Diss. ETH N° 22784 Strategies for improving the efficacy of anti

Research Collection
Doctoral Thesis
Strategies for improving the efficacy of anti-L1CAM
radioimmunotherapy in an ovarian cancer model
Author(s):
Lindenblatt, Dennis
Publication Date:
2015
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-010603304
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Diss. ETH N° 22784
Strategies for improving the efficacy of anti-L1CAM
radioimmunotherapy in an ovarian cancer model
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES OF ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Dennis Lindenblatt
M.Sc. Biotechnology
Technische Universität Braunschweig
born on 19.08.1983
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Roger Schibli, examiner
Prof. Dr. Simon Ametamey, co-examiner
Prof. Dr. Martin Pruschy, co-examiner
Dr. Jürgen Grünberg, co-examiner
2015
Summary
Epithelial ovarian cancer (OC) has the highest mortality rate of cancers unique to women.
Despite the gold-standard treatment, consisting of cytoreductive surgery followed by
paclitaxel-platinum chemotherapy, the five-year overall survival for advanced disease is as
low as twenty percent. Various research groups therefore focus on targeted therapies
including monoclonal antibodies (mAbs) and protein kinase inhibitors (PKIs) which,
unfortunately, show only limited success in the clinics until now. To further enhance the
cytotoxicity of mAb-based targeted treatments, radioimmunotherapy (RIT) is considered as
an attractive alternative against small tumor nodules, frequently appearing in OC. Though
pre-clinical results are promising, only one Yttrium-90-labeled mAb (90Y-muHMFG1) against
OC reached clinical phase III with poor results. New RIT approaches for the consolidation of
OC are therefore urgently needed and should be examined carefully at a pre-clinical stage.
Our previous studies showed that a single treatment with
177Lu-labeled
anti-L1 cell adhesion
molecule (L1CAM) mAb chCE7 is as effective as three times weekly i.p. applications of
unlabeled chCE7 (10 mg/kg) against OC in vivo. To further increase the efficacy of mAb
chCE7-based RIT in a pre-clinical setting, we investigated different, translatable combination
therapies which are presented in this thesis.
In a first project we examined if combined applications of the microtubule-stabilizing agent
paclitaxel (PTX) and anti-L1CAM
177Lu-DOTA-chCE7
increases the RIT efficacy against
IGROV1 OC cells. Initial in vitro studies demonstrated a significantly decreased number of
viable cells for the combination of
177Lu-labeled
mAb chCE7 and PTX compared to either
treatment alone. Thus, 177Lu-DOTA-chCE7 concentrations necessary to reduce cell viability to
50% compared to untreated controls could be reduced 3.2-fold by combination with PTX.
Combination was thereby effective in a synergistic manner. Cells treated with PTX showed a
dose-depended arrest in the radiosensitive G2/M phase of the cell cycle 24h post treatment
start.
Given this in vitro proof of concept we subsequently performed an in vivo therapy study
investigating the efficacies of mono and combined therapies against subcutaneous IGROV1
xenografts. We found that the combination therapy including
177Lu-DOTA-chCE7
and PTX
significantly prolonged overall survival compared to monotreatments. Median survival for
mice receiving the combination therapy (55 days) was thereby increased 3-fold compared to
PTX (18 days) and 1.9-fold compared to
177Lu-DOTA-chCE7
biodistribution studies revealed no significant difference in
(29 days). Comparative
177Lu-DOTA-chCE7
regardless of an additional PTX injection (177Lu-DOTA-chCE7: 49%IA,
tumor uptake
177Lu-DOTA-chCE7
+
PTX: 45%IA). We therefore assume that the G2/M phase cell cycle arrest of PTX treated
tumor cells was the reason for improved efficacy.
In a different approach we investigated if the exchange of the therapeutic radionuclide
177Lu
against the radiolanthanide 161Tb, featuring a similar physical half-life and beta-minus particle
energy but possessing additional, low energy Auger-electrons (3-50 keV), further increases
the
therapeutic
efficacy
of
anti-L1CAM
RIT
in
a
pre-clinical
model.
Both
radioimmunoconjugates (RICs) demonstrated similar high tumor uptakes after 72h (177LuDOTA-chCE7: 33%IA, 161Tb-DOTA-chCE7: 31%IA) based on biodistribution studies indicating
a similar in vivo behavior. Maximum tolerated activity was found to be slightly lower for the
161Tb-radiolabeled
RIC (10 MBq) compared to its
177Lu-labeled
counterpart (12 MBq). An
increased tumor growth inhibition by 82% for 161Tb-DOTA-chCE7 compared to 177Lu-RIT was
observed. The slightly higher beta-energy, as well as the 16-fold higher emission of conversion
and Auger-electrons compared to
radiotoxicity.
161Tb
177Lu,
are most likely the reasons for the increased
therefore proves to be a promising alternative to
177Lu
for RIT with
internalizing antibodies.
Subsequently, we addressed the question, if we can optimize the RIT with
161Tb
by
combination with PTX or the DNA-damaging chemotherapeutic carboplatin (CBT). Results
showed that all therapies containing 161Tb-RIT improved overall survival compared to non- or
chemotherapy treated mice. We found a non-significant but favorable trend in overall survival
for the combination including
days
(161Tb-RIT)
161Tb-RIT
and PTX with median survivals of 26 days (PTX), 57
and 69 days (combination therapy). No increased efficacy was observed
between groups receiving
161Tb-RIT
or
161Tb-RIT
and CBT. We assume, that the
161Tb-DOTA-
chCE7 treatment induced a sufficient amount of non-repairable DNA-damages that ultimately
forced tumor cells into cell death. In turn, additionally induced DNA-damages by CBT are
unlikely to produce any further positive therapeutic effects. Analysis of bystander effects,
DNA-double-strand-breaks (DSBs), apoptosis/ necrosis, as well as comparative therapy
studies based on
177Lu-
or
161Tb-DOTA-chCE7
treatments could provide further information
about effects induced by the Auger-electrons.
Along with mAbs, several protein kinase inhibitors (PKIs) are currently being tested in clinical
studies against OC as monotreatments or in combination with chemotherapy. For our studies
we selected five clinically relevant PKIs (MK1775, alisertib, MK2206, temsorolimus and
saracatinib, clinical phase I-II) for their ability to improve
177Lu-RIT
against OC, based on
their mechanisms influencing the cell cycle or DNA repair machinery.
We performed initial in vitro cytotoxicity studies showing highest efficacies for PKIs MK1775
and alisertib against the two OC cell lines tested (IGROV1, SKOV3ip). Subsequent
combination treatments revealed increased radiosensitizing effects for MK1775 (IC60 MK1775
+
177Lu-DOTA-chCE7:
(IC60 Alisertib +
14-fold decrease vs.
177Lu-DOTA-chCE7:
177Lu-DOTA-chCE7)
6-fold decrease vs.
compared to PKI alisertib
177Lu-DOTA-chCE7)
against IGROV1
cells.
The efficacy of combined applications including MK1775 and
177Lu-DOTA-chCE7
against
IGROV1 and the comparatively radioresistant cell line SKOV3ip was therefore further
examined including varying treatment sequences. We found that PKI MK1775 sensitizes
IGROV1 cells towards
177Lu-labeled
mAb chCE7 in a synergistic manner. However,
sensitization of rather radioresistant SKOV3ip cells was not achieved.
Western blot analysis showed a higher amount of induced DNA-DSBs for the combination
treatment compared to either monotreatment in IGROV1 cells. However, SKOV3ip cells
showed comparable amounts of present DNA-DSBs between MK1775 and combined
treatments. Higher levels of DNA-DSBs subsequently resulted in a significantly increased
number of early-apoptotic cells in IGROV1 cells (177Lu-DOTA-chCE7: 8%, MK1775: 28%,
177Lu-DOTA-chCE7
+ MK1775: 40%).
In contrast, SKOV3ip cells showed similar amounts of early-apoptotic cells for the combined
treatment compared to MK1775 alone (177Lu-DOTA-chCE7: 6%, MK1775: 11%,
177Lu-DOTA-
chCE7 + MK1775: 11%).
Immunohistology analysis of SKOV3ip xenografts revealed increased amounts of DNA-DSBs
in tumors treated with MK1775 (41%) or combination therapy (42%), compared to
177Lu-RIT
(20%) or untreated controls (21%). Observations are in line with SKOV3ip in vitro results
demonstrating that induction of DNA-DSBs was not significantly enhanced for the
combination treatment compared to both monotreatments.
Results indicate that the combination with
177Lu-labeled
mAb chCE7 and PKI MK1775 is an
alternative for combined treatments against OC. We suggest that existing radioresistance
mechanisms might influence the ability of MK1775 to sensitize tumor cells.
In summary, investigated strategies presented in this thesis improved the efficacy of RIT
against OC in vitro and in vivo providing potential clinical setups against small ovarian tumor
nodules, after first-line cytoreductive surgery. Patients may therefore benefit from a possible
enhanced therapeutic efficacy and lower side effects during therapy.
Zusammenfassung
Das Ovarialkarzinom (OK) hat die höchste Mortalitätsrate unter den gynäkologischen
Krebserkrankungen bei Frauen. Fehlende Tumormarker für eine Früherkennung sowie das
unbemerkte Voranschreiten der Krankheit in frühen Stadien führt häufig zu schlechten
Prognosen (Stadien III-IV) und einer 5-Jahres-Überlebensrate von nur 20 Prozent. Reicht für
die Behandlung der Tumore im ersten Stadium eine operative Behandlung, wird im weiteren
Krankheitsverlauf sowohl operativ als auch mit einer postoperativen, adjuvanten Taxol- und
Carboplatin-haltigen Chemotherapie behandelt. Trotz der stetigen Weiterentwicklung der
klinisch angewandten Chemotherapeutika sind residuale Tumorerkrankungen und das
Auftreten von Resistenzen das grösste Problem. Viele Forschungsgruppen arbeiten deshalb an
der Entwicklung zielgerichteter Therapieformen mit monoklonalen Antikörpern (mAks) oder
Proteinkinaseinhibitoren (PKIs). Trotz guter prä-klinischer Ergebnisse sind die Resultate aus
bereits absolvierten klinischen Studien nicht überzeugend. Daher sind neue Therapieformen
mit größerer Effizienz für diese Erkrankung notwendig.
Die Radioimmuntherapie (RIT) gilt als alternativer Ansatz um die Wirkung von Antikörper
basierenden Therapien zu verbessern. Eine RIT ist besonders bei kleineren Tumoren, wie sie
häufig nach einer operativen Entfernung des OK vorkommen, eine vielversprechende
Therapieoption. Prä-klinische Untersuchungen zeigten bereits gute Ergebnisse, dennoch
erreichte nur ein mit Yttrium-90 markierter Antikörper (90Y-muHMFG1) die klinische Phase
III. Gute Ergebnisse aus den vorherigen Studien liessen sich dabei leider nicht bestätigen.
Neue Therapieansätze zur Verbesserung der Effizienz von Radioimmuntherapien zur
Behandlung von OK sind daher von hoher klinischer Relevanz und sollten sorgfältig in präklinischen Studien untersucht werden.
In vorangegangenen Studien konnten wir zeigen, dass die einmalige Injektion von Lutetium177 markierten Antikörper chCE7 in Mäusen mit OK eine gleiche Wirkung erzielte wie
mehrfache (dreimal wöchentlich) Anwendungen von kaltem, nicht markierten Antikörper.
Der chimäre mAk chCE7 bindet dabei zielgerichtet an das von Tumorzellen exprimierte Zell
Adhäsions Molekül L1CAM. Verschiedene prä-klinische Ansätze, die Effektivität der mAk
chCE7 basierenden RIT weiter zu verbessern werden in dieser Dissertation vorgestellt.
In
einem
ersten
Projekt
wurde
untersucht,
ob
das
Mikrotubuli
stabilisierende
Chemotherapeutikum Paclitaxel (PTX) die RIT Effizienz gegen OK (IGROV1) Zellen
verbessert. In vitro Versuche zeigten, dass durch die Kombination mit PTX die mittlere
inhibitorische Konzentration (IC50) des Radioimmunkonjugates (RIK)
177Lu-DOTA-chCE7
signifikant um ein 3.6-faches verringert werden konnte. Paclitaxel arretierte dabei die
behandelten Zellen Dosis abhängig in der bestrahlungssensitiven Metaphase des Zellzyklus.
Bei einer nachfolgenden in vivo Therapiestudie verbesserte die Kombination beider
Substanzen die Gesamtüberlebensrate von Mäusen signifikant gegenüber den jeweiligen
Einzeltherapien. Die mediane Überlebenszeit von Mäusen mit Kombinationstherapie (55
Tage) konnte dabei um das 3-fache, bzw. 1.9-fache im Vergleich zur Chemotherapie (18 Tage)
und RIT (29 Tage) gesteigert werden. Bioverteilungsstudien bewiesen, dass durch die
zusätzliche Applikation von Paclitaxel die Aufnahme des RIKs im Tumor nicht erhöht werden
konnte (177Lu-DOTA-chCE7: 49%,
177Lu-DOTA-chCE7
+ PTX: 45%). Daraus schließen wir,
dass vor allem die Arretierung der Tumorzellen in der radiosensitiven Metaphase des
Zellzyklus eine ausschlaggebende Rolle spielt.
Als alternative Möglichkeit wurde in einer prä-klinischen Therapiestudie untersucht, ob der
Austausch des therapeutischen Radionuklides
177Lu
eine Verbesserung der RIT Effizienz erzielt.
gegen das radioaktive Lanthanid
161Tb
161Tb
weist dabei ähnliche physikalische
Eigenschaften in Bezug auf Halbwertszeit und beta-minus Strahlung auf. Jedoch emittiert
161Tb
zusätzlich Auger-Elektronen mit niedrigen Energien von 3-50 keV. Beide RIKs
verhielten sich gleich und zeigten hohe Akkumulierungen im Tumor von 31% (161Tb-DOTAchCE7) und 33% (177Lu-DOTA-chCE7). Die maximal tolerierbare Aktivität war jedoch mit 10
MBq etwas niedriger für den 161Tb markierten Antikörper verglichen zu dem 177Lu markierten
RIK (12 MBq). Die Therapiestudie resultierte in einer 82 prozentig höheren Tumorwachstums
Inhibierung in Mäusen mit
161Tb-DOTA-chCE7
Therapie im Vergleich zur
177Lu-DOTA-chCE7
Applikation. Die etwas höhere Energie der beta-minus Strahlung und die 16-fach höhere
Emittierung von Konversions- und Auger Elektronen des
161Tb
werden dabei als Gründe für
die höhere Radiotoxizität angesehen. Zusammenfassend ist das radioaktive Lanthanid
161Tb
eine vielversprechende Alternative für die RIT mit internalisierenden Antikörpern.
In einem anschliessenden Folgeprojekt evaluierten wir die Anwendung von
161Tb-DOTA-
chCE7 in Kombination mit PTX, sowie Carboplatin (CBT), einem DNA interkalierenden
Chemotherapeutikum. Alle Therapiegruppen, welche RIT alleine oder in Kombination mit
PTX oder CBT erhielten, zeigten verbesserte Gesamtüberlebensraten im Vergleich zu nicht –
oder nur mit Chemotherapie behandelten Gruppen. Therapiegruppen, die mit einer
Kombination aus RIT und PTX behandelt wurden, erreichten eine verlängerte mediane
Überlebenszeit von 69 Tagen verglichen zu 57 Tagen (161Tb-DOTA-chCE7) und 26 Tagen
(PTX). Kein Unterschied für die Gesamtüberlebensrate konnte zwischen Gruppen mit CBT
beinhaltender Kombinationstherapie verglichen zur RIT allein beobachtet werden. Wir gehen
davon aus, dass bereits durch die
161Tb-RIT
hinreichend letale DNA Schäden induziert
werden, so dass die zusätzliche Applikation von CBT keine weiteren positiven Effekte auslöst.
Vergleichende Therapiestudien mit
161Tb/ 177Lu
markierten Antikörpern in Kombination mit
PTX/CBT sowie weiterführende Versuche zu induzierten DNA Doppelstrangbrüchen,
Bystander-Effekten und Apoptose könnten weitere Aufschlüsse über die Wirksamkeit der von
161Tb
emittierten Auger-Elektronen geben.
Neben der Anwendung von Antikörpern werden auch PKIs für die Behandlung von OK
klinisch getestet. Für unsere Studien haben wir fünf klinisch relevante Kinaseinhibitoren auf
Grund ihres Einflusses auf den Zellzyklus sowie die DNA-Reparatur ausgewählt (MK1775,
Alisertib, MK2206, Temsorolimus und Saracatinib, klinische Phasen I-II). Toxizitätsstudien
ergaben, dass die beiden PKIs Alisertib und MK1775 die höchste Effektivität gegenüber den
beiden Zelllinien IGROV1 und SKOV3ip aufweisen. Kombinationsversuche zusammen mit
177Lu-DOTA-chCE7
demonstrierten stärker ausgeprägte radiosensitivierende Eigenschaften
von MK1775 verglichen zu Alisertib. Im Folgenden wurde daher MK1775 für weitere
Untersuchungen
verwendet.
Der
Kombinationsansätze mit MK1775 und
Einfluss
der
Applikations
177Lu-DOTA-chCE7
Reihenfolge
für
wurde für die Behandlung von
IGROV1 und den vergleichsweise radioresistenteren SKOV3ip Zellen getestet. Ergebnisse
zeigten
synergistische
Effekte
für
die
Kombination
gegenüber
IGROV1
Zellen.
Radioresistentere SKOV3ip Zellen konnten jedoch nicht strahlensensitiviert werden. Western
Blot Analysen ergaben, dass in IGROV1 Zellen signifikant mehr DNA Doppelstrangbrüche
(DSBs) durch die Kombination erzielt werden konnten als durch MK1775 oder
177Lu-DOTA-
chCE7 allein. Im Gegensatz zu IGROV1 konnte in SKOV3ip Zellen eine gleichbleibende Menge
an induzierten DNA DSBs, verursacht durch die Kombination oder MK1775, beobachtet
werden.
Des Weiteren wurde mittels Durchflusszytometrie ermittelt, ob induzierte DNA DSBs zu
vermehrter Apoptose führen. IGROV1 Zellen zeigten eine signifikant erhöhte Anzahl an frühapoptotischen Zellen nach Zugabe der Kombination (177Lu-DOTA-chCE7: 8%, MK1775: 28%,
177Lu-DOTA-chCE7
+ MK1775: 40%), während in SKOV3ip Zellen keine Erhöhung gegenüber
MK1775 festgestellt werden konnte (177Lu-DOTA-chCE7: 6%, MK1775: 11%,
177Lu-DOTA-
chCE7 + MK1775: 11%).
Immunhistochemische Analysen von DNA DSBs in SKOV3ip Tumoren konnten die in vitro
Ergebnisse bestätigen. Kombinations- als auch MK1775 behandelte Tumore zeigten gleiche
Mengen an DNA DSBs (Kombination: 42%; MK1775: 41%). Im Vergleich dazu wurden nach
der Applikation von
177Lu-DOTA-chCE7
(20%) sowie in unbehandelten Tumoren (21%)
deutlich weniger DSBs nachgewiesen.
Die Kombinationstherapie von
177Lu-DOTA-chCE7
und MK1775 ist eine vielversprechende
Strategie gegen OK. Wir nehmen an, dass Mechanismen der Radioresistenz verschiedener
Zelllinien die radiosensitivierenden Eigenschaften von PKI MK1775 beeinflussen können.
Zusammenfassend demonstrieren die Resultate dieser Dissertation prä-klinische Strategien
zur Verbesserung der Effizienz der RIT im Ovarialkarzinom-Modell. Klinisch betrachtet,
könnten Patienten von einer verbesserten therapeutischen Effektivität sowie reduzierten
Nebenwirkungen profitieren.