Telomerlängenverkürzung in nicht malignen peripheren Leukozyten

1
Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I
der Universitätskliniken, Homburg / Saar
Direktor: Prof. Dr. med. Michael Pfreundschuh
Telomerlängenverkürzung in nicht malignen peripheren Leukozyten
von Patienten mit
aggressivem Lymphom
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES GRADES
EINES DOKTORS DER MEDIZIN
der Medizinischen Fakultät der Universität des Saarlandes
Vorgelegt 2006
von Naim Taha
geboren in Petach Tikwa
2
Gewidmet
meinen Eltern und Ghadah Taha
3
Inhaltsverzeichnis
1.
Zusammenfassung
5
1.1
Summary
6
2.
Einleitung
7
2.1
Non-Hodgkin-Lymphome
7
2.2
Molekulargenetische Aspekte und virale Assoziationen
9
2.3
Die Verkürzung der Telomere und die Bedeutung des Enzyms
Telomerase
9
2.4
Fragestellung der Arbeit
12
3.
Material und Methoden
13
3.1
Chemikalien und Kits
13
3.2
Puffer und Lösungen
14
3.3
Geräte und Verbrauchsmaterialien
14
3.4
Patienten und Methoden
16
3.4 .1
Patienten
16
3.4.2
Zellzählung
16
3.4.3
Einfrieren und Auftauen von Zellen
17
3.5.
Aufreinigung und Vorbereitung der Zellen
17
3.5.1
Separation peripherer mononukleärer Zellen
17
3.5.2
Magnetische Zellseparation
18
3.5.3
Immunomagnetische Separation von B- und T-Lymphozyten
19
3.6
Isolation der Granulozyten
21
3.7
Immunologische Testverfahren
21
3.7.1
Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACScalibur)
21
3.7.2
Telomerlängenmesseung („Flow-FISH“)
22
3.7.3
Zellvorbereitung
24
3.7.4
DNS-Denaturierung
24
3.7.5
DNS-Hybridisierung
24
3.7.6
Waschschritte und DNS-Gegenfärbung
25
3.7.7
Analyse am Durchflusszytometer und Auswertung
26
3.7.8
Lineare Regressionsanalyse
28
3.8.
Statistische Auswertung
30
4
3.9.
Bestimmung der Telomeraseaktivität
31
3.9.1
Proteinisolation
31
3.9.2
Ansatz zur Messung der Telomeraseaktivität
31
3.9.3
Telomereverlängerung
32
3.9.4
Polymerse-Ketten-Reaktion (PCR)
32
4.
Ergebnisse
35
4.1
Die Telomerlänge in B- und T-Lymphozyten
35
4.2
Die Telomerlänge in Granulozyten
38
4.3
Messung der Telomeraseaktivität
39
5.
Diskussion
41
5.1
Telomerlängenanalyse von B- und T-Zellen
41
5.2
Die Telomeraseaktivität
42
5.3
Beeinflussung der Telomerdynamik von B- und T-Zellen
durch andere Faktoren
43
5.4
Schlussfolgerungen
45
6.
Literaturverzeichnis
46
7.
Danksagung
56
8.
Lebenslauf
57
5
1.
Zusammenfassung
Telomere sind die Enden aller linearen eukaryotischer Chromosomen, welche aus
repetitiven DNA-Sequenzen und aus spezifischen Proteinen bestehen. Die Funktion
der Telomere besteht im Schutz der Chromosomenenden vor Degradation, Fusion
und Rekombination. Für die vorliegende Arbeit wurde die Telomerlänge der B- und
T- Lymphozyten und Granulozyten von Patienten mit neu diagnostiziertem,
agressivem Lymphom analysiert.
Unsere Daten zeigen, dass bei diesen Patienten schon eine signifikante
Telomerverkürzung besteht, vor oder zumindest gleichzeitig zur Entwicklung eines
aggressiven Lymphoms. Im direkten Vergleich zeigen gleichaltrige gesunde
Normalpersonen längere Telomere in den untersuchten CD3+, CD19+ und
Granulozytenpopulationen. Aufgrund der Telomerverkürzung in allen Linien der
peripheren Leukozyten unserer Patienten einschließlich Granulozyten folgern wir,
dass die hämatopoietischen Stammzellen einer frühzeitigen Alterung unterworfen
sind, da die Telomerlänge in Granulozyten und der CD34+ hämatopoietischen
Stammzellen stark korrelieren.
Eine Telomeraseaktivität war bei 15% der B-Zellen unserer Patienten zu sehen
ebenso wie bei 20% der Kontrollgruppe, was einen immanenten Defekt der
Telomeraseaktivierung in den B-Zellen von Patienten mit aggressivem Lymphom als
Ursache der Telomereverkürzung unwahrscheinlich macht. Desweiteren entspricht
das Niveau der Telemeraseaktivität in den B-Zellen der Patienten oder der
Kontrollgruppe dem physiologisch niedrigen Niveau und ist wesentlich niedriger als in
leukämischen CD19+ B-Lymphoblasten, in welchen Telemerase konstitutionell
aktiviert wird. Somit konnte ein intrinsischer Defekt der Telomerase in der
Patientengruppe als Ursache der Telomereverkürzung ausgeschlossen werden.
Aufgrund
der
bisherigen
Ergebnisse
ist
von
einer
vorbestehenden
Telomereverkürzung bei den Patienten auszugehen, welche möglicherweise durch
erhöhte chromosomale Instabilität eine Rolle in der Lymphomentstehung spielen.
6
1.1
Summary
Telomeres form the ends of all linear eukaryote chromosomes which consist of
repetitive DNA-sequences and specific proteins. Telomeres serve to protect the ends
of the chromosomes from degradation, fusion and recombination. For the purpose of
this study the telomere length of B-, T- lymphocytes and granulocytes in patients with
newly diagnosed aggressive lymphoma was analysed.
Our data show that significant telomere shortening in these patients exists already
prior to or at least simultaneously with the development of an aggressive lymphoma.
In a direct comparison healthy persons of the same age show longer telomeres in the
examined CD3+, CD19+ and granulocyte populations. Due to the telomere
shortening in all lines of peripheral leukocytes of our patients we assume that the
hematopoietic stem cells are submitted to premature aging as the telomere length in
granulocytes and the CD34+ of the hematopoietic stem cells correlate well.
Telomerase activity was shown in 15 % of the B-cells of our patients as well as in 20
% of the control group which makes an immanent defect of the telomere activation in
the B-cells of aggressive Lymphoma unlikely to be the cause of a telomere
shortening. Furthermore, the level of telomerase activity in the B-cells of patients with
aggressive lymphoma or the control group corresponds to the physiologically low
level and is considerably lower than in CD19+ lymphoblasts, in which telomerase is
constitutionally activated. An intrinsic defect of telomerase could thus be excluded as
a cause of telomere shortening in the patient group. Telomeres in lymphoma patients
are prematurely eroded and may play a role in lymphomagenesis by contributing to
chromosomal instability.
7
2.
Einleitung
2.1.
Non-Hodgkin-Lymphome
Die malignen Lymphome lassen sich prinzipiell in 2 Gruppen einteilen: Non-Hodkgin
Lymphome und Hodgkin-Lymphome, die sich durch den Nachweis von Hodgkin- und
Sternberg- Reed-Zellen abgrenzen lassen (STERNBERG 1898, STEIN et al. 1999).
Die
Non-Hodgkin-Lymphome
umfassen
eine
klinisch,
biologisch
und
histopathologisch heterogene Gruppe von Erkrankungen (HARRIS et al. 1999),
deren gemeinsames Merkmal die Abstammung von den Zellen des lymphatischen
Systemes ist. Maligne Erkrankungen dieser Zellen manifestieren sich klinisch als
Lymphome
(mit
vorwiegendem
Befall
der
Lymphknoten),
Leukämien
oder
Plasmozytome.
Maligne Lymphome sind klonale Tumorerkrankungen, die von einer einzelnen, klonal
expandierenden Zelle des lymphatischen Systemes abstammen. Über 90% der
malignen Lymphome sind B-Zell-Lymphome, ca. 10% der Lymphome sind T- bzw.
NK-Zell-Lymphome (ARMITAGE et al. 1998). Der klinische Verlauf der indolenten
Lymphome ist eher protrahiert, generalisierte Krankheitsbilder sind die Regel, ein
leukämischer Verlauf ist häufig. Im Gegensatz dazu zeigen die aggressiven
Lymphome einen aggressiven klinischen Verlauf und gehen bei leukämischer
Präsentation
(Knochenmarkbeteiligung >25%) in akute lymphatische Leukämien
über.
Erste Symptome eines Non-Hodgkin-Lymphoms (NHL) sind fast immer schmerzlose
Lymphknotenvergrößerungen.
Diese
entstehen
durch
die
Vermehrung
von
Lymphozyten oder durch die Ansammlung von lymphknotenfremden (in der Regel
malignen) Zellen. Eine Eigenschaft der Lymphome ist, dass sie keine spezifischen
und manchmal nur sehr geringe Beschwerden verursachen, die auch bei weniger
schwerwiegenden
Erkrankungen
vorkommen.
Dazu
zählen
Müdigkeit,
Appetitlosigkeit, Übelkeit oder Sodbrennen sowie eine erhöhte Infektanfälligkeit.
Allgemeinsymptome (so genannte B-Symptome), wie etwa Fieber, Nachtschweiß
oder Gewichtsabnahme, finden sich in ca. 20% der Fälle und sind somit wesentlich
seltener als bei Patienten mit Hodgkin-Lymphomen.
8
Darüber hinaus treten vor allem bei follikulären und kleinzelligen Lymphomen und in
seltenen Fällen auch bei aggressiven Lymphomen klinische Symptome auf, die z.B.
durch eine Knochenmarkinfiltration (Befall des Knochenmarks) mit daraus folgender
Anämie ("Blutarmut"; Störung des Sauerstofftransports im Blut) oder Thrombopenie
(Verminderung der Blutplättchenzahl) verursacht werden. Eine Infiltration des
Knochenmarks wird in etwa 40 - 60% der Fälle beobachtet. Eine Infiltration (Befall)
der Haut ist bei NHL wesentlich häufiger als beim Hodgkin-Lymphom (insgesamt
aber selten) und auch Leber und Milz sind häufiger betroffen.
Nach mehrfachen Überarbeitungen wurde unter dem Dach der WHO eine
Klassifikation der Non-Hodgkin Lymphome erarbeitet, welche über 30 definierte
Subtypen enthält. (HARRIS et al. 1999).
Non-Hodgkin-Lymphome und Hodgkin Lymphome repräsentieren ca. 4-5% der neu
aufgetretenen hämatologischen Neoplasien in Nordamerika und Europa (Tendenz
steigend) (JEMAL et al. 2004). Die Ursachen für diesen – auch unabhängig von der
zunehmenden Verschiebung der Alterspyramide zu beobachteten Anstieg sind nicht
klar. Nachgewiesen ist jedoch eine altersassoziierte Zunahme der Inzidenz. Maligne
Lymphome stehen inzwischen an fünfter Stelle der Inzidenz bösartiger Erkrankungen
nach Brustkrebs, Prostatakrebs, Lungen- und Kolonkarzinom.
9
2.2
Molekulargenetische Aspekte und virale Assoziationen
Charakteristisch für die Non-Hodgkin Lymphome der B-Zellreihe ist die Translokation
eines Proto-Onkogens an die Gene der Immunglobulinrezeptoren. Bis zu 20% der
aggressiven Lymphom, vorwiegend vom zentroblastischen Typ, weisen die für
zentroblastisch-zentrozytische (follikuläre) Lymphome typische Translokation (t
14;18) mit Beteiligung des bcl-2 Gens auf. Die Translokation (t 8;14) mit Beteiligung
des myc-Onkogens liegt beim Burkitt-Lymphom vor.
Während das HTLV-1-Retrovirus (Human T-Cell Lymphotrophic Virus I) eine
pathogenetische Relevanz für einen Teil der T-Zell-Lymphome im ostasiatischen
Raum und der Karibik hat (HTLV-I-positives T-Zell-Lymphom/Leukämie) und etwa
5% der mit HTLV-I infizierten an einem Lymphom erkranken, scheint das HIV-Virus
nicht direkt an der Lymphomentstehung beteiligt zu sein (MANNS et al. 1999). EBV
DNA wird in 95% der Fälle des endemischen und zu einem geringen Prozentsatz bei
sporadischen Burkitt-Lymphom’s gefunden, wobei der Beitrag zur Lymphomgenese
unklar bleibt (YOUNG et al. 2003).
2.3
Die Verkürzung der Telomere und die Bedeutung des Enzyms
Telomerase
Telomere sind die körperlichen Enden der linearen eukaryoten Chromosomen. Sie
sind Nucleoproteinkomplexe, die chromosomale Enden vor Degradation schützen
(De LANGE 2002). Die repetitive Sequenz eines Telomers (TTAGGG)n wurde
erstmals bei dem Wimperntierchen Tetrahymena (Ciliata) beschrieben (BLACKBURN
und GALL 1978). Die Telomere menschlicher Chromosomen bestehen aus bis zu
2000
Wiederholungen
der
Sequenz
5'-TTAGGG-3'.
Aufgrund
der
Richtungsgebundenheit der DNS Synthese durch die Polymerase I (5’->3’) ergibt
sich jeweils am Ende der DNS Replikation während einer Zellteilung ein Verlust von
ca. 100 Basenpaaren, d.h. etwa 16 TTAGGG- Wiederholungen (HARLEY et al.
1990). Nach 125 Mitosen (16 x 125 = 2000) sind die Telomere dann theoretisch
aufgebraucht, wonach die Zelle sich nicht weiter ohne Verlust von genetischer
Information teilen kann (WATSON 1972). Bei der Replikation der DNS werden
zunächst die beiden komplementären Stränge mit Hilfe von Enzymen voneinander
10
getrennt. Jeder Einzelstrang wirkt jetzt als Matrize, an der ein neuer komplementärer
Strang gebildet wird. An die nun ungepaarten Basen der DNA lagern sich RNSStarter an, danach wird das Tochtermolekül mit Hilfe des Enzyms DNS-Polymerase
in 5'-3'-Richtung verlängert, indem sich anlagernde Nukleotide miteinander
verbunden werden (HARLEY et al. 1991).
Nicht ohne Grund wird daher die Länge der Telomere in Verbindung mit dem
Alterungsprozess gebracht, denn Zellteilung kann nicht unbegrenzt häufig ablaufen
und ist durch die Telomerlänge eingeschränkt (ALLSOPP et al. 1992, LEVY et al.
1992).
Je kürzer die Telomere sind, desto seltener können sich Zellen teilen und erneuern.
Die Limitierung der Zellteilungen im Rahmen von in vitro Experimenten bezeichnet
man als Hayflick-Limit (HAYFLICK 1961). Diese ist bei jedem Gewebetyp anders,
weil bei der Embryonalentwicklung die Telomeraseaktivität in den verschiedenen
Geweben zu unterschiedlichen Zeitpunkten abgestellt wird. Während in Körperzellen
die Verkürzung der Telomere und damit Alterung unvermeidlich zu sein scheint, wäre
sie in Keimzellen fatal, denn dadurch wäre eine Weitergabe von Erbinformationen
irgendwann nicht mehr möglich, weil die Chromosomen zu kurz geworden sind
(GREIDER et al. 1998). Dieser Gefahr beugt das Enzym Telomerase vor, ein
Ribonukleoprotein mit reverser Transkriptaseaktivität, das die Telomere vor der
Replikation verlängert. Das Gen für Telomerase ist beim Menschen hauptsächlich in
Keimzellen (HU et al. 1997, WENG et al. 1997), in hämatopoetischen Stammzellen
(WIDMANN et al. 2005), in T- und B-Zellen (NORRBACK et al. 1996, WENG et al.
1997), aber auch in Tumorzellen aktiv (KIM et al. 1994, SHAY & BACCHETTI 1997),
wobei die Aktivität mit zunehmender Reifung und Differenzierung der Zellen stark
abnimmt und schließlich erlischt (WRIGHT et al. 1996).
11
3`
5`
Replikationsrichtung
Matrizen Stränge
3`
DNS Polymerase
Replikationsgabel
5`
DNS Polymerase
OkazakiFragmente
DNS Ligase
Folgestrang
3` 5`
Leitstrang
3` 5`
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Endreplikation. Die getrennten
Elternstränge dienen den Polymerasen als Matrizen, als komplementäre Vorlagen.
Für den diskontinuierlich replizierten „nachfolgenden Strang“ werden für die
Polymerasen ständig sogenannte Primer (Okazaki-Fragmente) benötigt. Die Lücken
zwischen zwei DNS-Abschnitten werden durch die Ligase geschlossen. Allerdings
kann die einseitig begrenzte Lücke am 5´-Ende eines Tocherstranges nicht
geschlossen werden – der Strang bleibt verkürzt (modifiziert nach John-W. Kimball;
2005).
12
2.4
Fragestellung der Arbeit
Das Konzept der Telomerlänge als Marker für das Zellalter wurde erstmals 1992 von
ALLSOP et al. Anhand eines in vitro Modells etabliert. 1999 konnten RUFER et al. an
einem Kollektiv (N = 500) zeigen, dass die Telomerlänge von Lymphozyten und
Granulozyten in vivo kontinuierlich über die ganze Lebenszeit abnimmt. Im Laufe der
letzten
Jahre
konnte
für
viele
Tumoren,
auch
maligne
Lymphome,
eine
unphysiologische Verkürzung der Telomere in der Tumorzellpopulation gezeigt
werden (BRUMMENDORF et al. 2000, BRUMMENDORF et al. 2001, REMES et al.
2000, DeMARZO et al., 2003). Weitere wichtige Hinweise auf einen kausalen
Zusammenhang von Telomerlängenverkürzung und Lymphomgenese lassen sich
aus dem Telomerase-Knockout-Mausmodell ableiten (RUDOLPH et al. 1999). In
diesem Mausmodell zeigten Mäuse mit einer durch genetische Manipulation
herbeigeführten Störung der Telomerase eine kontinuierliche unphysiologische
Verkürzung der Telomere. Bei Beobachtung dieser Mäuse über 6 konsekutive
Generationen zeigte sich in der 6. Generation eine starke Verkürzung der Telomere,
begleitet
von
verschiedenen
Autoimmunphänomenen
sowie
der
spontanen
Entwicklung von Tumoren, vor allem malignen Lymphomen. Dabei konnte besonders
bei Leukozyten aus der 6. Generation der Telomerase-Knockout-Mäuse eine erhöhte
chromosomale Instabilität nachgewiesen werden. Dies ist ein wichtiger Hinweis auf
einen kausalen Zusammenhang von Telomerlänge und chromosomaler Instabilität.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Telomere in Leukozyten von Patienten
mit aggressivem Lymphom im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen als Hinweis
auf mögliche erhöhte chromosomale Instabilität verkürzt sind. Im Detail soll dabei
untersucht werden, ob eine Telomerlängenverkürzung bereits vor maligner
Transformation besteht. Weiterhin sollte geklärt werden, ob die Patienten eine
korrekte Telomeraseaktivierung zeigen. Es war also zu prüfen, ob eine Korrelation
zwischen der Telomerase-Aktivität und der resultierenden Längenveränderung an
den Telomeren besteht.
13
3.
Material und Methoden
3.1.
Chemikalien und Kits
Herstellerfirma
Firma Amersham Pharmacia Biotec
AB, Uppsala, Schweden
Verwendete Chemikalien
Ficoll-Paque
Firma Applied Biosystems,
Darmstadt
PNA-Probe, (5’) N-Terminal Single-Label
(FITC)
Firma Becton Dickinson, Heidelberg FACS-Flow, FACS-Rinse
Firma Caltag, Hamburg
FITC labelled beads Quantum 24
Firma DeltaSelect, Pfullingen
Aqua Spüllösung
Firma Exciton, München
LDS 751
Firma Gibco, Karlsruhe
Penicillin-Streptomycin,
Fetales Kälberserum (FCS)
HEK 293 Zellen
MACS CD19- und CD3-Reagent (Magnetic
beads)
Firma Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach
Becton Dickinson, Heidelberg,
Deutschland
Exciton, München, Deutschland
Firma PAA Laboratories, Linz,
Österreich
Anti-CD3FITC, Anti-CD19PE
LDS 751
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
(PBS) RPMI 1640
Firma Roche Group, Mannheim
SYBR Green I, MgCl2
Gibco, Karlsruhe, Deutschland
Firma Sigma-Aldrich, Steinheim
HEK 293 Zellen
Deionisiertes Foramid, Tris-Hydrochlorid
(TrisHCl), Dextran, MW 482 g/mol,
Ethylendiamintetraacetat (EDTA),
Polyoxyethylensorbitan Monolaurat (Tween 20)
Firma VWK, Darmstadt
Borsäure, Natriumchlorid, Dextrose,
Natriumacetat Natriumhydroxid, Hepes,
Trinatriumcitratdihydrat, Salzsäure 5 M,
Trypanblau, Acetessigsäure, Bovines
Serumalbumin (BSA), Dimethylsulfoxid
(DMSO)
14
3.2.
Puffer und Lösungen
Verwendete Puffer und Lösungen
Äqualibrierungspuffer
Zusammensetzung
5% Dextrose, 10 mM Hepes, 0,1 % BSA
Complete Medium (CM)
2,5 ml Penicillin-Streptomycin, 50 ml
FCS, 500 ml RPMI 1640 (1x)
Dextranlösung
3 % Dextran, 0,9 % NACl, auffüllen auf 1
Liter mit H2O
Einfriermedium
100 µl DMSO, 400 µl FCS, in Cryotubes
(Nunc), 1,8 ml
Hybridisierungspuffer I
75 % deionisiertes Formid, 20 mM NaCl,
20 mM Tris (pH 7,1), 1 % BSA
MACS-Puffer
0,5 % BSA, 2mM EDTA in 1 Liter PBS
Lösen und steril filtrieren
Wash-Lösung
75 % deionisiertes Formamid, 0,1 %
BSA, 10 mM Tris, 0,1 % Tween 20
3.3.
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Herstellerfirma
Firma Air liquide, Kryotechnik,
Düsseldorf
verwendete Geräte und Materialien
Stickstofftank Ranger
Firma Assistent, Sondheim
Kanülen Microlance Nr. 20
Firma Biometra, Göttingen
Heizblock TRIO-Thermoblock
Firma Bio-Rad Laboratories, München BioRad-Trocner Model 583 Gel-Dryer
Firma Eppendorf, Leipzig
Pipetten „Reference“,
Automatische Pipettierhilfe „Easypet“
Firma Griener bio-one, Frickenhausen Zentrifugenröhrchen, 5 ml
Firma Heidolph, Kelheim
Vortex Reax 2000
Firma Heraeus, Hanau
Firma Hermle Gosheim
Firma Igefa, Saarbrücken
Sterilbank Hera safe, Brutschrank Hera Cell
Zentrifuge, Z 383 K
Frischhaltefolie
Firma Kirsch, Offenburg
Kühlschrank
15
Firma KNF Neuberger Laboport,
Freiburg
Absaugpumpe
Firma Leica, Wetzlar
Mikroskop DMIL
Firma Mettler Toledo, Greiffensee
Waage P1210
Firma Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach
Vario-MACS, MS-Säulen, Filter 30 µm
Firma Nalgene, Rochester, NY, US
Sterilfilter, Cryo 1 °C Freezing Container
Firma Nunc, Wiesbaden
Einfrierröhrchen, -70 °C-Gefrierschrank
Advantage, 4-well-Platten Nunclon Surface
Firma Sarstedt, Nümbrecht
Zentrifugenröhrchen 50 ml, Pipettenspitzen,
serologische Pipetten 5 ml, 10 ml und 50 ml
Firma Roche Group, Mannheim
LightCycler-System
16
3.4.
Patienten und Methoden
3.4.1.
Patienten
Bei den Lymphompatienten handelte es sich um Patienten, welche aus dem
Studienkollektiv der Deutschen Studiengruppe für hochmalignen Non-HodgkinLymphome (=DSHNHL), rekrutiert sind. Diese Patienten willigten schriftlich sowohl in
die Teilnahme an einer klinischen Studie, als auch in die Durchführung
wissenschaftlicher Begleituntersuchungen ein. Die Einwilligungsbögen wurden
zentral bei der Studienkommission gesammelt und können dort angefordert werden.
Bei den gesunden Probanden handelte es sich um altersgleiche gesunde
Erwachsene, welche nicht an einer Tumor- oder Autoimmunerkrankung erkrankt
waren. Die schriftliche Einwilligung der Probanden wurde im onkologischen Labor
der Klinik und Poliklinik für Innere Medizin I aufbewahrt. Die Durchführung der
Blutentnahmen sowie die Datenspeicherung wurde von der lokalen Ethikkommission
genehmigt. Im Einzelnen lagen bei den Patienten folgende histologische Subtypen
vor: Diffus Großzellig n =
25, Folliculäres Lymphom Grad III n = 6,
Lymphoblastisches Lymphom n = 3, primäres mediastinales großzelliges Lymphom n
= 1.
3.4.2.
Zellzählung
Die Zellzählung wird in einer Neubauer-Zählkammer durchgeführt. Sie besteht aus
neun großen Quadraten mit einem Volumen von je 0.1 µl, von welchen 8 nochmals in
16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Zur Zählung wurden 10 µl Zellsuspension mit
dem gleichen Volumen 0.3 prozentige Trypanblaulösung gemischt und 10 µl dieses
Gemisches wurden zwischen Deckglas und Kammer pipettiert. Unter dem Mikroskop
wurden vier mal 16 Felder ausgezählt und der Mittelwert errechnet. Um die Zellzahl
pro Milliliter Zellsuspension zu ermitteln, wurde dieser Mittelwert mit dem
Verdünnungsfaktor und 104 multipliziert, wobei die durch Trypanblau angefärbten
toten Zellen bei der Zählung nicht berücksichtigt wurden.
17
3.4.3.
Einfrieren und Auftauen von Zellen
Die Proben der zu untersuchenden Zellen wurden in einem DMSO haltigen Medium
in Flüssigstickstoff gelagert. DMSO verhindert die intrazelluläre Ausbildung von
Kristallen und schützt die Zellen. Nach Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen
bei RT mit 1350 RPM für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das
Zellpellet mit 500 µl Complete Medium (CM) resuspendiert. 1 x 106 Zellen/ml wurden
unter der Sterilbank entsprechender Menge Einfriermedium resuspendiert und zügig
je 1.5 ml in Gefrierröhrchen, die auf Eis gelagert waren, pipettiert und die Zellen
sofort auf Eis gelegt. Die Gefrierröhrchen wurden in einer Einfriervorrichtung
langsam, mit ungefähr 1° C pro Minute bis auf -80° C abgekühlt. Anschließend
wurden
die
Gefrierröhrchen
für
die
langfristige
Aufbewahrung
direkt
in
Flüssigstickstoff überführt. Anonyme Angaben zur Person, Zellart, Datum und der
genaue Lagerort der Proben wurden in einer Datenbank gespeichert. Das Auftauen
der Zellen erfolgte möglichst rasch in 37° C Wasserbad, wonach die Zellen direkt in
das Kulturmedium gegeben wurden.
3.5.
Aufreinigung und Vorbereitung der Zellen
3.5.1
Separation peripherer mononukleärer Zellen
Die Isolation mononukleärer Zellen erfolgt aus heparinisiertem Vollblut mittels
Dichtegradientenzentrifugation. Als Trennmedium dient Ficoll-Paque mit einer
Dichte von 1.077 +/- 0.001 g/ml. Ungefähr 5 ml Blut wurden mit 4 ml RPMI 1640
verdünnt und vorsichtig in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf 4 ml Trennmedium
überschichtet. Die nach dem Zentrifugieren (2000 RPM; RT; 20 min) zwischen
Plasma und Trennmedium entstandene homogene Bande aus mononukleären Zellen
wurde abpipettiert. Bei der Zentrifugation von auf Ficoll-Paque liegendem Blut
konnten die Erythrozyten den dichten Ficoll-Paque durchdringen, wogegen die
restlichen Bestandteile (Lymphozyten und Monozyten) in den Schichten im oder über
dem Ficoll-Paque zurückgeblieben waren. Die Zellen wurden zweimal in CM
gewaschen und anschließend in der Neubauer-Zählkammer nach Färbung mit
Trypanblau gezählt.
18
Plasma
Mononukleäre Zellen
Ficoll-Paque®
Erythrozyten
Granulozyten
Thrombozyten
Abbildung 2: Schema zur Dichtegradientenzentrifugation. Durch Zentrifugation
mit Ficoll-Paque® von Vollblut kommt es zu einer Separation der mononukleären
Zellen von den polymorphkernigen Leukozyten und Erythrozyten.
3.5.2.
Magnetische Zellseparation
Die Isolierung entsprechender Zellpopulationen erfolgt durch immunomagnetische
Separation mittels supermagnetisierbarer Partikel (Mikrobeads). Dieses Trennsystem
arbeitet nach dem Prinzip der „high gradient“ -magnetischen Separation unter
Verwendung
Ziege-anti-Maus-IgG-Konjugierter
Anreicherung
von
Microbeads,
Maus-anti-Mensch-IgG-gebundenen
Zellen
welche
eine
aus
einer
Gesamtpopulation ermöglichen. Ein die Separationssäule mit einer Matrix aus
rostfreiem Edelstahl umschließendes Magnetfeld bewirkte die Anheftung der
partikelmarkierten Zellen an den dünnen Drähten der Stahlmatrix. Im Rahmen dieser
Promotionsarbeit wurden Mini-MACS-Zellseparationsgerät und MS-Säulen (Firma
Miltenyi; Kapazität 1 x 107 Zellen) verwendet. Die Reibungskraft des die Säule
durchfließenden MACS-Puffers eluierte die unkonjugierten Zellen (MILTENYI et al.,
1990).
19
3.5.3.
Immunomagnetische Separation von B- und T-Lymphozyten
Die Isolierung B- und T- Zellpopulationen erfolgte im Anschluss an die Separation
peripherer mononukleärer Zellen als sogenanntes positives Anreicherungsverfahren.
Dabei wurden die vorhandenen mononukleären Zellen mit einem für das jeweilige
Antigen (CD19 und CD3) spezifischen Antikörper markiert. Im Rahmen dieser Arbeit
wurden zunächst die B-Zellen und anschließend die T-Zellen isoliert. 1 x 107 Zellen
wurden mit je 80 µl MACS-Puffer resuspendiert, dann mit je 20 µl Microbeads (Ziegeanti-Maus-IgG,
Firma
Miltenyi
Biotec,
Bergisch
Gladbach)
vermischt
und
anschließend für 15 min bei 4 ºC inkubiert. Nach zweimaligem Waschen (10-20x
Zellsuspensionsvolumen) mit MACS-Puffer (1350 RPM, 10 min, 21 ºC) erfolgte das
Auftragen der Suspension auf die vorher mit 500 µl MACS-Puffer gewaschener
Separationssäule. Der Durchfluss wurde in einem 15 ml Gefäß gesammelt. Die
Säule wurde 3 Mal mit MACS-Puffer gewaschen. Danach wurde die Säule aus dem
Magnetfeld entfernt und in ein vorbereitetes 15 ml Gefäß platziert. 1000 µl MACSPuffer wurden nun mit Hilfe eines Säulentemels vorsichtig durch die Säule gedrückt,
die magnetisch markierten Zellen eluiert, nach Zählung in der Neubauer-Zählkammer
pelletiert und eingefroren. Nach dem gleichen Prinzip wurden CD3-positiven und
CD19-positiven Lymphozyten aufgereinigt.
Die Qualität der magnetischen Zellseparation wurde durch durchflusszytometrische
Analyse am FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelberg) mit PE-markierten antiCD3- und anti-CD19-Mab (Becton Dickinson) überprüft. Das Trennverfahren ergab
eine Reinheit der jeweils anzureichernden Populationen von > 90 %.
20
Aufreinigung aus PBMC
PBMC
Markierung
mit Mikrobeads-konjungierten AK
CD3 (T-Zellen)
CD19 (B-Zellen)
markierte PBMC
Sortierung
Vario-MACS
Positiv-selektionierte Zellen
( B-Zellen, T-Zellen)
unkonjungierte PBMC
Abbildung 3: Positive Selektion von B- und T-Lymphozyten. Die Isolation von
CD3+ T-Lymphozyten und CD19+ B-Lymphozyten erfolgte durch immunomagnetische
Separation mit an monoklonale Antikörper gekoppelte Mikrobeads.
21
3.6.
Isolierung der Granulozyten
Die Isolierung der Granulozyten erfolgt im Anschluss an die PBMC Separation aus
dem die Erythrozyten enthaltenden Pellet. Das in Abb. 1 gebliebene ErythrozytenGranulozyten-Pellet wurde mit gleicher Menge PBS aufgefüllt. Dann wurde
ebensoviel Dextranlösung hinzugefügt und gut gemischt. Die Erythrozyten nahmen
das Dextran auf und sinken dann auf den Boden des Gefäßes. Nach einer Stunde
Inkubationszeit in Raumtemperatur wurde der granulozytenreiche Überstand
abpipettiert und bei 1350 RPM für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde das
Pellet für 30 Sekunden in 2,5 ml 0,2 % NaCl resuspendiert. Dies bewirkte eine
hypoosmolare Lyse der restlichen Erythrozyten. Neutralisiert wurde mit 2,5 ml 1,6 %
NaCl, was wieder zu einer physiologischen Salzkonzentration von 0,9 % NaCl führte.
Die Granulozyten wurden dann bis zur Analyse in Gefrierröhrchen tiefgefroren.
3.7.
Immunologische Testverfahren
3.7.1.
Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie (FACScalibur)
Die Immunfluoreszenz besitzt gegenüber der Immunzytochemie den Vorteil, dass
viele Zellen getestet und keine Veränderung der antigenen Strukturen durch Fixative
hervorgerufen werden. Ferner erlaubt sie die Objektivierung und Quantifizierung der
Testergebnisse mittels Durchflusszytometrie.
Die Durchführung der Immunfluoreszenzanalysen und ihre durchflusszytometrische
Auswertung erfolgte unter leichten Modifikationen nach den Angaben von PARKIS et
al., (1986). Zur Analyse der mit dem ‚FACScalibur’-Durchflusszytometer gewonnenen
Daten wurde die Software des Herstellers angewendet (Cell Quest PR0, Becton
Dickinson, Heidelberg). Die zur Zellmarkierung verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
wurden durch
einen Argonlaser bei 488 nm angeregt. Die spezifischen
Emissionssignale wurden mittels Photodetektoren und ihnen vorgeschalteten Filtern
gemessen, wobei diese nur den für jeden Farbstoff charakteristischen Anteil des
Emissionsspektrums passieren ließen. Dieser charakteristische Bereich lag für
Fluorescein (Fluoresceinthiozyanat = FITC) bei 530 nm. Das aufgefangene Signal
erhielt eine über vier Dekaden reichende logarithmische Verstärkung.
22
3.7.2.
Telomerlängenmessung („Flow-FISH“
= Fluoreszenz in situ Hybridisierung)
Eine Methode der Telomerlängemessung ist eine Kombination aus Fluoreszenz in
situ Hybridisierung (FISH) und Durchflusszytometrie: Flow-FISH (RUFER et
al.,1998). Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Zellen in
Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften. Die
Kombination aus FISH und Durchflusszytometrie ermöglicht eine Aussage über die
Telomere in individuellen Zellen und bringt den Vorteil mit sich, dass auch ruhende
Zellen analysiert werden können. Zur Hybridisierung wird eine fluoreszenzmarkierte
Peptid-Nuklein-Acid
(=PNA)
Probe
verwendet.
Diese
bietet
gegenüber
konventionellen DNS-Sonden den Vorteil, stärker und spezifischer an die
denaturierten DNS-Einzelstränge zu binden. (EGHOLM et al., 1993). Im Falle des
Austausches des Strangrückgrats handelt es sich um nicht-natürliche Peptid- oder
Polyamid-Nucleinsäuren (PNA), deren Nucleobasen-tragendes Peptid-Rückgrat
jedoch
strukturell
dem
Nucleobasen-tragenden
Zucker-Phosphat-Rückgrat
natürlicher Nucleotide ähnlich ist (NIELSEN et al. 1991; EGHOLM et al. 1993). Der
Strukturvergleich zwischen beiden Nucleinsäure-Arten ist in Abb. 4 dargestellt.
23
Abbildung 4: Strukturvergleich von PNA und DNS. Eine Peptid-Nukleinsäure,
sog. PNA (peptide nucleic acid) ist ein DNS-analoges Molekül, in dem eine N-(2aminoethyl)glycin-Struktur die normale Zucker-Phosphat-Struktur des Rückgrats der
DNS ersetzt. Die Monomereinheiten (R) sind peptidisch verknüpft. B steht für die
Basen Thymin, Adenin, Guanin und Cytosin (modifiziert nach Egholm et al. 1993).
24
3.7.3.
Zellvorbereitung
Durch Äquilibrierung der aufgetauten zu untersuchenden Zellen in einem Dextrosehaltigen Puffer wird ein eine übermäßige Zellfragmentierung in den folgenden
Schritten des Protokolls, vermutlich durch die protektive Wirkung der Dextrose im
Hinblick auf den Zellmetabolismus (BAERLOCHER et al., 2001) verhindert.
Pro Untersuchung wurden zwischen 600.000 bis 1 Million Zellen benutzt, die zuvor in
Einfriermedium eingefroren waren. Zunächst wurden die Zellen auf 10 ml mit PBS
aufgefüllt und 7 Minuten bei 900 g zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 1 ml
Äquilibrierungspuffer resuspendiert. Es wurde dann nochmals für 7 Minuten bei 900g
zentrifugiert, danach wurde der Überstand vollständig abpipettiert. Es ist äußerst
wichtig, den Äquilibrierungspuffer ganz abzupipettieren, da ansonsten eine deutliche
Beeinflussung
der
Telomerlänge
bei
unklarem
Mischungsverhältnis
Äquibilisierungs/Hybridisierungspuffer-Puffer entsteht.
3.7.4.
DNS-Denaturierung
Die Zellen wurden in 100 µl Hybridisierungspuffer pro 100.000 Zellen vorsichtig und
blasenfrei resuspendiert. Die Lösung wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert,
was die Porenbildung der Zellen zur Folge hatte, um der Telo-PNA Sonde in einem
späteren Schritt die Penetration durch die Zellmembranen in den Zellkern zu
ermöglichen. Dann erfolgte die Denaturierung der Zellen im Heizblock bei 85° C
(Lymphozyten) bzw. 87° C (Granulozyten) für 16 Minuten. Die Proben werden für 2
min auf Eis gestellt und anschließend für 2 Sekunden zentrifugiert.
3.7.5.
DNS-Hybridisierung
Es
0,03
wurde
µg/100000
Zellen
Telo-PNA
zugegeben,
also
zu
einer
Endkonzentration von 0,3µg/ml und kurz mittels eines Vortex gemischt. Die Proben
wurden dann für 90 min in einer Dunkelkammer aufbewahrt. In dieser Zeit kann sich
die komplementäre Telo-PNA an die DNS anlagern, so dass alle Telomere mit TeloPNA besetzt sind.
25
3.7.6.
Waschschritte und DNS-Gegenfärbung
Die DNS Gegenfärbung ist eine interne Qualitätskontrolle und dient bei der
nachfolgenden durchflusszytometrischen Untersuchung der Identifizierung von so
genannten ‚Doubletten’, d.h. Ereignissen bei welchen das Durchflussytometer
fälschlicherweise zwei Zellen als singuläres Event erfasst, was aufgrund der in zwei
Zellen
doppelt
vorhandenen
Telomere
zu
einem
falsch
hohen
Telomerfluoreszenzsignal führt.
Die Proben wurden dreimal mit je 1 ml WASH-Lösung gewaschen (4200 RPM,
7min), um die nicht gebundene Telo-PNA auszuspülen. Der Überstand wurde bis auf
100 µl abgesaugt. Die Proben wurden dann mit 400 µl LDS 751, dem Farbstoff, der
sich in Dopplelstrang-DNS einlagert, für mindestens 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei 4° C bis zur Analyse gelagert.
Flow-FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung)
Zellseparation/-präparation
DNS-Denatuierung
Hybridisierung mit Telomer PNA-Probe
Waschschritte
DNS-Gegenfärbung
Anlayse am Durchflusszytometer
Abbildung 5: Prinzip der Telomerfärbung. Zusammenfassung der einzelnen
Schritte des Flow-Fish Protokolls zur Telomerlängenmessung.
26
3.7.7.
Analyse am Durchflusszytometer und Auswertung
Die Messung der Telomerlänge erfolgt durch quantitative Fluoreszenzmessung
anhand der hybridisierten, mit Fluorescein isothiocynate gekoppelten Telo-PNA an
einem FACSCalibur bei 488 nm mit Hilfe der Software CellQuest Pro. Um die
täglichen Schwankungen auszugleichen, wurden FITC (fluorescein isothiocynate)konjugierte Beads (Abbildung 6,7) benutzt, die jeweils definierte Mengen an
Fluoreszenz aufweisen, die sogenannten MESF (Molecules of equivalent soluble
fluorocrome). Diese wurden an jedem Messtag zusätzlich zu den Proben getestet.
Des Weiteren wurden die Ergebnisse in Relation zur Probe eines Probanden mit
zusätzlicher Negativkontrolle gesetzt, die an jedem Tag mitgemessen wurde. Die
Negativkontrolle wurde von den Messwerten abgezogen. Die Zellen können über die
Lichtstreuung im Dunkelfeld nach ihrer Größe (=FSC) und Granularität (=SSC)
beurteilt werden.
Abbildung 6: Darstellung von FITC-konjugierten Beads. Dargestellt ist die Größe
der
beads
(FSC,
Durchflusszytometer.
x-Achse)
und
deren
Granularität
(SSC,
y-Achse)
am
27
Um Daten bestimmter Experimente an verschiedenen Tagen zu vergleichen und um
die täglichen Schwankungen der einzelnen Komponenten des Durchflusszytometers
korrigieren zu können, wurden zu Beginn eines jeden Experiments FITC-markierte
Beads gemessen. Die Bead-Lösung enthielt fünf unterschiedliche FITC-markierter
Teilchen, die alle mit einer definierten Anzahl von Fluoreszenzmolekülen (molecules
of equivalent soluble fluorochrome, MESF) gekoppelt waren (Abbildung 7). Die vor
jedem Experiment gemessene mittlere Fluoreszenz für jeden der fünf verschiedenen
Fluoreszenzpeaks wurde benutzt, um eine Kalibrationskurve zu erstellen und so die
Umrechnung der gemessenen Fluoreszenzintensitäten in die Fluoreszenzeinheit
MESF zu ermöglichen. Zur Umrechnung der mittleren Telomerfluoreszenz von
Lymphozyten oder Granulozyten in MESF wurde ein Diagramm zur Umrechnung der
Kanäle erstellt (Abbildung 8). Außerdem wurden die Ergebnisse zur Probe eines
Probanden in Relation gesetzt, die an jedem Tag mitgemessen wurde.
Abbildung 7: Fluoreszenzintensitäten der fünf FITC-konjugierten Beads.
Dargestellt ist auf der X-Achse die FITC Fluoreszenz (logarhythmisch, Angabe in
Kanälen = Channel) sowie die Anzahl der detektierten Beads auf der Y-Achse. Die
einzelnen Beads konnten klar anhand der definierten Fluoreszenz unterschieden
werden.
28
350000
300000
250000
MESF
200000
150000
100000
50000
0
-50000
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Channnel
Abbildung 8: Eichgerade für die Auswertung der Flow-FISH Messergebnisse.
Umrechnung der Channel-Werte (sind auf der x-Achse aufgetragen) zu MESF (= YAchse) durch die Messung der FITC-konjugierte Beads. Abgebildet ist die
resultierende Regressionsgerade: y = 1019,8x – 2753,5 ; R²=0,9996.
3.7.8.
Lineare Regressionsanalyse
Mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse bestimmten wir den bp-Verlust pro Jahr in
Patienten und gesunden Probanden. Jeder Wert der Telomerlänge, der in
Basenpaaren ermittelt wurde, wird gegen den Wert, der mit der FACS-Methode in
MESF gemessen wurde, aufgetragen. So kann eine Regressionsgerade ermittelt
werden; mit deren Hilfe sich Basenpaaren in MESF-Einheiten umrechnen lassen
(Abbildung 9).
29
Telomerlänge in Basenpaaren
10500
10000
9500
9000
8500
8000
7500
18000
20000
22000
24000
26000
28000
30000
Telomerelänge in MESF
Abbildung 9: Korrelation der per FlowFISH und per Southern Blot gemessenen
Telomerlänge. Die Telomerlänge jedes einzelnen der 12 Probanden (gemessen in
der Southern Hybridisierung) wurde gegen die in der Flow-FISH-Methode
gemessenen Werte aufgetragen. Die Korrelation lag bei R = 0,76. Die
Regressionsgerade hat die Formel f(x) = 3070 + (0,24*x), x wird für die MESF
eingesetzt.
Die mittlere spezifische Telomerfluoreszenz der Lymphozyten bzw. Granulozyten
wurde durch Subtrahieren der durchschnittlichen Fluoreszenz der Leerwerte
(Probenansatz
ohne
PNA-Telomerprobe)
von
den
durchschnittlichen
Fluoreszenzwerten des gleichen, aber mit der FITC-markierten PNA-Probe
(„Telomere“) hybridisierten Probenansatzes ermittelt (Abbildung 10), wobei die
Granulozyten allerdings eine höhere Eigenfluoreszenz als die Lymphozyten zeigen.
Um die Telomerlänge in bp angeben zu können, müssen gleiche Proben per
FlowFish und Southern Blot bestimmt werden.
30
Abbildung 10: Beispiel der Histogramme zur Darstellung der am FACS
gemessenen
Fluoreszenzintensitäten.
Das
rote
Histogramm
stellt
die
Fluoreszenzintensität der mit der Telomersonde markierten Zellpopulation dar, das
weiße Histogramm die Autofluoreszenz der Negativkontrolle.
3.8.
Statistische Auswertung
Um die Korrelation der Telomerlängen von Granulozyten und Lymphozyten
zueinander zu ermitteln, wurde der Pearson-Korrelationskoeffizient ermittelt. Die
statistische Auswertung erfolgte mit den Programmen SigmaPlot, SigmaStat und MS
Excel. Es wurde eine lineare Regressionsanalyse für den Vergleich (Granulozyten,
CD19, CD3) von Patienten und Probanden
durchgeführt. In der einfachen
(bivariaten) linearen Regressionsanalyse wird der Einfluss einer unabhängigen
Variablen X (Synonyme: Regressor, exogene Variable) auf eine abhängige Variable
Y (Synonyme: Kriterium, Regressand, endogene Variable) untersucht. Die
Kausalitätsrichtung (Bestimmung der Variablen als unabhängig, bzw. abhängig) wird
theoretisch festgelegt und geht der Regressionsanalyse voraus. Des Weiteren wird
eine lineare Beziehung zwischen der bzw. den unabhängigen Variable(n) und der
abhängigen Variable vorausgesetzt (BALTES-GÖTZ, 2005). Mit Hilfe des Fisher
exact Tests wurde die Hypothese bei Größen n < 5 überprüft. Das Signifikanzniveau
wurde auf 5% (p<0.05) festgelegt. Die Korrelationen wurden mit linearer
Regressionsanalyse untersucht.
31
3.9.
Bestimmung der Telomeraseaktivität
Die Telomeraseaktivität wird über eine enzymatische Reaktion in Verbindung mit
einer Amplifikation durch PCR bestimmt (WIDMANN et al., 2005). Dabei wird die
zytoplasmatische Proteinfraktion der entsprechenden Zellen isoliert (enthält das
Enzym Telomerase) und zusammen mit einer telomeregleichen Matrize (welche
gleichzeitig als Primer für die anschließende PCR fungiert) für 30 Minuten bei 30
Grad Celsius inkubiert. Direkt im Anschluss erfolgt die Amplifikation der durch
Telomerase verlängerten Matrizen im Rahmen einer Real-Time PCR. Der gesamte
Reaktioszyklus (Enzymatische Reaktion und PCR) erfolgt in einem geschlossenen
Glaskapillarensystem, welches für die Durchführung der PCR mit Hilfe des
LightCycler Instruments (Roche) vorgesehen ist.
3.9.1
Proteinisolation
Die schockgefrorenen Zellen (1-2 x 106) wurden in 50 µl CHAPS- Puffer (+ 1µl
RNase-inhibitor) resuspendiert und anschließend bei 4° C für 30 min inkubiert. Die
Zellsuspension wurde dann für 30 min bei 12000 RPM und 4° C zentrifugiert. Das
Zelllysat wurde abpipettiert und bei -20° C bis zur Analyse eingefroren.
3.9.2
Ansatz zur Messung der Telomeraseaktivität
Die äquivalente Menge an Protein aus 1000 Zellen der zu untersuchenden
Zellfraktion wurde mit DNA-Polymerase (FastStart DNA Master SYBR GreenHot,
enthält SYBR Green sowie Oligonucleotide), Magnesium sowie den Primern TS
(Sequenz: 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3', KIM et al., 1997) und ACX (Sequenz:
5'-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3', KIM et al., 1997) inkubiert.
Protokoll:
- 0,4 µl MgCl2 (25 mM)
- 2,0 µl LightCycler – FastStart DNA Master SYBR Green Ι
- je 1 µl TS und je 1ul ACX Primer
- Proteineluat von 1000 CD19+ Zellen (enthält Telomerase)
- A.dest (PCR Grade) ad 20 µl
Alternativ wurden anstatt der Proteine aus CD19+ Zellen als Kontrollen zugegeben:
32
- 0,8 µl HEK 293 (1000 Zellen) (Positivkontrolle mit Telomeraseaktivität)
- 0,8 µl HEK 293 (1000 Zellen) hitzeinaktiviert (Negativkontrolle ohne
Telomeraseaktivität)
3.9.3
Telomerverlängerung
Die Telomerverlängerung bei vorhandener Telomeraseaktivität erfolgte in einem
Brutschrank bei 30 Grad Celsius für exakt 30 Minuten in den Glaskapillaren. Danach
wurden die Glaskapillaren unmittelbar in das Lightcyclersystem übergeführt. Zur
Vermeidung weiterer Verlängerung des (telomergleichen) Primers TS erfolgte
zunächst als erster Schritt eine Hitzebehandlung mit 95 Grad Celsius für 10 Minuten,
was zur irreversiblen Denaturierung der Telomerase führte. Gleichzeitig wurde
dadurch die im FastStart Mix enthaltene Polymerase aktiviert.
3.9.4
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Das Prinzip der PCR basiert auf einem dreiteiligen Reaktionszyklus (Denaturierung,
Annealing und Amplifikation), welcher mehrfach durchlaufen wird. Die Vorteile dieses
REAL-Time PCR-Assays zur Telomerasebestimmung gegenüber älteren Methoden
liegen im Verzicht auf radioaktiv-markierten Komponenten, einer deutlich verkürzten
Analysezeit, verbesserte Sensitivität und Effektivität (HOU et al., 2001). Die
Quantifizierung des PCR Produktes erfolgt in den Glaskapillaren (fluorimetrische
Bestimmung). Das optische System aus einer blauen High-Performance-Diode
(blaue LED) als Energiequelle, die mit einer Wellenlänge von 470 nm +/- 40nm die
Proben zur Fluoreszenz anregt. Das emittierte Licht der Proben wird über Spiegel
und einen Photomultiplier in einen der drei Analyskanäle geleitet, in dem die
emittierte Wellenlänge der Probe analysiert wird (WITTWER et al., 1997a; WITTWER
et al., 1997b).
Im ersten Schritt wurde bei einer Temperatur von 95° C (20 Sekunden) die Template
DNS denatuiert (Auseinanderweichen der beiden komplementären Einzelstränge).
Danach wurde der Reaktionsansatz auf die Annealing-Temperatur abgekühlt (60
Grad, 30 Sekunden). Zuletzt erfolgte bei einer Temperatur von 72° C (50 Sekunden)
durch das Enzym Polymerase die von den Oligonukleotiden ausgehende DNS-
33
Dopplelstrangsynthese.
Dieser
dreiteilige
Zyklus
wurde
insgesamt
35
Mal
durchlaufen.
Zur Minimierung von Kontamination wurden sämtliche Reagenzien unter der sterilen
Werkbank mit einem ausschließlich für PCR reservierten Pipettensatz pipettiert.
Weiterhin wurde bei der Durchführung der PCR die räumliche Trennung von PCR
Maschine, Endprodukten und Pipettierplatz praktiziert, um eine Rückkontamination
von amplifiziertem PCR Produkt in die Pipetten zu vermeiden. Alle Proben wurden
zweimal gemessen (Doppelbestimmung) und daraus der Mittelwert gebildet. Die
Quantifizierung der Telomeraseaktivität der einzelnen Proben erfolgte durch
Vergleich mit der Telomeraseaktivität von HEK 293 Zellen nach Etablierung einer
Standardkurve mit aufsteigender HEK 293 Zellzahl (Abbildung 11). Anhand der
jeweiligen Schmelzkurven der PCR Produkte wurde die Zellzykluszahl ermittelt, bei
der erstmals messbares PCR Produkt im Rahmen der Amplifikation auftrat. Ein
positives Ergebnis einer Telomeraseaktivität in peripheren (B-) Lymphozyten wurde
als ein über der dritten Standardabweichung des Mittelwertes aller Negativkontrollen
liegendes Signal definiert. Daraus konnte das Verhältnis zwischen den zu
analysierenden Proben und den HEK 293 Zellen bestimmt werden. Somit konnte die
Telomeraseaktivität der zu analysierenden Proben relativ zu den HEK 293 Zellen
angegeben werden. Dabei entsprach eine Aktivität von 100% in B-Lymphozyten der
gleichen Telomeraseaktivität von 1000 HEK 293 Zellen. Die Standardkurve der HEK
293 Zellen zeigte eine logarhythmische Beziehung von Zellzahl zu PCR Produkt
(entsprechend Telomeraseaktivität) innerhalb von 2 Logstufen (R2 = 0,997) nach der
Formel y = yo * ln(a)-x. Yo entsprach dabei der Zyklenzahl bei 0 HEK 293 Zellen, x
der zu errechnenden Zellzahl, y der gemessenen Zyklenanzahl während der PCR
und a der Geradensteigung. Nach Auflösung der Gleichung nach x konnte anhand
der für jede Probe gemessener Zyklenanzahl im Rahmen der PCR die
Telomeraseaktivität der Probe im Verhältnis von HEK293 Zellen gleicher
Zyklenanzahl bestimmt werden.
34
30
29
Zyklus
28
27
26
25
24
23
22
1
10
100
1000
10000
Zellzahl Hek 293
Abbildung 11: Standardkurve zur HEK 293 Titration. Dargestellt sind auf der XAchse die Anzahl der für die Telomerasequantifizierung eingesetzten HEK 293
Zellen (logarthythmisch) in Beziehung zum Auftreten der PCR Produkte anhand der
Zellzykluszahl (y-Achse) während der Real-Time PCR.
35
4.
Ergebnisse
4. 1.
Die Telomerlänge in B- und T-Lymphozyten
Die Telomerlängenkinetik in peripheren Blutzellen spiegelt den zellulären Umsatz im
Stammzellkompartiment des Knochenmarks wieder. Bei Erkrankungen wie dem
NHL findet sich eine Reduktion der Telomerlänge in den Lymphomzellen, welche in
beiden Fällen mit der Schwere und Dauer der Erkrankung sowie mit deren
Ansprechen
auf
Therapie
korreliert
(REMES
et
al.,
2000).
Telomerlängenmessung in der vorliegenden Untersuchung erfolgte in CD19+
Lymphozyten
und
CD3
+
T-Lymphozyten
bei
35
Patienten
im
Alter
Die
Bvon
durchschnittlich 58,2 Jahren mit neu diagnostiziertem aggressivem Lymphom und
gleichaltrigen Probanden (Mittelwert 58,5 Jahre). In der Abbildung 12 und 13 wurden
die Mittelwerte der Telomerlängenbestimmung von CD19+ B-Zellfraktion und CD3+
T-Zellfraktion der Lymphompatienten mit den Telomerlängen der Kontrollgruppe
gegeneinander aufgetragen. Das Diagramm (Abbildung 12) der CD19+ B-Zellfraktion
zeigt, dass in der Kontrollgruppe die Telomere im Durchschnitt 750 bp länger
gegenüber der Lymphompatienten sind (p=0,001). In der CD3+ T-Zellfraktion
(Abbildung 13) waren die Telomerlängen der Patienten ebenfalls signifikant (ca. 730
bp, p=0,002) verkürzt. In dieser Arbeit zeigten Patienten mit aggressivem Lymphom
und gesunde Kontrollen längere Telomere in ihrer CD19+ B-Zellfraktion im Vergleich
zu ihrer CD3+ T-Zellfraktion. Der mittlere Unterschied für Lymphompatienten war
1780 bp (p<0,001) und 1650 bp (p<0,001) für Kontrollspender.
36
35000
Telomerelänge (MESF)
30000
25000
20000
15000
10000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Alter (Jahre)
Abbildung 12: Telomerlänge in CD19+ B-Zellfraktion von Lymphompatienten
(helle Kreise) und
gesunde Kontrollen (schwarze Kreise). Telomerlängen
gemessen an n=35 Lymphompatienten und gleichaltrigen gesunden Kontrollen im
Alter von 22 und 82 Jahren mit der Flow-FISH-Methode. Die Abbildung zeigt, dass in
der Kontrollgruppe die Telomere über den gesamten Altersbereich länger als bei den
Lymphompatienten sind (p=0,001).
37
28000
26000
Telomerelänge (MESF)
24000
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Alter (Jahre)
Abbildung 13: Telomerlänge in CD3+ T-Zellfraktion von Lymphompatienten
(helle Kreise) und gesunde Kontrollen (schwarze Kreise). Die mit der Flow-FISH-
Methode gemessen Telomerlängen von n=35 Lymphompatienten und gleichaltrigen
gesunden Kontrollen im Alter von 22 und 82 Jahren. Innerhalb der CD3+ TZellfraktion waren die Telomerlängen der Lymphompatienten ca. 730 bp im
Durchschnitt kürzer als die der Kontrollgruppe (p=0,002).
38
4.2.
Die Telomerlänge in Granulozyten
Zum Vergleich der Telomerlängen in den Lymphozyten wurden außerdem die
Telomerlängen in den Granulozyten der gleichen Patienten und gesunden
Probanden untersucht (n=18, Mittelwert 58,3 Jahre für Patienten, 58,6 Jahre für
gesunde Probanden). Interessant dabei ist, dass auch die Telomerlänge in den
Granulozyten im Durchschnitt ca. 580 bp (p=0,011) kürzer in der PatientenZellfraktion ist (Abbildung 14).
30000
Telomerelänge (MESF)
28000
26000
24000
22000
20000
18000
16000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Alter (Jahre)
Abbildung
14:
Telomerlänge
in
Granulozyten
von
Lymphompatienten
(schwarze Kreise) und gesunde Kontrollen (helle Kreise). Die Telomerlänge in
den Granulozyten der Patienten-Zellfraktion ist über das gesamte Alter signifikant
kürzer als in den gesunden Kontrollen (p=0,011).
39
4.3.
Messung der Telomeraseaktivität
Die Fähigkeit von Tumorzellen im Gegensatz zu normalen menschlichen Zellen, ein
uneingeschränktes Wachstumspotential zu erlangen, wird durch die Expression bzw.
Reaktivierung der Telomerase und die daraus entstehende Möglichkeit der
Telomerstabilisierung
erreicht.
Wir
analysierten
in
unserer
Arbeit
die
Telomeraseaktivität in den CD19+ Lymphozyten bei 20 Patienten mit aggressivem
Lymphom und 25 gesunden Probanden, weiterhin verwendeten wir 6 Fälle von
CD19+ Lymphoblasten (Abbildung 15 und Tabelle 1). Es zeigte sich, dass 3/20 Fälle
(15%) von peripheren B-Lymphozyten der Lymphompatienten eine niedrige
Telomeraseaktivität
besitzen.
Im
Vergleich
zur
Telomeraseaktivität
der
Kontrollgruppe ist dieses Ergebnis statistisch nicht signifikant, hier war eine
Telomerase-Expression in 5/25 Fälle (20%, Fisher exact test, p=0,69) nachweisbar.
Die relative Telomeraseaktivität in peripheren CD19-Lymphozyten zeigte keine
Unterschied
zwischen
den
Patienten
und
den
Kontrollen
(5.7%
für
Lymphompatienten gegenüber 7.9% für gesunde Kontrollen; p=0,45).
Im Gegensatz dazu zeigten alle analysierten CD19+ Lymphoblasten (n=6) eine hohe
Telomeraseaktivität im Vergleich zu peripheren CD19+ Lymphozyten von gesunden
Probanden und Lymphompatienten (p < 0,001). Die CD19+ Lymphoblasten zeigten
sogar eine höhere Telomeraseaktivität als die HEK 293 Kontrollzelllinie.
Tabelle 1: Nachweis der Telomeraseaktivität bei Patienten mit aggressivem
Lymphom und gesunden Kontrollen.
Telomeraseaktivität
keine Telomeraseaktivität
Aggressive Lymphome
3
17
Gesunde Kontrollen
5
25
Lymphoblasten
6
0
Ein
qualitativer
Nachweis
von
Telomeraseaktivität
konnte
bei
Lymphompatienten und 5/30 gesunden Kontrollen geführt werden (p=0,69).
3/20
40
Relative Telomeraseaktivität (%)
200
150
100
50
0
hgNHL
Kontrollen Lymphoblasten HEK 293
Abbildung 15: Relative Telomeraseaktivität in CD19+ Lymphozyten von
Lymphompatienten und von gesunden Personen. Die Telomeraseaktivität in %
als relative Telomeraseaktivität ist im Vergleich mit der HEK 293 Kontrollzelllinie
dargestellt.
Lymphompatienten
und
gesunde
Kontrollen
hatten
geringe
Telomeraseaktivität. CD19+ positive (leukämische) Lymphoblasten hatten eine
bedeutend höhere relative Telomeraseaktivität als periphere CD19-Zellen von
Lymphompatienten (p<0,001) oder von Kontrollen (p<0, 0001).
41
5.
Diskussion
5.1.
Telomerlängenanalyse von B- und T-Zellen und Granulozyten
In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass deutliche Unterschiede der
Telomerlängenverteilung in
B- und T-Lymphozyten zwischen den Patienten mit
aggressivem Lymphom einerseits und gesunden Probanden anderseits bestehen.
Dies ist der erste systematische Ansatz zur Untersuchung der Telomerlänge in nichtneoplastischen B-Zellen, aus denen sich Lymphome entwickeln.
Die Messung der Telomerlängen in peripheren B-CD19+- und T-CD3+-Zellen bei 35
Patienten im Alter zwischen 22 und 82 Jahren mit neu diagnostiziertem aggressivem
Lymphom und gleichaltrigen Probanden mit der Flow-FISH-Methode ergab, dass die
Telomere der B- und T-Zellen der gesunden Kontrollpersonen länger als die der
Lymphompatienten sind. Zum Vergleich der Telomerlängen in den Lymphozyten
wurden außerdem die Telomerlängen in den Granulozyten derselben Patienten und
gesunden Probanden untersucht. Interessant dabei ist, dass auch die Telomerlänge
in den Granulozyten bei den Patienten verkürzt ist.
Unsere Daten zeigen, dass bei diesen Patienten eine signifikante Telomerverkürzung
schon besteht, vor oder wenigstens gleichzeitig mit der Entwicklung eines
aggressivem Lymphoms. Frühere Studien an Krebspatienten konzentrierten sich auf
intraindividuelle Vergleiche von malignen und nicht-malignen Zellen innerhalb
derselben Patienten. Beim Non-Hodgkin Lymphom (REMES et al., 2000) ebenso wie
bei den meisten anderen untersuchten menschlichen Neoplasmen (NORRBACK et
al., 1997, HASTIE et al., 1990, ENGELHARDT et al., 1997) sind die Telomere in der
Tumorfraktion verkürzt.
Eine weitere Studie von WU et al. 1999 zeigte Telomereverkürzung und TelomeraseExpression in peripheren PBMCs und T-Zelllinien von Patienten mit T-Zell-Lymphom.
Neben der kleinen Patientenzahl (n=5 Patienten in der relevanten Patientengruppe)
war die Kontrollgruppe in der Studie 14 Jahre älter im Vergleich zu Patienten.
Dadurch wurde eindeutig der Unterschied in der Telomerlängendifferenz überschätzt
wird, da ältere Probanden kürzere Telomere haben. Weiterhin bleibt unklar, ob die
PBMCs auch (prä-) maligne Zellen enthielten und im Fall von T-Zelllinien wie häufig
42
diese während des in vitro Expansionsprozesses repliziert hatten. Dadurch wird die
Interpretation der Telomererosion schwierig und mit unserer Studie nicht
vergleichbar. In einer weiteren Studie von LEE et al. (2003) wurden Patienten vor
und nach der Chemotherapie hinsichtlich der Telomerlänge untersucht. Jedoch
waren die Telomere von fünf Patienten vor der Chemotherapie kürzer als von
gesunden altersgleichen Kontrollpersonen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit
unserer Studie. Die Autoren empfehlen jedoch bei geringer Fallzahl eine
Untersuchung mit mehr Patienten.
Basierend auf unseren Flow-FISH-Messergebnissen ergibt sich für die gesamte
Altersspanne
(22-82
Jahre)
mit
fortgeschrittenem
Alter
ein
kontinuierlicher
Telomerlängenverlust für die CD3+ T-Zellen, wohingegen die CD19+ B-Zellen eine
nur rund halb so große Telomerverlustrate aufweisen. Während der durchschnittliche
Telomerverlust der T-Zellen in Übereinstimmung mit den Ergebnissen ähnlicher
Studien in der auf die meisten somatischen Zellen zutreffenden Größenordnung von
30-50 bp pro Jahr liegt (VAZIRI et al., 1993; VAZIRI et al., 1994, SLAGBOOM et
al.,1994, SON et al., 2000), schreitet der Telomerverlust in B-Zellen langsamer
voran.
Dies
ist
am
ehesten
durch
die
nachgewiesene
Möglichkeit
der
intermittierenden Telomeraseexpression (NORRACK et al. 1996) und damit
Telomerkonservierung erklärt.
Aufgrund der Telomerverkürzung in allen Linien der peripheren Leukozyten unserer
Patienten, einschließlich Granulozyten, folgern wir, dass die hämatopoetischen
Stammzellen einer frühzeitigen Alterung unterworfen sind, da die Telomerlänge von
Granulozyten und CD34 positiven hämatopoetischen Stammzellen stark korrelieren
(WIDMANN et al., 2005).
5.2.
Die Telomeraseaktivität
Für die Ausreifung von B-Lymphozyten und insbesondere die Entwicklung eines
effektiven Immungedächtnisses in Form von langlebigen B-Gedächtniszellen (mit
entsprechend langen Telomeren) scheint die Telomerase-Expression eine wichtige
Rolle zu spielen. Hierfür sprechen auch die Ergebnisse von Untersuchungen an
Telomerase-knock-out Mäusen (RUDOLF et al., 1999): In über 6 Generationen
beobachteten Mäusen, in denen die Telomeraseaktivität zerstört wurde (Telomerase-
43
knockout), kommt es nach signifikanter Telomerlängenverkürzung spontan zu
Defekten im blutbildenden System und der spontanen Entwicklung von malignen
Lymphomen, wogegen Mäuse mit normaler Telomerlänge und Telomeraseaktivität
unter 5 % Tumoren bekommen haben. Eine Telomeraseaktivität war bei 15% der BZellen unserer Patienten zu sehen ebenso wie bei 20% der Kontrollgruppe, was
einen immanenten Defekt der Telomeraseaktivierung in den B-Zellen der
Lymphompatienten unwahrscheinlich macht. Desweiteren entspricht das Niveau der
Telemeraseaktivität in den B-Zellen der Lymphompatienten oder der Kontrollgruppe
dem
physiologisch
niedrigen
Niveau
der
Telomeraseaktivierung
peripherer
Lymphozyten (WENG et al., 1997, NORRBACK et al., 1996), ist aber wesentlich
niedriger im Vergleich zu CD19+ (leukämischen) Lymphoblasten, wo die Telomerase
konstitutionell aktiviert wird.
JANUSZKIEWICZ
et
al.,
(NORRBACK et al., 1996, LI et al., 2000,
2003
).
Das
schließt
auch
eine
relevante
Tumorzellenkontamination der geprüften B-Zellen von Lymphompatienten aus, die
möglicherweise die Telomerlängenergebnisse, die wir in unserer Studie erhielten,
kompromittieren könnten.
Es lässt sich somit die Schlussfolgerung ziehen, dass die Telomeraseaktivität in den
peripheren
Lymphozyten
nicht
defekt
und
daher
nicht
die
Ursache
der
Telomereverkürzung in den peripheren Lymphozyten ist.
5.3.
Beeinflussung der Telomerdynamik von B- und T-Zellen
durch andere Faktoren
Auch andere Faktoren wie oxidativer Stress könnten die Telomerlängen beeinflussen
(VON ZGLINICKI et al., 2003). In einer Studie von Epel et al. (2004) konnte eine
Verbindung von auf Personen einwirkendem Stress, in Verbindung zu erhöhtem
oxidativem Stress in vivo, zu einer verringerten Telomerlänge in den betreffenden
Zellen gezeigt werden. Die Telomerlänge in Lymphozyten kann zu mindest teilweise
vererbt sein, wie Studien an Granulozyten von ein- und zweieiigen Zwillingen zeigen
(RUFER et al., 1999). Vererbte kurze Telomere könnten eine mögliche Erklärung für
die
Ergebnisse
unserer
Studie
sein.
Wenn
man
die
zahlenstärkste
Querschnittsstudie in Betracht zieht (RUFER et al., 1999, n=500) können wir davon
ausgehen, dass die Telomerreduktion während des ganzen Lebens aller getesteten
44
Personen, die zu Beginn unterschiedliche Telomerlängen hatten, konstant wäre.
Dennoch kann die Exposition gegenüber Antigenen (e.g. EBV (PLUNKETT et al.,
2001), Candida Albicans oder Tetanus toxid Antigen)) zu einer signifikanter
Verkürzung der Telomere in den entsprechenden Lymphozyten führen. Dies macht
eine unterschiedliche Telomererosion aufgrund unterschiedlicher Antigenexposition
bei verschiedenen Personen theoretisch möglich.
Für aggressive Lymphome wurde bis jetzt noch keine klare vererbte genetische
Assoziation beschrieben, pathogenetisch spielen somatische Mutationen bzw.
chromosomale Veränderungen bei der Entstehung eine Rolle. Stattdessen dürften
familiäre Cluster von Lymphomen eher Umwelteinflüssen zuzuordnen sein (LINET et
al., 1992, PALTIEL et al., 2000). Der Alterungsprozess steht eindeutig in
Zusammenhang mit einer erhöhten Inzidenz von NHL (ZEEB et al., 2001) sowie
einer Telomererosion (RUFER et al., 1999). Die von uns erhobenen Daten
ermöglichen die Hypothese, ob die Telomererosion selbst zur Entwicklung eines
aggressiven Lymphoms beiträgt. Die vorzeitige Telomererosion, die in peripheren
Leukozyten
von
Lymphompatienten
beobachtet
wurde,
entspricht
etwa
15
zusätzlichen Teilungen in vivo, die das menschliche Chromosom destabilisieren
können. Die primäre Funktion der Telomere ist die Stabilisierung der Chromosomen
durch die Verhütung von schädlichen Rekombinationen und Schutz der Zellen vor
inadäquater Apoptose (BLACKBURN, 1991). In seriell transplantierten Mäusen war
der mTR-/--Genotyp anfällig für fortschreitende Telomerverkürzung und invers mit den
End-zu-End Chromosomenverbindungen korreliert, einem Anzeichen für eine
Instabilität der Chromosomen. Bemerkenswert die ist Häufigkeit der spontanen
Tumorentwicklung (hauptsächlich Lymphome), welche invers mit der Telomerlänge
in diesen Mäusen (BLASCO et al., 1997) korreliert. Weiterhin gibt es zunehmend
Hinweise
an
humanem
Material,
die
die
Telomerverkürzung
mit
einer
Chromosomeninstabilität in Bezug setzen. GEIGL et al. (2004) berichteten über eine
verstärkte Chromosomeninstabilität, namentlich Aneuploidie, beim Durchgang von
Fibroblasten in vitro. Bei MDS-Patienten (myelodysplastisches Syndrom) stand die
Telomerverkürzung
signifikant
in
Verbindung
mit
erhöhten
zytogenetischen
Abberationen, erhöhtem Auftreten von Blasten, leukämischen Transformationen und
einer größeren Sterblichkeit (OHYASHIKI et al., 1999). Umgekehrt fanden MEEKER
et al., 2004 Anaphasenbrückenbildung als Anzeichen von Chromosomeninstabilität
in präinvasiven Karzinomzellen begleitet von einer Telomerverkürzung. Es ist
45
interessant, dass die Anaphasenbrückenbildung hauptsächlich in Darmkrebszelllinien mit kurzen Telomeren auftritt (STEWENIUS et al., 2005), aber nicht in
Zelllinien
mit
langen
Telomeren,
während
kurze
Telomere
onkogenische
Translokationen in einem Doppel-Knock-Out Mausmodell (Mäuse, die für die
Telomerase RNS und Ataxia Telangiectasia mutierte (ATM) Gene ausgeschaltet
sind) (QI et al., 2005) zu begrenzen scheinen. Alternativ wäre bei den
Lymphompatienten eine bereits bei Geburt bestehende Telomereverkürzung zu
diskutieren.
5.4.
Schlussfolgerungen
Aus unserer ex vivo Telomerlängenanalyse von B-, T-Zellen und Granulozyten
lassen sich folgende Schlussfolgerungen ableiten: Alle peripheren Leukozyten
erfahren mit fortschreitendem Alter einen graduellen Telomerverlust. Unsere Daten
zeigen,
dass
bei
Patienten
mit
aggressivem
Lymphom
eine
signifikante
Telomerverkürzung schon besteht, bevor oder zumindest gleichzeitig zu der
Entwicklung ihres Lymphoms. Im direkten Vergleich zeigen gleichaltrige, gesunde
Normalpersonen längere Telomere. Aufgrund der Telomerverkürzung in allen Linien
der peripheren Leukozyten unserer Patienten, einschließlich Granulozyten, folgern
wir, dass die hämatopoetischen Stammzellen einer frühzeitigen Alterung unterworfen
sind, da die Telomerlänge in Granulozyten und der CD34+ der hamatopoetischen
Stammzellen gut korrelieren.
Es lässt sich weiterhin die Schlussfolgerung ziehen, dass die Telomeraseaktivität in
Leukozyten
der
Telomererosion
Lymphompatienten
verantwortlich
Telomerverkürzung
eine
ist.
nicht
Wir
defekt
und
daher
kommen
zu
dem
stammzellenbezogene
Störung
bei
nicht
für
Schluss,
Patienten
die
dass
mit
aggressivem Lymphom ist und durch mögliche chromosomale Instabilität zur
Lymphomgenese beitragen könnte. Weitere Studien müssen zeigen, ob die hier
beschriebene
Telomerverkürzung
im
Hinblick
auf
eine
erhöhte
Chromosomeninstabilität relevant ist. Weiterhin ist von generellem Interesse zu
erforschen, ob das hier beschriebene Szenario auch in anderen menschlichen
Tumoren evident ist. Wenn ja, wäre eine Telomerverkürzung möglicherweise ein
früher Schritt in der Tumorgenese.
46
6.
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56
7.
Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Michael Pfreundschuh, Direktor der I. Medizinischen Klinik,
danke ich für die Überlassung des Themas und für das motivierende Interesse an
der Fertigstellung dieser Arbeit.
Herrn Dr. med. Thomas Widmann danke ich für die sehr geduldige Einarbeitung in
die Methodik und die ausgezeichnete Betreuung während allen Phasen dieser Arbeit.
Ich habe in ihm einen sehr guten verständnisvollen Freund kennen gelernt und
wünsche ihm und seiner Familie alles Gute, Gesundheit und viel Erfolg.
Allen Mitarbeitern des Onkologischen Labors danke ich für die zahllosen
Hilfestellungen und den Spaß, der immer mit dabei war.
Mein besonderer Dank gilt Familie Daas, die sich sehr geduldig und liebevoll um das
jüngste Familienmitglied kümmerte.
57
8.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Geburtsdatum:
05. März 1971
Geburtsort:
Petach Tikwa
Staatsangehörigkeit:
Israelisch
Familienstand:
verheiratet, ein Sohn
Schulbildung
1976 – 1989
Schulbildung und Gymnasium in Al-Tira, Israel
1989
Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife,
Abschlussnote 1.3
Studium
WS 90/91 bis SS 91
Deutschkurs an der Universität des Saarlandes
WS 91/92 bis WS 98/99
Medizinstudium am Universitätsklinikum Homburg
3. Abschnitt der ärztlichen Prüfung am 29.04.1999
Berufspraxis
01.09.99 bis 31.12.02
Arzt im Praktikum und Assistenzarzt in der
Fachklinik für Geriatrische Rehabilitation am
Marienkrankenhaus in St. Wendel
01.01.2003 bis 31.12.04
Assistenzarzt in der Inneren Abteilung des St. Josef
Krankenhauses in Neunkirchen
Seit 01.01.2005
Assistenzarzt in der Inneren Abteilung des
Städtischen Krankenhauses in Pirmasens
Sprachenkenntnisse
Arabisch (in Wort und Schrift fließend)
Hebräisch/Iwrit (in Wort und Schrift fließend)
Englisch (Mittelstufe)
Deutsch (in Wort und Schrift fließend)