TTechnik - Verband Deutscher Zytologisch Tätiger Assistenten eV

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Technik
Techniken im zytologischen Alltag – HPV-Diagnostik
In dieser Rubrik möchten wir künftig gerne
Methoden, welche die zytologische Diagnostik
ergänzen, vorstellen. In fast allen zytologischen
Laboren übernehmen die Assistentinnen heute
diese „Mikroskop-fremden“ Aufgaben. Eine der
am häufigsten angewendeten, die Zytologie
ergänzenden Methoden ist die HPV-Diagnostik.
Hybrid Capture 2: Schritt 1
Freisetzung und Denaturierung der Nukleinsäure
Der Nachweis von humanen Papilloma Viren kann
mittels verschiedener molekularbiologischen Methoden erfolgen. Eine dieser Methoden ist die DNA-insitu-Hybridisierung. Die in-situ-Hybridisierung ist eine
molekulare Diagnostik unter Verwendung der sogenannten Signalamplifikation. Einer der bekanntesten
kommerziell erhältlichen Kits ist der Hybrid Capture 2®
der Firma Digene, welcher im folgenden als Beispiel
des Testablaufes dient.
Der HPV-DNA-Test von Digene verwendet zwei RNA
Probencocktails zur Differenzierung zwischen High
und Low risk HPV-Typen. (Abb 1)
Abb. 2
Diese sind mit hochspezifischen Antikörpern gegen
die RNA-DNA-Doppelstränge beschichtet. Nichtgebundene Bestandteile werden mittels Dekantierung
und Spüldurchgängen mit einem Waschpuffer entfernt.
Hybrid Capture 2: Schritt 2
Hybridisierung der RNA-Probe mit der Ziel-DNA
Die Sonden
> Low Risk Sonde-
6, 11, 42, 43, 44
> High Risk Sonde-
16, 18, 31, 33 ,35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68
Aus Cyto-Info 3/ 2006, Herausgeber: Verband Deutscher Cytologisch Tätiger Assistenten e.V
Abb. 3
Abb. 1
Eine Unterscheidung ist demnach nur zwischen Risikogruppen möglich. Der Hybrid Capture II® erlaubt
keine Bestimmung des jeweils einzelnen HPV-Types.
Eine Typenbestimmung ist nur mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) möglich.
Testprinzip
Im ersten Schritt erfolgt die Freisetzung der DNA und
die Trennung der DNA-Stränge (Abb. 2) durch Denaturierung in einem auf 65°C erhitzten Wasserbad. Sind
im zu untersuchenden Probenmaterial DNA-Sequenzen der spezifischen HPV-Typen enthalten, bilden
diese im zweiten Schritt in Lösung mit den sog. High
risk und/oder Low risk Sonden sogenannte RNA/DNAHybride. (Abb. 3)
Anschließend erfolgt im nächsten Schritt die Überführung des Gemisches in Vertiefungen, welche auf
einer Mikrotiterplatte angeordnet sind.(Abb. 4)
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Hybrid Capture 2: Schritt 3
Bindung der RNA: DNA-Hybriden an einer soliden Phase einer
Mikrotiterplatte
Abb. 4
Durch Zugabe von Nachweisreagenzien, welche zum
einen an alkalische Phosphortase gekoppelte Antikörper enthalten (Abb.5) als auch ein bei seiner Umsetzung Lichtsignale freisetzendes Substrat, erfolgt
der Nachweis der vervielfältigten viralen DNA.
Hybrid Capture 2: Schritt 4
Reaktion der gebundenen Hybriden mit multiplen Antikörperkonjugaten
Verwendete Fremdwörter
Chemilumineszenz:
eine durch chemische Reaktion hervorgerufene
Leuchterscheinung
Hybrid:
von zweierlei Herkunft; gemischt
Abb. 5
Die semiquantitative Messung der amplifizierten, chemilumineszenten Signale erfolgt im Luminometer.
(Abb. 6)
Hybridisierung:
komplementäre Anlagerung eines synthetischen RNA
Abschnittes (Sonde) an zu untersuchender DNA unter
Bildung eines Doppelstranges
komplementär:
ergänzend
Signalamplifikation:
Verstärkung des Lichtsignales
Hybrid Capture 2: Schritt 5
Messung der amplifizierten chemilumineszierten Signale im
Luminometer
synthetisch:
künstlich hergestellt
Verfasserin:
Anke Weiß ,
Pfarrer- Röhrig- Str. 1,
50127 Bergheim
Quelle Bildmaterial:
Digene Deutschland GmbH
Aus Cyto-Info 3/ 2006, Herausgeber: Verband Deutscher Cytologisch Tätiger Assistenten e.V
Abb. 6
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