unbeschädigten Zellrasen der Kontrolle sind eine nahezu vollständige
Zerstörung der Zellen in den ersten beiden Verdünnungsstufen und eine
abnehmende Anzahl an Plaques (bei 107 markiert mit Kreisen) in den folgenden drei
Verdünnungsstufen zu erkennen. Plaquetest mit L2-Zellen der Passage 47.
4.1.3 Nachweis
Die Produktion von Theilerviruspartikeln wurde mittels Immunfluoreszenz unter
Verwendung eines monoklonalen murinen anti-TMEV-Antikörpers (DAmAb2) und
eines FITC-gekoppelten Sekundärantikörpers (Jackson ImmunoResearch Europe
Ltd.) nachgewiesen (Abb. 4.3).
Ergebnisse
Abb. 4.3:
61
Nachweis des TMEV in L2-Zellen mittels Immunfluoreszenz 72 h
nach der TMEV-Infektion.
A
B
(A) Phasenkontrastaufnahme der TMEV-infizierten L2-Zellen. (B) Überlagerung von
grün-fluoreszierenden TMEV-positiven Zellen (monoklonaler Antikörper DAmAb2;
FITC) und blau-fluoreszierenden Kernen (gefärbt mit Bisbenzimide 0.01%).
Zahlreiche zellassoziierte Theilerviruspartikel sind zu erkennen. Balken = 100 µm.
4.2 Herstellung primärer Gehirnzellkulturen
4.2.1 Herstellung einer Mischkultur
In den neonatalen Gehirnmischkulturen wurden überwiegend flache polygonale
Astrozyten
beobachtet.
Zwischen
den
Astrozyten
befanden
sich
einige
Oligodendrozytenvorläuferzellen mit bipolaren spindelförmigen Fortsätzen. Des
Weiteren waren zahlreiche abgerundete Mikrogliazellen diesen Zellen aufgelagert
(Abb. 4.4).
62
Abb. 4.4:
Ergebnisse
Mischkultur glialer Zellen 7 Tage nach der Isolation aus neonatalen
SJL/J-Mäusen.
Zellrasen mit flachen polygonalen Astrozyten (große Pfeile) und bi- und tripolaren
spindelförmigen Oligodendrozytenvorläuferzellen (kleine Pfeile) sowie aufgelagerten
abgerundeten Mikrogliazellen (Pfeilspitzen). Phasenkontrastaufnahme. Balken = 50
µm.
4.2.2 Herstellung der primären Astrozyten- und Mikrogliakulturen
Die primären Astrozyten und Mikrogliazellen wurden in zwei aufeinanderfolgenden
Experimenten aus den Großhirnhemisphären von jeweils 8-10 neonatalen SJL/JMäusen (1 Wurf) gewonnen und von Oligodendrozytenvorläuferzellen getrennt (Abb.
4.5). Der Reinheitsgrad der einzelnen primären Astrozyten- und Mikrogliazellkulturen
betrug ca. 90% bzw. 95% in der GFAP bzw. DiI-ac-LDL/Iba1-Immunfluoreszenz.
Ansonsten befanden sich einzelne Fibroblasten und andere gliale Zellen in den
Gehirnzellkulturen. Die Versuche wurden in der Monokultur im fünffachen Ansatz und
in der Kokultur im dreifachen Ansatz durchgeführt.
Ergebnisse
63
Abb. 4.5:
Auftrennung glialer Zellen neonataler SJL/J-Mäuse.
Mischkultur 4 Tage nach Aussaat (A), Astrozyten 3 Tage nach Aussaat (B),
Mikroglia 4 Tage nach Aussaat (C) und Oligodendrozytenvorläuferzellen 6 Tage nach
Aussaat (D). Phasenkontrastaufnahmen. Balken = 60 µm.
4.3. Infektion der primären Astrozyten- und Mikrogliakulturen
Die primären Astrozyten bildeten in 7 bis 10 Tagen nach der Aussaat einen
konfluenten Zellrasen aus. Sie zeigten nach der TMEV-Infektion eine leichte
Zunahme
an
Zytoplasma,
prominente
Zellfortsätze
und
einen
gering-
bis
mittelgradigen zytolytischen ZPE, der durch eine Abrundung und Ablösung der Zellen
charakterisiert war. Die primären Mikrogliazellen stellten sich als eine gemischte
Population von abgerundeten, amöboiden und ruhenden, ramifizierten Zellen dar.
Nach
der
TMEV-Infektion
wurden
zusätzlich
vermehrt
aktivierte,
teilweise
vakuolisierte (phagozytierende) Mikrogliazellen, einzelne mehrkernige Riesenzellen
und ein geringgradiger ZPE beobachtet (Abb. 4.6).
64
Ergebnisse
Abb. 4.6:
Primäre Mikroglia 6 (A,B), 48 (C,D), 72 (E,F) und 240 (G,H) Stunden
nach der TMEV-Infektion.
Nicht
infizierte
Zellen
(A,C,E,G)
und
Phasenkontrastaufnahmen. Balken = 60 µm.
TMEV-infizierte
Zellen
(B,D,F,H).
Ergebnisse
65
4.3.1 Nachweis von TMEV-Antigen und infektiösem Virus in der Monokultur
TMEV-Protein wurde in den Astrozyten zu allen untersuchten Zeitpunkten nach der
Infektion, 6, 12, 24, 48, 72 und 240 hpi, mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Der
Prozentsatz an TMEV-Antigen-positiven Zellen betrug 6 h.p.i. im Median 1,6%, 12
h.p.i. 4,3% und 24 h.p.i. 4,0%. Zum Zeitpunkt 48 h.p.i. erreichte er einen Peak von
15,9%. Danach fiel der Prozentsatz 72 h.p.i. auf 10,3% und 240 h.p.i. auf 0,0% (Abb.
4.7). Gleichermaßen stieg die Menge an infektiösem Virus von 8,0 × 102 PFU/ml (6
h.p.i.; Abb. 4.8) über 3,5 × 104 PFU/ml (12 h.p.i.; Abb. 4.9) und 2,6 × 105 PFU/ml (24
h.p.i.; Abb. 4.10) auf 3,3 × 105 PFU/ml (48 h.p.i.; Abb. 4.11). Anschließend wurde
ebenfalls ein Abfall auf 1,3 × 105 PFU/ml (72 h.p.i.; Abb. 4.12) bzw. 2,0 × 105 PFU/ml
(240 h.p.i.; Abb. 4.13) festgestellt.
Abb. 4.7:
Prozentsatz GFAP- und TMEV-positiver primärer Astrozyten und
Anzahl an PFU/ml Zellkulturüberstand in der Monokultur.
1.000.000
100%
90%
100.000
70%
10.000
60%
50%
1.000
40%
PFU/ml
% positive Zellen
Median (Max;Min)
80%
100
30%
20%
10
10%
0%
1
0
6
12
24
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Median mit Maximum und Minimum der Prozentsätze GFAP (
und TMEV (
)-
)-positiver Zellen in der Immunfluoreszenz und die Menge an
infektiösem Virus (
).
66
Ergebnisse
Im Gegensatz zu den Astrozyten wurden in der Mikroglia an allen untersuchten
Zeitpunkten keine TMEV-Antigen-positiven Zellen beobachtet (Abb. 4.14). Infektiöses
Virus wurde in der Mikroglia erst 48 h.p.i. mit 1,8 × 103 PFU/ml nachgewiesen. Nach
einem leichten Abfall 72 h.p.i. auf 7,7 × 102 PFU/ml stieg die Menge an infektiösem
Virus im Zellkulturüberstand jedoch 240 h.p.i. stark auf 1,1 × 105 PFU/ml an.
Abb. 4.8-4.13: Primäre Astrozyten 6, 12, 24, 48, 72 und 240 h nach der TMEVInfektion in der Monokultur.
(A) Phasenkontrastaufnahme
(B) grün-fluoreszierende TMEV-Antigen–positive
Zellen (Cy2); (C) rot-fluoreszierende GFAP-positive Zellen (Cy3); (D) Überlagerung
von A und B (Cy2, Cy3 und blau-fluoreszierende Kerne gefärbt mit Bisbenzimide
0.01%). Balken = 60 µm.
Abb. 4.8:
Primäre Astrozyten 6 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
C
D
Ergebnisse
Abb. 4.9:
67
Primäre Astrozyten 12 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
C
D
Abb. 4.10: Primäre Astrozyten 24 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
C
D
68
Ergebnisse
Abb. 4.11: Primäre Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
C
D
Abb. 4.12: Primäre Astrozyten 72 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
C
D
Ergebnisse
69
Abb. 4.13: Primäre Astrozyten 240 h nach der TMEV-Infektion in der
Monokultur.
A
B
C
D
Abb. 4.14: Primäre Mikroglia 240 h nach der TMEV-Infektion in der Monokultur.
A
B
(A) Phasenkontrastaufnahme (B) Überlagerung von grün-fluoreszierenden TMEVAntigen-positiven Zellen (Cy2), rot-fluoreszierenden Iba1-positiven Zellen (Cy3) und
blau-fluoreszierenden Kernen (gefärbt mit Bisbenzimide 0.01%). Kein Nachweis von
TMEV-Antigen. Balken = 60 µm.
70
Ergebnisse
4.3.2 Nachweis von TMEV-Antigen und infektiösem Virus in der Kokultur
In der Kokultur wurde eine der Monokultur vergleichbare Menge an TMEV-Antigen
mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen (Abb. 4.15). Der Prozentsatz an TMEVAntigen-positiven Astrozyten betrug 6 h.p.i. im Median 5,3%, erreichte 48 h.p.i. einen
Peak von 12,5% und fiel zum Zeitpunkt 72 h.p.i. auf 5,0% und 240 h.p.i. auf 5,0% ab
(Abb. 4.16). In der kokultivierten Mikroglia wurde wie in der Monokultur kein TMEVAntigen beobachtet (Abb. 4.17). Zur Bestimmung der Menge an infektiösem Virus
wurde der gemeinsame Zellkulturüberstand der kokultivierten Astrozyten und
Mikrogliazellen benutzt. Mit Hilfe des Plaquetests wurden 2,2 × 103 PFU/ml (6 h.p.i.),
3,8 × 104 PFU/ml (48 h.p.i.), 7,0 × 104 PFU/ml (72 h.p.i.) und. 1,9 × 104 PFU/ml (240
h.p.i.) ermittelt (Abb. 4.15).
Abb. 4.15: Prozentsatz GFAP- und TMEV-positiver primärer Astrozyten und
Anzahl an PFU/ml Zellkulturüberstand in der Kokultur.
100%
1.000.000
90%
100.000
70%
10.000
60%
50%
1.000
40%
PFU/ml
% positive Zellen
Median (Max;Min)
80%
100
30%
20%
10
10%
0%
1
0
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Median mit Maximum und Minimum der Prozentsätze GFAP (
und TMEV (
)-
)-positiver Zellen in der Immunfluoreszenz und die Menge an
infektiösem Virus (
).
Ergebnisse
71
Abb. 4.16: Primäre Astrozyten 72 h nach der TMEV-Infektion in der Kokultur.
A
B
C
D
(A) Phasenkontrastaufnahme
(B) grün-fluoreszierende TMEV-Antigen–positive
Zellen (Cy2); (C) rot-fluoreszierende GFAP-positive Zellen (Cy3); (D) Überlagerung
von A und B (Cy2, Cy3 und blau-fluoreszierende Kerne gefärbt mit Bisbenzimide
0.01%). Balken = 60 µm.
4.3.3 Zellzahlen der primären Astrozyten und Mikrogliazellen
In der Monokultur stieg die Zellzahl der nicht infizierten Astrozyten im Median von
89 474 Zellen/cm2 zum Zeitpunkt der Infektion, über 90 789 Zellen/cm2 (6 h.p.i.),
93 026 Zellen/cm2 (12 h.p.i.), 105 263 Zellen/cm2 (24 h.p.i.), 147 368 Zellen/cm2 (48
h.p.i.) und 155 263 Zellen/cm2 (72 h.p.i.) auf 173 684 Zellen/cm2 bis zum Ende der
Untersuchung (240 h.p.i.) an. Im Gegensatz dazu blieb die Zellzahl der TMEVinfizierten Astrozyten mit 11 474 Zellen/cm2 (6 h.p.i.), 81 579 Zellen/cm2 (12 h.p.i.),
117 105 Zellen/cm2 (24 h.p.i.), 94 737 Zellen/cm2 (48 h.p.i.), 121 053 Zellen/cm2 (72
h.p.i.) und 88 158 Zellen/cm2 (240 h.p.i.) über alle untersuchten Zeitpunkte relativ
konstant. Die nicht infizierte Mikroglia zeigte eine Zellzahl von 44 400 Zellen/cm2 zum
Zeitpunkt der Infektion, 39 400 Zellen/cm2 6 h.p.i. und 40 000 Zellen/cm2 48 h.p.i.
72
Ergebnisse
Danach stieg die Zellzahl auf 47 800 Zellen/cm2 72 h.p.i. bzw. auf 147 200 Zellen/cm2
240 h.p.i. an. Nach der TMEV-Infektion wies die Mikroglia eine überwiegend
unveränderte Zellzahl von 36 400 Zellen/cm2 (6 h.p.i.), 39 400 Zellen/cm2 (48 h.p.i.),
52 400 Zellen/cm2 (72 h.p.i.) und 33 400 Zellen/cm2 (240 h.p.i.) auf (Abb. 4.18).
Eine statistische Analyse der in der Mono- und Kokultur erhobenen Zellzahlen wurde
aufgrund der Studienplanung mit nur zwei Werten pro Gruppe nicht durchgeführt.
Abb. 4.17: Primäre Mikroglia und L2-Zellen 72 h nach der TMEV-Infektion in der
Kokultur.
(A)
A
B
C
D
Phasenkontrastaufnahme
der
Mikroglia
(B)
Überlagerung
von
rot-
fluoreszierender Iba1-positiver Mikroglia (Cy3) und blau-fluoreszierenden Kernen
(gefärbt mit Bisbenzimide 0.01%). Kein Nachweis von TMEV-Antigen. (C)
Phasenkontrastaufnahme der L2-Zellen (D) Überlagerung von grün-fluoreszierenden
TMEV-Antigen-positiven L2-Zellen (Cy2) und blau-fluoreszierenden Kernen (gefärbt
mit Bisbenzimide 0.01%). Balken = 60 µm.
Ergebnisse
73
Abb. 4.18: Zellzahl der primären Astrozyten (A) und Mikroglia (B) in der
Monokultur.
A
200.000
180.000
Zellen/cm2
Median (Max;Min)
160.000
140.000
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
0
6
12
24
48
72
240
Stunden nach der Infektion
B
200.000
180.000
Zellen/cm2
Median (Max;Min)
160.000
140.000
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
0
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Die Zellen wurden entweder nur mit Sato’s Medium (
) kultiviert oder mit TMEV
(MOI = 1; ) infiziert. Dargestellt ist der Median der Zellen/cm2 mit Maximum und
Minimum.
74
Ergebnisse
In der Kokultur wurde an den ersten vier untersuchten Zeitpunkten eine relativ
konstante Zellzahl der nicht infizierten Astrozyten mit im Median 68 800 Zellen/cm2
0 h.p.i., 73 600 Zellen/cm2 6 h.p.i., 72 000 Zellen/cm2 48 h.p.i. und 68 800 Zellen/cm2
72 h.p.i. beobachtet. Bis zum Ende der Untersuchung (240 h.p.i.) stieg die Zellzahl
auf 99 200 Zellen/cm2 an. Im Gegensatz dazu fiel die Zellzahl der TMEV-infizierten
Astrozyten über den Verlauf der Untersuchung kontinuierlich von 84 800 Zellen/cm2
(6 h.p.i.), über 70 400 Zellen/cm2 (48 h.p.i.) und 57 600 Zellen/cm2 (72 h.p.i.) auf 40
000 Zellen/cm2 (240 h.p.i.). Die nicht infizierte Mikroglia zeigte eine Zellzahl von im
Median 32 000 Zellen/cm2 0 h.p.i., 24 000 Zellen/cm2 6 h.p.i., 24 000 Zellen/cm2 48
h.p.i., 24 000 Zellen/cm2 72 h.p.i. und 36 800 Zellen/cm2 240 h.p.i. Nach der TMEVInfektion wies die Mikroglia einen Anstieg der Zellzahl von im Median 25 600
Zellen/cm2 (6 h.p.i.) auf 52 800 Zellen/cm2 (48 h.p.i.) auf. Danach fiel die Zellzahl wie
bei den kokultivierten Astrozyten auf 35 200 Zellen/cm2 (72 h.p.i.) bzw. 27 200
Zellen/cm2 (240 h.p.i.) ab (Abb. 4.19).
4.3.4 BrdU-Test von primären Astrozyten
Der Einfluss einer TMEV-Infektion auf die Proliferationsrate von primären Astrozyten
wurde mittels eines BrdU-Tests genauer untersucht, welcher 48 Stunden nach einer
TMEV-Infektion (MOI = 10) im vierfachen Ansatz durchgeführt wurde (Beginn der
BrdU-Inkubation 34 Stunden nach der TMEV-Infektion). Zur Kontrolle wurden die
Zellen mit UV-Licht inaktiviertem TMEV inkubiert oder nur mit Wachstumsmedium
kultiviert.
Nicht infizierte Astrozyten wiesen einen Median der Proliferationsrate von 10,9% auf.
Nach einer Inkubation der Zellen mit UV-Licht inaktiviertem TMEV lag die
Proliferationsrate im Median bei 6,0%. Ein statistisch signifikanter Unterschied zu den
nicht infizierten Astrozyten wurde nicht nachgewiesen (p = 0,115). Die Proliferationsrate fiel jedoch nach einer TMEV-Infektion auf einen Median von 1,5% und war
statistisch signifikant kleiner als die Proliferationsrate der mit UV-Licht inaktiviertem
TMEV-inkubierten Zellen (p = 0,031) und der nicht infizierten Zellen (p = 0,01; Abb.
4.20).
Ergebnisse
Abb. 4.19:
75
Zellzahl der primären Astrozyten (A) und Mikroglia (B) in der
Kokultur.
A
120.000
Zellen/cm2
Median (Max;Min)
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
0
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
B
120.000
Zellen/cm2
Median (Max;Min)
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0
0
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Die Zellen wurden entweder nur mit Sato’s Medium (
) kultiviert oder mit TMEV
(MOI = 1; ) infiziert. Dargestellt ist der Median der Zellen/cm2 mit Maximum und
Minimum.
76
Ergebnisse
Abb. 4.20:
Proliferationsrate von primären Astrozyten.
% BrdU positiver Zellen__
Median (Max;Min)
14%
‡
12%
‡
10%
8%
6%
4%
2%
0%
0
1
2
Die Zellen wurden entweder mit Sato’s Medium (
3
4
) kultiviert oder mit UV-Licht
inaktiviertem TMEV ( ) inkubiert oder mit TMEV (MOI = 10; ) infiziert. Dargestellt ist
der Median des prozentualen Anteils BrdU-positiver Zellen mit Maximum und
Minimum
48
Stunden
nach
der
TMEV-Infektion.
Statistisch
signifikant
unterschiedliche Gruppen sind mit dem gleichen Symbol markiert ( , ‡; p < 0,05).
Außerdem wurde eine Doppelfärbung der TMEV-infizierten Astrozyten mit dem
monoklonalen Anti-BrdU-Antikörper und einem polyklonalen Anti-TMEV-Antikörper
durchgeführt, um die Zellen auf das Vorliegen einer Kolokalisation von BrdU und
TMEV-Antigen zu untersuchen. Hierbei stellte sich heraus, dass BrdU-positive Zellen
überwiegend negativ für TMEV-Antigen waren (Abb. 4.21).
Des Weiteren wurde die Zellzahl in jeder Vertiefung bestimmt, in dem jeweils 5
Felder in der 40fachen Vergrößerung ausgezählt wurden. Aus der so ermittelten
Zellzahl pro Fläche wurde die Zellzahl in der gesamten Vertiefung errechnet. Die
Abbildung 4.22 stellt die Zellen pro Vertiefung in den drei Gruppen dar, die in dem
BrdU-Test und dem nachfolgenden Versuch zur Bestimmung der Apoptoserate
ermittelt wurden.
Ergebnisse
77
Abb. 4.21: Proliferation von primären Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion.
Grün-fluoreszierende BrdU–positive Zellen (FITC), rot-fluoreszierende TMEVAntigen-positive
Bisbenzimide
Zellen
0.01%.
(Cy3)
Eine
und
blau-fluoreszierende
Kolokalisation
der
Kerne
gefärbt
Fluoreszenzsignale
ist
mit
nicht
nachweisbar. Balken = 50 µm.
Nicht infizierte Astrozyten wiesen einen Median von 41 648 Zellen pro Vertiefung auf.
48 Stunden nach einer Inkubation der Zellen mit UV-Licht inaktiviertem TMEV
wurden 41 040 Zellen pro Vertiefung beobachtet. Ein statistisch signifikanter
Unterschied zu den nicht-infizierten Astrozyten wurde nicht nachgewiesen (p =
0,960). Die Zellzahl fiel nach einer TMEV-Infektion auf einen Median von 32 528
Zellen pro Vertiefung und war statistisch signifikant kleiner als die Zellzahl der nicht
infizierten Zellen (p = 0,041). Der statistisch auffällige Abfall dieser TMEV-infizierten
auch gegenüber den mit UV-Licht inaktiviertem TMEV-inkubierten Zellen erreichte
jedoch nicht das statistisch relevante Signifikanzniveau (p = 0,079).
78
Ergebnisse
Abb. 4.22: Zellzahl von primären Astrozyten 48 Stunden nach der TMEVInfektion.
60000
Zellen
_Median (Max;Min)_
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
1
2
Die Zellen wurden entweder mit Sato’s Medium (
3
4
) kultiviert oder mit UV-Licht
inaktiviertem TMEV ( ) inkubiert oder mit TMEV (MOI = 10; ) infiziert. Dargestellt ist
der Median der Zellen pro Vertiefung mit Maximum und Minimum. Statistisch
signifikant unterschiedliche Gruppen sind mit dem gleichen Symbol markiert (
;p<
0,05).
4.3.5 Apoptoserate von primären Astrozyten
Der Einfluss einer TMEV-Infektion auf die Apoptoserate von primären Astrozyten
wurde mittels einer Immunfluoreszenz für “cleaved“ Caspase-3 untersucht, welche 48
Stunden nach einer TMEV-Infektion (MOI = 10) im vierfachen Ansatz durchgeführt
wurde. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit UV-Licht inaktiviertem TMEV inkubiert
oder nur mit Wachstumsmedium kultiviert.
Nicht-infizierte Astrozyten wiesen einen Median der Apoptoserate von 3,0% auf.
Nach einer Inkubation der Zellen mit UV-Licht inaktiviertem TMEV wurde in 3,5% der
Zellen “cleaved“ Caspase-3 nachgewiesen. TMEV-infizierte Zellen zeigten eine
Apoptoserate von 3,7%. Statistisch signifikante Unterschiede lagen zwischen diesen
Gruppen nicht vor. Jedoch konnten teilweise höhere prozentuale Anteile an “cleaved“
Ergebnisse
79
Caspase-3-positiven Zellen in TMEV-infizierten Zellen und mit UV-Licht inaktiviertem
TMEV-inkubierten Zellen gegenüber nicht-infizierten Zellen beobachtet werden (Abb.
4.23).
Abb. 4.23: Apoptoserate von primären Astrozyten.
% Caspase-3 positiver Zellen__
Median (Max;Min)
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
0
1
2
Die Zellen wurden entweder mit Sato’s Medium (
3
4
) kultiviert oder mit UV-Licht
inaktiviertem TMEV ( ) inkubiert oder mit TMEV (MOI = 10; ) infiziert. Dargestellt ist
der Median des prozentualen Anteils “cleaved“ Caspase-3-positiver Zellen mit
Maximum und Minimum 48 Stunden nach der TMEV-Infektion.
Außerdem wurde eine Doppelfärbung der TMEV-infizierten Astrozyten mit dem
polyklonalen Anti-“cleaved“ Caspase-3-Antikörper und einem monoklonalen AntiTMEV-Antikörper durchgeführt, um die Zellen auf das Vorliegen einer Kolokalisation
von “cleaved“ Caspase-3 und TMEV-Antigen zu untersuchen. Hierbei wurden
zahlreiche Zellen nachgewiesen, welche gleichzeitig mit beiden Antikörpern
reagierten (Abb. 4.24).
80
Ergebnisse
Abb. 4.24: Apoptose von primären Astrozyten 48 h nach der TMEV-Infektion.
Grün-fluoreszierende
TMEV-Antigen–positive
Zellen
(Cy2),
rot-fluoreszierende
“cleaved“ Caspase-3-positive Zellen (Cy3) und blau-fluoreszierende Kerne gefärbt
mit Bisbenzimide 0.01%. Zwei Zellen zeigen eine deutliche Doppelfärbung (Pfeile).
Balken = 50 µm.
Ergebnisse
81
4.4 Molekularbiologische Untersuchungen
4.4.1 RT-qPCR
Die absoluten Werte der normalisierten Kopien / 10 ng RNS von TMEV und allen
untersuchten Genen sind im Anhang in den Tabellen 9.1 bis 9.6 angegeben. In allen
TMEV-infizierten Astrozyten und Mikrogliazellen war TMEV-spezifische RNS
nachweisbar. Die Untersuchung der nicht-infizierten Zellen, welche zur Kontrolle
mitkultiviert wurden, auf TMEV-spezifische RNS verlief mit negativem Ergebnis. Die
Mediane, Minima und Maxima der mono- und kokultivierten und mit TMEV infizierten
Astrozyten und Mikrogliazellen sind in Tab. 4.1 angegeben.
Tab. 4.1:
TMEV-RNS-Expression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) in
primären Astrozyten und primärer Mikroglia 6, 48, 72 und 240
Stunden nach der Infektion.
Mikroglia
Astrozyten
Zelle
Zeit
Monokultur
Kokultur
6
601 855
(404 149 ; 875 617)
164 593
(162 806 ; 169 617)
48
22 530 836
15 825 731
(19 758 511 ; 26 271 495) (10 692 334 ; 20 199 950)
72
11 059 396
(9 713 381 ; 12 564 665)
6 214 288
(5 882 421 ; 7 321 029)
240
706 513
(528 998 ; 1 573 839)
428 169
(426 841 ; 495 595)
6
3 219
(1 832 ; 5 503)
4 148
(3 852 ; 4 891)
48
1 339
(652 ; 4 228)
425 551
(239 937 ; 831 115)
72
64
(40 ; 137)
280 431
(253 091 ; 749 212)
240
1
(0 ; 2)
1 883
(950 ; 9 393)
Vergleich zwischen Monokultur und Kokultur. Die Daten der Monokultur entsprechen
KUMNOK et al., 2008. Median (Mininum ; Maximum).
82
Ergebnisse
Die Astrozyten wiesen sowohl in der Monokultur als auch in der Kokultur eine sehr
hohe Virus-RNS-Menge auf. Der Höhepunkt der Expression lag zum Zeitpunkt 48
Stunden nach der Infektion mit einem Median von ca. 2,25 x 107 normalisierten
Kopien / 10 ng RNS in der Monokultur bzw. ca. 1,58 x 107 normalisierten Kopien / 10
ng RNS in der Kokultur. In Monokultur wachsende Mikrogliazellen wiesen nur geringe
und stetig abnehmende Virus-RNS-Mengen von maximal ca. 5,50 x 103
normalisierten Kopien / 10 ng RNS auf. Im Gegensatz dazu wurden bei in Kokultur
wachsenden Mikrogliazellen stark erhöhte Virus-RNS-Mengen festgestellt. Hierbei
zeigte sich wieder ein Höhepunkt der Expression zum Zeitpunkt 48 Stunden nach der
Infektion mit einem Median von ca. 4,25 x 105 normalisierten Kopien / 10 ng RNS.
4.4.1.1 RT-qPCR der Astrozyten in der Monokultur
Sowohl in den nicht infizierten als auch in den TMEV-infizierten Astrozyten wurde
eine Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max und TNF
nachgewiesen. Des Weiteren wurden im Verlauf der Infektion Unterschiede in der
Genexpression dieser Gene zwischen den nicht infizierten und TMEV-infizierten
Zellen festgestellt, die stark von den untersuchten Zeitpunkten abhingen. 6 Stunden
nach der Infektion zeigte sich bei der Mehrheit der untersuchten Gene keine
statistisch signifikante Veränderung der Genexpression. Jedoch wiesen p65, Max
und TNF an diesem Zeitpunkt eine gering- bis mittelgradige Herunterregulierung auf.
Im Gegensatz dazu wurde 48 Stunden nach der Infektion bei der Mehrheit der
untersuchten Gene eine statistisch signifikante Aufregulierung festgestellt. Lediglich
p65 und Max wiesen keine statistisch signifikante Veränderung der Genexpression
an diesem Zeitpunkt auf. 240 Stunden nach der Infektion lag keine einheitliche
Tendenz einer Auf- oder Herunterregulierung der untersuchten Gene vor.
Die Genexpression von p65, c-jun, c-fos und Max zeigte eine gering- bis
mittelgradige Herunterregulierung. Bei p50, Ets-1 und TNF wurde keine statistisch
signifikante Veränderung der Genexpression zwischen nicht infizierten und TMEVinfizierten Astrozyten festgestellt. Als einziges Gen wies p53 auch 240 Stunden nach
der Infektion eine mittelgradige Aufregulierung der Genexpression auf. IFN-γ war in
keiner der untersuchten Proben nachweisbar. Als Maß für die Größe der
Ergebnisse
83
beschriebenenen Veränderungen wurde die relative Genexpression mit oberem und
unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.2; Abb. 4.25; Abb.
4.26).
Tab. 4.2:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max
und TNF in primären Astrozyten 6, 48 und 240 Stunden nach der
Infektion (Monokultur).
Gen
p50
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
Max
TNF
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
1,08
6,33
1,36
0,61
0,97
0,43
0,70
1,50
0,39
0,57
1,46
0,18
0,82
2,08
1,93
1,32
6,64
2,30
0,56
0,77
0,44
0,41
17,16
1,25
1,61
11,15
1,90
0,81
1,24
0,63
1,03
2,18
0,55
1,03
2,08
0,25
1,69
3,80
4,07
2,27
15,95
4,70
0,72
1,17
0,51
0,55
25,53
1,88
0,73
3,59
0,97
0,45
0,76
0,29
0,47
1,03
0,28
0,32
1,03
0,13
0,40
1,14
0,91
0,76
2,76
1,12
0,44
0,51
0,39
0,31
11,53
0,84
0,649
0,000
0,066
0,004
0,808
0,001
0,067
0,039
0,003
0,061
0,037
0,000
0,543
0,023
0,077
0,280
0,007
0,028
0,001
0,184
0,000
0,000
0,000
0,229
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Astrozyten / nicht infizierte
Astrozyten) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
84
Ergebnisse
Abb. 4.25:
Relative Genexpression von NF-κ
κB (p50/p65) und AP-1 (c-jun/cfos) in nicht infizierten und TMEV-infizierten primären Astrozyten
(Monokultur).
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
100,0
10,0
p50
p65
c-jun
c-fos
1,0
0,1
6
48
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Ergebnisse
Abb. 4-26:
85
Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht infizierten
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
und TMEV-infizierten primären Astrozyten (Monokultur).
100,0
10,0
Ets-1
p53
Max
1,0
0,1
6
48
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Um
einen
direkten
Vergleich
der
Expression
von
TMEV
und
diesen
Transkriptionsfaktoren mit der Expression weiterer Gene zu erleichtern, werden die
Ergebnisse einer analogen Studie in entsprechender Weise an dieser Stelle
beschrieben (KUMNOK et al, 2008). 6 Stunden nach einer TMEV-Infektion wurden
keine statistisch signifikanten Veränderungen der Genexpression von MMP-2, MMP3, MMP-9 und MMP-12 in TMEV- gegenüber nicht infizierten Astrozyten festgestellt.
Während die Genexpression von MMP-2 im gesamten Verlauf dieser Studie keine
statistisch signifikanten Veränderungen aufwies, zeigte sich eine mittel- bis
hochgradige Aufregulierung der Genexpression von MMP-3 zu den Zeitpunkten 48,
72 und 240, von MMP-9 zu den Zeitpunkten 48 und 72 und von MMP-12 zu den
86
Ergebnisse
Zeitpunkten 72 und 240 Stunden nach der Infektion. Als Maß für die Größe der
beschriebenenen Veränderungen wurde die relative Genexpression dieser MMPs mit
oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.3; Abb.
4.27).
Tab. 4.3:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
primären Astrozyten 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion
(Monokultur).
MMP-12
MMP-9
MMP-3
MMP-2
Gen
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
1,34
1,07
1,05
1,55
1,25
4,75
32,17
11,84
1,25
2,96
11,66
1,08
0,85
1,83
17,52
7,26
2,35
2,27
2,01
2,78
2,17
8,56
68,31
23,38
1,86
5,50
18,93
1,93
1,37
3,35
27,27
10,14
0,77
0,50
0,55
0,86
0,72
2,63
15,15
6,00
0,84
1,59
7,18
0,60
0,53
1,00
11,26
5,20
0,269
0,849
0,868
0,129
0,390
0,001
0,000
0,000
0,234
0,003
0,000
0,785
0,460
0,050
0,000
0,000
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Astrozyten / nicht infizierte
Astrozyten) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert (KUMNOK
et al., 2008).
Ergebnisse
Abb. 4.27:
87
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
nicht
infizierten
und
TMEV-infizierten
primären
Astrozyten
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
(Monokultur).
100,0
10,0
MMP-2
MMP-3
MMP-9
MMP-12
1,0
0,1
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
88
Ergebnisse
4.4.1.2 RT-qPCR der Mikroglia in der Monokultur
Entsprechend zu den untersuchten Astrozyten wurde sowohl in den nicht infizierten
als auch in den TMEV-infizierten Mikrogliazellen eine Genexpression von p50, p65,
c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max und TNF nachgewiesen. IFN-γ war ebenfalls nicht
nachweisbar. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Astrozyten wiesen p50 und
p53 über den gesamten Verlauf der Untersuchung keine statistisch signifikanten
Veränderungen der Genexpression auf. Bei p65 wurde nur eine geringgradige
statistisch signifikante Herunterregulierung 6 Stunden nach der Infektion und bei cjun eine geringgradige statistisch signifikante Aufregulierung 240 Stunden nach der
Infektion festgestellt. Des Weiteren wurde eine mittel- bzw. geringgradige statistisch
signifikante Aufregulierung von Max 6 bzw. 48 Stunden nach der Infektion
beobachtet. Im Verlauf der Untersuchung zeigte c-fos eine stetig zunehmende
gering- bis mittelgradige statistisch signifikante Aufregulierung der Genexpression.
Ets-1 wies nach einer geringgradigen statistisch signifikanten Herunterregulierung 6
Stunden nach der Infektion ebenfalls eine an den folgenden Zeitpunkten
zunehmende gering- bis mittelgradige statistisch signifikante Aufregulierung auf. Die
Genexpression von TNF war bei TMEV-infizierter im Vergleich zu nicht infizierter
Mikroglia 6 Stunden nach der Infektion nur geringgradig statistisch signifikant
aufreguliert und 48 Stunden nach der Infektion nicht statistisch signifikant verändert.
Jedoch wurde eine hochgradige statistisch signifikante Aufregulierung von TNF 240
Stunden nach der Infektion festgestellt. Als Maß für die Größe der beschriebenen
Veränderungen wurde die relative Genexpression mit oberem und unterem 95%Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.4; Abb. 4.28; Abb. 4.29).
Ergebnisse
Tab. 4.4:
89
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max
und TNF in primärer Mikroglia 6, 48 und 240 Stunden nach der
Infektion (Monokultur).
Gen
p50
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
Max
TNF
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
6
48
240
1,10
1,00
0,98
0,66
0,89
1,03
1,04
1,05
1,42
1,41
3,08
6,09
0,63
1,53
9,62
0,92
1,18
1,13
2,05
1,76
1,19
1,64
1,05
16,37
1,45
1,42
1,29
0,99
1,20
1,16
1,27
1,42
1,73
2,01
3,87
7,77
0,95
2,21
15,60
1,28
1,45
1,38
3,09
2,57
1,61
2,11
1,46
20,63
0,83
0,71
0,75
0,44
0,66
0,92
0,85
0,78
1,16
0,99
2,46
4,77
0,42
1,06
5,93
0,66
0,96
0,93
1,36
1,20
0,88
1,27
0,75
12,98
0,450
0,987
0,893
0,044
0,381
0,515
0,663
0,717
0,004
0,058
0,000
0,000
0,033
0,029
0,000
0,575
0,109
0,176
0,004
0,009
0,221
0,002
0,753
0,000
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia / nicht infizierte
Mikroglia) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
90
Ergebnisse
Abb. 4.28: Relative Genexpression von NF-κ
κB (p50/p65) und AP-1 (c-jun/c-fos)
in
nicht
infizierter
und
TMEV-infizierter
primärer
Mikroglia
(Monokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
100,0
10,0
p50
p65
c-jun
c-fos
1,0
0,1
6
48
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Signifikante
Ergebnisse
91
Abb. 4.29: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht infizierter
und TMEV-infizierter primärer Mikroglia (Monokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
100,0
10,0
Ets-1
p53
Max
1,0
0,1
6
48
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Signifikante
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Um
einen
direkten
Vergleich
der
Expression
von
TMEV
und
diesen
Transkriptionsfaktoren mit der Expression weiterer Gene zu erleichtern, werden die
Ergebnisse einer analogen Studie in entsprechender Weise an dieser Stelle
beschrieben (KUMNOK et al, 2008). 6 Stunden nach einer TMEV-Infektion wurden
keine statistisch signifikanten Veränderungen der Genexpression von MMP-2, MMP3 und MMP-12 in TMEV- gegenüber nicht infizierter Mikroglia festgestellt.
Demgegenüber war die Genexpression von MMP-9 an diesem Zeitpunkt
geringgradig statistisch signifikant herunterreguliert. MMP-3, MMP-9 und MMP-12
zeigten 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion eine gering- bis mittelgradige
statistisch signifikante Herunterregulierung der Genexpression. MMP-2 wies 48
92
Ergebnisse
Stunden nach der Infektion eine geringgradige statistisch signifikante Aufregulierung,
72 Stunden nach der Infektion keine statistisch signifikante Veränderung und 240
Stunden
nach
der
Infektion
eine
geringgradige
statistisch
signifikante
Herunterregulierung auf. Als Maß für die Größe der beschriebenenen Veränderungen
wurde die relative Genexpression dieser MMPs mit oberem und unterem 95%Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.5; Abb. 4.30).
Tab. 4.5:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
primärer Mikroglia 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion
(Monokultur).
MMP-12
MMP-9
MMP-3
MMP-2
Gen
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
1,53
1,48
1,30
0,70
0,93
0,20
0,38
0,36
0,50
0,31
0,33
0,55
1,05
0,51
0,76
0,20
2,55
2,00
1,72
0,93
1,56
0,40
0,64
0,67
0,64
0,43
0,45
0,72
1,41
0,61
0,95
0,26
0,91
1,10
0,99
0,53
0,56
0,10
0,23
0,19
0,39
0,23
0,24
0,43
0,77
0,42
0,60
0,16
0,096
0,016
0,059
0,019
0,773
0,000
0,002
0,004
0,000
0,000
0,000
0,000
0,752
0,000
0,023
0,000
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia / nicht infizierte
Mikroglia) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert (KUMNOK et
al., 2008).
Ergebnisse
Abb. 4.30:
93
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
nicht
infizierter
und
TMEV-infizierter
primärer
Mikroglia
(Monokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
100,0
10,0
MMP-2
MMP-3
MMP-9
MMP-12
1,0
0,1
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Signifikante
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
4.4.1.3 RT-qPCR der Astrozyten in der Kokultur
In der Kokultur wiesen c-jun und Max keine statistisch signifikanten Veränderungen
im Verlauf der Untersuchung auf. Dagegen war TNF in TMEV- im Vergleich zu nicht
infizierten Astrozyten an allen untersuchten Zeitpunkten statistisch signifikant
hochgradig aufreguliert. Bei den übrigen Genen wurde sowohl eine unveränderte als
auch eine statistisch signifikante auf- und herunterregulierte Genexpression
beobachtet. Als Maß für die Größe dieser Veränderungen wurde die relative
Genexpression dieser Gene mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und pWert berechnet (Tab. 4.6; Abb. 4.31; Abb. 4.32).
94
Ergebnisse
Tab. 4.6:
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max
und TNF in primären Astrozyten 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der
Infektion (Kokultur).
Gen
p50
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
Max
TNF
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
17,30
12,61
2,08
17,30
4,39
4,99
1,31
2,68
1,84
2,49
1,07
1,23
3,72
3,78
0,11
10,07
2,40
2,82
5,20
2,03
12,11
7,81
1,39
11,36
1,47
1,37
0,81
1,12
30,77
370,00
45,33
92,96
48,48
127,32
19,73
101,67
11,31
19,05
5,76
13,05
6,27
7,26
2,59
2,77
12,44
40,12
0,70
31,52
4,78
5,76
12,95
5,58
47,80
81,37
8,41
106,88
2,88
3,02
2,10
2,44
54,81
3736,66
952,34
1372,32
6,17
1,25
0,22
2,94
1,70
1,31
0,30
0,55
0,54
0,85
0,44
0,55
1,11
0,36
0,02
3,22
1,20
1,38
2,09
0,74
3,07
0,75
0,23
1,21
0,75
0,63
0,31
0,52
17,27
36,64
2,16
6,30
0,002
0,038
0,418
0,011
0,012
0,029
0,641
0,160
0,237
0,077
0,846
0,519
0,039
0,193
0,030
0,030
0,025
0,016
0,007
0,125
0,007
0,072
0,638
0,040
0,186
0,325
0,565
0,699
0,000
0,002
0,025
0,009
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Astrozyten / nicht infizierte
Astrozyten) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
Ergebnisse
95
Abb. 4.31: Relative Genexpression von NF-κ
κB (p50/p65) und AP-1 (c-jun/c-fos)
in nicht infizierten und TMEV-infizierten primären Astrozyten
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
(Kokultur).
1000,00
100,00
p50
p65
c-jun
c-fos
10,00
1,00
0,10
0,01
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
96
Ergebnisse
Abb. 4.32: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht infizierten
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
und TMEV-infizierten primären Astrozyten (Kokultur).
1000,00
100,00
Ets-1
p53
Max
10,00
1,00
0,10
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Zusätzlich wurde in der Kokultur die Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und
MMP-12 in nicht und TMEV-infizierten Astrozyten untersucht. 6 und 48 Stunden nach
der
Infektion
wurden
keine
statistisch
signifikanten
Veränderungen
der
Genexpression dieser MMPs festgestellt. Jedoch zeigten MMP-2 240 Stunden nach
der Infektion eine mittelgradige und MMP-3, MMP-9 und MMP-12 sowohl 72 als auch
240 Stunden nach der Infektion eine mittel- bis hochgradige statistisch signifikante
Aufregulierung. Als Maß für die Größe der beschriebenenen Veränderungen wurde
die relative Genexpression dieser MMPs mit oberem und unterem 95%Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.7; Abb. 4.33).
Ergebnisse
Tab. 4.7:
97
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
primären Astrozyten 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion
(Kokultur).
MMP-12
MMP-9
MMP-3
MMP-2
Gen
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
0,82
1,15
1,10
2,68
1,09
1,57
5,77
5,68
0,80
1,09
14,66
26,18
1,58
1,33
4,47
17,03
1,22
1,61
2,48
2,87
1,54
2,53
11,24
11,62
1,83
2,62
31,58
71,66
3,36
2,70
8,70
41,91
0,55
0,82
0,48
2,51
0,77
0,97
2,96
2,78
0,35
0,45
6,81
9,57
0,74
0,66
2,29
6,92
0,239
0,320
0,771
0,000
0,535
0,059
0,002
0,003
0,505
0,801
0,001
0,001
0,171
0,322
0,003
0,001
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Astrozyten / nicht infizierte
Astrozyten) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
98
Ergebnisse
Abb. 4.33: Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
nicht
infizierten
und
TMEV-infizierten
primären
Astrozyten
Astrozyten (Infizierte/Kontrollen)
(Kokultur).
1000,00
100,00
MMP-2
MMP-3
MMP-9
MMP-12
10,00
1,00
0,10
0,01
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte
Astrozyten / nicht infizierte Astrozyten) mit seinem 95%-Konfidenzintervall.
Signifikante Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
4.4.1.4 RT-qPCR der Mikroglia in der Kokultur
In der Kokultur wiesen p65 und Ets-1 keine statistisch signifikanten Veränderungen
im Verlauf der Untersuchung auf. Bei den übrigen Genen wurde in TMEV- im
Vergleich zu nicht infizierter Mikroglia je nach Zeitpunkt eine unveränderte oder eine
statistisch signifikante auf- bzw. herunterregulierte Genexpression beobachtet. Als
Maß für die Größe dieser Veränderungen wurde die relative Genexpression dieser
Gene mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab.
4.8; Abb. 4.34; Abb. 4.35).
Ergebnisse
Tab. 4.8:
99
Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max
und TNF in primärer Mikroglia 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der
Infektion (Kokultur).
Gen
p50
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
Max
TNF
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
3,02
3,83
6,46
2,75
1,50
1,28
1,42
2,13
2,10
3,01
2,09
0,75
1,81
2,30
0,71
2,96
1,16
2,08
0,26
5,16
3,56
9,45
1,99
4,05
1,13
2,46
2,06
0,82
0,68
308,94
11,42
44,34
6,58
24,41
30,81
7,66
3,02
4,50
4,34
5,25
9,78
4,34
4,25
1,04
2,72
5,35
1,46
6,62
6,49
10,54
0,92
26,93
7,36
371,96
10,15
10,24
1,60
5,18
2,62
1,09
5,93
123898,50
152,39
152,88
1,38
0,60
1,36
0,99
0,75
0,37
0,46
0,86
0,45
2,09
1,03
0,54
1,20
0,99
0,35
1,32
0,21
0,41
0,07
0,99
1,72
0,24
0,39
1,60
0,80
1,17
1,61
0,62
0,08
0,77
0,86
12,86
0,017
0,114
0,029
0,052
0,240
0,610
0,474
0,082
0,250
0,001
0,044
0,073
0,016
0,052
0,260
0,020
0,818
0,278
0,095
0,105
0,008
0,165
0,306
0,014
0,374
0,028
0,001
0,121
0,645
0,057
0,059
0,001
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia / nicht infizierte
Mikroglia) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
100
Ergebnisse
TNF zeigte nur 240 Stunden nach der Infektion eine hochgradige und statistisch
signifikante Aufregulierung. Trotz einer stark erhöhten relativen Genexpression 48
und 72 Stunden nach der Infektion wurde aufgrund der starken Schwankung der
entsprechenden Werte das statistisch Signifikanzniveau von 0,05 an diesen
Zeitpunkten nicht ganz erreicht (p = 0,057 und p = 0,059).
Abb. 4.34: Relative Genexpression von NF-κ
κB (p50/p65) und AP-1 (c-jun/c-fos)
in
nicht
infizierter
und
TMEV-infizierter
primärer
Mikroglia
(Kokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
1000,00
100,00
p50
p65
c-jun
c-fos
10,00
1,00
0,10
0,01
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Signifikante
Ergebnisse
101
Abb. 4.35: Relative Genexpression von Ets-1, p53 und Max in nicht infizierter
und TMEV-infizierter primärer Mikroglia (Kokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
1000,00
100,00
10,00
Ets-1
p53
Max
1,00
0,10
0,01
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Signifikante
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
Außerdem wurde in der Kokultur die Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9
und MMP-12 in nicht und TMEV-infizierter Mikroglia untersucht. 6 Stunden nach der
Infektion wurden keine statistisch signifikanten Veränderungen der Genexpression
dieser MMPs festgestellt. Jedoch wiesen MMP-2 48 Stunden nach der Infektion eine
mittelgradige statistisch signifikante Aufregulierung und MMP-3 72 Stunden nach der
Infektion eine hochgradige statistisch signifikante Aufregulierung auf. MMP-9 war 48
Stunden nach der Infektion mittelgradig statistisch signifikant herunterreguliert, 72
Stunden nach der Infektion mittelgradig statistisch signifikant aufreguliert und 240
Stunden nach der Infektion geringgradig statistisch signifikant aufreguliert. Die
Genexpression von MMP-12 war 72 bzw. 240 Stunden nach der Infektion mittel- bzw.
hochgradig statistisch signifikant herunterreguliert. Als Maß für die Größe der
102
Ergebnisse
beschriebenenen Veränderungen wurde die relative Genexpression dieser MMPs mit
oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.9; Abb.
4.36).
Tab. 4.9:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
primärer Mikroglia 6, 48,72 und 240 Stunden nach der Infektion
(Kokultur).
MMP-12
MMP-9
MMP-3
MMP-2
Gen
Zeit
(hpi)
Quotient
(Infizierte /
Kontrolle)
oberes 95%
Konfidenzintervall
unteres 95%
Konfidenzintervall
p-Wert
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
6
48
72
240
1,28
3,55
1,84
0,52
2,01
1,73
23,56
1,25
0,95
0,35
2,04
1,52
1,12
1,04
0,37
0,02
2,34
8,98
3,72
1,41
6,39
24,43
115,58
7,82
1,62
0,62
3,48
2,19
1,66
1,27
0,55
0,03
0,70
1,40
0,91
0,19
0,63
0,12
4,80
0,20
0,56
0,20
1,19
1,05
0,76
0,85
0,25
0,01
0,321
0,019
0,074
0,143
0,170
0,596
0,005
0,754
0,813
0,007
0,021
0,035
0,457
0,611
0,018
0,000
Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia / nicht infizierte
Mikroglia) mit oberem und unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
Ergebnisse
103
Abb. 4.36:
Relative Genexpression von MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in
nicht infizierter und TMEV-infizierter primärer Mikroglia (Kokultur).
Mikroglia (Infizierte/Kontrollen)
1000,00
100,00
MMP-2
MMP-3
MMP-9
MMP-12
10,00
1,00
0,10
0,01
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Quotient der geometrischen Mittelwerte (TMEV-infizierte Mikroglia /
nicht
infizierte
Mikroglia)
mit
seinem
95%-Konfidenzintervall.
Signifikante
Unterschiede der zeitpunktbezogenen Gruppenvergleiche: * ≤ 0,05.
4.4.2 Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten
4.4.2.1 Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten in der Monokultur
Zur Untersuchung der TMEV RNS-Expression auf mögliche Korrelationen zu der
Genexpression von Transkriptionsfaktoren, TNF und MMPs wurden Rangorrelationskoeffizienten nach Spearman für Astrozyten und Mikroglia in der
Monokultur berechnet (Tab. 4.10 und Tab. 4.11).
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
0,073
Max
TNF
-0,674** -0,182 0,762** 0,584** 0,724** -0,252 -0,386*
0,246
0,133
0,422* 0,732**
Max
TNF
0,385*
.
-0,033
MMP-12 0,447** 0,547** -0,357* -0,325
-0,166
0,053
0,270
0,322
.
0,317*
-0,233 0,437**
0,143
0,376*
0,447**
0,322
0,053
0,065
-0,211
.
0,317*
0,351*
-0,233
0,270
-0,166
-0,033
-0,325
-0,357*
0,143
0,592** 0,671**
.
.
0,671**
0,413** 0,592**
0,546**
0,583** 0,437**
-0,533** -0,005
0,519**
0,288
-0,389*
-0,271
-0,513** -0,114
0,511** 0,662** 0,547**
0,748**
-0,005 0,583** 0,546** 0,413**
0,368*
0,368*
0,018
0,111
0,112
0,067
0,134
0,133
0,333
0,217
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
Spearmans-Rang-korrelationskoeffizienten (SR). Hellgrau: 0,5 ≤ SR < 0,8; dunkelgrau: 0,8 ≤ SR.
* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.
0,065
-0,211
0,018
0,376* 0,662** -0,114
0,111
MMP-9
0,112
.
0,194
0,217
0,067
.
0,194
0,748** 0,511** -0,513** -0,271 -0,389* 0,288 0,519** -0,533** 0,351*
0,134
0,220
-0,386* 0,515**
-0,252
0,724** 0,431**
MMP-3
0,231 0,431** 0,220 0,515**
0,004
0,246
0,231
MMP-2
0,333
-0,103
0,004
0,385*
0,657** 0,674** -0,150
.
-0,256
p53
.
-0,256
0,083
0,003
0,735** 0,598**
0,073
0,324
-0,335*
-0,103 0,584**
0,453**
0,598** 0,083
c-fos
.
-0,150 0,762**
0,324 0,674** -0,182 0,732**
0,773** 0,735** 0,003
-0,015
Ets-1
.
-0,015 0,773**
-0,184
-0,074
-0,447** -0,074
.
p65
0,644**
p50
p50
0,644** -0,447** -0,184 -0,335* 0,453** 0,657** -0,674** 0,422*
c-jun
.
TMEV
TMEV
Tab. 4.10: Korrelation der mRNS-Expression von TMEV, p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF,
MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in primären Astrozyten (Monokultur).
104
Ergebnisse
0,178
-0,309
0,141
.
-0,310
-0,377*
0,316
0,734** 0,484**
0,423*
-0,284
0,217
p50
p65
c-jun
c-fos
Ets-1
0,328
0,199
.
0,600**
0,038
0,141
0,423*
0,217
Ets-1
0,228
0,412*
0,227
-0,186
.
0,199
0,308
0,167
-0,183
0,500**
0,141
p53
0,018
-0,171
0,445**
.
0,451**
0,227
0,792**
-0,416*
-0,198
.
0,445**
0,041
0,412*
0,254
0,369*
-0,462**
0,140
.
-0,198
-0,173
-0,373*
0,228
-0,471**
0,005
0,291
-0,272
0,016
-0,034
MMP-3
-0,171
0,350*
0,361*
-0,677**
-0,059
.
0,140
.
0,670**
0,531**
-0,646** -0,648**
-0,403* -0,660**
0,016
-0,517** -0,364*
-0,187
-0,535** -0,485**
0,158
0,700**
-0,593** -0,681**
-0,513**
MMP-9 MMP-12
-0,059 -0,660** -0,648** 0,531** 0,670**
-0,403* -0,646**
-0,373* -0,173
0,041
0,451**
.
-0,186
0,328
0,164
0,647** 0,778**
0,454** 0,835**
0,035
0,256
0,155
MMP-2
Spearmans-Rang-korrelationskoeffizienten (SR). Hellgrau: 0,5 ≤ SR < 0,8; dunkelgrau: 0,8 ≤ SR.
* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.
-,364*
TNF
0,521** 0,472**
Max
-0,535** -0,187 -0,517** 0,016
0,158
0,350* -0,485** -0,677**
-0,171
-0,681** 0,361*
-0,513** -0,593** 0,700**
MMP-9
0,254
-0,471**
MMP-12
0,005
0,291
0,016
-0,272
0,778** -0,416* -0,462** 0,369*
0,164
0,835** 0,792**
0,454**
0,308
0,600**
.
0,217
-0,309
-0,034
0,018
0,035
0,167
0,038
0,217
.
0,178
MMP-2
-0,171
0,472** 0,647**
TNF
0,734**
c-fos
-0,377* 0,484**
0,316
c-jun
MMP-3
0,256
0,155
Max
-0,183
0,500**
0,141
0,521**
p53
.
-0,310
-0,284
0,108
.
0,108
TMEV
p65
p50
TMEV
Tab. 4.11 Korrelation der mRNS-Expression von TMEV, p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF,
MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in primärer Mikroglia (Monokultur).
Ergebnisse
105
106
Ergebnisse
Im folgenden Abschnitt werden die mittelmäßigen positiven und negativen
Korrelationen in den Astrozyten einzeln beschrieben. Starke Korrelationen lagen bei
den Astrozyten in der Monokultur nicht vor. Zwischen TMEV, p50, p53 und MMP-3
war eine positive Korrelation untereinander nachweisbar. Darüberhinaus wurde eine
positive Korrelation von p50 mit TNF, MMP-9 und MMP-12, von TNF mit MMP-9 und
und von p65, c-jun, c-fos und Max untereinander beobachtet. Eine negative
Korrelation wurde zwischen TMEV und Max festgestellt Außerdem waren p65 und
Max jeweils mit MMP-3 negativ korreliert. Weitere positive Korrelationen wurden
zwischen MMP-2 und MMP-9, zwischen MMP-3 und MMP-12 und zwischen MMP-9
und MMP-12 festgestellt.
In der Mikroglia wurde eine starke positive Korrelation zwischen c-fos und TNF
beobachtet. Die folgende Beschreibung geht ausschließlich auf die mittelmäßigen
Korrelationen in der monokultivierten Mikroglia ein. TMEV wies eine positive
Korrelation mit c-fos und Max, sowie eine negative Korrelation mit MMP-9 auf. Des
Weiteren zeigte p50 eine positive Korrelation mit p53, TNF und MMP-2 und eine
negative Korrelation mit MMP-9 und MMP-12. Eine positive Korrelation wurde
ebenfalls zwischen p65 und MMP-9, zwischen c-fos und Ets-1 und zwischen Ets-1
und TNF beobachtet. Außerdem waren c-fos und p53 jeweils mit MMP-9 und TNF
und Ets-1 jeweils mit MMP-12 negativ korreliert. Weitere positive Korrelationen
wurden wie bei den oben beschriebenen Astrozyten zwischen MMP-3 und MMP-12
und zwischen MMP-9 und MMP-12 festgestellt. MMP-2 war negativ mit MMP-9 und
MMP-12 korreliert.
4.4.2.2 Spearmans-Rangkorrelationskoeffizienten in der Kokultur
Zur Untersuchung der TMEV RNS-Expression auf mögliche Korrelationen zu der
Genexpression von Transkriptionsfaktoren, TNF und MMPs wurden Rangorrelationskoeffizienten nach Spearman für Astrozyten und Mikroglia in der Kokultur
berechnet (Tab. 4.12 und Tab. 4.13).
c-jun
c-fos
Ets-1
p53
Max
.
0,324
0,343 0,757** 0,751** 0,640**
0,659** 0,645** 0,688** 0,473*
Ets-1
0,332
0,472* 0,510**
.
0,463*
0,360
0,261
0,271
0,188
0,293
0,234
0,341
0,392*
0,234
0,341
.
0,393* 0,640**
.
Spearmans-Rang-korrelationskoeffizienten (SR). Hellgrau: 0,5 ≤ SR < 0,8; dunkelgrau: 0,8 ≤ SR.
* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.
0,515**
0,717**
0,578**
0,553**
0,385*
0,457*
0,588**
0,540**
.
.
0,551**
0,640** 0,568**
0,627** 0,393*
MMP-12 0,584** 0,675** 0,540** 0,588** 0,457* 0,385* 0,553** 0,578** 0,717** 0,515** 0,568** 0,551**
MMP-9
0,314
0,293
0,188
0,510** 0,605** 0,392*
MMP-3 0,570** 0,590** 0,562** 0,551** 0,537** 0,563** 0,314 0,520** 0,605** 0,627**
0,402* 0,471* 0,457* 0,386* 0,552** 0,347
0,876** 0,914** 0,872** 0,749** 0,554** 0,743** 0,483* 0,869**
TNF
0,332
.
0,563**
0,869** 0,472* 0,520**
0,524** 0,483*
.
0,314 0,557** 0,633** 0,627** 0,595** 0,244
0,702** 0,957** 0,922** 0,744** 0,753** 0,672** 0,524**
p53
0,347
0,244 0,672** 0,743**
Max
.
0,324 0,595** 0,753** 0,554** 0,552** 0,537**
0,640** 0,473* 0,627** 0,744** 0,749** 0,386* 0,551**
c-fos
.
0,271
0,261
0,810** 0,751** 0,688** 0,633** 0,922** 0,872** 0,457* 0,562**
.
0,675**
0,584**
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
0,360
0,674** 0,921**
MMP-2
TNF
0,921** 0,773** 0,757** 0,645** 0,557** 0,957** 0,914** 0,471* 0,590**
0,572** 0,773** 0,810**
.
p65
0,744**
p50
p65
0,744** 0,674** 0,572** 0,343 0,659** 0,314 0,702** 0,876** 0,402* 0,570** 0,463*
p50
c-jun
.
TMEV
TMEV
Tab. 4.12: Korrelation der mRNS-Expression von TMEV, p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF,
MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in primären Astrozyten (Kokultur). 0,01.
Ergebnisse
107
p53
-0,007
0,161
0,379
-0,011 0,452*
-0,016
0,036
0,020
0,034 -0,048
0,252
0,283
.
0,264
0,453*
0,089
0,104
0,010
TNF
0,116
0,263
0,285
.
0,548**
0,348
0,283
0,297
0,439*
0,135
0,528**
.
0,285
0,327
0,010
0,252
0,198
0,452*
-0,011
0,293
0,188
0,387*
.
0,528**
0,263
0,192
0,104
-0,048
0,034
0,379
-0,016
0,456*
0,368
.
0,387*
0,135
0,116
0,015
0,089
0,020
0,036
0,161
-0,007
0,231
0,004
Spearmans-Rang-korrelationskoeffizienten (SR). Hellgrau: 0,5 ≤ SR < 0,8; dunkelgrau: 0,8 ≤ SR.
* p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.
.
-0,289
-0,435*
-0,264
-0,557**
-0,265
-0,057
-0,018
-0,145
-0,053
-0,302
-0,498**
-0,459*
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
-0,265 -0,557** -0,264 -0,435* -0,289
0,015
0,192
0,327
0,348 0,548**
MMP-12 -0,459* -0,498** -0,302 -0,053 -0,145 -0,018 -0,057
0,231
0,004
MMP-9
0,198
0,293
0,456*
0,188
0,368
MMP-2
0,297
0,692** 0,655** 0,388* 0,439*
.
-0,162
TNF
.
0,515** 0,692** 0,616** 0,241 0,658** 0,453* 0,264
0,447*
0,183 0,618** 0,062 -0,162
0,061
0,447* 0,062 0,658**
Max
0,392*
.
0,061 0,618** 0,241
0,019
MMP-3
Max
0,275 0,392* 0,183 0,616** 0,388*
0,248
0,586** 0,488**
0,248
.
0,054
p53
0,091
Ets-1
Ets-1
0,275
0,447* 0,529**
c-fos
.
0,054
0,333
0,573**
c-fos
0,573** 0,566** 0,529** 0,091 0,488** 0,692** 0,655**
0,649** 0,566**
.
0,845**
p50
c-jun
0,333 0,649** 0,447* 0,019 0,586** 0,515** 0,692**
c-jun
0,845**
.
TMEV
p65
p65
p50
TMEV
Tab. 4.13 Korrelation der mRNS-Expression von TMEV, p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF,
MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in primärer Mikroglia (Kokultur).
108
Ergebnisse
Ergebnisse
109
Die Astrozyten zeigten in der Kokultur im Vergleich zur Monokultur häufiger und
auch deutlich stärkere Korrelationen zwischen der Expression von TMEV und den
gemessenen Genen. Des Weiteren lagen in den Astrozyten unter diesen
Bedingungen ausschließlich positive Korrelationen vor. So wurde eine starke
Korrelation zwischen TMEV und TNF und zwischen p65 und c-jun beobachtet.
Außerdem zeigten p50, p65, Max und TNF untereinander jeweils eine starke
Korrelation. TMEV wies eine mittelmäßige Korrelation mit p50, p65, Ets-1, Max,
MMP-3 und MMP-12 auf. TNF war mittelmäßig mit c-jun, c-fos, Ets-1, MMP-2, MMP3 und MMP-12, Ets-1 mittelmäßig mit p50, p65 und Max und c-fos mittelmäßig mit
MMP-2 korreliert. Ansonsten waren p50, p65, c-jun, c-fos, p53 und Max mittelmäßig
oder wie oben beschrieben stark miteinander korreliert. MMP-3 und MMP-12 waren
mit fast allen untersuchten Genen mittelmäßig korreliert. Ausnahmen stellten die
geringen Korrelationen von MMP-2 mit p53 und von MMP-12 mit c-fos und Ets-1 dar.
In der kokultivierten Mikroglia war TMEV stark mit p50 und mittelmäßig mit c-jun,
p53, Max, TNF positiv korreliert. Außerdem war p50 mit p65, c-jun, c-fos, Max und
TNF und Max mit p65, c-fos und TNF mittelmäßig positiv korreliert. Eine mittelmäßige
positive Korrelation lag ebenfalls zwischen c-jun und p53 und zwischen MMP-2 und
MMP-3 vor. Eine mittelmäßige negative Korrelation war zwischen TNF und MMP-12
nachweisbar.
4.4.3 Vergleich der Genexpression zwischen Astrozyten und Mikroglia
Die molekularbiologischen Untersuchungen zeigten den oben beschriebenen
Einfluss einer TMEV-Infektion auf die Genexpression von Transkriptionsfaktoren,
TNF und MMPs in Astrozyten und Mikroglia unter den Bedingungen einer Monooder Kokultur. Außerdem wurden Unterschiede zwischen nicht-infizierten Astrozyten
und nicht-infizierter Mikroglia in der Genexpression dieser Gene beobachtet. Als Maß
für die Größe einer unterschiedlichen Genexpression zwischen diesen Zellen wurde
die relative Genexpression dieser Gene mit oberem und unterem 95%Konfidenzintervall und p-Wert berechnet (Tab. 4.14).
110
Ergebnisse
Tab. 4.14: Relative Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max,
TNF, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12 in nicht infizierter
Monokultur (Mono) und Kokultur (Ko).
Quotient
Kultur (Astrozyten /
Mikroglia)
Mono
0,315
p50
Ko
0,286
Mono
3,241
p65
Ko
1,026
Mono
2,886
c-jun
Ko
0,903
0,741
Mono
c-fos
Ko
0,188
Mono
7,496
Ets-1
Ko
7,097
Mono
0,436
p53
Ko
0,583
Mono
6,745
Max
Ko
0,824
Mono
0,102
TNF
Ko
0,026
Mono
97,054
MMP-2
Ko
14,512
1,332
Mono
MMP-3
Ko
16,550
Mono
0,003
MMP-9
Ko
0,009
Mono
0,002
MMP-12
Ko
0,001
Gen
oberes 95%
Konfidenzintervall
0,222
0,166
2,789
0,669
2,401
0,590
0,485
0,084
4,477
4,594
0,342
0,460
5,441
0,369
0,059
0,007
70,014
8,645
0,659
9,175
0,001
0,006
0,001
0,001
unteres 95%
Konfidenzintervall
0,446
0,494
3,767
1,573
3,470
1,384
1,134
0,417
12,551
10,962
0,556
0,738
8,361
1,841
0,177
0,092
134,536
24,360
2,691
29,855
0,006
0,013
0,004
0,001
p-Wert
0,000
0,000
0,000
0,903
0,000
0,629
0,162
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,626
0,000
0,000
0,000
0,000
0,413
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
Quotient der geometrischen Mittelwerte (Astrozyten / Mikroglia) mit oberem und
unterem 95%-Konfidenzintervall und p-Wert.
Ergebnisse
111
Dieser Quotient zeigte statistisch signifikante Unterschiede in der Genexpression
zwischen Astrozyten und Mikroglia, die unabhängig von den Kulturbedingungen
waren. Während Astrozyten im Vergleich zur Mikroglia eine stärkere Genexpression
von Ets-1 und MMP-2 aufwiesen, wurde eine schwächere Genexpression von p50,
p53, TNF, MMP-9 und MMP-12 in Astrozyten gegenüber Mikroglia beobachtet (Abb.
4.37).
Abb. 4.37: Vergleich der Genexpression zwischen Astrozyten und Mikroglia
Astrozyt
Mikroglia
MMP-2
MMP-9 MMP-12
Ets-1
p50 p53 TNF
p65 c-jun c-fos Max MMP-3
p65 c-jun c-fos Max MMP-3
p50 p53 TNF
Ets-1
MMP-9 MMP-12
MMP-2
Die Schriftgröße stellt die relativen Unterschiede zwischen Astrozyten und Mikroglia
in der Genexpression von Ets-1, p50, p65, p53, c-jun, c-fos, Max, TNF, MMP-2,
MMP-3, MMP-9 und MMP-12 dar, die sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur
beobachtet wurden.
Außerdem zeigte sich in der Monokultur in Astrozyten im Vergleich zur Mikroglia eine
stärkere Genexpression von p65, c-jun und Max. In der Kokultur wurde kein
Unterschied
zwischen
Astrozyten
und
Mikroglia
nachgewiesen,
da
die
Genexpression dieser drei Gene in den Astrozyten gegenüber der Mikroglia
überproportional abnahm. Eine überproportionale Abnahme der Genexpression von
c-fos in Astrozyten gegenüber Mikroglia in der Kokultur im Vergleich zur Monokultur,
führte auch zu einer schwächeren Genexpression von c-fos in Astrozyten in der
Kokultur. Im Gegensatz dazu zeigten die Astrozyten in der Kokultur im Vergleich zur
Monokultur einen leichten Anstieg und die Mikroglia eine starke Abnahme der
Genexpression von MMP-3, so dass in der Kokultur Astrozyten gegenüber Mikroglia
112
Ergebnisse
eine stärkere Genexpression dieses Gens aufwiesen. In der Monokultur wurde kein
statistisch signifikanter Unterschied in der Genexpression von MMP-3 zwischen
diesen Zellen beobachtet.
4.4.4 RT-qPCR der mit siRNS behandelten Astrozyten
Die primären Astrozyten wurden in 24-Loch-Platten in einer Konzentration von
50.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. 24 Stunden nach der Aussaat erfolgte die
Infektion der Zellen mit TMEV (MOI = 10,0) oder UV-Licht inaktiviertem TMEV nach
dem unter 3.3.5 beschriebenen Protokoll. Nicht-infizierte primäre Astrozyten dienten
zur Kontrolle. 24 Stunden nach der TMEV-Infektion wurden die TMEV-infizierten
Zellen mit für p50 bzw. c-jun spezifischer siRNS oder unspezifischer NegativkontrollsiRNS nach dem unter 3.4.9 beschriebenen Protokoll transfiziert. Zur Überprüfung
eines spezifischen Effekts der eingesetzten siRNS wurden weiterhin TMEV-infizierte
Astrozyten mit einer Transfektionslösung aus Transfektionsreagenz in Sato’s Medium
oder nur mit Sato’s Medium behandelt. Weitere 24 Stunden später wurden die Zellen
nach dem unter 3.4.1 beschriebenen Protokoll lysiert. Die mit der RT-qPCR
ermittelten Kopienzahlen von p50, c-jun und TNF wurden mit den Kopienzahlen von
GAPDH der entsprechenden Proben normalisiert. Dieses Experiment wurde im
vierfachen Ansatz durchgeführt (4 Vertiefungen pro Gruppe).
Die Genexpression von p50 stieg in den TMEV-infizierten und nicht mit für p50
spezifischer siRNS behandelten Zellen um durchschnittlich 72,83 % gegenüber den
nicht infizierten Zellen an (p < 0,01). In mit UV-Licht inaktiviertem TMEV infizierten
Zellen wurde ein Anstieg von 49,60 % gegenüber nicht infizierten Zellen
nachgewiesen (p = 0,029). Zwischen den TMEV-infizierten und den mit UV-Licht
inaktiviertem TMEV-infizierten nicht mit für p50 spezifischer siRNS behandelten
Zellen lag kein statistisch signifikanter Unterschied in der Genexpression von p50
vor. Die beiden mit für p50 spezifischer siRNS behandelten und TMEV-infizierten
Zellen wiesen eine Reduktion der Genexpression von p50 auf durchschnittlich 34,57
% gegenüber den nicht mit für p50 spezifischer siRNS behandelten und TMEVinfizierten Zellen auf (p < 0,01; Abb. 4.38).
Ergebnisse
113
Abb. 4.38: Normalisierte Genexpression von p50 in nicht und TMEV-infizierten
Astrozyten (24 Stunden nach der Transfektion mit siRNS, 48
Stunden nach der Infektion mit TMEV).
p50 (Kopien / Kopie GAPDH)
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Gruppe
Dargestellt sind die Werte in % GAPDH. Die Gruppen 1-7 wurden mit TMEV, Gruppe
8 mit UV-Licht inaktiviertem-TMEV und Gruppe 9 nicht infiziert. Die Gruppen 1 und 2
wurden mit 2 unterschiedlichen siRNS für p50, die Gruppen 3 und 4 mit mit 2
unterschiedlichen siRNS für c-jun, Gruppe 5 mit einer Negativkontroll-siRNS, Gruppe
6 nur mit Transfektionsreagenz und die Gruppen 7-9 nicht transfiziert.
114
Ergebnisse
Im Gegensatz zu dem oben beschriebenen Anstieg der Genexpression von p50 in
TMEV-infizierten Zellen gegenüber nicht infizierten Zellen wurden keine Unterschiede
in diesen Zellen in der Genexpression von c-jun durch eine TMEV-Infektion
festgestellt. Des Weiteren erbrachte die Behandlung von TMEV-infizierten primären
Astrozyten mit für c-jun spezifischer siRNS keine statistisch signifikante Reduktion
der Genexpression von c-jun gegenüber den Kontrollen (Abb. 4.39).
Abb. 4.39:
Normalisierte Genexpression von c-jun in nicht und
TMEV-infizierten Astrozyten (24 Stunden nach der Transfektion mit
siRNS, 48 Stunden nach der Infektion mit TMEV).
c-jun (Kopien / Kopie GAPDH)
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Gruppe
Dargestellt sind die Werte in % GAPDH. Die Gruppen 1-7 wurden mit TMEV, Gruppe
8 mit UV-Licht inaktiviertem TMEV und Gruppe 9 nicht infiziert. Die Gruppen 1 und 2
wurden mit 2 unterschiedlichen siRNS für p50, die Gruppen 3 und 4 mit mit 2
unterschiedlichen siRNS für c-jun, Gruppe 5 mit einer Negativkontroll-siRNS, Gruppe
6 nur mit Transfektionsreagenz und die Gruppen 7-9 nicht transfiziert.
Ergebnisse
115
Die Genexpression von TNF wies einen Anstieg um den Faktor 33,47 in den TMEVinfizierten Zellen gegenüber den nicht infizierten Zellen auf (p < 0,01). Außerdem
stieg die Genexpression von TNF in den mit UV-Licht inaktiviertem TMEV-infizierten
Zellen gegenüber den nicht infizierten Zellen um den Faktor 8,62 an (p < 0,01). Es
wurden jedoch keine statistisch signifikaten Unterschiede zwischen den einzelnen
TMEV-infizierten Gruppen festgestellt. Somit war kein Einfluss der siRNSBehandlung auf die Genexpression von TNF nachweisbar (Abb. 4.40).
Abb. 4.40: Normalisierte Genexpression von TNF in nicht und TMEV-infizierten
Astrozyten (24 Stunden nach der Transfektion mit siRNS, 48
Stunden nach der Infektion mit TMEV).
TNF (Kopien / Kopie GAPDH)
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Gruppe
Dargestellt sind die Werte in % GAPDH. Die Gruppen 1-7 wurden mit TMEV, Gruppe
8 mit UV-Licht inaktiviertem TMEV und Gruppe 9 nicht infiziert. Die Gruppen 1 und 2
wurden mit 2 unterschiedlichen siRNS für p50, die Gruppen 3 und 4 mit mit 2
unterschiedlichen siRNS für c-jun, Gruppe 5 mit einer Negativkontroll-siRNS, Gruppe
6 nur mit Transfektionsreagenz und die Gruppen 7-9 nicht transfiziert.
116
Ergebnisse
4.4.5 Quantifizierung von TMEV-Minus-Strang-RNS in Mikroglia
Die Menge an TMEV-Minus-Strang-RNS in TMEV-infizierter Mikroglia wurde mittels
einer selektiven reversen Transkription und anschließender RT-qPCR an vier
Zeitpunkten, 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der Infektion, im sechsfachen Ansatz
quantifiziert. Hierfür wurde die aus der TMEV-infizierten Mikroglia isolierte RNS mit
einem für TMEV spezifischen Sense-Primer (interne Bezeichnung: p149) in cDNS
umgeschrieben. Außerdem wurde die Gesamtmenge an TMEV-RNS in der TMEVinfizierten Mikroglia im sechs-fachen Ansatz und die Menge an TMEV-RNS im
Zellkulturüberstand im Doppelansatz bestimmt, in dem die RNS mit “Random
Hexamers“ in cDNS umgeschrieben wurde. Die Menge an infektiösem Virus im
Zellkulturüberstand wurde mit Hilfe eines Plaquetests im Doppelansatz ermittelt. Eine
statistische Analyse der beiden Versuche im Doppelansatz (Menge an TMEV-RNS
und infektiösem Virus im Zellkulturüberstand) wurde aufgrund der geringen
Gruppengröße mit nur 2 Werten pro Gruppe nicht durchgeführt.
Die Gesamtmenge an TMEV-RNS in der TMEV-infizierten Mikroglia fiel im Verlauf
der Untersuchung stetig von im Median 3391 Kopien zum Zeitpunkt 6 h.p.i. über
1354 Kopien 48 h.p.i. und 71 Kopien 72 h.p.i. auf letztlich 1 Kopie 240 h.p.i.
Gleichzeitig wurde ein Abfall an TMEV-Minus-Strang-RNS von 58 Kopien 6 h.p.i.
über 16 Kopien 48 h.p.i. und 4 Kopien 72 h.p.i. auf 0 Kopien zum Zeitpunkt 240 h.p.i.
gemessen. Im Vergleich zur Gesamtmenge an TMEV-RNS wurde 6 h.p.i. ca. 59-fach
(p = 0,028), 48 h.p.i ca. 86-fach (p = 0,028) und 72 h.p.i. ca. 18-fach (p = 0,028)
weniger Transkripte an TMEV-Minus-Strang-RNS festgestellt. 240 h.p.i. lagen 7-fach
weniger Transkripte an TMEV-Minus-Strang-RNS gegenüber der Gesamtmenge an
TMEV-RNS vor. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant (p =
0,463; Abb. 4.41).
Die Menge an TMEV-RNS im Zellkulturüberstand fiel ebenfalls von 199 Kopien 6
h.p.i. über 30 Kopien 48 h.p.i. bis auf 3 Kopien zum Zeitpunkt 72 h.p.i. Am Ende der
Untersuchung, 240 h.p.i., wurde jedoch ein Anstieg auf 69 Kopien beobachtet (Abb.
4.41).
Ergebnisse
117
Der Plaquetest zeigte an den ersten drei untersuchten Zeitpunkten nur geringe
Mengen an infektiösem Virus mit 0 PFU/ml (6 h.p.i.), 2,3 × 103 PFU/ml (48 h.p.i.) und
8,5 × 102 PFU/ml (72 h.p.i.). Allerdings wurde entsprechend den oben beschriebenen
Ergebnissen der RT-qPCR zum Zeitpunkt 240 h.p.i. ein Anstieg des infektiösen Virus
auf 4,1 × 104 PFU/ml festgestellt (Abb. 4.41).
Abb. 4.41: Normalisierte TMEV-RNS-Expression in Mikroglia 6, 48, 72 und 240
Stunden nach der Infektion mit TMEV.
1.000.000
100.000
1.000,0
10.000
100,0
1.000
10,0
PFU/ml
TMEV (Kopien / 10ng RNA)
10.000,0
100
1,0
10
0,1
1
6
48
72
240
Stunden nach der Infektion
Dargestellt ist der Median mit Maximum und Minimum der gesamten Menge an
TMEV-RNS in der Mikroglia (
), der Menge an TMEV-Minus-Strang-RNS (
der Menge an TMEV-RNS im Zellkulturüberstand (
) und
). Die zweite Y-Achse zeigt die
im Plaquetest ermittelte Menge an infektiösem Virus ( ). * p =0,028.
118
Ergebnisse
Diskussion
5
119
Diskussion
Die Demyelinisierungsprozesse bei der TME stellen ein wichtiges Modell der
chronisch-progressiven Form der MS dar (DRESCHER u. SOSNOWSKA, 2008; KIM
et al., 2005; STOHLMAN u. HINTON, 2001). Hierbei spielt die Viruspersistenz eine
entscheidende Rolle für die Entwicklung der zuerst gegen das Virus und später
gegen Myelinepitope gerichteten Typ IV-Hypersensitivitätsreaktion (DAL CANTO et
al., 2000). Die Zerstörung der Myelinscheide beruht letztendlich auf einer CD4+ und
CD8+ T-Zell vermittelten Entzündungsreaktion (JOHNSON et al., 2001; KATZ-LEVY
et al., 2000; MILLER et al., 2001; TOMPKINS et al. 2002). In resistenten C57BL/6Mäusen wird die Viruspersistenz durch eine starke Immunantwort, die zur Elimination
des Virus aus dem ZNS führt, verhindert (GERHAUSER et al., 2007b; WELSH et al.,
2004). Dagegen kommt es in empfänglichen SJL/J-Mäusen zur persistenten Infektion
von Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia/Makrophagen und einer axonalen
Verbreitung des Erregers (LIPTON et al., 1995; LIPTON et al., 2005; RODRIGUEZ et
al., 1997; TSUNODA et al., 2007; ZHENG et al., 2001). Astrozyten sind an der
Homöostase des ZNS, der synaptischen Plastizität, der Aufrechterhaltung der BlutHirn-Schranke und der Sekretion von zahlreichen Zytokinen wie Interleukin-1, -6, -12,
TNF und MCP-1 beteiligt, die im Zusammenhang mit dem Demyelinisierungsprozess
stehen (CHANG et al., 2000; DONG u. BENVENISTE, 2001; GRÖNE et al., 2000;
PALMA et al., 2003; TROTTIER et al., 2004). Aktivierte Mikroglia/Makrophagen
tragen unter anderem durch die Freisetzung verschiedener Sauerstoff- und
Stickstoffradikale und MMPs zur Demyelinisierung bei (ULRICH et al., 2006).
Diese Studie untersuchte nun den Einfluss einer TMEV-Infektion auf die
Transkription mehrerer Zytokine, MMPs und hierfür benötigter Transkriptionsfaktoren
in infizierten Astrozyten und Mikroglia. Eine Kokultur diente zur Detektion potentieller
Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen. Neben den Veränderungen in der
Genexpression hat sich eine Hemmung der Proliferation der TMEV-infizierten Zellen
gezeigt. Des Weiteren wurde eine deutliche größere Virussynthese in Astrozyten
gegenüber Mikroglia festgestellt.
120
Diskussion
5.1 Geringe Replikation des Theilervirus in Mikoglia
Zahlreiche in vivo und in vitro Studien haben nachgewiesen, dass die
schwachvirulenten TMEV-Stämme neben Neuronen überwiegend gliale Zellen wie
Astrozyten, Makrophagen, Mikroglia und Oligodendrozyten infizieren (LIPTON et al.,
2005; QI u. DAL CANTO, 1996; ZHENG et al., 2001). Dennoch enthielten diese
Studien widersprüchliche Ergebnisse bezüglich des zellulären Tropismus von TMEV,
die
sich
unter
anderem
auf
die
unterschiedlichen
Virusstämmen
und
Detektionsmethoden zurückführen lassen. In BeAn-infizierten SJL/J-Mäusen wurde
TMEV-Antigen überwiegend in Makrophagen und in einem geringeren Ausmaß in
Oligodendrozyten und Astrozyten beobachtet (DAL CANTO u. LIPTON, 1982;
LIPTON et al., 1995). Im Gegensatz dazu wurde virale RNS in DA-infizierten SJL/JMäusen häufiger in Oligodendrozyten und Astrozyten als in Mikroglia/Makrophagen
gefunden (AUBERT et al., 1987). ZOECKLEIN et al. (2003) zeigten 100-fach größere
Mengen an viraler RNS und 4-fach größere Mengen an TMEV-Antigen-positiven
Zellen in DA- gegenüber BeAn-infizierten Mäusen. Des Weiteren zeigten OLESZAK
et al. (2004) einen Unterschied in der Empfänglichkeit zwischen Mikroglia und
einwandernder aktivierter Makrophagen, die den Hauptteil des intraläsionalen Virus
zu beherbergen scheinen. Eine weitere in vitro Studie wies ebenfalls nach, dass
TMEV vorzugsweise aktivierte Makrophagen infiziert (JELACHICH et al., 1999). Die
unterschiedlichen Ergebnisse der genannten Studien haben außerdem eine Debatte
ausgelöst, welche Zelle hauptverantwortlich für die Virusreplikation ist.
In dieser Studie wurden drei unterschiedliche Methoden zur Detektion von TMEV
benutzt. Obwohl bereits 6 h.p.i mittels RT-qPCR und Immunfluoreszenz reichlich
TMEV-RNS und -Antigen nachgewiesen wurde, zeigte der Plaquetest zu diesem
Zeitpunkt nur wenig infektiöses Virus. Dieser Widerspruch lässt sich durch die
Zeitdauer des viralen Replikationszykluses erklären, der bei Picornaviren zwischen 5
bis 10 h dauert (RACANIELLO, 2001). Alle drei Methoden stellten jedoch eine
deutliche größere Menge an Virus in Astrozyten gegenüber Mikroglia fest. Mikroglia
wies eine ca. 1000-fach kleinere Menge an Kopien auf, TMEV-Protein war in diesen
Zellen vermutlich aufgrund der Unterschreitung der Nachweisgrenze überhaupt nicht
nachweisbar und zum Zeitpunkt 48 h.p.i wurde eine über 100-fach kleinere Menge
Diskussion
121
an infektiösem Virus beobachtet. Der Anstieg der PFU/ml zum Zeitpunkt 240 h.p.i. in
der Mikroglia geht vermutlich auf die Freisetzung von infektiösen Viren aus
untergehenden
Zellen
zurück.
Zwischen Mono- und
Kokultur wurden
nur
unbedeutende Unterschiede festgestellt. Die ca. 300-fach größere Menge an viraler
RNS in kokultivierter im Vergleich zu monokultivierter Mikroglia lässt sich durch die
ständige Produktion infektiöser Viren in den Astrozyten erklären, die anschließend
zur Infektion der sich im gleichen Zellkulturmedium befindenen Mikroglia beitragen.
Der erhöhte Infektionsdruck der Mikroglia in der Kokultur könnte ebenso für das
gegenüber der Monokultur unterschiedliche Expressionsmuster der untersuchten
Gene verantwortlich sein.
Inwieweit eine aktive Virusreplikation in der Mikroglia stattfindet bzw. ob das
nachgewiesene Virus lediglich phagozytiert wurde, konnte mit den oben genannten
Methoden nicht beantwortet werden. Aus diesem Grund wurde der genaue Anteil an
replizierter TMEV-RNS an der Gesamtmenge viraler RNS mittels spezifischer
reverser Transkription der Minus-Strang-RNS von TMEV bestimmt. TMEV besitzt als
Picornavirus eine einzelsträngige Plus-Strang-RNS in seinem unbehüllten Kapsid.
Dabei zeigte sich eine ungefähr 40-fach kleinere Menge an replizierter TMEV-RNS
im Vergleich zur Gesamtmenge, so dass von einer extrem eingeschränkten
Virusreplikation in der Mikroglia ausgegangen werden muss. Dieses Ergebnis sollte
jedoch in weiteren Untersuchungen überprüft werden, da es von der Annahme einer
vergleichbaren Effizienz der reversen Transkription von “Random Primern“ und für
TMEV spezifischen Sense-Primern ausgeht. Hierfür müssten mehrere RNSStandards für die zu unterscheidenen RNS-Stränge hergestellt und mit der zu
untersuchenden TMEV-RNS gleichzeitig spezifisch umgeschrieben werden. Dennoch
bestätigen die Ergebnis dieser Studie die These von ZHENG et al. (2001), dass sich
TMEV überwiegend in Astrozyten repliziert. Aufgrund der geringen Halbwertszeit von
TMEV, weniger als 1 Tag, wird eine kontinuierliche Virusreplikation benötigt, um die
hohe Menge viraler Kopien im Verlauf der TMEV-Infektion in vivo aufrechtzuerhalten.
Die beträchtliche Produktion des infektiösen Virus trägt zu der ständigen Infektion
von unter anderem Oligodendrozyten bei, in denen die TMEV-Infektion im Gegensatz
122
Diskussion
zu den anderen glialen Zellen zu einer starken Zelllyse führt (LIPTON et al., 2005; QI
u. DAL CANTO,1996).
5.2 Proliferationshemmung und Apoptose/Nekrose durch TMEV in Astrozyten
Die Immunfluoreszenz zeigte, dass der Prozentsatz TMEV-positiver Zellen in der
Mono- und Kokultur bei den Astrozyten weniger als 30% und bei der Mikroglia 0%
betrug. Dennoch wurde eine starke Auswirkung der TMEV-Infektion auf die Zunahme
der Zellzahl im Verlauf der Untersuchung festgestellt. So wurde zum Zeitpunkt 240
h.p.i. sowohl bei den Astrozyten als auch bei der Mikroglia ein starker Rückgang der
Zellzahl der TMEV-infizierten gegenüber den nicht infizierten Zellen beobachtet. Zur
Abklärung in welchem Ausmaß eine gesteigerte Apoptose und/oder eine verminderte
Proliferationsrate der Zellen zur Abnahme der Zellzahl beitrugen, wurden weitere
Untersuchungen durchgeführt. Der BrdU-Test zeigte deutlich die Abnahme der
Proliferationsrate der Astrozyten durch die TMEV-Infektion. Des Weiteren waren
BrdU-positive
also
proliferierende
Zellen
überwiegend
negativ
für
TMEV.
Möglicherweise tragen aus den TMEV-infizierten Zellen freigesetzte parakrin
wirkende Botenstoffe wie z.B. Zytokine zu der Proliferationshemmung der
angrenzenden nicht infizierten Astrozyten bei. Eine konkrete Zunahme der Apoptose
war aufgrund der starken Streuung innerhalb der Werte der TMEV-infizierten
Astrozyten nicht nachweisbar. Jedoch deuten der häufige Nachweis von TMEVAntigen in den “cleaved“ Caspase-3-positiven Zellen auf eine direkt virus-vermittelte
Apoptose der infizierten Zellen hin. Diese Ergebnisse entsprechen vorherigen
Untersuchungen über den Verlauf der kaninen Staupevirusinfektion, bei denen in den
chronischen Läsionen eine starke Reduktion der Astrozytenzahl nachgewiesen
wurde. Dieser Rückgang der intraläsionalen Astrozyten geht vermutlich auf die
zytolytische Infektion mit dem Staupevirus zurück, welches sich ähnlich den
Verhältnissen bei der TME vor allem in den Astrozyten repliziert (ALLDINGER et al.,
1993b; MUTINELLI et al., 1989).
Interessanterweise wies die nicht infizierte Mikroglia in der Kokultur gegenüber der
Monokultur nur einen geringen Anstieg der Zellzahl auf. Dieses deutet auf einen
ebenfalls parakrinen Einfluss der Astrozyten auf die Proliferationsrate der Mikroglia
Diskussion
123
hin, der in weiteren Untersuchungen abgeklärt werden müsste (JONES et al., 1998).
Neuere Studien haben die Signalwege untersucht, die in TMEV-infizierten Zellen
aktiviert werden und Einfluss auf die Proliferationsrate und andere Reaktionen der
Zelle haben können. Die Ergebnisse dieser Studie bezüglich der Genexpression
verschiedener Transkriptionsfaktoren, MMPs und Zytokine werden in den folgenden
Abschnitten näher erläutert.
5.3 Unterschiede zwischen nicht infizierten Astrozyten und Mikroglia in der
basalen Genexpression von Transkriptionsfaktoren, MMPs und Zytokinen
Astrozyten
und
Mikroglia
zeigten
deutliche
Unterschiede
in
der
basalen
Genexpression der untersuchten Transkriptionsfaktoren, MMPs und Zytokine.
Sowohl in der Monokultur als auch in der Kokultur wurde die mRNS von Ets-1 ca. 7fach und von MMP-2 über 14-fach stärker in Astrozyten als in Mikroglia exprimiert.
Die starke astrozytäre Expression von Ets-1 entspricht den Beobachtungen
vorheriger in vivo Studien in der Maus (GERHAUSER et al., 2007b). Dieser
Transkriptionsfaktor ist insbesondere an der Ausbildung zentralnervöser Strukturen,
der Angiogenese und der Differenzierung von Astrozyten beteiligt (FLEISCHMAN et
al., 1995; GERHAUSER et al., 2005; KOLA et al., 1993; MAROULAKOU u. BOWE,
2000; WERNERT et al., 1992). Eine im Vergleich zu Mikroglia starke Expression von
MMP-2 wurde auch schon in Astrozyten beschrieben, die aus neuralen Stammzellen
durch Differenzierung gewonnen worden (CROCKER et al. 2008). MMP-2 stellt ein
Schlüsselenzym für die Migration von Astrozyten dar, dessen proteolytisches Signal
über β1-Integrine an das Aktin-Zytoskelett vermittelt wird (OGIER et al., 2006).
TNF, p50 und p53 wiesen eine ungefähr 10-fach, dreifach bzw. zweifach. stärkere
Genexpression in Mikroglia gegenüber Astrozyten auf, wodurch die herausragende
Rolle der Mikroglia in der primären Immunantwort des ZNS unterstrichen wird.
LAFORTUNE et al. (1996) zeigten gleichartige in vitro Ergebnisse für die Expression
von TNF in adulten humanen Zellen. Dagegen wurde in unstimulierten neonatalen
humanen Zellen eine leicht stärkere Expression von TNF in Astrozyten im Vergleich
zu Mikroglia beobachtet. Allerdings konnte die Expression von TNF in diesen Zellen
deutlich stärker in Mikroglia als in Astrozyten stimuliert werden (LEE et al., 1993).
124
Diskussion
MMP-9 und MMP-12 wurden in dieser Studie sogar über 100-fach stärker in
Mikroglia als in Astrozyten gebildet. Somit können die Ergebnisse bisheriger Studien
bestätigt werden, die die Expression verschiedener MMPs untersucht und teilweise
zwischen Astroyzten und Mikroglia verglichen haben. OGIER et al. (2006) wiesen
bereits die extrem schwache Expression von MMP-9 in Astrozyten nach. Das
Überwiegen der MMP-9 und MMP-12-Expression in Mikroglia gegenüber aus
neuralen Stammzellen differenzierten Astrozyten wurde von CROCKER et al. (2008)
gezeigt. Interessanterweise wird MMP-12 auch als Makrophagen-Metalloelastase
bezeichnet
und
wurde
erstmalig
aus
dem
Zellkulturüberstand
muriner
Peritonealmakrophagen isoliert (BANDA u. WERB, 1981).
Im Gegensatz zu den oben genannten Genen (Ets-1, p50, p53, TNF, MMP-2, MMP9, MMP-12) hatten die Kulturbedingungen einen bedeutenden Einfluss auf das
relative Verhältnis der Genexpression von Max, p65, c-jun, c-fos und MMP-3
zwischen den untersuchten Zellen. Kokultivierte Zellen wiesen meist eine deutliche
Abnahme der absoluten Genexpression dieser Gene auf. Außerdem war dieser
Einfluss fast immer stärker in den Astrozyten als in der Mikroglia ausgeprägt. Eine
Ausnahme hierzu stellte der leichte Anstieg bzw. der starke Abfall der MMP-3Genexpression in den kokultivierten Astrozyten und Mikrogliazellen gegenüber den
Zellen in der Monokultur dar. Diese gegenseitige Beeinflussung der untersuchten
Zellen unterstreicht die Vielschichtigkeit der untersuchten Signalwege und die
Schwierigkeiten, die bei der Übertragung von Ergebnissen aus vereinfachten
Modellen auf einen komplexen Organismus auftreten.
5.4 Beeinflussung der Genexpression von Transkriptionsfaktoren, Zytokinen
und MMPs durch die TMEV-Infektion
Die
im
Rahmen
dieser
Studie
durchgeführten,
molekularbiologischen
Untersuchungen wiesen den starken Einfluss einer TMEV-Infektion auf die
Genexpression von Transkriptionsfaktoren, MMPs und Zytokinen nach. Außerdem
können bereits geringe Veränderungen in der Genexpression einen großen Einfluss
auf das fein abgestimmte Verhältnis der unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren und
ihrer Kofaktoren haben (ANGEL u. KARIN, 1991; CAAMAÑO u. HUNTER, 2002;
Diskussion
125
HALAZONETIS et al., 1988; KARIN et al., 1997). Die beobachteten Korrelationen
deuten auf eine kausale Verbindung der entsprechenden Gene hin, jedoch kann
hiermit eine TMEV-induzierte Aktivierung der untersuchten Transkriptionsfaktoren
und eine darauffolgende Transkription verschiedener MMPs und Zytokine nicht
bewiesen werden. Das Vorliegen eines reinen Epiphänomens ist jedoch aufgrund
zahlreicher anderer Studien unwahrscheinlich, die entsprechende Zusammenhänge
belegen konnten (KWON et al., 2004; LIU et al., 2000; PALMA et al., 2003; RUBIO et
al., 1996; RUBIO u. MARTIN-CLEMENTE, 1999; SO et al., 2006; ZAGARIYA et al.,
1998). Des Weiteren zeigte sich die große Abhängigkeit der Genexpression von dem
untersuchten Zeitpunkt und den gewählten Kulturbedingungen. Um eine bessere
Übertragbarkeit dieser in vitro Ergebnisse auf die in vivo Situation zu gewährleisten,
werden im folgenden Abschnitt überwiegend die Unterschiede in der Genexpression
bzw. die Korrelationen diskutiert, die gleichzeitig in ähnlicher Weise in Monokultur
und Kokultur auftraten.
5.4.1 Die Rolle der Transkriptionsfaktoren und Zytokine im Verlauf der TMEVInfektion
5.4.1.1 Bedeutung von p50 für die TMEV-induzierte Transkription von TNF
Ein eindeutiges Ergebnis dieser Studie stellt die TMEV-abhängige Aufregulierung
des Genexpression von p50 in Astrozyten dar, welche insbesondere zum Zeitpunkt
48 h.p.i. ausgeprägt war und sich in der starken Korrelation von TMEV und p50
widerspiegelt. Die gleichzeitige Aufregulierung von TNF sowie dessen Korrelation mit
TMEV und p50 deuten auf eine Beteiligung des NF-κB-Proteins p50 in der TMEVinduzierten TNF-Expression hin. Ebenso wurde eine positive Korrelation zwischen
p50 und TNF in der in dieser Studie untersuchten Mikroglia gezeigt. Eine
entscheidende Rolle des NF-κB-Signalweges in Astrozyten für die Expression
verschiedener Zytokine und Chemokine nach einer TMEV-Infektion wurde bereits in
vorherigen Studien gezeigt (GERHAUSER et al., 2007a; PALMA et al., 2003; PALMA
u. KIM, 2004). Hierbei wurde innerhalb von 5 bis 15 min eine TMEV-induzierte
Translokation von p50/p65 und p50/p50-Dimeren in den Zellkern beobachtet
126
Diskussion
(PALMA et al., 2003). Des Weiteren konnte p50 in Astrozyten innerhalb von
demyelinisierten
Herden
des
Rückenmarks
TMEV-infizierter
SJL/J-Mäuse
nachgewiesen werden (GERHAUSER et al., 2007a). Außerdem wird TNF in SJL/Jund C57BL/6-Mäusen nach einer TMEV-Infektion aufreguliert (BEGOLKA et al.,
1998; CHANG et al., 2000; TROTTIER et al., 2004).
Weitergehende Studien haben teilweise widersprüchliche Ergebnisse über die
Signalwege ergeben, die für die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren wie
NF-κB nach einer TMEV-Infektion verantwortlich sind. SO et al. (2006) wiesen eine
wichtige Rolle des Toll-like Rezeptors 3 (TLR-3) für die TMEV-induzierte NF-κBvermittelte Expression von dem Monozyten-Chemoattraktiven Protein-1 (MCP-1) und
Interleukin-8 (IL-8) in Astrozyten nach. Des Weiteren wurde hierbei eine TLR-3
induzierte Aufregulierung des TLR-2 bebachtet, die an der Expression von IL-6, IL1b, MCP-1 und RANTES (“Regulated on activation, normal T lymphocytes expressed
and secreted“, CCL-5) beteiligt ist (SO u. KIM, 2009). TURRIN (2008) stellten
außerdem eine unterschiedliche TLR-Expression zwischen empfänglichen und
resistenten Mausstämmen fest. CARPENTIER et al. (2007) zeigten, dass Astrozyten
die
doppelsträngige
(ds)-RNS-abhängige
Proteinkinase
(PKR),
eine
zytoplasmatische Serin/Threonin-Kinase, für die Expression von IFN-α, IFN-β, IL-6,
MCP-1 (CCL-2) und IP-10 (Interferon-induzierbares Protein, CXCL10) nach einer
TMEV-Infektion benötigen. Das “melanoma differentiation-associated gene-5” (mda5) stellt einen weiteren zytoplasmatischen Sensor für ds-RNS dar, der unentbehrlich
für die Expression von IFN-α, IL-6 und MCP-1 in Makrophagen nach einer Infektion
mit dem Enzephalomyokarditisvirus, ebenfalls ein Picornavirus, ist (GITLIN et al.,
2006). Interessanterweise können NF-κB-Inhibitoren nicht nur die Expression
verschiedener Zytokine und Chemokine hemmen sondern auch die Replikation von
TMEV vollständig verhindern, womit die herausragende Bedeutung dieses
Transkriptionsfaktors in der Pathogenese der TME verdeutlicht wird (KIM et al.,
2005).
Aufgrund dieser zahlreichen Hinweise einer TMEV-induzierten p50-vermittelten TNFExpression wurden in dieser Studie Astrozyten mit für p50 spezifischer siRNS
transfiziert, um diese Hypothese zu belegen. Die Zellen wurden 48 h.p.i. lysiert, da
Diskussion
127
die Genexpression von TNF und p50 zu diesem Zeitpunkt deutlich aufreguliert war.
Obwohl mit dem durchgeführten Protokoll eine Abnahme der p50-Expression um
ungefähr 70% erreicht wurde, ließ sich hierdurch die TNF-Expression jedoch nicht
erkennbar beeinflussen. Dennoch besteht die Möglichkeit, dass eine 30%ige
Expression von p50 für die Initiation der TNF-Transkription ausreicht. Außerdem
kann das Fehlen von p50 durch andere NF-κB-Familienmitglieder insbesondere p52
ausgeglichen werden, indem der klassische den alternativen NF-κB-Signalweg
ersetzt (BONIZZI u. KARIN, 2004; CAAMAÑO u. HUNTER, 2002).
5.4.1.2 Expression von Max im Verlauf der TME
Die Genexpression von Max wurde in den untersuchten Astrozyten nur geringfügig
von den Kulturbedingungen und der TMEV-Infektion beeinflusst. Diese konstitutive
Expression beruht auf der Interaktion eines ständig exprimierten 90-kDa-Proteins mit
dem Promotor des Max-Gens (PETERS et al., 1997). Außerdem besitzt die mRNS
von Max eine ungewöhnlich lange Halbwertszeit von mehr als 3h (WAGNER et al.,
1992). Das Max-Protein wird ebenfalls in vivo allgegenwärtig exprimiert und stellt
einen obligaten Bindungspartner für Myc- und Mad-Proteine dar (BLACKWOOD et
al., 1992; BLACKWOOD u. EISENMAN, 1991; KURAMOTO et al., 1999; SHEN-LI et
al., 2000; VÄSTRIK et al., 1995). Während Myc/Max-Heterodimere an der Kontrolle
der Zellproliferation und Apoptose beteiligt sind, induzieren Max/Mad-Heterodimere
die Differenzierung von Zellen (BAUDINO u. CLEVELAND, 2001; LÜSCHER, 2001;
Abb. 5.1). Max/Max-Homodimere hemmen kompetitiv Myc/Max-Heterodimere und
haben auf diese Weise einen anti-apoptotischen Effekt (AMATI et al., 1992; DANG,
1999; PETRS-SILVA et al., 2004; SHICHIRI et al., 1999). Interessanterweise wurde
in der Mikroglia eine Aufregulierung der Genexpression von Max nach der TMEVInfektion festgestellt, die außerdem mit TNF korreliert war. Möglicherweise reagiert
Mikroglia auf die hohe Expression von TNF mit einer vermehrten Produktion von
Max,
um
den
von
diesem
Zytokin
induzierten
proapoptotischen
Signalen
entgegenzuwirken. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits in vivo beobachtet. SJL/JMäuse wiesen im Gegensatz zu C57BL/6-Mäusen ebenfalls eine Aufregulierung der
Genexpression von Max in der Spätphase einer TMEV-Infektion auf (persönliche
128
Diskussion
Beobachtung). Mittels Immunhistologie konnte außerdem gezeigt werden, dass Max
überwiegend von Entzündungszellen innerhalb der demyelinisierten Läsionen und
nicht von Astrozyten exprimiert wird. Myc-Max-Heterodimere können unter anderem
durch die vermehrte Bildung von Bax zu einer Apoptose von T-Zellen führen
(BISSONNETTE et al., 1994; MITCHELL et al., 2000). Somit könnte eine
Überexpression von Max in autoreaktiven T-Zellen zur Bildung von Max/MaxHomodimeren und demzufolge zur Hemmung der Apoptose dieser Zellen führen, die
eine wichtige Rolle in der Pathogenese der TME spielen. Zur Bestätigung dieser
Hypothese werden jedoch weitere Studien benötigt, die das Zusammenspiel des
Myc/Max/Mad-Netzwerks bei der Transkriptionskontrolle ihrer Zielgene im Rahmen
einer TMEV-Infektion in unterschiedlichen Zellen genauer untersuchen.
Abb. 5.1:
Einfluss des Myc/Max/Mad-Netzwerks auf die Proliferation und
Differenzierung von Zellen (KURAMOTO et al., 1999; modifiziert).
c-Myc
Max c-Myc
E-Box
Proliferation
Mad
Max
Max Max
E-Box
X
Max Mad
E-Box
X
Differenzierung
Während Myc/Max-Heterodimere zur Zellproliferation führen, induzieren Max/MaxHomodimere und Max/Mad-Heterodimere die Differenzierung von Zellen, indem sie
die DNS-Bindungsstelle (E-Box) für Myc/Max-Heterodimere im Promoter von
Zielgenen blockieren.
Diskussion
129
5.4.1.3 Bedeutung von Ets-1 und p53 für die Pathogenese der TME
Neben
p50
wurde
in
den
untersuchten
Astrozytenkulturen
eine
deutliche
Aufregulierung der Genexpression von Ets-1 und p53 nach der TMEV-Infektion
festgestellt. Außerdem war Ets-1 in den Astrozyten mit TMEV korreliert. In der
Mikroglia wiesen Ets-1, p53, p50 und p65 lediglich auf Monokultur oder Kokultur
beschränkte statistisch signifikante Veränderungen der Genexpression auf. Des
Weiteren lagen in der Mikroglia keine eindeutigen Korrelationen zwischen TMEV,
Ets-1 und p53 vor. Der Transkriptionsfaktor Ets-1 wird somit vermutlich im Rahmen
der TMEV-Infektion zumindest in Astrozyten aktiviert, in denen Ets-1 bereits eine
starke konstitutionelle Expression aufweist. Abgesehen von den Astrozyten ist Ets-1
auch an der Differenzierung T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen beteiligt (BORIES et
al., 1995; FLEISCHMAN et al., 1995; MUTHUSAMY et al., 1995; TASSI et al., 2006).
Des Weiteren spielt Ets-1 eine wichtige Rolle bei der Expression verschiedener
Zytokin- und MMP-Gene einschließlich TNF (CHAKRABORTI et al., 2003; KRAMER
et al., 1995; OYAMA et al., 2007; ROSENBERG et al., 2002; TSAI et al., 2000;
WESTERMARCK u. KÄHÄRI, 1999). GRENNINGLOH et al. (2005) zeigten eine
entscheidende Rolle von Ets-1 in der gegenseitigen Regulation der pro- und
antiinflammatorischen TH1-Immunantwort. Dementsprechend wiesen TMEV-infizierte
Mäuse eine starke Expression dieses Transkriptionsfaktors auf, der vermutlich zur
primären
antiviralen
Immunantwort
in
der
Frühphase
der
TME
beiträgt
(GERHAUSER et al., 2007b). Inwieweit Ets-1 in der Spätphase der TME an der
Progression der Läsionen durch die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen
und MMPs beteiligt ist, bleibt aufgrund des Fehlens einer Korrelation mit TNF oder
den untersuchten MMPs unklar. Die positive Korrelation von TNF und p53 in den
Astrozytenkulturen
könnte
jedoch
auf
eine
TNF-induzierte
p53-vermittelte
Proliferationshemmung und/oder Apoptose dieser Zellen hinweisen.
5.4.1.4 Interaktionen der untersuchten Transkriptionsfaktoren
Im Gegensatz zu Ets-1, p53 und p50 wiesen p65, c-jun und c-fos eine stark von den
Kulturbedingungen abhängige Reaktion auf die TMEV-Infektion auf. In den
Astrozyten waren die Genexpressionen dieser drei Gene untereinander und mit Max
130
Diskussion
positiv korreliert. Die Mikroglia wies eine positive Korrelation zwischen c-fos und Ets1 sowie c-fos und Max auf. Die Transkriptionsfaktoren p50 und p53 waren in beiden
Zelltypen
miteinander
positiv
korreliert.
Die
genaue
Bedeutung
dieser
Zusammenhänge bleibt unklar. Interessanterweise wird eine Interaktion von
Mitgliedern der Myc/Max-, NF-κB- und AP-1-Transkriptionsfaktorfamilien in der
humanen p53-Promotorregion benötig, um die Transkription dieses Gens zu
aktivieren
(KIRCH
et
al.,
1999).
Außerdem
interagieren
ETS-Proteine
bekanntermaßen mit zahlreichen anderen Transkriptionsfaktoren darunter NF-κBund AP-1-Familienmitgliedern (BASSUK et al., 1997; BASSUK u. LEIDEN, 1995;
YANG et al., 1998). Derartige Interaktionen koordinieren verschiedene zelluläre
Prozesse, die unter anderem durch Zytokine, Wachstumsfaktoren, Antigene und
zellulärem Stress ausgelöst werden (LI et al., 2000). Folglich könnten Max, p50, p65,
c-jun und c-fos eine Rolle in dem oben erwähnten Signalweg der TNF-induzierten
p53-vermittelten Proliferationshemmung und/oder Apoptose von Astrozyten und
Mikroglia spielen (PRENDERGAST, 1999).
Die positive Korrelation von c-jun und c-fos in den Astrozyten deutet auf eine
gleichzeitige Aktivierung von Mitgliedern der AP-1-Familie in diesen Zellen hin. Eine
derartige Korrelation wurde auch in vivo in TMEV-infizierten SJL/J-Mäusen
beobachtet, die außerdem eine starke Expression von c-jun und c-fos in
intraläsionale Astrozyten zeigten (GERHAUSER et al., 2007a). Eine Akkumulation
von c-fos mRNS wurde ebenfalls in glialen Zellen im Bereich demyelinisierter MSPlaques beobachtet (YU et al., 1991). Jedoch ließ sich in vitro keine eindeutige
Korrelation dieser Gene mit den untersuchten Zytokinen und MMPs feststellen. Eine
Ausnahme hierzu stellte lediglich die Korrelation von c-fos mit TNF dar. In vorherigen
Studien konnte eine Aufregulierung von c-jun und c-fos nach einer TMEV-Infektion
und nach einer IFN-γ-Stimulation in verschiedenen glialen Zelllinien beobachtet
werden (RUBIO et al. 1996; RUBIO u. MARTIN-CLEMENTE, 1999; RUBIO, 1997).
RUBIO u. MARTIN-CLEMENTE (1999) zeigten, dass TMEV schnell in Astrozyten
aufgenommen wird und sich anschließend im Zytoplasma repliziert. Des Weiteren
wiesen sie eine ebenfalls eine starke Zunahme der Expression von c-fos nach,
welche 30 min nach der Infektion ihren Höhepunkt erreichte, bis 2 Stunden nach der
Diskussion
131
Infektion andauerte und direkt durch das Virus induziert worden war. Eine Zunahme
der mRNS von c-fos wurde jedoch in vivo auch nach einer intranasalen Infektion von
Ratten mit Bornavirus und Tollwutvirus beschrieben, welches auf eine eher
stereotype als TMEV-spezifische Reaktion des ZNS nach einer Virusinfektion
hindeutet (FU et al., 1993).
Humane Astrozyten benötigen für die Expression von IL-8 und MCP-1 nach Infektion
mit verschiedenen Picornaviren inklusive TMEV die Aktivierung von NF-κB- und AP1-Proteinen (KWON et al., 2004). Außerdem beruht die LPS-induzierte Aktivierung
des TNF-Promotors in humanen Makrophagen auf der Expression von NF-κB und cjun (LIU et al., 2000). Sowohl TNF als auch p50 werden in vivo im gesunden ZNS nur
schwach exprimiert. Beide Gene werden aber im Rahmen von entzündlichen
Prozessen in Mikroglia/Makrophagen verschiedener Spezies deutlich aufreguliert
(GVERIC et al., 1998; KALTSCHMIDT et al., 1994; MEDANA et al., 1997). Im
Rahmen dieser Studie wurde in den Mikrogliakulturen eine Aufregulierung von c-jun
und c-fos sowie eine positive Korrelation zwischen TMEV und c-fos im Verlauf der
TMEV-Infektion beobachtet, so dass murine Mikrogliazellen möglicherweise ebenfalls
sowohl NF-κB- als auch AP-1-Proteine für die Aktivierung der TMEV-induzierten
TNF-Expression benötigen. Im Gegensatz dazu scheinen murine Astrozyten lediglich
auf die Aktivierung von NF-κB angewiesen zu sein (KWON et al., 2004).
Interessanterweise können TNF, IFN-γ und IL-1 selbst wiederum die Transkription
verschiedener Transkriptionsfaktoren wie c-jun, c-fos und c-myc aktivieren (LIN u.
VILČEK, 1987; RUBIO, 1997). Somit lässt sich die in Astrozyten beobachtete
Korrelation zwischen c-fos und TNF möglicherweise eher durch eine TNF-induzierte
Expression von c-fos als durch eine c-fos-induzierte Expression von TNF erklären.
Neben TNF wies das NF-κB-Protein p50 in den Astrozyten eine positive Korrelation
mit MMP-3 und MMP-9 auf. In der Mikroglia zeigten jedoch sowohl TNF als auch p50
eine negative Korrelation mit MMP-12. Diese Ergebnisse stellen einen weiteren
Hinweis auf einen zellspezifischen Einfluss der untersuchten Transkriptionsfaktoren
bezüglich
der
Expression
ihrer
Zielgene
dar.
Allerdings
bestehten
einige
Schwierigkeiten in der Interpretation derartiger Korrelationen. Erstens bleibt hierbei
die Zuordnung zu Ursache und Folge unklar, wie bereits weiter oben für den
132
Diskussion
Zusammenhang zwischen TNF und c-fos erläutert wurde. Zweitens kann aus einem
Anstieg in der Bildung von mRNS nur bedingt auf eine vermehrte Produktion des
entsprechenden Proteins geschlossen werden, wobei überdies gegebenenfalls durch
unterschiedliches Spleißen unterschiedliche Proteine entstehen können. Drittens
bleibt die Frage offen, ob die gebildeten Proteine auch aktiviert werden und so ihre
spezifischen Funktionen ausüben können. Somit werden weitere Studien benötigt,
um
die
vermutlich
zellspezifischen
Interaktionen
dieser
und
anderer
Transkriptionsfaktoren in den entsprechenden Promotorregionen ihrer Zielgene
aufzuklären. Außerdem muss anschließend geklärt werden, welche Rolle diese
Zielgene in dem untersuchten physiologischen oder pathologischen Prozess spielen.
Die Bedeutung der MMPs für den Verlauf der TMEV-Infektion wird im folgenden
Abschnitt diskutiert.
5.4.2 Die Rolle der MMPs im Verlauf der TMEV-Infektion
MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese demyelinisierender
Erkrankungen, weil sie die Blut-Hirn-Schranke öffnen, TNF freisetzen, die Invasion
und Migration von Entzündungszellen begünstigen und Myelinproteine spalten
können (BAKER et al., 2002; RIES u. PETRIDES, 1995; ROSENBERG et al., 1995).
Von den im Rahmen dieser Studie untersuchten MMPs zeigten MMP-3, -9 und -12
eine deutliche Aufregulierung in den untersuchten Astrozytenkulturen im Verlauf der
TMEV-Infektion. ULRICH et al. (2006) wiesen bereits in vivo eine TMEV-induzierte
Aufregulierung der Genexpression von MMP-3 nach. Außerdem wurde bei einer
Coronavirus-Infektion von Mäusen, einem anderen Tiermodell von MS, ebenfalls eine
ausschließlich von Astrozyten getragene MMP-3-Expression festgestellt (ZHOU et
al., 2005). In akut und subakut demyelinisierender kaniner Staupeenzephalitis
wurden MMP-3-Proteine zusammen mit MMP-1, -7, -9, -12, -13, and -14 in
Astrozyten und Mikroglia/Makrophagen beobachtet (MIAO et al., 2003). Des
Weiteren zeigten LINDBERG et al. (2001) eine Aufregulierung der mRNS-Transkripte
von MMP-3 in frühen MS-Läsionen, in denen ein inflammatorisches Ödem der
Myelinscheide jedoch keine offenkundige Demyelinisierung nachweisbar war.
Diskussion
133
Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Studie wurde die mRNS-Transkription von
MMP-9 in vivo nur unwesentlich durch eine TMEV-Infektion beeinflusst (ULRICH et
al., 2006). Interessanterweise könnte das Fehlen einzelner Zytokine in vitro diese
unterschiedlichen Ergebnisse erklären. So konnte IFN-γ im Verlauf dieser Studie
weder in Astrozyten noch in Mikroglia nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine
starke Aufregulierung von IFN-γ im ZNS TMEV-infizierter SJL/J-Mäuse beobachtet
(BEGOLKA et al., 1998; CHANG et al., 2000; GERHAUSER et al., 2007a). Die
Aktivität und Proteinexpression von MMP-9 wird jedoch durch IFN-β und IFN-γ
gehemmt (MA et al., 2001). Hierfür aktiviert IFN-γ den Transkriptionsfaktor “Signal
transducer and activator of transcription“ (STAT)-1α. Dieser bindet an das “cyclic
AMP response element-binding protein (CREB)-binding protein“ (CBP) und das
p300-Protein und behindert auf diese Weise dessen Funktion als Koaktivator der
MMP-9-Transkription (MA et al., 2005). Außerdem hemmt STAT-1α die Azetylierung
der Histone und die Rekrutierung der RNS-Polymerase II (Abb. 5.2). Folglich kann
das von Immunzellen gebildete IFN-γ die in der Zellkultur beobachtete Aufregulierung
der Genexpression von MMP-9 in vivo unterdrücken. Vorherige Untersuchung in
Mäusen mit EAE haben widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der MMP-9Expression ergeben (CLEMENTS et al., 1997; PAGENSTECHER et al., 1998;
TEESALU et al., 2001; TOFT-HANSEN et al., 2004). Allerdings wird MMP-9 im
Verlauf der MS deutlich aufreguliert und übt möglicherweise eine Schlüsselfunktion
bei der Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke aus (COSSINS et al., 1997; LINDBERG et
al., 2001; ROSENBERG et al., 1995; ROSENBERG, 2002).
Die in dieser Studie in Astrozyten festgestellte Aufregulierung von MMP-12 entspricht
den Ergebnissen zahlreicher Studien, die die Expression verschiedener MMPs im
Verlauf unterschiedlichster demyelinisierender Erkrankungen in vivo untersucht
haben (MIAO et al., 2003; PAGENSTECHER et al., 1998; VOS et al., 2003; ZHOU et
al., 2005). So wurde bei der MS und der EAE eine Expression von MMP-12 in
demyelinisierenden Läsionen beobachtet (PAGENSTECHER et al., 1998; VOS et al.,
2003). In der Coronavirus-Infektion von Mäusen wird MMP-12 von ortsständigen
Zellen des ZNS und Entzündungszellen exprimiert (ZHOU et al., 2005). Außerdem
wurden im Verlauf der chronisch demyelinisierenden Staupeenzephalitis MMP-12-
134
Diskussion
Proteine in Astrozyten, Makrophagen, Mikroglia und perivaskulären mononukleären
Entzündungszellinfiltraten nachgewiesen (MIAO et al., 2003).
Abb. 5.2:
Hemmung der Transkription von MMP-9 durch IFN-γγ (MA et al., 2005;
modifiziert) *.
Zellmembran
IFN-γγ
Rezeptor
STAT-1 α
HistonAcetylierung
Rekrutierung von
Koaktivatoren
HDAC
AP-1
p65
300
P/p
CB
Histon
Rekrutierung der
RNS-Polymerase II
p50
mRNS
Pol II
DNS
Transkription des MMP-9-Gens
Legende: AP-1, Aktivator-Protein-1; CBP, “CREB-binding protein“; CREB, “cyclic
AMP response element-binding protein“; HDAC, “Histon-Deacetylase“; p300, p300Protein; Pol II, RNS-abhängige Polymerase II; STAT-1α
α, “Signal transducer and
activator of transcription“-1α
*Der genaue Ablauf der Hemmung wird im Text erläutert.
Im Gegensatz zu den Astrozyten zeigte die Mikroglia eine Herrunterreglierung von
MMP-3, -9 und -12 im Verlauf dieser Studie. Die absoluten Werte von MMP-9 und
MMP-12 waren jedoch deutlich höher in der Mikroglia im Vergleich zu den
Diskussion
135
Astrozyten. TMEV-infizierte SJL/J-Mäuse wiesen einen starken Anstieg in der
Genexpression von MMP-12 in der Spätphase der Erkrankung auf (ULRICH et al.,
2006).
Außerdem
wurde
innerhalb
von
späten
TME-Läsionen
mittels
Immunhistologie eine starke MMP-12-Expression sowohl von Astrozyten als auch
von Makrophagen beschrieben, so dass MMP-12 zur Spaltung verschiedener
Moleküle einschließlich MBP im Verlauf der Demyelinisierung der TME beitragen
kann (CHANDLER et al., 1996; GRONSKI et al., 1997). Somit könnte die
beobachtete Aufregulierung von MMP-12 in vivo möglicherweise eine Folge (a) der
Aufregulierung von MMP-12 in den intraläsionalen Astrozyten, (b) eines Anstiegs der
absoluten Zahl von Mikroglia und Makrophagen in den Läsionen des Rückenmarks
oder (c) einer Kombination dieser beiden Möglichkeiten sein. Eine starke Zunahme
intraläsionaler Mikroglia/Makrophagen wurde in TMEV-infizierten SJL/J-Mäusen
beobachtet (GERHAUSER et al., 2007b). Die Expression dieser Metalloelastase in
Mikroglia/Makrophagen in vivo könnte durch Stimulation indirekt virus-vermittelter
Signalwege induziert werden.
MMP-2 wies in den Astrozyten eine hohe Genexpression von MMP-2 auf, die aber
nur unwesentlich von der TMEV-Infektion beeinflusst wurde. Eine konstitutive und
starke Expression von MMP-2 in astroglialen Zellen wurde ebenfalls mittels
“Ribonuclease
protection
assay“
(RPA),
“Western
Blot“,
Zymographie
und
Immunfluoreszenz festgestellt (OGIER et al.; 2006; QIN et al., 1998; YONG et al.,
1998). Dagegen wies die Mikroglia in dieser Studie eine Aufregulierung von MMP-2
zum Zeitpunkt 48 h.p.i. auf. Hierbei muss jedoch berücksichtigt werden, dass trotz
dieser Aufregulierung die Anzahl der mRNS-Transkripte von MMP-2 in den
untersuchten Mikrogliakulturen im Vergleich zu den Astrozyten auf sehr niedrigem
Niveau blieb. Interessanterweise wurde MMP-2 bei MS-Patienten überwiegend in
Mikroglia und Makrophagen in den akuten, aktiv demyelinisierenden Läsionen sowie
in den aktiven Randbereichen chronischer Läsionen und nur vereinzelt in Astrozyten
beobachtet (ANTHONY et al., 1997; CUZNER et al., 1996; MAEDA u. SOBEL,
1996). Eine RT-qPCR-Studie wies ebenfalls eine Aufregulierung der MMP-2Expression nach, die jedoch auf sehr frühe MS-Läsionen begrenzt war (LINDBERG
et al., 2001). Im Gegensatz dazu konnte in EAE erkrankten Mäusen und Ratten
136
Diskussion
keine signifikante Veränderung der Genexpression von MMP-2 festgestellt werden
(CLEMENTS et al., 1997; PAGENSTECHER et al., 1998; TEESALU et al., 2001;
TOFT-HANSEN et al., 2004). Desgleichen wies eine immunhistologische Studie
keine Veränderung der Anzahl MMP-2 exprimierender Zellen im Verlauf der
demyelinisierenden Staupeenzephalitis nach (MIAO et al., 2003). TMEV-infizierte
SJL/J-Mäuse zeigten lediglich in der Spätphase eine verstärkte Genexpression von
MMP-2 (ULRICH et al., 2006). Eine Erklärung hierfür stellt die sich im Verlauf der
Demyelinisierung entwickelnde Astrogliose dar, welche zu einer Zunahme an MMP-2
exprimierenden Astrozyten führt (ULRICH et al., 2008). Dennoch könnte MMP-2 eine
Rolle in der Pathogenese der Demyelinisierung spielen, da es überwiegend in den
astrozytären Fortsätzen lokalisiert ist und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke
beeinträchtigen kann (ROSENBERG et al., 1995; ROSENBERG, 2002).
Zusammenfassend deuten die in dieser Studie durchgeführten Untersuchungen auf
eine herausragende Bedeutung der Astrozyten für die Expression verschiedener
MMPs im Verlauf der TMEV-induzierten Demyelinisierung hin. Der genaue Ablauf
dieser autoimmunen Entzündungsreaktion sowie die Interaktionen zwischen
Astrozyten und Mikroglia muss jedoch in weiteren Studien detaillierter untersucht
werden.
5.5 Schlussbetrachtung
Die durchgeführte Studie hat einen starken wechselseitigen Einfluss der kultivierten
Astrozyten und Mikroglia auf die Expression der untersuchten Transkriptionsfaktoren,
Zytokine und MMPs ergeben. So wurde in der Kokultur im Vergleich zur Monokultur
eine im Allgemeinen deutlich stärkere und auch frühere Reaktion der Astrozyten auf
die TMEV-Infektion beobachtet. Sowohl die Astrozyten als auch die Mikroglia
reagierten mit einer Hemmung der Zellproliferation und/oder einer vermehrten
Apoptose. Während die Virusreplikation überwiegend in den Astrozyten stattfand,
wies die Mikroglia lediglich eine Speicherung phagozytierter Viruspartikel auf. Die
Ergebnisse der RT-qPCR stimmen mit der folgenden Hypothese überein. Die
intrazerebrale Injektion von TMEV verursacht eine Infektion von Astrozyten mit
nachfolgender Aktivierung von NF-κB. Als Folge dieser Virusinfektion werden die
Diskussion
137
Astrozyten bei der Aufrechterhaltung der Homöstase des ZNS behindert. Die Bildung
von TNF und anderer Entzündungsmediatoren führt zu einer Aktivierung von
weiteren Transkriptionsfaktoren einschließlich AP-1-Proteine in benachbarten nicht
infizierten Zellen. Auf diese Weise entsteht eine pro-inflammatorischen Kaskade
durch autokrine und parakrine Signale, die einerseits zur Elimination des Virus aus
dem ZNS führen kann oder andererseits den fortschreitenden Prozess der
Demyelinisierung einleiten kann. Hierbei scheinen Makrophagen durch eine MMPvermittelte Zerstörung der Myelinscheide und Apoptose-resistente autoimmune TZellen eine wichtige Rolle zu spielen (CHIARUGI, 2002; KIM et al., 2005; KWON et
al., 2004; PALMA u. KIM, 2004; RUBIO, 1997).
Vorherige Studien konnten bereits den Zusammenhang zwischen der Aktivierung von
AP-1- und NF-κB-Proteinen und der sich daraus entwickelnden Entzündung und dem
Abbau der extrazellulären Matrix in der Pathogenese der Dermatitis zeigen (KANG et
al., 2005). Somit üben diese Transkriptionsfaktoren vermutlich eine Schlüsselfunktion
in der Entwicklung von Entzündungen verschiedenster Organsysteme aus. Die
Entwicklung von Angrifffspunkten zukünftiger Therapeutika beruht auf der Kenntnis
der Interaktionen dieser Proteine sowie ihrer pro- und antiinflammatorischen Rolle im
Rahmen pathologischer Prozesse (EGGERT et al., 2004).
138
Diskussion
Zusammenfassung
6
139
Zusammenfassung
Ingo Gerhauser - In vitro Expressions-Analyse von Transkriptionsfaktoren muriner
Astrozyten und Mikrogliazellen nach Infektion mit dem Theiler-EnzephalomyelitisVirus
Die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis (“Theiler’s murine encephalomyelitis“;
TME) stellt neben der kaninen Staupe ein bedeutendes, virusinduziertes Tiermodell
für demyelinisierende Erkrankungen wie die multiple Sklerose des Menschen dar.
Während das Theilervirus (“Theiler’s murine encephalomyelitis virus“; TMEV) im
Rückenmark von empfänglichen SJL/J-Mäusen persistiert, wird es aus dem zentralen
Nervensystem (ZNS) von resistenten C57BL/6-Mäusen durch eine eine starke
antivirale Immunantwort eliminiert. Die Viruspersistenz führt zu einer ständigen
Stimulation des Immunsystems mit daraus folgender Demyelinisierung. Neben den
einwandernden Entzündungszellen sind Astrozyten und Mikroglia durch die
Freisetzung
von
Zytokinen
und
Matrix-Metalloproteinasen
(MMPs)
am
Entmarkungsprozess beteiligt. Ets-1, NF-κB (p50/p65), AP-1 (c-jun/c-fos), Max und
p53
sind
interagierende
Transkriptionsfaktoren,
die
im
Rahmen
von
unterschiedlichen Entzündungsprozessen aktiviert werden und die Produktion von
verschiedenen Botenstoffen und Effektormolekülen kontrollieren. Außerdem haben
dieser Transkriptionsfaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation,
Differenzierung und Apoptose von Zellen. Allerdings fehlen vergleichende Studien
über die spezifischen Expressionsmuster dieser Transkriptionsfaktoren in Astrozyten
und Mikroglia sowie deren Verbindung zur Pathogenese der TME.
Im Rahmen dieser Studie wurden primäre Astrozyten und Mikroglia aus Gehirnen
neonataler SJL/J-Mäuse gewonnen, in Mono- und Kokultur ausgesät und
anschließend mit TMEV infiziert. 6, 48, 72, 240 Stunden nach der Infektion wurden
die Zellzahl und mittels Immunfluoreszenz der Prozentsatz GFAP-positiver
Astrozyten, DiI-LDL/Iba-1-positiver Mikroglia und TMEV-positiver Zellen in den
einzelnen Kulturen bestimmt. Ein Plaquetest diente zur Bestimmung der “Plaque
Forming Units“ (PFU)/ml im Zellkulturüberstand. Die mRNS wurde aus den Zellen für
140
Zusammenfassung
eine quantitative RT-PCR (RT-qPCR) isoliert und die Genexpression von Ets-1, p50,
p65, c-jun, c-fos, Max, p53, TNF, IFN-γ, MMP-2, MMP-3, MMP-9 und MMP-12
bestimmt. In weiterführenden Untersuchugen wurde die Proliferations- und
Apoptoserate von Astrozyten nach der TMEV-Infektion mittels BrdU-Test bzw.
“cleaved“ Caspase-3 spezifischer Immunfluoreszenz ermittelt. Die Virusreplikation in
Mikroglia wurde mittels Quantifizierung der TMEV-Minus-Strang-RNS genauer
untersucht.
Die Untersuchungen der aufgereinigten Kulturen ergaben eine Hemmung der
Proliferationsrate
der
TMEV-infizierten
Zellen.
Des
Weiteren
wurde
eine
virusinduzierte Apoptose von Astrozyten beobachtet. Im Gegensatz zu den
Astrozyten wies die Mikroglia eine extrem eingeschränkte Virusreplikation auf. In den
Astrozyten wurde gegenüber der Mikroglia eine statistisch signifikant stärkere basale
Genexpression von Ets-1 und MMP-2 nachgewiesen. Dagegen wurden in der
Mikroglia mehr mRNS-Transkripte von TNF, p50 und p53 als in den Astrozyten
festgestellt. Außerdem wurden MMP-9 und MMP-12 über 100-fach stärker in
Mikroglia als in Astrozyten exprimiert. Bei Max, p65, c-jun, c-fos und MMP-3 lagen
lediglich auf die Mono- oder Kokultur beschränkte Unterschiede zwischen diesen
beiden Zelltypen bezogen auf die basale Genexpression vor. Das Zytokin IFN-γ war
in keiner der untersuchten Zellkulturen nachweisbar.
Die Ergebnisse der RT-qPCR deuten auf eine Beteiligung des NF-κB-Proteins p50
bei der TMEV-induzierten TNF-Expression hin. Dennoch hatte eine Hemmung der
Genexpression von p50 mittels siRNS keinen Einfluss auf die Transkriptionsrate von
TNF, so dass ein Fehlen dieses Proteins zumindest teilweise durch andere
Transkriptionsfaktoren ausgeglichen werden kann. So wird die Genexpression
verschiedener Zytokine vermutlich ebenfalls durch AP-1-Proteine kontrolliert.
Interessanterweise kann TNF selbst verschiedene Transkriptionsfaktoren im Rahmen
der Signaltransduktionskaskade aktivieren, so dass der Anstieg der Genexpression
von c-fos in der TMEV-infizierten Mikroglia möglicherweise durch TNF induziert
wurde. Des Weiteren wurden positive Korrelationen zwischen Max, p50, p65, c-jun,
c-fos, p53 und TNF in beiden untersuchten Zelltypen festgestellt. Diese lassen sich
durch den Einfluss der interagierenden NF-κB-, AP-1- und Max-Proteine auf eine
Zusammenfassung
141
TNF-induzierte sowie p53-vermittelte Proliferationshemmung und/oder Apoptose von
Astrozyten und Mikroglia erklären. Außerdem stellt der leichte aber statistisch
signifikante Anstieg der Genexpression von Max in der Mikroglia nach der TMEVInfektion möglicherweise eine Schutzreaktion dieser Zellen vor einer TMEVinduzierten Apoptose dar.
Während die Genexpression von MMP-2 in den Astrozyten kaum durch die TMEVInfektion beeinflusst wurde, war die Genexpression von MMP-3, MMP-9 und MMP-12
in den TMEV-infizierten Astrozyten stark aufreguliert. Hierbei muss jedoch
berücksichtigt werden, dass in vivo die Transkription von MMP-9 durch im Rahmen
der Entzündung freigesetztes IFN-γ unterdrückt wird. Im Gegensatz dazu wies die
Mikroglia eine eindeutig verminderte Genexpression dieser drei MMPs nach der
TMEV-Infektion auf. Diese Ergebnisse belegen die herausragende Rolle der
Astrozyten für den Entmarkungsprozess der TME, an dem MMPs durch die
Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke und der Myelinscheiden beteiligt sind.
Astrozyten und Mikroglia weisen deutliche Unterschiede in der Reaktion auf eine
TMEV-Infektion auf. Außerdem scheinen die untersuchten Trankriptionsfaktoren eine
wichtige Rolle in der Pathogenese der TME zu spielen. Dennoch werden weitere
Studien benötigt, um die genaue zellspezifische Bedeutung dieser interagierenden
Transkriptionsfaktoren in vivo aufzuklären.
142
Zusammenfassung
Summary
7
143
Summary
Ingo Gerhauser - In vitro analysis of the expression of transcription factors of murine
astrocytes and microglia after infection with Theiler’s murine encephalomyelitis virus
Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) and canine distemper represent important
virus-induced animal models for demyelinating diseases in humans including multiple
sclerosis. Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) persists in the spinal cord
of susceptible SJL/J mice. In contrast, a strong antiviral response eliminates the virus
from the central nervous system (CNS) in resistant C57BL/6 mice. Virus persistence
leads to permanent stimulation of the immune system thereby causing demyelination.
Astrocytes, microglia, and invading immune cells are deeply involved in this process
by producing and secreting different cytokines and matrix-metalloproteinases
(MMPs). Ets-1, NF-κB (p50/p65), AP-1 (c-jun/c-fos), Max, and p53 are interacting
transcription factors, which are activated during different inflammatory processes.
They control the production of various messenger and effector molecules and
influence cellular proliferation, differentiation, and apoptosis. However, studies
comparing the cell-specific expression of these transcription factors in astrocytes and
microglia as well as their role in the pathogenesis of TME are lacking.
In the present study primary astrocytes and microglia were isolated from the brain of
neonatal SJL/J mice, seeded in a mono- or co-culture system, and subsequently
infected with TMEV. Absolute cell numbers as well as percentage of GFAP-positive
astrocytes,
DiI-LDL/Iba-1-positive
microglia,
and
TMEV-positive
cells
were
determined 6, 48, 72, 240 hours after infection. Plaque assays were done to
calculate plaque forming units (PFU)/ml in the cell culture supernatant. The mRNA of
the cells was isolated and used in a quantitative RT-PCR (RT-qPCR) to measure
transcript numbers of Ets-1, p50, p65, c-jun, c-fos, Max, p53, TNF, IFN-γ, MMP-2,
MMP-3, MMP-9 and MMP-12. Additionally, cell proliferation and apoptosis rate of the
TMEV-infected astrocytes were determined by using a BrdU assay and fluorescent
labeled antibodies specific for cleaved caspase-3, respectively. Virus replication in
microglia was investigated by quantifying the minus-strand RNA of TMEV.
144
Summary
The study revealed a reduction of the proliferation rate of TMEV-infected cells and
indicated a virus-induced apoptosis of astrocytes. Virus replication was extremely
repressed in microglia compared to astrocytes. Sham-infected astrocytes showed
statistically significant higher numbers of Ets-1 and MMP-2 mRNS transcripts
compared to sham-infected microglia. In contrast, there was a stronger expression of
TNF, p50, and p53 in sham-infected microglia compared to sham-infected astrocytes.
Furthermore, sham-infected microglia demonstrated a more than 100 times stronger
expression of MMP-9 and MMP-12 compared to sham-infected astrocytes. The
differences between these two glial cell lines in the basal expression of Max, p65, cjun, c-fos, and MMP-3 were restricted to the mono- or coculture. The cytokine IFN-γ
was not detected in any of the investigated cell cultures.
RT-qPCR results pointed to a participation of the NF-κB-protein p50 in the TMEVinduced expression of TNF. However, siRNA inhibition of this protein yielded no
influence on the transcription rate of TNF. Therefore, lack of p50 seems to be
functionally compensated by other transcription factors including different AP-1proteins, which are involved in cytokine expression. Interestingly, TNF can itself
activate various transcription factors during its signal transduction cascade.
Consequently, the increase in the expression of c-fos in the TMEV-infected microglia
might be induced by high TNF levels. Both investigated cell types showed positive
correlations between Max, p50, p65, c-jun, c-fos, p53 and TNF. These correlations
can be explained by the well-known influence of the interacting NF-κB-, AP-1-, and
Max-proteins on the transcription of p53, which might be induced by TNF.
Furthermore, an increase in the expression of p53 might have caused the observed
inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis of astrocytes and microglia. In
contrast, the slight but statistically significant increase in the expression of Max in the
TMEV-infected microglia might represent a way of these cells to protect themselves
against a TMEV-induced apoptosis.
Though the expression of MMP-2 in astrocytes was only insignificantly influenced by
TMEV-infection, MMP-3, MMP-9 and MMP-12 were strongly upregulated in TMEVinfected astrocytes. However, transcription of MMP-9 is inhibited in vivo by IFN-γ,
which is released by inflammatory cells during the demyelination process. A strongly
Summary
145
reduced expression of MMP-3, MMP-9 and MMP-12 was found in TMEV-infected
microglia. These results substantiate the prominent role of astrocytes in the
demyelination process of TME by releasing different MMPs, which can destroy the
blood-brain-barrier and myelin sheath components.
Astrocytes and microglia show considerable differences in their reaction pattern to
TMEV-infection. In addition, the investigated transcription factors seem to play an
important role in the pathogenesis of TME. However, further studies are needed to
elucidate the cell-type specific function of these interacting transcription factors in
vivo.
146
Summary
Literaturverzeichnis
8
147
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RNA accumulation in multiple sclerosis white matter tissue. J. Neurol. Sci. 103, 209-215
ZAGARIYA, A., S. MUNGRE, R. LOVIS, M. BIRRER, S. NESS, B. THIMMAPAYA u. R. POPE (1998):
Tumor necrosis factor alpha gene regulation: enhancement of C/EBPbeta-induced activation by cJun. Mol. Cell. Biol. 18, 2815-2824
ZHENG, L., M. A. CALENOFF u. M. C. DAL CANTO (2001): Astrocytes, not microglia, are the main
cells responsible for viral persistence in Theiler’s murine encephalomyelitis virus infection leading
to demyelination. J. Neuroimmunol. 30, 256-267
Literaturverzeichnis
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ZOECKLEIN, L. J., K. D. PAVELKO, J. GAMEZ, L. PAPKE, D. B. MCGAVERN, D. R. URE, M. K.
NJENGA, A. J. JOHNSON, S. NAKANE u. M. RODRIGUEZ (2003): Direct comparison of
demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine
encephalomyelitis virus. Brain Pathol. 13, 291-308
164
Literaturverzeichnis
Anhang
9
165
Anhang
9.1 Bezugsquellen für Reagenzien und Einmalartikel
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG, Waldbronn
Deutschland (ehemals Stratagene®, Amsterdam, Niederlande)
Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit, 600546
Mx4000® 8-Tube Strips, 410022
Mx4000® 8-Cap Strips, 410024
ATCC®,
American
Type
Culture
Collection,
Rockville,
MD,
USA
(Vertriebspartner: LGC Standards GmbH, Wesel, Deutschland)
Murine Lewis-Lung-Karzinom-Zellen, LL/2 cells, CR-1642™
Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland
PCR Softtubes 0,5 ml, #711098
Safeseal-Tips 1000 µl, #692079
Safeseal-Tips 200 µl, #692069
Safeseal-Tips 100 µl, #692066
Safeseal-Tips 20 µl, #692151
Safeseal-Tips 10 µl, #693010
Seakem Agarose LE, #840004
Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA (Vertriebspartner: New England
Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland)
Anti-Cleaved Caspase-3-Antikörper, Kaninchen Asp175
Corning Life Sciences, München, Deutschland (Vertriebspartner: Diagonal GmbH
& Co KG, Münster, Deutschland)
12 Well Zellkulturplatten Costar®, 3513
24 Well Zellkulturplatten Costar®, 3524
Zellkultureinsatz für Transwellsystem, 12 mm Transwell® mit 0,4 µm Poren
Polyester, 3460
DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland (ehemals Dako® Diagnostika
GmbH)
166
Anhang
Dako® Fluorescent Mounting Medium, S3023
Anti-GFAP Antikörper, Kaninchen Z0334
Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Suffolk, UK (Vertriebspartner: dianova
GmbH, Hamburg, Deutschland)
Fluorescein (FITC)-conjugated Goat anti-Mouse IgG (H+L), 115095-146
Cy™2-conjugated AffiniPure Goat-Anti-Mouse IgG (H+L), 115-225-003
Cy™2-conjugated AffiniPure Goat-Anti-Rabbit IgG (H+L), 111-225-144
Cy™3-conjugated AffiniPure Goat-Anti-Mouse IgG (H+L), 115-165-166
Cy™3-conjugated AffiniPure Goat-Anti- Rabbit IgG (H+L), 111-165-144
Fischer, Frankfurt, Deutschland
96-Fachloch-Mikrotiterplatte, Falcon® Becton Dickinson, 3072
GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg MD, USA
DMEM, 41965-039
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland (Vertriebspartner: Diagonal
GmbH & Co KG, Münster, Deutschland)
15 ml Zentrifugenröhrchen, 188271
50 ml Zentrifugenröhrchen, 227261
Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland
SJL/JHanHsd, weiblich, 3-4 Wochen, 87802F
Invitrogen™ GmbH, Karlsruhe, Deutschland
TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Chemically
Competent E.coli, K4575-01
RNAse Out®, 10777-019
Universal M13 Forward Primer, N520-02
Universal M13 Reverse Primer, N530-02
Agarose-Gel 4%, Gibco 18300012
Macherey-Nagel, Düren, Deutschland
Nucleo Spin® Extract Kit II, 740609.50
Menno Chemie Vertriebsges. mbH, Norderstedt, Deutschland
Venno-Vet 1 super
Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland
Anhang
167
Montage™ PCR Centrifugal Filter Devices, UFC7PCR50
MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland
Primersynthese für die PCR
Sequenzierung von PCR-Produkten
PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland
Dulbeccos modified eagle medium (DMEM), E15-810
Fötales Kälberserum, A11-041
Typsin-EDTA (1x), 0,05% Trypsin + 0,02% EDTA in D-PBS, L-11-004
Paesel & Lorei GmbH & Co Biochemika, Diagnostika und Pharmazeutika,
Hanau, Deutschland
DiI-ac-LDL, BT-902
PeproTech GmbH, Hamburg, Deutschland
Rekombinantes Humanes M-CSF, 300-25
Perkin Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland
GeneAmp RNA PCR Core Kit, N8080143
Promega GmbH, Mannheim, Deutschland
“Random Primers” 500µg/ml, C1181
Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA
DNase I, 10104159001
“In Situ Cell Proliferation Kit“, FLUOS, 11810740001
Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland
Omniscript® RT Kit, 205113
RNeasy Mini Kit (250), 74106
RNase-Free DNase Set (50), 79254
Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Ethanol, Rotipuran®, 9065
Ethanol, vergällt, K928.2
Formaldehyd 37%, 7398
Kaliumchlorid (KCl)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 x 6 H2O)
168
Anhang
Natriumchlorid (NaCl), P029.2
Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1
Salzsäure Rotipuran® 25% p.a., 6331.3
Sarsted AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Mikrovette CB 300 Z, 16440
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 72690
Reaktionsgefäße 2,0 ml, 72695
SeqLab, Göttingen, Deutschland
Sequenzierung von PCR-Produkten
Serva Feinbiochemica GmbH und Co KG, Heidelberg, Deutschland
Natriumcarbonat p.a., 30181
Tween® 20 pure; 37470
Zitronensäure Na3-Salz, reinst, 38642
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Anti-GFAP-Antikörper, monoklonal Maus, Klon G-A-5, G3893
Bisbenzimide H 33258, B2883
Bovines Serumalbumin (BSA), A3059
Concanavalin A, C9017
Diethylpyrocarbonat (DEPC), 32490
Ethidiumbromid-Lösung 10mg/ml, E1510
Fetales Kälberserum, 2-01F00-I
Gentamicin, G1397
HEPES, H3375
Ham’s F-12 Nutrients-Mix, N6760-10L
Insulin, I-4011
Kaninchenserum, R4505
Kodak®, X-Omat AR Film, XAR-5, Size: 8 in. x 10 in., F5513-50EA
L-Glutamin, G-8540
Methylzellulose, M0512
Natriumbikarbonat, 71628
Penicillin-Streptomycin, 4-02F00-I
Anhang
169
Poly-L-Lysine hydrobromide, P-1274
Putrescine, P-5780
Saccharose, Sucrose minimum 99,5%, S-9378
Transferrin, T-8158
Tris (hydroxymethyl-)aminomethane, Fluka 93352
Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland
ssniff R/M-Haltung, V1534-727
ssniff bedding ¾ Faser, H1185-000
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland (ehemals ABgene®
Advanced Biotechnologies, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH und
Nunc™ GmbH &Co. KG, Wiesbaden, Deutschland; Vertriebspartner: LAT-Labor-undAnalyse-Technik GmbH, Garbsen, Deutschland und Omnilab-Laborzentrum GmbH &
Co KG, Gehrden, Deutschland)
6 Well Zellkulturplatten, Multidishes Nunclon™ Surface, 140675
24 Well Zellkulturplatten, Multidishes Nunclon™ Surface, 143982 (142475)
96 Well Zellkulturplatten, F96 MicroWell™, 167008
6x Gel Loading Dye, 3211107
Petrischalen 8,8 cm, 150318
Petrischalen 10 cm, 150350
Superladder-Low 100bp Ladder, 3161402
Zellkulturflaschen, 25 cm2: 156367
Zellkulturflaschen, 75 cm2: 156499
Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere, Hannover,
Deutschland
Ziegennormalserum
VWR™ International GmbH, Darmstadt, Deutschland (ehemals Merck KGaA)
Borsäure krist. reinst, 1.00160
Calciumchlorid-2-hydrat krist., 2382
Ethanol (Alkohol) absolut p.a., 1.00983
Glycerol, etwa 87%, K304023912121
Glycine pro analysis, 1.04201.1000
170
Anhang
Kaliumkarbonat p.a., 4928
2-Mercaptoethanol pA-Qualität 99%, 1.15433
Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498.1000
Natriumchlorid reinst, 1.06400.1000
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x 2 H2O ) p.a., 1.06580.1000
Natriumhypochlorid-Lösung, 1.05614
Natronlauge p.a., 1.09137
Paraformaldehydlösung, mind. 37%., 1.03999.2500
Salzsäure (HCl) 1N, 1.09057.1000
Salzsäure (HCl) 2N, 1.09063.1000
Titrisol® Salzsäure 1N, 1.09970
Titrisol® Natronlauge 1N, 1.09956
Triton® X-100, 1086032500
Trypanblau (C.I. 23850) für die Mikroskopie; 1.11732
Wako Chemicals GmbH, Neuss, Deutschland
Anti-Iba1, Kaninchen 019-19741
9.2 Bezugsquellen für Geräte
Es
sind
nur
die
über
eine
Laborgrundausstattung
(insbesondere
eines
Histologielabors) hinausgehenden Geräte aufgeführt:
Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Deutschland (Vertriebspartner: Tierärztebedarf
J. Lehnecke GmbH, Schortens, Deutschland)
Skalpell, BB084-R
Klinge, BB522
Skalpell, BB073-R
Klinge, BB513
Baby-Metzenbaumschere gebogen, BC603-R
Irisschere gerade, BC110
Irisschere gebogen, BC111
Anhang
171
Pinzette anatomisch, BD 320-R
Pinzette anatomisch, BD215
Pinzette anatomisch gebogen, BD035-R
Agilent Technologies Sales & Services GmbH & Co. KG, Waldbronn
Deutschland (ehemals Stratagene®, Amsterdam, Niederlande)
Mx3005P® QPCR System
Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen, Deutschland
BioDoc Analyse
BIO-RAD Laboratories GmbH, München, Deutschland
Elektrophoresekammer und Zubehör: Mini-Protean-II-Cell, 165-2940
Xcluda® Aerosol Barrier Pipet Tips Style G, 211-2031
Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland
Multicycler® PTC 200
CEAG-Schirp Reinraumtechnik, Dortmund, Deutschland
Sterilbank
Consort N.V., Turnhout, Belgien
Mikrocomputer "Elektrophoresis Power Supply", E 425
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Zentrifuge 5417 R
Eppendorf Thermomixer compact, 5350 000.013
Pipette Reference 10 µl
Pipette Reference 100 µl
Pipette Reference 1000 µl
Pipette Research 20 µl
Pipette Research 200 µl
GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Deutschland (ehemals Amersham
Biosciences Europe GmbH)
Spektralphotometer GeneQuant™ pro
Hettich A., Tuttlingen, Deutschland
Kühlzentrifuge Rotina 48 RC
hilab.de Laborgeräte & Zubehör, Düsseldorf, Deutschland
172
Anhang
Schüttelwasserbad für Hin/Herbewegung GFL-1083
Holger Veith Handelsvertretungen, Westerau, Deutschland
Philips UV-Entkeimungslampe, TUV TL-D 15W G13 (G15T8), 1095100
IKA®-Labortechnik, Staufen, Deutschland
Vortexer VF2
Keutz Laborgeräte, Reiskirchen, Deutschland
Flachgel-Elektrophoresekammer "Midi", horizontal, 0030191-00
Gießvorrichtung, 0030191-03
Kleinfeld Labortechnik, Gehrden, Deutschland
Clean Air Sicherheitswerkbank
Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach, Deutschland
Wasserbad WB22
Wasserbad WB45
Merck Eurolab, Darmstadt, Deutschland
Test Tube Shaker, MELB 1719
Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Deutschland
Laborwaage PC180
Präzisionswaage LabStyle 204
Präzisionswaage PB3000
New Brunswick Scientific GmbH, Nürtingen, Deutschland
Innova 2000, Plattformschüttler
Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co KG, Gehrden, Deutschland
Magnetrührer IKAMAG® RCT,
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland
Exposure Control Unit PM30
Mikroskop IX 70
Netzmikrometerplatte U-OCMSQ 10/10, 034077
Roth, Karlsruhe, Deutschland
Glasplatten, 0513.1
Ohrenglasplatten, 0520.1
Spacer (0,75 mm Breite), N624.1
Anhang
Kämme (0,75 mm Dicke, 12 Taschen), N640.1
MINI-Blottingmodul, 0666.1
MINI-Vertikal-Doppel-Elektrophorese-Kammer, Y001.1
Elektrophorese-Netzgerät Typ 143, P004.1
Laufmodul, Y007.1
Gelgießmodul, Y008.1
Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091
Papierfaltenfilter 270 mm Durchmesser, FT-4-303-270
Vivaspin, Konzentratoren, VS02K-1
Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Parafilm M, P-7543
Zelldissoziationssieb, S0895
Zellschaber, C2802
Soft Imaging System, Münster, Deutschland
analySIS® 3.1.
Color view II, 3,3 Megapixel CCD
Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting, Deutschland
Omni TH Homogenisator
Wechselspitzen
Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland
Autoklav 3850 ELC
Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Deutschland
SlimLine-Gebläseeinheit, BOXUNCP04
SealSafe-IVC-Systemgestell, 2L96MAC20CA
H-Temp (Polysulfon) Käfig Eurostandard: Typ II L, 1284L00SUV
Edelstahl Gitterdeckel, 1284L189
H-Temp SealSafe Haube, 1284L452SU
Tränkeflasche 260 ml, ACBT0262
Tränkekappe, ACCP6521
Edelstahl-Kartenhalter, ACPC10575VS
173
174
Anhang
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland (ehemals ABgene®
Advanced Biotechnologies, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH und
Nunc™ GmbH &Co. KG, Wiesbaden, Deutschland; Vertriebspartner: LAT-Labor-undAnalyse-Technik GmbH, Garbsen, Deutschland und Omnilab-Laborzentrum GmbH &
Co KG, Gehrden, Deutschland)
HERAcell® 150 CO2 Incubator
Heraeus Function Line, Begasungsbrutschrank, BK5060
Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS
Heraeus Multifuge 1 S-R
Heraeus Wärmeschrank, ST6200
Heraeus Wärmeschrank, B6030
Heraeus Wärmeschrank, UT 6
Heraeus Zentrifuge Biofuge 13
HERAsafe Mikrobiologische Sicherheitswerkbank KS 18
Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens, Deutschland
Zählkammer Neubauer 3711-62-06
WTW Wissenschaftlich-Technische Werkstätten GmbH, Weilheim, Deutschland
pH-Meter inoLab®
Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen, Deutschland
Eismaschine ZBE 70-35
Zeiss, Oberkochen, Deutschland
Inverses Mikroskop Axiovert 10
9.3 Lösungen und Puffer
9.3.1 Lösungen und Puffer in der Molekularbiologie
Aqua Diethylpyrokarbonat (depc.)-behandelt :
1 ml DEPC-Reinsubstanz mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und schütteln.
16-24 h bei Raumtemperatur unter einem Abzug stehen lassen, danach
autoklavieren: 0,3 atü, 120°C, 20 Minuten.
Anhang
175
Ethidiumbromid (10 mg / ml):
0,2 g Ethidiumbromid mit Aqua bidest. auf 20 ml auffüllen und schütteln.
2 %iges ethidiumbromidhaltiges Agarosegel (104,3 cm²):
1,82 g Agarose werden in einem Glaskolben in 91 ml TBE-Puffer in der
Mikrowelle aufgekocht. Danach bis 64°C abkühlen lassen, 1,8 µl Ethidiumbromid
hinzufügen, mischen, in Gießkammer ausgeben und erstarren lassen.
TBE-Elektrophoresepuffer:
Für die Stammlösung werden 108,8 g Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 55,0 g
Borsäure und 40 ml 0,5M Na2-EDTA-Lösung mit Aqua dest. auf 1000 ml aufgefüllt
(Magnetrührer). Die Stammlösung wird autoklaviert: 0,3 atü, 120°C, 20 Minuten.
Gebrauchslösung aus 100 ml Stammlösung und 900 ml Aqua dest.
9.3.2 Medien und Puffer in der Zellkultur
Dissoziationslösung
9,1 ml PBS- mit 0,4 ml Trypsin-EDTA 0,5% (PAA Laboratories GmbH; entspricht
einer Endkonzentration von 22 mg/ml) und 0,5 ml DNase I (Roche Applied Science;
entspricht
einer
Endkonzentration
von
0,2
mg/ml)
mischen.
Dissoziationslösung reichen für ca. 6-8 neonatale Mausgehirne.
Paraformaldehyd
Material:
Lösung A: 0,2 M NaH2PO4 (24 g in 1000 ml Aqua bidest.)
Lösung B: 0,2 M Na2PO4 (28,4 g in 1000 ml Aqua bidest.)
Paraformaldehyd, reinst
Saccharose (für eine bessere Zellerhaltung)
Herstellung:
Aqua bidest (60°C)
25 ml
Paraformaldehyd
2g
NaOH (1N)
1-2 Tropfen
Die
10
ml
176
Anhang
Auf einem heizbaren Rührer mischen bis Lösung klar und durchsichtig wird.
Lösung B
20 ml
Lösung A
5 ml
Saccharose
2g
Den pH Wert auf 7,4 einstellen und vor Anwendung auf 37° C erhitzen.
Lagerung: bei 4 °C bis eine Woche zu lagern, bei kritischen Anwendungen frisch
(direkt vor Gebrauch) zubereiten!
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
Lösung A: PBSNaCl
8,00 g
KCl
0,20 g
Na2HPO4
1,15 g
KH2PO4
0,20 g
Aqua tridest
0,9 Liter
Den pH-Wert auf 7,2 einstellen.
Lösung B: Kalzium- und Magnesium-Lösung
CaCl2
0,10 g
MgCl2
0,10 g
Aqua tridest.
100 ml
Herstellung von PBS+:
Die Lösung A mit der Lösung B kombinieren, den pH-Wert auf 7,2 einstellen und in
sterile Flaschen filtrieren.
Poly-L-Lysin 10 mg/l (PLL)
Sigma P-1274
MW 128,100
Grad der Polymerisation: 593
Anhang
177
1. 6.18 g Borsäure mit 1000 ml Wasser mischen und einen pH von 8,4 einstellen.
2. Dazu 10 mg Poly-L-Lysin (PLL) geben und über Nacht bei 4°C rühren.
3. Die Lösung durch einen 22 µm Filter filtrieren und die Lösung bei 4°C
aufbewahren.
Sato’s Medium
Für 1 Liter Medium:
Ham’s F12 Nutrient-Mix
5,32 g
Hepes
2,38 g
DMEM Pulver
6,68 g
Brenztraubensäure
0,055 g
NaHCO3
2,438 g
Transferrin
0,005 g
Insulin (5mg/ml)
1,0 ml
Aqua tridest.
1000,0 ml
Glukose
6,000 g
L-Glutamin
0,0292 g
Penizillin-Streptomycin
1,250 ml
Putreszin
0,100 ml
Progesteron
0,020 ml
Selen
0,010 ml
vor Gebrauch :
(Phenolrot)
3,18 ml
Gentamicin
1,20 ml
Den pH-Wert auf 7,2 einstellen, in sterile Faschen filtrieren, und beschriften.
Trypanblau
0,2 g Trypanblau (C.I. 23850; VWR™ International GmbH) mit 100 ml PBS- mischen.
3.413
2.825
3.963
1.091
1.024
3.213
2.926
2.009
1.160
1.064
5.614
5.476
4.797
1.731
1.721
4.231
6.101
5.020
2.030
2.266
3.713
4.723
4.686
2.341
1.902
724
744
1.268
175
190
659
1.010
654
359
349
178
184
253
183
217
361
423
204
237
203
253
170
86
313
281
74
64
74
25
18
90
75
62
43
52
77
74
69
63
107
244
308
149
87
129
3.088
3.740
3.374
4.916
1.690
99
106
84
68
151
184
144
158
172
104
60
88
70
74
76
132
47
93
105
89
389
229
249
461
247
p50
5.143
914
3.440
6.477
2.654
5.177
6.476
3.824
3.513
3.044
1.669
2.406
4.869
3.556
2.502
.
.
.
.
.
10.317
7.866
5.244
10.162
6.747
p65
21.522
15.523
28.802
21.923
20.148
15.776
26.032
14.508
22.095
20.336
26.025
16.761
24.126
22.318
18.597
.
.
.
.
.
30.457
26.050
32.428
15.671
20.809
c-jun
87.157
89.857
145.753
112.682
75.149
114.856
94.727
64.157
161.802
88.704
100.781
69.621
79.410
73.466
42.112
.
.
.
.
.
128.792
95.855
136.580
70.871
67.508
7.323
10.443
14.093
7.757
7.314
1.981
4.482
2.572
7.474
3.805
6.099
4.554
6.155
5.988
2.959
.
.
.
.
.
9.711
13.325
16.170
18.368
10.918
1.593
1.017
3.123
3.042
812
2.886
3.036
4.945
2.116
5.019
3.628
1.392
2.490
3.308
3.977
.
.
.
.
.
3.898
1.061
1.950
1.669
639
c-fos Ets-1
p53
Max
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
.
.
.
.
.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
TNF IFN-γγ
29.677 39.041 2.374
26.497 35.595 1.513
31.435 59.716 1.772
29.164 57.948 1.412
15.148 62.882 1.132
19.158 36.802 1.099
28.146 63.494 1.382
17.207 39.095
922
24.538 48.884 1.625
19.859 43.929 1.382
28.774 24.475 1.640
21.239 13.245
906
14.892 68.927
878
19.655 111.726 1.204
17.321 39.316 1.042
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
29.358 59.210 4.229
33.829 32.652 2.645
35.840 47.036 3.193
30.347 100.903 2.299
26.333 69.844 2.131
Die Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF und IFN-γ wurde zum Zeitpunkt 72 Stunden nach
der Infektion nicht gemessen (.). n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
0
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
Zeit TMEV MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
der Infektion.
in nicht infizierten Astrozyten (Monokultur) 0, 6, 48, 72 (nur TMEV und MMPs) und 240 Stunden nach
Tabelle 9.1: Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen
178
Anhang
TMEV
404.149
571.397
623.886
601.855
875.617
22.530.836
24.849.068
20.458.523
19.758.511
26.271.495
10.913.798
9.713.381
12.564.665
11.207.741
11.059.396
1.246.676
1.573.839
706.513
568.019
528.998
3.147
3.597
3.450
1.454
1.619
4.601
5.543
6.080
1.633
2.255
4.963
5.565
6.134
2.396
1.945
5.140
7.589
2.557
4.497
2.747
880
863
1.074
365
427
982
2.040
1.958
491
1.034
20.068
14.017
14.115
4.074
3.147
3.818
4.077
1.296
2.096
2.144
112
102
106
54
54
253
416
394
69
269
2.085
1.740
2.040
2.303
1.767
5.657
5.129
3.498
2.459
1.442
116
66
197
105
227
71
173
261
83
249
1.903
1.657
1.142
1.728
879
1.578
1.858
2.111
2.331
3.041
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
p50
4.725
4.234
5.733
5.510
3.251
21.057
25.353
19.075
9.584
18.070
.
.
.
.
.
12.640
11.916
9.195
10.771
9.062
p65
c-jun
11.491 65.932
13.271 80.153
13.187 78.118
9.318
52.734
11.797 75.156
23.304 132.522
24.978 122.799
19.397 95.734
19.643 93.609
17.250 88.883
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
11.102 38.074
8.359
37.558
13.655 35.412
11.648 40.412
8.347
35.816
2.430
1.465
2.275
1.844
2.709
7.779
7.855
8.064
6.892
5.955
.
.
.
.
.
1.938
1.968
3.061
2.577
2.641
3.361
3.920
1.736
5.592
1.327
5.671
8.940
5.440
3.125
7.505
.
.
.
.
.
3.016
3.239
3.123
3.883
1.939
c-fos Ets-1
p53
12.877
14.586
11.602
10.838
10.761
21.309
18.584
9.241
15.050
15.221
.
.
.
.
.
13.949
12.385
14.730
14.208
13.639
Max
76.830
105.582
30.607
44.899
69.578
277.869
284.800
290.815
206.973
265.857
.
.
.
.
.
167.575
132.187
51.763
208.823
171.880
429
627
589
447
530
21.451
24.239
15.908
12.416
23.697
.
.
.
.
.
4.663
4.668
3.432
2.607
2.792
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
.
.
.
.
.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
TNF IFN-γγ
Die Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF und IFN-γ wurde zum Zeitpunkt 72 Stunden nach
der Infektion nicht gemessen (.). n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
Zeit
der Infektion.
in TMEV-infizierten Astrozyten (Monokultur) 6, 48, 72 (nur TMEV und MMPs) und 240 Stunden nach
Tabelle 9.2: Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen
Anhang
179
54
58
60
59
49
42
55
43
75
48
13
14
12
19
21
17
20
26
17
34
19
16
29
15
17
25
40
26
29
19
195
135
167
237
95
1.807
1.924
979
3.244
2.353
889
801
514
1.307
953
59
127
106
61
184
16.298
19.466
16.022
16.933
19.749
30.170
35.809
25.323
39.563
29.453
54.783
76.448
55.429
89.453
60.650
82.077
97.002
84.902
61.078
87.449
137.585
159.051
121.165
175.992
215.840
11.803
15.485
8.669
15.172
13.183
19.809
16.306
18.557
26.511
12.522
151.491
145.672
170.222
113.457
175.857
87.117
106.573
83.019
57.842
79.547
192.346
246.188
237.207
187.213
225.093
p50
15.412
22.241
12.005
13.793
14.578
23.398
23.150
20.526
29.205
29.487
9.801
12.554
8.271
9.020
7.755
.
.
.
.
.
6.052
9.866
9.762
7.302
8.948
p65
5.269
9.246
4.249
6.290
5.877
6.459
6.266
4.276
8.337
6.991
5.796
6.519
4.928
6.380
6.774
.
.
.
.
.
7.703
9.502
8.843
7.591
8.344
10.035
12.969
8.608
8.477
7.532
21.803
19.136
23.170
26.269
40.348
9.718
8.133
6.810
6.833
7.768
.
.
.
.
.
3.132
4.452
5.406
3.513
3.621
479
808
578
444
706
719
1.151
820
745
931
127
227
146
104
126
.
.
.
.
.
99
98
209
64
111
c-jun c-fos Ets-1
30.143
31.646
28.985
18.148
21.002
26.147
31.185
27.061
32.713
36.897
46.307
35.158
33.828
48.468
42.579
.
.
.
.
.
32.710
25.566
39.996
30.466
25.717
p53
3.391
5.252
3.520
3.106
3.926
2.730
2.678
4.450
3.824
5.166
2.740
3.714
1.789
1.778
1.925
.
.
.
.
.
3.863
7.137
5.937
5.267
4.346
Max
102.470
150.476
115.891
125.991
144.027
96.509
117.573
95.065
146.733
165.219
110.500
137.254
106.043
102.338
113.654
.
.
.
.
.
74.830
95.829
89.780
77.287
77.280
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
.
.
.
.
.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
TNF IFN-γγ
24.202
33.716
23.256
21.959
23.854
39.073
44.596
39.775
58.376
50.091
18.525
26.996
12.440
22.888
17.238
.
.
.
.
.
2.075
2.465
3.367
2.964
2.568
Die Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF und IFN-γ wurde zum Zeitpunkt 72 Stunden nach
der Infektion nicht gemessen (.). n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
0
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
Zeit TMEV MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
der Infektion.
in nicht infizierter Mikroglia (Monokultur) 0, 6, 48, 72 (nur TMEV und MMPs) und 240 Stunden nach
Tabelle 9.3: Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen
180
Anhang
99
38
79
91
61
20
21
28
18
29
24
24
30
30
33
16
14
14
10
11
229
133
160
71
187
544
222
303
323
160
297
252
230
465
437
24
32
28
55
34
20.036
13.471
13.686
11.709
19.949
20.102
16.477
21.211
15.864
15.716
20.341
19.368
34.400
40.195
30.529
80.375
86.517
114.622
90.478
81.965
21.385
16.513
15.309
21.431
22.109
89.767
66.275
70.669
65.366
79.492
59.528
51.274
64.170
76.541
69.563
37.610
38.463
66.065
39.003
56.199
38.086
24.683
26.701
21.127
29.162
6.175
8.986
9.238
10.547
13.332
.
.
.
.
.
7.997
10.502
7.704
6.858
7.909
p65
6.989
3.083
4.044
3.720
3.788
3.940
4.440
6.023
5.484
7.644
.
.
.
.
.
7.997
8.422
8.567
9.270
9.085
30.473
34.863
29.409
38.038
47.825
29.312
23.889
22.572
19.062
26.462
.
.
.
.
.
21.683
25.765
27.230
22.572
23.393
938
368
448
497
604
169
217
216
198
295
.
.
.
.
.
944
1.356
1.174
878
894
c-jun c-fos Ets-1
38.049
31.801
28.845
27.474
33.708
50.374
40.091
29.773
43.409
55.540
.
.
.
.
.
46.703
45.160
41.274
41.109
41.814
p53
10.176
7.191
5.554
6.066
9.505
4.165
3.431
3.369
4.204
5.148
.
.
.
.
.
5.026
6.612
5.529
7.581
6.399
Max
141.682
100.603
108.137
84.444
131.679
124.665
111.078
123.430
145.135
170.616
.
.
.
.
.
97.861
110.209
102.194
73.950
88.354
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
.
.
.
.
.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
TNF IFN-γγ
89.604
71.401
66.868
61.032
91.882
18.904
18.633
19.460
18.365
24.597
.
.
.
.
.
35.634
46.953
49.989
43.550
42.275
Die Genexpression von p50, p65, c-jun, c-fos, Ets-1, p53, Max, TNF und IFN-γ wurde zum Zeitpunkt 72 Stunden nach
der Infektion nicht gemessen (.). n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
3.851
1.832
2.079
3.219
5.503
1.339
1.309
2.570
652
4.228
137
40
64
55
95
0
2
1
0
1
Zeit TMEV MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12 p50
Stunden nach der Infektion.
Zytokinen in TMEV-infizierter Mikroglia (Monokultur) 6, 48, 72 (nur TMEV und MMPs) und 240
Tabelle 9.4: Absolute mRNS-Expression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und
Anhang
181
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
164.593
162.806
169.617
15.825.731
20.199.950
10.692.334
7.321.029
5.882.421
6.214.288
495.595
426.841
428.169
TMEV
Infektion.
n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
240
72
48
6
0
Gruppe Zeit
Kontrolle
TMEV-Infiziert
163
233
243
235
202
163
191
207
223
328
306
169
120
119
127
132
182
175
266
266
189
261
415
206
322
325
337
415
492
512
797
529
609
427
398
326
1.442
933
683
242
295
493
649
716
713
492
808
539
4.768
6.803
5.444
2.366
1.426
1.913
4
2
4
5
10
6
7
3
5
6
4
3
4
5
10
4
4
8
4
7
5
63
74
44
210
149
99
31
36
23
26
33
19
34
30
35
56
49
28
58
32
21
58
26
43
28
67
44
173
233
169
728
443
596
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
763
563
365
338
180
127
186
197
1.062
1.185
5.127
375
453
261
390
2.144
4.054
4.607
1.327
10.094
5.842
3.675
3.645
1.525
2.304
5.385
19.202
p50
900
550
797
647
334
244
232
434
918
1.298
3.759
819
781
641
744
1.342
1.398
2.373
1.402
3.608
2.261
1.963
3.490
1.306
706
2.007
5.037
p65
4.876
463
5.773
570
3.205
466
4.229
538
2.012
215
5.577
162
3.415
124
2.858
109
7.502
1.356
8.947
6.743
21.903 13.813
9.328
1.536
9.922
246
5.590
257
5.595
257
4.097
737
5.978
828
12.155 1.586
6.372
681
13.901 1.514
12.739
962
13.378
464
16.156
844
10.315
430
5.903
1.121
7.756
3.839
12.596 3.852
1.547
1.435
1.285
1.444
798
753
740
674
904
857
1.357
506
505
488
707
2.213
1.838
2.937
1.429
3.307
2.140
4.055
5.958
3.436
672
992
2.176
c-jun c-fos Ets-1
1.724
1.569
839
584
791
386
698
775
5.027
2.691
10.944
1.314
782
432
1.363
2.896
8.251
13.219
3.700
22.023
15.908
6.535
4.536
3.504
2.286
10.237
28.874
p53
1.629
1.998
1.544
1.786
1.400
1.048
1.472
2.054
2.414
3.777
3.752
2.077
2.095
3.103
2.211
2.409
1.397
2.478
2.076
4.336
2.103
1.491
3.942
2.620
1.828
2.572
4.329
Max
15
2
2
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
2
3
33
n.n.
2
n.n.
n.n.
22
17
35
73
871
730
223
212
157
24
91
523
TNF
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
IFN-γγ
in nicht infizierten und TMEV-infizierten Astrozyten (Kokultur) 0, 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der
Tabelle 9.5: Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen
182
Anhang
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
4.148
4.891
3.852
239.937
831.115
425.551
749.212
253.091
280.431
9.393
950
1.883
TMEV
Infektion.
n.n.: nicht nachweisbar.
240
72
48
6
240
72
48
6
0
Gruppe Zeit
Kontrolle
TMEV-Infiziert
14
20
17
11
13
19
n.n.
5
7
9
12
5
59
42
53
15
16
23
11
19
16
16
14
16
52
18
19
58
51
48
27
47
35
n.n.
82
n.n.
33
14
n.n.
79
67
102
123
34
85
12
32
39
239
257
574
254
29
142
442
294
380
328
309
235
763
1.263
808
473
512
287
766
1.131
1.004
319
326
198
272
291
415
772
955
793
1.558
1.531
1.269
47.433
29.837
44.284
45.508
42.144
31.774
41.365
39.234
42.283
61.400
62.202
59.973
56.959
50.110
47.014
45.488
50.576
37.446
45.806
37.201
45.298
25.546
17.385
26.728
1.316
830
1.278
MMP-2 MMP-3 MMP-9 MMP-12
2.497
1.843
973
767
1.159
1.874
1.286
2.964
2.751
1.240
1.474
796
1.385
2.099
2.098
2.934
3.614
4.315
6.199
3.504
27.220
6.876
3.015
18.958
9.679
3.058
4.289
p50
920
1.096
506
565
511
594
648
1.226
1.669
573
471
534
773
359
419
509
1.032
1.105
1.198
840
2.785
516
483
1.648
1.585
731
962
p65
5.907
2.468
3.748
1.291
8.339
1.408
6.721
2.804
7.004
4.521
1.449
3.943
4.884
2.692
5.487
3.123
4.803
3.057
4.466
4.169
7.607
4.885
8.427
2.641
11.964 1.789
12.108 3.354
12.174 4.168
5.862
6.817
10.020 6.152
10.828 7.018
11.959 4.472
16.234 5.744
18.141 12.168
15.093 2.630
10.057 1.979
17.256 3.721
11.164 11.149
7.437
6.832
9.083
8.476
238
132
132
236
244
52
27
110
132
167
170
193
295
51
50
84
204
276
93
145
255
27
31
113
489
399
531
c-jun c-fos Ets-1
Max
5.416
6.075
3.821
2.245
n.n.
2.770
1.413
3.338
2.844
3.387
2.385
2.631
n.n.
4.307
n.n.
2.729
8.459
4.753
3.325
2.962
827
3.079
1.122
3.190
1.201
4.536
2.755
3.986
2.910
4.046
5.768
4.093
7.570
2.965
9.894
3.558
6.711
6.940
3.143 13.944
12.593 8.623
1.699
6.382
2.218
5.431
6.447
7.289
11.499 3.936
6.339
3.565
8.789
2.882
p53
272
523
378
130
219
122
n.n.
n.n.
322
221
284
20
31
43
24
27
107
374
742
896
8.472
2.491
611
1.248
2.110
615
2.151
TNF
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
n.n.
IFN-γγ
in nicht infizierter und TMEV-infizierter Mikroglia (Kokultur) 0, 6, 48, 72 und 240 Stunden nach der
Tabelle 9.6: Absolute Genexpression (normalisierte Kopien / 10 ng RNS) von TMEV, MMPs, IEGs und Zytokinen
Anhang
183
184
Anhang
9.4 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD danke ich für die Überlassung des
interessanten Themas, die stets gewährte Unterstützung, die freundliche
Zusammenarbeit, die konstruktive Kritik und die ständige Ansprechbarkeit.
Herrn Jirawat Kumnok (Bo) möchte ich für seine ganze mühevolle Arbeit danken,
die er hier im Institut für Pathologie vollbracht hat und unglücklicherweise nicht
vollenden konnte. Ich wünsche ihm, dass er jetzt seinen lang gesuchten Frieden
gefunden hat.
Ich danke Kidsadagon Pringproa (Gorn) für seine Hilfe bei der Präparation der
zahlreichen Mäuse, die im Rahmen dieser Studie verwendet wurden und dafür
leider sehr früh aus dem Leben schieden.
Danuta Waschke und Julia Schirrmeier gilt mein Dank für die geduldige
Einführung in die Arbeitsmethoden der Zellkultur inklusive der zahlreichen
Besonderheiten und Tücken, ihre ständige Hilfsbereitschaft und die ausdauernde
Pflege zahlloser Zellkulturflaschen.
Herrn Dr. Konstantin Wewetzer möchte ich für zahlreiche hilfreiche Diskussionen
in der Interpretation von Zellkulturversuchen danken.
Mein besonderer Dank gilt meinen Arbeitskollegen und Freunden Christina, Ilka
und María für die ausgezeichnete Arbeitsatmosphäre im gemeinsamen Büro.
Allen
anderen
nicht
namentlich
erwähnten
Arbeitskollegen
möchte
ich
insbesondere für die vielen lustigen Gespräche und Anekdoten in der Mensa
danken, die das Leben in der Pathologie herzlich und angenehm gemacht haben.
Annika danke ich von ganzem Herzen für ihren unerschütterlichen Glauben an
den Sinn meiner Arbeit und die einzigartige Gabe, aus einer kleinen
Alltagssituation eine wunderschöne Begebenheit zu gestalten.
Meinen Eltern danke ich herzlichst für ihre ständige Bereitschaft, mich bei der
Lösung aller kleinen Probleme des Lebens bedingungslos zu unterstützen.
Anhang
185
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation “In vitro Expressions-Analyse von
Transkriptionsfaktoren muriner Astrozyten und Mikrogliazellen nach Infektion mit dem
Theiler-Enzephalomyelitis-Virus“ selbständig verfasst habe.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation am Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Hannover, den 24.04.2009
Ingo Gerhauser