Regulation of Synapse Formation and Synaptic Plasticity by

ZUSAMMENFASSUNG
IIIB. ZUSAMMENFASSUNG
Chemische Synapsen sind wichtige Strukturen, die eine schnelle und effiziente
Kommunikation zwischen Nervenzellen ermöglichen. Sie bestehen im zentralen
Nervensystem aus der Präsynapse, an der Neurotransmitter ausgeschüttet
werden, dem synaptischen Spalt und der postsynaptischen Membran mit den
passenden Neurotransmitter-Rezeptoren.
Neurone sind im zentralen Nervensystem (ZNS) von Gliazellen umgeben, dabei sind
speziell Astrozyten und ihre Fortsätze sehr nah an synaptischen Kontakten
lokalisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Astrozyten teilweise die Fähigkeit
besitzen, die synaptische Übertragung zu steuern. Ferner sind Moleküle, die von
Astrozyten produziert werden, in der Lage, die Formation und Reifung von Synapsen
zu kontrollieren. Dazu gehört zum Beispiel Cholesterol oder Moleküle der
extrazellulären Matrix (EZM), wie das Thrombospondin. Darüber hinaus gilt es als
sehr wahrscheinlich, dass weitere Mitglieder der Familie der EZM-Proteine wie die
Chondroitinsulfat Proteoglykane (CSPGs) und die Hyaluronsäure, an solchen
Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Aufgrund dieser Befunde
wurde in dieser Arbeit die Expression von CSPGs und interagierenden Molekülen
während zwei kritischer Phasen der Synaptogenese im Hippocampus untersucht.
Dabei konnte mit Hilfe der RT-PCR und der Immunhistochemie die Expression von
verschiedenen CSPGs, Hyaluronsäure und Tenascin-C im E18- und P9-Gewebe des
Gyrus Dentatus detektiert werden.
Es wurde auch der Einfluss von Chondroitinsulfat Proteoglykanen und der
Hyaluronsäure auf die Bildung von strukturellen Synapsen untersucht. Dafür wurden
zwei verschiedene in-vitro Kokultur-Systeme für die Kultivierung von E18 RattenHippocampusneurone und primären Astrozyten etabliert. Im “Mikroinsel-Model”, in
dem Neurone auf kleinen konfluenten Inseln von primären Astrozyten kultiviert
wurden, konnte ebenfalls die Expression von CSPGs, Hyaluronsäure und von
interagierenden Proteinen nachgewiesen werden. Im “Zell-Einsatz Kokultur System”
dagegen konnten hippocampale Neurone ohne direkten Kontakt zu primären
Astrozyten oder anderen Zellen für eine Zeitspanne von etwa drei Wochen kultiviert
werden. Nach 10 Tagen konnte eine gleichzeitige Expression von prä- und
postsynaptischen Proteinen dokumentiert werden. Zusätzlich deuteten viele
Kolokalisationen des präsynaptischen Proteins Bassoon und des postsynaptischen
Proteins ProSAP1/Shank2 auf die Bildung von strukturell intakten Synapsen hin. Es
wurde ein Software-basiertes Verfahren entwickelt, mit der man in der Lage ist, die
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ZUSAMMENFASSUNG
Anzahl der entstandenen synaptischen Punkte halbautomatisch zu quantifizieren.
Mit Hilfe dieser Technik konnte festgestellt werden, dass sich die Effizienz der
verschiedenen Zelltypen für das Überleben und die Bildung von Synapsen zwischen
hippocampalen Neuronen signifikant unterscheidet. Dabei konnte gezeigt werden,
dass ausschließlich primäre Astrozyten verschiedenen Ursprungs die Bildung von
strukturellen Synapsen fördern. Neben den strukturellen Synapsen konnte auch die
Bildung von perineuronalen Netzwerken verifiziert werden. Ferner konnte die
Präsenz des 473HD Epitopes, welches eine spezielle Chondroitinsulfat-Struktur
darstellt und des EZM-Glykoproteins Tenascin-C in diesen Netzwerken detektiert
werden. Um den Einfluss von speziellen glialen Molekülen auf die Synaptogenese zu
untersuchen, wurden die Kokulturen mit Hyaluronidase oder Chondroitinase ABC
behandelt. Diese Enzyme entfernen definierte Kohlenhydrat-Strukturen der EZM. Die
Behandlung mit beiden Enzymen erhöhte signifikant die Anzahl der strukturellen
Synapsen im “Zell-Einsatz Kokultur System”.
In beiden Systemen kann es sich initial bei vielen Synapsen um “stille Synapsen”
handeln. Deswegen wurde anschließend die Existenz und dann die Eigenschaften von
Miniatur exzitatorischen postsynaptischen oder miniatur inhibitorischen
postsynaptischen Strömen untersucht. So konnte durch Ganzzell-Ableitungen von
enzymbehandelten, im Vergleich zu Kontrollkulturen gezeigt werden, dass die
Chondroitinase ABC-Behandlung zu einer signifikanten Reduktion der Amplituden
führt. Ferner war auch die Ladung der Neurone in den behandelten Kulturen
signifikant erniedrigt. Andere gemessene Parameter der Miniatur exzitatorischen /
inhibitorischen postsynaptischen Ströme waren nicht signifikant verändert. Diese
Ergebnisse sind insofern relevant, weil während pathophysiologischer Zustände,
zum Beispiel in glialen Narben nach Verletzungen im ZNS vermehrt CSPGs
produziert werden. Dabei wirken CSPGs inhibitorisch auf den Auswuchs neuer
Neuriten. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass das Entfernen der
Chondroitinsulfat-Glykosaminoglykan-Ketten zu einer höheren Regeneration nach
Verletzungen im ZNS und zu einer gesteigerten Plastizität führen kann. Die
molekularen Mechanismen und die Konsequenzen solcher Behandlungen auf die
charakteristischen Eigenschaften von einzelnen Neuronen sind bis jetzt so gut wie
gar nicht untersucht. Die Bedeutung der Ergebnisse dieser Studie wird erst deutlich,
wenn man bedenkt, dass es geplant ist, Patienten, die eine Läsion im ZNS erlitten
haben, mit Chondroitinase ABC zu behandeln.
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