Kapitel 1 Einleitung

Kapitel 1
Einleitung
1.1
Motivation der Arbeit
Die Elektrophorese ist eine Methode zur Auftrennung biologischer Substanzen. Sie hat
mittlerweile ein breites Anwendungsspektrum in der Analytik klinischer Proben, da mit
ihr die Untersuchung verschiedenster wässriger Substanzen, wie zum Beispiel Blut oder
Urin, möglich ist. Des Weiteren benötigt sie eine sehr kleine Probenmenge. Darüber hinaus
bewerkstelligt diese Methodik die Auftrennung unterschiedlichster Substanzklassen, hat
aber andererseits auch einige hunderttausend theoretische Böden.
Es gibt viele verschiedene Techniken der Elektrophorese, wobei zur Auftrennung von Biomolekülen die Kapillarelektrophorese (CE) und die Gelelektrophorese (GE) die gebräuchlichsten sind. Proteine und Peptide werden im Allgemeinen mittels GE oder 2D-GE aufgetrennt, DNA kann sowohl mit GE als auch mit CE aufgetrennt werden. Diese beiden
Techniken werden bereits in der Routineanalytik eingesetzt, beispielsweise zur Herstellung
von DNA Fingerabdrücken oder im Bereich der Screening Techniken die Differentielle Gel
Elektrophorese (DIGE) [Fig03].
Zur Identifikation der elektrophoretisch aufgetrennten Substanzen kommen unterschiedlichste Detektionsmethoden zum Einsatz. Am gebräuchlichsten sind die Massenspektro-
2
1.1. MOTIVATION DER ARBEIT
metrie (MS) [Moi02], aber auch ein Vergleich von Retentionszeiten in der CE oder von
Molekulargrößen in der GE. Diese Detektionsmethoden bieten aber nicht die Möglichkeit,
die biologische Funktion oder Aktivität einer Probe zu untersuchen. Dies wurde aber in
den letzten Jahren zum Hauptinteresse der pharmazeutischen Industrie. Es besteht nicht
mehr nur die Herausforderung, Tausende von Proteinen aufzutrennen und zu identifizieren,
sondern die hauptsächliche Aufgabe ist die Identifikation des Moleküls, das eine spezielle
biologische Funktion besitzt [Nel00].
Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche neue Untersuchungsverfahren oder Detektionsmethoden entwickelt. Ein möglicher Lösungsansatz ist es, nur die Moleküle mittels Elektrophorese aufzutrennen, die eine gewisse biologische Funktion haben. Dies erreicht man
durch Kopplung einer (Immuno-)Affinitätschromatographie mit einer Kapillarelektrophorese (IACE) [Guz05]. Eine andere Möglichkeit besteht darin, jede aufgetrennte Fraktion
auf ihre biologische Wirksamkeit zu untersuchen. Dies kann mit unterschiedlichsten Verfahren erfolgen, wie zum Beispiel mit dem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
[Zha04], mit der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) [Was99, Whe03] oder auch mittels
eines Polymersensors [Bos03].
Eine dritte Methode ist das Untersuchungsverfahren der Affinitätskapillarelektrophorese
(ACE) [Gv00, Hua04]. Hierbei wird die Stabilität der biomolekularen Interaktion dadurch
analysiert, dass man die Retentionszeit der komplexierten und der freien Biomoleküle
untersucht.
Die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) ist eine Methode, die ähnlich wie
SPR, biomolekulare Wechselwirkungen an einer Schicht detektiert [Pie97a]. Jedoch ist
diese Methode nicht auf leitende Oberflächen angewiesen, sondern kann prinzipiell mit
jeder transparenten Schicht verwendet werden. Des Weiteren ist die Methode RIfS nicht
nur auf einen Messpunkt beschränkt, sondern sie kann auch eine Fläche 2 Dimensional
untersuchen [Bir02]. All diese Voraussetzungen wecken nun die begründete Hoffnung, dass
diese Detektionsmethode in den Bereichen der Elektrophorese, die die Analyse biologischer
Substanzen behandeln, anwendbar ist.
KAPITEL 1. EINLEITUNG
1.2
3
Zielsetzung der Arbeit
Ausgehend von obiger Fragestellung soll geklärt werden, ob ein Biosensor basierend auf
der reflektometrischen Interferenzspektroskopie als Detektion in einer Elektrophorese verwendet werden kann. Hierzu sollen unterschiedliche Substanzklassen direkt im elektrophoretischen Fluss detektiert werden.
Außerdem will diese Arbeit zeigen, dass ein optischer Biosensor basierend auf der RIfS Methodik eine biomolekulare Interaktion sowohl thermodynamisch als auch kinetisch vollständig
charakterisieren kann. Hierbei soll nicht nur die heterogene Interaktion an der Sensoroberfläche, sondern auch die Interaktion in homogen Phase untersucht werden.
Des Weiteren sollen unterschiedliche transparente Sensoroberflächen auf ihre Verwendbarkeit untersucht werden. Für eine mögliche Kopplung mit der Matrix-Assisted-LaserDesorption-Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie sollen leitende Schichten aus IndiumZinn-Oxid (ITO), für eine Implantatoptimierung Titanoxidoberflächen und als günstige
Alternative zu bisher verwendete Schichten sollen Plastiksensoren aus TOPAS untersucht
werden.
4
1.2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT
Kapitel 2
Theorie
Im Folgenden sollen sowohl die biochemischen als auch die optischen Grundlagen der Detektion erklärt werden. Des Weiteren wird dargelegt, wie die Messsignale in den verschiedenen Untersuchungen ausgewertet werden, um eine Charakterisierung der biochemischen
Reaktion zu erzielen.
2.1
Biochemische Grundlagen
In den Experimenten wurden biochemische Reaktionen charakterisiert. Aus diesem Grund
sollen zunächst die biochemische Wechselwirkung und die verwendeten Biomoleküle näher
erläutert werden.
2.1.1
Biomolekulare Erkennung
Viele Signaltransductionen in Lebewesen basieren auf biomolekularen Reaktionen, bei denen supramolekulare Strukturen von so genannten Rezeptoren selektiv mit niedermolekularen Substanzen, den Liganden, reagieren. Um die biologische Funktion über längere
Zeit zu erhalten, sind diese Reaktionen meist reversibel. Sie beruhen auf einer schwachen chemischen Wechselwirkung des Rezeptors mit dem strukturell passenden Liganden.
2.1. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
6
Diese nicht kovalenten Interaktionen resultieren aus Van der Waals Kräften, ionischen
und hydrophoben Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen. Diese schwachen
Wechselwirkungen geben bei einer Reaktion sehr wenig Wärme an das System ab (vgl.
Tabelle 2.1). Dies ist für ein biologisches System von entscheidender Bedeutung, da bei
einer zu hohen Erwärmung die Proteine denaturieren und somit ihre biologische Funktion
verlieren.
Bindungsart
Bindungsstärke [kJ/mol]
Van der Waals Bindung
0.4 - 4.0
Wasserstoffbrückenbindung
12 - 30
Ionische Wechselwirkung
20
Hydrophobe Wechselwirkung
< 40
Tabelle 2.1
Bindungsstärken schwacher chemischer Wechselwirkungen
Die Rezeptoren interagieren nur in Teilbereichen, den so genannten Bindungsstellen oder
den Bindungstaschen, mit den Liganden, wobei ein Rezeptor auch mehrere Bindungsstellen
besitzen kann. Die Anzahl der Bindungsstellen wird auch als Valenz bezeichnet. In diesen
Bindungstaschen finden gleichzeitig mehrere schwache chemische Wechselwirkungen statt,
die in ihrer Summe zu einer starken reversiblen Bindung führen.
Beispielhaft wurden in den Messungen Antikörper - Antigen und DNA - DNA Wechselwirkungen untersucht.
2.1.2
Antikörper
Antikörper sind Eiweißmoleküle, die mit körperfremden und gegebenenfalls auch körpereigenen Substanzen, den so genannten Antigenen, wechselwirken. Sie werden bei der Immunabwehr des Körpers gebildet und kommen im Serum in der so genannten
γ-Globulin Fraktion vor. Es lassen sich fünf Klassen von Immunglobulinen unterscheiden
[Lot98, Voe92], wobei für die Bioanalytik das Immunglobulin G (IgG) die bedeutendste
KAPITEL 2. THEORIE
7
Rolle einnimmt. Der IgG Antikörper besitzt zwei Bindungsstellen, die so genannten Paratope, d.h. er ist bivalent. Schematisch kann ein IgG Antikörper als Ypsilon dargestellt
werden (vgl. Abbildung 2.1). Er lässt sich mit Hilfe des Enzyms Papain in drei Teile zerteilen, die beiden Arme des Ypsilons und den Rumpf. Die Arme werden als Fab (fragment
antigen binding), der Rumpf als Fc (fragment crystallisable) bezeichnet.
Abbildung 2.1
Schematische Darstellung eines IgG Antikörpers
Die Bildung von Antikörpern durch das Immunsystem des Körpers erfolgt durch die
B-Zellen. Diese produzieren als Immunantwort auf ein Antigen, zum Beispiel ein Bakterium, die Antikörper. Die Paratope des Antikörpers erkennen in einer spezifischen Reaktion
das Antigen, weshalb dieser Mechanismus auch als Schlüssel-Schloss-Prinzip bezeichnet
wird. Durch das Eindringen des Antigens in den Körper werden mehrere B-Zellen zur Produktion von Antikörpern angeregt. Die Antikörper der verschiedenen B-Zellen können zum
einen verschiedene Merkmale des Antigens erkennen, zum anderen kann diese Interaktion
aber auch unterschiedlich spezifisch sein. Dies führt zu einer Mischung unterschiedlicher
Antikörper, die alle gegen dasselbe Antigen gerichtet sind. Diese Mischung nennt man nun
einen polyklonalen Antikörper. Bei der biomolekularen Interaktionsanalyse eines solchen
polyklonalen Antikörpers ist es somit nur möglich gemittelte, Eigenschaften festzustellen.
2.1. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
8
Um nun einen besser charakterisierbaren Antikörper zu erhalten, sollte dieser monoklonal
sein, d.h. er sollte nur von einer B-Zelle stammen. Die Herstellung eines solchen Antikörpers
kann nun nicht mehr durch Immunisierung und anschließende Affinitätsaufreinigung (in
vivo) erfolgen, sondern eine B-Zelle, die spezifisch Antikörper gegen ein Antigen herstellt,
wird im Reagenzglas (in vitro) durch Fusion mit einer Tumorzelle vermehrt. Die resultierende so genannte Hybridomazelle wächst in einer Zellkultur und produziert monoklonale
Antikörper.
2.1.3
DNA und DNA Homologe Verbindungen
DNA oder Desoxyribonukleinsäure (DNS) ist der Grundbaustein des Lebens, da sie die
Erbinformation ihrer Zelle beinhaltet.
Abbildung 2.2
Darstellung einer DNA Doppelhelix
Sie hat die Struktur einer Doppelhelix (vgl. Abbildung 2.2). Das DNA Molekül besitzt ein
Rückgrat aus β-D-deoxyribose Zucker und Phosphat, an das die vier verschiedenen Basen
Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G) gebunden sind. Diese Basen zeigen
ins Innere der Doppelhelix und bilden Basenpaare zwischen A-T und C-G. Die Abfolge
KAPITEL 2. THEORIE
9
dieser Basenpaare codiert die Information zur Produktion von Eiweißen. Teilabschnitte der
DNA, welche die Information zur Produktion eines Proteins enthalten, werden Gene genannt. Die Basenpaarungen entstehen auf Grund von Wasserstoffbrückenbindungen. Somit
lässt sich die Doppelhelix durch Wärmezugabe in ihre beiden Einzelstränge ssDNA (single stranded DNA) zerlegen. Diese rekombinieren oder hybridisieren beim Abkühlen zur
ursprünglichen Doppelhelix. Den einen Einzelstrang nennt man bei einer Interaktionsanalyse sens-DNA, den anderen dazu komplementären Strang die antisens-DNA. Die Wechselwirkung der beiden Einzelstränge kann somit mittels Biomolekularer Interaktionsanalyse
(BIA) untersucht werden. Diese Wechselwirkung hängt zum einen von der Länge der DNA
ab, welche in der Anzahl der Basen, den Meren, angegeben wird. Besitzt ein DNA Molekül
bis zu 100 Basen, so nennt man es Oligomer. Zum anderen hängt die Wechselwirkung von
der Basenabfolge der Einzelstränge ab, ob diese vollständig Basenpaare ausbilden können,
oder ob sie sogennannte Fehlstellen besitzen. Haben zwei komplementäre DNA Stränge
nur eine Fehlstelle, so nennt man diese SNPs (single nucleotide Polymorphism). Die DNA
wird durch Nucleasen sehr schnell enzymatisch hydrolisiert. Deshalb ist es wünschenswert
DNA Homologe Verbindungen herzustellen, die zwar mit DNA interagieren, aber nicht
den Nachteil des Abbaus besitzen. LNA (locked nucleic acid) ist ein derartiges Beispiel.
Sie besitzt eine 2’-O,4’-C-methylen Brücke, welche einen bicyclischen ribofuranosyl Zucker
ergeben. Diese Moleküle bilden sogar eine stärkere Hybridisierung als DNA aus.
2.2
Detektion an Grenzschichten
Die Detektion der Biomolekularen Wechselwirkung findet an einer funktionalisierten Sensoroberfläche statt. Es handelt sich also um eine heterogene Reaktion. Im folgenden soll
erläutert werden, wie es durch Auswertung dieser heterogenen Reaktion möglich ist, die
biochemische Reaktion sowohl bezüglich ihres kinetischen Verlaufs als auch bezüglich des
thermodynamischen Gleichgewichts der Reaktion zu charakterisieren. Wie schon in 2.1.1
dargelegt wurde, interagiert ein Rezeptor, im folgenden stets mit A bezeichnet, spezifisch
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
10
mit seinem Liganden, im folgenden stets mit B bezeichnet. Die Interaktion dieser beiden
Moleküle lässt sich in der Reaktionsgleichung
ka
A+B AB
k
(2.1)
d
beschreiben, wobei AB der Rezeptor-Ligand-Komplex ist. Die Bildung dieses Komplexes
erfolgt mit der Assoziationsratenkonstanten ka , die Dissoziation mit der Dissoziationsratenkonstanten kd . Die thermodynamische Stabilität dieses Komplexes lässt sich durch
die Gleichgewichtskonstante, die so genannte Affinitätskonstante KAf f , beschreiben. Diese lässt sich sowohl mit Hilfe des Massenwirkungsgesetzes (MWG), als auch über das
Verhältnis der Ratenkonstanten, berechnen:
KAf f =
ka
[AB]
,
=
kd
[A] · [B]
(2.2)
wobei [AB] die Konzentration des Rezeptor-Ligand-Komplexes, [A] die Konzentration des
Rezeptors und [B] die Konzentration des Liganden ist. Häufig wird auch die Dissoziationskonstante angegeben, welche das Reziprok der Affinitätskonstante ist. Findet diese
Wechselwirkung an einer Sensoroberfläche statt, auf der der dazugehörige Ligand immobilisiert ist, so nimmt die Rezeptorkonzentration in der Nähe des Sensors ab. Somit
entsteht ein Konzentrationsgradient zwischen dem Hauptteil der Lösung und der Oberfläche (vgl. Abbildung 2.3). Der verarmte Teil der Lösung wird die Diffusionsschicht genannt, der Hauptteil der Lösung ist der so genannte bulk. Es handelt sich somit um
eine Zweischrittreaktion, bei der stets nur der langsamere Teil der Raktion charakterisiert
werden kann. Die Diffusionsrate an die Oberfläche ist durch die Massentransportratenkonstanten km gegeben [Mys97, Kar94]. Durch Variation der Rezeptor oder Ligandenkonzentration ist es möglich, dass man gezielt einen der beiden Schritte, die biomolekulare
Interaktion oder die Diffusion, charakterisiert.
KAPITEL 2. THEORIE
Abbildung 2.3
2.2.1
11
Reaktion eines Rezeptors in Lösung mit einem immobilisierten Liganden am Beispiel einer Antigen-Antikörper-Reaktion
Kinetisch kontrolliert
Um die Biomolekulare Interaktion an der Oberfläche zu charakterisieren, verwendet man
eine sehr hohe Rezeptorkonzentration im bulk und eine kleine Ligandenkonzentration auf
der Oberfläche. Unter diesen Bedingungen verläuft die Diffusion zur Oberfläche sehr viel
schneller als die Komplexbildung an der Oberfläche, man spricht von einer kinetisch kontrollierten Reaktion. Es kann also vereinfacht angenommen werden, dass die Rezeptorkonzentration im bulk genauso groß ist, wie in der Diffusionsschicht. Die Assoziation des
Rezeptors erfolgt nach einem Zwei-Teilchen-Mechanismus, die Dissoziation des RezeptorLigand-Komplexes nach einem Ein-Teilchen-Zerfallsmechanismus. Somit lässt sich die Bil-
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
12
dung dieses Komplexes an der Oberfläche mit folgender Geschwindigkeitsgleichung beschreiben [Kar91, Kar97, Pie97b]:
d [ABsf ]
= ka [Abu ] [Bsf ] − kd [ABsf ]
dt
= ka [Abu ] ([ABsf, ∞ ] − [ABsf ]) − kd [ABsf ] ,
wobei
[ABsf ]
die
Konzentration
des
Rezeptor-Ligand-Komplexes
(2.3a)
(2.3b)
an
der
Oberfläche (surface), [ABsf, ∞ ] die maximal mögliche Konzentration dieses Komplexes,
die so genannte Maximalbeladung, welche durch Injektion einer unendlich großen Rezeptorkonzentration erreicht wird, [Abu ] die Rezeptorkonzentration im bulk und [Bsf ] die
Konzentration an auf der Oberfläche immobilisiertem Ligand sind. Die Konzentration des
Rezeptors im bulk kann für das vorliegende System vereinfacht als konstant betrachtet
werden, da durch ein fluidisches System ständig Lösung dieser Konzentration nachgeliefert wird. Umformung und Integration der Gleichung 2.3 liefert einen Ausdruck, der den
zeitlichen Verlauf der Komplexbildung beschreibt (vgl. 2.4).
[ABsf ] (t) = [ABsf,GG ] (1 − exp(−ks t)) ,
(2.4)
mit der Gleichgewichtsbeladung:
[ABsf,GG ] = [ABsf, ∞ ]
KAf f [Abu ]
1 + KAf f [Abu ]
(2.5)
welche die Konzentration des Komplexes nach unendlich langer Reaktionszeit, also im
Gleichgewicht zwischen Lösung und Oberfläche beschreibt, und der scheinbaren Ratenkonstanten
ks = ka [Abu ] + kd ,
(2.6)
welche die Steigung der Exponentialfunktion wiedergibt. Sowohl die Gleichgewichtsbeladung, welche die Thermodynamik der biomolekularen Interaktion beschreibt, als auch die
scheinbare Ratenkonstante, welche die Kinetik dieser Interaktion wiedergibt, sind von der
Rezeptorkonzentration im bulk abhängig. Somit ist es durch Untersuchung verschiedener Konzentrationen möglich, sowohl die Stabilität als auch Bildungsgeschwindigkeit des
Komplexes zu bestimmen.
KAPITEL 2. THEORIE
2.2.2
13
Diffusions kontrolliert
Verwendet man eine sehr kleine Rezeptorkonzentration im bulk und eine sehr hohe Ligandenkonzentration auf der Oberfläche, so bildet jedes Rezeptormolekül, das an die Oberfläche gelangt, einen Rezeptor-Liganden-Komplex. Die Diffusion zur Oberfläche ist also
unter diesen Bedingungen der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der heterogenen Reaktion. Man nennt die Reaktion also diffusions beziehungsweise massentransport kontrolliert. Die Diffusion des Rezeptors zur Oberfläche erfolgt nach dem 1. Fickschen Gesetz
[Atk90],
J = −D
∂c
,
∂x
wobei J der Fluss, D der Diffusionskoeffizient und
(2.7)
∂c
∂x
der Konzentrationsgradient ist.
Formuliert man Gleichung 2.7 für die Diffusion des Rezeptors zur Oberfläche, so gilt:
−
d [Asf ]
d [ABsf ]
[Abu ]
,
=
=D
dt
dt
hdif
(2.8)
wobei D der Diffusionkoeffizient des Rezeptors und hdif die Dicke der Diffusionsschicht ist.
Der Konzentrationsgradient des Rezeptors stellt sich zwischen dem bulk und der Oberfläche ein und ergibt sich unter der Annahme, dass dieser durch die Diffusionsschicht
hinweg linear ist zu
0 − [Abu ]
∂c
=
,
∂x
hdif
(2.9)
da die Konzentration des Rezeptors an der Oberfläche 0 ist. Für die Dicke der Diffusionsschicht gilt [Chr97]:
hdif =
3
Dh2 bl
,
F
(2.10)
mit einer Höhe h, einer Breite b und einer Länge l des Flusskanals und einer Flussgeschwindigkeit F parallel zur Sensoroberfläche. Den Quotient aus Diffusionskoeffizient und Diffusionsschicht nennt man Onsagerscher Massentransportkoeffizient Lm [Gla93, Sjö91]. Unter
diesen Bedingungen kann zwar nicht die Rezeptor-Ligand Wechselwirkung an der Oberfläche charakterisiert werden, aber aus Gleichung 2.8 lässt sich schließen, dass die Komplexbildungsgeschwindigkeit proportional zu Rezeptorkonzentration im bulk ist. Hierbei
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
14
ist entscheidend, dass es sich um die aktive Rezeptorkonzentration handelt, das heißt nur
um die Rezeptormoleküle, die auch die Fähigkeit besitzen, mit einem Liganden zu interagieren. Diese aktive Konzentration kann stark von der, zum Beispiel UV-spektroskopisch
bestimmten, Rezeptorkonzentration abweichen.
Abbildung 2.4
Reaktion eines Rezeptors in Lösung mit einem Liganden, der sich
ebenfalls in Lösung befindet, am Beispiel einer Antigen-AntikörperReaktion
Die Berechnung von thermodynamischen und kinetischen Konstanten sollte also stets mit
der aktiven Konzentration erfolgen, um die Werte nicht zu verfälschen. Die Bestimmung
der aktiven Konzentration ist aber nicht direkt möglich, da der Propertionalitätsfaktor
nicht rechnerisch bestimmt werden kann.
Es ist jedoch durch diese Proportionalität möglich, die Komplexbildung von Rezeptor und
Ligand im bulk, also in einer homogenen Reaktion (vgl. Abbildung 2.4), zu charakteri-
KAPITEL 2. THEORIE
15
sieren. Hierbei sind kas und kdi die Ratenkonstanten in homogener Phase. Die Stabilität
des Komplexes wird durch eine Titration des Rezeptors mit dem zugehörigen Liganden
bestimmt. Die Form der Titrationskurve ergibt sich aus Gleichung 2.2 durch Umformung
[Pie97b].
KAf f =
[ABbu ]
,
([Abu ]0 − [ABbu ]) · ([Bbu ]0 − [ABbu ])
(2.11)
mit der eingesetzten Rezeptorkonzentration [Abu ]0 und der eingesetzten Ligandenkonzentration [Bbu ]0 . Durch Lösung dieser Gleichung mit der Mitternachtsformel erhält man als
einzig sinnvolles Ergebnis für die Komplexkonzentration in Lösung:
[ABbu ] =
[Abu ]0 + [Bbu ]0 +
1
KAf f
2
[Abu ]0 + [Bbu ]0 +
−
2
1
KAf f
2
− [Abu ]0 [Bbu ]0 . (2.12)
Und hieraus die Konzentration an Rezeptoren die an die Oberfläche binden können:
[Abu ] = [Abu ]0 − [ABbu ]
=
[Abu ]0 − [Bbu ]0 −
2
1
KAf f
[Abu ]0 + [Bbu ]0 +
+
2
1
KAf f
2
− [Abu ]0 [Bbu ]0 (2.13)
Diese Konzentration an bindungsfähigem Rezeptor hängt also nur von den eingesetzten
Konzentrationen und der Affinitätskonstante ab. Da die Konzentration an aktiven Liganden in den vorgestellten Beispielen aber immer mit der Ligandenkonzentration übereinstimmt, ist es durch eine Anpassung obiger Gleichung an eine Titrationskurve möglich,
sowohl die Affinitätskonstante als auch die aktive Konzentration an Rezeptor zu bestimmen.
Die Gleichung 2.13 ist allerdings nur für die Untersuchung monovalenter Rezeptoren geeignet, da ein polyvalenter Rezeptor immer noch an die Oberfläche binden kann, obwohl eine
Bindungsstelle besetzt ist. Unter der Annahme, dass sich alle Bindungsstellen des Rezep-
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
16
tors gleich verhalten und unabhängig voneinander reagieren, ergibt sich die Konzentration
an vollständig besetztem Rezeptor [Abu ]voll am Beispiel eines Antikörpers zu:
[Abu ]0
[Abu ]voll = B2, [ABbu ] (2) ·
[Abu ]0
2
2 0
[ABbu ]
[Abu ]0
2
[ABbu ]
=
1−
·
[Abu ]0
[Abu ]0
2
2
[ABbu ]2
=
,
2 [Abu ]0
(2.14a)
(2.14b)
(2.14c)
wobei [ABbu ] und [Abu ]0 die Konzentration an Bindungsstellen des Rezeptors und Komplexes beschreiben und Bn,p (·) die Binomialverteilung ist. In Gleichung 2.14 beschreibt
der linke Faktor die Wahrscheinlichkeit, dass beide von zwei willkürlich gewählten Rezeptorbindungsstellen besetzt sind, der rechte Faktor beschreibt, wie viele solcher Paare
oder anders gesagt bivalente Antikörper sich in der Lösung befinden. Somit ergibt sich die
Konzentration an bindungsfähigem Antikörper aus 2.13 und 2.14c zu:
[Abu ]bind =
[Abu ]0
− [Abu ]voll
2
⎛
⎝
=
[Abu ]0
−
2
1
Af f
[Abu ]0 −[Bbu ]0 − K
2
+
1
Af f
[Abu ]0 +[Bbu ]0 + K
2
(2.15)
⎞2
2
− [Abu ]0 [Bbu ]0 ⎠
2 [Abu ]0
Es lässt sich durch eine Titration einer bestimmten Rezeptorkonzentration, sei der Rezeptor nun mono- oder bivalent, mit variierenden Konzentrationen an zugehörigem Liganden
und anschließender Untersuchung der dann noch freien Rezeptorkonzentration mit Hilfe
der Gleichungen 2.13 und 2.15 sowohl die aktive Konzentration des Rezeptors, als auch die
Affinitätskonstante des Ligand-Rezeptor-Komplexes bestimmen. Jedoch sind diese Gleichungen nur für ein wohldefiniertes Problem, dass soll heißen für DNA oder einen monoklonalen Antikörper, geeignet. Dies ist auch ein Unterschied zur Untersuchung in 2.2.1, bei
der man für einen polyklonalen Antikörper eine mittlere Affinitätskonstante und mittlere
Ratenkonstanten erhält. Untersucht man einen solchen Antikörper in einer homogenen
Reaktion durch eine Titration, so wird diese Kurve durch die Gleichung 2.15 nur sehr
KAPITEL 2. THEORIE
17
schlecht angepasst. Aus diesem Grund verwendet man die empirische so genannte Logistic
Funktion [Dud85].
Signal =
A1 − A 2
p + A2 ,
1 − xx0
(2.16)
Hierbei ist A1 der größte und A2 der kleinste Signalwert, x ist die Ligandenkonzentration
und x0 ist die Ligandenkonzentration am Testmittelpunkt. p ist der Steigungsfaktor der
Funktion. Durch Anpassung all dieser Parameter lässt sich dann aus dem Testmittelpunkt
die mittlere Affinitätskonstante des Rezeptors bestimmen [Red03]. Für diese Berechnung
wird die Rezeptorkonzentration verwendet. Da nur die Proteinkonzentration und nicht die
aktive Konzentration einbezogen wird, ist dieser Wert meist etwas verfälscht.
Unter diffusionskontrollierten Bedingungen kann aber nicht nur die Affinitätskonstante,
sondern auch die Assoziationsratenkonstante bestimmt werden. Hierzu wird der Konzentrationsverlauf der Reaktion zeitabhängig untersucht. Die Probe befindet sich also nicht
im Gleichgewicht, wie bei der thermodynamischen Untersuchung, sondern ist am Anfang
der Reaktion. Die Änderung des Ligand-Rezeptor-Komplexes lässt sich ähnlich wie in
Gleichung 2.3 nur in homogener Phase beschreiben.
d [ABbu ]
= kas [Abu ] [Bbu ] − kdi [ABbu ]
dt
= kas ([Abu ]0 − [ABbu ]) ([Bbu ]0 − [ABbu ]) − kdi [ABbu ] ,
(2.17a)
(2.17b)
Diese Geschwindigkeitsgleichung lässt sich durch Ausmultiplizieren der rechten Seite und
Anwendung der Mitternachtsformel folgendermaßen umformulieren [Jun99]:
dy
= a (α − y) (β − y)
dt
mit den Parametern
√
b+ Δ
α=
2
und
√
b− Δ
β=
.
2
Die Vorfaktoren des Polynoms 2. Grades sind:
a = kas ,
1
,
KAf f
und somit die Diskriminante
b = [Abu ]0 + [Bbu ]0 +
c = [Abu ]0 [Bbu ]0
Δ = b2 − 4c
(2.18)
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
18
Die Differentialgleichung 2.18 lässt sich mit gängiger Software (Mathematica, Maple) symbolisch lösen. Man erhält
y(t) = β
1 − exp(a(β − α)(t − t0 ))
,
1 − αβ exp(a(β − α)(t − t0 ))
(2.19)
wobei t0 den Zeitpunkt bezeichnet, an dem die Reaktion gestartet wird. Wendet man
obige Funktion, welche wieder nur für monovalente Rezeptoren gültig ist, auf die bivalenten
Antikörper an, so muss wiederum Gleichung 2.14c berücksichtigt werden. Das Signal ergibt
sich somit zu
t
Signal = of f + F
= of f +
F
2
[Abu ]bind (t) dt
t0
[Abu ]0 (t − t0) −
(2.20a)
t
y(t)2 dt
[Abu ]0
t0
,
(2.20b)
wobei mit of f der Offset der Funktion und mit F ein gerätespezifischer Faktor bezeichnet
wird. Dieser gerätespezifische Faktor ist ein Umrechnungsfaktor, der sowohl die Konstanten
wie Diffusionskoeffizient und Flussgeschwindigkeit als auch einen Wert, der die Proportionalität zwischen Komplex an der Oberfläche zu generiertem Signal, beinhaltet.
Durch Anpassung des Signals ist es bei bekannter Affinitätskonstante möglich, die Assoziationsratenkonstante zu bestimmen [Jun98]. Es besteht nun auch die Möglichkeit verschiedenste Detektionsmethoden zur Bestimmung der Konzentration an freiem Antikörper, wie
zum Beispiel Fluorophor gelabelte Antikörper [Ohm01] oder ELISA [Zhu01], zu verwenden.
2.2.3
Überlagerung von Kinetik und Diffusion
Kinetisch kontrollierte und diffusionskontrollierte Untersuchungen sind allerdings nur Spezialfälle, die unter der Annahme bestehen, dass man ein optimales System vorliegen hat.
Diese optimalen Bedingungen sind zwar im Fall einer diffusions kontrollierten Untersuchung leicht zu erkennen, will man aber kinetisch kontrolliert arbeiten, so ist es schwierig
zu beurteilen, ob man dies erreicht hat, oder ob eine Überlagerung der beiden Effekte
KAPITEL 2. THEORIE
19
besteht. Es gibt verschiedenste Ansätze, die resultierenden Gleichungen 2.21a und 2.21b
gekoppelt zu lösen.
d [Asf ]
km ([Abu ] − [Asf ]) − ka [Asf ] [Bsf ] + kd [ABsf ]
=
dt
hdif
d [ABsf ]
= ka [Asf ] [Bsf ] − kd [ABsf ] ,
dt
(2.21a)
(2.21b)
wobei km = N hD
. N ist ein Normierungsfaktor über die gesamte Detektionsfläche [Chr97]
dif
mit
N = 1.47
1−
23
1−
l1
l2
.
l1
l2
(2.22)
Man berechnet entweder mit numerischen Methoden [Mys97, Sik02] eine Lösung, die der
realen ziemlich nahe kommt, oder man gibt eine analytische Lösung an [Sig02]. Diese
analytische Lösung lautet:
1
[ABsf ] = [ABsf, ∞ ] K1 1 −
W (exp(K2 − K3 t))
K2
(2.23)
mit den Konstanten
[Abu ] ka
[Abu ] ka + kd
[Abu ] ka2 [ABsf, ∞ ]
=
([Abu ] ka + kd )km Mw G + ka kd [ABsf, ∞ ]
([Abu ] ka + kd )2 km Mw G
,
=
([Abu ] ka + kd )km Mw G + ka kd [ABsf, ∞ ]
K1 =
K2
K3
wobei Mw die molare Masse des Rezeptors und G eine gerätespezifische Konstante ist.
W (·) ist die so genannte Lambertsche W-Funktion. Diese besitzt die Eigenschaft,
daß W (x exp(x)) = x, welche man sich zunutze macht um die gekoppelten Geschwindigkeitsgleichungen zu lösen. Vergleicht man die Interaktion ohne Berücksichtigung der
Diffusion gemäß Gleichung 2.4 und unter Berücksichtigung der Diffusion gemäß Gleichung
2.23 für einen Rezeptor der Masse 150 000 Dalton, mit einer Diffusionskonstante von
2
L
, mit einer Dissoziati5 · 10−9 cms , mit einer Assoziationsratenkonstanten von 2 · 105 mol·s
,
onsratenkonstanten von 2 · 10−3 1s und somit mit einer Affinitätskonstanten von 1 · 108 mol
L
20
2.2. DETEKTION AN GRENZSCHICHTEN
für Konzentrationen von 50 μg
bis 10 μg
, so sieht man, dass sich die Kurven bei höheren
L
L
Konzentrationen immer mehr aneinander annähern.
Abbildung 2.5
Vergleich von Assoziation und Dissoziation mit und ohne Diffusion
Verständlicherweise verläuft die Assoziationsphase und Dissoziationsphase ohne Diffusion
immer schneller als mit Berücksichtigung der Diffusion zur Oberfläche. Im einen Fall, kann
die Reaktion nur so schnell erfolgen, wie Rezeptor nachgeliefert wird. Im anderen Fall nur
so schnell, wie der Rezeptor von der Oberfläche abtransportiert wird.
Ausgehend von Gleichung 2.23 ist es nun möglich, unter der Voraussetzung, daß man
alle Geräteparameter und Rezeptorkonstanten kennt, die biomolekulare Interaktion dieses
Rezeptors mit dem auf der Oberfläche immobilisierten Liganden zu charakterisieren.
KAPITEL 2. THEORIE
2.3
21
Optische Grundlagen
Die biomolekulare Interaktionsanalyse fand mit Hilfe eines optischen Biosensors statt. Um
dessen Detektionsprinzip zu erklären, sollen zunächst einige grundlegende Begriffe und
Eigenschaften des Lichts erläutert werden.
Licht ist eine elektromagnetische Welle, d.h. es handelt sich um eine sich ausbreitende
Schwingung des elektromagnetischen Feldes. Hierbei stehen das elektrische und magnetische Feld senkrecht zur Ausbreitungsrichtung und aufeinander; Licht ist also eine Transversalwelle. Diese Felder schwingen mit der Frequenz ν und wiederholen sich mit der
Wellenlänge λ. Es gilt die Grundgleichung der Wellenlehre [Pau03]
c = λν ,
(2.24)
mit der Ausbreitungsgeschwindigkeit c. Im Vakuum ist die Ausbreitungsgeschwindigkeit
eine Naturkonstante, c0 . In anderen Medien breitet sich das Licht langsamer aus als im
Vakuum, wodurch sich eine stoffspezifische Konstante, der so genannte Brechungsindex,
bestimmen lässt. Dieser ist durch
n=
c0
c
(2.25)
definiert.
2.3.1
Reflexion an Grenzschichten
Trifft nun ein Lichtstrahl auf die Grenzfläche zweier unterschiedlicher Medien, so wird ein
Teil des einfallenden Strahls reflektiert. Der restliche Teil passiert die Grenzschicht und
wird in das andere Medium transmittiert (vgl. Abbildung 2.6). Für absorptionsfreie, nicht
streuende Schichten, die wir vereinfachend im Folgenden annehmen, gilt:
1=R+T
(2.26)
mit der Reflektivität R und der Durchlässigkeit T. Das transmittierte Licht ändert hierbei
seine Richtung. Man sagt, es wird gebrochen.
2.3. OPTISCHE GRUNDLAGEN
22
Abbildung 2.6
Lichtstrahl, welcher nach dem Snelliusschen Brechungsgesetz an einer
Grenzschicht reflektiert und transmittiert wird
Wobei der Einfallswinkel θe und Ausfallswinkel θr des einfallenden und reflektierten Lichts
gleich groß sind. Für das transmittierte Licht gilt das Snelliussche Brechungsgesetz.
sin(θe )
nt
=
sin(θt )
ne
(2.27)
Diese drei Strahlen, einfallender, reflektierter und transmittierter, liegen alle in einer Ebene, der so genannten Einfallsebene. Die Intensität der Strahlen lässt sich mit den Formeln
von Fresnel beschreiben (vgl. Gleichungen 2.28, 2.29 [Haf03]).
nt cos(θe ) − ne cos(θt )
E⊥,r
=
r⊥ =
E⊥,0
ne cos(θe ) + nt cos(θt )
E,r
nt cos(θe ) − ne cos(θt )
=
r =
E,0
nt cos(θe ) + ne cos(θt )
2ne cos(θe )
E⊥,t
=
E⊥,0
ne cos(θe ) + nt cos(θt )
E,t
2ne cos(θt )
=
,
=
E,0
nt cos(θe ) + ne cos(θt )
(2.28a)
(2.28b)
t⊥ =
(2.29a)
t
(2.29b)
KAPITEL 2. THEORIE
23
Diese Formeln gelten allerdings nur für linear polarisiertes Licht, wobei zwei Fälle unterschieden werden. Im ersten Fall liegt das elektrische Feld senkrecht zur Einfallsebene und
somit das magnetische parallel zu dieser (vgl. Abbildung 2.7).
Abbildung 2.7 Brechung einer elektromagnetischen Welle an einer Grenzschicht. Das elektrische Feld steht senkrecht zur Einfallsebene
Abbildung 2.8 Brechung einer elektromagnetischen Welle an einer Grenzschicht. Das elektrische Feld steht parallel zur Einfallsebene
Im anderen Fall steht das elektrische Feld parallel zur Einfallsebene und das magnetische
senkrecht dazu, vgl Abbildung 2.8. Hierbei sind r⊥ und r die Amplitudenreflektivitätskoeffizienten und t⊥ und t die Amplitudentransmissionkoeffizienten jeweils senkrecht oder
parallel zur Einfallsebene. Aus diesen ergibt sich dann die Reflektivität (R) 2.30
2
R⊥ = r⊥
(2.30a)
R = r2
(2.30b)
und die Durchlässigkeit (T) 2.31.
nt cos(θt ) 2
t
ne cos(θe ) ⊥
nt cos(θt ) 2
t
=
ne cos(θe ) T⊥ =
(2.31a)
T
(2.31b)
2.3. OPTISCHE GRUNDLAGEN
24
Für senkrechten Lichteinfall vereinfachen sich diese Formeln, da keine Fallunterscheidung
mehr nötig ist.
2.3.2
Reflexion an einer dünnen Schicht
Als eine dünne Schicht bezeichnet man ein Medium, das eine Dicke im Bereich der Wellenlänge des Lichts besitzt. Im Folgenden soll die Reflexion an einer dünnen Schicht mit
dem Brechungsindex n1 und der Dicke d1 untersucht werden, die sich zwischen zwei Medien
mit Brechungsindices n0 und n2 von unendlicher Dicke befindet. Hierbei soll von senkrechtem Lichteinfall ausgegangen werden, da dies auch bei dem verwendeten Sensorsystem der
Fall ist. Eine Skizze des Strahlengangs ist in Abbildung 2.9 dargestellt [Han65].
Abbildung 2.9
Skizze der Reflexion eines Lichtstrahls an einer dünnen Schicht bei
senkrechtem Lichteinfall
Eine Lichtwelle der Amplitude 1 trifft am Punkt A senkrecht auf die Grenzfläche. Dort
wird gemäß 2.28 der Bruchteil r1 =
n0 −n1
n0 +n1
reflektiert und somit nach 2.26 eine Welle der
KAPITEL 2. THEORIE
Amplitude
√
25
1 − r2 in die dünne Schicht transmittiert. Dieser Teil wird an der zweiten
2
Grenzschicht am Punkt B wiederum reflektriert, allerdings mit dem Bruchteil r2 = nn11 −n
,
+n2
√
so dass eine Welle der Amplitude r2 1 − r2 zurück zur ersten Grenzschicht läuft. Dort am
√
Punkt C wird die Welle −r1 r2 1 − r2 e−iΔ reflektiert. Des Weiteren wird hier auch eine
Welle der Amplitude r2 (1 − r2 ) in das ursprüngliche Medium emittiert. Diese Welle hat
im Gegensatz zur ersten reflektierten Welle r1 zweimal die dünne Schicht der optischen
Schichtdicke n1 d1 durchlaufen und hat somit einen Gangunterschied von 2n1 d1 . Hierdurch
ist ihre Phase
Δ=
4π
n1 d1 .
λ
(2.32)
Diese beiden Wellen müssen nun nach Amplitude und Phase addiert werden und man
erhält:
r1 + r2 (1 − r2 )e−iΔ .
(2.33)
Betrachtet man nun alle weiteren Reflexionen und Transmissionen, so ergibt sich eine
unendliche Anzahl von Teilwellen. Die resultierende Welle ergibt sich durch Addition aller
Amplituden und Phasen. Man erhält die unendliche Reihe
r1 + r2 (1 − r2 )e−iΔ − r1 r22 (1 − r2 )e−i2Δ + r12 r23 (1 − r2 )e−i3Δ ± ...
(2.34)
Diese kann man umformulieren zu
r1 +
i=∞
a qi ,
(2.35)
i=0
mit a = r2 (1 − r2 )e−iΔ und q = −r1 e−iΔ . Da der zweite Teil eine geometrische Reihe ist,
kann man die gesamte Summe zu
4π
rei =
r1 + r2 e−i λ n1 d1
4π
1 + r1 r2 e−i λ n1 d1
(2.36)
berechnen. Die Reflektivität erhält man nun, indem man Gleichung 2.36 mit ihrem komplex
konjugierten multipliziert:
R=
r12 + r22 + 2r1 r2 cos (Δ)
1 + r12 r22 + 2r1 r2 cos (Δ)
(2.37)
2.3. OPTISCHE GRUNDLAGEN
26
Trägt man die Reflektivität in Abhängigkeit von der Wellenlänge auf, so nimmt diese alternierend Minima und Maxima an (vgl. Abbildung 2.10).
Abbildung 2.10
2.3.3
Reflektivität-Wellenlängen Diagramm der Reflexion an einer
dünnen Schicht mit einem Grundmedium aus D263 Glas auf der
eine dünnen Schicht aus 150 nm SiO2 aufgebracht ist, welche mit
Wasser überschichtet ist
Reflexion an Multischichtsystemen
Wird das Licht an mehreren Schichten reflektiert und transmittiert, so ist eine vollständige
Untersuchung mit den Fresnelschen Formeln nicht zweckmäßig. Um ein derartiges Schichtsystem zu beschreiben, verwendet man die Eigenschaft der elektrischen und magnetischen
Felder, damit diese an jeder Grenzfläche stetig sind [Fow89]. Untersucht man nun ein
Schichtsystem wie in 2.3.2, so ergeben sich die folgenden Bedingungen. Für die erste Grenzschicht muss
n0 E0 − n0 E0,r = n1 EI − n1 EI,r ,
(2.38)
KAPITEL 2. THEORIE
27
mit den Brechungsindices n0 und n1 und den elektrischen Feldern E0 und EI , einfallendes Feld in 0. und 1. Schicht, und E0,r und EI,r , reflektiertes Feld in 0. und 1. Schicht
beziehungsweise an 1. und 2. Grenzfläche, gelten. Für die zweite Grenzschicht gilt:
2π
2π
n1 EI ei λ d1 − n1 EI,r e−i λ d1 = n2 EII ,
(2.39)
wobei die Exponentialfunktion die Phasendifferenz und EII das elektrische Feld in der 2.
Schicht beschreibt. Durch Elimination von EI und EI,r kann man diese Gleichungen in die
Matrixschreibweise
⎛
⎞ ⎛
⎞
⎛
1
cos( 2π
d)
1
E
0,r
λ 1
⎠+⎝
⎠
⎝
=⎝
E
0
−n0
d)
−in1 sin( 2π
n0
λ 1
−i
n1
sin( 2π
d)
λ 1
cos( 2π
d)
λ 1
⎞
⎞⎛
⎠⎝
1
n2
⎠ EII
E0
(2.40)
umformulieren. Verwendet man wieder die bereits eingeführten Reflexions- und Transmissionskoeffizienten, so lässt sich Gleichung 2.40 als
1
1
1
+
r = MI
t
n0
−n0
n2
(2.41)
mit der Tranfermatrix MI darstellen. Für ein System mit k Schichten erhält man somit
die Reflektivität oder die Durchlässigkeit, indem man die Gleichung
1
1
1
+
r = MI MII ...Mk
t
−n0
nk
n0
(2.42)
nach dem entsprechenden Koeffizienten auflöst. Hierbei sind die verschiedenen Matrices
M die Transfermatrices für die jeweilige Schicht.
2.4
Fluidik
Die biomolekulare Interaktionsanalyse beruht auf der Detektion der Proben an einer heterogenen Schicht mit Hilfe eines optischen Sensors. Diese Proben werden mit einem fluidischen System zur Detektionsfläche befördert. Um ein Verständnis der Probenhandhabung
zu erlangen, ist deshalb eine kurze Einführung über dieses System unerlässlich. Hierbei
sollen zwei verschiedene verwendete Systeme, ein druckgetriebenes und ein elektrophoretisches, beschrieben werden.
2.4. FLUIDIK
28
2.4.1
Druckgetriebener Fluss
In den meisten Anwendungen wird druckgetriebener Fluss verwendet. Hierbei wird die
Probe mit Hilfe von Pumpen oder hydrostatischem Druck durch Schläuche zur Detektionsfläche geführt. Die Reynoldszahl Re (vgl. Gleichung 2.43 [Flu]), bestimmt, ob in diesem
Schlauch laminare oder turbulente Bedingungen herrschen.
Re =
ρvDh
,
η
(2.43)
mit der Dichte ρ, der mittleren Geschwindigkeit v, der Viskosität der Flüssigkeit η und
dem hydraulischen Durchmesser des Schlauchs Dh =
4A
,
U
wobei A die Fläche und U der
Umfang des Schlauchquerschnitts sind. Ist die Reynoldszahl kleiner als 1000, so ist der
Fluss im Schlauch laminar. Dies ist bei den Untersuchungen mit einem Schlauchradius
von 0.8 mm, einer Flussgeschwindigkeit von höchstens 20 μL/s und einer Viskosität der
wässrigen Lösung von 1 · 10−3 Pa·s stets der Fall. Somit lässt sich die Strömung über
die Navier-Stokes Gleichung, welche die Bewegung einer inkompressiblen newtonschen
Flüssigkeit beschreibt, berechnen. Es ergibt sich somit ein parabolisches Flussprofil (vgl.
Abbildung 2.11).
Abbildung 2.11
2.4.2
Parabolisches Flussprofil eines laminaren Flusses
Mischen
Wie in 2.2.2 dargestellt, sollen im bulk sowohl Rezeptor als auch Ligand gemischt vorliegen. Will man thermodynamische Konstanten berechnen, so stellt der Mischprozess keine
KAPITEL 2. THEORIE
29
weiteren Probleme dar, da man die beiden Lösungen einfach zueinander gibt und dann
bis zur Einstellung des Gleichgewichtszustands wartet. Sollen allerdings kinetische Konstanten bestimmt werden, so geht man in der Modellbildung davon aus, dass zu Beginn
der Reaktion Rezeptor und Ligand ideal gemischt vorliegen, ohne miteinander reagiert
zu haben. Wünschenswert ist also ein Prozess, der möglichst schnell eine ideal gemischte
Lösung herstellt. Unter laminaren Flussbedingungen erfolgt der Mischprozess allerdings
nur durch Diffusion, welche bei den großen Rezeptoren sehr langsam ist.
Abbildung 2.12
Mischprozess eines Rezeptors (150000 Da) mit einem Liganden
(300 Da) mit geradem Schlauch
Dies wurde zum einen mit Fluoreszenzmessungen [Büh01], zum anderen mit Computational Fluid Dynamic (CFD) Berechnungen (vgl. Abbildung 2.12), bestätigt, welche denen
in der Literatur [Koc03] ähneln. Hierbei wurde die Mischung einer Antikörperlösung der
2.4. FLUIDIK
30
Konzentration 3 · 10−7 μg/L mit einer Antigenlösung der gleichen Konzentration simuliert.
Die Mischung erfolgt über ein Y-Stück und man erkennt, dass auch nach mehr als 10 cm
Schlauchlänge noch nahezu keine Mischung erfolgt ist.
Die Konzeption von Micromixern beschäftigt die Mikrosystemtechnik in zunehmendem
Maße. Hierbei können dynamische und statische Mixer unterschieden werden [Ngu05], wobei für uns nur ein statischer in Frage kommt, um keinerlei Einfluss auf die Reaktion und
die Biomoleküle auszuüben. Eine Möglichkeit besteht in der vielfachen Verzweigung der
beiden Lösungen, welche hinterher ähnlich einem Y-Stück zusammengeführt werden. Dies
erhöht die Diffusionsrate, ist aber auf Grund des hohen Gegendrucks an der Verzweigung
nur mit einer geringen Flussrate zu bewerkstelligen. Ähnliche Ansätze die Diffusion zu
erhöhen ohne einen zu hohen Gegendruck zu erhalten, finden sich in [Bur03, Men02]. Eine
einfache und praktikable Lösung ist es, den Schlauch zu häkeln. Dies wurde wiederum mit
CFD Simulationen (vgl. Abbildung 2.13), und Farbmessungen verifiziert.
Abbildung 2.13
Mischprozess eines Rezeptors (150000 Da) mit einem Liganden
(300 Da) mit gehäkeltem Schlauch
KAPITEL 2. THEORIE
31
Ähnliche Micromixer, die auch auf dreidimensionalen Drehungen des Schlauchs beruhen
finden sich in [Vij03, Cha05]. Hierbei ist der erzeugte Gegendruck sehr klein im Vergleich
zu einer Verästelung.
2.4.3
Elektrophoretischer Fluss
Der elektrophoretische Fluss beruht auf der Bewegung elektrisch geladener Teilchen in
einem elektrischen Feld. Hierbei gilt für die elektrophoretische Geschwindigkeit [Bie59,
Wed97] eines dieser Teilchen
vep =
q·E
,
6πηr
(2.44)
mit der Ladung q und dem Radius r des Teilchens und der Viskosität η des umgebenden
Mediums. Aus dieser Geschwindigkeit leitet man die elektrophoretische Mobilität
μep =
vep
q
=
,
E
6πηr
(2.45)
welche das Ladung zu Größe Verhältnis des Teilchens beschreibt. Da dieses Verhältnis
bei den meisten geladenen Teilchen variiert, kann man mit Hilfe des elektrophoretischen
Flusses unterschiedlich geladene Teilchen auftrennen. Bei einer Elektrophorese überlagert
meist der elektroosmotische Fluss den elektrophoretischen Fluss. Der elektroosmotische
Fluss kommt dadurch zustande, dass sich zwischen Flusskanal und Flüssigkeit eine mobile
Schicht bildet. Dies führt zu einem stufenförmigen Flussprofil (vgl. Abbildung 2.14).
Abbildung 2.14
Stufenförmiges Flussprofil eines elektroosmotischen Flusses
Unterdrückt man allerdings den elektroosmotischen Fluss, so ist das Flussprofil stark von
den Dimensionen des Flusskanals und dem angelegten elektrischen Feld abhängig [Len02].
32
2.4. FLUIDIK
Für kleine Dimensionen erhält man auch ein stufenförmiges Flussprofil, für große Dimensionen ist es parabolisch. Dies resultiert aus der stärkeren Erwärmung in einem größeren
Kanal durch die so genannte Joule Erwärmung [Swi02].
Kapitel 3
Material und Methoden
Zur biomolekularen Interaktionsanalyse wurden verschiedenste Verbrauchsmateralien verwendet. Diese und deren Anwendung soll nun beschrieben werden. Des Weiteren soll die
Detektionsmethode und die Probenhandhabung basierend auf dem Theoretischen Teil dargestellt werden.
3.1
3.1.1
Chemikalien und Lösungen
Chemikalien
AMD
Aminodextran 170 kD
Helixresearch Co., Oregon, USA
DCC
Dicyclohexylcarbodiimid
Sigma, Deisenhofen
DIC
Diisopropylcarbodiimid
Fluka, Neu-Ulm
DCM
Dichlormethan
Fluka, Neu-Ulm
DIPEA
N,N-Diisopropylethylamin Sigma, Deisenhofen
DMF
Dimethylformamid
Fluka, Neu-Ulm
3.1. CHEMIKALIEN UND LÖSUNGEN
34
GA
Glutarsäureanhydrid
Fluka, Neu-Ulm
GOPTS
3 - Glycidyloxypropyl-trimethyl-siloxan
Fluka, Neu-Ulm
HCl
Salzsäure
Merck, Darmstadt
H2 O2
30 % ige Wasserstoffperoxidlösung
Fluka, Neu-Ulm
H2 SO4
rauchende Schwefelsäure
Sigma, Deisenhofen
KH2 PO4
Kaliumdihydrogenphosphat
Fluka, Neu-Ulm
KOH
Kaliumhydroxid
Fluka, Neu-Ulm
NaCl
Natriumchlorid
Fluka, Neu-Ulm
NaOH
Natronlauge
Fluka, Neu-Ulm
NHS
N-Hydroxysuccidinimid
Fluka, Neu-Ulm
Ova
Ovalbumin
Sigma, Deisenhofen
PEG
Aminopolyethylenglycol
Rapp Polymere, Tübingen
SDS
Natriumdodecylsulfat
Fluka, Neu-Ulm
TBTU
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)
Fluka, Neu-Ulm
-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat
3.1.2
Lösungen
• Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate buffered saline PBS)
8,67 g (150 mmol) NaCl un 1,36 g (50 mmol) KH2 PO4 in 1 L deionisiertem Wasser,
mit KOH auf pH 7,4 titriert.
• SDS-Regenerationslösung
0,5 % ige SDS in deionisiertem Wasser, mit HCl auf pH 1,9 titriert
• Piranha
60 Vol % rauchende Schwefelsäure 40 Vol % Wasserstoffperoxidlösung werden gemischt und direkt weiter verwendet
KAPITEL 3. MATERIAL UND METHODEN
3.2
35
Trägermaterialien
• Interferenzglass
1,1 mm D263 Glas mit 10 nm hochbrechendem Ta2 O5 (n=2,2) und einer Interferenzschicht aus 330 nm SiO2 (n=1,45) beschichtet, Schott, Mainz.
• IndiumZinnOxid (ITO)
0,7 mm D263 Glas mit 20 nm SiO2 und einer Interferenzschicht aus 200 nm ITO
(n= 2,0)
• Titandioxid
1,1 mm D263 Glas mit 315 nm TiO2 (n=2,55) bedampft.
• Topas
1,1 mm Topas (n=1,53), Cycloolefin-Copolymer aus Ethylen und Norbornen
3.3
3.3.1
Rezeptoren und Liganden
Antigen-Antikörper-Wechselwirkung
Antikörperart
Bezug
polyklonaler α - Atrazin, Schaf
Dr. Ram Abuknesha, King’s College, London, GB.
monoklonaler α - Atrazin K4E7
Connex, Martinsried.
polyklonaler α - Trifluralin, Schaf
Dr. Ram Abuknesha, King’s College, London, GB.
monoklonaler α - Testosteron
Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen
Die folgenden Analyte wurden bei der Firma Sigma-Aldrich erworben. Das α - Atrazin Derivat Atrazincapronsäure (ACA) und das α - Trifluralin Derivat, welche auf der
Oberfläche immobilisiert wurden, stellte ebenfalls Herr Dr. Ram Abuknesha bereit. Das
α - Testosteron Derivat wurde ebenfalls von Sigma-Aldrich bezogen.