Doktorarbeit Druckfassung2
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Aus dem Institut für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Untersuchungen zur Prävalenz von Rotaviren der Gruppe A bei Katzen und Hunden mit Durchfall sowie zur antiviralen Wirksamkeit von rekombinantem felinen Interferon Omega Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Stefanie Neumann aus Stralsund Leipzig, 2012 Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Dekan: Prof. Dr. Uwe Truyen Betreuer: Prof. Dr. Dr. Thomas W. Vahlenkamp Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas W. Vahlenkamp Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Prof. Dr. Uwe Liebert Institut für Virologie, Universitätsklinikum, Universität Leipzig Tag der Verteidigung: 18.September 2012 Nicht Kunst und Wissenschaft allein, Geduld will bei dem Werke sein! -Johann Wolfgang von Goethe- Meiner Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Zielstellung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Rotaviren 2 2.1.1 Geschichte 2 2.1.2 Morphologie und virale Proteine 2 2.1.3 Übertragung 5 2.1.4 Pathogenese der intestinalen Rotavirusinfektion 6 2.1.5 Klinische Symptomatik bei Hunden und Katzen 8 2.1.6 Diagnostik 9 2.1.7 Therapie und Prophylaxe 9 2.2 Interferone 11 2.2.1 Geschichte 12 2.2.2 Einteilung der Interferone 12 2.2.3 Signaltransduktion der Typ I Interferone 13 2.2.4 Antivirale Aktivität der Typ I Interferone 15 2.2.5 Virale Abwehrstrategien gegen Interferon 16 2.2.6 Anwendung von Interferonen 17 3 Material und Methoden 20 3.1 Materialien 20 3.1.1 Virusnachweis (Retrospektive Studie) 20 3.1.1.1 Daten zum Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen 20 3.1.2 In vitro Experimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen 20 3.1.2.1 Zelllinien 21 3.1.2.2 Zellkulturmedien 22 3.1.2.3 Interferone 22 3.1.2.4 Antikörper 23 3.1.2.5 Virusstamm 23 3.2 Methoden 24 3.2.1 Virusnachweis (Retrospektive Studie) 24 3.2.1.1 Daten zum Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen 24 3.2.1.2 Statistische Auswertung und Software 24 3.2.2 In vitro Experimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen 25 3.2.2.1 Kultivierung der Zellen 25 3.2.2.2 Messung der Zellproliferation 25 3.2.2.2.1 Prinzip 25 3.2.2.2.2 Experimentelle Durchführung 26 3.2.2.3 Durchflußzytometrie 27 3.2.2.3.1 Prinzip 27 3.2.2.3.2 Experimentelle Durchführung 30 3.2.2.4 Nachweis des Mx Proteins 31 3.2.2.4.1 Herstellung der Zelllysate 31 3.2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 31 3.2.2.4.3 Gelelektrophorese 32 3.2.2.4.4 Western Blot 32 3.2.2.4.5 Analyse der Expression des Mx Proteins 32 3.2.2.5 Induktion antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle 33 3.2.2.5.1 Inkubation mit Interferon 33 3.2.2.5.2 Färbung der MHC I Moleküle 33 3.2.2.6 In vitro Infektionsexperimente 33 3.2.2.6.1 Infektion und IFN Behandlung feliner Zelllinien 33 3.2.2.6.2 Immunfluoreszenz 34 4 Ergebnisse 35 4.1 Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen (Retrospektive Studie) 35 4.1.1 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden 35 4.1.1.1 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden im Zeitraum von 2000 bis 2006 35 4.1.1.2 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich Einzel– und Mehrfachinfektionen 40 4.1.1.2.1 Einzelinfektionen 40 4.1.1.2.2 Coinfektionen 45 4.1.1.3 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich der Altersverteilung 47 4.1.1.4 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich des Geschlechtes 50 4.1.2 Rotavirusinfektionen bei Hunden und Katzen 50 4.1.2.1 Nachweishäufigkeit von Rotavirusinfektionen bei unterschiedlichen Rassen 4.1.2.2 Geographische Verteilung von Rotavirusinfektionen in Deutschland 50 52 4.1.2.3 Nachweishäufigkeit von Rotavirusinfektionen bei unterschiedlichen Lufttemperaturen 4.2 In-vitro Infektionsexperimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen 55 56 4.2.1 Zellproliferation unter Einwirkung von IFN 56 4.2.2 Induktion des Mx Proteins in unterschiedlichen Zelllinien 58 4.2.2.1 Behandlung mit rFeIFN- ω 58 4.2.2.2 Behandlung mit rBoIFN- α 59 4.2.2.3 Behandlung mit rHuIFN- α 60 4.2.3 Expression antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle des MHC I 62 4.2.4 Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN-ω auf felinen Zelllinien 64 5 Diskussion 66 5.1 Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen (Retrospektive Studie) 5.1.1 Prävalenz viraler Enteritiden bei Hunden und Katzen 66 66 5.1.2 Rasseprädisposition, geographische Verteilung und Saisonalität bei Rotavirusinfektionen 5.2 Ergebnisse der In-vitro Infektionsexperimente 69 70 6 Zusammenfassung 75 7 Summary 77 8 Literaturverzeichnis 79 9 Anhang 87 9.1 Chemikalien 87 9.2 Puffer und Lösungen 88 9.3 Gelelektrophorese (SDS PAGE) 89 9.4 Verbrauchsmaterialien und Geräte 89 9.5 Abbildungsverzeichnis 91 9.6 Tabellenverzeichnis 93 10 Danksagung 94 Abkürzungen ADAR1 RNA abhängige Adenosin-Deaminase ATP Adenosintriphosphat ATV Adjusted trypsin versen β –TrCP beta-transducin repeat containing protein BKH Britisch Kurzhaar BSA Bovines Serumalbumin Ca2+ Calcium CD Cluster of Differentiation CFSE Carboxyfluoreszein Succimidyl Ester Cl- Chlorid-Ionen CO2 Kohlenstoffdioxid DSH Deutscher Schäferhund DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure eIF-2α Proteinsynthese Initiationsfaktor 2 alpha ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EKH Europäisch Kurzhaar ENS Enterales Nervensystem EU Europäische Union dsRNA Doppelsträngige Ribonukleinsäure FCS Forward scatter GTP Guanosintriphosphat HSV 1 Herpes Simplex Virus 1 ENS Enterisches Nervensystem FKS Fetales Kälberserum IBR Infektiöse Bovine Rhinotracheitis Ig Immunglobulin IFN Interferon IFNAR Interferon A Rezeptor IкB Inhibitorischer Faktor kappa B ISG Interferon Stimuliertes Gen ISGF3 Interferon stimulated gene factor 3 ISRE Interferon stimulated response element IRFs Interferon regulatory factors JRT Jack Russell Terrier FCV Felines Calicivirus FCoV Felines Coronavirus FeLV Felines Leukämievirus FITC Fluoreszeinisothiocyanat FIV Felines Immunschwächevirus FHV Felines Herpesvirus FPV Felines Parvovirus Jak Janus-Kinase kb Kilobase KCS Keratokonjunktivitis sicca kDa Kilodalton l Liter LAH Albuminhydrolysat MEM Minimum essential medium MHC Major Histokompatibilitätskomplex µ Mikro mRNA Messanger Ribonukleinsäure n Nano Na+ Natrium NFкB Nuclear Factor kappa B NEAS Nicht essentielle Aminosäuren NK-Zellen Natürliche Killerzellen NSP Nicht-Strukturprotein m Meter OAS Oligoadenylatsynthetase PBS phosphate buffered saline PCR Polymerase Kettenreaktion PEG Polyethylenglykol p.i. Post infectionem PIK Potsdam Institut für Klimaforschung PLC-IP3 Phospholipase C-Inositol 1,3,5 Triphosphatase PLZ Postleitzahl PKR Proteinkinase R POD Peroxidase rBoIFN Rekombinantes bovines Interferon rFeIFN Rekombinantes felines Interferon rHuIFN Rekombinantes humanes Interferon RT-PCR Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion RNA Ribonukleinsäure RNAse Ribonuklease RPMI Roswell Park Memorial Institute SPF Spezifisch pathogenfreien SSC Sideward scatter SDS Sodiumdodecylsulfat STAT Signal transducer and activator of transcription TEMED N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine Tyk Tyrosinkinase VP Virusprotein WHWT West Highland White Terrier ZB Zellbank 1 Einleitung 1 Einleitung Rotaviren der Gruppe A stellen in der Veterinär- und Humanmedizin einen der bedeutendsten Erreger von Gastroenteritiden dar. In Deutschland gehören Rotavirusinfektionen in der Humanmedizin als meldepflichtige Infektion nach Norovirusinfektionen zweithäufigsten mit jährlich gastrointestinalen über 50.000 gemeldeten Durchfallerkrankungen Fällen zu den (ROBERT-KOCH- INSTITUT 2008). Die Letalität ist mit 0,1% vergleichsweise gering (FORSTER und HAMMERSCHMIDT 2007). In den ärmsten Entwicklungsländern sind etwa 82% aller durchfall bedingten Todesfälle auf Rotaviren zurückführen. Weltweit sterben jährlich mehr als 500.000 Menschen an den Folgen einer Rotavirusinfektion (PARASHAR et al. 2003). In der Veterinärmedizin verursachen Rotaviren als Jungtiererkrankung, vor allem in der Nutztierpraxis, hohe ökonomische Verluste (HOUSE 1978). Über die Prävalenz von Rotavirusinfektionen bei Hunden und Katzen ist derzeit wenig bekannt. Untersuchungen zeigen jedoch, dass es durchaus Hinweise für zoonotische Übertragungen von Rotaviren auf den Menschen gibt (COOK et al. 2004). 1.1 Zielstellung Im ersten Teil dieser Doktorarbeit sollten aktuelle Prävalenzdaten über den Nachweis von Rotaviren bei durchfall erkrankten Hunden und Katzen im Vergleich zu Coronaviren und Parvoviren erhoben werden. Zusätzlich sollten Besonderheiten hinsichtlich der geographischen Verteilung, der Altersverteilung, mögliche Rasseprädispositionen und das Auftreten saisonaler Erkrankungshäufigkeiten untersucht werden. Im zweiten Teil der Doktorarbeit sollte die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber kommerziell erhältlichen Typ I Interferonen in vitro getestet werden, um eine mögliche therapeutische Anwendung von Typ I Interferonen bei Rotavirusbedingten Durchfallerkrankungen bei Hunden und Katzen zu untersuchen. 1 2 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Rotaviren 2.1.1 Geschichte Im Jahr 1973 wurde erstmals der Zusammenhang von Durchfallerkrankungen bei Säuglingen und Kleinkindern zu Rotaviren beschrieben (BISHOP 1973). In Dünnschnitten der menschlichen duodenalen Mucosa, sowie in menschlichen Kotproben konnten Rotaviren elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden (FLEWETT et al. 1974a). Man postulierte eine 35-50%ige Beteiligung an der Hospitalisierung bei Kleinkindern (BISHOP 1996) und somit eine wichtige ätiologische Rolle bei Durchfallerkrankungen. Im Jahre 1976 wurden gleiche Viruspartikel im Kot erkrankter Kälber nachgewiesen werden. Des weiteren gelang das Auslösen einer klinischen Symptomatik durch experimentelle Virusinfektion gesunder Kälber (MEBUS et al. 1976). Der Name „Rotavirus“ wurde aufgrund der elektronenmikroskopischen Ähnlichkeit des Partikels zu einem Rad (lat. rota = Rad) gewählt (FLEWETT et al. 1974b). Ähnlichkeiten hinsichtlich der molekularen Genomstruktur und Sequenz führten zur Klassifizierung der Rotaviren in den Genus Rotavirus innerhalb der Familie der Reoviridae (MATHEWS 1979). 2.1.2 Morphologie und virale Proteine Rotaviren sind unbehüllte ikosaedrische Partikel mit einem Durchmesser von 65-75 nm. Sie bestehen aus einem äußeren und einem inneren Kapsid. Das innere Kapsid beinhaltet das zentral gelegene Core. Zusammen bilden sie den nichtinfektiösen „doppelschichtigen-Partikel“ (DLP), welcher alle für die virusspezifische Transkription und Replikation essentiellen Enzyme enthält. Die Virusoberfläche trägt bis zu 60 Projektionen (spikes) mit einer Länge von etwa 4-6 nm. Als Artefakt durch Behandlung/Präparation entstandenen Partikeln fehlt zum Teil das äußere Kapsid. Das Virusgenom liegt in 11 Segmenten als doppelsträngige RNA vor. Anhand des unterschiedlichen elektrophoretischen Laufverhaltens, können die Segmente in Größenklassen eingeteilt werden, wobei die spezifischen Bandenmuster von Gruppe A Rotaviren eine Zuordnung in vier Elektropherotypen erlauben: Gruppe I (RNS-Banden der Segmente 1-4), Gruppe II (Segmente 5, 6), Gruppe III 2 2 Literaturübersicht (Segmente 7-9), sowie Gruppe IV (Segmente 9-11) (DESSELBERGER 1996, ESTES 1996). Die Zuordnung der Elektropherotypen wurde vor allem für epidemiologische Studien genutzt (HOLMES 1996). Rotaviren der Gruppe A besitzen 6 Strukturproteine (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7) und 6 Nichtstrukturproteine (NSP1-6) (RAMIG 2004) . Die 11 Segmente des Virusgenoms sind zwischen 0,6 und 3,3 kb groß. Sie kodieren für jeweils ein Protein, ausgenommen NSP 5 und 6, welche mittels überlappenden Leserahmen von Segment 11 kodiert werden (RAMIG 2004). VP1, VP2 und VP3 bilden das Core. VP6 bildet das innere, VP4 und VP7 das äußere Kapsid. Die Oberflächenprojektionen werden von VP4 gebildet (Abb. 1). Abb.1. Morphologie der Rotaviren (Granzow, Jörn; Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems) VP6 stellt das gruppenspezifische Antigen dar. Der Nachweis von VP6 wird daher unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern zur Diagnostik verwendet. Aufgrund der Antigenität von VP6 unterscheidet man mindestens 7 Serogruppen (A-G). Die meisten bekannten Rotavirusisolate beim Mensch und verschiedenen 3 2 Literaturübersicht Tierarten sind der Serogruppe A zuzuordnen. Zudem gehören Rotaviren beim Mensch den Gruppen B und C an. Mit der zunehmenden Anzahl kompletter Genomsequenzen wurde in den letzten Jahren eine einheitliche Nomenklatur für die Klassifizierung von Rotaviren der Gruppe A geschaffen. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen Gensegmenten unterschiedlicher Rotaviren werden für jedes der 11 Segmente Genotypen definiert (Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx). Hierdurch werden Reassortierungsereignisse und die Herkunft der Gensegmente bei Intra- und Interspeziesübertragungen besser nachvollziehbar. Mittlerweile werden bei VP7 insgesamt 27 Genotypen (G1-G27) unterschieden. Bei VP4 werden 35 Genotypen (P[1]-P[35]), bei VP6 werden 16 Genotypen (I1-I16), bei VP1 werden 9 Genotypen (R1-R9), bei VP2 werden 9 Genotypen (C1-C9), bei VP3 werden 8 Genotypen (M1-M8), bei NSP1 werden 16 Genotypen (A1-A16), bei NSP2 werden 9 Genotypen (N1-N9), bei NSP3 werden 12 Genotypen (T1-T12), bei NSP4 werden 14 Genotypen (E1-E14) und bei NSP5/6 werden 11 Genotypen (H1-H11) unterschieden. Die bei den Viren am häufigsten untersuchten Genotypen beziehen sich auf das glycolysierte VP7 und das proteaseempfindlichen VP4 und werden deshalb als G-Typen bzw. P-Typen bezeichnet (COHEN et al. 1989); (COONEY et al. 2001). Die Virusvermehrung erfolgt ausschließlich im Zytoplasma (RAMIG 1994). Die Adsorption des Virus wird durch VP4 und VP7 vermittelt. Es kommt zur Fusion des äußeren Kapsids mit der Zellmembran der Wirtszelle, sofern VP4 proteolytisch gespalten vorliegt. Die proteolytische Spaltung von VP4 in VP5 und VP8 durch Trypsin erhöht die Infektivität des Virus (ARIAS et al. 1996). Folgend gelangt das DLP durch Endozytose in das Zytoplasma der Wirtszelle. Es ist sowohl eine Kalziumund Clathrinabhängige Route der Endozytose (CHEMELLO et al. 2002), als auch eine Lipid-Mikrodomänen- und Dynaminabhängige Route beschrieben (PONCET et al. 1994). Nach Aufnahme in das Zytoplasma erfolgt die Synthese der viralen mRNA durch viruseigene Transkriptasen (ESTES 1996). Die Initiation beginnt ca. eine Stunde p.i. (PELKMANS et al. 2001). Die mRNA gelangt durch Poren des VP6 in das Zytoplasma der Wirtszelle (ESTES 1996). Im Zytoplasma werden die Transkripte an freien und an Endoplasmatisches Retikulum (ER)-gebundenen Ribosomen translatiert. DsRNA kann ca. 3-4 Stunden p.i. nachgewiesen werden (PATTON 1990). Nach erfolgter Translation und RNA-Replikation erfolgt die Reifung 4 2 Literaturübersicht (Morphogenese) des Nukleokapsids und Freisetzung durch Knospung resp. budding an den Membranen des ER. Für die Freisetzung des Virions aus der Wirtszelle sind unterschiedliche Modelle beschrieben. Virionen einer Rotavirus-infizierten MA104 Zelle (Modell der nicht-polarisierten Zelle) werden durch Zelllyse freigesetzt (NEWTON et al. 1997). Im Gegensatz dazu stehen Beobachtungen, die beschreiben, dass die Freisetzung der Virionen in Rotavirus-infizierten Caco-2 Zellen (Modell der polarisierten Zelle) an der apikalen Oberfläche der Zellen erfolgt (JOURDAN et al. 1997). Das segmentierte Genom ermöglicht das Entstehen von Reassortanten (TIAN et al. 1996) bei gleichzeitiger Infektion einer Wirtszelle mit unterschiedlichen Rotaviren. Diese, auch in vitro erzeugbaren, Reassortanten enthalten Teile des genetischen Materials beider elterlicher Genome (HUNDLEY et al. 1985, GOMBOLD und RAMIG 1989, KOBAYASHI et al. 1994, HOSHINO et al. 1995). Virusreassortanten zeigen z.T. Veränderungen im Elektropherotyp, eine Veränderung serologischer Eigenschaften (PEDLEY et al. 1983, PEDLEY et al. 1986, DUNN et al. 1993), sowie Änderungen des Wirtstropismus und der Pathogenität (BRIDGER et al. 1992, BURKE et al. 1994). Wenn gleich die Bildung von Reassortanten nicht die gleiche Bedeutung des Antigenshift der Influenzaviren aufweist, trägt es jedoch maßgeblich zur Evolution und Mannigfaltigkeit der Rotaviren bei (TIAN et al. 1993, KOBAYASHI et al. 1994, DESSELBERGER 1996). 2.1.3 Übertragung Rotaviren werden sowohl fäkal-oral, als auch aerogen übertragen (KAPIKIAN 1996). Eine wichtige Infektionsquelle in der Human- und Veterinärmedizin stellt kontaminiertes Wasser dar (HUNG et al. 1984). Rotaviren weisen eine hohe Tenazität auf und bleiben bei Raumtemperatur bis zu 7 Monate infektiös (MURPHY F 1999). Das Risiko der Erkrankung wird durch schlechte Hygiene und Überbelegung in Krankenhäusern begünstigt (HUNG et al. 1984). Die Inkubationszeit beträgt bei Mensch und Tier 16-72 Stunden (MCNULTY et al. 1978). Rotaviren werden bei klinisch erkrankten Tieren und subklinischen Trägern in hoher Zahl (bis zu 1011 Viruspartikel/g) im Kot ausgeschieden, die maximale Virusausscheidung im Kot findet am 3. und 4. Tag post infectionem statt (MURPHY F 1999). Es existieren 5 2 Literaturübersicht zahlreiche Studien in denen über die Isolierung von für die entsprechende Spezies untypische Rotaviren berichtet wird. Hierbei werden meist (siehe 2.1.2) die G und P-Typen zur Charakterisierung genutzt. Die meisten humanen Rotaviren sind den G-Typen G1-4 sowie den P-Typen P[4] und [8] zuzuordnen. Bovine Rotaviren gehören in der Mehrzahl zu den G-Typen G6, G8 und G10 sowie den P-Typen P[1], P[5] oder P[11]. Sämtliche bei Katzen charakterisierten Rotaviren gehören zu den Typen G3 sowie P[3] oder P[9]. Die bei Hunden beschriebenen Rotaviren gehören bislang ausnahmslos zu den Typen G3 und P[3].(COOK et al. 2004). Darüber hinaus wurden Transmissionen von Rotaviren zwischen Mensch-Rind, Mensch-Schwein, Schwein-Rind und Schwein-Pferd nachgewiesen (GERNA et al. 1992, KAPIKIAN 1996, PONGSUWANNA et al. 1996, CIARLET et al. 2001). Eine Übertragung von Rotaviren von einer Katze auf den Menschen mit dem Ergebnis einer klinischen Erkrankung wurde erstmals 1985 beschrieben (NAKAGOMI et al. 1985). Seitdem werden sporadisch immer wieder mal die bei Katze bzw. Hund vorkommenden Rotaviren der Typen G3 und P[3] sowie G3 und P[9] beim Mensch beobachtet (Matthijnssens et al., 2011b). 2.1.4 Pathogenese der intestinalen Rotavirusinfektion Rotaviren der Gruppe A infizieren differenzierte luminale Enterozyten des Dünndarms. Die im gesunden Dünndarm existierende Balance zwischen absorbierenden Enterozyten und sezernierenden Zellen der Lieberkühnschen Krypten (MOON 1994) wird verändert. Durch Zerstörung der Enterozyten kommt es zur verminderten Absorption von Natrium, Wasser und Disacchariden (ESTES und GRAHAM 1985, HUNDLEY et al. 1987) und somit zur Passage unverdauter Monound Disaccharide, Kohlenhydrate, Proteine und Fette, welche eine hohe osmotische Aktivität aufweisen. Ergebnis ist eine osmotische Diarrhöe (ESTES et al. 1983). Lundgren et al. konnten nachweisen, dass es neben der osmotischen Diarrhöe in Korrelation mit Zellzerstörung, auch einen davon unabhängigen, neuronalen Zusammenhang zum Durchfallgeschehen gibt (LUNDGREN et al. 2000, LUNDGREN und SVENSSON 2001). Die Schlüsselrolle spielt dabei das NSP4, welches mit Hilfe einer enterotoxin-ähnlichen Aktivität via Stimulation des enteralen Nervensystems (ENS) die Diarrhöe auslöst (ZHANG et al. 2000). Nach Infektion der Zelle kommt es 6 2 Literaturübersicht zu einer NSP4 bedingten Leerung intrazellulärer Kalziumspeicher (Abb. 2, graue Zellen). Der Anstieg an intrazellulärem Kalzium bedingt eine Zerstörung des Zytoskeletts, einer herabgesetzten Expression von Disaccharidasen und weiteren Verdauungsenzymen der apikalen Oberfläche, sowie einer reduzierten Aktivität des Natrium Cotransportsystems (RAMIG 2004). Der Verlust der Integrität der tight junctions führt zum parazellulären Verlust von Wasser und Elektrolyten (RAMIG 2004). Neben intrazellulären und interzellulären Wirkungen, erlaubt die Sezernierung des NSP4 auch parakrine Effekte. Dabei bindet NSP4 an Rezeptoren benachbarter, nicht infizierter Zellen und löst über die Phospholipase C-Inositol 1,3,5 – Triphosphatase (PLC-IP3) Kaskade die Freisetzung von Kalzium aus dem Endoplasmatischen Retikulum aus (ESTES 2003). Die Lokalisation der durch NSP4 beeinflussten Zelle spielt dabei eine wichtige Rolle. An proliferierenden Kryptenzellen führt NSP4 zu einem Anstieg der Kalziumausschüttung und einer Erhöhung der Aktivität des Chloridtransporters mit dem Resultat einer erhöhten Sekretion von Zellen der Lieberkühnschen Krypten (Abb. 2, gelbe Zelle) (RAMIG 2004). Abb. 2. Pathophysiologie der intestinalen Rotavirusinfektion modifiziert nach Ramig et al. (2004) mit NSP4 ( ). 7 2 Literaturübersicht Die Pathophysiologie der intestinalen Rotavirusinfektion ist ein multifaktorielles Geschehen aus einer malabsorptiven, vorwiegend durch Zellzerstörung bedingten und einer sekretorischen, vorwiegend auf den Effekten des NSP4 und des ENS beruhenden Komponente. Nach experimenteller Infektion konnten Rotaviren in Lungen-, Leber-, Milz-, Nierenund Hirngewebe der Maus nachgewiesen werden (CONNER M 1997). Beim Mensch konnten nach Auftreten plötzlicher Todesfälle post mortem Rotaviren im Myokard nachgewiesen werden (CIOC und NUOVO 2002). Untersuchungen an Mäusen lassen annehmen, dass Rotaviren über Lymphbahnen in die Peyer´schen Platten, in die mesenterialen Lymphknoten und von dort aus über die Zellen der lymphatischen und myeloischen Reihe in periphere Gewebe gelangen (CONNER M 1997). Das Virusgenomsegment 7, welches für NSP3 kodiert, sowie das Virusgenomsegment 6, welches für VP6 kodiert, beeinflussen dabei das Ausmaß der extraintestinalen Virusausbreitung (MOSSEL und RAMIG 2002, 2003, RAMIG 2007). Neue Studien belegen die Möglichkeit der Virusausbreitung in Form einer Virämie. Der Nachweis erfolgte in verschiedenen Tiermodellen und beim Menschen (BLUTT und CONNER 2007). Eine Korrelation zwischen Virämie und klinischer Symptomatik konnte in den Studien zumindest für den Menschen nicht nachgewiesen werden (BLUTT et al. 2007). 2.1.5 Klinische Symptomatik bei Hunden und Katzen Rotavirusinfektionen kommen bei Hunden und Katzen aller Altersstufen vor. Vorwiegend betroffen sind Jungtiere unter 12 Wochen (GREENE 2006). Die klinische Symptomatik reicht von milder Diarrhöe, bis zu stark wässrigen Durchfällen mit begleitendem stark geschwächtem Allgemeinbefinden und hochgradiger Dehydratation (GREENE 2006). Die Infektion verläuft sehr selten tödlich (ENGLAND und POSTON 1980). Schwere und Dauer der Erkrankung hängen vom Virus und Alter der Tiere ab (DIRKSEN und BACHMANN 1977). Das Durchfallgeschehen dauert generell vier bis maximal zehn Tage an und verläuft dabei vorwiegend ohne Fieber (MCNULTY et al. 1978, GREENE 2006). Die Rekonvaleszenz tritt in der Regel komplikationslos ein. 8 2 Literaturübersicht 2.1.6 Diagnostik Zur Diagnostik der Rotavirusinfektion stehen mehrere Verfahren für den direkten Erregernachweis zur Verfügung. Goldstandard war früher der elektronen- mikroskopische Nachweis von Viruspartikeln im Kot (KAPIKIAN 1996). Diese Methode hat mit einer Nachweisgrenze von ca. 106-107 Viruspartikeln pro Gramm Kot eine geringe Sensitivität. Eine weitere labordiagnostische Möglichkeit ist die Anzucht und Kultivierung von Rotaviren auf Zelllinien. Oft verwendete Zelllinien sind MA 104 - (Grüne Meerkatze, embryonale Nierenzelle) und Vero- (Grüne Meerkatze, Nierenzelle) Zellen. Die Rotaviruskultivierung wird in Gegenwart proteolytischer Enzyme, z.B. Trypsin, durchgeführt. Damit wird gewährleistet, dass das Oberflächenprotein VP4 proteolytisch gespalten wird, ein essentieller Schritt bei der Infektion der Zellen (BOHL et al. 1984). Für die Praxis werden in der Humanmedizin kommerziell erhältliche Testsysteme, die das gruppenspezifische Antigen VP6 auf dem Prinzip des ELISA (enzyme linked immuno absorbend assay) oder der LatexAgglutination nachweisen, angeboten. Beispiele dafür sind: Rotazyme®, Enzygnost®, Rotalex® und Slidex Rota-kit®. Nachteil der genannten Verfahren, wie Elektronenmikroskopie, ELISA und der Latex Agglutination ist die mit ca. 105-107 Viruspartikeln Untersuchungen von pro Gramm Lebensmittel- Kot und vergleichsweise Wasserproben, geringe in Sensitivität. denen geringe Virusmengen erwartet werden, benötigen spezifische und sensitive diagnostische Verfahren. Diese stehen für Gruppe A Rotaviren mit Hilfe der Reversen Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verfügung (HAMPEL et al. 2007). 2.1.7 Therapie und Prophylaxe Die Therapie der Rotavirusinfektion in der Human- und Veterinärmedizin setzt sich aus Flüssigkeit- und Elektrolytsubstitution, sowie begleitender Antibiose zur Abwendung bakterieller Sekundärinfektionen zusammen (GREENE 2006). Aufgrund der hohen Inzidenz und der schwerwiegenden Symptomatik der Rotavirusinfektionen bei Kälbern und Säuglingen steht der Schutz vor Infektion im Vordergrund. Die durch IgA vermittelte lokale Immunität bietet nur kurzfristigen Schutz. Man geht davon aus, dass der Schutz des saugenden Kalbes durch Antikörper im aufgenommenen Kolostrum, für etwa 48 Stunden andauert (MURPHY F 1999). Für eine gezielte 9 2 Literaturübersicht Prophylaxe beim Rind wird eine sog. Muttertierimpfung angewendet. Dafür stehen drei Totimpfstoffe und ein Lebendimpfstoff zur Verfügung, welche jeweils eine Kombivaccine gegen Rotavirus, Coronavirus und E.coli K99 enthalten (Lactovac®C, Rotavec®Corona, Trivacton®, Scourgard III®). Der Applikationszeitpunkt ist Tabelle 1 zu entnehmen. Das Ziel ist die passive Immunisierung des Kalbes durch Aufnahme der sich im Kolostrum des geimpften Muttertieres angereicherten Rotavirusspezifischen IgG. In der Humanmedizin stehen in Deutschland seit dem Jahr 2006 zwei Lebendimpfstoffe zur Verfügung. Es handelt sich dabei um einen monovalenten Impfstoff mit einem humanen Rotavirus (Stamm RIX4414, Typ G1/P[8] – Rotarix®) und um einen pentavalenten Impfstoff basierend auf bovinen Rotavirus-Reassortanten der G-Typen G1, G2, G3, G4 sowie des P-Typs P[8] (Typen G1 G2 G3 G4 und P[8] Rotateq®). Rotarix® wird zweimal im Abstand von zwei Monaten oral appliziert. Rotateq® wird dreimal im Abstand von mindestens vier Wochen oral verabreicht. Das Mindestalter der Erstimpfung sollte 6 Wochen betragen und die Impfung sollte nach der 24.-26. Lebenswoche beendet sein (GLASS und PARASHAR 2006). In umfangreichen Zulassungsstudien konnten beide Impfstoffe hinsichtlich der Immunogenität, der Effektivität, der Sicherheit und der Verträglichkeit gute Ergebnissen erzielen (GLAXOSMITHKLINE 2006, MSD 2006, RUIZ-PALACIOS GM und GROUP 2006, BLOCK et al. 2007). Derzeit liegen noch keine weltweit umfassenden Daten vor, ob als längerfristiges Impfziel eine Senkung der Morbidität und Mortalität auftritt. 10 2 Literaturübersicht Tab.1. Impfstoffe zur Muttertiervakzinierung bei Rindern Produktname Pharmazeutische Applikationszeitpunkt Formulierung Scourgard III® Lebend Gefriergetrocknet 1.Impfung: Suspension zur 6-8 Wochen vor Injektion Abkalbedatum 2.Impfung: 2-3 Wochen vor Abkalbedatum Lactovac®C inaktiviert Suspension zur Injektion 1.Impfung: 6-8 Wochen vor Abkalbedatum 2.Impfung: 2-3 Wochen vor Abkalbedatum Rotavec®Corona Trivacton® inaktiviert inaktiviert Emulsion zur einmalig 12-3 Wochen Injektion vor Abkalbedatum Suspension zur 1.Impfung: 1-2 Monate Injektion vor Abkalbedatum 2.Impfung im Abstand von mind. 2 Wochen Milchvieh: 2-3 Wochen vor Abkalbedatum Mutterkühe: am Tag der Abkalbung (± 24h) 11 2 Literaturübersicht 2.2 Interferone 2.2.1 Geschichte Interferone wurden 1957 durch Jean Isaacs und Alick Lindenmann erstmalig beschrieben (ISAACS 1957). Isaacs und Lindenmann infizierten embryonierte Hühnereier mit einem Hitze inaktivierten Influenza-A Virus. Sie fanden heraus, dass die Chorioallantoismembran ein nicht-virales Protein freisetzten, welches Nachbarzellen sowohl gegen eine Influenzavirusinfektion, als auch gegen andere virale Infektionen schützt („Ringzonen-Phänomen“). Die Isolierung des Proteins gelang erstmals 1977 (PESTKA 2007). Trotz des Wissens um das mögliche Potential des Interferons gegen Viruserkrankungen stagnierte die Forschung über Jahre. Die minimalen Mengen des natürlich freigesetzten Interferons machten eine eindeutige Klassifizierung nicht möglich. Seit Entwicklung der Mechanismen der molekularen Zellklonierung und der rekombinanten DNA Technologie ist es möglich, größere Mengen Interferon zu produzieren (GOEDDEL et al. 1980, HERSHBERG et al. 1981, PESTKA 2007). Zunächst beschränkte sich die Produktion auf humanes Interferon alpha und beta (IFN α, IFN β) (WECK et al. 1981, DWORKIN-RASTL et al. 1982), sowie auf murines Interferon (GRAY und GOEDDEL 1983). 1992 gelang die Entwicklung eines rekombinanten felinen Interferon omega (rFeIFN-ω) mit Hilfe eines in einer Seidenspinnerraupe (lat. bombyx mori) inokuliertem rekombinanten Baculovirus als Vektor (SAKURAI et al. 1992, UEDA et al. 1993). 2.2.2 Einteilung der Interferone Interferone (IFNe) sind Glycoproteine und gehören zur Gruppe der Zytokine. Sie sind ein Teil des angeborenen Immunsystems. Virale und bakterielle Infektionen induzieren die Synthese von IFN (DECKER et al. 2002). Sie werden entsprechend ihrer Antigenität, Struktur und dem Syntheseort in zwei Gruppen eingeteilt: (i) die Hitze- und Säurestabilen Typ I IFNe – IFN α, IFN β, IFN κ, IFN ω, IFN τ und das Limitin sowie (ii) die Säurelabilen Typ II IFNe, wozu allein das IFN γ zählt (STEWART 1980, BIRON 2001). Innerhalb der Gruppe der Typ I IFNe bestehen Sequenzhomologien, zwischen Typ I und Typ II IFNe gibt es keine Homologien (ROBERTS et al. 1998). Sie binden an unterschiedliche Oberflächenrezeptoren und haben eine hohe Rezeptorspezifität (MULLER-DOBLIES et al. 2002). IFNe wirken 12 2 Literaturübersicht antiviral, antiproliferativ und immunmodulatorisch, wobei bei Typ I IFN die antivirale Wirksamkeit und bei Typ II IFN die immunmodulatorische Komponente überwiegt. Ursache ist das Spektrum der IFN produzierenden Zellen: Während Typ I IFNe von nahezu allen Zellen des Körpers gebildet werden (Leukozyten, Fibroblasten, Trophoblasten, Epithelzellen), beschränkt sich die Synthese der Typ II IFNe hauptsächlich auf T-Helferzellen und NK-Zellen (U. TRUYEN 2002). Stärkster Stimulus für die Synthese der IFNe ist die Infektion mit dsRNA Viren (ABBAS 2003). In der frühen Phase der Infektion sind neben IFN auch phagozytierende Zellen, natürliche Killerzellen und das Komplementsystem beteiligt (BIRON 2001). IFNe induzieren eine erhöhte Expression von Molekülen des major histocompatibility complex (MHC), welches zur vermehrten Antigenpräsentation infizierter Zellen führt (BIRON 1998). Desweiteren tragen sie zur Aktivierung von CD8+-memory Zellen bei (GOODBOURN et al. 2000). Die spätere Phase der angeborenen Immunantwort wird charakterisiert durch die Beteiligung des adaptiven Immunsystems, wobei B-Zellen, zytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen im Vordergrund stehen, von denen hauptsächlich IFN γ produziert wird (BIRON 1999). Typ I und Typ II IFNe wirken u.a. als Vermittler zwischen humoraler und zellvermittelter Immunantwort. Ein jüngeres Mitglied der Interferon Familie stellt das Typ III IFN (lambda Interferon [IFN-λ] resp. Interleukin 28/29 IL-28/29]) dar (ZHOU Z 2007). Es induziert eine „IFN-like“ Aktivität, nimmt aber einen anderen Rezeptorkomplex in Anspruch als Typ I IFN (ANK N 2006). 2.2.3 Signaltransduktion der Typ I Interferone Auf jeder kernhaltigen Zelle befinden sich IFN-Rezeptoren, die eine hohe Bindungsaffinität aufweisen (FLINT et al. 2000, BIRON 2001). Der Oberflächenrezeptor für Typ I IFN besteht aus 2 Polypeptidkomponenten, dem IFNalpha/beta Rezeptor 1 und 2 (IFNAR1, IFNAR2) (Abb. 3). Nach Bindung des IFN an die Untereinheit IFNAR1 kommt es zur Hetero-Dimerisierung des Rezeptorkomplexes (MOGENSEN et al. 1999) und Bindung an die Tyrosinkinase2 (Tyk2) und Januskinase1 (Jak1). Daraufhin binden die Janus-Kinasen, Jak1 und Tyk2, an die intrazelluläre Rezeptordomäne, was eine Phosphorylierung zytoplasmatischer „signal transducer and activator of transcription“ (STAT) Proteine 13 2 Literaturübersicht zur Folge hat (LUTFALLA et al. 1995, ABBAS 2003). Die phosphorylierten STAT Proteine formen mit der zusätzlichen Untereinheit p48/IRF-9 (ISGF3γ), welche eine DNA-Bindungsdomäne besitzt, einen Multimerkomplex, welcher in den Zellkern transloziert (KESSLER et al. 1990, YUAN et al. 2004). Dort induziert er die Expression von Genen, welche ein „Interferon Stimulated Response Element“ (ISRE) in ihrem Promotor aufweisen (LEVY und DARNELL 1990). Diese Gene werden als „Interferon stimuliertes Gen“ (ISG) bezeichnet. IFNe werden kontinuierlich in minimalen Mengen von den Zellen produziert. Diese konstitutive Produktion bezeichnet man als „priming“, sie macht die IFN Signaltransduktion effektiver, um bei viralen Infektionen unmittelbar das Signal zu verstärken und antivirale Proteine exprimieren zu können (HATA et al. 2001, SATO et al. 2006). Abb. 3. Interferonrezeptor und Signaltransduktion der Typ I Interferone, modifiziert nach (BANDYOPADHYAY et al. 1995) 14 2 Literaturübersicht 2.2.4 Antivirale Aktivität der Typ I Interferone ISGs stellen die eigentlichen Effektoren im IFN-System dar, denn die antivirale Wirkung der IFNe wird durch ihre Produkte, nachgeschaltete aktivierte Proteine, ausgeübt. Zu den wichtigsten antiviral wirksamen Proteinen gehören die Mx Proteine, die Oligoadenylatsynthetase (OAS) / RNAse L-System, die Proteinkinase R (PKR) und die Adenosin-Deaminase ADAR1 (Tab. 2). Tab. 2. Antiviral wirksame Proteine Enzym Antiviraler Mechanismus Mx Protein Inhibition der viralen Transkription Proteinkinase R (PKR) Stoppen der mRNA Translation Adenosin Deaminase (ADA) RNA editing Oligoadenylatsynthetase (OAS) / RNAse RNA Degradation L-System Mx Proteine gehören zur Gruppe der GTPasen. Es sind stabile nukleäre Proteine, deren Aktivität darin besteht, die Transkription der viralen RNA zu blockieren (STAEHELI et al. 1993). Mx hat eine molekulare Masse von etwa 74,7 und 75,5 kDa. Das Protein wird nach IFN Stimulation innerhalb von 1-2 Stunden induziert und erreicht seine maximale Menge innerhalb von 36 Stunden (HORISBERGER und GUNST 1991). Die biologische Halbwertszeit beträgt 2,5 Tage (FLOHR et al. 1999). Der Mechanismus der antiviralen Aktivität ist nicht bis ins Detail geklärt, man geht davon aus, das das Mx Protein nukleokapsidähnliche Strukturen bindet und sie somit für die Virusvermehrung unbrauchbar macht (PAVLOVIC et al. 1993). Mx Proteine werden ausschließlich durch Typ I IFNe reguliert, sie werden als verlässliche Marker für die Aktivität der Typ I IFNe in vitro und in vivo genutzt. Mx Proteine sind biologisch IFN-induzierte Marker, die sowohl nach parenteraler, als auch nach oraler Applikation von Interferon messbar sind (BRACKLEIN et al. 2006). 15 2 Literaturübersicht Das Enzym Oligoadenylatsynthetase (OAS) wird durch das Vorkommen replikativer Intermediate in der Frühphase der viralen Vermehrung aktiviert. Es katalysiert die Entstehung von 2´5´Oligoadenylat aus ATP (HOVANESSIAN und JUSTESEN 2007). Das 2´5´Oligoadenylat steht in direktem Zusammenhang mit der Aktivität der Ribonuklease L, welche nach Bindung mit ihrem Substrat vom monomeren – passiven Zustand, in einen dimeren – aktiven Zustand übergeht (DONG und SILVERMAN 1995). Der antivirale Effekt des 2´5´Oligadenylat besteht in der Hemmung der Synthese viraler RNA und die Degradation viraler mRNA als direkte Konsequenz auf die Aktivierung der Endonuklease RNAse L (RIOS et al. 1995). Die Proteinkinase R (PKR) wird durch das Vorkommen doppelsträngiger Ribonukleinsäure aktiviert (THOMIS und SAMUEL 1993). Nach Bindung der dsRNA wird die PKR autophosphoryliert, um dann die α-Untereinheit des ProteinsyntheseInitiationsfaktors eIF-2α und den Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFκB, IκB zu phosphorylieren. Ergebnis ist die Unterbindung der Translation viraler Proteine (MALIK et al. 1995, PROUD 1995, SAMUEL et al. 1997). Die Adenosin-Deaminase (ADAR1) katalysiert die Deamination von Adenosin zu Inosin. Diese Reaktion führt zum Verlust der Stabilität von dsRNA, da die Bindungen eingeschränkt werden (SCADDEN und SMITH 1997). Es handelt sich bei diesem Vorgang um eine posttranskriptionelle Modifikation, sie wird als RNA-Editing bezeichnet und erfolgt an viraler und an zellulärer RNA (SCADDEN und SMITH 1997). 2.2.5 Virale Abwehrstrategien gegen Interferon Im Laufe der Evolution haben Viren Strategien entwickelt, um antivirale Abwehrmechanismen der Zellen zu umgehen. Viren können an unterschiedlichen Stadien in die Interferonsynthese eingreifen oder für eine Unterdrückung der Interferonantwort sorgen. Das Herpes Simplex Virus (HSV 1), zum Beispiel, führt über 2´5´Adenylatderivate zur Inhibition der RNAse L (CAYLEY et al. 1984). Eine andere Strategie haben beispielsweise Viren des Genus Orthopox-Virus entwickelt. Das Virusgenom kodiert für einen löslichen viralen Interferonrezeptor (vIFN-Rc), der von infizierten Zellen sezerniert wird, so dass es außerhalb der Zelle zur Bindung des 16 2 Literaturübersicht Interferons an diesen „falschen“ Rezeptor kommt (ALCAMI und SMITH 1995). Angriffspunkte der Rotaviren sind die Interferon Regulations Faktoren (IRFs). Rotavirus NSP1 antagonisiert hierbei die Interferon Signaltransduktion durch Degradation von IRF3 (GRAFF et al. 2002, BARRO und PATTON 2005). Neue Studien konnten darlegen, das NSP1 auch für die Degradation von IRF5 und IRF7 verantwortlich ist (BARRO und PATTON 2007). NSP1 ist als ein „BreitspektrumAntagonist“ der IRFs anzusehen und vermittelt einen sehr effizienten Schutz vor zellulärem Interferon. 2.2.6 Anwendung von Interferonen In der Humanmedizin werden Interferone seit 1986 angewendet. In der EU sind ausschließlich rekombinant hergestellte IFNe zugelassen. Eingesetzt werden u.a. das rHuIFN-α2b (Intron A ®, Shering-Plough), rHuIFN-α2a (Roferon A ®, HoffmannLaRoche „Roche“®), rHuIFN-β1a (Avonex®, Biogen) und rHuIFN-β1b (Betaferon®, Schering-Plough). Natürliche und rekombinante IFNe haben eine kurze Halbwertzeit (3-6 Stunden) und daher nur ein kurzes Plateau des Wirkstoffspiegels (PICHLMAIR et al. 2004). Durch „Pegylierung“, einer kovalenten Bindung an Polyethylenglykol (PEG), kann die Halbwertszeit verlängert werden (PERRY und JARVIS 2001, 2002). In der EU zugelassen sind Pegintron® (Schering-Plough) und Pegasys® (HoffmanLaRoche). Indikationen für die Anwendung von α-IFN sind u.a.: Chronische Myeloische Leukämie (SILVER et al. 1999), Multiples Myelom (FRITZ und LUDWIG 2000) und Kutanes T-Zell-Lymphom (RUPOLI et al. 1999) und Hepatitis C (RUPOLI et al. 1999). Indikationen für die Anwendung von β-IFN stellt die Multiple Sklerose dar (RUDICK 1999). In höheren Dosierungen wurden zahlreiche Nebenwirkungen beschrieben, die von leichten klinischen Symptomen wie Müdigkeit über Übelkeit bis hin zu signifikanter Abnahme der Lymphozyten reichen (PESTKA 2007). Der Einsatz von humanem IFN bei Tieren wird durch die Speziesspezifität und Bildung Cytokinspezifischer neutralisierender Antikörper limitiert (MOCHIZUKI et al. 1994). In der Veterinärmedizin ist das rFeIFN-ω (Virbagen Omega ®) derzeit das einzige in der EU zugelassene veterinärmedizinische IFN. Die Zulassung beschränkt sich auf Infektionen mit dem caninen Parvovirus, dem felinen Leukämievirus (FeLV) und/oder dem felinen Immunschwächevirus (FIV). Das Glycoprotein rFeIFN-ω ist bei einem ph 17 2 Literaturübersicht Wert von 2 stabil, das Molekulargewicht beträgt 25kDa. Die Aminosäuresequenz ist zu 60% derjenigen des rHuIFN-α/ω, sowie zu 35% derjenigen des rHuIFN-β identisch (UEDA et al. 1993). Pharmakokinetisch wird rFeIFN-ω bei Hunden und Katzen vorwiegend in Leber und Nieren metabolisiert und über den Harn ausgeschieden. Zu einer Passage der Blut-Hirn-Schranke kommt es nicht (UEDA et al. 1993). Es liegen klinisch-experimentelle Studien vor, in denen IFN zur Therapie bei Virusinfektionen untersucht wurde. Dabei handelt es sich i.d.R. um Vorversuche oder Feldstudien. In vitro konnte eine hemmende Wirkung auf die Vermehrung des FeLV unter Verwendung von rHuIFN-α und bovinem IFN (rBoIFN-β) gezeigt werden (JAMESON und ESSEX 1983, CUMMINS et al. 1988). Placebo-kontrollierte Feldstudien demonstrierten, dass die Behandlung mit rFeIFN-ω von Katzen mit FeLV und/oder mit FIV Coinfektion eine statistisch signifikante Verbesserung der klinischen Symptome und eine Verlängerung der Überlebenszeit zur Folge hat (DE MARI K 2003). In vitro Studien haben gezeigt, das die Vermehrung des felinen Calicivirus (FCV), des felinen Herpesvirus 1 (FHV-1), des felinen Panleukopenievirus (FPV) und des felinen Coronavirus (FCoV) durch IFN gehemmt werden kann (MOCHIZUKI et al. 1994, MARTIN et al. 2002). Neuere Studien konzentrieren sich vor allem auf Auswirkungen unterschiedlicher Applikationsarten des IFN. Eine klinische Studie zur topischen Anwendung von rFeIFN–ω bei chronischer Gingivostomatitis der Katze hat gezeigt, dass durch subgingivale bzw. submukosale Verabreichung eine höhere therapeutisch wirksame Konzentration von IFN im Bereich der Entzündung erreicht wird (MIHALJEVIC 2003). Eine klinisch experimentelle Studie an spezifisch pathogenfreien (spf) Katzen zur konjunktivalen und oralen IFN Gabe zeigte hinsichtlich der IFN Wirkung eine Abhängigkeit von Dosis und Zeit (BRACKLEIN et al. 2006). Nach Konzentrationen konjunktivaler von 50–20000 und oraler Einheiten Applikation wurden von rFeIFN–ω Konjunktivalzellen in und Lymphozyten hinsichtlich der Mx Proteinexpression untersucht. Die Expression der Mx Proteine nahm mit sinkender IFN-Konzentration und steigender Zeitspanne nach Behandlung ab (BRACKLEIN et al. 2006). Eine neue experimentelle Anwendung ist die intratumorale Applikation. In einer Studie wurden Katzen mit Fibrosarkom einer Kombinationsbehandlung bestehend aus intratumoraler und subkutaner rFeIFN–ω 18 2 Literaturübersicht Injektion unterzogen. Schlussfolgerung der Studie ist, dass rFeIFN–ω gut toleriert wird und ein sicheres Medikament darstellt (HAMPEL et al. 2007). Die Wirksamkeit muß anhand weiterer Placebo-kontrollierter Studien jedoch erst belegt werden. In vitro führte die Behandlung von fünf felinen Fibrosarkomzell-Linien zu einer Erhöhung der Expression des MHC I (HAMPEL et al. 2007). Beim Hund konnten in vivo Studien belegen, dass rFeIFN–ω die Überlebensrate von Parvovirus-infizierten Hunden steigert (DE MARI K 2003). Die topische Anwendung wurde beim Hund mit der Indikation der Keratokonjunktivitis sicca (KCS) getestet. Die KCS ist eine Entzündung der Konjunktiva, der eine pathologische Reduktion der wässrigen Phase des Tränenfilms zugrunde liegt. Sie ist in dem meisten Fällen immunvermittelt (WILLIAMS 2008). Es konnte keine signifikante Senkung der Entzündung, keine qualitative Verbesserung des Tränenfilms oder der Tränenproduktion festgestellt werden (GILGER et al. 1999). Für das Rind ist derzeit kein rekombinantes Interferon in der EU zugelassen. Die Anwendung beschränkt sich auf wissenschaftliche Studien. Experimentell mit infektiösem bovinem Rhinotracheitis Virus (IBR) infizierte Kälber zeigten bei Behandlung mit bovinem IFN-β eine Reduktion der Morbidität und Mortalität (CUMMINS et al. 1988). Rinder, die mit bovinem Rotavirus infiziert wurden, zeigten unter Behandlung mit rHuIFN- α eine Reduktion der Morbidität (SCHWERS et al. 1985). Untersuchungen zur Empfänglichkeit boviner intrazellulärer Parasitosen (Theileria parva) gegenüber IFN zeigten eine signifikant niedrigere Infektion bei peroraler Behandlung mit rHuIFN-α (YOUNG et al. 1990). Es wurde keine Wirkung auf bovine intraerythrozytäre Parasiten (Babesia bigemina, Anaplasma marginale) nachgewiesen. Dies ist vermutlich auf das Fehlen eines Zellkerns in Erythrozyten und somit auf das Unvermögen auf IFN zu reagieren, zurückzuführen (ORINDA et al. 1993). Im Gegensatz dazu konnte eine Babesien - Parasitämie durch Verabreichung von rHuIFN-α gehemmt werden (ORINDA et al. 1994). Unerwünschte Wirkungen ließen sich bei Hunden und Katzen in Form von Apathie, Fressunlust, milder Anstieg der Atem- und Herzfrequenz, sowie Thrombozytopenie und Leukopenie nachweisen (LEOPOLD-TEMMLER 2002, DEMUTH 2005). 19 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Materialien 3.1.1 Virusnachweis (Retrospektive Studie) 3.1.1.1 Daten zum Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen Die Datensätze wurden mit freundlicher Genehmigung von der Firma LABOKLIN, Labor für Klinische Diagnostik GmbH & Co.KG Bad Kissingen (http://laboklin.de), zur Verfügung gestellt. Sie beinhalten folgende Informationen: • Befundschlüssel zur Identifizierung des Einsenders • Name und Adresse des Einsenders • Datum des Probeneinganges im Labor • Art, Rasse und Alter des beprobten Tieres • Ergebnis („positiv“/„negativ“) der Kotuntersuchung auf Coronavirus, Parvovirus und Rotavirus Bei den eingegangenen Proben handelt es sich ausschließlich um Kotproben durchfallerkrankter Hunde und Katzen. Sie wurden im Rahmen der Durchfalldiagnostik von Tierarztpraxen und Tierärztlichen Kliniken aus Deutschland und dem angrenzenden europäischen Ausland zur Firma LABOKLIN gesendet. Die Daten der Durchschnittstemperaturen Deutschlands über den Zeitraum von Januar 2000 bis Dezember 2006 wurden mit freundlicher Genehmigung vom Potsdam-Institut für Klimafolgenforschung (PIK), Potsdam zur Verfügung gestellt. Die Datensätze beinhalten die Temperaturen Deutschlands im Monatsdurchschnitt für die einzelnen Postleitzahlgebiete. 3.1.2 In vitro Experimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen Eine Auflistung der verwendeten Verbrauchsmaterialien, Geräte, Chemikalien, Puffer und Lösungen mit den jeweiligen Herstellerangaben befindet sich im Anhang. 20 3 Material und Methoden 3.1.2.1 Zelllinien Alle verwendeten Zelllinien wurden durch Dr. Riebe von der Zellbank für Zelllinien in der Veterinärmedizin am Friedrich-Loeffler Institut, Insel Riems, zur Verfügung gestellt. Tab. 3. Übersicht der verwendeten Zelllinien Bezeichnung Zellart Verwendetes Wachstumsmedium MA 104 Embryonale Nierenzelllinie ZB 5 der Grünen Meerkatze Vero Nierenzelllinie der Grünen ZB 5 Meerkatze LEO Leopardenzelllinie ZB 28 KE-R Feline embryonale ZB 21 Fibroblastenzelllinie KG-R Feline embryonale ZB 21 Gehirnzelllinie MDCK Canine Nierenzelllinie ZB 5 MDBK Bovine Nierenzelllinie ZB 5 BoMac Bovine Peritoneal- ZB 5 makrophagenzelllinie HRT-18 Humane Rektum- ZB 5 Adenokarzinomzelllinie Panc-1 Humane ZB 5 Pankreaskarzinomzelllinie 21 3 Material und Methoden 3.1.2.2 Zellkulturmedien Die Zellkulturmedien sind folgend zusammengesetzt: Medium ZB 5: 0,532% MEM Hanks, 0,476 MEM Earle, 0,125% NaHCO3, 1% NEAS(100x), 0,012% Na Pyruvat und 10% FKS. Medium ZB 12 (Serumfreies Medium) 3,75% Hanks A (enthält: 16% NaCl, 0,8% KCl, 0,2% MgSO4.7H2O und 0,056% CaCl.2H2O), 3,75% Hanks B (enthält: 2% Dextrose, 0,12% Na2HPO4. 2H2O und 0,12% KH2PO4), 0,126% NaHCO3, 0,27% LAH, 0,375% Leibovitz und 0,375% Phenolrot 0,4%. Medium ZB 19 1,046% RPMI, 0,2% NaHCO3 und 10% FKS. Medium ZB 21 1,063% MEM Hanks, 0,085% NaHCO3 und 10 % FKS. Medium ZB 28 0,532% F12, 0,88% Iscove’s modifiziertes Dulbeccos Medium und 0,245% NaHCO3. 3.1.2.3 Interferone Felines Interferon Das rekombinante feline Interferon-ω (rFeIFN-ω; Virbagen® Omega) wurde durch die Virbac Tierarzneimittel GmbH URL:http://virbac.de zur Verfügung gestellt. Es lag in Form eines Lyophilisates vor, welches durch Lösung in 1 ml des mitgelieferten Excipiens, eine Gebrauchslösung von 10 Mio. Einheiten rFeIFN-ω ergibt. Die Gebrauchslösung wurde bei 4°C gelagert, eine Arbeit slösung von 1 Mio. Einheiten wurde unmittelbar vor Gebrauch angefertigt. 22 3 Material und Methoden Humanes Interferon Das rekombinante humane Interferon-α (Hu-IFN-αA) wurde von der Firma SigmaAldrich Chemie GmbH URL:http://sigma-aldrich.com erworben. Es lag gelöst in PBS in einer Konzentration von 4x106 Einheiten vor. Die Lagerung der Gebrauchslösung erfolgte bei -70°C, eine Arbeitslösung von 1 Mio. E inheiten wurde unmittelbar vor Gebrauch angefertigt. Bovines Interferon Das rekombinante bovine Interferon-α (boIFN-α) wurde von Dr. Keil, Labor für Molekularbiologie, Friedrich-Loeffler Institut, Insel Riems, zur Verfügung gestellt. Es lag gelöst in PBS in einer Konzentration von 1 x 106 Einheiten vor. Die Gebrauchslösung entsprach der Arbeitslösung, sie wurde bei -20°C gelagert. 3.1.2.4 Antikörper α-Rotavirus VP6 Serum Labor Vahlenkamp, FLI Insel Riems α-rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen, Karlsruhe α-mouse IgG POD Dianova GmbH, Hamburg α-mouse IgG FITC Invitrogen, Karlsruhe α-Mx M143 Universitätsklinikum, Freiburg α-MHC I IgG Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München 3.1.2.5 Virusstamm Feline Rotaviren Die felinen Rotaviren (FR-5, FR-6) wurden aus Originalkot durchfallerkrankter Katzen isoliert und auf der Zelllinie MA104 als Virusstamm angezogen. 23 3 Material und Methoden 3.2 Methoden 3.2.1 Virusnachweis (Retrospektive Studie) 3.2.1.1 Daten zum Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen Die Durchführung des Tests auf Coronavirus erfolgte mittels mit Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) (GUT et al. 1999), nach RNA Isolierung mit dem “QIAamp Viral RNA“-Mini-Kit (Qiagen Sample&Technologies, Deutschland) nach Herstelleranleitung. Der Nachweis von caninem Parvovirus und felinem Panleukopenievirus erfolgte mittels PCR (LABOKLIN), nach Isolation der DNA mit dem „Invisorb PSP Spin Stool Kit“ (Invitek GmbH, Deutschland) nach Herstelleranleitung. Der Nachweis von caninem und felinem Rotavirus erfolgte mittels Serazym® Rotavirus Antigen ELISA der Fa. Seramun Diagnostica GmbH, Wolzig, nach Herstelleranleitung. 3.2.1.2 Statistische Auswertung und Software Die Auswertung der Daten erstreckte sich über den Zeitraum von Januar 2000 bis Dezember 2006. Alle Daten wurden retrospektiv ausgewertet. Die statistische Auswertung erfolgte mit den Softwarepaketen SPSS 16.0® für Windows, MS Access®, MS Excel® und BIAS® für Windows. Für die Untersuchungen auf statistisch relevante Unterschiede wurden zwei Signifikanztests benutzt. Zum einen finden Konfidenzintervalle und zum anderen der χ2 (Chi-Quadrat) Test Anwendung. Das Konfidenzintervall (= Vertrauensintervall) erlaubt Aussagen über die Präzision eines Parameters (z. B. des Mittelwertes). Es gibt den Bereich an, der den jeweils wahren Wert mit hoher Wahrscheinlichkeit einschließt. Somit ist es möglich zu ermitteln, ob sich errechnete Mittelwerte statistisch signifikant unterscheiden. Für das am häufigsten genutzte Konfidenzintervall von P = 95% heißt das, das in 95 von 100 Fällen das errechnete Intervall den wahren Wert enthält. In der graphischen Darstellung werden Hoch-Tief-Schlussdiagramme verwendet. Überschneiden sich die Balken nicht, werden die Mittelwerte als signifikant unterschiedlich bezeichnet. Der χ2 (Pearsons Chi-Quadrat) Test für unabhängige Stichproben wird verwendet, um Verteilungseigenschaften der Grundgesamtheit zu untersuchen. Er sagt aus, ob zwischen 24 beobachteten Merkmalen ein 3 Material und Methoden wahrscheinlicher Zusammenhang besteht oder nicht. Dabei dient die Differenz (= Residuum) zwischen beobachtetem und erwartetem Wert als Kriterium für die statistische Signifikanz. Um die Abweichung zu beurteilen, werden standardisierte Residuen berechnet. Standardisierte Residuen ≥2,0 werden als signifikant unterschiedlich bezeichnet. Als Nullhypothese für die vorliegende retrospektive Studie wurde zugrunde gelegt, dass die zu vergleichenden Merkmale sich nicht unterscheiden. Die Nullhypothese wird bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 verworfen. 3.2.2 In vitro Experimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen 3.2.2.1 Kultivierung der Zellen Die Kultivierung der Zellen erfolgte in Zellkulturflaschen mit einer Grundfläche von 25 cm2 oder 75 cm2. Während der Inkubationsperioden wurden die Zellkulturflaschen im Brutschrank bei 37°C Lufttemperatur und einem CO 2-Gehalt von 5% gelagert. Eine Kontrolle des Zellrasens wurde täglich vorgenommen. Bei Ausbildung eines konfluenten Zellrasens wurden die Zellen umgesetzt. Dazu wurde das Medium abgesaugt und der Zellrasen mit 1 ml Trypsinlösung (ATV) beschichtet. Nach Absaugen des ATV wurde der Zellrasen mit 500µl (auf 25 cm2) oder 1000µl (auf 75 cm2) ATV beschichtet und für ca. 5 – 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Nachdem sich die Zellen vom Flaschenboden gelöst haben, wurden 5 ml des entsprechenden Wachstumsmediums zugefügt. Die Zählung der Zellen erfolgte in einer Neubauer Zählkammer. Bei der Zählung wurden ausschließlich lebende, mit Trypanblau gefärbte, Zellen berücksichtigt. Anschließend wurde eine entsprechende Menge der Zellsuspension in neue Zellkulturflaschen überführt. 3.2.2.2 Messung der Zellproliferation 3.2.2.2.1 Prinzip Die Färbung der Zellen mit Carboxyfluoreszein Diazetat Succimidyl-Ester (CFSE) wurde verwendet um Untersuchungen hinsichtlich der Zellproliferation und Zytotoxizität gegenüber den verwendeten Interferonen durchzuführen. CFSE wird als farbloses und nicht fluoreszierendes Molekül durch Diffusion in die Zelle aufgenommen. Intrazellulär werden die Azetatgruppen durch intrazelluläre Esterasen 25 3 Material und Methoden abgespalten. Diese Abspaltung führt zur Entstehung des fluoreszierenden Carboxyfluoreszein Succimidyl-Ester. Die Succimidyl-Estergruppen reagieren mit intrazellulären Aminen, so dass entstandene fluoreszierenden Konjugate die Zelle nicht mehr verlassen. Das fluoreszierende Konjugat wird bei jeder Zellteilung zu gleichen Teilen an die Tochterzellen weitergegeben. Diese Tatsache ermöglicht bei einer anschließenden Analyse der CFSE Menge in den Zellen, mittels Durchflußzytometrie, Rückschlüsse auf die Zellproliferation. 3.2.2.2.2 Experimentelle Durchführung Zunächst wurde eine 5 mM CFSE-Lösung nach Herstellerangaben hergestellt. Anschließend wurden die Zellen der unterschiedlichen Zelllinien trypsiniert und in 5 ml des entsprechenden Wachstumsmediums resuspendiert. Die Färbung der Zellen erfolgte durch Zugabe von 2 µl CFSE/106 Zellen über 10 Minuten bei 37°C. Die Reaktion wurde mit eiskaltem Medium gestoppt. Anschließend wurden vom rekombinanten felinen IFN-ω, humanen IFN-α und bovinen IFN-α Verdünnungen von 10, 100, 1000, 10000 Einheiten/ml in PBS angefertigt. In einer Mikrotiterplatte mit 6 Reaktionsvertiefungen wurden, wie in Abb. 4 dargestellt, jeweils 1x106 Zellen/ml mit unterschiedlichen Mengen IFN (104-101 Einheiten/ml) für 5 Tage bei 37°C inkubiert. Der Zellrasen wurde täglich begutachtet. Die Analyse der in den Zellen enthaltenen Menge CFSE wurde mittels Durchflußzytometrie an Tag 3, 4 und 5 vorgenommen. 26 3 Material und Methoden 1 2 3 4 5 6 Abb. 4. Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 6 Reaktionsvertiefungen zur Messung der Zellproliferation 6 4 6 3 6 2 6 1 1 1x10 Zellen/ml mit 10 Einheiten IFN/ml 2 1x10 Zellen/ml mit 10 Einheiten IFN/ml 3 1x10 Zellen/ml mit 10 Einheiten IFN/ml 4 1x10 Zellen/ml mit 10 Einheiten IFN/ml 5 1x10 Zellen/ml ohne IFN (Negativkontrolle) 6 1x10 Zellen/ml ohne CFSE, ohne IFN (Negativkontrolle) 6 6 3.2.2.3 Durchflußzytometrie 3.2.2.3.1 Prinzip Das Prinzip der Durchflußzytometrie (Abb. 5) basiert auf den optischen Eigenschaften einer Zelle. Die zu untersuchende monodisperse Zellsuspension wird an einem Laserstrahl vorbeigeführt, wobei der Laserstrahl der Zellgröße und der Granularität der Zelle entsprechend abgelenkt wird und als Streulicht von zwei Detektoren (Vorwärtsstreulicht [FSC – Forward Scatter] und Seitwärtsstreulicht [SSC – Sideward Scatter]) erfasst wird. Mit zunehmender Größe und Granularität der Zellen werden sie im Dot-Plot des Vorwärts bzw. Seitwärtsstreulichts auch größer dargestellt (Abb. 6). 27 3 Material und Methoden Seitwärtsstreulicht Detektor LASER Vorwärtsstreulicht Detektor Abb. 5. Vereinfachtes Schema der Durchflußzytometrie. Der durch Größe und Granulation der Zellen unterschiedlich abgelenkte Laserstrahl wird mit den beiden Detektoren aufgefangen und für jede individuelle Zelle bildlich in einem Punktehistogramm, dem sog. Dot-Plot, dargestellt (siehe Abb. 6). Zur graphischen Veranschaulichung werden die Zellen in einem Punktehistogramm, dargestellt. Dabei kennzeichnet die x-Achse das Vorwärtstreulicht und die y-Achse das Seitwärtsstreulicht. 28 3 Material und Methoden Abb. 6. Streulicht Dot-Plot. Die Zellen werden nach ihrem Vorwärts (x-Achse) und Seitwärtsstreulicht (Y-Achse) im Diagramm dargestellt. Partikel mit ähnlichen Streulichteigenschaften häufen sich im gleichen Bereich an. Kleine Zellen mit wenig Granula (blau) sammeln sich im niedrigen Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtbereich an, während große Zellen mit viel Granula im oberen Bereich beider Streulichteigenschaften liegen(rosa). Die Durchflußzytometrie kann auch zur Messung von Fluoreszenslicht benutzt werden. Dazu werden z. B. Zellantigene mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert oder Zellen mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Fluorochrome absorbieren das Anregungslicht des Lasers und senden Fluoreszenslicht einer charakteristischen Wellenlänge aus. Graphisch werden die Fluoreszensmessungen u.a. im Dot-Plot (Abb. 6) und im Linien-Histogramm dargestellt (Abb. 7). Dadurch können die Zellpopulationen hinsichtlich unterschiedlicher Eigenschaften getrennt voneinander analysiert werden. 29 3 Material und Methoden Abb. 7. Linien-Histogramm bei Zellfärbung mit CFSE. Die Zellen werden nach ihrer Anzahl (y-Achse) und nach dem Grad der Färbung mit CFSE (x-Achse) im Diagramm dargestellt. Im Beispiel erkennt man mit CFSE markierte Zellen (grün) und CFSE freie Zellen (rot) am Tag der Einsaat. Die mehrfarbigen Linien zeigen bereits mehrfach geteilte Zellen am Tag 5 nach Einsaat, ersichtlich an der reduzierten Menge CFSE. 3.2.2.3.2 Experimentelle Durchführung Analyse der Zellen fand jeweils nach 3, 4 und 5 tägiger Inkubation statt. Dazu wurde das Medium abgesaugt, der Zellrasen mit ATV gelöst, die Zellsuspension für 5 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert und anschließend resuspendiert. Folgend wurden die Zellen im FACScan hinsichtlich ihres CFSE Gehaltes analysiert. Konnte die Analyse nicht direkt im Anschluss an die Ernte erfolgen, wurden die geernteten Zellen durch Zugabe von 150 µl PBS und 150 µl 4% Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C verwahrt. Die im FACScan gemessenen Daten wurde n mit Hilfe der Software CellQuest®pro graphisch dargestellt. Die Grundeinstellungen wurden vor den Messungen als Standardmaske definiert. Das gate wurde entsprechend der 30 3 Material und Methoden unterschiedlichen Zelllinien angepasst. Bei jeder Messung wurden 10.000 Zellen analysiert. 3.2.2.4 Nachweis des Mx Proteins 3.2.2.4.1 Herstellung der Zelllysate Jeweils 1x106 Zellen/ml felinen (LEO, KE-R, KG-R), caninen (MDCK), bovinen (MDBK) und humanen (HRT-18, Panc-1) Ursprunges, sowie zwei Affenzelllinien (MA104, Vero) wurden in Mikrotiterplatten mit 6 Reaktionsvertiefungen eingesät. Die Zellen wurden mit rekombinantem felinen IFN-ω, bovinen IFN-α und humanen IFN-α in Verdünnungen von 101-105 Einheiten/ml behandelt und über 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur Herstellung des Zelllysates wurde das Medium abgesaugt, der Zellrasen mit PBS gereinigt und nachfolgend mit jeweils 300 µl Lysispuffer behandelt, in der Reaktionsvertiefung resuspendiert und in Eppendorfgefäße überführt. Zur Aufbrechung von Disulfidbrücken wurde den Eppendorfgefäßen jeweils 1,5 µl β-Mercaptoethanol zugesetzt. Es folgte eine Ultraschallbehandlung für 20 Sekunden. Abschließend wurden die Proben für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und anschließend auf 4°C abgekühlt. 3.2.2.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration Die Bestimmung der quantitativen Proteinkonzentration im Zelllysat erfolgte mit Hilfe der Biuret Reaktion (SMITH et al. 1985). Durch Zusetzen von Bicinchoninsäure bildet sich ein violetter Absorbsionsmaximum wasserlöslicher aufweist und Komplex, es somit der bei ermöglicht 562 nm sein photometrische Quantifizierungen von Proteinen in wässriger Lösung vorzunehmen. Es wurde eine Standardreihe angefertigt, indem neben einer mit Aqua dest. gefüllten Leerprobe (zur Eichung des Photometers), Proteinlösungen mit bovinem Serumalbumin in aufsteigender Konzentration hergestellt wurden. Die Biuretreaktion wurde nach Herstellerangaben durchgeführt und die Proben nach 30 minütiger Inkubation bei 60°C bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen. Die Standartverdünnung ergibt eine Eichkurve, die eine lineare Beziehung zwischen Proteinkonzentration und Extinktion widerspiegelt. Somit kann eine direkte Umrechnung des gemessenen Extinktionswertes in die zugrundeliegende Proteinkonzentration der Probe erfolgen. 31 3 Material und Methoden 3.2.2.4.3 Gelelektrophorese Grundlage bildete die von Laemmli (LAEMMLI Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese 1970) modifizierte (SDA-Page), bei der denaturierte Proteine in Abhängigkeit ihres Molekulargewichts elektrophoretisch aufgetrennt werden. Zwanzig µl des Proteingemischs wurden elektrophoretisch über 40 Minuten bei 200 Volt aufgetrennt. 3.2.2.4.4 Western Blot Der Transfer der elektrophoretisch getrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran fand bei 14 Volt über 90 Minuten statt. Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran für 15 Stunden in 5%-ige Magermilch gelegt, um freie Proteinbindungsstellen zu besetzten und unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern. 3.2.2.4.5 Analyse der Expression des Mx Proteins Der monoklonale anti-Mx Antikörper M143 (FLOHR et al. 1999) wurde in einer Konzentration von 1:500 aufgetragen und bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Peroxidase gekoppelten anti-Maus IgG in einer Verdünnung von 1:10000 inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mittels Enhanced Chemolumineszens (LightShift Chemiluminescent EMSA Kit, Thermo Fisher Scientific Inc, USA) dargestellt. Dabei wurde durch die enzymatische Aktivität der an den Sekundärantikörper gekoppelten Peroxidase, die Oxidation von Luminol katalysiert. Die entstehende Chemolumineszenz wurde auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht. 32 3 Material und Methoden 3.2.2.5 Induktion antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle 3.2.2.5.1 Inkubation mit Interferon Jeweils 1 x 106 Zellen/ml felinen (KE-R) und caninen (MDCK) Ursprunges, sowie eine Affenzelllinie (MA104) wurden auf Mikrotiterplatten mit 6 Reaktionsvertiefungen eingesät, mit rFeIFN-ω sowie rHuIFN-α in Verdünnungen von 101-104 Einheiten/ml behandelt und bei 37°C über 48 Stunden inkubiert. 3.2.2.5.2 Färbung der MHC I Moleküle Dazu wurden 1x106 Zellen/ml in FACS Röhrchen überführt und für 5 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert, resuspendiert und erneut für 5 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert. Nachfolgend wurde das „Pellet“ in 100 µl ZB 12 resuspendiert und mit 50 µl des monoklonalen MHC I Antikörpers für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen. Abschließend wurden die Zellen in 100 µl PBS aufgenommen und mit einem FITC konjugiertem anti-mouse IgG, für 20 Minuten bei 4°C in Dunkelheit inkubiert . Die Zellen wurden dreimal gewaschen und im FACScan® Durchflußzytometer hinsichtlich ihrer antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle analysiert. 3.2.2.6 In vitro Infektionsexperimente 3.2.2.6.1 Infektion und IFN Behandlung feliner Zelllinien Jeweils 1x106 Zellen/ml KE-R und KG-R wurden in Mikrotiterplatten mit 6 Reaktionsvertiefungen eingesät und über 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen mit 30 µl eines felinen Rotavirus (≥104 TCID50) in ZB 12 mit 0,05% Trypsin behandelt. KE-R Zellen wurden mit dem felinen Rotavirus FR-5, KG-R Zellen mit dem felinen Rotavirus FR-6 infiziert. Die Mikrotiterplatten wurden für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde den Zellen 2 ml ZB 12, 60 µl FKS 3%, 40 µl Trypsin und 20 µl rekombinantem felinen IFN-ω in Verdünnungen von 101 – 104 Einheiten/ml hinzugefügt. Die Mikrotiterplatten wurden über weitere 48 Stunden bei 37°C inkubiert. 33 3 Material und Methoden 3.2.2.6.2 Immunfluoreszenz Zwei Tage post infectionem (p.i.) wurde der Überstand der Mikrotiterplatten abgesaugt. Die Zellen wurden mit 90% Aceton für 20 Minuten bei -20°C fixiert. Anschließend wurde der Zellrasen mit jeweils 2 ml PBS/FKS 10% zur Blockierung unspezifischer Bindungen für 45 Minuten überschichtet. Folgend wurde als Primärantikörper anti-VP6 in einer Verdünnung von 1:100 aufgetragen und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Mikrotiterplatten mit PBS für jeweils 10 Minuten, wurde der Alexa Fluor 488 fluorchrommarkierte Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:100 bei Dunkelheit für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach abschließendem Waschvorgang erfolgte die Analyse im Fluoreszenzmikroskop. (Abb. 8) A B Abb. 8. Fluoreszenzmikroskopisches Bild. (A) Zellbild unter dem Mikroskop bei 20facher Vergrößerung; die Zellen sind homogen gefärbt, es ist kein Fluoreszenzsignal vorhanden. (B) Zellbild unter dem Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung; einige Zellen zeigen ein deutliches Fluoreszenzsignal (hell-grün), das gesuchte Antigen ist anwesend. 34 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen (Retrospektive Studie) 4.1.1 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden 4.1.1.1 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden im Zeitraum von 2000 bis 2006 Insgesamt wurden 3536 Proben von 2055 Hunden und 1481 Katzen aus Deutschland und von 159 Hunden, sowie 117 Katzen aus dem anliegenden europäischen Ausland untersucht. Bei 223 von 2055 Hunden und 214 von 1481 Katzen konnten Virusinfektionen nachgewiesen werden. Bei den verbleibenden 1832 Hunden und 1267 Katzen konnten keine der untersuchten Viren nachgewiesen werden. Der absolute Nachweis viraler Infektionen und der statistischen Prävalenz der einzelnen Viren ist in Abb. 9 dargestellt. Im Diagramm erfolgte keine Unterscheidung hinsichtlich bestehender Einfach- und/oder Mehrfachinfektionen. Beim Hund beträgt die absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen n = 141, Coronavirusinfektionen n = 177 und Parvovirusinfektionen n = 163. Bei der Katze beträgt die absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen n = 119, Coronavirusinfektionen n = 190 und Parvovirusinfektionen n = 113. Die statistische Prävalenz im Untersuchungsmaterial erkrankter Tiere beträgt für Rotavirusinfektionen 0,07 beim Hund und 0,08 bei der Katze. Die statistische Prävalenz für Coronavirusinfektionen ist vergleichsweise höher mit 0,09 bei Hunden und 0,13 bei Katzen. Für Parvovirusinfektionen beträgt die statistische Prävalenz bei Hunden und Katzen jeweils 0,08. 35 4 Ergebnisse Absolute Anzahl nachgewiesener Infektionen 200 190 177 180 163 160 140 141 Rotavirus Coronavirus 119 120 100 (0,09) 80 113 Parvovirus (x) (0,13) Statistische Prävalenz (0,08) Getestete Hunde: 2055 (0,07) 60 (0,08) Getestete Katzen: 1481 (0,08) 40 20 0 Hund Katze Abb. 9. Absolute Anzahl und statistische Prävalenz viraler Infektionen der Jahre 2000-2006 Abbildung 10 stellt die absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen (y1-Achse) der einzelnen Jahre und die dazugehörige absolute Anzahl eingegangener Kotproben (y2-Achse) dar. Ab 2004 kann sowohl bei Hunden als auch bei Katzen eine Erhöhung der nachgewiesenen Virusinfektionen bei annähern gleichbleibendem Probeneingang verzeichnet werden. Eine statistisch signifikant höhere Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen besteht bei Hunden für Rota-, und Parvovirusinfektionen in den Jahren 2005 und 2006, für Coronavirusinfektionen im Jahr 2005 (Tab. 4 a-c). Bei den Katzen für Rota- und Parvovirusinfektionen in den Jahren 2005 und 2006, für Coronavirusinfektionen in den Jahren 2004, 2005 und 2006 (Tab. 5 a-c). 36 4 Ergebnisse Absolute Anzahl erkrankter Tiere Absolute Anzahl eingegangener Proben 80 330 70 320 60 310 50 300 40 290 30 280 20 270 10 260 Hund 0 250 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Absolute Anzahl erkrankter Tiere Absolute Anzahl eingegangener Proben 80 330 70 280 60 230 50 180 40 130 30 80 20 30 10 Katze 0 -20 2000 2001 2002 2003 2004 Rotavirus 2005 Coronavirus 2006 Parvovirus Probeneingang Abb. 10. Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen der Jahre 2000-2006 im Verhältnis zur absoluten Anzahl eingegangener Kotproben 37 4 Ergebnisse Jahr 2000 Rotavirus negativ Count positiv Total 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Total 272 262 271 303 257 284 265 Std. Residual 0,5 0,3 0,4 0,9 -0,4 -1,0 -,6 Count 12 14 13 6 26 39 31 Std. Residual -1,7 -1,1 -1,5 -3,3 1,5 3,6 2,4 Count 284 276 284 309 283 323 296 1914 141 2055 Tab. 4a. Absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen beim Hund Jahr 2000 Coronavirus negativ Count positiv Total 2001 2002 2003 2004 2005 2006 266 256 264 297 251 281 263 Std. Residual 0,4 0,2 0,3 0,9 -0,5 -0,8 -0,5 Count 18 20 20 12 32 42 33 Std. Residual -1,3 -0,8 -0,9 -2,8 1,5 2,7 1,5 Count 284 276 284 309 283 323 296 Total 1878 177 2055 Tab. 4b. Absolute Anzahl nachgewiesener Coronavirusinfektionen beim Hund Jahr 2000 Parvovirus negativ Count positiv Total 2001 2002 2003 2004 2005 2006 270 255 268 296 255 285 263 Std. Residual 0,5 0,1 0,4 0,7 -0,3 -0,7 -0,6 Count 14 21 16 13 28 38 33 Std. Residual -1,8 -,2 -1,4 -2,3 1,2 2,4 2,0 Count 284 276 284 309 283 323 296 Tab. 4c. Absolute Anzahl nachgewiesener Parvovirusinfektionen beim Hund 38 Total 1892 163 2055 4 Ergebnisse Jahr 2000 Rotavirus negativ Count Total 2002 2003 2004 2005 2006 Total 155 207 182 204 193 202 219 0,9 0,9 1,0 0,9 -0,3 -1,5 -1,5 2 4 2 4 21 42 44 Std. Residual -3,0 -3,1 -3,3 -3,1 0,9 5,1 5,0 Count 157 211 184 208 214 244 263 Std. Residual positiv 2001 Count 1362 119 1481 Tab. 5a. Absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen bei der Katze Jahr 2000 Coronavirus negativ Count Total 2002 2003 2004 2005 2006 153 207 179 204 175 174 199 1,4 1,7 1,5 1,7 -0,8 -2,7 -2,0 4 4 5 4 39 70 64 Std. Residual -3,6 -4,4 -3,8 -4,4 2,2 6,9 5,2 Count 157 211 184 208 214 244 263 Std. Residual positiv 2001 Count Total 1291 190 1481 Tab. 5b. Absolute Anzahl nachgewiesener Coronavirusinfektionen bei der Katze Jahr 2000 Parvovirus negativ Count Total 2002 2003 2004 2005 2006 154 205 181 200 195 211 222 0,7 0,7 0,8 0,6 -0,2 -1,0 -1,3 3 6 3 8 19 33 41 Std. Residual -2,6 -2,5 -2,9 -2,0 0,7 3,3 4,7 Count 157 211 184 208 214 244 263 Std. Residual positiv 2001 Count Tab. 5c. Absolute Anzahl nachgewiesener Parvovirusinfektionen bei der Katze 39 Total 1368 113 1481 4 Ergebnisse 4.1.1.2 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich Einzel– und Mehrfachinfektionen Begriffsdefinitionen Die untersuchten viralen Erreger im Probenmaterial wurden in Einzel- und Mehrfachinfektionen eingeteilt. Die verwendeten Begriffe „Einfach- resp. Mono-, Zweifach- und Dreifachinfektion“ beinhalten ausschließlich die Infektion mit einem, zwei oder allen drei Erregern. Der verwendete Begriff „Coinfektion resp. Mehrfachinfektion“ hingegen wurde definiert als die Beteiligung von mindestens zwei Erregern, wobei eine Beteiligung eines dritten Erregers nicht ausgeschlossen ist. 4.1.1.2.1 Einzelinfektionen Um Vergleiche zwischen den Virusinfektionen zu ermöglichen, wurden 8 Gruppen gebildet. Gruppe I-III sind ausschließlich Monoinfektionen, Gruppe IV-VI ausschließlich Zweifachinfektionen, Gruppe VII ausschließlich Dreifachinfektionen und Gruppe VIII klinisch erkrankte Tiere ohne Nachweis der untersuchten Viren. Hunde und Katzen mit nachgewiesenen Mehrfachinfektionen wurden für die Berechnungen nur einmal in den jeweiligen Gruppen verwendet, sie wurden nicht zu den Monoinfektionen hinzugezählt. Von 2055 untersuchten Kotproben des Hundes wurden 13 (0,6%) Rotavirusmonoinfektionen, 47 (2,3%) Coronavirusmonoinfektionen und 30 (1,5%) Parvovirusmonoinfektionen nachgewiesen. Es konnten keine Zweifachinfektionen mit Rota- und Coronavirus, 3 (0,1%) Zweifachinfektionen mit Rota- und Parvovirus, sowie 5 (0,2%) Zweifachinfektionen mit Corona- und Parvovirus nachgewiesen werden. Ein Nachweis aller drei Viren fand bei 125 (6,1%) Kotproben statt. Bei 1832 (89,1%) Kotproben konnten keine der drei untersuchten Viren nachgewiesen werden (Tab. 6). 40 4 Ergebnisse Tab. 6. Infektionen des Hundes 2000-2006 Anzahl I Monoinfektion Rota 13 0,6 II Monoinfektion Corona 47 2,3 III Monoinfektion Parvo 30 1,5 IV Rota + Corona 0 0 V Rota + Parvo 3 0,1 VI Corona + Parvo 5 0,2 125 6,1 1832 89,1 2055 100,0 VII Rota + Corona + Parvo VIII Kein Nachweis der untersuchten Viren Gesamt Von 1481 % untersuchten Kotproben der Katze konnten 11 (0,7%) Rotavirusmonoinfektionen, 78 (5,3%) Coronavirusmonoinfektionen und 12 (0,8%) Parvovirusmonoinfektionen nachgewiesen werden. Es konnten 12 (0,8%) Zweifachinfektion mit Rota- und Coronavirus, 1 (0,1%) Zweifachinfektion mit Rotaund Parvovirus, 5 (0,3%) Zweifachinfektionen mit Corona- und Parvovirus nachgewiesen werden. In 95 (6,4%) Kotproben konnten alle drei Viren nachgewiesen werden. Den größten Anteil bildet Gruppe VIII mit 1267 (85,6%) Proben. (Tab. 7). 41 4 Ergebnisse Tab. 7. Infektionen der Katze 2000-2006 Anzahl % I Monoinfektion Rota 11 0,7 II Monoinfektion Corona 78 5,3 III Monoinfektion Parvo 12 0,8 IV Rota + Corona 12 0,8 V Rota + Parvo 1 0,1 VI Corona + Parvo 5 0,3 95 6,4 1267 85,6 1481 100,0 VII Rota + Corona + Parvo VIII Kein Nachweis der untersuchten Viren Gesamt Es wurde untersucht, ob ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen besteht. Dazu wurden die jeweiligen Konfidenzintervalle (P=95%) berechnet und graphisch dargestellt (Abb. 11a, 11b). 42 4 Ergebnisse 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 I II III IV V VI VII VIII I II III IV V VI VII VIII a 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 b Abb. 11. Konfidenzintervalle der Gruppen I-VIII. (a) Konfidenzintervalle für die Gruppeneinteilung bei Hund. (b) Konfidenzintervalle für die Gruppeneinteilung bei der Katze. Aufgetragen sind auf der y-Achse das Konfidenzintervall P und auf der xAchse die jeweiligen Gruppen. Überschneiden sich die Balken nicht, spricht man von einem signifikanten Unterschied. Die Konfidenzintervalle für Gruppe VIII liegen jeweils weit über die Skalierung der y-Achse hinaus bei 0,84 bis 0,90. Im untersuchten Probenmaterial kommen somit Enteritiden nichtviraler Genese signifikant häufiger vor, als Enteritiden viraler Genese. 43 4 Ergebnisse Sowohl bei Hunden als auch bei Katzen wurden Infektionen ohne nachgewiesene Virusätiologie (VIII), im Vergleich zu den übrigen Gruppen, statistisch signifikant häufiger nachgewiesen. Die Unterschiede der Gruppen I bis VII stellen sich beim Hund folgend dar: Rotavirusmonoinfektionen wurden signifikant häufiger nachgewiesen als Zweifachinfektionen der Gruppe IV und V. Sie kommen jedoch signifikant weniger häufig vor als die Monoinfektion mit Corona- und Parvovirus, sowie eine Infektion mit allen drei Viren. Coronavirusmonoinfektionen wurden signifikant häufiger nachgewiesen als Rotavirusmonoinfektionen und Zweifachinfektionen. Sie wurden signifikant weniger häufig nachgewiesen als Dreifachinfektionen. Parvovirusmonoinfektionen wurden signifikant häufiger nachgewiesen als Rotavirusmonoinfektionen und Zweifachinfektionen, kommen jedoch signifikant weniger häufig vor als Dreifachinfektionen. Die Zweifachinfektionen Rota- und Coronavirus, sowie Rota- und Parvovirus wurden signifikant weniger häufig nachgewiesen als die Mono- und Dreifachinfektionen. Die Kombination Corona- und Parvovirus konnte signifikant weniger häufig als die Coronavirusmono- und Dreifachinfektionen nachgewiesen werden. Die Infektion aller drei Viren wurde statistisch signifikant häufiger nachgewiesen als die Gruppen I bis VI. Katzen zeigen vom Hund abweichende Ergebnisse: Rotavirusmonoinfektionen wurden signifikant häufiger nachgewiesen als die Zweifachinfektion mit Rota- und Parvovirus, jedoch signifikant weniger häufig als Coronavirusmonoinfektionen und die Dreifachinfektionen. Coronavirusmonoinfektionen kommen signifikant häufiger vor als Rota- und Parvovirusmonoinfektionen, sowie die Zweifachinfektionen. Parvovirusmonoinfektionen wurden signifikant häufiger nachgewiesen als die Zweifachinfektion mit Rota- und Parvovirus, jedoch signifikant weniger häufig als Coronavirusmonoinfektionen und Infektionen mit allen drei Viren. 44 4 Ergebnisse Zweifachinfektionen mit Rota- und Coronavirus kommen signifikant häufiger vor als Rota- und Parvovirusinfektionen und weniger häufig als Coronavirusmonoinfektionen und Dreifachinfektionen. Die Infektion mit allen drei Viren wurde signifikant häufiger nachgewiesen als Rotaund Parvovirusmonoinfektionen und Zweifachinfektionen. 4.1.1.2.2 Coinfektionen Bei Hunden und Katzen kommen Coinfektionen, d.h. Infektionen mit der Beteiligung von mindestens zwei Viren, häufiger vor, als Monoinfektionen. Beim Hund wurden 125 (6,08%) Coinfektionen mit Beteiligung von Rota- und Coronavirus, 130 (6,33%) mit Beteiligung von Corona- und Parvovirus, sowie 128 (6,23%) mit Beteiligung von Rota- und Parvovirus nachgewiesen (Abb.12). Bei der Katze wurden 119 (8,04%) Coinfektionen mit Beteiligung von Rota- und Coronavirus, 190 (13,83%) mit Beteiligung von Corona- und Parvovirus, sowie 113 (7,63%) mit Beteiligung von Rota- und Parvovirus nachgewiesen (Abb. 13). Absolute Anzahl erkrankter Tiere 140 125 130 128 120 100 80 60 47 40 20 30 13 0 Monoinfektionen Coinfektionen Rotavirus mind. Rota- & Coronavirus Coronavirus mind. Corona- & Parvovirus Parvovirus mind. Rota- & Parvovirus Abb.12. Nachweishäufigkeit von Mono- und Coinfektionen beim Hund 45 4 Ergebnisse Absolute Anzahl erkrankter Tiere 200 190 180 160 140 119 120 113 100 78 80 60 40 20 12 11 0 Monoinfektionen Coinfektionen Rotavirus mind. Rota- & Coronavirus Coronavirus mind. Corona- & Parvovirus Parvovirus mind. Rota- & Parvovirus Abb. 13. Nachweishäufigkeit von Mono- und Coinfektionen bei der Katze In der Gegenüberstellung von Coinfektionen und Dreifachinfektionen wird deutlich, dass beim Hund in 96,15 % der Fälle einer Coinfektion mit Beteiligung von mindestens zwei Viren, auch eine Infektion mit allen drei Viren vorliegt. Bei einer Infektion mit Beteiligung von Rota- und Coronavirus kann zu 100% auch Parvovirus nachgewiesen werden (Abb.14a). Bei Katzen liegt in 88,78 % der Fälle einer Coinfektion mit einer Beteiligung von mindestens zwei Viren auch eine Infektion mit allen drei Viren vor (Abb.14b). 46 4 Ergebnisse 125 125 130 128 RCP RC CP RP 95 RCP a 107 100 96 RC CP RP b Abb. 14. Gegenüberstellung von Co- und Dreifachinfektionen. (a) Nachweise beim Hund. (b) Nachweise bei der Katze. [RC] Beteiligung von Rota- und Coronavirus. [RP] Beteiligung von Rota- und Parvovirus. [CP] Beteiligung von Corona- und Parvovirus. [RCP] Dreifachinfektionen. 4.1.1.3 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich der Altersverteilung Sowohl bei Hunden (814 [39,6%]), als auch bei Katzen (614 [41,5%]) bilden Patienten mit einem Alter von ≤ 1Jahr den größten Anteil eingesendeter Proben. Patienten mit einem Alter von ≥ 10 Jahren wurden zur besseren Übersicht zusammengefasst, sie bilden die zweitgrößte Gruppe mit 137 (6,1%) eingesendeten Proben beim Hund und 117 (7,9%) Proben bei der Katze. Die absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen macht bei Hunden und Katzen in der Altersgruppe ≤1 Jahr den größten Anteil aus, während jedoch der prozentuale Anteil nachgewiesener Virusinfektionen in allen Altersgruppen annähernd gleich bleibt (Abb. 15a, 15b). 47 4 Ergebnisse Infektion bei Hunden Prozentualer Anteil nachgewiesener Virusinfektionen Absolute Anzahl eingegangener Proben 12% 300 10% 250 8% 200 6% 150 4% 100 2% 50 0% 0 Rotavirus Probeneingang Ja hr e Ja hr e Parvovirus > 10 Ja hr e 9 10 Ja hr e Ja hr e Ja hr e 8 7 6 Ja hr e Ja hr e Ja hr e Ja hr e 5 4 3 2 1 Ja hr Coronavirus Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen Absolute Anzahl eingegangener Proben 100 300 90 250 80 70 200 60 Rotavirus 50 150 40 Coronavirus Parvovirus Probeneingang 100 30 20 50 10 0 1 Ja hr 2 Ja hr e 3 Ja hr e 4 Ja hr e 5 Ja hr e 6 Ja hr e 7 Ja hr e 8 Ja hr e 9 Ja hr e 10 Ja hr > e 10 Ja hr e 0 * … Tiere unbekannten Alters wurden der Graphik entnommen Abb. 15a. Altersverteilung beim Hund 48 4 Ergebnisse Infektion bei Katzen Prozentualer Anteil nachgewiesener Virusinfektionen Absolute Anzahl eingegangener Proben 18% 400 16% 350 14% 300 12% 250 10% 200 8% 150 Rota Corona Parvo Probeneingang 6% 100 4% Ja hr e Ja hr e Ja hr e Ja hr e Ja hr e Ja hr e 10 10 > 9 8 7 6 5 3 Infektion bei Katzen 4 Ja hr 2 1 Ja hr e 0 Ja hr e 0% Ja hr e 50 Ja hr e 2% Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen Absolute Anzahl eingegangener Proben 90 400 80 350 70 300 60 250 50 200 40 150 Rotavirus Coronavirus Parvovirus Probeneingang 30 100 20 Ja hr e > 10 Ja hr e Ja hr e 10 9 Ja hr e 8 Ja hr e 7 Ja hr e 6 Ja hr e 5 4 3 2 1 Ja hr e 0 Ja hr e 0 Ja hr e 50 Ja hr 10 * … Tiere unbekannten Alters wurden der Graphik entnommen Abb. 15b. Altersverteilung bei der Katze Rota-, Corona- und Parvovirusinfektionen wurden beim Hund statistisch signifikant häufiger in der Altersgruppe ≤ 1 Jahr nachgewiesen. Bei der Katze konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen Virusnachweis und Alter ermittelt werden. 49 4 Ergebnisse 4.1.1.4 Nachweishäufigkeit viraler Enteritiden hinsichtlich des Geschlechtes Insgesamt waren 854 (41,6%) Hunde männlich, 53 (2,5%) männlich-kastriert, 693 (33,7%) weiblich, 90 (4,4%) weiblich-kastriert und 366 (17,8%) unbekannten Geschlechtes. Es waren 414 (28%) Katzen männlich, 193 (13%) männlich-kastriert, 416 (28,1%) weiblich, 113 (7,6%) weiblich-kastriert und 345 (23,3%) unbekannten Geschlechtes. Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Virusinfektionen und dem Geschlecht nachgewiesen werden. 4.1.2 Rotavirusinfektionen bei Hunden und Katzen 4.1.2.1 Nachweishäufigkeit von Rotavirusinfektionen bei unterschiedlichen Rassen Aufgrund der hohen Rassevielfalt wurden ausschließlich Hunde- und Katzenrassen mit einem Probeneingang von ≥ 20 Proben berücksichtigt. Es konnten 15 Hunderassen und 8 Katzenrassen mit mehr als 20 eingesendeten Proben ermittelt werden, wobei „Mischlingstiere resp. Mix“ aufgrund der hohen Zahl an Einsendungen als eigenständige Kategorie eingeschlossen wurden. Bei Cocker Spaniel (11,1%), Dackel (12,0%) und Yorkshire Terrier (13,3%) konnte der größte Anteil Rotaviruspositiver Proben nachgewiesen werden (Tab. 8 a). Bei den Katzen konnte bei Norwegischen Waldkatzen (11,1%), Mix (13,3%) und Siam (22,2%) mehr als 10 % der Proben ein positiver Rotavirusnachweis erfolgen (Tab. 8b). Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Hunderasse und Rotavirusinfektion nachgewiesen werden. Bei Siamkatzen und „Mix“ wurden signifikant häufiger Rotavirusinfektionen nachgewiesen. 50 4 Ergebnisse Tab. 8a. Rotavirusnachweis bei Hunderassen Hunderassen Rotavirus negativ Beagle positiv Total 26 1 27 96,3% 3,7% 100,0% 29 1 30 96,7% 3,3% 100,0% 44 3 47 93,6% 6,4% 100,0% 22 1 23 95,7% 4,3% 100,0% 32 4 36 88,9% 11,1% 100,0% 22 3 25 88,0% 12,0% 100,0% 132 12 144 91,7% 8,3% 100,0% 105 2 107 98,1% 1,9% 100,0% 35 1 36 97,2% 2,8% 100,0% 86 7 93 92,5% 7,5% 100,0% 389 33 422 92,2% 7,8% 100,0% 29 1 30 96,7% 3,3% 100,0% 35 3 38 92,1% 7,9% 100,0% 37 3 40 92,5% 7,5% 100,0% 52 8 60 86,7% 13,3% 100,0% Berner Sennenhund Boxer Chihuahua Cocker Spaniel Dackel DSH Golden Retriever JRT Labrador Retriever Mix Pudel Rottweiler WHWT Yorkshire Terrier 51 4 Ergebnisse Tab. 8b. Rotavirusnachweis bei Katzenrassen Katzenrassen Rotavirus negativ BKH positiv Total 42 2 44 95,5% 4,5% 100,0% 562 50 612 91,8% 8,2% 100,0% 93 6 99 93,9% 6,1% 100,0% 111 17 128 86,7% 13,3% 100,0% 56 7 63 88,9% 11,1% 100,0% 87 2 89 97,8% 2,2% 100,0% 21 6 27 77,8% 22,2% 100,0% EKH Maine Coon Mix Norw. Waldkatze Perser Siam 4.1.2.2 Geographische Verteilung von Rotavirusinfektionen in Deutschland Die untersuchten Proben wurden nach Postleitzahlen sortiert. Die Postleitzahlen wurden zur Übersicht auf die erste Zahl reduziert und repräsentieren das gesamte Postleitzahlengebiet. Im Postleitzahlengebiet 2 (10,4%) und 3 (11,3%) konnten bei >10 % der eingesendeten Kotproben der Hunde ein positiver Rotavirusantigennachweis geführt werden. Im Postleitzahlengebiet 3 konnte statistisch signifikant häufiger Rotavirus nachgewiesen werden (Tab. 9a). Für Katzen konnte ebenfalls im Postleitzahlengebiet 3 mit 11,2% die höchste Anzahl positiver Proben ermittelt werden. Es bestand jedoch kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Postleitzahlengebiet und Rotavirusantigennachweis (Tab. 9b). 52 4 Ergebnisse Tab. 9a. Geographische Verteilung der Rotavirusinfektionen beim Hund negativ PLZ 0 PLZ 1 PLZ 2 PLZ 3 PLZ 4 PLZ 5 PLZ 6 PLZ 7 PLZ 8 PLZ 9 Rotavirus positiv Anzahl % Std. Residual 58 95,1% 3 4,9% 0,16 -0,58 Anzahl % Std. Residual 58 98,3% 1 1,7% 0,41 -1,51 Anzahl % Std. Residual 163 89,6% 19 10,4% -0,50 1,84 Anzahl % Std. Residual 142 88,8% 18 11,3% -0,58 2,12 Anzahl % Std. Residual 187 93,0% 14 7,0% -0,02 0,06 Anzahl % Std. Residual 226 92,6% 18 7,4% -0,08 0,31 Anzahl % Std. Residual 300 94,0% 19 6,0% 0,17 -0,62 Anzahl % Std. Residual 378 95,0% 20 5,0% 0,38 -1,40 Anzahl % Std. Residual 104 92,0% 9 8,0% -0,12 0,45 Anzahl % Std. Residual 146 91,8% 13 8,2% -0,17 0,63 53 Total 61 100,0% 59 100,0% 182 100,0% 160 100,0% 201 100,0% 244 100,0% 319 100,0% 398 100,0% 113 100,0% 159 100,0% 4 Ergebnisse Tab. 9b. Geographische Verteilung der Rotavirusinfektionen bei der Katze negativ PLZ 0 PLZ 1 PLZ 2 PLZ 3 PLZ 4 PLZ 5 PLZ 6 PLZ 7 PLZ 8 PLZ 9 Rotavirus positiv Anzahl % Std. Residual 31 96,9% 1 3,1% 0,29 -0,98 Anzahl % Std. Residual 43 93,5% 3 6,5% 0,11 -0,36 Anzahl % Std. Residual 121 91,0% 12 9,0% -0,12 0,40 Anzahl % Std. Residual 95 88,8% 12 11,2% -0,34 1,16 Anzahl % Std. Residual 120 93,8% 8 6,3% 0,21 -0,71 Anzahl % Std. Residual 178 90,8% 18 9,2% -0,17 0,57 Anzahl % Std. Residual 285 92,5% 23 7,5% 0,10 -0,35 Anzahl % Std. Residual 195 90,7% 20 9,3% -0,19 0,66 Anzahl % Std. Residual 113 91,9% 10 8,1% -0,01 0,04 Anzahl % Std. Residual 74 96,1% 3 3,9% 0,38 -1,28 54 Total 32 100,0% 46 100,0% 133 100,0% 107 100,0% 128 100,0% 196 100,0% 308 100,0% 215 100,0% 123 100,0% 77 100,0% 4 Ergebnisse 4.1.2.3 Nachweishäufigkeit von Rotavirusinfektionen bei unterschiedlichen Lufttemperaturen Es wurde untersucht, ob bei Hunden (Abb. 16a) und Katzen (Abb. 16b) ein Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und positivem Virusnachweis, im Sinne einer Saisonalität des Infektionsvorkommens, besteht. Dazu wurde die absolute Anzahl positiver Rotavirusantigennachweise der Jahre 2000 bis 2006 (blau) chronologisch gegen die durchschnittliche Lufttemperatur Deutschlands (rot) aufgetragen. Aufgrund der geringen Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen, wurde auf eine Darstellung der Einzelmonate verzichtet. Sowohl bei Hunden, als auch bei Katzen lässt sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und Rotavirusinfektionen nachweisen. Die „Infektionskurve“ (blau) verläuft als Reaktion auf die Lufttemperatur leicht zeitlich versetzt zur „Temperaturkurve“ (rot). Desweitern verlaufen die Kurven, mit wenigen Ausnahmen, regelmäßig gegenläufig, d.h. mit steigender Lufttemperatur sinkt die Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen. 25 9 Durchschnittliche Lufttemperatur in °C 20 8 7 15 6 5 10 4 3 5 2 1 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 0 Absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen 10 -1 -5 -2 Abb. 16a. Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und Rotavirusinfektionen beim Hund 55 4 Ergebnisse 25 9 Durchschnittliche Lufttemperatur in °C 20 8 7 15 6 5 10 4 3 5 2 1 0 0 2000 2001 2002 2003 -5 2004 2005 2006 Absolute Anzahl nachgewiesener Rotavirusinfektionen 10 -1 -2 Abb. 16b. Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und Rotavirusinfektionen bei der Katze 4.2 In-vitro Infektionsexperimente zur Wirksamkeit von Typ I Interferonen 4.2.1 Zellproliferation unter Einwirkung von IFN Als Maß einer möglichen Zytotoxizität wurde die Zellproliferation unter Einwirkung von IFN in den Konzentrationen 101-104 Einheiten/ml untersucht. Dazu wurden die mit IFN behandelten CFSE markierten Zellen im Durchflußzytometer analysiert. Exemplarisch ist dies an rFeIFN-ω behandelten KE-R Zellen in Abbildung 17 veranschaulicht. 56 4 Ergebnisse A B Gefärbte Zellen Ungefärbte Zellen Zellen + IFN 10-10.000 Tag 3 Zellen + IFN 10-10.000 Tag 5 Abb. 17. Darstellung der KE-R Zellproliferation bei Behandlung mit felinem rekombinantem Interferon-ω. (A) Dot-Plot von KE-R Zellen im Vorwärts- und Seitwärtsscatter. Die im Dot-Plot eingegrenzten Zellen stellen die untersuchte und im Histogramm dargestellte Zellpopulation dar. (B) Histogramm CFSE markierter Zellen nach Behandlung mit IFN: Im Histogramm wird die Proliferation der Zellen anhand ihrer logarithmisch abnehmenden CFSE Färbung dargestellt. Die dunkelgrau unterlegte Fläche zeigt die mit CFSE markierten KE-R Zellen ohne Interferonbehandlung am Tag der Einsaat (Positivkontrolle). Die hellgrau unterlegte Fläche zeigt ungefärbte Zellen am Tag der Einsaat (Negativkontrolle). Interferon behandelte Zellen zeigten bei verschiedenen IFN Konzentrationen (101-104 Einheiten/ml) eine vergleichbare Zellproliferation. Im Histogramm dargestellt am Tag 3 und 5 post expositionem. 57 4 Ergebnisse Für die mit rFeIFN-ω, rBoIFN-α und rHuIFN-α behandelten Zelllinien felinen (LEO, KE-R, KG-R), caninen (MDCK), bovinen (BoMac, MDBK) und humanen Ursprungs (HRT-18, Panc-1), sowie Affenzelllinien (MA104, Vero), konnte innerhalb der verwendeten Interferonkonzentration keine Hemmung der Zellproliferation festgestellt werden. Die Anzahl der Zellen nahm mit Dauer der Inkubation zu, die Menge der CFSE Färbung nahm dementsprechend ab. 4.2.2 Induktion des Mx Proteins in unterschiedlichen Zelllinien Zellen felinen (KE-R, KG-R, LEO), caninen (MDCK), bovinen (MDBK, BoMac) und humanen Ursprungs (HRT-18, Panc-1), sowie Affenzelllinien (MA104, Vero) wurden mit rFeIFN-ω, rBoIFN-α und rHuIFN-α in Verdünnungen von 101-105 Einheiten/ml behandelt und über 24 Stunden bei 37°C inkubiert. N achfolgend wurde mittels Western Blot die Expression des Mx Proteins, als spezifischer biologischer Marker für die Aktivität der Typ I Interferone, nachgewiesen. Als Nachweis des Mx Proteins wird die dominante Bande bei ca. 75 kDa, in Korrelation mit dem tatsächlichen Molekulargewicht des Proteins, erwartet. 4.2.2.1 Behandlung mit rFeIFN- ω Nach Behandlung mit rFeIFN-ω konnte bei allen Zellen felinen Ursprungs eine konzentrationsabhängige Induktion der Expression des Mx Proteins nachgewiesen werden. Bei den KE-R Zellen konnte eine Induktion ab 102 Einheiten/ml und bei KG-R Zellen ab 103 Einheiten/ml nachgewiesen werden, die Stärke der Bande nimmt bei jeweils höheren Konzentrationen des IFNs zu. LEO Zellen zeigen in der Negativkontrolle und ab einer Konzentration von 101 Einheiten/ml eine Induktion. Dieses Ergebnis kann auf eine mögliche konstitutive Expression des Mx Proteins zurückzuführen sein. Eine Behandlung boviner und humaner Zellen, sowie der Affenzelllinien konnte keine Induktion des Mx Proteins herbeiführen. Die Behandlung der caninen Zelllinie MDCK führte bei einer Interferonkonzentration von 104 Einheiten/ml zu einer schwachen Bande. Die Behandlung mit 105Einheiten/ml führte zu einer deutlichen Induktion der Expression des Mx Proteins (Abb. 18). 58 4 Ergebnisse Abb. 18. Induktion des Mx Proteins nach Behandlung mit rFeIFN- ω 4.2.2.2 Behandlung mit rBoIFN- α LEO Zellen zeigten nach Behandlung mit rBoIFN-α eine dominante Bande bei Konzentrationen von 101 bis 104 Einheiten/ml, sowie in der Negativkontrolle. Die Stärke der Bande ist in allen Konzentrationen konstant. Das Bild entspricht einer möglichen konstitutiven Expression, nicht aber einer spezifischen Induktion des Mx Proteins durch die IFN Behandlung. Bei KE-R Zellen konnte keine Induktion nachgewiesen werden. Bovine MDBK Zellen weisen eine Konzentrationsabhängige Induktion der Expression auf. Bei humanen und caninen Zellen, sowie den beiden Affenzelllinien ist keine Expression des Mx Proteins nachweisbar (Abb.19). 59 4 Ergebnisse Abb. 19. Induktion des Mx Proteins nach Behandlung mit rBoIFN- α 4.2.2.3 Behandlung mit rHuIFN- α Nach Behandlung mit rHuIFN-α konnte bei felinen KE-R Zellen eine konzentrationsabhängige Induktion ab 103 Einheiten/ml nachgewiesen werden. Bei KG-R Zellen zeigte sich eine Induktion ab 104 Einheiten/ml. LEO Zellen zeigen eine konstante Stärke der Bande in allen Konzentrationen . Bovine MDBK Zellen, humane Zellen und die canine MDCK Zelllinie zeigen eine konzentrationsabhängige Induktion. Bei Vero Zellen konnte eine konzentrationsabhängige Induktion des Mx Proteins nachgewiesen werden. Bei MA104 Zellen konnte kein Mx Protein nachgewiesen werden (Abb. 20). 60 4 Ergebnisse Abb. 20. Induktion des Mx Proteins nach Behandlung mit rHuIFN- α Tab. 10. Übersicht der Induktion des Mx Proteins auf unterschiedlichen Zelllinien 61 4 Ergebnisse 4.2.3 Expression antigenpräsentierender Oberflächenmoleküle des MHC I KE-R Zellen, MDCK Zellen und MA104 Zellen wurden mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α in Verdünnungen 101-104 Einheiten/ml behandelt über 24 Stunden bei 37°C in kubiert. Die Zellen wurden anschließend hinsichtlich ihrer antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle bzw. der Rezeptordichte im Durchflußzytometer untersucht (Abb. 21). rFeIFN - ω rHuIFN - α KE-R MDCK MA104 Abb. 21. Darstellung der Expression der MHC I Proteine auf unterschiedlichen Zelllinien nach Behandlung mit felinem und humanem Interferon. KE-R, MDCK und MA104 Zellen wurden mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α behandelt. Konzentration: 104 Einheiten/ml (rosa), 103 Einheiten/ml (hellblau), 102 Einheiten/ml (orange), 101 Einheiten/ml (lila), unbehandelte Zellen (grün). Der Nachweis der MHC I Moleküle erfolgte mit einem monoklonalen MHC I Antikörper, Sekundärantikörper war ein FITC konjugierter anti-mouse IgG. 62 4 Ergebnisse Die Behandlung der KE-R Zellen mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α führte zu einer signifikanten konzentrationsabhängigen Erhöhung der antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle des MHC I. Bei MDCK Zellen konnte keine Erhöhung der Rezeptordichte nach Interferonbehandlung nachgewiesen werden. Bei MA104 Zellen konnte eine signifikante Erhöhung der antigenpräsentierenden Oberflächenmoleküle nach Behandlung mit rHuIFN-α nachgewiesen werden. (Abb. 21, Tab. 11a, b). Tab. 11a. Übersicht der prozentualen Anteile MHC I Protein exprimierender Zellen an der Gesamtzellzahl nach Behandlung mit rFeIFN-ω KE-R MDCK MA 104 rFeIFN-ω % % % 104 Einheiten/ml 14,71 2,56 1,27 103 Einheiten/ml 8,88 2,62 0,71 102 Einheiten/ml 4,42 1,94 1,02 101 Einheiten/ml 3,09 1,93 1,27 - KO 2,07 2,23 1,96 Tab. 11b. Übersicht der prozentualen Anteile MHC I Protein exprimierender Zellen an der Gesamtzellzahl nach Behandlung mit rHuIFN-α KE-R MDCK MA 104 rHuIFN-α % % % 104 Einheiten/ml 15,41 2,83 9,98 103 Einheiten/ml 8,72 2,64 5,70 102 Einheiten/ml 3,17 3,01 2,83 101 Einheiten/ml 3,00 2,50 2,29 - KO 2,55 2,34 1,80 63 4 Ergebnisse 4.2.4 Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN-ω auf felinen Zelllinien Die antivirale Wirksamkeit von rFeIFN-ω wurde KE-R und KG-R Zellen untersucht. Beide Zelllinien zeigten eine deutliche Reduktion der infizierten Zellen bei Behandlung mit rFeIFN-ω in steigender Konzentration. Die antivirale Wirkung war in KE-R Zellen deutlicher ausgeprägt. Dort konnten bereits bei einer Interferonkonzentration von 103 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr nachgewiesen werden (Abb. 22). Die KG-R Zellen wiesen bei einer Interferonkonzentration von 104 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr auf (Abb. 23). Negativkontrolle Feline Zelllinie KE-R Positivkontrolle 10 u IFN 20x 20x 20x 40x 100 u IFN 20x 40x 40x 40x 1000 u IFN 20x 40x 10.000 u IFN 20x 40x Abb. 22. Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN-ω auf KE-R Zellen. Die Positivkontrolle (links) zeigt Rotavirusinfizierte Fluoreszenssignals. Rechts Zellen im Bild anhand des dargestellt deutlich sind sichtbaren virusinfizierte, Interferonbehandelte KE-R Zellen. Ab einer Konzentration von 103 Einheiten/ml sind keine virusinfizierten Zellen mehr nachweisbar. 64 4 Ergebnisse Negativkontrolle Positivkontrolle Feline Zelllinie KG-R 10 u IFN 20x 20x 20x 40x 100 u IFN 40x 40x 20x 40x 1000 u IFN 20x 40x 10.000 u IFN 20x 40x Abb. 23. Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN-ω auf KG-R Zellen. Rechts im Bild dargestellt sind virusinfizierte, Interferonbehandelte KG-R Zellen. Bei einer Konzentration von 104 Einheiten/ml sind nachweisbar. 65 keine virusinfizierten Zellen mehr 5 Diskussion 5 Diskussion 5.1 Virusnachweis in Kotproben erkrankter Hunde und Katzen (Retrospektive Studie) 5.1.1 Prävalenz viraler Enteritiden bei Hunden und Katzen Über den Zeitraum von 2000 bis 2006 konnte bei 223 Hunden, sowie 214 Katzen mit einer klinisch manifesten Durchfallerkrankung ein positiver Virusnachweis (Rotavirus, Parvovirus, Coronavirus) geführt werden. Die untersuchten Proben unterlagen keiner speziellen Vorselektion, sie entstammen Tierärztlichen Praxen und Kliniken aus Deutschland und dem angrenzenden europäischen Ausland. Die Durchführung des Tests auf Corona- und Parvoviren fanden mittels RT-PCR bzw. PCR nach Isolation der Nukleinsäure aus Faeces statt. Diese Methodik wird als hoch spezifisch und hoch sensitiv beschrieben (GUT et al. 1999). Die Durchführung des Tests auf canines und felines Rotavirus erfolgte mittels Antigen ELISA, welcher laut Herstellerangaben hoch spezifisch und sensitiv auf Gruppe A Rotaviren reagiert. Ein positiver Nachweis von Coronavirus war bei Hunden und Katzen am häufigsten. Die statistische Prävalenz im Untersuchungsmaterial beträgt bei Hunden 9 % und bei Katzen 13 %. Die Ergebnisse korrelieren mit bereits vorhandenen Studien hinsichtlich des caninen Coronavirus (SCHULZ et al. 2008). Da in der vorliegenden Arbeit nur Daten klinisch erkrankter Hunde und Katzen vorliegen, ist eine Aussage über die tatsächliche Beteiligung am Krankheitsgeschehen schwierig. Bei gesunden Hunden konnten Antikörper mit einer Prävalenz von bis zu 59 % ermittelt werden (TENNANT et al. 1993). Die Höhe der Seroprävalenz ist scheinbar von der Haltung der Hunde abhängig, da Zwingerhunde signifikant häufiger seropositiv sind, als Hunde die in Familien gehalten werden (TENNANT et al. 1993). Die Prävalenz für feline enterale Coronaviren liegt in Mehrkatzenhaushalten sogar bei 80-90 % (SPARKES et al. 1992a, SPARKES et al. 1992b, GUT et al. 1999). Es ist zudem bekannt, dass enterale Coronaviren äußerst selten zu klinisch manifesten Infektionen führen (KIPAR et al. 1998). Katzen und Hunde scheiden Coronaviren intermittierend über den Kot aus. Die Ausscheidung über den Kot kann bei klinisch inapperenten Trägerkatzen bis zu 9 Monaten (ADDIE und JARRETT 2001), bei Hunden bis zu 5 Monaten andauern (PRATELLI et al. 2000). Um festzustellen, ob virulente Virusstämme beteiligt sind, welchen das Herbeiführen einer klinisch manifesten 66 5 Diskussion Durchfallerkrankung zugeschrieben wird (PRATELLI et al. 2000), wären weiterführende Untersuchungen der Proben sinnvoll. Der zweithäufigste nachgewiesene Erreger ist das Parvovirus. Die statistische Prävalenz im Untersuchungsmaterial beträgt bei Hunden und Katzen 8 %. Das Ergebnis ist deutlich niedriger als in bereits durchgeführten Studien (TRUYEN et al. 1996, TRUYEN 2006, SCHULZ et al. 2008). Generell erscheint die Prävalenz für eine Viruserkrankung, gegen die seit Jahren geimpft wird, noch relativ hoch. Da die neuen antigenen Varianten CPV 2a und CPV 2b dem ursprünglichen Virustyp noch sehr ähnlich sind, schützt eine korrekt durchgeführte Impfung gegen alle Typen (TRUYEN 2006). Die relativ hohe Prävalenz könnte demzufolge nicht auf die neuen Varianten, sondern eher auf fehlende oder nicht korrekt durchgeführte Impfungen zurückzuführen sein. Die Höhe der Prävalenz ist ein direkter Anhaltspunkt für das Vorkommen der klinisch manifesten Erkrankung. Im Gegensatz zu Coronaviren werden Parvoviren in gesunden Hunden und Katzen nur sehr vereinzelt nachgewiesen, z.B. bis zu 14 Tagen nach der Impfung mit einer Lebendvaccine (ESFANDIARI und KLINGEBORN 2000). Der Nachweis von Parvoviren ist, mit der Ausnahme des Nachweises bei gerade geimpften Tieren, immer verbunden mit klinischen Symptomen (SCHULZ et al. 2008). Rotaviren liegen mit einer statistischen Prävalenz von 7 % bei Hunden und 8 % bei Katzen im Untersuchungsmaterial nahe an der nachgewiesenen Prävalenz von Parvoviren. Die Beteiligung am Durchfallgeschehen ist aber anders zu bewerten. Da in der vorliegenden Studie die Daten zur Nachweishäufigkeit bei gesunden Tieren fehlen, ist nicht sicher, in wie fern ein positiver Antigennachweis eine Aussage über die Beteiligung am Krankheitsbild ermöglicht bzw. ob Rotaviren einen tatsächlichen Auslöser einer klinisch manifesten Erkrankung darstellen. In älteren Studien konnte in Kotproben gesunder Hunde eine Prävalenz von 6,66 % ermittelt werden, welche sehr nah am Ergebnis dieser Studie liegt (OLDENBURG et al. 1984), während klinisch erkrankte Hunde nur eine Prävalenz von 1,74 % aufwiesen. Zwar verläuft der Großteil der Rotavirusinfektionen subklinisch, es wurden jedoch mehrfach Infektionen in Zusammenhang mit einer schweren Durchfallproblematik bei neonatalen Hunden festgestellt (ENGLAND und POSTON 1980, FULTON et al. 1981). Bei adulten Tieren wurden Antikörper gegen Rotaviren in hohen Prozentzahlen nachgewiesen. Bei Hunden kann man von einer Seroprävalenz von 62-85 % ausgehen (OLDENBURG 67 5 Diskussion et al. 1984). Bereits vorliegende Studien beziehen sich in der Regel auf Untersuchungszeiträume vor dem Jahr 2001. Allen Studien ist gemeinsam, das die Prozentzahl der Rotavirusnachweise relativ niedrig bei 1,2-2,4 % ist (MOCHIZUKI et al. 2001). Interessanterweise liegt die statistische Prävalenz in der vorliegenden Arbeit bis zum Jahr 2003 bei Hunden und Katzen auch im niedrigen Bereich (1-5 %), steigt aber ab dem Jahr 2004 signifikant an (9-17%). Die Erhöhung der Werte ist weder auf eine Änderung der Testmethodik, noch auf eine signifikante Änderung der Anzahl des Probeneinganges zurückzuführen. Ob es sich um eine tatsächliche Erhöhung der Prävalenz handelt, muss in weiteren Studien untersucht werden. Das Ergebnis, dass Zweifachinfektionen deutlich weniger häufig vorkommen als Monoinfektionen korreliert mit bereits vorhandenen Studien (YESILBAG et al. 2007). Die vorliegenden Dreifachinfektionen Mischinfektionen Daten zeigen, vorkommen. zu klinisch dass beim Dieses Hund Ergebnis manifesten signifikant häufiger untermauert, oder dass schwerwiegenderen Krankheitsverläufen führen (PRATELLI et al. 2000). Bei Katzen kommen Dreifachinfektionen zwar signifikant häufiger vor als Zweifachinfektionen, jedoch nur geringfügig häufiger als Coronavirusmonoinfektionen. Diese Tatsache wirft wiederum die Frage auf, ob und inwiefern feline Coronaviren am Krankheitsgeschehen beteiligt sind. Möglicherweise sind feline Coronaviren maßgeblich für den Schweregrad der Erkrankung verantwortlich oder fungieren als „Türöffner“ für weitere enterale Viren und somit zur Verstärkung des Symptombildes. Für Rotavirus-, Coronavirus- und Parvovirusinfektionen ist eine Altersprädisposition im ersten Lebensjahr bekannt (MOCHIZUKI et al. 1986, TRUYEN 2000, SCHULZ et al. 2008). Die vorliegenden Ergebnisse untermauern diese Daten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass alle Altersstufen für die untersuchten Viren empfänglich waren, welches Ergebnisse älterer vorhandener Studien ergänzt (POLLOCK und COYNE 1993). Den größten Anteil eingesendeter Kotproben machen bei Hunden und Katzen die Altersgruppen unter 1 Jahr und über 10 Jahren aus. Dieses Ergebnis könnte wiederspiegeln, dass Halter und/oder Tierärzte sensibler auf Durchfallerkrankungen bei Welpen und älteren Tieren reagieren und frühzeitig eine Untersuchung hinsichtlich einer Viruserkrankung in einem externen Labor durchgeführt wird. Es kann außerdem widerspiegeln, dass Durchfallerkrankungen im 68 5 Diskussion mittleren Alter weniger häufig schwerwiegende Symptome aufweisen und erst bei prolongiertem Krankheitsverlauf eine externe Laboruntersuchung eingeleitet wird. 5.1.2 Rasseprädisposition, geographische Verteilung und Saisonalität bei Rotavirusinfektionen Aufgrund der Rassevielfalt und der hohen Anzahl des eingesendeten Probenmaterials kann man von einer repräsentativen Menge ausgehen. In älteren Studien konnten meist aufgrund der geringen Fallzahlen keine Rasseprädispositionen bei Hunden festgestellt werden. Für Katzen existieren bislang keine Daten hinsichtlich der Rasse. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine Häufung positiver Rotavirus-antigennachweise bei Cocker Spaniel, Dackel und Yorkshire Terrier. Yorkshire Terriern und Dackeln wird eine Prädisposition für Parvovirusinfektionen zugeschrieben (HOUSTON et al. 1996, TRUYEN 2000). Bei den Katzen konnten Rotaviren signifikant häufiger bei der Rasse Siam nachgewiesen werden. Siam Katzen sind dafür bekannt gehäuft an Durchfall zu erkranken. Insbesondere eine erhöhte Prädisposition für die enterale Form der Tritrichomonas foetus Infektion wurde beschrieben (GUNN-MOORE et al. 2007). Rotavirusinfektionen konnten bei der Katze gehäuft, beim Hund signifikant häufiger im Postleitzahlengebiet 3 nachgewiesen werden. Gründe für diese Häufungen, wie eventuell bestehende Zusammenhänge zur Temperatur, ein generell höheres Aufkommen von Hunden und Katzen oder ein erhöhter Infektionsdruck durch „Mehrtierhaushalte“, konnten mit den vorhandenen Daten nicht nachvollzogen werden. Dazu müssten genauere demographische Daten der Postleitzahlengebiete erhoben werden. Für humane Rotaviren wurden bereits Zusammenhänge zum saisonalen Auftreten der Infektionen ermittelt. Rotavirusinfektionen treten vorwiegend in den kalten Monaten gehäuft auf (BERNER et al. 1997, COOK et al. 2004). Es wird postuliert, das Rotavirusinfektionen streng saisonal der Kältesumme in der Umwelt folgen und bei Temperaturen ≤12°C auftreten (pers. Mitteilung Dipl.-Ing.W.Soddem ann, 2007). Anhand der untersuchten Temperaturdaten lässt sich bei Hunden und Katzen ebenfalls der Trend absehen, dass es bei kälteren Temperaturen zu einer erhöhten 69 5 Diskussion Anzahl von Rotavirusinfektionen kommt. Es ist wird angenommen, dass die erhöhten Infektionsraten zu den kalten Jahreszeiten in Zusammenhang mit einer erhöhten Tenazität des Virus bei den niedrigen Umgebungstemperaturen stehen und somit die Infektionskette stabiler aufrechterhalten wird. 5.2 Ergebnisse der In-vitro Infektionsexperimente Eine virale Infektion der meisten Zellen induziert die Expression und Sekretion von Typ I Interferonen. Zellsensoren erkennen Viren, woraufhin Mechanismen in Gang gesetzt werden, welche über Aktivierung von Transkriptionsfaktoren zur Bindung an ISREs und Induktion der Transkription einer Vielzahl von ISGs führen (SHERRY 2009). Einige ISGs, unter anderem das Mx Protein, wirken antiviral (STAEHELI et al. 1993). Manche ISGs sind latent, bis sie durch virale dsRNA aktiviert werden (SHERRY 2009). Die IFN-Kaskade kann andere Zell-Faktoren einbeziehen und ist Zelltyp-spezifisch (VAN BOXEL-DEZAIRE AH 2006). Die Infektion mit Rotaviren induziert IFN bei Menschen und Tieren (DE BOISSIEU et al. 1993, CHAPLIN et al. 1996). Untersuchungen an saugenden Mäusen, Schweinen und Kälbern zeigen stark variierende Resultate in Bezug auf die Rolle des IFN. Exogen zugeführtes IFN-γ oder IFN- α/β konnte nicht vor Rotavirus bedingter Diarrhoe und Virusreplikation in saugenden Mäusen schützen (ANGEL et al. 1999). Im Gegensatz dazu wurde belegt, dass die Verabreichung von rekombinantem IFN bei Schweinen und Kälbern die virale Replikation reduzieren und die Dauer der Diarrhoe verkürzen kann (SCHWERS et al. 1985, LEECE JG 1990). Vancott et al. (2003) erzielt ähnliche Ergebnisse für saugende Mäuse, konnten jedoch überraschend für adulte Stat-/Mäuse eine verstärkte Replikation von Murinem- und Rhesus-Rotavirus während der akuten Phase der Infektion im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen nachweisen. Eine mögliche Ursache wird in der vermehrten Anfälligkeit von saugenden Mäusen für Rotavirusinfektionen gesehen. Desweiteren besteht die Möglichkeit, dass epitheliale Zellen bei saugenden Mäusen weniger auf IFN ansprechen, als epitheliale Zellen adulter Mäuse (VANCOTT et al. 2003). Aktuellen Ergebnissen zufolge spielen Typ III Interferone (IFN-λ) eine große Rolle in der epithelialen antiviralen Wirtsabwehr. Mäuse, denen funktionale IFN-λ Rezeptoren fehlen, sind hoch anfällig für Rotavirusinfektionen. Die Resultate deuten daraufhin, dass das Dünndarmepithel 70 5 Diskussion viel stärker auf IFN-λ reagiert und nur marginal auf IFN-α/β, welches die Diskrepanzen der vorangegangenen Studien erklären könnte (POTT et al. 2011). Zudem wird gezeigt, das IFN- α/β eine höhere Aktivität im subepithelialen Darmgewebe aufweist. Daher wird vermutet, das Typ I IFNe nicht ausreichend gegen Rotavirusinfektionen schützen können, da Rotaviren einen ausgeprägten Zelltropismus zu den Epithezellen des Darm haben (POTT et al. 2011). In der vorliegenden Arbeit soll die Induktion des Mx Protein auf unterschiedlichen Zelllinien unter Anwendung rekombinantem bovinen, felinen und humanen Interferon untersucht werden. Das Mx Protein ist ein schnell induzierbarer, sensitiver und verlässlicher Indikator für die Aktivität der Typ I Interferone. Es dient als quantitativer Marker zur Kontrolle der biologischen Aktivität von Typ I IFN in vitro und in vivo (BRACKLEIN et al. 2006). In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass rBoIFN-α ausschließlich auf Zellen bovinen Ursprungs die Expression des Mx Proteins induziert. Die Induktion erfolgt konzentrationsabhängig. Im Unterschied hierzu induziert das rFeIFN-ω auf Zellen felinen und bei höheren Konzentrationen auch auf Zellen caninen Ursprungs die Expression des Mx Proteins. Das rHuIFN-α zeigt eine sehr breite Induktion des Mx Proteins konzentrationsabhängig in Zellen humanen, caninen, felinen und bovinen Ursprunges, sowie in Affenzelllinien. Dies ist bemerkenswert, Rezeptorspezifität da man generell Interferone davon weitgehend ausgeht, dass speziesspezifisch aufgrund sind ihrer (MULLER- DOBLIES et al. 2002). Die vorliegenden Ergebnisse untermauern diese Aussage für rekombinantes bovines und weitgehend auch felines Interferon. Im Gegensatz dazu zeigt rekombinantes humanes Interferon eine Kreuz-Speziesspezifität in vitro. In der Humanmedizin werden Typ I Interferone erfolgreich gegen virale Erkrankungen und bei Krebserkrankungen eingesetzt (FERRANTINI et al. 2007). Der Einsatz von humanem Interferon wird in der Veterinärmedizin bei Katzen und beim Hund immer wieder diskutiert. Die z.T. berichteten Behandlungseffekte werden jedoch durch die Bildung Cytokin-spezifischer neutralisierender Antikörper limitiert (MOCHIZUKI et al. 1994). Desweiteren ist beschrieben, dass canine Zelllinien vergleichsweise weniger empfänglich für rHuIFN-α sind (BRIDGMAN et al. 1988). In den vorliegenden in vitro Untersuchungen mit MDCK-Zellen konnte dies so nicht nachvollzogen werden. Inwieweit humanes Interferon α hinsichtlich 71 seiner antiviralen und 5 Diskussion immunmodulatorischen Wirkung bei anderen Tierarten genutzt werden kann, muss in weiterführenden in vitro und in vivo Studien untersucht werden. In der verwendeten Leopardenzelllinie LEO konnte Mx Protein dosisunabhängig nach Behandlung mit rBoIFN-α nachgewiesen werden. Es liegt höchstwahrscheinlich eine konstitutive Interferon Produktion und somit kontinuierliche Expression des Mx Proteins zu Grunde (HATA et al. 2001). Die verwendete Nierenzellllinie der grünen Meerkatze (VERO) war ausschließlich empfänglich für rHuIFN-α. Vero-Zellen besitzen kein intaktes Interferonsystem aufgrund einer Deletion im Interferon-Gen (DIAZ et al. 1988). Dennoch reagieren sie auf exogen zugeführtes Interferon. Die embryonale Nierenzelllinie der grünen Meerkatze (MA104) war für keine der verwendeten rekombinanten Interferone empfänglich. Eine mögliche Ursache könnte in einem ebenfalls defekten oder fehlenden Interferonsystem / Interferonrezeptoren oder mangelnder Zelldifferenzierung begründet sein. MA104 Zellen sind hoch empfänglich für Rotaviren in vitro (JOLLY et al. 2001), welches u.a. im Unvermögen Interferon zu exprimieren oder auf exogen zugeführtes Interferon zu reagieren begründet sein könnte. Zur Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkung wurde die Expression der MHC I Oberflächenrezeptoren, nach Behandlung mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α, untersucht. Die Behandlung mit rFeIFN-ω führte nach 24 Stunden ausschließlich in felinen Zellen zu einer konzentrationsabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptorendichte. Dieses Resultat schließt nicht aus, das die Anwendung von rFeIFN-ω auf caninen Zelllinien nicht zu einer Expression der MHC I Oberflächenrezeptoren führt. Die Induktion des Mx Proteins erfolgte auf Zellen caninen Ursprungs erst bei einer deutlich höheren Konzentration des rFeIFN-ω. Es wird vermutet, dass somit auch die Expression der MHC I Oberflächenrezeptoren auf MDCK Zellen bei entsprechend hoher Konzentration erfolgt. Die Behandlung mit rHuIFN-α führte nach 24 Stunden zu einer dosisabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptorendichte in felinen Zellen und in der Affenzelllinie MA104. Kommerziell erhältliche Typ I Interferone α und ω werden vorwiegend aufgrund ihrer antiviralen und antiproliferativen Wirkung angewendet. In der Veterinärmedizin werden für die Stimulierung des Immunsystems hauptsächlich sog. Immunmodulatoren (Paramunitätsinducer) angewendet. Untersuchungen zeigten, dass am 12. Tag nach Behandlung mit dem Immunmodulator Zylexis® (attenuiertes Parapoxvirus ovis) eine 72 5 Diskussion signifikante Zunahme der IFN-γ Expression in caninen PBMCs in vitro nachgewiesen werden konnte (MANGOLD-GEHRING 2005). Der Vorteil der Anwendung rekombinanter Interferone könnte eine Induktion des immunmodulatorischen Effektes in kürzerer Zeit sein. Rotaviren haben spezielle Mechanismen entwickelt, um der antiviralen Aktivität der Interferone zu entgehen. Mindestens vier unterschiedliche virale Abwehrstrategien sind bislang bekannt (SHERRY 2009). Erstens, NSP1 induziert eine Proteasomenabhängige Degradation der Transkriptionsfaktoren IRF3, IRF5 und IRF7, um ihre Induktion durch IFN zu unterbinden. Zweitens, NSP1 induziert eine Proteasomenabhängige Degradation des Ubiquitin-Ligase-Komplex Protein β-TrCP. Zum Dritten kann Rotavirus NF-κB in Viroplasmen sequestrieren und viertens, kann die nukleäre Translokation von STAT1 und STAT2 unterbunden werden (SHERRY 2009). Quin et al. (2011) postulierten jüngst, das NSP1 die Retinolsäure induzierbares Gen I (RIG-I) hemmt. Die dominierenden antiviralen Strategien sind dabei abhängig von Rotavirusstamm und Zelltyp. Humane Rotavirusstämme konnten vermehrt mit NSP1 induzierter Degradation von IRF5 und IRF7 in Verbindung gebracht werden, während NSP1 von tierischen Rotavirusstämmen IRF3, IRF5 und IRF7 als Ziel haben (ARNOLD und PATTON 2011). Diese Resultate verdeutlichen das breitere Spektrum viraler Abwehrstrategien animaler Rotaviruen (ARNOLD und PATTON 2011). Die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber kommerziell erhältlichem rFeIFN-ω wurde in vitro auf felinen Zelllinien getestet. Mögliche zytotoxische Effekte des rekombinanten Interferons wurden ausgeschlossen. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Reduktion virusinfizierter Zellen bei Behandlung mit rFeIFN-ω in steigender Konzentration. Die antivirale Wirkung war auf KE-R Zellen ausgeprägter. Bereits ab einer Interferonkonzentration von 103 Einheiten/ml konnten keine virusinfizierten Zellen mehr nachgewiesen werden. Die Unterschiede zwischen den verwendeten felinen Zelllinien könnten durch Unterschiede in der Expression von Interferonrezeptoren erklärt werden. Die Anzahl der Interferonrezeptoren kann von Zelle zu Zelle stark variieren (10-200 pro Zelle) (FLINT et al. 2000). Ein ähnliches Phänomen konnte für die felinen Zelllinien der Crandel feline kidney (CRFK) Zellen und der Felis catus whole fetus (fcwf-4) Zellen gezeigt werden (MOCHIZUKI et al. 1994). Möglicherweise verfügt die embryonale feline Fibroblastenzelllinie (KE-R) über eine größere Anzahl Interferonrezeptoren als die embryonale feline Gehirnzelllinie 73 5 Diskussion (KG-R). Eine weitere Erklärung wäre, dass unterschiedliche virale Abwehrstrategien in den Zelllinien ablaufen. Douagie et al. (2007) konnten zeigen, dass ein Affen-Rotavirusstamm eine Degradation von IRF3 in Murinen embryonalen Fibroblasen (MEFs), aber nicht in murinen myeloiden Dendritischen Zellen (mDCs) induzieren kann. Die vorliegenden Ergebnisse korrelieren mit in vitro Studien, in denen eine dosisabhängige antivirale Aktivität des rFeIFN-ω gegen canines Parvovirus, felines Panleukopenievirus, felines Calicivirus, felines Herpesvirus und felines Coronavirus auf unterschiedlichen felinen Zelllinien nachgewiesen wurde (MOCHIZUKI et al. 1994, U. TRUYEN 2002). Zusammenfassend stellt rFeIFN-ω in vitro eine wirksame antivirale Substanz gegen Rotavirusinfektionen dar. 74 6 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Neumann, Stefanie: Untersuchungen zur Prävalenz von Rotaviren der Gruppe A bei Katzen und Hunden mit Durchfall sowie zur antiviralen Wirksamkeit von rekombinantem felinen Interferon Omega Institut für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig 78 Seiten, 23 Abbildungen, 10 Tabellen und 180 Literaturangaben Eingereicht im März 2012 Schlüsselwörter: Rotavirus, Prävalenz, Durchfall, rekombinantes felines Interferon Omega In der Veterinärmedizin verursachen Rotaviren als Jungtiererkrankung vor allem in der Nutztierpraxis hohe ökonomische Verluste. Über die Prävalenz von Rotavirusinfektionen bei Hunden und Katzen ist sehr wenig bekannt, obwohl von den in der Literatur als wechselseitig zwischen Mensch und Tier übertragbaren Viren ein nicht zu unterschätzendes Risiko ausgehen kann. Zunächst wurden retrospektiv Prävalenzdaten über den Nachweis von Rotaviren bei Hunden und Katzen mit Durchfall im Vergleich zu Coronaviren und Parvoviren erhoben. Dazu wurden Kotproben von 2055 Hunden und 1481 Katzen quantitativ auf das Vorhandensein von Rota-, Corona- und Parvovirus untersucht. Desweiteren wurden Aspekte der geographischen Verteilung, der Altersverteilung, mögliche Rasseprädispositionen und das Auftreten saisonaler Erkrankungsgipfel untersucht und ausgewertet. Für Rotavirusinfektionen beträgt die statistische Prävalenz 7% bei Hunden und 8% bei Katzen. Bei Hunden und Katzen konnten signifikant häufiger Dreifachinfektionen nachgewiesen werden. Bei einer Infektion mit Rota- und Coronavirus liegt beim Hund zu 100% auch eine Infektion mit Parvovirus vor. Zweifachinfektionen kamen weniger häufig vor als Monoinfektionen. Alle drei Virusinfektionen kamen bei Hunden statistisch signifikant häufiger in der Altersgruppe ≤ 1 Jahr vor. Ein statistisch signifikant häufiger Rotavirusnachweis konnte bei der Katzenrasse Siam nachgewiesen werden, während keine Hunderasse besonders hervortrat. Im Postleitzahlengebiet 3 konnten im Beobachtungszeitraum von 2000 bis 2006 statistisch signifikant häufiger Rotavirusinfektionen bei Hunden nachvollzogen werden. Es konnte sowohl für Hunde, als auch für Katzen der Trend belegt werden, dass bei steigenden Lufttemperaturen, die Anzahl der Rotavirusinfektionen sinkt. Es 75 6 Zusammenfassung kann somit von einer bedingten Saisonalität ausgegangen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber kommerziell erhältlichem Typ I Interferon (rFeIFN-ω) in vitro getestet. Zunächst wurde zum Nachweis der Aktivität der Typ I Interferone (rFeIFN-ω, rBoIFN-α, rHuIFN-α) die Expression des Mx Proteins auf Zelllinien felinen, caninen, bovinen und humanen Ursprungs, sowie auf Affenzelllinien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass rBoIFN-α ausschließlich auf Zellen bovinen Ursprungs eine konzentrationsabhängige Expression des Mx Proteins induziert. Das rFeIFN-ω induziert auf Zellen felinen und bei höheren Konzentrationen auch auf Zellen caninen Ursprungs die Expression des Mx Proteins. Das rHuIFN-α zeigt eine konzentrationsabhängige Induktion des Mx Proteins in Zellen humanen, caninen, felinen und bovinen Ursprunges, sowie in Affenzelllinien. Somit konnte in vitro eine Kreuz-Speziesspezifität für rekombinantes humanes Interferon immunmodulatorischen nachgewiesen Wirkung wurde werden. Zum Nachweis die Expression der einer MHC I Oberflächenrezeptoren nach Behandlung mit rFeIFN-ω und rHuIFN-α untersucht. Die Behandlung mit rFeIFN-ω führte ausschließlich in felinen Zellen zu einer konzentrationsabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptordichte. Die Behandlung mit rHuIFN-α führte zu einer konzentrationsabhängigen signifikanten Erhöhung der Rezeptordichte auf felinen Zellen und in der Affenzelllinie MA104. Die Empfänglichkeit von Rotaviren gegenüber rFeIFN-ω wurde auf der embryonalen felinen Fibroblastenzelllinie (KE-R) und auf der embryonalen felinen Gehirnzelllinine (KG-R) unter steigender Interferonkonzentration (101-104 Einheiten/ml) untersucht. Beide Zelllinien zeigten eine deutliche Reduktion der infizierten Zellen bei steigender Interferonkonzentration. Die antivirale Wirkung war in KE-R Zellen deutlicher ausgeprägt. Dort konnten bereits bei einer Interferonkonzentration von 103 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr nachgewiesen werden, während KG-R Zellen erst bei einer Konzentration von 104 Einheiten/ml keine sichtbar infizierten Zellen mehr nachzuweisen waren. Abschließend wird deutlich, dass Infektionen mit Rotaviren ein vielmals vernachlässigtes Problem in der Veterinärmedizin darstellt, vor allem, wenn man von einer Vergesellschaftung mit den für Hund und Katze pathogenen Viren Corona- und Parvovirus ausgeht. Mit dem rFeIFN-ω steht in vitro eine wirksame antivirale Substanz gegen Rotavirusinfektionen zur Verfügung. 76 7 Summary 7 Summary Neumann, Stefanie: Investigations on the prevalence of group A Rotaviruses in cats and dogs with diarrhea and on the antiviral efficacy of recombinant feline interferon omega Institute of Virology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig 78 pages, 23 figures, 10 tables und 180 references Submitted in March 2012 Keywords: Rotavirus, Prevalence, Diarrhea, Recombinant feline interferon omega Rotavirus infections of young animals are veterinary medicine of highly economic importance, especially in farm animals. Although it has been described that transmission between humans and animals might occur, little is known about the prevalence of Rotavirus in dog and cat which might be an underestimated risk for infections in men. Initially data have been collected retrospectively regarding the prevalence of confirmed cases of diarrhea caused by Rotavirus in dogs and cats in comparison to Corona- and Parvovirus. For this purpose fecal samples of 2055 dogs and 1481 cats have been examined quantitatively for the presence of Rota-, Coronaand Parvovirus. Additionally the geographical distribution, age pattern, breed predisposition and occurrence of seasonal climax have been examined and evaluated. The statistical prevalence of Rotavirus is given 7 % in dogs and 8 % in cats. In dogs and cats a significant higher rate of infection with all three viruses could be confirmed. In the dog the presence of Rota- and Coronavirus showed an additional presence of Parvovirus in 100% of the animals. Infections with two viruses were less common than infection with one virus only. A significant higher rate of infections in cases of all three viruses could be detected in the age group ≤1 year in dogs. For the breed “Siam” a significant higher infection rate could be demonstrated, while among the dogs no breed emerged. In post code 3 a significant higher rate of Rotavirus infections during the observation period between 200 and 2006 could be detected in dogs, whereas in cats no geographical distribution could be noticed. It could be validated that an increase of air temperature led to a decrease of Rotavirus infection in both dogs and cats confirming a seasonality of infection. 77 7 Summary In the second part of the study the sensitivity of Rotavirus for commercially available type I Interferon (rFeIFN-ω) has been tested in vitro. To prove the activity of type I IFN (rFeIFN-ω, rBoIFN-α, rHuIFN-α) the expression of Mx protein has been examined using cell lines of feline, canine, bovine and human origin, as well as in a monkey cell line. It could be shown that rBoIFN-α led exclusively on cells of bovine origin to a concentration dependent expression of Mx protein. However, rFeIFN-ω induced Mx protein expression on feline cells, also on canine cells using higher concentrations of interferon. A concentration dependent induction of Mx protein could be elicited by rHuIFN-α in cells of human, feline, canine and bovine origin, as well as on the monkey cell line. Consequently a cross species specifity for rHuIFN-α could be demonstrated in vitro. For proving the immune modulatory effects of rFeIFN-ω and rHuIFN-α the presence of MHC I receptors has been examined. Only in feline cells treated with rFeIFN-ω a concentration dependent increase of receptors could be observed. Feline cells and the monkey cell line MA104 treated with rHuIFN-α showed a concentration dependent increase of MHC I receptors. The susceptibility of Rotavirus for rFeIFN-ω has been examined in feline fibroblast cell line (KE-R) and in feline brain cell line (KG-R). Increasing IFN concentration (101-104 units/ml) resulted in a considerable reduction of infected cells in both cell lines. The antiviral effect was more prominent in KE-R, where no visibly infected cell could be found at a concentration of 103 units/ml, in comparison to KG-R where the latter occurred at a concentration of 104 units/ml. In summary it can be concludes that the infection of Rotavirus is often a neglected infection in veterinary medicine, especially if an association with Corona- and Parvovirus, both pathogen for dog and cat, frequently occurs. Recombinant feline Interferon omega showed to be an effective antiviral substance in vitro for the inhibition of rotavirus replication. 78 8 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Abbas. Cellular and molecular immunology. 2003(5th ed.):78-80, 257-262, 356-357, 406. Addie DD, Jarrett O. Use of a reverse-transcriptase polymerase chain reaction for monitoring the shedding of feline coronavirus by healthy cats. Vet Rec 2001;148(21):649-53. Alcami A, Smith GL. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. J Virol 1995;69(8):4633-9. Angel J, Franco MA, Greenberg HB, Bass D. Lack of a role for type I and type II interferons in the resolution of rotavirus-induced diarrhea and infection in mice. J Interferon Cytokine Res 1999;19(6):655-9. Ank N WH, Bartholdy C, Eriksson K, Thomsen AR, Paludan SR. 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Type III interferon (IFN) induces a type I IFNlike response in a restricted subset of cells through signaling pathways involving both the JakSTAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. J Virol 2007;81(14):7749-58. 86 9 Anhang 9 Anhang 9.1 Chemikalien Acrylamid Carl Roth Chemie, Karlsruhe APS Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg Bromphenolblau Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg BSA Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg β-Mercaptoethanol Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg CFSE Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Dextrose Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg DMSO Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München EDTA Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg FKS Biochrom Ag, Berlin Glycin Carl Roth Chemie, Karlsruhe Hühnerserum Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München KCl Merck KGaA Chemie, Darmstadt LAH Difco Laboratories, USA Leibovitz Biochrom Ag, Berlin NaCl Carl Roth Chemie, Karlsruhe NaHCO3 Carl Roth Chemie, Karlsruhe Natriumpyruvat Fluka Chemie AG, Schweiz NEAS Biochrom Ag, Berlin Magermilchpulver TSI GmbH, Zeven MEM Earl GibcoBRL, Eggenstein 87 9 Anhang MEM Hanks GibcoBRL, Eggenstein Methanol Carl Roth Chemie, Karlsruhe Molekulargewichtsmarker Invitrogen, Karlsruhe Paraformaldehyd Carl Roth Chemie, Karlsruhe Phenolrot Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg RPMI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München SDS Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg Succrose ICN, Meckenheim TEMED GibcoBRL, Eggenstein Tris-Cl Invitrogen, Karlsruhe Trypanblan Serva Elektrophoresis GmbH, Heidelberg Trypsin GibcoBRL, Eggenstein TWEEN 20 Merck KgGaA Chemie, Darmstadt 9.2 Puffer und Lösungen Der Proteinladepuffer besteht aus: 40% Succrose, 12% SDS, 0,5% Tris-Cl und 5% Bromphenolblau 5%. Der Transferpuffer besteht aus: 0,303% Tris, 1,44% Glycin, 0,1% SDS und 20% Methanol. Der Phosphatpuffer (DULBECCO u. VOGT (1954) besteht aus: 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,237% Na2HPO4, 0,02% KH2PO4, 0,013% CaCl2 und 0,01% MgCl2. 88 9 Anhang Der Trypsinpuffer besteht aus: 0,8 % NaCl, 0,04% KCl, 0,1% Dextrose, 0,058% NaHCO3, 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA Proteinkonzentrationsbestimmung: Lösung A und Lösung B (Kit) Thermo Scientific, Karlsruhe 9.3 Gelelektrophorese (SDS PAGE) Das Trenngel besteht aus 40,5% H2O, 25% 1,5 Tris. Cl, 0,001% SDS 10%, 33% Acrylamid 30%, 0,0005% APS 10% und 0,00005% TEMED. Das Sammelgel besteht aus 61% H2O, 25% 0,5 Tris Cl, 0,001% SDS 10%, 0,013% Acrylamid 30%, 0,0005% APS 10% und 0,0001%TEMED. 9.4 Verbrauchsmaterialien und Geräte Eppendorfgefäße Sarstedt AG&Co, Nümbrecht Eppendorfpipetten Eppendorf AG, Hamburg Deckgläschen Menzel-Glaser, Braunschweig FACS Röhrchen BD-Falcon, Heidelberg Filterpapier Carl Roth Chemie, Karlsruhe Kulturplatten „6-well-plates“ Corning, USA Nitrocellulosemembran Whatman über Fisher Scientific, Schwerte Zellkulturflaschen (T25, T75) Corning, USA Inkubator Heraeus, Hanau Schüttler IKA Labortechnik, Staufen Vortexer Carl Roth Chemie, Karlsruhe 89 9 Anhang Gel-Elektrophorese Apparaturen Transformator SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese Apparatur Bio-Rad Laboratories Blot-Apparatur GmbH, München Ultraschall-Homogenisierer Branson Ultrasonics, USA Wasserbad Gesellsch. f. Labortechnik, Burgwedel Zentrifuge Heraeus, Hanau Photometer Beckmann Instrumente, München Neubauer-Zählkammer Merck KgGaA Chemie, Darmstadt FACScan Durchflußzytometer Bentcon Dickinson GmbH, Heidelberg Lichtmikroskop Olympus Dtschld GmbH, Hamburg Inversmikroskop Leitz, Wetzlar Pipettierhilfe Tecnorama AG, Schweiz Biohazard Sicherheitswerkbank Biohit Dtschld GmbH, Köln 90 9 Anhang 9.5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Morphologie der Rotaviren Abbildung 2 Pathophysiologie der intestinalen Rotavirusinfektion Abbildung 3 Signaltransduktion der Typ I Interferone Abbildung 4 Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 6 Reaktionsvertiefungen zur Messung der Zellproliferation Abbildung 5 Vereinfachtes Schema der Durchflußzytometrie Abbildung 6 Streulicht Dot-Plot Abbildung 7 Linienhistogramm bei Zellfärbung mit CFSE Abbildung 8 Fluoreszensmikroskopisches Bild Abbildung 9 Absolute Anzahl und statistische Prävalenz viraler Infektionen der Jahre 2000-2006 Abbildung 10 Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen der Jahre 2000-2006 im Verhältnis zur absoluten Anzahl eingegangener Proben Abbildung 11a,b Konfidenzintervalle der Gruppen I-VIII Abbildung 12 Nachweishäufigkeit der Coinfektionen beim Hund Abbildung 13 Nachweishäufigkeit der Coinfektionen bei der Katze Abbildung 14 Gegenüberstellung von Coinfektionen und Dreifachinfektionen bei Hunden (a) und Katzen (b) Abbildung 15a Altersverteilung beim Hund Abbildung 15b Altersverteilung bei der Katze Abbildung 16a Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und Rotavirusinfektion beim Hund 91 9 Anhang Abbildung 16b Zusammenhang zwischen Lufttemperatur und Rotavirusinfektion bei der Katze Abbildung 17 Darstellung der KE-R Zellproliferation bei der Behandlung mit felinem rekombinantem Interferon omega Abbildung 18 Induktion des Mx Protein auf felinen Zelllinien Abbildung 19 Induktion des Mx Proteins auf bovinen und humanen Zelllinien Abbildung 20 Induktion des Mx Proteins auf caninen und Affenzelllinien Abbildung 21 Darstellung der Expression der MHC I Proteine auf unterschiedlichen Zelllinien nach Behandlung mit felinem und humanem Typ I Interferon Abbildung 22 Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN – ω auf KE-R Zellen Abbildung 23 Antivirale Wirksamkeit von rFeIFN – ω auf KG-R Zellen 92 9 Anhang 9.6 Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Impfstoffe zur Muttertiervakkzinierung bei Rindern Tabelle 2 Antiviral wirksame Proteine Tabelle 3 Übersicht der verwendeten Zelllinien Tabelle 4a-c Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen beim Hund in den Jahren 2000-2006 Tabelle 5a-c Absolute Anzahl nachgewiesener Virusinfektionen bei der Katze in den Jahren 2000-2006 Tabelle 6 Infektionen des Hundes 2000-2006 Tabelle 7 Infektionen der Katze 2000-2006 Tabelle 8a Rotavirusnachweis bei häufigen Hunderassen Tabelle 8b Rotavirusnachweis bei häufigen Katzenrassen Tabelle 9a Geographische Verteilung der Rotavirusinfektion beim Hund Tabelle 9b Geographische Verteilung der Rotavirusinfektion bei der Katze Tabelle 10 Übersicht der Induktion des Mx Proteins auf unterschiedlichen Zelllinien 93 10 Danksagung 10 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. Thomas W. Vahlenkamp für die freundliche Aufnahme im Friedrich-Loeffler Institut, für die Bereitstellung des Themas, die zahlreichen kreativen Anregungen und Hilfestellungen und die freundschaftliche Betreuung auch über weite Entfernungen hinweg. Für die außerordentlich geduldige Begleitung im Labor möchte ich Kerstin Wink ganz herzlich danken. Hierbei sei Anne Carnitz nicht vergessen, die mir beim „Kampf“ mit den Messungen am FACS beigestanden hat. Dr. R. Riebe von der Zellbank des FLI danke ich für die Bereitstellung der Zelllinien, Dr. G. Keil für die Bereitstellung des rekombinanten bovinen Interferon und Dr. M. Dauber für die Bereitstellung des bovinen Rotavirus. Frau Dr. Elisabeth Müller der Firma LABOKLIN, Labor für Klinische Diagnostik GmbH & Co.KG danke ich herzlich für die Bereitstellung der Rohdaten der retrospektiven Studie der Arbeit. Hierbei möchte ich insbesondere Janine Guthardt danken, die durch stimulierende Arbeitsatmosphäre, Geduld und hervorragenden Kaffee das Sammeln der vielen Daten angenehm gemacht hat. Jörg Hannemann der Virbac Tierarzneimittel GmbH danke ich für die Unterstützung und Bereitstellung des rekombinanten felinen Interferon omega (rFeIFN-ω; Virbagen® Omega). Matthias möchte ich ganz besonders dafür danken, dass er immer für mich da war und ein Auge darauf hatte, das der Computer auch das tat, was ich wollte. Enrico danke ich für seine stimulierenden, wenn auch unspezifischen Kommentare aus dem Äther. Zu guter Letzt danke ich meiner Familie und allen Freunden, die mich auf meinem Weg begleitet und immer an mich geglaubt haben. Liebe Mama, lieber Papa, vielen Dank für Euren Rückhalt und Eure Liebe. Liebes Brüderchen, ich bin unheimlich stolz auf Dich und wünsche Dir für die Zukunft die Erfüllung all Deiner Wünsche. 94
