Kardioprotektive Wirkung
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Kardioprotektive Wirkung von Antagonisten am Mineralokortikoidrezeptor nach akutem Myokardinfarkt Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Katharina Schmidt geboren am 01. August 1975 in Pisz Greifswald, 04.03.2013 Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser 1. Gutachter: Prof. Dr. Heyo K. Kroemer 2. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Wieland Tag der Promotion: 30.08.3013 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG ....................................................................................................................... 1 1.1 Der Myokardinfarkt.............................................................................................................. 1 1.2 Ischämie/Reperfusionsschaden ............................................................................................ 1 1.3 Die Postkonditionierung....................................................................................................... 5 1.4 Aldosteron .......................................................................................................................... 10 1.5 Der Mineralokortikoidrezeptor .......................................................................................... 13 1.6 Die Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten .................................................................... 14 1.6.1 Eplerenon .................................................................................................................... 14 1.6.2 Canrenoat .................................................................................................................... 16 1.7 Aufgabenstellung ............................................................................................................... 17 2 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................... 18 2.1 Material .............................................................................................................................. 18 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien...................................................................................... 18 2.1.2 Substanzen und Inhibitoren......................................................................................... 20 2.1.3 Antikörper ................................................................................................................... 20 2.1.4 Puffer und Lösungen ................................................................................................... 20 2.1.5 Versuchstiere............................................................................................................... 22 2.1.6 Verbrauchsmaterialien ................................................................................................ 22 2.1.7 Geräte .......................................................................................................................... 23 2.1.8 EDV, Software ............................................................................................................ 24 2.2 Methoden............................................................................................................................ 25 2.2.1 Tierhaltung .................................................................................................................. 25 2.2.2 Genotypisierung der Versuchstiere ............................................................................. 25 2.2.2.1 Gewinnung genomischer DNA aus Schwanzspitzen-Biopsien........................ 26 2.2.2.2 PCR zur Genotypisierung................................................................................. 26 2.2.2.3 DNA- Konzentrationsbestimmung................................................................... 28 2.2.2.4 Agarosegelelektrophorese ................................................................................ 28 2.2.3 In situ Mausmodell...................................................................................................... 29 2.2.3.1 Infarktgrößenbestimmung der Mäuseherzen.................................................... 31 2.2.3.2 Troponinmessung ............................................................................................. 33 2.2.4 Das isolierte Rattenherz .............................................................................................. 33 2.2.4.1 Infarktgrößenbestimmung der Rattenherzen .................................................... 35 Inhaltsverzeichnis 2.2.4.2 Gewinnung transmuraler Biopsien ................................................................... 36 2.2.5 In situ Kaninchenmodell ............................................................................................. 37 2.2.5.1 Infarktgrößenbestimmung der Kaninchenherzen ............................................. 38 2.2.6 Proteinanalytische Methoden ...................................................................................... 38 2.2.6.1 Protein Isolation aus Biopsieproben................................................................. 38 2.2.6.2 Bestimmung der Proteinkonzentration (BCA-Test)......................................... 39 2.2.6.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..................................... 39 2.2.6.4 Western Blot Verfahren.................................................................................... 41 2.2.6.5 Densitometrische Auswertung der Bandintensitäten........................................ 43 2.2.7 Statistik........................................................................................................................ 43 3 ERGEBNISSE ..................................................................................................................... 44 3.1 Genotyp-Identifizierung ..................................................................................................... 45 3.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Eplerenon während der Reperfusion....... 46 3.2.1 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen ................................................. 46 3.2.2 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in CD73-/--Mäusen....................... 51 3.2.3 Western Blot Analyse isolierter Rattenherzen ............................................................ 52 3.2.3.1 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von Akt............................................ 53 3.2.3.2 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2.................................... 54 3.3 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion....... 55 3.3.1 Dosenabhängige Infarktgrößenbestimmung in in situ Mausmodell ........................... 55 3.3.2 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung bei ............. 57 verschiedenen Zeitpunkten................................................................................................... 57 3.3.3 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in CD73-/--Mäusen....................... 59 3.3.4 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in A2bAR-/--Mäusen ..................... 60 3.3.5 Infarktgrößenbestimmung in in situ Kaninchenherzen ............................................... 61 3.3.6 Bestimmung der hämodynamichen Parameter im in situ Kaninchemodell ................ 62 3.3.7 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen ................................................. 63 3.3.8 Western Blot Analyse isolierter Rattenherzen ............................................................ 65 3.3.8.1 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von Akt............................................ 65 3.3.8.2 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2.................................... 66 3.4 Wirkung von Aldosteron.................................................................................................... 67 3.4.1 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen mit Eplerenon ......................... 67 3.4.2 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von Akt....................................................... 68 3.4.3 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2............................................... 70 Inhaltsverzeichnis 3.4.4 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von Akt....................................................... 72 3.4.5 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2............................................... 73 4 DISKUSSION ...................................................................................................................... 76 4.1 Methodenetablierung.......................................................................................................... 77 4.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Eplerenon während der Reperfusion....... 79 4.3 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion....... 83 4.4 Wirkung von Aldosteron.................................................................................................... 87 4.5 Postkonditionierung in der Klinik ...................................................................................... 89 5 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................... 92 6 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 94 7 ANHANG ........................................................................................................................... 109 7.1 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Eplerenon während der Reperfusion..... 109 7.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion..... 110 7.3 Wirkung von Aldosteron.................................................................................................. 113 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis % Prozent % (v/v) Volumenprozent % (w/v) volumenbezogenes Massenprozent °C Grad Celsius ACTH adrenokortikotropes Hormon A. dest destilliertes Wasser Abb. Abbildung A1/A2a/A2b/A3 AR A1/A2a/A2b/A3 Adenosinrezeptor AIP Aldosteron induzierte Proteine Akt Proteinkinase B AMISTAD Acute Myocardial Infarction STudy of ADenosine AMP Adenosinmonophosphat ANP atrialen natriuretischen Peptid ATP Adenosintriphosphat BAY60-6583 2-[6-amino-3,5-dicyano-4-(4-hydroxyphenyl)pyridin-2-ylsulfanyl] acetamide, Adenosin A2b Rezeptor Agonist CD73 5’-Ektonukleotidase CHEL Chelerythrine, PKC-Inhibitor DAG Diacylglycerol DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonulcleic acid) dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat (deoxynucleoside triphosphat) DPCPX 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine, A1AR-Antagonist DTT Dithiothreitol ENaC epitheliales Natriumkanal eNOS endothelial nitric oxide synthase EPHESUS Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study ERK extracellular-signal regulated kinase et al. et alteri (und andere) GC Guanylatzyklase (guanylyl cyclase) GPCR G-Protein gekoppelte Rezeptoren (G-protein coupled receptor) h Stunden HMLS humane, mononukleare Leukozyten (human mononuclear leukocytes) Abkürzungsverzeichnis iNOS inducible nitric oxide synthase IP3 Inositol 1,4,5-triphosphat IPC ischämische Präkonditionierung (ischemic preconditioning) IPost ischämische Postkonditionierung (ischemic postconditioning) KATP-Kanäle ATP-abhängigen Kaliumionenkanäle kDa Kilodalton LAD linke Koronararterie (left anterior descending artery) MAPK mitogen activated protein kinase MEK mitogen activated ERK activating kinase min Minute mPTP mitochondrial permeability transition pore MR Mineralokortikoidrezeptor MRI magnet resonance imaging mRNA messenger ribonucleic acid MRS1754 8-[4-[((4-Cyanophenyl)carbamoylmethyl)oxy]phenyl]-1,3-di(n-propyl) xanthine hydrate, Adenosin A2b Rezeptor Antagonist NECA 5´-(N-ethylcarboxamido)adenosine, Adenosin A1/A2 Rezeptor Agonist NO Stickstoffmonoxid (nitric oxide) NYHA New York Heart Association PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS Phosphate buffered saline pH negativer dekadischer Logarithmus der H+-Ionenkonzentration PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PIP3 Phosphatidylinositol-3-Phosphat PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PKC Proteinkinase C PKG Proteinkinase G PS Phosphatidylserin PTCA percutaneous transluminal coronary angioplasty RAAS Renin Angiotensin Aldosteron System RALES Randomized Aldactone Evaluation Study RISK reperfusion injury salvage kinase rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) ROS reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) Abkürzungsverzeichnis RNS reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species) RT Raumtemperatur SARA selektive Aldosteronrezeptor-Antagonisten SD Standardabweichung (standard deviation) SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) SPECT Einzelphotonen-Emissions-Tomografie (Single Photon Emission Computed Tomography) SPT 8-(p-Sulfophenyl)theophylline hydrate, Adenosinrezeptor-Antagonist SR Sarkoplasmatisches Retikulum Tab. Tabelle TBS Tris buffered saline TMRE Tetramethylrhodaminethylester TRIS Tris(Hydroxymethyl)-aminoethan Triton X-100 Ethylenglycolether U0126 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene, Mek 1/2-Inhibitor UV ultraviolet VSMC vaskuläre glatte Muskelzellen (vascular smooth muscle cell) WORT Wortmannin, PI3-Kinase-Inhibitor ΔΨm mitochondriales Membranpotential 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Der Myokardinfarkt Die koronare Herzerkrankung ist nach wie vor die häufigste Todesursachen im Erwachsenenalter in den Industrieländern. Allein in Deutschland sind im Jahr 2011 52113 Menschen an einem akuten Myokardinfarkt gestorben [1]. Ein Herzinfarkt wird durch artherosklerotische und entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße oder Embolien hervorgerufen. Dies führt zu einer hochgradigen Stenose oder zu einem kompletten thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung (Ischämie) [2]. Daher ist das höchste Therapieziel das möglichst schnelle Öffnen des verschlossenen Koronargefäßes zur Wiederherstellung der Sauerstoff- und Nährstoffversorgung (Reperfusion). Für die Wiederherstellung des koronaren Blutflusses werden zurzeit in der Klinik verschiedene etablierte Reperfusionstherapien eingesetzt. Die Wiedereröffnung des Gefäßes kann mechanisch mit PTCA (percutaneous transluminal coronary angioplasty) oder durch medikamentöse Behandlung, die sogenannte Lysetherapie, erreicht werden. Bei der ersten Methode wird ein Ballonkatheter über den arteriellen Zugang, meistens von der Arteria femoralis aus, unter Röntegenkontrolle bis in die Verengung der Koronararterie eingeführt. Dort kann der Ballon aufgedehnt und die Blutversorgung wiederhergestellt werden. In den meisten Fällen muss eine zusätzliche Implantation einer Gefäßstütze (Stent) erfolgen, um eine wiederkehrende Verengung des Koronargefäßes zu verhindern. Bei der Lysetherapie wird der intrakoronare Thrombus durch intravenöse Injektion eines Fibrinolytikums wie Streptokinase und Urokinase aufgelöst. Die Lysetherapie ist besonders in der frühen Phase des Myokardinfarktes sehr wirksam, erhält die linksventrikuläre Funktion und verbessert die Überlebensrate. 1.2 Ischämie/Reperfusionsschaden Die Reperfusion ist ein Mechanismus, um das Herz vor der Ischämie zu schützen [3]. Die myokardiale Reperfusion kann neben dem erwünschten Myokardschutz auch zu einer möglichen Schädigung der Myozyten führen. Dieses Phänomen wird als Ischämie/Reperfusionsschaden bezeichnet und wurde bereits von Jennings in den 80er Jahren 2 Einleitung beschrieben [4]. Hier konnte gezeigt werden, dass die frühe Reperfusion ischämisches Myokard vor einem Untergang schützen kann. Jedoch traten in ischämischen Hundeherzen deutliche endotheliale und mikrovaskuläre Dysfunktionen, metabolische Veränderungen und Nekrose auf. Außerdem wurde berichtet, dass nicht nur die infarktinduzierende Ischämie sondern auch die darauffolgende Reperfusion noch lebende Kardiomyozyten zerstören kann [5]. Der Reperfusionsschaden am Herzen wird heute in vier verschiedene klinische Erscheinungsbilder eingeteilt, welche gemeinsam oder getrennt voneinander auftreten können. Das erste ist das „no-reflow“-Phänomen, welches eine fehlende oder inkomplette Wiederherstellung des Blutflusses nach Wiedereröffnung eines Koronargefäßes beschreibt. Das zweite ist die mechanische, reversible Dysfunktion, die auch als myokardiales „stunning“ bezeichnet wird [6, 7]. Hier kommt es während der Reperfusion bereits nach wenigen Tagen zu einer vollständigen Erholung des Myokards. Als weitere Reperfusionsschäden nach einem Myokardinfarkt werden ventrikuläre Arrhythmien und tödliche Reperfusionsschäden, „lethal reperfusion injury“, beobachtet. Bei den Letzten handelt es sich um eine irreversible Nekrose von Myozyten, die zum Beginn der Reperfusion noch am Leben erhalten werden konnten. Der Ischämie/Reperfusionsschaden entsteht in zwei aufeinander folgenden Schritten. Nämlich zuerst in der Ischämie, wo die Schäden der Kardiomyozyten durch den Nährstoff- und Sauerstoffmangel hervorgerufen werden und in der Reperfusion durch Wiedereröffnung der Koronararterie. Der Schaden wird ausgelöst durch erhöhte Ionen-Konzentrationen und darauffolgende schnelle Änderung des pH-Wert, die Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies und letztendlich die Apoptose. Die Folgen der Ischämie und Reperfusion führen zu einer irreversiblen Myokardschädigung. Während der Ischämie werden die Kardiomyozyten mit molekularem Sauerstoff und metabolischen Substraten unterversorgt (siehe Abb. 1.1). Demzufolge wird die ATP-Produktion reduziert, die Ca2+-Aufnahme in das Sarkoplasmatische Retikulum (SR) blockiert und demzufolge intrazellulär akkumuliert. Die Zellen werden von dem aeroben auf anaeroben Stoffwechsel umgestellt und somit intrazellulär anorganisches Phosphat, Laktat und Wasserstoffionen (H+) einlagern. Die darauffolgende Absenkung des pH-Wertes führt zusätzlich zu einer Aktivierung der Na+/H+Kanäle, die durch Azidose zu einer Akkumulation von intrazellulären Na+ führen und somit die ATP-Produktion zusätzlich hemmen. Anschließend führe die erhöhte intrazelluläre IonenKonzentration zur osmotischen Schwellung der Kardiomyozyten und Aktivierung Ca2+abhängiger Proteasen und Phospholipasen. Dieser Prozess ist zeitabhängig und führt zu einer irreversiblen Schädigung der Kardiomyozyten und zu unmittelbarer Ischämie [8]. 3 Einleitung Abb. 1.1: Während der Ischämie werden die Kardiomyozyten mit molekularem Sauerstoff unterversorgt. Dadurch kommt es zur Überladung mit Ca2+ und Na+, osmotischer Zellschwellungen und schließlich zur Nekrose (nach Ferdinandy et al. [8]). Während einer plötzlichen Wiederversorgung des Myokards in der Phase der Reperfusion treten weitere nekrotische Schäden auf, die durch das sauerstoffreiche Blut ausgelöst werden. Durch die schnelle Versorgung mit molekularem Sauerstoff werden erneut die Mitochondrien erregt und die Sauerstoffspezies Elektronentransportkette (ROS, reactive oxygen reaktiviert. species), Zusätzlich bzw. in entstehen reaktive Anwesenheit von Stickstoffmonoxid (NO) werden reaktive Stickstoffspezies (RNS, reactive nitrogen species) gebildet [8]. ROS und RNS verursachen zusätzlich oxidative und nitroaktive Schäden der Zellstrukturen und führen zur Ca2+-Freisetzung aus dem SR. Somit werden die intrazellulären Ca2+-Konzentrationen weiter erhöht. Anschließend werden durch die erneute ATP-Produktion die Na+/Ca2+-Kationenpumpen aktiviert, um die Ionen-Konzentration zu normalisieren, die dann Na+ gegen Ca2+ austauschen und letztendlich das Ca2+ aus dem SR in das Cytosol freisetzen (Abb. 1.2). 4 Einleitung Abb. 1.2: In der Reperfusion die wiederhergestellte Versorgung mit Sauerstoff aktiviert die ATP-Produktion und die Elektronentransportkette, stimuliert ROS/RNS und die Nekrose der Kardiomyozyten durch Öffnen der mPTP (nach Ferdinandy et al. [8]). In den letzten Jahren stellte sich heraus, dass während der Ischämie/Reperfusion eine mPTP (mitochondrial permeability transition pore) gebildet wird. Sie hat eine wichtige Funktion bei der mitochondrialen Reaktion auf Stress und wird innerhalb der inneren und äußeren mitochondrialen Membran gebildet [9, 10]. Die genaue Struktur der Pore ist noch unbekannt. Sie ist ein nichtselektiver, spannungsabhängiger Kanal und ist für die meisten Substanzen undurchlässig. Unter normalen physiologischen Bedingungen bleibt die mPTP geschlossen. Unter Stressbedingungen, wie Ischämie/Reperfusion, wird die Pore in der inneren Membran des Mitochondriums jedoch eröffnet. Dies ermöglicht ein freies Passieren von Wasser und Molekülen bis 1,5 kDa in das Mitochondrium. Die Folgen sind die Schwellung der Mitochondrien, die Entkopplung oxidativer Phosphorylierung, der Blockade der ATPProduktion und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials (∆Ψm) [11, 12]. Dies führt zum apoptischen Zelltod und zur Freisetzung großer Mengen von Cytochrom C. Die Zusammenwirkung der Effekte wie die Ca2+-Akkumulation in der mitochondrialen Matrix, ROS und RNS führen zu Bildung und Öffnung der mPTP. Dabei spielt auch der pH-Wert eine wichtige Rolle. Die komplette mPTP-Öffnung konnte bereits bei einem Wert von 6.2 beobachtet werden [13]. Während der Ischämie nimmt der pH-Wert im Cytosol ab und in der Reperfusion kehrt er zu seinem physiologischen Wert zurück. Es wird vermutet, dass die großen Schwankungen des pH-Wertes zum Öffnen der mPTP führen und letztendlich Einleitung 5 zum nekrotischen Zelltod der Zellen, die bereits während der Ischämie beschädigt wurden. Einige Zellen erleiden apoptischen Zelltod. Dies betrifft die Zellen, die in der Ischämie noch intakt waren und erst in der Reperfusion geschädigt wurden. Wie der Mechanismus der Aktivierung des apoptischen Programms funktioniert, ist noch unklar. Es wird vermutet, dass hier mitochondriale und extrazelluläre Signale des Zelltodes eine wichtige Rolle spielen. Das Ausmaß des Zellschadens während der Reperfusion ist vom der Schweregrad der Ischämie und dem Einfluss der Ca2+-Überladung im SR abhängig, welcher dann in der Reperfusion durch osmotische Schwellung und die Aktivierung von Proteasen, Lipasen und Nukleasen weiter verschlimmert werden kann [8]. Neuere Untersuchungen zeigen [14, 15], dass die frühe Phase der Reperfusion und nicht die Ischämie zur Bildung der mPTP führt und dass eine Hemmung der Porenöffnung in der Reperfusion vor dem Zelltod schützt [16]. Die Schwere und die Zeitdauer des Koronarverschlusses und die daraus resultierende Ischämie führten zum Absterben des Myokardgewebes [17]. Daher ist das Ziel der Therapie die schnellstmöglichste Wiederherstellung der Blutversorgung im Infarktgefäß, um eine Reperfusion des ischämischen Myokardgewebes, eine Reduktion der Infarktgröße und damit der Sterblichkeit zu erreichen. 1.3 Die Postkonditionierung Bei einem Myokardinfarkt ist die Dauer der Ischämie einer der wichtigsten Faktoren, die Einfluss auf den Grad des Myokardschadens haben. Um die Infarktgröße möglichst klein zu halten, ist es wichtig, eine schnelle Reperfusion einzuleiten. Trotz der effektiven Reperfusionstherapien, die zur Zeit in der Klinik zur verfügung stehen, wie PTCA oder Lysetherapie besteht ein großes Interesse an der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden, die in dazu beitragen können, den Reperfusionsschaden noch weiter zu verringern und die Herzfunktion nach einem Infarkt zu verbessern. Eine solche Behandlungsmethode ist die ischämische Präkonditionierung (IPC). Hierbei wird das Myokard bereits vor Beginn der lang andauernden Ischämie mehreren kurzen Zyklen von Ischämie und Reperfusion unterzogen (Abb. 1.3). Diese Methode wurde zuerst 1986 durch Murry [18] an isolierten Hundeherzen durchgeführt und sie hat sich als eine wirksame Intervention zum Myokardschutz erwiesen. Dabei konnte durch vier Zyklen von je fünf Minuten Ischämie und fünf Minuten Reperfusion und folgender 40-minütiger Ischämiephase die Infarktgröße im Vergleich mit Kontrolltieren um 75 % reduziert werden. Diese protektiv 6 Einleitung wirkende Methode ist jedoch klinisch für die Patienten mit akutem Myokardinfarkt weniger relevant, da die IPC vor einer Ischämie erfolgen muss, die Patienten aber erst in der Phase der fortgeschrittenen Ischämie in die Klinik gebracht werden. Ischämie Reperfusion kurze Intervalle Ischämie/Reperfusion Abb. 1.3: Ischämische Präkonditionierung. Kurze Intervalle vor der folgenden Ischämie und Reperfusion führen zu einer signifikanten Infarktgrößenreduktion (nach Murry et al. [18]). Es wurden bereits mehrere Studien durchgeführt, um die Mechanismen dieser Methode aufzuklären [19, 20]. Allerdings hat sich die klinische Anwendung dieser Methode als ziemlich schwierig herausgestellt. Aus klinischer Sicht ist es dennoch von Bedeutung, das ischämische Myokard in der frühen Phase der Reperfusion zu schützen. Erste tierexperimentelle Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Interventionen auch direkt nach dem Infarkt, in der sog. frühen Reperfusionsphase, kardioprotektiv wirken können. So konnte im Jahr 2003 eine Arbeitsgruppe zeigen [21], dass drei Zyklen von je 30 Sekunden Ischämie und 30 Sekunden Reperfusion direkt am Ende einer 60-minütigen Ischämie zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße in Hundeherzen führen (Abb. 1.4). Ischämie Reperfusion kurze Intervalle Ischämie/Reperfusion Abb. 1.4: Ischämische Postkonditionierung. Kurze Intervalle direkt nach der Ischämie führen zu einer signifikanten Infarktgrößenreduktion (nach Zhao et al. [21]). Fujita und Kollegen verwendeten ein anderes Versuchsprotokoll, in dem nach 90 min regionaler Ischämie vier Zyklen von je 60 Sekunden Ischämie und 60 Sekunden Reperfusion durchgeführt wurden [22]. Auch hier konnte eine Abnahme der Infarktgröße in Hundeherzen gezeigt werden. Diese Befunde konnten durch andere Arbeitsgruppen bestätigt werden [23, 24]. Dieser Effekt ist mit der IPC vergleichbar und wurde dementsprechend als ischämische Postkonditionierung (IPost) bezeichnet. Außerdem konnte durch weitere Studien in verschiedenen Modellen, in vivo [25, 26], ex vitro [27] und in vitro [28, 29], die Wirksamkeit der IPost mehrfach bestätigt werden. 7 Einleitung An der Postkonditionierung besteht ein großes klinisches Interesse, da diese Methode potentiell nach einem Infarkt angewendet werden kann und in Kombination mit den anderen Reperfusionstherapien einsetzbar erscheint. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, den genauen Signaltransduktionsweg der Protektion zu erforschen. Während bei der IPC bereits viele Effekte der Signaltransduktion bekannt sind und die schützenden Mechanismen der Postkonditionierung nur unzureichend aufgeklärt. Es ist bereits bekannt, dass die ischämische Postkonditionierung das Myokard von den schädlichen Auswirkungen der Reperfusion durch die Begrenzung von oxidativem Stress, Reduktion der Ca2+-Überladung, Aufrechterhaltung der Endothelfunktion und die Verringerung der Entzündung schützt [21]. Die Postkonditionierung kann nicht nur ischämisch durch kurze Zyklen der Ischämie/Reperfusion sondern auch pharmakologisch durch Freisetzung endogener Mediatoren wie Adenosin [30], Bradykinin [31], oder Opioide [32] erfolgen. Diese Substanzen aktivieren membranständige G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR, G-protein coupled receptor) und sind damit fähig, schützende Signaltransduktionswege der Postkonditionierung auszulösen [33]. Downey und seine Forschungsgruppe hat zuerst bewiesen, dass die Aktivierung von Adenosinrezeptoren während der frühen Reperfusionsphase zur Reduktion der Infarktgröße beiträgt [29]. Die Adenosinrezeptoren werden in vier Subtypen unterteilt: A1, A2a, A2b und A3 [34] und sind an die G-Protein gekoppelte Rezeptoren gebunden. A1 und A3 Rezeptoren sind an inhibitorische G Proteine der Gi/o Familie gekoppelt und die Rezeptoren A2a und A2b generell stimulatorische Gs Proteine aktivieren. A1/A2-Adenosinrezeptoragonisten wie AMP579 [35] oder NECA [36, 37] zeigen eine schützende Wirkung. Letztlich wurde postuliert, dass nur die Aktivierung bestimmter Rezeptorsubtypen zum erfolgreichen Schutz führt. In diesem Zusammenhang konnte die Verwendung selektiver pharmakologischer Inhibitoren diese Frage klären. So hat sich herausgestellt, dass der Rezeptorsubtyp A2a und A3 aber nicht der A1 protektiv in einem in vivo Rattenherzen wirkt, während der Rezeptorsubtyp A2b aber nicht A1 oder A2a in perfundierten Kaninchenherzen seine Wirkung zeigte [38, 39]. Die Proteinkinase C (PKC) erhöht die Affinität des A2b Rezeptorsubtyps, die dann durch endogen freigesetztes Adenosin in der Phase der frühen Reperfusion aktiviert wird [40, 41]. Dies wiederum aktiviert Phosphorylierung bekannter Kinasen wie PI3-K/Akt und ERK 1/2 (extracellular-signal regulated kinases) und führt zum erfolgreichen Myokardschutz. Bradykinin führt ebenfalls zu kardioprotektivem Schutz während der Postkonditionierung. Penna et al. konnten zeigen, dass mit unterschiedlichen pharmakologischen Antagonisten des 8 Einleitung Bradykinin B2 Rezeptors die Protektion reduziert werden konnte. Bei der Aktivierung des Bradykinin-Rezeptors ist Proteinkinase G (PKG) und das Öffnen der mitochondrialen KATPKanäle beteiligt, die dann ROS (reactive oxygen species) aktivieren [42]. Vor kurzem wurde bewiesen, dass auch die Aktivierung des endogenen Opioidrezeptors zur Postkonditionierung beiträgt. Nachdem die schützende Wirkung mit Naloxon, einem nichtselektiven Opioidrezeptor-Antagonisten, vermindert werden konnte, wurde die Auswirkung der Postkonditionierung in Gegenwart von pharmakologischen Antagonisten der δ-, κ-, μ-Opioid-Rezeptoren untersucht [43]. Dabei hat sich herausgestellt, dass die endogene Stimulation von den μ- und δ-Opioid-Rezeptoren zur Aufhebung der Postkonditionierung führen kann. Außerdem sind bei dem schützenden Signaltransduktionsweg des δ-OpioidRezeptors Stickstoffmonoxid (NO), Guanylatzyklase (GC), Proteinkinase G (PKG) beteiligt, die das Öffnen der mPTP verhindern [44]. Das mPTP spielt beim Herzschutz eine entschiedene Rolle während der Postkonditionierung. Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass das Öffnen der mPTP in der frühen Reperfusionsphase mit Hilfe pharmakologischer Inhibitoren unterbunden werden kann. Die genaue Funktion der mPTP wurde bereits im Abschnitt 1.2 beschrieben. Die Signalwege, die durch Bindung von Adenosin, Bradykinin und Opioiden an ihre GPCR gebundene Rezeptoren aktiviert werden, verlaufen unterschiedlich. Jedoch endet bei allen drei Liganden der Signalweg in der Aktivierung der Protein Kinase C (PKC) [45]. PKC gehört zu Familie der Serin-Threonin-Kinasen. Die Regulation der PKC erfolgt über eine Translokation sowie eine Phosphorylierung, welche zu ihrer Aktivierung führt [46]. Die Aktivierung der PKC ist Ca2+-abhängig und wird durch Bindung von Phosphatidylserin (PS) und Diacylglycerin (DAG) bewirkt [47]. Veränderungen in der Aktivität der PKC im Myokard spielen sowohl bei der Ischämie-Reperfusion als auch bei der Herzinsuffizienz und folgender Entwicklung von Kardiomyopathien eine wichtige Rolle [48, 49]. Die ersten Untersuchungen zeigten, dass PKC auch bei der Signalweiterleitung der Postkonditionierung eine zentrale Rolle spielt. Zatta et al. demonstrierten, dass die Kardioprotektion während der Postkonditionierung mit einem nichtselektiven PKC-Inhibitor, Chelerythrine, in einem in vivo Rattenmodell aufgehoben werden konnte [50]. Die schützende Rolle der PKC wurde ebenfalls in isolierten perfundierten Rattenherzen [51] und im in vivo Kaninchenherzen [39] nachgewiesen. Die Postkonditionierung aktiviert in den frühen Minuten der Reperfusion spezifische Kinasen des RISK-Signalwegs (reperfusion injury salvage kinase), die ebenfalls in der 9 Einleitung Präkonditionierung eine wichtige Rolle spielen. Hierfür sind zwei interagierende Signalwege verantwortlich, die zuerst von Hausenloy et al. beschrieben wurden [52]. Der eine verläuft über die Aktivierung von PI3K-Akt und eNOS und inhibiert die Öffnung der mPTP und der andere Weg über die Aktivierung des MEK1/2- ERK 1/2 Signalweges. Bei dem PI3K-Akt-Signalweg spielen die PI3-Kinasen (Phosphoinositid-3-Kinasen) eine wichtige regulatorische Rolle und sind für die Synthese des second messengers PIP3 (Phosphatidylinositol-3-Phosphat) aus membranständigen Inositolphospholipiden verantwortlich. Die zytosolische Akt-Kinase (auch Proteinkinase B genannt, kurz PKB) bindet an das PIP3 und wird an die Zellmembran transportiert. Dort wird sie an ihren Aminosäuren Serin (473) und Threonin (308) phosphoryliert und dadurch vollständig aktiviert [53, 54]. Im Jahr 2000 konnte erstmalig bewiesen werden, dass die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges bei dem Myokardschutz während der Präkonditionierung beteiligt ist [55]. Hierbei konnte die induzierte Phosphorylierung der Akt, die Translokation der Proteinkinase ε (PKCε), die induzierte NO Produktion und dieser kardioprotektive Effekt durch einen pharmakologischen Inhibitor der PI3-Kinase (Wortmannin) aufgehoben werden. Tsang et al. demonstrierten in perfundierten Rattenherzen, dass auch während der Postkonditionierung dieser Signalweg beteiligt ist [55]. Diese Ergebnisse konnten mit weiteren Studien im in vivo Kaninchenmodell [39], in vivo Rattenherzen [56] aber auch in isoliert perfundierten Rattenherzen [29, 27] und in situ Kaninchenherzen [57] bestätigt werden. Bei dem MEK1/2-ERK 1/2 Signalweg gehört die ERK 1/2-Kinase (extracellular-signal regulated kinasen), auch p42/p44 genannt, zu den MAP-Kinasen (mitogen activated protein kinase). Die Aktivierung der beiden Isoformen ERK 1 und ERK 2 erfolgt durch die phosphorylierte Form der MAPKK (MAP-Kinase-Kinasen, mitogen activated protein kinase kinase). Die intrazelluläre Signaltransduktion über ERK-Kinasen wird durch unterschiedliche Stimuli wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Hormone oder zellulären Stress aktiviert [58] und ist bei der Regulation zellulärer Prozesse, wie z.B. der Proliferation, der Differenzierung und des Überleben der Zellen, beteiligt. Die aktivierte ERK 1/2 Signalkaskade ist in der Lage während der Ischämie/Reperfusion zellulären Schutz zu vermitteln [59, 60]. Auch während der Postkonditionierung kommt es zu einer Aktivierung der MEK 1/2-ERK 1/2-Kinasen. Dieser Effekt konnte bisher in vivo in Kaninchen [28], in isoliert perfundierten Kaninchenherzen [61], in hypertensiven isolierten Rattenherzen [62] und in isolierten Mäuseherzen [63] gezeigt werden. Der Schutzmechanismus der ERK 1/2 ist noch unbekannt und wird ihrer Fähigkeit zur Phosphorylierung und gleichzeitiger Inaktivierung verschiedener 10 Einleitung apoptischer Proteine zugeschrieben. Auch die Wechselwirkung der oben genannten Kinasen konnte bislang nicht geklärt werden. 1.4 Aldosteron Aldosteron spielt eine wichtige Rolle bei chronischer Herzinsuffizienz [64]. Beim Myokardinfarkt ist seine Produktion im Herzen sowie der Aldosteronspiegel im Blutplasma erhöht [65]. Aldosteron ist ein physiologisch wichtiges Steroidhormon. Es wird in der Zona glomerulosa der Nebennierenrinde produziert [66]. Freigesetzt wird es in der Nebennierenrinde und reguliert durch das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) [67, 68]. Die Bildung und Freisetzung von Aldosteron wird überwiegend durch Angiotensin II (Ang II) und Kalium aber auch durch ACTH (adrenokortikotropes Hormon) und Neurotransmitter, wie z.B. Katecholamine, stimuliert [69]. Dagegen wird die Hemmung der Aldosteron-Produktion in den Nebennieren dem Dopamin und dem atrialen natriuretischen Peptid (ANP) zugeschrieben [70]. Aldosteron ist an der Regulierung des Elektrolyt- und Wasserhaushaltes beteiligt und gehört zu den Mineralokortikoiden. Dabei steigert das Hormon die renale Rückresorption von Natrium sowie die vermehrte Produktion von Kalium und Protonen mit dem Ziel, den Blutdruck zu regulieren [68, 71]. Es ist seit längerem bekannt, dass die Überproduktion des Aldosterons zu arteriellem Blutdruck und letztendlich auch zu unerwünschten kardiovaskulären Effekten führt. Ein erhöhter AldosteronPlasmaspiegel ist ein prognostisch ungünstiger Marker bei Herzinsuffizienz und wird mit einer erhöhten Mortalitätsrisikorate assoziiert [72]. Aldosteron reguliert den Natriumtransport vor allem in den renalen Epithelzellen. In der Niere ist im distalen Tubulus des Nephrons der Mineralokortikoidrezeptor (MR) exprimiert und reguliert die Aktivität des epithelialen Natriumkanals (ENaC), der basolateralen Na+/K+-ATPase sowie viele Enzyme des Zitratzyklus. Aldosteron aktiviert den MR und erhöht dadurch den Natriumrückstrom über den ENaC in die Epithelzellen, die dann die Natriumionen über die Na+/K+-ATPase und damit auch Wasser in den Blutkreislauf weitergeben [73, 74]. Infolgedessen wird Kalium über den luminalen K+-Kanal vermehrt ausgeschieden und es kommt zu Bluthochdruck [75]. In den letzten Jahren wurden neben den epithelialen Zielgeweben auch andere die nichtepitheliale Gewebe identifiziert, die von Aldosteron reguliert werden, wie die glatten Muskelzellen der Gefäße, der Hippokampus des Gehirns und die Kardiomyozyten [76, 77, 78]. In diesen Geweben scheint die Rolle und Wirkung von Aldosteron im Vergleich zu Einleitung 11 epithelialem Gewebe sehr unterschiedlich zu sein. Die Wirkung von Aldosteron lässt sich unterteilen in eine genomische Wirkung, die erst innerhalb von Stunden messbar wird und in eine nicht-genomische Wirkung, die innerhalb von Sekunden auf zellulärer Ebene eintritt. Genomische Wirkung von Aldosteron Die genomische Wirkung von Aldosteron wird über die Bindung des Hormons an seinen spezifischen Rezeptor, den MR, vermittelt. Aldosteron wirkt über einen Liganden gesteuerten Transkriptionsfaktor, den MR und wird über die Regulation und Expression von Genen induziert, die seinem Rezeptor spezifisch sind [79]. Nach freier Diffusion der Mineralokortikoide durch die Plasmamembran gelangen sie in die Zelle und binden an den intrazellulären MR (Kd≈ 1-2 nM), was zur Konformationsänderung und gleichzeitiger Aktivierung des Rezeptors führt [80]. Der so gebildete Komplex wird zum Zellkern transloziert, dort an spezifische DNA-Abschnitte gebunden und löst dadurch die Transkription aus [76, 81]. Anschließend wird die neu synthetisierte mRNA in das Cytoplasma transportiert, um dort sogenannte Aldosteron induzierte Proteine (AIP) herzustellen. Die Expression der AIP steuert die Aktivierung und die Neusynthese des Natriumkanals (ENaC) und Na+/K+-ATPase [82]. Charakteristisch für die genomische Wirkung des Aldosterons ist die Empfindlichkeit gegenüber Transkriptions- und Translationsinhibitoren, Actinomycin D und Cyclohexamid und durch die erst nach mehreren Stunden sichtbare Wirkung [80, 83]. Nicht-genomische Wirkung von Aldosteron Neue Untersuchungen belegen eine schnelle Wirkung von Aldosteron, die innerhalb weniger Minuten (< 15 min) sichtbar ist. Dieser Effekt wird entsprechend nicht-genomisch genannt, zeigt keine Sensitivität gegenüber den bekannten Inhibitoren, die bei dem genomischen Effekt wirksam sind und ist deshalb von der Genexpression unabhängig [80, 84, 85, 74]. Eine an Patienten durchgeführte Studie zeigte, dass innerhalb von 5 min nach intravenöser Verabreichung von 1 mg Aldosterons eine Zunahme des peripheren Gefäßwiderstandes und eine Abnahme des Herzauswurfvolumens gemessen werden konnte [86]. Die nichtgenomische Wirkung von Aldosteron konnte zuerst in Hundeerythrozyten identifiziert werden. Hier wurde ein verzögerter Na+-Austausch innerhalb weniger Minuten nach Zugabe einer physiologischen Aldosteron-Konzentration beobachtet [87]. Diese Untersuchungen weisen auf einen nicht-genomischen Wirkmechanismus hin, nicht nur wegen der raschen 12 Einleitung Wirkungsweise, sondern auch wegen des fehlenden Zellkerns in den Erythrozyten, wo normalerweise die Transkription und Translation stattfindet. Der nicht-genomische Effekt von Aldosteron wird durch Membranrezeptoren vermittelt, die insensitiv für die Mineralokortikoidrezeptor-Inhibitoren, wie z.B. Spironolacton und Kaliumcanrenoat, sind. So konnte in MR knockout-Mäusen, bei denen der MR fehlt, in den Fibroblasten eine Zunahme von Ca2+ und cAMP innerhalb weniger Minuten (< 3 min) nach der Verabreichung des Aldosterons beobachtet werden [83]. Abb. 1.5: Schematische Darstellung genomischer und nicht-genomischer Wirkung des Aldosteron (nach Christ et at. [88]). Die nicht-genomische Wirkung von Aldosteron wird durch zahlreiche second messenger Systeme gesteuert [74]. Aldosteron hydrolysiert das Phosphatidylinositol und induziert somit den schnellen Anstieg der Diacylglycerol (DAG)- und Inositol 1,4,5-triphosphat (IP3)Konzentrationen aber auch die Zunahme des intrazellulären Kalziums, die Aktivierung der Proteinkinase C und die Aktivierung der Na+/K+-Pumpe [89]. Diese Effekte wurden in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs, vascular smooth muscle cells), humanen mononuklearen Leukozyten (HMLS, human mononuclear leukocytes), Kardiomyozyten und Endothelzellen der Ratte beobachtet [90, 84]. Zusätzlich diese Wirkung von Aldosteron ist bei der Signalkaskade, wie MAPK beteiligt und spielt eine wichtige Rolle bei dem Zellwachstum und Differenzierung. Einleitung 13 1.5 Der Mineralokortikoidrezeptor Der Mineralokortikoidrezeptor (MR) ist ein Steroidrezeptor und gehört zu der Superfamilie der nukleären Rezeptoren (NR) [91]. Er ist besonders in Epithelzellen der Niere, des Dickdarms, der Schweiß- und Speicheldrüsen für die Kontrolle des Na+- und K+-Transports zuständig [92]. MR spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-epithelialen Geweben, wie Myokard, Blutgefäße, Gehirn und Fettgewebe [93, 94, 95]. Die MR Aktivierung durch Aldosteron spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie des Bluthochdrucks, endothelialer Dysfunktion aber auch bei linksventrikulärer Hypertrophie und kardialer Fibrose [96, 97, 69]. Die nichtepitheliale Wirkung wurde bereits vor über zwei Jahrzehnten demonstriert [98]. Dabei konnte gezeigt werden, dass chronisch erhöhter Aldosteron-Spiegel bei Ratten das Wachstum kardialer Fibroblasten und vermehrte Kollagenbildung fördert, und somit das Remodeling des Myokards. Die negative Wirkung von Aldosteron kann mit Hilfe Mineralokortikoid-Antagonisten aufgehoben werden. Zwei große klinische Studien, die RALES-Studie für Spironolacton [99] und später die EPHESUS-Studie für Eplerenon [100] haben demonstriert, dass die MR-Blockade bei Patienten mit Herzinsuffizienz zu einer signifikanten Reduktion der Morbidität und Mortalität führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser positiven Effekte sind noch unbekannt. Der humane MR ist aus drei für die NR-Superfamilie charakteristischen Domänen aufgebaut: einer variablen N-terminalen Domäne (NTD), einer cysteinhaltigen DNA-bindenden Domäne (DBD) und einer C-terminalen ligandenbindenden Domäne (LBD) [101, 102]. Zusätzlich befindet sich zwischen der DBD und LBD eine vierte Domäne, die sogenannte H-Domäne, die als Scharnier-Region dient [101]. Innerhalb der Superfamilie nukleärer Rezeptoren ist die DBD hoch konserviert und enthält zwei Zinkfingerstrukturen, die bei der Bindung an die DNA und bei der Rezeptor-Dimerisierung involviert sind. Die C-terminal gebundene LBD ist für zahlreiche Funktionen, wie Ligandenbindung, Interaktion mit Hitzeschockproteinen und transkriptionellen Koaktivatoren, Dimerisierung, sowie Hormon abhängige Aktivierung, verantwortlich [103]. Die N-terminale hingegen scheint für die Rezeptorspezifität verantwortlich zu sein [104, 105]. Im inaktiven Zustand ist der MR mit einem Komplex von Chaperon-Protein Hsp90 und Immunophilin 56 assoziiert [106]. Die Bindung des Steroidhormons an diesen Rezeptor 14 Einleitung induziert die Dissoziation von zytoplasmatischem Chaperon-Protein, Homodimerization und Translokation in den Zellkern, wo die Transkription der Zielgene fortgesetzt werden kann [107, 108]. In Abwesenheit des Hormons ist der MR im Cytoplasma und im Nukleus lokalisiert, während in Anwesenheit des Aldosterons das aktivierte MR im Zellkern akkumuliert wird [109]. Daher ist die Regulation der Transkription auch von der Interaktion mit dem Initiationskomplex der Transkription und verschiedener intrazellulärer Signalwege anhängig [76]. 1.6 Die Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten 1.6.1 Eplerenon Eplerenon (Inspra®) ist ein selektiverer MR-Antagonist für die Behandlung der linksventrikulären Dysfunktion und chronischen Herzinsuffizienz. Eplerenon gehört zu einer neuen Substanzklasse, der selektiven Aldosteronrezeptor-Antagonisten (SARA) und bindet an den Mineralokortikoidrezeptor, wodurch folglich eine verringerte Natriumrückresorption und Kaliumausscheidung resultiert und damit die vermehrte Ausscheidung von Wasser reduziert wird [110]. Eplerenon besitzt eine mit Aldosteron und Spironolacton verwandte Struktur (siehe Abb. 1.6). Die geringen Veränderungen der Struktur des Eplerenon bewirken eine deutlich verbesserte Selektivität des Moleküls für den MR. Aldosteron Spironolacton Eplerenon Abb. 1.6: Strukturen des Aldosteron und der MR-Antagonisten Spironolacton und Eplerenon. So zeigt das Eplerenon im Vergleich zu Spironolacton 15-20-mal niedrigere Affinität zum Mineralokortikoidrezeptor auf, dafür aber eine 500-mal niedrigere Affinität zum Glucocorticoid-, Androgen- und Progesteronrezeptor [111]. Nach oraler Einnahme wird 15 Einleitung Eplerenon rasch resorbiert und erreicht nach ca. 1,5 Stunden die maximale Plasmakonzentration. Die Bioverfügbarkeit von Eplerenon beträgt mehr als 90 % und die Halbwertszeit beträgt 3,5 bis 5 h. Eplerenon wird in der Leber durch die Cytochrom P450abhängige Monooxygenase Cyp3A4 metabolisiert. Inaktive Metaboliten werden vorwiegend über die Niere ausgeschieden. Eplerenon ist zugelassen als Kombinationspartner zu einer Standardtherapie, um das Risiko der kardiovaskulären Mortalität und Morbidität bei Patienten mit linksventrikulärer Dysfunktion und klinischen Zeichen einer Herzinsuffizienz nach einem kürzlich aufgetretenen Myokardinfarkt zu verringern. Die Zulassung des Eplerenons basiert auf der EPHESUSStudie (Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study) [100]. Dabei handelte es sich um eine Postinfarktstudie, die an 6632 Patienten durchgeführt wurde. Die Randomisierung der Patienten in dieser multizentrischen Doppelblindstudie erfolgte innerhalb von 3 bis 14 Tagen (durchschnittlich 7 Tagen) nach akutem Myokardinfarkt. Zusätzlich zur Standardtherapie [ACE-Hemmern oder AngiotensinRezeptorblockern (87 %), Betablockern (75 %) und Diuretika (60 %)] bekamen die Patienten entweder Eplerenon (3319 Patienten) oder Placebo (3313 Patienten) in einer Initialdosierung von 25 mg einmal täglich mit anschließender Erhöhung auf die Erhaltungsdosis von 50 mg einmal täglich innerhalb von 4 Wochen. Primäre Endpunkte waren die Mortalität und die Sterblichkeit oder die erste Hospitalisierung auf Grund kardiovaskulärer Ereignisse. Nach einer Behandlungsdauer von 16 Monaten verstarben 14,4 % der Patienten unter Eplerenon und 16,7 % unter Placebo. Damit reduzierte Eplerenon im Vergleich zum Placebo das Risiko der Gesamtsterblichkeit signifikant um 15 %, was überwiegend auf die Reduktion der kardiovaskulären Mortalität zurückzuführen [112]. In der EPHESUS-Studie wurde bewiesen, dass der günstige Einfluss von Eplerenon auf die Sterblichkeitsrate bereits 30 Tage nach einem Infarktereignis eintritt. So war die Gesamtmortalität innerhalb dieser Zeitspanne um relativ 31 % und der plötzliche Herztod um relativ 37 % vermindert [112]. Eine aktuelle EMPHASIS-HF-Studie (Eplerenone in Mild Patients Hospitalization and SurvIval Study in Heart Failure) zeigt, dass Eplerenone auch zu verkürzter Hospitalisierung bei Patienten mit mildem Herzversagen führt [113]. 16 Einleitung 1.6.2 Canrenoat Canrenoat (Aldactone®) ist der aktive Metabolit des Spironolactons. Spironolacton wurde vor etwa 50 Jahren entdeckt und ist ein synthetisches Derivat von Aldosteron, das in der Position C 17 einen Lactonring enthält. Es ist ein kompetitiver Antagonist des Aldosterons. Spironolacton ist in der Lage nichtselektiv an MR zu binden und damit die Bindung von Aldosteron zu verhindern und seine negative Wirkung zu hemmen [114]. Bei Menschen liegt die Bioverfügbarkeit bei 50-90 %. Die Halbwertszeit von Spironolacton beträgt 1,4 Stunden und danach wird es in seine Metaboliten umgewandelt Spironolacton ist wasserunlöslich und kann nur in Tablettenform oral appliziert werden. Der Metabolit des Spironolactons Canrenoat hat den Vorteil, dass er gut wasserlöslich ist, d.h. er kann intravenös injiziert werden und seine Halbwertszeit liegt bei 14-22 Stunden. Wichtig ist auch, dass die Menge Canrenon ungefähr der Menge entspricht, die aus einer gleichen Dosis von Spironolacton freigesetzt wird. Das Canrenoat und seine Metaboliten wie Canrenon und 7-ThiomethylCanrenon werden vorwiegend mit dem Urin (53 %) ausgeschieden. Spironolacton und Canrenoat fördern die vermehrte Ausscheidung von Natriumchlorid und Wasser und damit inhibieren die Freisetzung von Kalium. Die Wirkung von Spironolacton auf die Behandlung der schweren Herzinsuffizienz wurde in der RALES-Studie (Randomized Aldactone Evaluation Study) belegt. In dieser Doppelblindstudie wurden insgesamt 1663 Patienten mit fortgeschrittener Herzinsuffizienz (NYHA III–IV) und einer linksventrikulären Auswurffraktion von weniger als 35 % eingeschlossen. Dabei wurden 841 Patienten in die Placebogruppe und 822 Patienten in eine Spironolacton-Gruppe aufgenommen. Die Patienten der Spironolacton-Gruppe bekamen einmal täglich 25 mg Spirinolacton. Nach 8 Wochen wurde die Dosis auf einmal täglich 50 mg erhöht. Diese Studie wurde nach 24 Monaten vorzeitig abgebrochen, da eine Zwischenanalyse einen signifikanten Vorteil von Spironolacton zeigte. Hierbei konnte durch die zusätzliche Behandlung mit Spironolacton eine Reduktion der Mortalität um 30 % und der Hospitalisierungen um 35 % erreicht werden. Außerdem konnte die Aldosteron-Wirkung, die durch Aldosteron vermittelte myokardialen Remodelling-Prozesse und der pathologischen Fibrosierung des Myokards gehemmt werden. Allerdings traten bei der Therapie mit Spironolacton neben Hyperkaliämie weitere unerwünschte Nebenwirkungen auf. Spironolacton blockierte, trotz der relativ niedrigen Dosierung, auch die Androgen-, Glukokortikoid-, und Progesteronrezeptoren, was zu unerwünschten Effekten wie Gynäkomastie und Brustschmerzen (10 % der männlichen Patienten), Impotenz und Menstruationsstörungen führt [115, 99]. 17 Einleitung 1.7 Aufgabenstellung Im klinischen Bereich bietet die Postkonditionierung ein hohes Potential für die Behandlung eines akuten Myokardinfarktes. Bisher wurden jedoch noch keine wirksamen pharmakologischen Interventionen während der Reperfusion entwickelt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und im klinischen Alltag anzuwenden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die kardioprotektive Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten Eplerenon und Canrenoat zu untersuchen und die zugrunde liegenden Elemente der Signaltransduktion zu erforschen. Hierfür wurden drei Tiermodelle verwendet: isolierte Rattenherzen, ein in situ Mausmodell und ein in situ Kaninchenmodell, in denen die schützende Wirkung dieser Substanzen während der Reperfusion getestet werden sollte. Ein akuter Myokardinfarkt konnte dabei durch Verschluss und Wiedereröffnung der linken Koronararterie simuliert werden. Des Weiteren sollten wichtige Signalelemente wie PKC, PI3-Kinase, Akt und ERK 1/2, die zu der Schutzwirkung dieser MR-Antagonisten beitragen, charakterisiert werden. Anschließend wurde mit Hilfe CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen die Rolle von Adenosin bei dem Eplerenon und Canrenoat vermitteltem Myokardschutz genauer untersucht. Um die Untersuchungen im in situ Mausmodell durchführen zu können, wurde diese Methode zuvor etabliert. Im Gegensatz zu Organversuchen bieten die in situ Tiermodelle den Vorteil, dass die Pharmaka unter den komplexen Bedingungen im Gesamtorganismus getestet werden können. 18 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien Acrylamid/bis-Acrylamid (37,5:1), Roth, Karlsruhe Agarose Serva, Heidelberg APS Ammoniumpersulfat, Roth, Karlsruhe β-Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe BCA Protein Assay Kit Pierce, Rockford, USA Borsäure Roth, Karlsruhe BSA Rinderserumalbumin, bovine serum albumine, Roth, Karlsruhe Kalziumchlorid Roth, Karlsruhe Cell Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA DMSO Dimethylsulfoxid, Roth, Karlsruhe DNA-Leiter VIII 19-1114 bp Roche Diagnostics, Mannheim DTT 1,4-Dithiothreit, Roth, Karlsruhe EDTA Ethylendiamintetraacetat, Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Ethanol Roth, Karlsruhe Entwickler Tetanal, Norderstedt Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Evance Blue Sigma-Aldrich, Dreisenhofen FCS fötales Kälberserum, fetal calve serum, Invitrogen, Karlsruhe Fixierer Tetanal, Norderstedt Fluorescent Polymer Microspheres, 2-8 μM Duke Scientific Corp., Fremont, USA Glukose Roth, Karlsruhe Glycin Roth, Karlsruhe Heparin-Natrium 25000 I.E. Ratiopharm, Ulm Isofluran Dalta Select, Dreieich Isopropanol Merck, Darmstadt Material und Methoden Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Lämmlipuffer Biorad, Hercules, USA Load Dye blue/orange Promega, Mannheim ® LumiGLO Reagent Cell Signaling, Danvers, USA Milchpulver Roth, Karlsruhe Magnesiumsulfat Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Methanol J. T. Backer, Holland Natriumchlorid Roth, Karlsruhe Natriumchlorid 0,9 % B.Braun, Melsungen Natriumhydrogencarbonat Roth, Karlsruhe Paraformaldehydlösung (4 %) Sigma-Aldrich, Dreisenhofen PBS phosphate buffered saline, PAA, Pasching, Österreich PCR-Primer Invitrogen, Karlsruhe Pentobarbital-Natrium Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Peroxide Reagent Cell Signaling, Danvers, USA PMSF Phenylmethylsulforylfluorid, Roth, Karlsruhe Ponceau S Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Proteinase K Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Proteinmarker (dual color, prestained), Biorad, Hercules, USA Salzsäure Merck, Darmstadt SDS sodiumdodecylsulfate, Roth, Karlsruhe TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine, Biorad, USA Thiopental-Natrium (Trapanal ), Nycomed, Konstanz Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Roth, Karlsruhe TTC 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, Sigma-Aldrich, ® Dreisenhofen Tween 20 Roth, Karlsruhe 19 20 Material und Methoden 2.1.2 Substanzen und Inhibitoren Aldosteron Sigma-Aldrich, Dreisenhofen Canrenoat (Aldactone®) Riemser, Greifswald-Insel Riems Chelerythrine Calbiochem/Merck, Darmstadt Eplerenon (Inspra®) Pfizer, Karlsruhe Spironolacton Sigma-Aldrich, Dreisenhofen SPT Sigma-Aldrich, Dreisenhofen U0126 Calbiochem/Merck, Darmstadt Wortmannin Sigma-Aldrich, Dreisenhofen 2.1.3 Antikörper anti-phospho-Akt (Ser473) Cell Signaling, Danvers, USA anti-Akt (Ser473) Cell Signaling, Danvers, USA anti-phospho-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) Cell Signaling, Danvers, USA anti-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204) Cell Signaling, Danvers, USA goat-anti-rabbit- IgG (horseradish peroxidase linked) Cell Signaling, Danvers, USA 2.1.4 Puffer und Lösungen Agaroselösung 1,5 g Agarose 100 ml 1 x TBE-Puffer In der Mikrowelle aufkochen, anschließend etwas abkühlen lassen. 4 µl 1 % Ethidiumbromid zugeben Lysis-Puffer 1 x Cell Lysis Buffer 10 µM PMSF Microspheres-Lösung 250 mg Fluorescent Polymer Microspheres 100 ml Natriumchloridlösung (0,9 %) Material und Methoden modifizierter Krebs-HenseleitPuffer (Rattenherzen) 118,5 mM Natriumchlorid 24,8 mM Natriumhydrogencarbonat 4,7 mM Kaliumchlorid 1,2 mM Magnesiumsulfat 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat 2,5 mM Kalziumchlorid 10 mM Glukose 10 x PBS 1,35 M Natriumchlorid 30 mM Kaliumchlorid 80 mM Natriumhydrogenphosphat 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat pH 7,4 Pentobarbital/Heparin (Ratte) 10 ml Pentobarbital-Natrium (1g/40 ml) 15 μl Heparin-Natrium (5000 I.E./ml) Pentobarbital (Maus) 2,5 % (w/v) Pentobarbital-Natrium 0,9 % NaCl-Lösung Stripping-Puffer 14,3 M β-Mercaptoethanol 2 % (w/v) SDS 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 TBE-Puffer 90 mM Tris-HCl 90 mM Borsäure 20 mM EDTA 10 x TBS 1,37 M Natriumchlorid 26,8 mM Kaliumchlorid 247,6 mM Tris-Base pH 7,6 21 22 Material und Methoden TBST 1 x TBS 0,1 % (v/v) Tween 20 1,92 M Glycin 10 x Transferpuffer 250 mM Tris-Base Transferpuffer 1 x Transferpuffer 20 % (v/v) Methanol TTC-Lösung (Ratte) 1 x PBS 0,4 % (w/v) TTC TTC-Lösung (Maus) 1 x PBS 0,8 % (w/v) TTC 2.1.5 Versuchstiere Ratten Wistar Charles River, Sulzfeld Mäuse CD1 Charles River, Sulzfeld C57BL/6N Charles River, Sulzfeld A2bAR-/- Biotechnikum, Greifswald CD73-/- Biotechnikum, Greifswald 2.1.6 Verbrauchsmaterialien Chirurgische Fäden: Meriderm schwarz 2 x DSM 20-6, 7/0 USP Catgut, Markneukirchen PET-Faden, Greenfil, 5 x 50cm 3/0 USP Catgut, Markneukirchen PET-Faden, Greenfil, DRT 18, 2/0 USP Catgut, Markneukirchen Material und Methoden Einmal-Injektionskanülen: 21G x 11/2” Nr. 2 Dispomed, Gelnhausen 24G x 1“ Nr. 17 Becton Dickinson, Heidelberg 27G x 3/4 ” Nr. 20 Dispomed, Gelnhausen Einmalpipetten (5 ml, 10ml, 25 ml) Sarstedt, Nümbrecht Filterpapier Whatman, Dassel Fixierpflaster, Leukosilk S BSN medical, Hamburg Naturseide-S 1,5 EP Catgut, Markneukirchen Nitrocellulosemembran Schleicher und Schuell, Dassel Pinzetten FST, Heidelberg Pipettenspitzen (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Eppendorf, Hamburg Röhrchen (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, Hamburg Röhrchen, Falcon (50 ml) Becton Dickinson, Röhrchen (15 ml) Greiner, Nürtingen Röntgenfilm-HyperfilmTM ECL GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Scheren FST, Heidelberg Schläuche, Tygon Fisher Scientific, Schwerte Tupfer, Pur Zellin Hartmann, Österreich Whatman Papier Schleicher und Schuell, Dassel 2.1.7 Geräte Analysewaage Sarorion, Göttingen Autoradiographiekasette Amersham Buchler, Braunschweig Beatmungsgerät MiniVent Type 845 Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten Elektrophoresekammern Biorad, Hercules, USA Elektrokauter FST, Heidelberg Digitalkamera Cyber-shot, Sony, Japan Geldokumentierstation Biorad, Hercules, USA Injektionspumpe 11 Plus Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten Kaltlichtlampe KL 1500 LCD Schott, Mainz Langendorff-Anlage Medizinisch-Glastechnische-Werkstätte, Berlin Magnetrührer Heidolph, Schwabach 23 24 Material und Methoden Mausthermometer, TCAT 2LV Physitemp Instruments, USA Mikroskop, Mantis Compact Vision Engineering, Emmering Mikrotiterplattenlesegerät 1420 Victor2 Multilabel Counter, Wallac, USA Mikrowelle Simens, München pH Meter Schott, Mainz Pipetten Eppendorf, Hamburg Rührer mr 3000 Heidolph, Schwabach Schüttler Duomax 1030 Heidolph, Schwabach Schüttelwasserbad SW22 Julabo Labortechnik, Seelbach Spektrophotometer Nano Drop Peqlab Biotechnologie, Erlangen Thermocycler Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems,USA Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg Tiefkühlschrank (-20 °C) Bosch Tiefkühltruhe (-80 °C) Bosch Vortexer Scientific Industries,USA Zentrifugen: Biofuge fresco Heraeus, Hanau Mini-Zentrifuge Fisher Scientific, Schwerte 2.1.8 EDV, Software Hardware: PC Software: Microsoft Word, Microsoft Excel, Microsoft PowerPoint, Adobe Photoshop 5.0, Image Tool, Sigma Plot, Sigma Stat, Nano Drop 1000 Version 3.7.1. 25 Material und Methoden 2.2 Methoden Für die Untersuchungen zur Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten und zur Beantwortung der gestellten Fragen wurden isolierte perfundierte Rattenherzen als auch die in situ Mäuseherzen und in situ Kaninchenherzen verwendet. Die Durchführung der Versuche wurde dem Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommerns angezeigt (LALLF M/V/TSD/7221.3-23.31-002/07, LALLF M/V-TSD/7221.3-2.4-006/07, LALLF M/V-TSD/7221.32.4-007/09). 2.2.1 Tierhaltung Die für die Versuche benötigten Ratten und CD1-Mauslinie wurden bei Charles River und die A2bAR-/--, CD73-/-- und C57Bl/6N-Mauslinien in der Versuchstierkunde der Universität Greifswald gezüchtet. Die Tiere wurden zum Zeitpunkt des Versuchs unter gleichen Bedingungen im Tierstall des Instituts für Pathologie gehalten. Sie wurden in einer kleinen Gruppe (3 Ratten pro Käfig bzw. 5 Mäuse pro Käfig) bei einem konstanten Tag-NachtRhythmus von 12 Stunden und 23 °C gehalten und der Luftaustausch erfolgte kontinuierlich. Als Nahrung dienten Trockenfutter und Wasser, welches jederzeit zur Verfügung stand. 2.2.2 Genotypisierung der Versuchstiere Zur Bestimmung des Genotyps wurden den Zuchttieren nach der Narkotisierung mit Isofluran ca. 0,5 cm der Schwanzspitze entfernt. Der Bestimmung des Genotyps einer Maus erfolgte nach dem Absetzen von den Elterntieren. Nach der Gewinnung genomischer DNA aus Biopsieproben der Schwanzspitzen, ihrer Vervielfältigung mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) und Auftrennung der PCR-Produkte mit Hilfe von Agarosegelen konnte der Genotyp identifiziert werden. 26 Material und Methoden 2.2.2.1 Gewinnung genomischer DNA aus Schwanzspitzen-Biopsien Die Gewinnung genomischer DNA aus Schwanzspitzen-Biopsien erfolgte mit Hilfe von DNeasy® Blood & Tissue Kit der Firma Qiagen und wurde nach den Angaben der Herstellprotokolle durchgeführt. Dabei wurde die Schwanzspitze mit 180 μl ATLBiopsiepuffer über Nacht bei 56 °C mit 20 μl Proteinase K (20 mg/ml) verdaut. Am nächsten Tag wurde die Probe für 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert, der Überstand in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit je 400 µl AL-Ethanol-Puffergemisch (Verhältnis 1:1) versetzt. Die Lösung wurde auf eine DNeasy Mini Säule gegeben und für 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Die an der Säule gebundene DNA wurde zuerst mit 500 µl AW1-Puffer gewaschen und für 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert und anschließend mit 500 µl AW2-Puffer und erneut zentrifugiert. Am Ende der Isolation wurde die DNeasy Mini Säule auf ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß platziert und auf die an der Membran gebundene DNA wurden 100 µl AE-Puffer gegeben. Nach 2 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde die DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 8000 rpm eluiert und anschließend bei - 20 °C gelagert. 2.2.2.2 PCR zur Genotypisierung Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Standardmethode zur Amplifikation und zum Nachweis definierter DNA-Fragmente. Zur Genotypisierung wurden Primerpaare verwendet, die für Wildtyp und Knockout unterschiedliche Produkte liefern. Um eine unspezifische Produktbildung auszuschließen wurde, die spezifische DNA jeder Maus mit zwei verschiedenen PCR Ansätzen vervielfältigt. 27 Material und Methoden Tab. 2.1: PCR-Ansatz. Substanzen Volumen (µl) genomische DNA 1,0 dNTPs 4,0 10 x Puffer 5,0 forward Primer 0,2 reverse Primer 0,2 Taq-Polymerase 0,2 dH2O 39,4 Gesamtvolumen 50,0 Tab. 2.2: Sequenz der Genotypisierungsprimer. Produkt Primer Typ Sequenz (5’-3’) CD73+/+ forward AAT CCA GGG ACA AAT TTA GTC CD73+/+ reverse AGA AAG GTG TTG GAG TGT CCT CD73-/- forward CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC CD73-/- reverse AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC A2bAR+/+ forward GTA CGT GGC GCT GGT TAT C 217 A2bAR-/- forward GGG TGG GAT TAG ATA AAT GCC TGC TCT 417 A2bAR gemeinsam reverse GCT CTG TGT GAG CAC CAG CAC GAA G (bp) 280 190 Die Proben wurden anschließend im Thermocycler der Firma Applied Biosystems mittels PCR nach folgendem Zeit-Temperatur-Schema vervielfältigt. Tab. 2.3: PCR-Programm für CD73-Mauslinie. Schritt Temperatur Zyklusdauer Wiederholung 1 94 °C 15 min 1x 2 94 °C 1 min 3 56 °C 1 min 35 x (Schritte 2-4) 4 5 6 72 °C 72 °C 4 °C 1 min 10 min unendlich 1x 28 Material und Methoden Tab. 2.4: PCR-Programm für A2bAR-Mauslinie. Schritt Temperatur Zyklusdauer Wiederholung 1 9 °C 15 min 1x 2 96 °C 1 min 3 60 °C 1 min 31 x (Schritte 2-4) 4 5 6 68 °C 68 °C 4 °C 1 min 10 min unendlich 1x Die gewählte Annealing-Temperatur ist vom Schmelzpunkt des verwendeten PrimerKonstruktes abhängig und ist während einer PCR entscheidend für die Spezifität der Bindung an die Zielsequenz. Die Elongationszeit ist von der benutzten Taq-Polymerase und der Produktgröße abhängig. Die Lagerung der Proben bis zur Analyse durch Gelelektrophorese erfolgte bei - 20 °C. Um Kontaminationen auszuschließen, wurde eine Negativkontrolle mit amplifiziert, die bis auf die cDNA alle für die PCR notwendigen Reagenzien enthielt. 2.2.2.3 DNA- Konzentrationsbestimmung Die Konzentration der DNA-Lösungen wurde durch die Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt. Die Verdünnung wurde dabei so gewählt, dass die OD260 in einem Bereich zwischen 0,1 und 0,8 lag. 2.2.2.4 Agarosegelelektrophorese Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese, nach ihrer Größe im elektrischen Feld, aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte in einem 1,5 % Agarosegel. Für die Gele wurde 1,5 g (w/v) Agarose in 100 ml 1 x TBE-Puffer aufgekocht, abgekühlt und zur Färbung der DNA mit 4 µl 1 % Ethidiumbromid versetzt. Die DNA-Proben wurden mit 10 x Gelladepuffer versetzt, in die vorhandenen Geltaschen je 20 µl befüllt und bei einer konstanten Spannung von 85 V aufgetrennt. Die mit Ethidiumbromid gefärbten DNA-Amplifikate wurden mit Hilfe des UVLichts sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert. Zur Identifizierung der 29 Material und Methoden Fragmentgröße der zu untersuchten Proben wurde 1 µl DNA-Leiter VIII 19-1114 Bp verwendet. Der DNA-Marker wurde mit 4 µl dest. Wasser und 1 µl 6 x blue/orange Load Dye versetzt und in die Geltasche aufgetragen. 2.2.3 In situ Mausmodell Das in situ Mausmodell ist eine etablierte Untersuchungsmethode für den akuten Myokardinfarkt. Die Methode erlaubt die Untersuchung von Pharmaka unter physiologischen Bedingungen im Gesamtorganismus. Für die Versuche werden vor allem Mäuse bevorzugt, weil sie als Gen-Knockout genetisch manipuliert werden können. Für die Untersuchungen wurden Mäuse beider Geschlechter zwischen 8-12 Wochen benutzt. Die CD73-/--Mäuse wurden freundlicherweise erhalten von Dr. Thompson von der Medical Research Foundation aus Oklahoma (USA) und die A2bAR-/--Mäuse von Dr. Eltzschig vom Department of Anesthesiology, University of Colorado aus Denver (USA). Die CD73-/--Mäuse durch das fehlende Enzym sind nicht fähig, das extrazelluläre Adenosin durch die 5´-Ektonukleotidase (CD73) zu produzieren. Das CD73 katalysiert die Phosphorylierung von AMP und dient während eines Herzinfarktes als eine Quelle für das extrazelluläre Adenosin [141]. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen das Gen für den A2bAdenosinrezeptor deletiert. Der A2bAR zeigt eine niedrige Affinität für Adenosin und spielt eine wichtige Rolle in Situationen, in denen große Mengen an Adenosin freigesetzt werden, wie z.B. beim Myokardinfarkt. Als Kontrolltiere für die beiden Stämme wurden C57BL/6NMäuse eingesetzt. Das in situ Mausmodell wurde zuerst durch Eckle und Mitarbeitern beschreiben [116]. Bei den durchgeführten Versuchen fanden jedoch einige Modifizierungen statt. Die Mäuse wurden am Anfang des Versuches mit 70 mg/kg Pentobarbital intraperitoneal (i.p.) anästhesiert und eine zusätzliche Anästhesie erfolgte während des Versuches. Nach Wirkungseintritt der Narkose wurde die Maus gewogen und auf einer temperaturregulierten Wärmeplatte in Rückenlage fixiert. Zur Kontrolle der Körpertemperatur wurde ein Thermofühler rektal eingeführt. Mit einem Rückkopplungssystem wurde dafür gesorgt, dass die Körperinnentemperatur der Maus relativ konstant auf 37 °C gehalten wurde. Alle weiteren Schritte wurden unter dem Mikroskop durchgeführt. Mit einem ca. 1 cm langen longitudinalen medianen Hautschnitt wurde die Trachea frei präpariert und ein Intubationsröhrchen des Beatmungsgerätes in die Trachea eingeführt und fixiert. Die 30 Material und Methoden Beatmung der Maus erfolgte mit einem Raumluft-Sauerstoff-Gemisch mit einer konstanten Beatmungsfrequenz von 110 Atemzügen pro min, einem Atemvolumen zwischen 200-250 µl, einem positiven inspiratorischen Druck (PIP) von 10 cm Wassersäule und einem positiven endexpiratorischen Druck (PEEP) von 3 cm Wassersäule. Als nächstes wurde die über dem linken Thorax liegende Haut im Bereich des sichtbaren Herzschlages mit einem ca. 2 cm longitudinalen Schnitt eröffnet. Die darunter liegende Muskelschicht und die Rippen mit einem Elektrokauter durchtrennt, um die Blutung der Blutgefäße zu verhindern. Mit zwei Fäden konnte der eröffnete Brustkorb fixiert werden und der Zugang zum Herzen erfolgte durch Eröffnung des Perikards. Als nächtes wurde die linke Koronararterie (LAD, left anterior descending artery) mittels einer 7-0 Nadel-Faden-Kombination unterhalb des linken Atriums umstochen. Für die 30 min Ischämie wurden die beiden Fadenenden durch ein ungefähr 1 mm langen Tube aus 10 µl Pipettenspitze gefädelt, der auf die LAD gedrückt und mit einer Klemme festgehalten wurde (Abb. 2.1). Die erfolgreich erzeugte Ischämie konnte durch ein weißes Risikoareal des Herzens beobachtet werden. Nach dieser Zeit wurde die zweistündige Reperfusion eingeleitet. Nach der Reperfusion wurde der Faden wieder eröffnet und das Herz hat im Risikoareal wieder eine rote Färbung bekommen. Während des Versuches wurden die Halterfäden des Brustkorbes gelockert und die Muskulatur mit einem 0,9 %igen NaCl getränktem Zellstofftuch abgedeckt, um Austrocknung des Gewebes zu vermeiden. Zusätzlich wurde die Maus mit einer Aluminiumdecke zugedeckt, um den Wärmeverlust zu verhindern. Die Tiere wurden in folgende Versuchsgruppen unterteilt, wie aus der Tabelle 2.5 zu entnehmen ist. Die Postkonditionierung (IPost) der Herzen erfolgte durch die intravenöse (i.v.) Injektion der Substanzen in die Schwanzvene. Canrenoat wurde als einmaliger 100 µl Bolus injiziert. Eplerenon wurde als kontinuierliche Infusion von 1 µl/min mit einer Injektionspumpe gegeben. Die Kontrolltiere enthielten entsprechend 0,9 % NaCl-Lösung. Abb. 2.1: In situ Mausmodell. Das linke Bild zeigt eine anästhesierte Maus auf einer Heizplatte mit rektalem Thermometer und angeschlossener Beatmung während der Ischämie. Das rechte Bild zeigt ein frei präpariertes Mäuseherz während der Ischämiephase. 31 Material und Methoden Tab. 2.5: Zusammenfassung der verwendeten Mauslinien, Substanzkonzentrationen und Versuchsprotokollen für das in situ Mausmodell. Mausstamm Substanz Konzentration Applikation C57BL/6N Canrenoat 0,003 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 0,03 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 0,3 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 1 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 10 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 1 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, nach 0 min Reperfusion C57BL/6N Canrenoat 1 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, nach 15 min Reperfusion C57BL/6N Eplerenon CD73-/- Canrenoat CD73-/- Eplerenon A2bAR-/- Canrenoat 10 mg/kg 1 µl/min Infusion, 5 min vor Reperfusion für 2 h 1 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion 10 mg/kg 1 µl/min Infusion, 5 min vor Reperfusion für 2 h 1 mg/kg 1 x 100 µl Bolus, 5 min vor Reperfusion Am Ende des Versuches wurde der Bauchraum eröffnet und aus der abdominalen Aorta das Blut entnommen, um den Troponin-Wert zu bestimmen. Danach erfolgte die Färbung des Riskoareals mit Evans Blue und des Infarktareals mit TTC-Lösung. Die besondere Schwierigkeit in dieser Operationstechnik bestand darin, die Intubation der Maus während des Versuches ohne großen Abfall des Atemvolumens durchzuführen. Die Tiere bei denen das Atemvolumen von 250 µl auf weniger als 190 µl herunter ging, zeigten große Infarktareale oder sie verstarben sogar während des Versuches, was ein Hinweis auf die Unterversorgung mit Sauerstoff war. Weiterhin bestand die Gefahr, dass beim Umstechen der LDA auch andere Gefäße verletzt wurden, was zu Blutungen führte. 2.2.3.1 Infarktgrößenbestimmung der Mäuseherzen Bei der Infarktgrößenbestimmung des Herzens wurde zuerst mit dem Farbstoff Evans Blue das Risikoareal genau definiert. Hierfür wurde direkt nach der Reperfusion der Brustkorb transversal eröffnet und es wurde die Bauchvene (inferior vena cava) und die Speiseröhre (Oesophagus) durchgeschnitten, um besseren Zugang zur Aorta zu schaffen. Danach wurde die Aorta frei präpariert und leicht angeschnitten, um den Katheter einzuführen. Der selbstpräparierte Katheter bestand aus einer 1 ml Spritze, einer 24 G Kanüle und einem 32 Material und Methoden ca. 5 cm langen Schlauch. Für die Färbung wurde zuerst das Herz mit 1 ml 0,9 % NaCl blutfrei gespült, der Koronararterie umschließende Faden zugeknotet und das Herz mit ca. 100 µl Evans Blue Lösung gefärbt. Der mit Blut unterversorgte Herzbereich konnte dadurch mit dem applizierten Farbstoff nicht eingefärbt werden und wurde deshalb von dem perfundierten Risikoareal, also dem blau gefärbten Myokard, abgegrenzt. Am Ende des Versuches wurde das Herz aus dem Brustkorb ausgeschnitten, gewogen und bei -20 °C für ca. 15 min eingefroren. Anschließend wurden mit einer Rasierklinge 1 mm dicke transversale Schnitte angefertigt und mit (2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid) TTC-Lösung fungiert als gefärbt. Das unspezifischer verwendete TTC Protonenakzeptor mitochondrieller Enzymsysteme der Atmungskette. Das in vitalem Myokard reichlich vorhandene NADH reagiert mit dem Tetrazoliumsalz und wird zu Formazan reduziert. Formazan ist für die Rotfärbung verantwortlich. Im Infarktareal kommt es zu einem Abfall der NADH-Konzentration und dadurch bedingt zu einer fehlenden Reduktion des Tetrazoliums. Eine Färbung bleibt aus. Damit lässt sich ein stoffwechselinaktives Gewebe, d.h. ein nekrotisches Gewebe (weiße Areale) von gesundem Gewebe mit vorhandener Enzymaktivität (rote Areale) abgrenzen [117]. Hierzu wurde das eingefrorene Mäuseherz in ca. 6 dünne Scheiben geschnitten und anschließend für 20 min bei 37 °C in TTC-Lösung gefärbt. Anschließend wurden die Gewebeschnitte zwischen zwei Objektträgern in einer 4 % Paraformaldehyd-lösung für 3 Tage fixiert. Abb. 2.2: Transversale Schnitte eines Mäuseherzens. Der Evans-Blue-Farbstoff färbt das versorgte Herzgewebe während der Ischämie blau und grenzt damit das Risikoareal ab. Die TCC-Färbung lässt das infazierte, nekrotische Gewebe weiß erscheinen. Das vitale Gewebe im Risikoareal ist rot dargestellt. Ein Abschnitt des Größenstandards entspricht 1 cm. Die Infarktgröße wurde planimetrisch bestimmt. Hierfür wurden die Herzschnitte in eine mit Wasser gefüllte Petrischale gelegt und mit einem Größenstandard und gleicher Vergrößerung mit einer Digitalkamera fotografiert. Die Auswertung der Infarktgrößen erfolgte mittels ImageTool (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, USA). Die Infarktgröße wird als Prozent des Infarktes vom Risikoareal bestimmt. Material und Methoden 33 2.2.3.2 Troponinmessung Troponin I ist ein wichtiges Strukturprotein des Herzens.Während eines Myokardinfarktes wird der Herzmuskel geschädigt und das kardiale Troponin I (cTnI, cardiac troponin I) geht ins Blut über, wo es direkt gemessen werden kann. Um die Korrelation zwischen Herzinfarkt und kardialem Troponin zu bestimmen, wurde am Ende des in situ Versuches der Maus aus der abdominalen Aorta Blut entnommen und für 10 min bei 5000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde das Blutplasma für die Messung bei 4 °C gelagert. Die Troponinmessung wurde freundlicherweise durch das Institut für Klinische Chemie der Universität Greifswald durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des CTNI-Reagenz Kits und dem neuen Analysesystem Dimension Vista 1500 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield IL). 2.2.4 Das isolierte Rattenherz Das perfundierte Rattenherz nach Langendorff ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung von akuten Herzinfarkten. Hierfür wurde das isolierte Rattenherz an der Aorta an der Langendorff-Anlage befestigt und retrograd, d.h. entgegen der physiologischen Flussrichtung des Blutes, mit wichtigen Nährstoffen versorgt. Der Vorteil dieser Methode ist, dass die Aortenklappen in einem geschlossenen Zustand gehalten werden und das Perfusat in die Herzkranzgefäße gedrückt wird. Unter diesen Bedingungen wird das Herz versorgt und kann mehrere Stunden in der Anlage arbeiten. Das Langendorff-Modell erlaubt es, durch Verschluss und Wiedereröffnung eines Koronargefäßes einen akuten Myokardinfarkt zu simulieren und dessen Wirkungen zu studieren. Für die Versuche wurden männliche Ratten Wister mit einem Gewicht von 180-200 g verwendet. Diese wurden mit einer letalen Dosis von 1 ml Pentobarbital-Natrium/Heparin intraperitoneal (i.p.) anästhesiert. Nachdem die Tiere keine Schmerzreflexe mehr zeigten, wurde der Thorax geöffnet, das Herz schnell entnommen und in eine eiskalte physiologische NaCl-Lösung (0,9 %) gegeben. Der Aortenbogen wurde aufgesucht und von proximalen Anteilen der großen thorakalen Gefäße und vom Thymus befreit und das Herz an die Langendorff-Anlage gehängt. Danach wurde die Versorgung des Herzens durch Perfusion mit 37 °C warmem, begastem (95 % O2/5 % CO2) und modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer wiederhergestellt. 34 Material und Methoden Abb. 2.3: Darstellung des isolierten Rattenherzens an der Langendorff-Anlage. Das linke Bild stellt das Herz nach dem Umstechen schematisch dar. Das rechte Bild zeigt die mit einer 2-0 Nadel-Faden-Kombination umstochene linke Koronararterie des isolierten Rattenherzens nach der Ischämie an der Langendorff-Anlage. Um den Myokardinfarkt zu stimulieren wurden, alle Rattenherzen einem Standardprotokoll unterzogen. Dabei wurde nach 30 min Äquilibrierung (s.g. Einschlagphase) die linke Koronararterie unterhalb des linken Atriums mittels 2/0 Nadel-Faden-Kombination umstochen. Für die 30 min Ischämie wurden die beiden Fadenenden durch einen ca. 0,5 cm langen Plastikschlauch gefädelt, dieser wurde an die LAD gedrückt und mit einer Klemme fixiert, um die Versorgung zu unterbinden. Nach der Ischämiephase wurde der Schlauch entfernt und die 120 min Repefusion eingeleitet. Die untersuchten Rattenherzen wurden in folgende Gruppen unterteilt: Kontrolle, Pharmaka, Pharmaka mit Inhibitor und Inhibitor alleine. Die Versuchsdurchführung ist in der Abb. 2.2 dargestellt. Die applizierten Substanzen wurden dem Perfusat immer frisch zugegeben (Tab. 2.6). MR-Antagonist Inhibitor Ischämie 0 30 60 90 120 150 180 min Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Versuchsprotokolle für das isolierte Rattenherz. Das Rattenherz wurde einer 30 min Ischämie an der Langendorff-Anlage unterzogen. Die Applikation von Inhibitor erfolgte 10 min, bzw. von MR-Antagonisten 5 min vor der 120 min Reperfusion. 35 Material und Methoden Tab. 2.6: Zusammenfassung der verwendeten Substanzen, Konzentrationen und Versuchsprotokolle für die isolierten Rattenherzen. Substanz Konzentration Applikation Eplerenon 1 µM 120 min, beginnend 5 min vor der Reperfusion Eplerenon 10 µM 120 min, beginnend 5 min vor der Reperfusion Spironolacton 10 µM 120 min, beginnend 5 min vor der Reperfusion Canrenoat SPT Wortmannin Chelerythrine U0126 Aldosteron Aldosteron 50 µM 100 µM 100 nM 2,8 µM 500 nM 50 nM 500 nM 120 min, beginnend 5 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 120 min, beginnend 10 min vor der Reperfusion 2.2.4.1 Infarktgrößenbestimmung der Rattenherzen Bei der Infarktgrößenbestimmung wurde das durch das Umstechen des Koronargefäßes unterversorgte Areal (Risikoareal) mit grün fluoreszierenden Mikropartikeln (Microspheres) markiert und die Größe eines Myokardinfarktes (Infarktareal) mit TTC-Färbung bestimmt. Dabei wurde das Koronargefäß mit dem Faden erneut verschlossen und das Herz mit 3 ml Microspheres-Lösung perfundiert. Infolgedessen erschien im UV-Licht das Risikoareal rot, während der Rest des Herzens grün fluoreszierte. Anschließend wurde das Herz von der Anlage entnommen und eine Stunde bei -20 °C gelagert. Danach wurde das eingefrorene Herz mit Hilfe einer Rasierklinge in 2 mm starke transversale Schnitte geschnitten, in 25 ml einer TTC-Lösung bei 37 °C für 10 min gefärbt und dann in einer 4 %igen Paraformaldehydlösung für 24 h fixiert. 36 Material und Methoden Abb. 2.5: Die planimetrische Bestimmung der Infarktgrößen. Das linke Bild zeigt das Herz mit Risikoareal nach dem Verschluss des Koronargefäßes. Rechts oben sind die mit TTC-Lösung gefärbten Herzscheiben gezeigt. Rechts unten ist die Zeichnung der Herzschnitte dargestellt, bei denen das Risikoareal (blau) und das Infarktareal (rot) dargestellt ist. Die Infarktgröße wurde planimetrisch bestimmt (siehe Abb. 2.5). Für die Auswertung wurden die gefärbten Herzschnitte zwischen zwei Glasplatten gelegt. Um die Herzkonturen nachzeichnen zu können, wurde auf die obere Glasplatte eine Klarsichtfolie gelegt und unter UV-Licht das Risikoareal und das Infarktareal markiert. Die Folie wurde zusammen mit einem Größenstandard mit einer Digitalkamera fotografiert und die Infarktgröße mittels ImageTool (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, USA) bestimmt. 2.2.4.2 Gewinnung transmuraler Biopsien Um die Wirkung von Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten während einer Ischämie/Reperfusion zu untersuchen und die protektive Signaltransduktion zu erforschen, wurden zu definierten Zeitpunkten transmurale Biopsieproben aus dem linken Ventrikel gewonnen. Hierfür wurden die isolierten Rattenherzen verwendet und an der LangendorffAnlage mit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer perfundiert. Alle Herzen wurden nach 30 min Äquilibrierung einer 30-minütigen globalen Ischämie und einer 10-minütigen Reperfusion unterzogen. Die globale Ischämie wurde durch vollständige Unterbrechung des Pufferflusses erzeugt. Das Biopsiematerial wurde nach 25 min Einschlagen (Probe I, baseline) und nach 10 min Reperfusion (Probe II) gewonnen und sofort für die weitere Bearbeitung in flüssigem Stickstoff gelagert. Die behandelten Herzen erhielten die MR-Antagonisten und 37 Material und Methoden Inhibitoren (Tabelle 2.7) in der Phase der Reperfusion und bis zum Ende des Versuches. Dabei wurden sieben verschiedene Gruppen studiert: die Kontrolle, nach der Behandlung mit Canrenoat allein und in Anwesenheit von Aldosteron, nach der Behandlung mit Eplerenon allein und mit Aldosteron oder dem PI3-Kinase Inhibitor und Wortmannin. In der letzten Gruppe wurden die Herzen nur mit Aldosteron behandelt. Anschließend wurden aus diesen Biopsieproben Proteine isoliert und im Western-Blot analysiert. Tab. 2.7: Zusammenfassung der verwendeten Substanzen, Konzentrationen und Versuchsprotokolle für die Gewinnung transmuraler Biopsien. Substanz Konzentration Applikation Eplerenon 10 µM 10 min mit Beginn der Reperfusion Canrenoat Canrenoat Wortmannin Aldosteron 10 µM 50 µM 500 nM 500 nM 10 min mit Beginn der Reperfusion 10 min mit Beginn der Reperfusion 10 min mit Beginn der Reperfusion 10 min mit Beginn der Reperfusion 2.2.5 In situ Kaninchenmodell Die in dieser Arbeit präsentierten Myokardinfarkte an Kaninchenherzen wurden in der Arbeitsgruppe von Herrn Bijan Ghaleh (INSERM U955, Universität Paris, Frankreich) durchgeführt. Für diese Versuche wurden männliche Kaninchen des Stammes New Zealand White mit einem Gewicht 2,7-3,3 kg verwendet. Die Narkose wurde intravenös mit der Tiletamin/Zolazepam-Lösung (20-30 mg/kg) durchgeführt. Die erforderliche Nachdosierung der Narkose erfolgte intravenös mit Pentobarbital (35 mg/kg). Nach Wirkungseintritt der Narkose wurde der linke Thoraxbereich des Kaninchens rasiert. Für die Ventilation wurde die Trachea nach einer ca. 3 cm langen Hautinzision freipräpariert. Danach wurde eine Metallkanüle in die Trachea eingeführt und das Tier wurde an das Beatmungsgerät angeschlossen und mit Sauerstoff versorgt. Der arterielle Blutdruck wurde in der Ohrarterie mit einem Katheter gemessen und mit einem Echokardiogramm erfolgte die Registrierung der Herzfunktion. Um den Myokardinfarkt durchführen zu können, wurde in Höhe des Herzens die Haut und die darunter liegende Muskelschicht durchtrennt. Die Thorakotomie erfolgte durch eine Eröffnung des vierten Intercostalraumes und des Herzbeutels. Danach wurde die linke Koronararterie (LAD, left anterior descending artery) mit einer 3-0 Nadel-Faden- 38 Material und Methoden Kombination knapp unterhalb des linken Atriums umstochen. Für die Induktion der Ischämie wurden die beiden Fadenenden mit einer Klemme fixiert. Am Ende der Ischämiephase wurde die Perfusion des Herzens erneut wiederhergestellt. Während der Reperfusion wurde der Brustkorb geschlossen gehalten, um der Auskühlung des Herzens zu vorbeugen. Die erfolgreiche Ischämie wurde mit dem Eintritt der ST-Streckenabweichung im Elektrokardiogramm bestätigt. Im Einzelnen verlief das Versuchsprotokoll wie folgt: Alle Herzen wurden in zwei Gruppen unterteilt. Bei der ersten Gruppe, die das akute Modell präsentieren sollte, erfolgte nach der 30 min Einschlagphase, die 30 min regionale Ischämie und die 4 h Reperfusion. Am Ende des Versuches wurde das Herz für die Auswertung entnommen. Bei der zweiten Gruppe, die das chronische Modell darstellen sollte, erfolgte ebenfalls nach der 30 min Einschlagphase, die 30 min regionale Ischämie. Die Reperfusion in diesem Modell dauerte aber 72 h, d.h. direkt nach der Ischämie wurde der Brustkorb verschlossen und das Kaninchen ist aus der Narkose aufgewacht. Nach Ablauf der Reperfusionszeit wurde das Tier noch einmal narkotisiert und das Herz für die Auswertung entnommen. Jede dieser untersuchten Gruppen wurde in Kontroll- und Canrenoat-Gruppe unterteilt. Die Injektion des Canrenoats mit einer Konzentration von 1 mg/kg erfolgte 5 min vor der Reperfusion. 2.2.5.1 Infarktgrößenbestimmung der Kaninchenherzen Die Bestimmung des Risikoareals und der Infarktgröße wurde nach dem gleichen Prinzip wie die Infarktgrößenbestimmung der Mäuseherzen durchgeführt (siehe 2.2.3.1). 2.2.6 Proteinanalytische Methoden 2.2.6.1 Protein Isolation aus Biopsieproben Die eingefrorenen Biopsieproben wurden im flüssigem Stickstoff mit einem Mörser pulverisiert und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 500 µl Lysispuffer überführt. Der im Lysispuffer erhaltene PMSF ist ein irreversibler Proteasen Inhibitor, der den Proteinabbau inhibiert. Der Überstand wurde nach 10 min Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C in ein neues Gefäß überführt. Für die Proteinbestimmung (siehe 2.2.6.2) wurden 20 µl vom Material und Methoden 39 Proteinüberstand in 80 µl dest. Wasser verdünnt. Für die Western Blot-Analyse wurden die restlichen 500 µl Probenüberstand mit 225 µl Laemmli-Puffer und 25 µl DTT (Dithiothreitol) vermengt. Der Laemmli-Puffer enthält neben einem Färbemittel sowohl Sodium-DodecylSulfat (SDS), welches den Proteinen eine einheitliche negative Ladungsdichte verleiht, als auch β-Mercaptoethanol, das die Neubildung von Sekundärstrukturen der Proteine verhindert. DTT zerstört zusätzlich die Disulfidbrücken und stabilisiert damit die entfaltete Struktur der Proteine. Um die Proteine vollständig zu denaturieren, wurden die Proben für 5 min auf 95 °C erhitzt und bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert. 2.2.6.2 Bestimmung der Proteinkonzentration (BCA-Test) Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der BCA-Assay der Firma Pierce verwendet. Dieser Test beruht auf einer quantitativen Reaktion der zweiwertigen Kupferionen mit Protein zu einwertigen Kupferionen. Diese bilden, in alkalischer Lösung, mit der Bicinchoninsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex, dessen Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm photometrisch gemessen werden kann [118]. Als Proteinstandard diente BSA (bovines Serumalbumin) in Konzentrationen von 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml. In einer Doppelbestimmung wurden 10 μl der Proteinlösung bzw. des BSAStandards mit 200 μl BCA-Reaktionslösung (50 Teile Reagenz A (1 %ige BCA-Lösung) + 1 Teil Reagenz B (4 %ige Kupfer-II-Sulfat-Lösung)) in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion der Proben bei 560 nm in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Nach linearer Regressionsanalyse der BSA-Standardkurve konnten die Proteinwerte errechnet werden. 2.2.6.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Der Proteinextrakt wurde unter denaturierenden Bedingungen nach ihrem Molekulargewicht mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt [119]. Hierbei werden die Proteine mit dem anionischen Detergenz SDS (sodiumdodecylsulfate) behandelt. Die meisten Proteine binden SDS zu negativ geladenen SDS-Protein-Komplexen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit. SDS unterbindet zusammen mit DTT oder β-Mercaptoethanol die Protein-Protein-Wechselwirkung. Somit unterscheiden sich die 40 Material und Methoden Proteine nur noch in ihrer Masse und haben vergleichbare hydrodynamische Eigenschaften. Im Gel werden die SDS-Protein-Komplexe im elektrischen Feld nach ihrem Molekulargewicht entsprechend aufgetrennt. Für eine hohe Auflösung der Banden wurde die diskontinuierliche Elektrophorese durchgeführt. Die für den Versuch verwendete Gelkammer setzte sich aus zwei Glasplatten zusammen, die zuerst gründlich mit 100 % Alkohol entfettet wurden. Das Glasplattenmodul wurde in einen Ständer gespannt und in den Zwischenraum wurde das Trenngel (10 %ig) ca. 2 cm unter dem oberen Rand gegossen. Um eine glatte Geloberfläche zu erhalten, wurde das Gel mit 500 µl Isopropanol überschichtet. Nach ca. 30 min war das Gel bei Raumtemperatur auspolymerisiert. Nach dem Dekantieren des Isopropanols wurde das Trenngel mit dem Sammelgel (5 %ig) überschichtet und ein Gelkamm eingespannt, um die Geltaschen für die Proben zu formen. Das Sammelgel hat die Aufgabe, bei der Auftrennung der Proteine eine einheitliche Lauffront zu schaffen. Nach ca. 20 min war auch das Sammelgel auspolymerisiert und der Gelkamm konnte entfernt werden. Das Glasplatten-Gel-Element wurde in die Gelkammer eingesetzt und diese mit Laufpuffer aufgefüllt. Vor der Probenauftragung wurden die Geltaschen gereinigt, um eventuelle Gelreste zu entfernen, die die spätere Taschenbeladung erschweren könnten. Die Beladung des Gels erfolgte mit jeweils 50 µg Protein. Um die Proteingröße zu ermitteln, wurde ein Molekulargewichtsmarker (3 μl) mit mitgeführt. Die Trennung der Proteinproben fand bei Raumtemperatur für das Sammelgel bei einer konstanten Spannung von 80 V und für das Trenngel bei 100 V für ca. 1,5 h statt. Tab. 2.8: Zusammensetzung von Trenn- und Sammelgel. Trenngel (10 %) Sammelgel (5 %) dest. Wasser 7,9 ml 4,1 ml Acrylamid/bis-Acrylamid (37,5:1) 6,7 ml 5,0 ml 1,0 ml --- --- 750 µl SDS (10 %) 200 µl 60 µl APS (10 %) 200 μl 60 μl 8 μl 6 μl 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 1 M Tris-HCl (pH 6,8) TEMED 41 Material und Methoden 2.2.6.4 Western Blot Verfahren Mit dem Western Blot Verfahren wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine aus der Gelmatrix auf eine Nitrocellulosemembran unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes transferiert und immobilisiert. Der Nachweis der Proteine konnte mit Hilfe spezifischer Antikörper detektiert werden. Um die unspezifische Absorption des Antikörpers an die Membran zu verhindern, wurde zuerst die Membran durch eine Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur in einem Blocking Reagenz abgesättigt. Für den Protein-Nachweis wurde die Membran mit einem primären Antikörper, der gegen das gesuchte Protein gerichtet ist, inkubiert. Die Detektion der Proteine wurde anschließend mit Meerrettichperoxidase konjugierten sekundären Antikörper durchgeführt. Die Peroxidase oxidiert das im Färbereagenz enthaltene Luminol und erzeugt damit die Chemilumineszenz, die anschließend auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden kann. Proteintransfer auf Nitrocellulosemembran: Der Transfer der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran wurde mit dem Verfahren nach Towbin [120] durchgeführt. Hierfür wurden eine Nitrocellulosemembran, das SDS-Gel und das Whatman-Papier in Transferpuffer getränkt, anschließend luftblasenfrei in eine Sandwichform angeordnet und in einen Rahmen gespannt (siehe Abb. 2.6). Anschließend wurde das Sandwich in eine mit kaltem Transferpuffer gefüllte Blot-Kammer eingesetzt. Der Transfer der Proteine aus dem SDS-Gel auf die Membran erfolgte für 1 h bei konstanter Spannung von 100 V bei 4 °C. Um die Wärmeentwicklung während des Verfahrens zu verhindern, wurde die Kammer mit Eis gekühlt. Abb.2.6: Aufbau des Western Blots. 42 Material und Methoden Die Überprüfung der Qualität des Proteintransfers auf der Membran wurde mit Ponceau S Färbung durchgeführt. Hierfür wurde die Membran für 1 min mit dem Farbstoff inkubiert. Anschließend konnte das ungebundene Ponceau S von der Membran mit Wasser entfernt werden. Die gefärbten Proteinbanden wurden zur Dokumentation eingescannt und danach wurde der Farbstoff mit TBST wieder vollständig ausgewaschen. Immundetektion Die Immundetektion der gesuchten Proteine auf der Nitrocellulosemembran erfolgte mit Hilfe spezifischer Antikörper. Hierzu wurde die Membran nach dem Proteintransfer mit 5 %iger Milch-TBST für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzusättigen. Nach dem Waschen der Membran, fünfmal für 5 min mit TBST, erfolgte über Nacht bei 4 °C die Inkubation mit dem primären Antikörper. Der Antikörper wurde entsprechend den Herstellerangaben verdünnt. Anschließend wurde der ungebundene Antikörper durch Waschen mit TBST entfernt und die Membran bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Meerrettichperoxidase gekoppelten sekundären Antikörper (1:5000 verdünnt in 5 % Milch/TBST) inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte der Nachweis der Antikörperkomplexe mit einem ECL-Western-Blot-Detektion-Kit. Für die Detektion der Proteine wurde die Membran mit dem Färbereagenz für 1 min inkubiert, in eine Filmkassette reingelegt und auf einen Röntgenfilm gelegt. Hierbei erzeugte die Meerrettichperoxidase des sekundären Antikörpers mit dem Färbereagenz die Lumineszenz, die anschließend mittels Autoradiographie nachgewiesen werden konnte. Entfernen gebundener Antikörper („stripping“) Das Entfernen gebundener Antikörper durch sogenanntes „stripping“ von der Western-BlotMembran dient dazu, bereits gebundene Antikörper zu entfernen und ermöglicht so die Detektion mit einem anderen Primärantikörper. So kann z. B eine quantitative Aussage zur Phosphorylierung eines Proteins getroffen werden, in dem die gleiche Membran zuerst mit einem phosphospezifischen Antikörper und anschließend nach dem Entfernen erneut mit einem Antikörper auf das Gesamtprotein behandelt wird. Dazu wurde die Membran dreimal 5 min mit 1 x TBST gewaschen und danach im StrippingPuffer bei 65 °C für 30 min inkubiert. Anschließend wurde die Membran dreimal 5 min mit 1 x TBST gewaschen, erneut für 1 h in 5 % Milchpulver in 1 x TBST bei RT blockiert und wieder gewaschen. Abschließend erfolgte die erneute Inkubation der Membran mit dem Primär- und Sekundärantikörper (siehe: Immundetektion. 43 Material und Methoden 2.2.6.5 Densitometrische Auswertung der Bandintensitäten Die Intensitäten einzelner Banden wurden mit der Software SigmaGel (SPSS Inc., Chicago, USA) densitometrisch ausgewertet. Hierbei wurde die Bandenintensität in der Reperfusionsprobe auf die Baselineprobe (Probe vor der Ischämie) bezogen. Anschließend wurden die Unterschiede des Proteingehaltes zwischen den einzelnen phosphorylierten Banden mit den gemessenen Bandenintensitäten der entsprechend unphosphorylierten Form korrigiert. 2.2.7 Statistik Die statistische Auswertung wurde mit SigmaStat (SPSS Inc., Chicago, USA) durchgeführt und alle Daten sind als Mittelwert mit Standardabweichung (SD, standard deviation) angegeben. Die Unterschiede von Infarktgrößen, Troponin-Werten, Akt- und ERK 1/2Phosphorylierung zwischen den einzelnen Gruppen wurden mittels one-way-ANOVA mit Fisher’s LSD post hoc Test analysiert. Bei den Kaninchenexperimenten wurden die Herzfrequenz und der Blutdruck gemessen und die Unterschiede zwischen den Gruppen mittels two-way-ANOVA ausgewertet. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant bewertet. 44 Ergebnisse 3 Ergebnisse Ziel dieser Arbeit war es, die kardioprotektive Wirkung von MineralokortikoidrezeptorAntagonisten (MR-Antagonisten) am Beispiel von Eplerenon und Canrenoat in verschiedenen Tiermodellen zu untersuchen und deren Wirkungsweisen genauer zu charakterisieren. Es wurde untersucht, ob die bekannten Elemente der Prä- und Postkonditionierung, PKC, PI3Kinase, ERK 1/2 und Akt zum Myokardschutz beitragen. Zum besseren Verständnis ist der Signalweg in der Abb. 3.1 schematisch dargestellt. Die verwendeten Inhibitoren Chelerythrine, Wortmannin, U0126 sind ebenfalls abgebildet. Des Weiteren wurde die Rolle des Adenosinsrezeptors während der Reperfusion mittels Adenosinrezeptor-Antagonisten und mit Hilfe der CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse geklärt. CD73-/--Mäuse sind nicht fähig extrazelluläres Adenosin zu bilden, welches ein wichtiger Mediator in der Prä- und Postkonditionierung ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen das Gen für den A2bAdenosinrezeptor deletiert. Als letztes wurde die Rolle des Aldosterons bei dem durch die MR-Antagonisten vermittelten Myokardschutz untersucht. MR-Antagonist Adenosin (Eplerenon, Canrenoat) AdenosinRezeptor MR-Rezeptor PI3Kinase Wortmannin Akt Chelerythrine U0126 PKC ERK 1/2 Myokardprotektion Abb. 3.1: Hypothetischer Signalweg der MR-Antagonisten vermittelten Myokardprotektion während der Reperfusion. 45 Ergebnisse 3.1 Genotyp-Identifizierung Die Untersuchungen am in situ Mausmodell wurden unter anderen an A2bAR-/-- und CD73-/-Mäusen durchgeführt. Sie stammen ursprünglich aus C57/BL6N-Mäusen, die dann dementsprechend als Wildtyp-Mäuse benutzt wurden. Mit entsprechenden Primern konnte die PCR durchgeführt und der Genotyp identifiziert werden. Dabei konnte durch die CD73+/+ forward und CD73+/+ reverse Primer bei den Wildtyp-Mäusen ein Genfragment mit 190 Basenpaaren (Bp) amplifiziert werden, welches dem vollständigen Genabschnitt entspricht. Mit dem Primer CD73-/- forward und CD73-/- reverse wurde der 280 Bp lange Genabschnitt der CD73-/--Mäuse nachgewiesen. Bei den Wildtyp- und knockout-Mäusen wurde der gleiche reverse Primer A2bAR gemeinsam verwendet. Um die A2bAR+/+-Maus zu identifizieren, wurde der A2bAR+/+ forward Primer mitgeführt und das damit amplifizierte Genfragment war 247 Bp groß, welches dem vollständigen Genabschnitt entspricht. Dagegen ergab der bei der A2bAR-/--Maus verwendete zweite A2bAR-/- forward Primer ein Genfragment von 417 Bp. Nach erfolgreicher Genotypisierung konnten die Tiere zu Versuchen oder zur weiteren Nachzucht eingesetzt werden. A) B) [Bp] 500 400 320 242 190 Maus: PCR Primer: [Bp] 500 400 320 242 (-/-) (-/-) (+/+) (+/+) + + - Maus: PCR Primer: (-/-) (-/-) (+/+) (+/+) + + - Abb. 3.2: Genotyp-Bestimmung nach der PCR-Analyse. A) Genotypisierung der CD73-Mäuse, B) Genotypisierung der A2bAR-Mäuse. Von links nach rechts: Bande 1) DNA-Marker, Bande 2) KnockoutMaus (-/-) mit PCR-Primer für Wildtyp (+), Bande 3) Knockout-Maus (-/-) mit PCR-Primer für Knockout (-). 4) Wildtyp-Maus (+/+) mit PCR-Primer für Wildtyp (+), Bande 5) Wildtyp-Maus (+/+) mit PCR-Primer für Knockout (-). 46 Ergebnisse 3.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Eplerenon während der Reperfusion In dieser Studie sollte die Postkonditionierung mit dem Mineralokortikoidrezeptor-Antagonist Eplerenon untersucht werden. Eplerenon unterbindet die negative Wirkung von Aldosteron und kann zu einem Myokardschutz in der frühen Reperfusion führen. Um das zu untersuchen, sollte getestet werden, ob Eplerenon in isolierten Rattenherzen seine schützende Wirkung zeigt und ob bei dem Schutz bekannte Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung beteiligt sind. Des Weiteren wurde die Rolle des Adenosins in isolierten Rattenherzen mit SPT und in den 5‘-Ektonukleotidase knockout-Mäusen (CD73-/--Mäusen) in einem in situ Mausmodell untersucht. Diese Mäuse sind nicht in der Lage extrazelluläres Adenosin zu bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. 3.2.1 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen Um zu ermitteln, ob der MR-Antagonist Eplerenon (EPL) die protektive Wirkung über den bekannten protektiven Signalweg ausübt, wurden die an der Langendorff-Anlage perfundierten Rattenherzen einer Ischämie durch 30 min Okklusion der linken Koronararterie mit nachfolgender 2 h Reperfusion ausgesetzt und die Infarktgröße wurde bestimmt. Kontrolle Eplerenon Eplerenon Inhibitor Eplerenon Eplerenon + Inhibitor Inhibitor Inhibitor -30 0 +20 +25+30 +40 Zeit (min) Abb. 3.3: Schematische Darstellung der Versuche in isolierten Rattenherzen. +150 47 Ergebnisse Zuerst wurde die kardioprotektive wirksame Dosis von Eplerenon in perfundierten Rattenherzen ermittelt. Eplerenon wurde für 2 h perfundiert beginnend 5 min vor Ende der 30-minütigen Ischämiephase. Durch die Behandlung mit 10 µM Eplerenon zeigte sich hierbei im Vergleich zur Kontrollgruppe eine ca. 75 %ige Reduktion der Infarktgröße (siehe Anhang, Tab. 7.1). Dagegen wirkte Eplerenon bei einer niedrigeren Konzentration von 1 µM nicht kardioprotektiv. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.4 graphisch dargestellt. Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL [1 µM] EPL [10 µM] Abb. 3.4: Kardioprotektive Wirkung von Eplerenon in isolierten Rattenherzen. Die Behandlung mit 10 µM Eplerenon führt zu einer sichtbaren Reduktion der Infarktgröße (*** p < 0,001 vs. Kontrolle). 1 µM Eplerenon hingegen wirken nicht protektiv. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Zuerst sollte an isolierten Rattenherzen untersucht werden, welche Elemente des Signalweges an einer Eplerenon vermittelten Myokardprotektion beteiligt sind. Hierfür kamen mehrere pharmakologische Inhibitoren bekannter Signaltransduktion zum Einsatz. Zuerst wurde die Rolle von PKC mit Chelerythrine (2,8 µM) untersucht. Als nächstes wurde mit Wortmannin (100 nM) und U0126 (500 nM) getestet, ob die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon ebenfalls von der Kinase PI3K/Akt und Mek/ERK abhängig ist. Zum Schluss wurde mit Hilfe von einem nicht selektiven Adenosinrezeptor-Antagonist SPT (100 μM) die Rolle vom Adenosinrezeptor untersucht. 48 Ergebnisse Um den schützenden Eplerenon vermittelten Signalweg besser zu erforschen, wurde zuerst die Rolle der Protein Kinase C (PKC) mit einem unspezifisch wirkendem PKC-Inhibitor Chelerythrine untersucht. Hierfür wurden die isolierten Rattenherzen mit 2,8 µM Chelerythrine perfundiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Perfusion von Chelerythrine mit Eplerenon die protektive Wirkung von Eplerenon aufhebt, was darlegt, dass auch PKC bei dem schützenden Signalweg beteiligt ist. Chelerythrine allein verabreicht, zeigte keinen Effekt auf diesen Parameter. Die Ergebnisse des Versuches sind in Abb. 3.5 graphisch dargestellt, die Mittelwerte ± SD sind im Anhang in der Tab. 7.1 zusammengefasst. Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL [10 µM] EPL [10 µM] + CHEL CHEL Abb. 3.5: Effekt des PKC-Inhibitors Chelerythrine auf die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon. Eplerenon vermittelter Myokardschutz ((10 µM); *** p < 0,001 vs. Kontrolle) wird durch die gleichzeitige Zugabe von Chelerythrine (CHEL, 2,8 µM) blockiert. CHEL alleine verabreicht zeigt keinen Effekt auf die Infarktgröße. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Als nächstes wurde getestet, ob bei dem Eplerenon vermittelten Myokardschutz die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3-Kinase) beteiligt ist. Um das zu untersuchen, wurde Wortmannin - ein spezifischer Phosphoinositid-3-Kinase Inhibitor - verwendet. Hierfür wurden die isolierten Rattenherzen mit 10 μM Eplerenon und 100 nM Wortmannin perfundiert. Die Rattenherzen präsentieren eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Infarktgröße, so dass eine Mitwirkung der Phosphoinositid-3-Kinase angenommen werden kann. Wortmannin allein verabreicht, zeigte kein Effekt auf diesen Parameter. Die Ergebnisse 49 Ergebnisse sind in Abb. 3.6 graphisch dargestellt, die Mittelwerte ± SD sind in Tab. 7.1 (Anhang) zusammengefasst. Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL [10 µM] EPL [10 µM] + WORT WORT Abb. 3.6: Effekt des PI3-Kinase-Inhibitors Wortmannin auf die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon. Eplerenon vermittelter Myokardschutz ((10 µM); *** p < 0,001 vs. Kontrolle) wird durch die gleichzeitige Zugabe von Wortmannin (WORT, 100 nM) blockiert. Der Inhibitor alleine verabreicht, zeigt keinen Effekt auf die Infarktgröße. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Es konnte gezeigt werden, dass bei dem Eplerenon vermitteltem Myokardschutz auch ERK 1/2-Kinase beteiligt ist. Dies konnte mit einem hochselektiven Inhibitor für ERK 1/2-Kinase U0126 nachgewiesen werden. Um die unspezifische Wirkung des Inhibitors auszuschließen, wurde U0126 auch alleine verabreicht. Die Ergebnisse der Infarktgrößenmessung sind in Abb. 3.7 graphisch dargestellt und in Tab. 7.1 (Anhang) zusammengefasst. 50 Ergebnisse Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL [10 µM] EPL [10 µM] + U0126 U0126 Abb. 3.7: Effekt des ERK 1/2-Inhibitors U0126 auf die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon. Eplerenon vermittelter Myokardschutz ((10 µM); *** p < 0,001 vs. Kontrolle) wird durch die gleichzeitige Zugabe von U0126 (500 nM) blockiert. U0126 alleine verabreicht zeigt keinen Effekt auf die Infarktgröße. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Zum Schluss kam der Adenosinrezeptorinhibitor SPT (100 µM) (8-(p-Sulfophenyl)theophylline hydrate) zum Einsatz. Dabei zeigte sich eine deutliche Blockade des Eplerenon vermittelten Myokardschutzes, wenn Eplerenon mit SPT perfundiert wurde (siehe Anhang, Tab. 7.1). Der SPT Inhibitor zeigte allein, wie erwartet, keinen Einfluss auf die Infarktgröße. Die spezifische Inhibition des Eplerenon vermittelten Myokardschutzes ist in Abb. 3.8 graphisch dargestellt. 51 Ergebnisse Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL [10 µM] EPL [10 µM] + SPT SPT Abb. 3.8: Effekt des Adenosinrezeptor-Inhibitors SPT auf die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon.. Eplerenon vermittelter Myokardschutz ((10 µM); ***p < 0,001 vs. Kontrolle) wird durch die gleichzeitige Zugabe von SPT (100 μM) blockiert. SPT alleine verabreicht zeigt keinen Effekt auf die Infarktgröße. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.2.2 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in CD73-/--Mäusen In dieser Studie wurde die Rolle des Adenosins bei dem Myokardschutz nach der Behandlung mit Eplerenon in CD73-/--Mäusen untersucht. Dabei wurden 10 µM Eplerenon 5 min vor Ende der 30-minütigen Ischämiephase als 100 µl Bolus injiziert, gefolgt durch weitere Infusion 1 µl/min während der 2-stündigen Reperfusion. Hierbei zeigte sich eine erfolgreiche Reduktion der Infarktgröße von 7,9 ± 3,8 % in den Wildtyp-Mäusen im Vergleich mit der Kontrollgruppe von 37,8 ± 7,5 % (siehe Anhang, Tab. 7.2). Damit konnte die Infarktgröße um fast 79 % reduziert werden. Dagegen wirkte Eplerenon erwartungsgemäß bei den CD73-/-Mäusen nicht kardioprotektiv. Die in der Abb. 3.9 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen für die Kontrolle in den CD73-/--Mäusen eine Infarktgröße von 33,0 ± 10,0 % und nach der Behandlung mit 10 µM Eplerenon war die Infarktgröße bei diesem Mäusestamm unverändert (34,0 ± 6,1 %). 52 Ergebnisse Bolus (i.v.) 0.278 mg/kg A) Infusion (i.v.) 0.576 mg/kg B) Infarktgröße [% vom Risikoareal] 30 min Ischämie 2 h Reperfusion 50 40 30 20 *** 10 0 Kontrolle EPL Kontrolle Wildtyp EPL CD73-/-/- Abb. 3.9: Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit Eplerenon in CD73 Mäusen. A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Behandlung der Wildtyp-Mäuse (CD73+/+) mit 100 µl Bolus (i.v.) 0.278 mg/kg nach 25 min Ischämie und folgender Infusion (i.v.) 0.576 mg/kg während der Reperfusion -/führt zur signifikanten Reduktion der Infarktgröße (*** p < 0,001 vs. Kontrolle). Die Behandlung der CD73 Mäuse mit gleicher Eplerenon Konzentration hingegen zeigt keine Myokard schützende Wirkung im Vergleich mit der Kontrolle. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.2.3 Western Blot Analyse isolierter Rattenherzen Nächstes Ziel dieses Projektes war es, weitere wichtige Signalelemente des Eplerenon vermittelten Myokardschutzes mit der Western Blot Analyse zu identifizieren. Da die Kinase ERK 1/2 durch die Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen bereits identifiziert werden konnte, sollte getestet werden, ob die Bindung des Eplerenon an den Mineralokortikoidrezeptor zu einer erhöhten ERK 1/2 Phosphorylierung führt. Des Weiteren sollte die Phosphorylierung der Kinase Akt untersucht werden. 53 Ergebnisse 3.2.3.1 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von Akt Die Infarktgrößenbestimmung zeigte einen Eplerenon vermittelten Myokardschutz. Hier sollte untersucht werden, ob eine Behandlung der isolierten Rattenherzen zu einer AktPhosphorylierung führt. Für die Kinase Akt konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit 10 µM Eplerenon während der Reperfusion die Phosphorylierung im Myokard deutlich erhöht. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Abb. 3.10 graphisch dargestellt, die Mittelwerte ± SD sind in Tab. 7.3 im Anhang zusammengefasst. phospho-Akt / AKT (x Baseline) A) 12 *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle EPL B) phospho-Akt Akt Kontrolle EPL BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.10: Effekt von Eplerenon auf die Akt-Phosphorylierung: A) Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem Akt zu Gesamt-Akt bezogen auf die Baseline (BL) während der Reperfusion (RP). B) Repräsentative Western Blots der entsprechenden Gruppen. Eplerenon (10 μM) führt während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Akt-Phosphorylierung (*** p < 0.001 vs. Kontrolle). Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 54 Ergebnisse 3.2.3.2 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2 Die Herzen der Kontrollgruppe wurden nach der Behandlung mit Eplerenon auf die Phosphorylierung der beiden Isoformen ERK 1 und ERK 2 mit der Western Blot Analyse untersucht. Die Perfusion mit Eplerenon zeigte während der Reperfusion auf der Proteinebene eine erhöhte und signifikante Intensität der Phosphorylierung beider Isoformen. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.11 graphisch dargestellt und im Anhang 7.4 zusammengefasst. phospho-ERK / ERK (x Baseline) A) 12 *** *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle EPL Kontrolle ERK 2 ERK 1 B) EPL phospho-ERK ERK phospho-ERK 1 Kontrolle phospho-ERK 2 Kontrolle EPL ERK 1 ERK 2 EPL BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.11: Effekt von Eplerenon auf die ERK-Phosphorylierung: A) Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem ERK zu Gesamt-ERK bezogen auf die Baseline (BL) während der Reperfusion (RP). B) Repräsentative Western Blots der entsprechenden Gruppen. Eplerenon (10 μM) führt während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung beider ERK-Isoformen ERK 1 und ERK 2 (*** p < 0.001 vs. Kontrolle). Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Ergebnisse 55 3.3 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion In dieser Studie wurde ein weiteres Mineralokortikoidrezeptor-Antagonist, das KaliumCanrenoat (CAN), auf die kardioprotektive Wirkung in der frühen Reperfusion untersucht. Zuerst mußte die schützende Dosis herausgefunden werden. Die Wirkung des Canrenoats sollte dann in verschiedenen Tiermodellen untersucht werden: in einem in situ Mausmodell, in isolierten Rattenherzen und in einem in situ Kaninchenmodell. Des Weiteren wurden die schützenden Elemente der Signalkaskade untersucht. Unter Verwendung der CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen sollte die Rolle von Adenosin überprüft werden. Mit der Western Blot Analyse konnte getestet werden, ob auch CAN zu erhöhter Phosphorylierung der Kinasen Akt und ERK 1/2 führt. CAN ist ein aktives Metabolit des Spironolactons und wird bereits in der Klinik als Diuretika für die Behandlung von Hyperaldosteronismus, Leberzirrhose und Ödemen angewendet. 3.3.1 Dosenabhängige Infarktgrößenbestimmung in in situ Mausmodell Um die maximale Reduktion der Infarktgröße mit Canrenoat zu erreichen, wurden zuerst verschiedene Konzentrationen getestet. Hierfür wurde 5 min vor Ende der 30-minütigen Ischämiephase intravenös ein Bolus mit jeweiliger Canrenoat-Dosis injiziert (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg und 10 mg/kg) gefolgt von einer 2-stündigen Reperfusion. In diesem Versuch wurde die größte Reduktion der Infarktgröße mit 1 mg/kg Canrenoat im Vergleich zur Kontrollgruppe erreicht (siehe Anhang, Tab. 7.5). Mit dieser CanrenoatKonzentration behandelte Mäuse hatten die Infarktgröße von 6,7 ± 4,7 % und waren damit um ca. 80 % kleiner als die Kontrollgruppe (37,8 ± 7,4 %). Am Ende des Versuches wurde der Maus aus der Bauchaorta Blut entnommen und daraus Blutplasma gewonnen. Im Blutplasma wurde dann das kardiale Troponin, als Marker für die Infarktgröße, bestimmt. Hierbei zeigte sich, dass die Troponin-Werte die Infarktgrößen widerspiegelten (siehe Abb. 3.12). Die Troponin-Werte nach der Behandlung der Mäuse mit 1mg/kg Canrenoat zeigten signifikante Reduktionen (siehe Anhang, Tab. 7.6). Die Ergebnisse sind in Abb. 3.12 graphisch dargestellt. 56 Ergebnisse Canrenoat Bolus (i.v.) A) B) Infarktgröße [% vom Risikoareal] 30 min Ischämie 2 h Reperfusion 50 40 *** 30 *** 20 *** *** 10 0 Kontrolle 0,003 0,03 0,3 1 10 C) Kardiales Troponin I (µg/L Plasma) Canrenoat (mg/kg) 400 300 200 * 100 0 Kontrolle 0,003 0,03 0,3 1 Canrenoat (mg/kg) Abb. 3.12.: Dosenabhängige Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit unterschiedlichen Canrenoat-Konzentrationen. A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Behandlung der Mäuse mit 1 mg/kg Canrenoat führt zu höchsten Reduktion der Infarktgröße (*** p < 0,001 vs. Kontrolle). Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal dargestellt. C) Die Messung des kardialen Troponins zeigt nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat eine signifikante Reduktion im Vergleich zur Kontrollgruppe (* p < 0,05 vs. Kontrolle). Die jeweiligen Mittelwerte ± SD sind dargestellt. Ergebnisse 57 3.3.2 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung bei verschiedenen Zeitpunkten Weiterhin sollte getestet werden, ob die kardioprotektive Dosis von 1 mg/kg Canrenoat auch noch in der Reperfusion eine entsprechende Wirkung zeigt. Hierfür wurde der MR-Antagonist zu drei verschiedenen Zeitpunkten injiziert: nach 25 min Ischämie, direkt am Anfang bei 0 min Reperfusion und erst nach 15 min Reperfusion. Bei der Kontrollgruppe lag die Infarktgröße bei 37,8 ± 7,4 %. Die Behandlung mit Canrenoat nach 25 min Ischämie ergab eine signifikante Reduktion der Infarktgröße auf 6,7 ± 4,7 %. Dagegen zeigte die Injektion von Canrenoat zu beiden Zeitpunkten der Reperfusion keinen Myokardschutz mehr (siehe Anhang, Tab. 7.7). Die im Blutplasma gemessenen Troponin-Werte bestätigen die Größen der Infarkte. Die signifikante Reduktion der Troponin-Werte wurde nach der Injektion von Canrenoat nach 25 min Ischämie (244,53 ± 58,1 %) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (42,40 ± 17,3 %) erzielt. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.13 graphisch dargestellt. 58 Ergebnisse A) Canrenoat Bolus (i.v.) B) Infarktgröße [% vom Risikoareal] 30 min Ischämie 2 h Reperfusion 5 4 ** * 3 2 *** 1 0 Kontrolle Canrenoat (mg/kg) 0´ RP 25´ I 15´ RP Kardiales Troponin I (µg/L Plasma) C) 400 300 200 * 100 0 Kontrolle Canrenoat (mg/kg) 25´ I 0´ RP 15´ RP Abb. 3.13: Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit Canrenoat bei verschiedenen Zeitpunkten. A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Behandlung der Mäuse mit 1 mg/kg Canrenoat nach 25 min Ischämie führt zur signifikanten Reduktion der Infarktgröße (*** p < 0,001 vs. Kontrolle). Die Injektion während der Reperfusion bei 0 min und nach 15 min zeigt signifikante Werte, aber der Myokardschutz war nicht mehr vorhanden. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal. C) Die Messung der Troponin-Werte zeigt nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat nach 25 min Ischämie auch eine signifikante Reduktion im Vergleich zur Kontrollgruppe (* p < 0,05 vs. Kontrolle). Die jeweiligen Mittelwerte ± SD sind dargestellt. 59 Ergebnisse 3.3.3 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in CD73-/--Mäusen In dieser Testreihe sollte in CD73-/--Mäusen untersucht werden, ob Adenosin auch bei der kardioprotektiven Wirkung von Canrenoat beteiligt ist. CD73 ist zuständig für die Bildung extrazellulären Adenosin, das bei einer Ischämie vermehrt produziert wird und damit zum Myokardschutz beiträgt. Canrenoat Bolus (i.v.) A) B) Infarktgröße [% vom Risikoareal] 30 min Ischämie 2 h Reperfusion 60 50 40 30 ** 20 10 0 Kontrolle CAN Wildtyp Kontrolle CAN CD73-/- Abb. 3.14: Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit Canrenoat in CD73-/-Mäusen A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Behandlung der Mäuse mit 1 mg/kg Canrenoat nach 25 min Ischämie führt zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße (** p < 0,01 vs. Kontrolle). Die Behandlung der CD73-/--Mäuse mit Canrenoat zeigt keine Myokard schützende Wirkung im Vergleich mit der Kontrolle. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Hierfür wurden die Mäuse nach 30-minütiger Ischämiephase der 2-stündigen Reperfusion ausgesetzt. Die in der Abb. 3.14 graphisch dargestellten Werte zeigen, dass bei der Wildtypgruppe mit 1 mg/kg Canrenoat behandelte Herzen eine signifikante Reduktion der Infarktgröße von 14,9 ± 8,8 % aufweisen, im Vergleich mit der Kontrollgruppe 32,0 ± 7,0 %. 60 Ergebnisse Dagegen zeigte Canrenoat bei den CD73-/--Mäusen keine schützende Wirkung (40,1 ± 6,2 %), was dafür spricht, dass Adenosin auch bei dem durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz eine wichtige Rolle spielt (siehe Anhang, Tab. 7.9). 3.3.4 Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell in A2bAR-/--Mäusen Die Aktivierung des Adenosin-A2b-Rezeptors (A2bAR) spielt eine Schlüsselrolle bei dem schützenden Signaltransduktionsweg während der Reperfusion. Daher sollte studiert werden, ob der A2bAR auch zu der kardioprotektiven Wirkung des Canrenoats beiträgt. Für diese Untersuchung wurden A2bAR-/--Mäuse verwendet. Auch hier wurden die Mäuse einer 30-minütigen Ischämie und einer 2-stündigen Reperfusion ausgesetzt. Die Kontrollgruppe blieb nach der Ischämie unbehandelt, dagegen wurde der Canrenoat-Gruppe 5 min vor Ende der Ischämie ein Canrenoat-Bolus (1 mg/kg) i.p. injiziert. Bei der Canrenoat-Gruppe der Wildtyp-Mäuse konnte eine signifikante Reduktion der Infarktgröße von 14,9 ± 8,8 %, im Vergleich mit der Kontrolle (32,0 ± 7,0 %) gemessen werden. Bei den A2bAR-/--Mäusen konnte nach der Behandlung mit Canrenoat dieser Effekt nicht gemessen werden. Hier zeigen die mit Canrenoat behandelten Mäuseherzen eine Infarktgröße im Risikoareal von 40,3 ± 9,2 %, die mit der Kontrollgruppe von 41,7 ± 10,6 % vergleichbar ist (siehe Anhang, Tab. 7.10). Die Ergebnisse sind in der Abb. 3.15 graphisch dargestellt. 61 Ergebnisse A) Canrenoat Bolus (i.v.) B) Infarktgröße [% vom Risikoareal] 30 min Ischämie 2 h Reperfusion 60 50 40 30 ** 20 10 0 Kontrolle CAN Wildtyp Kontrolle CAN A2bAR-/- Abb. 3.15: Infarktgrößenbestimmung im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit Canrenoat in A2bAR-/-Mäusen A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Behandlung der Mäuse mit 1 mg/kg Canrenoat nach 25 min Ischämie führt zur signifikanten Reduktion der Infarktgröße (** p < 0,01 vs. Kontrolle). Die Behandlung der A2bAR-/--Mäuse mit Canrenoat zeigt dagegen keine Myokard schützende Wirkung im Vergleich mit der Kontrolle. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.3.5 Infarktgrößenbestimmung in in situ Kaninchenherzen In einer weiteren Studie wurde die protektive Wirkung von Canrenoat in der frühen Phase der Reperfusion in einem in situ Kaninchenmodell untersucht. Dabei wurden die Tiere 5 Minuten vor der Reperfusion mit 1 mg/kg Canrenoat behandelt. Bei dem akuten Herzinfarkt wurden die Infarktgrößen nach 4 Stunden Reperfusion gemessen, während bei dem chronischen Herzinfarkt die Infarktgrößen erst nach 72 h bestimmt wurden. Die Abbildung 3.16 zeigt, dass in beiden Modellen die Infarktgrößen im Vergleich mit der Kontrolle signifikant reduziert werden konnten. 62 Ergebnisse A) Canrenoat 1 mg/kg Bolus (i.v.) 30 min Ischämie B) 4 h oder 72 h Reperfusion Infarktgröße [% vom Risikoareal] 80 60 * * 40 20 0 Kontrolle CAN 4 h Reperfusion Kontrolle CAN 72 h Reperfusion Abb. 3.16: Infarktgrößenbestimmung im in situ Kaninchenmodell nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat A) Das experimentelle Protokoll. B) Die Kaninchen der Canrenoat-Gruppe wurden nach 25 min Ischämie mit 1mg/kg Canrenoat behandelt. Das akute Modell, zeigt (4 h Reperfusion) eine signifikante Reduktion der Infarktgröße (* p < 0,05 vs. Kontrolle). Im chronischen Modell (72 h Reperfusion) zeigt Canrenoat auch eine Infarkt reduzierende Wirkung (* p < 0,05 vs. Kontrolle). Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.3.6 Bestimmung der hämodynamichen Parameter im in situ Kaninchenmodell Um die Wirkung von Kalium-Canrenoat genauer beurteilen zu können, wurden zusätzlich hämodynamische Parameter bestimmt. Dabei wurden in einem akuten und chronischen Kaninchenmodell die Herzfrequenz und der mittlere Blutdruck gemessen. Verglichen wurden Kontrollgruppe und Canrenoat-Gruppe kurz vor der Ischämie als Baseline, nach 5 min, 15 min, 29 min Ischämie und nach 30 min Reperfusion. Dabei zeigte sich nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat kein signifikanter Unterschied in Bezug auf die Herzfrequenz zwischen der Canrenoat-Gruppe und den Kontrollen. Vergleicht man die Herzfrequenz vor der Ischämie, während der Ischämie und während der Reperfusion, erkennt 63 Ergebnisse man ebenfalls keinen signifikanten Unterschiede. Der mittlere Blutdruck wird aus der Summe des systolischen und des diastolischen arteriellen Blutdruckes mit Division durch 2 berechnet. Auch hier zeigten sich keine signifikanten Differenzen zwischen den Canrenoat-Gruppen und den Kontrollgruppen in den Kaninchenherzen. Herzfrequenz und mittlere arterieller Blutdruck sind in der Tabelle 3.1 dargestellt. Tabelle 3.1: Hämodynamische Parameter während Ischämie und Reperfusion nach intravenöser Zugabe von Kalium-Canrenoat. Baseline Ischämie 5 min Ischämie 15 min Ischämie 29 min Reperfusion 30 min Herzfrequenz (Schläge/min) Akuter Myokardinfarkt mit 30 min Ischämie und 4 h Reperfusion Kontrolle 248 ± 40 243 ± 22 247 ± 22 239 ± 29 235 ± 16 Canrenoat 256 ± 23 250 ± 24 246 ± 26 242 ± 13 222 ± 29 Chronischer Myokardinfarkt mit 30 min Ischämie und 72 h Reperfusion Kontrolle 242 ± 26 240 ± 22 239 ± 40 233 ± 26 218 ± 29 Canrenoat 248 ± 22 234 ± 29 234 ± 24 231 ± 24 222 ± 24 Mittlerer arterieller Blutdruck (mmHg) Akuter Myokardinfarkt mit 30 min Ischämie und 4 h Reperfusion Kontrolle 70 ± 11 62 ± 13 62 ± 13 61 ± 13 62 ± 11 Canrenoat 74 ± 15 61 ± 4 60 ± 2 69 ± 7 66 ± 7 Chronischer Myokardinfarkt mit 30 min Ischämie und 72 h Reperfusion Kontrolle 76 ± 13 69 ± 9 65 ± 9 64 ± 9 61 ± 4 Canrenoat 75 ± 13 69 ± 11 63 ± 11 63 ± 9 66 ± 7 3.3.7 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen Im Folgenden sollte getestet werden, ob sich die kardioprotektive Wirkung von Canrenoat auch in isolierten Rattenherzen zeigt. Dabei wurde das Rattenherz aus dem Tier (wie in 2.2.4 beschrieben) entnommen, mit der Aorta an die Langendorff-Anlage aufgehängt und mit einer 64 Ergebnisse Nährlösung retrograd perfundiert. Das experimentelle Protokoll ist in der Abbildung 3.17 dargestellt. Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 ** 30 ** 20 *** 10 0 Kontrolle CAN [10 µM] CAN [50 µM] SPIRO [10 µM] Abb. 3.17: Kardioprotektive Wirkung von Canrenoat und Spironolacton in isolierten Rattenherzen. Die Perfusion isolierter Rattenherzen mit Canrenoat (10 µM, 50 µM) oder mit Spironolacton (10 µM) führte in allen Gruppen zur signifikanten Reduktion der Infarktgröße (*** p < 0,001 vs. Kontrolle** p < 0,01 vs. Kontrolle). Die Rattenherzen zeigen nach der Behandlung mit 50 µM Canrenoat, wie erwartet, die größte Reduktion der Infarkte von 10,2 ± 3,8 %. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. Die Rattenherzen wurden einer 30-minütigen Ischämie und einer 2-stündigen Reperfusion ausgesetzt. Die Perfusion mit Canrenoat erfolgte 5 min vor dem Ende der Ischämie und während der ganzen Reperfusion. Hierbei zeigten beide getestete Canrenoat-Konzentrationen signifikante Reduktionen der Infarktgrößen, wobei die 50 µM Canrenoat-Konzentration am besten das Herz geschützt hat und im Vergleich mit der Kontrollgruppe (40,8 ± 5,3 %) zu einer 75 %igen Reduktion der Infarktgröße von 10,2 ± 3,8 % führte. Mit 10 µM Canrenoat betrug die Infarktgröße auch nur noch 21,4 ± 9,6 % (siehe Anhang, Tab. 7.12). Canrenoat ist ein aktiver Metabolit des Spironolactons. Um die Wirkung zu vergleichen, wurden die Rattenherzen mit 10 µM Spironolacton perfundiert. Auch hier zeigen die Ergebnisse (Abb. 3.17) eine signifikante Reduktion der Infarktgröße, die 17,9 ± 6,3 % betrug, und damit mit der Infarktgröße nach der Behandlung mit 10 µM Canrenoat vergleichbar ist. Ergebnisse 65 3.3.8 Western Blot Analyse isolierter Rattenherzen Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, wichtige Signalelemente des Canrenoat vermittelten Myokardschutzes mit der Western Blot Analyse zu identifizieren. Es sollte untersucht werden, ob die Blockade des Mineralkortikoidrezeptors mit Canrenoat zu einer Änderung der Phosphorylierung führt. Dabei wurde die Transaktivierung der beiden zellschützend wirkenden Kinasen Akt und ERK 1/2 untersucht. Für diese Untersuchung wurden aus dem linken Ventrikel die Biopsien nach 25 min Einschlagen (Baseline) und nach 10 min Reperfusion entnommen. Die unbehandelten Kontrollherzen wurden während der Reperfusion mit Canrenoat behandelten Herzen verglichen. Anschließend wurden die einzelnen Proteinproben auf Grad der Phosphorylierung der Kinase Akt und ERK 1/2 untersucht. 3.3.8.1 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von Akt Parallel zur Bestimmung der Infarktgröße konnte auch auf Proteinebene eine Canrenoat vermittelte Aktivierung nachgewiesen werden. Im Vergleich zu den Kontrollherzen führte die Behandlung mit 50 µM Canrenoat während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Akt-Phosphorylierung (siehe Abb. 3.18). 66 Ergebnisse phospho-Akt / AKT (x Baseline) A) 10 ** 8 6 4 2 0 Kontrolle CAN Akt phospho-Akt B) Kontrolle CAN BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.18: Effekt von Canrenoat auf die Akt-Phosphorylierung: A) Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem Akt zu Gesamt-Akt bezogen auf die Baseline (BL) während der Reperfusion (RP). B) Repräsentative Western Blots der entsprechenden Gruppen. Canrenoat (50 µM) führt während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Akt-Phosphorylierung (** p < 0.01 vs. Kontrolle). Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.3.8.2 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2 Weiterhin wurden die Rattenherzen nach der Behandlung mit Canrenoat auf die Phosphorylierung der beiden Isoformen ERK 1 und ERK 2 hin untersucht. Auch in diesem Fall zeigte eine Behandlung mit 50 µM Canrenoat in der Phase der Reperfusion, im Vergleich zu den Kontrollherzen, einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung beider Isoformen. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.19 graphisch dargestellt und im Anhang in der Tab. 7.14 zusammengefasst. 67 Ergebnisse phospho-ERK / ERK (x Baseline) A) *** 12 *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle CAN Kontrolle CAN ERK 1 B) ERK 2 ERK phospho-ERK phospho-ERK 1 phospho-ERK 2 Kontrolle CAN ERK 1 ERK 2 Kontrolle CAN BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.19: Effekt von Canrenoat auf die ERK-Phosphorylierung: A) Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem ERK zu Gesamt-ERK bezogen auf die Baseline (BL) während der Reperfusion (RP). B) Repräsentative Western Blots der entsprechenden Gruppen. Canrenoat (CAN, 50 µM) führt während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung beider ERK-Isoformen ERK 1 und ERK 2 (*** p < 0.001 vs. Kontrolle). Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.4 Wirkung von Aldosteron 3.4.1 Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen mit Eplerenon In dieser Studie sollte getestet werden, mit welcher Aldosteron-Konzentration Eplerenon von dem Mineralokortikoidrezeptor verdrängt wird und dadurch seine kardioprotektive Wirkung aufgehoben wird. Um das zu untersuchen, wurde Aldosteron mit Eplerenon gleichzeitig in isolierten Rattenherzen perfundiert und die Infarktgrößen bestimmt. Die Ergebnisse in der Abb. 3.20 zeigen, dass die gleichzeitige Zugabe von 50 nM Aldosteron die protektive Wirkung von Eplerenon nicht aufheben kann. Es gibt immer noch eine signifikante Reduktion der Infarktgröße von 15,2 ± 8,6 % im Vergleich mit der Kontrollgruppe von 40,8 ± 5,3 %. 68 Ergebnisse Erst mit der höheren Aldosteron-Dosis von 500 nM war es möglich, die Wirkung von Eplerenon zu inhibieren. Aldosteron allein zeigte keinen Effekt auf die Infarktgröße. Die Daten sind im Anhang Tab. 7.15 zusammengefasst. Infarktgröße [% vom Risikoareal] 50 40 30 *** 20 *** 10 0 Kontrolle EPL EPL + ALDO [50 nM] EPL + ALDO [500 nM] ALDO [500 nM] Abb. 3.20: Effekt von Aldosteron auf die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon. Der Eplerenon vermittelte Myokardschutz ((10 µM); *** p < 0,001 vs. Kontrolle) wird durch die gleichzeitige Zugabe von 50 nM Aldosteron (ALDO) nicht verändert. Die Perfusion mit 500 nM ALDO hingegen blockiert die schützende Wirkung von Eplerenon. Der Inhibitor alleine verabreicht zeigt keinen Effekt auf die Infarktgröße. Die offenen Kreise präsentieren die Infarktgrößen der einzelnen Herzen, die gefüllten Kreise stellen den Mittelwert der jeweiligen Infarktgrößengruppe dar. Dargestellt sind die Infarktgrößen der einzelnen Herzen als Prozent vom Risikoareal und die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 3.4.2 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von Akt In dieser Studie wurde die Wirkung von Aldosteron auf die Eplerenon vermittelte Phosphorylierung der survival Kinase Akt untersucht. Dabei zeigten mit 10 µM Eplerenon und 500 nM Aldosteron perfundierte Rattenherzen eine reduzierte Phosphorylierung der Akt, die mit der Kontrollgruppe vergleichbar war. Dagegen führte die Perfusion mit 10 µM Eplerenon zu erhöhter Phosphorylierung dieser Kinase. Bei gleichzeitiger Zugabe von Eplerenon und dem Inhibitor für PI3K/Akt, Wortmannin (WORT, 100 nM), wurde erwartungsgemäß die Phosphorylierung herabgesetzt. Aldosteron allein zeigte keine Wirkung auf die Akt-Phosphorylierung. Die Ergebnisse der mittleren Bandenintensitäten und die 69 Ergebnisse repräsentativen Western Blots sind in Abb. 3.21 graphisch dargestellt und im Anhang in der A) phospho-Akt / Akt (x Baseline) Tab. 7.16 nochmals zusammengefasst. 12 *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle EPL EPL+ EPL+ ALDO ALDO WORT phospho-Akt B) Akt Kontrolle EPL EPL + ALDO EPL + WORT ALDO BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.21: Effekt von Eplerenon auf die Akt-Phosphorylierung: A) Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem Akt zu Gesamt-Akt bezogen auf die Baseline (BL) während der Reperfusion (RP). B) Repräsentative Western Blots der entsprechenden Gruppen. Während Eplerenon (10 µM) in der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung der Akt-Kinase führt (*** p < 0,001 vs. Kontrolle), zeigen mit Aldosteron (ALDO, 500 nM) behandelte Herzen eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Phosphorylierung. Der Inhibitor Wortmannin (WORT; 100 nM; Inhibitor der PI3-Kinase) führte zu fast vollständiger Reduktion der Phosphorylierung. Aldosteron alleine übt auf Akt-Kinase keinen Effekt aus. Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 70 Ergebnisse 3.4.3 Eplerenon vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2 Zusätzlich wurde die Wirkung von Aldosteron auf die Eplerenon vermittelte Phosphorylierung der Kinase ERK 1/2 untersucht. Auch hier führte eine Behandlung mit 10 µM Eplerenon während der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung beider Isoformen. Vergleichbar mit den Ergebnissen der AktPhosphorylierung konnte mittels Aldosteron und Wortmannin auch hier eine komplette Blockade der ERK 1/2-Phosphorylierung beobachtet werden. Die Ergebnisse der mittleren Bandenintensitäten und die repräsentativen Western Blots sind in Abb. 3.22-3.24 graphisch phospho-ERK1 / ERK1 (x Baseline) dargestellt und im Anhang in der Tab. 7.17 zusammengefasst. 12 *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle EPL EPL+ EPL+ ALDO ALDO WORT Abb. 3.22: Effekt von Eplerenon auf die ERK 1-Phosphorylierung: Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem ERK 1 zu Gesamt-ERK 1 bezogen auf die Baseline während der Reperfusion. Während Eplerenon (10 µM) in der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der ERK 1-Phosphorylierung führt (*** p < 0,001 vs. Kontrolle), zeigen mit Aldosteron (ALDO, 500 nM) und mit Wortmannin (WORT; 100 nM; Inhibitor der PI3-Kinase) koinkubierte Herzen eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Phosphorylierungsstärke. Aldosteron alleine übt auf diese Kinase keinen Effekt aus. Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 71 phospho-ERK2 / ERK2 (x Baseline) Ergebnisse 12 *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle EPL EPL+ EPL+ ALDO ALDO WORT Abb. 3.23: Effekt von Eplerenon auf die ERK 2-Phosphorylierung: Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem ERK 2 zu Gesamt-ERK 2 bezogen auf die Baseline während der Reperfusion. Während Eplerenon (10 µM) in der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Erk-Phosphorylierung führt (*** p < 0,001 vs. Kontrolle), zeigen mit Aldosteron (ALDO, 500 nM) und mit Wortmannin (WORT; 100 nM; Inhibitor der PI3-Kinase) koinkubierte Herzen eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Phosphorylierungsstärke. Aldosteron alleine zeigt keine Wirkung auf diese Kinase. Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. ERK phospho-ERK phospho-ERK 1 phospho-ERK 2 Kontrolle EPL EPL EPL + ALDO EPL + ALDO EPL + WORT EPL + WORT ALDO ERK 1 ERK 2 Kontrolle ALDO BL 10´RP BL 10´RP Abb. 3.24: Die Abbildung zeigt repräsentative Western Blots für eine ERK 1/2-Phosphorylierung. Die Auswertung der mittleren Bandenintensitäten wurde für ERK1in der Abb. 3.22 und für ERK 2 in der Abb. 3.23 graphisch dargestellt. Die Abkürzung BL steht für Baseline und RP für Reperfusion. 72 Ergebnisse 3.4.4 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von Akt Um die Wirkung von Aldosteron auf der Proteinebene zu bestätigen, wurden die isolierten Rattenherzen mit 500 nM Aldosteron und 50 µM Canrenoat perfundiert. Dabei zeigte sich eine vollständige Blockade der Canrenoat vermittelten Akt-Phosphorylierung. Bei alleiniger Zugabe von 50 µM Canrenoat während der Reperfusion zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Phosphorylierung im Myokard. Um die unspezifische Wirkung des Inhibitors auszuschließen, wurde Aldosteron auch alleine verabreicht. Es zeigten sich keine Effekte auf die Infarktgröße. Die Ergebnisse der mittleren Bandenintensitäten sind in Abb. 3.25, die repräsentativen Western Blots in der Abb. 3.26 graphisch dargestellt und im Anhang Tab. 7.18 erneut phospho-Akt / Akt (x Baseline) zusammengefasst. 12 10 8 ** 6 4 2 0 Kontrolle CAN CAN+ ALDO ALDO Abb. 3.25: Effekt von Canrenoat auf die Akt-Phosphorylierung: Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem Akt zu Gesamt-Akt bezogen auf die Baseline während der Reperfusion. Während Canrenoat (50 µM) in der Reperfusion zu einem signifikanten Anstieg der Akt-Phosphorylierung führt (** p < 0,01 vs. Kontrolle), zeigen mit Aldosteron (500 nM) koinkubierte Herzen eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Phosphorylierungsstärke. Aldosteron alleine übt auf Akt-Kinase keinen Effekt aus. Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 73 Ergebnisse Akt phospho-Akt Kontrolle CAN CAN + ALDO ALDO BL 10´ RP BL 10´ RP Abb. 3.26: Die Abbildung zeigt repräsentative Western Blots für eine Akt-Phosphorylierung. Die Auswertung der mittleren Bandenintensitäten ist in der Abb. 3.25 graphisch dargestellt. Die Abkürzung BL steht für Baseline und RP für Reperfusion. 3.4.5 Canrenoat vermittelte Phosphorylierung von ERK 1/2 Anhand der Infarktgrößen der isolierten Rattenherzen konnte gezeigt werden, dass bei dem durch Canrenoat verursachtem Myokardschutz die Kinase ERK 1/2 beteiligt ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Inkubation mit 50 µM Canrenoat zu einem deutlichen Anstieg der ERK 1- und ERK 2-Phosphorylierung führt. Außerdem sollte getestet werden, ob Aldosteron die Phosphorylierung verändert. Die Ergebnisse zeigten, dass nach der Koinkubation mit 500 nM Aldosteron die Phosphorylierung beider Kinasen reduziert werden konnte. Das Aldosteron allein zeigte keinen Effekt auf die Infarktgrößen. Die Ergebnisse sind in Abb. 3.27 graphisch dargestellt, die Mittelwerte ± SD sind im Anhang Tab. 7.19 zusammengefasst. A) Ergebnisse phospho-ERK 1 / ERK 1 (x Baseline) 74 12 *** 10 8 6 4 2 0 B) phospho-ERK 2 / ERK 2 (x Baseline) Kontrolle CAN 12 CAN+ ALDO ALDO *** 10 8 6 4 2 0 Kontrolle CAN CAN+ ALDO ALDO Abb. 3.27: Effekt von Canrenoat auf die ERK 1/2-Phosphorylierung: A) ERK 1, B) ERK 2. Das Diagramm zeigt das Verhältnis von phosphoryliertem ERK 1/2 zu Gesamt-ERK 1/2 bezogen auf die Baseline während der Reperfusion. Während Canrenoat (50 µM) zu einem signifikanten Anstieg der Phosphorylierung beider Isoformen führt (*** p < 0,001 vs. Kontrolle), zeigen mit Aldosteron (ALDO, 500 nM) koinkubierte Herzen eine mit der Kontrollgruppe vergleichbare Phosphorylierungsstärke. Der Inhibitor allein zeigt keinen Effekt auf diese Kinase. Dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SD. 75 Ergebnisse ERK phospho-ERK phospho-ERK 1 phospho-ERK 2 Kontrolle CAN CAN CAN + ALDO CAN + ALDO ALDO ALDO BL 10´ RP ERK 1 ERK 2 Kontrolle BL 10´ RP Abb. 3.28: Die Abbildung zeigt repräsentative Western Blots für eine ERK 1/2-Phosphorylierung. Die Auswertung der mittleren Bandenintensitäten ist in der Abb. 3.27 graphisch dargestellt. Die Abkürzung BL steht für Baseline und RP für Reperfusion. 76 Diskussion 4 Diskussion Der Myokardinfarkt stellt in den Industrieländern immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Laut des Statistischen Bundesamtes, lag allein in Deutschland im Jahr 2011 der akute Herzinfarkt mit 52113 Menschen, an zweiter Stelle der häufigsten Todesursachen [1]. Daher ist es von großem Interesse, das Ausmaß eines Infarktes zu verringern. Dabei ist eine möglichst schnelle Wiederherstellung des Koronarflusses nach einem akuten Myokardinfarkt (Reperfusion) immer noch die wirksamste therapeutische Maßnahme, um den Herzmuskelschaden so klein wie möglich zu halten. Allerdings geht dies häufig auch mit erheblichen und teilweise auch irreversiblen Myokardschäden (Reperfusionsschäden) einher. Die haupsächliche Ursache für den Reperfusionsschaden nach der Ischämie ist die Natrium- und Kalziumüberladung der Herzmuskelzellen, die nach Wiederherstellung der Durchblutung und der Energieversorgung durch osmotisch bedingte Schwellung irreversibel Sauerstoffzufuhr beschädigt entstehen im werden ischämischen [8, 121]. Myokard Mit Wiederherstellung große Mengen der toxischer Sauerstoffradikale, die ebenfalls zum Reperfusionsschaden beitragen. Durch gezielte Modifikationen der Reperfusion kann der Schaden erheblich minimiert werden. Mit der Entdeckung der ischämischen Präkonditionierurng (IPC) konnte zuerst durch kurze repetetive Ischämie/Reperfusion-Intervalle vor der Indexischämie der Reperfusionsschaden reduziert werden [18]. Sie ist aber nur wirksam, wenn eine rechtzeitige Reperfusion erfolgt. Da Patienten mit akutem Herzinfarkt normalerweise erst in der fortgeschrittenen Ischämie in der Klinik eintreffen, ist die IPC doch von geringem therapeutischem Nutzen. Aus diesem Grund sind Interventionen während der frühen Reperfusion nach der Ischämie von klinischer Bedeutung. Im Jahr 2003 zeigte die Arbeitsgruppe von Vinten-Johannson, dass die kurzen Ischämie/Reperfusion-Intervalle unmittelbar zu Beginn der Reperfusion ebenfalls zum Myokardschutz beitragen. Dieser Effekt ist mit der IPC vergleichbar und wurde dementsprechend ischämische Postkonditionierung (IPost) genannt. Die Mechanismen, die während der IPost zum Myokardschutz führen, sind in den Details noch unklar. Die Untersuchungen weisen aber auf große Ähnlichkeit zur Signaltransduktion der ischämischen Präkonditionierung hin. So sind auch hier das Adenosin als Trigger [29], freie Sauerstoffradikale [51], mitochondriale ATP-abhängige Kaliumkanäle [28, 51], die Proteinkinase C, sowie die Bildung und Öffnung der mitochondialen Permeability Transition Pore (mPTP) beteiligt [51]. Viele Studien belegen, dass auch die protektive Kinasen des RISK-Signalweges während der ischämischen Postkonditionierung Diskussion 77 involviert sind. Wie in der IPC so ist es auch in der IPost möglich, das Myokard durch pharmakologische Interventionen zu schützen. So konnte bereits für Agonisten der GPCRs, wie die Rezeptoren für Adenosin [30], Bradykinin [31] oder Opioide [32], ein kardioprotektiver Effekt gezeigt werden. Bisher konnte eine Postkonditionierung bei Patienten mit einem akuten Myokardinfarkt nur in Form wiederholter kurzer Ischämiephasen [122] oder mittels pharmakologischer Inhibierung der Bildung der mPTP`s angewendet werden [123]. Im Allgemeinen ist die IPost eine erfolgversprechende Methode, den Myokardinfarkt dauerhaft zu reduzieren. Um diese Methode in den klinischen Alltag zu integrieren, sind noch weitere therapeutische Ansätze und weitere Studien notwendig. In letzter Zeit hat sich die Behandlung von Patienten nach einem Myokardinfarkt mit Mineralokortikoidrezeptor-Blockern (MR-Blockern), Eplerenon und Spironolacton in klinischen Studien (RALES-Studie, EPHESUS-Studie) bereits als sehr effektiv erwiesen [99, 112]. Es ist allerdings nicht völlig geklärt, wie die MR-Blockade ein höheres Überleben der behandelten Patienten ermöglicht. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die kardioprotektive Wirkung von Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten, Eplerenon und Kalium-Canrenoat (ein Metabolit von Spironolacton) in der frühen Reperfusion Phase der Postkonditionierung zu untersuchen und die beteiligten Elemente der Signalkaskade näher zu charakterisieren. 4.1 Methodenetablierung Um den Myokardinfarkt bei Patienten dauerhaft zu reduzieren, wird immer noch nach einer Intervention gesucht, die im klinischen Alltag zum Standard wird. Für die Aufklärung vieler Forschungsansätze bieten Tierversuche am Herzen unterschiedlicher Spezies ein breites Band von Möglichkeiten, die am menschlichen Herzen gar nicht durchführbar wären. Zum Beispiel bei der Entnahme von humanen Biopsien während Operationen spielt neben ethischen Aspekten die geringe Verfügbarkeit eine wichtige Rolle. Außerdem weist das menschliche Biopsiematerial eine unterschiedliche Qualität und Heterogenität auf. Zusätzlich bieten die Tierversuche unter homogenen Arbeitsbedingungen die Möglichkeit, unterschiedliche Parameter zu testen. In dieser Arbeit wurden zuerst die Untersuchungen an isolierten Rattenherzen an der Langendorff-Anlage durchgeführt. Mit dieser Methode ist es möglich, in isolierten Rattenherzen den akuten Myokardinfarkt durchzuführen. Dieses Verfahren ist mittlerweile 78 Diskussion gut etabliert und wurde bereits in vielen Tierspezies verwendet. Die Untersuchungen an isolierten Rattenherzen bieten im Vergleich zu in vivo Experimenten viele Vorteile. In erster Linie ist der technische Aufwand hier deutlich geringer. Außerdem ist die Biopsieentnahme zu unterschiedlichen Zeitpunkten möglich und die Ergebnisse können ohne den Einfluss anderer Organe und den zirkulierenden Botenstoffen erhoben werden. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der isolierten Rattenherzen die Auswirkung der MR-Antagonisten und mit Anwendung bestimmter Inhibitoren die schützende Signaltransduktion untersucht. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit in einem in situ Mausmodell die kardioprotektive Wirkung von Eplerenon und Canrenoat untersucht. Generell bietet die Nutzung von Mäusen für Versuchszwecke enorme Vorteile. Das Genom der Maus ist vollständig entschlüsselt und eine Vielzahl von Mausmutanten (knockout und transgen) sind kommerziell erhältlich. Außerdem bringt die Forschung an Kleintiermodellen auch wirtschaftliche Vorteile. Die Mäuse verfügen über eine schnelle Reproduktionszeit und die Haltung ist kostengünstig. Allerdings stellt die Größe der Maus ein chirurgisches Problem dar. Alle operativen Eingriffe müssen unter einem Mikroskop durchgeführt werden. Zudem ist die in situ Maus-Methode lernintensiv und erfordert ein längeres operatives Training. Jedoch liefert sie sehr gute reproduzierbare Ergebnisse unter komplexen Bedingungen im Gesamtorganismus. Das in dieser Arbeit verwendete in situ Mausmodell basiert auf dem Mausmodell von Eckle [116]. Für die Versuchszwecke wurden die Tiere mit Natrium-Pentobarbital anästhesiert. Das Betäubungsmittel hat im Vergleich zu Inhalationsanästhetika, wie Isofluran oder Opioide und Propofol keinen Einfluss auf die Präkonditionierung des Myokards [124]. In zahlreichen Publikationen wurde die Körpertemperatur als ein Hauptfaktor für die Entstehung der Infarktgröße beschrieben [125, 126, 116]. Für den operativen Eingriff wurde die Temperatur der Tiere auf einer Wärmeplatte mit einem rektalem Thermometer konstant gehalten. Eckle zeigte, dass die Länge der Ischämie und Reperfusion eine enorme Auswirkung auf die Infarktgröße hat [116]. Um einen irreversiblen Reperfusionsschaden am Herzen zu erzielen, wurden die Versuche mit einer Ischämie von 30 Minuten und anschließender Reperfusion von 2 Stunden durchgeführt. Unter diesen Bedingungen konnte eine Infarktgröße von ca. 40 % vom Risikoareal erreicht werden. Die Infarktgröße kann mit Hilfe ischämischer oder pharmakologischer Postkonditionierung reduziert werden. Die Erfolgsrate der ischämischen Postkonditionierung ist abhängig von der Dauer und der Anzahl der repetetiven Ischämie/Reperfusion-Intervalle und ist abhängig von der Tierspezies [127, 56]. Des Weiteren ist von entscheidender Bedeutung, dass die beiden Methoden der Postkonditionierung direkt im Anschluss an die Ischämie, direkt in der frühen Reperfusion, eingesetzt werden [25]. Diskussion 79 In dieser Arbeit zeigte die Injektion einer protektiven Dosis von 1mg/kg Canrenoat am Beginn der Reperfusion im in situ Mausmodell eine schützende Wirkung. Um die kardioprotektive Wirkungsdosis in anderen Tierspezies zu bestätigen, wurde das in situ Kaninchenmodell benutzt. Das Kaninchenherz ist sehr gut geeignet für die Untersuchungen von Substanzen, die klinisch angesetzt werden sollen, da es der Physiologie des menschlichen Herzens am besten entspricht. 4.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Eplerenon während der Reperfusion Im klinischen Bereich wird immer noch an pharmazeutischen Mitteln geforscht, die in der Lage sind, das infarzierte Herz vor Reperfusionschäden effektiv zu schützen. Seit 2004 ist der Aldosteron-Antagonist Eplerenon (Inspra ®) der Firma Pfizer zugelassen. Diese Zulassung basiert auf der EPHESUS-Studie (Eplerenone Post-Acute Myocardial Infarction Heart Failure Efficacy and Survival Study) [112], einer Postinfarktstudie zur Wirksamkeit und Überlebensdauer bei Patienten mit Herzinsuffizienz und linksventrikulärer Dysfunktion nach akutem Myokardinfarkt, in der die Zugabe von Eplerenon zusätzlich zu ACE-Hemmer und Betablockertherapie die Lebensqualität und Lebenserwartung von Infarktpatienten mit Herzinsuffizienz deutlich verbesserte und demzufolge die Hospitalisierung senkte. Die aktuelle Studie weist darauf hin, dass Eplerenon bei Patienten mit systolischer Herzinsuffizienz das Todesfallrisiko und die Krankenhausaufenthaltszeit reduziert [128]. Eplerenon hemmt kompetitiv die Bindung von Aldosteron an dem zytoplasmatischen MR-Rezeptor, woraus eine reduzierte Kaliumausscheidung und Natriumrückresorption resultiert. Durch die damit verbundene Ausscheidung von Wasser kommt es zur Entlastung der betroffenen Organe. Es ist allerdings noch nicht geklärt, wie die MR-Blockade mit Eplerenon zur erhöhten Überlebensrate der behandelten Patienten führt. Bisher wurde bei Eplerenon nur über den klinischen Aspekt berichtet, über die kardioprotektive Wirkung in der IPost und den begleitenden Signalweg ist noch nichts bekannt. In diesem Abschnitt der Arbeit wurde untersucht, inwieweit eine Behandlung mit Eplerenon die Infarktgröße in der frühen Phase der Reperfusion reduzieren kann. Des Weiteren wurde die Beteiligung von wichtigen Elementen der schützenden Signalkaskade mit Hilfe unterschiedlicher Inhibitoren (Chelerythrine, Wortmannin, U0126) und mit Aktivierung der Phosphorylierung von den Kinasen Akt und ERK 1/2 untersucht. Die Beteiligung von 80 Diskussion Adenosin bei dem durch Eplerenon vermittelten Schutz wurde in isolierten Rattenherzen mit SPT Inhibitor und in CD73 knockout-Mäusen erforscht. Bei den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Bindung des Eplerenons an den MR-Rezeptor die Infarktgröße am isolierten Rattenherzen und in einem in situ Mausmodell signifikant reduziert, wenn die Applikation in der frühen Reperfusion erfolgt. Die Arbeitsgruppe Chai zeigte, dass die Behandlung isolierter Rattenherzen mit 1 µM Eplerenon in der IPC zur Reduktion der Infarktgröße beiträgt und der koronare Fluss unverändert bleibt [129]. Unsere Untersuchungen zeigten, dass dieser MR-Antagonist auch in der mehr klinisch relevanten Phase der Postkonditionierung kardioprotektiv ist. Hier mussten jedoch höhere Dosierungen eingesetzt werden, um die schützende Wirkung zu erhalten. Die Konzentration von 1 µM zeigte keinen Effekt auf die Infarktgröße, während 10 µM diesen deutlich verminderte. Jedoch ist bisher wenig über die Signaltransduktionswege, die zu dieser Protektion mit Eplerenon führen, bekannt. Wir vermuten, dass Eplerenon für den Myokardschutz die bekannten Signalwege der Prä- und Postkonditionierung nutzt. Hausenloy beschreibt, dass für den Schutz zwei interagierende Signalwege verantwortlich sind [52]. Der eine Weg, der über die Aktivierung von PI3K-Akt und Inhibition der Öffnung der mPTP verläuft und der andere Weg, der über eine Aktivierung des MEK 1/2-ERK 1/2 Signalweges erfolgt. In beiden dieser zellulären Wege der Signalweiterleitung spielt die Proteinkinase C (PKC) eine zentrale Rolle [45]. Die PKC spielt im Myokard sowohl bei der Ischämie/Reperfusion als auch bei der Herzinsuffizienz und der folgenden Kardiomyopathie eine wichtige Rolle [47, 48]. Die schützende Rolle der PKC konnte bereits in isolierten perfundierten Rattenherzen [51] und in in vivo Kaninchenherzen [39] nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Kardioprotektion während der Postkonditionierung mit einem nichtselektiven PKC-Inhibitor, Chelerythrine, in einem in vivo Rattenmodell aufgehoben werden konnte [50]. Anhand dieser Befunde wurde bei dem Eplerenon vermittelten Myokardschutz eine mögliche Beteiligung der PKC untersucht. Wir konnten zeigen, dass die durch Eplerenon erzeugte Kardioprotektion in isolierten Rattenherzen mit dem Inhibitor Chelerythrine aufgehoben werden konnte, d.h. PKC ist auch bei dem Eplerenon vermittelten Signalweg beteiligt. Dieser Inhibitor zeigte allein keine Wirkung auf die Reduktion der Infarktgröße. Bisher ist nachgewiesen, dass PI3-Kinase (Phosphoinositid-3-Kinase) einen protektiven Effekt in Bezug auf die dilatative und hypertrophe Kardiomyopathie ausübt [130]. Die kardioprotektive Bedeutung der PI3-Kinase während der Postkonditionierung wurde erstmals durch Tsang et al. beschrieben [56]. Dabei konnte in einem in vitro Rattenmodell der Schutz 81 Diskussion der Postkonditionierung mittels Wortmannin (100 nM) komplett blockiert werden. Basierend auf diesen Befunden, haben wir untersucht, ob PI3-Kinase bei dem Eplerenon vermitteltem Schutz eine Rolle spielt. Wir konnten zeigen, dass die gleiche Wortmannin Konzentration die protektive Wirkung des Eplerenons in isolierten Rattenherzen blockierte. Der Inhibitor selbst hatte keinen Einfluss auf die Infraktgröße. Vor kurzem wurde berichtet, dass Wortmannin auch den durch ischämische Postkonditionierung (3 Zyklen je 30 Sekunden Ischämie/Reperfusion-Intervalle) erreichten Schutz blockieren kann [131]. Die Arbeitsgruppe Ovize zeigte, dass PI3-Kinase das Öffnen der mPTPs in reperfundierten Rattenherzen während der Postkonditionierung reguliert [27]. Die Wirkung der Phosphoinositid-3-Kinase in der Postkonditionierung kann auch mit einem anderen Inhibitor, wie LY294002, aufgehoben werden [56]. Bisher gab es nur eine Arbeit, welche die PI3-Kinase nicht als Element der Signaltransduktion der Postkonditionierung nachweisen konnte [61]. Weiterhin wurde der zweite Pfad des RISK-Signalweges für die Wirkung von Eplerenon erforscht. In unseren Untersuchungen wurden die mit Eplerenon behandelten Rattenherzen mit U0126 inhibiert. Dieser Blocker ist ein Antagonist der Kinase MEK 1/2 und dadurch auch der Kinase ERK 1/2. Downey und seine Mitarbeiter zeigten, dass U0126 (500 nM) in isolierten Kaninchenherzen die protektive Wirkung der ischämischen Präkonditionierung aufhebt [132]. Basierend auf diesen Befunden konnten wir mittels der Western Blot Analyse zeigen, dass die Kinase ERK 1/2 bei dem durch Eplerenon erreichten protektiven Schutz eine wichtige Rolle spielt. Nach 10-minütiger Reperfusion der Rattenherzen mit 10 µM Eplerenon war die Phosphorylierung beider Isoformen signifikant erhöht. Dabei zeigte die Kinase ERK 1 eine über 4fach und eine Kinase ERK 2 eine fast 4fach erhöhte Phosphorylierung im Vergleich mit den Kontrollherzen. Die Zunahme der Phosphorylierung von ERK 1/2 zeigte auch Yang in in vivo Kaninchenherzen. Dabei konnte der Schutz mittels vier Zyklen von jeweils 30 Sekunden Ischämie und Reperfusion hervorgerufen werden [28]. Darling war es ebenfalls möglich, die Phosphorylierung von ERK mit dem gleichen Postkonditionierungsprotokoll im in vivo Kaninchenherzen nachzuweisen [61]. Die Phosphorylierung von ERK wurde auch in in vivo Schweineherzen [127] untersucht. Es gibt auch andere Arbeitsgruppen, die auf diesem Gebiet forschen und abweichende Ergebnisse erhalten haben. So ist es Zhu nicht gelungen, den Anstieg der phospho-ERK 1/2 in postkonditionierten Rattenherzen nachzuweisen [62]. Mittels Western Blot Analyse war es ebenfalls möglich, die survival Kinase Akt in isolierten Rattenherzen nach der Perfusion mit Eplerenon zu untersuchen. Die nach 10-minütiger Reperfusion gewonnenen Biopsieproben und die daraus isolierten Proteine zeigten eine über 82 Diskussion 5fach erhöhte Phosphorylierung der Akt-Kinase im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Eine Studie belegt, dass bei dem kardioprotektiven Mechanismus von Eplerenon die endotheliale NO-Synthase (eNOS) durch Akt stimuliert wird und die induzierbare NO-Synthase (iNOS) durch NF-κB inhibiert wird [133]. Schwartz konnte in in situ Schweineherzen eine verstärkte Phosphorylierung der Akt, in einem Postkonditionierungsprotokoll von 3 Zyklen je 30 Sekunden Ischämie und 30 Sekunden Reperfusion, nachweisen [127]. Auch in isolierten perfundierten Rattenherzen konnte nach sechs Zyklen von je 10 Sekunden Ischämie und 10 Sekunden Reperfusion dieser Befund bestätigt werden [56]. Unsere Untersuchungen zeigten, dass die Behandlung isolierter Rattenherzen mit Eplerenon zu erhöhter Phosphorylierung der beiden Kinasen führt. Die hier erhobenen Ergebnisse weisen eine Beteiligung bekannter Kinasen des RISK-Signalweges während einer pharmakologischen Postkonditionierung mittels Eplerenon auf. Des Weiteren haben wir eine Beteiligung von Adenosin bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz untersucht. Adenosin wird im Herzen während der Ischämie vermehrt gebildet. Es ist fähig, das Ausmaß der Zellschädigung zu verringern und die Funktion des Herzens nach der Reperfusion zu verbessern [132, 134 135, 136, 137]. Adenosin ist auch ein wichtiger Mediator in der ischämischen Präkonditionierung und Postkonditionierung [138]. Mit den komerziell erhältlichen Adenosinrezeptor-Antagonisten und -Agonisten sowie Mausmodellen, bei denen gezielt einer der Adenosinrezeptoren ausgeschaltet werden konnte, wurde eine wichtige Basis für die weitergehenden Untersuchungen geschaffen. Die Rolle des Adenosinrezeptors wurde in vielen Studien mit dem nichtselektiven AdenosinrezeptorAntagonisten SPT erforscht [139, 140]. So konnten Downey und seine Mitarbeiter zeigen, dass SPT in in situ Kaninchenherzen die kardioprotektive Wirkung in der ischämischen Präkonditionierung sowie während der Postkonditionierung aufhebt [39, 132]. Dieser Effekt konnte ebenfalls im in situ Rattenmodell bestätigt werden [38]. Basierend auf diesen Befunden wurden mit SPT die mit Eplerenon behandelten isolierten Rattenherzen in der frühen Phase der Reperfusion perfundiert. Diese Untersuchungen in isolierten Rattenherzen zeigten, dass der durch Eplerenon vermittelte Schutz ebenfalls durch diesen Adenosininhibitor aufgehoben werden konnte, d.h. auch hier spielt das Adenosin eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Adenosin bei der Postkonditionierung durch Eplerenon in CD73-/--Mäusen untersucht. Die Untersuchungen zeigen eine wichtige Rolle des Adenosins, das in Abhängigkeit von CD73 produziert wird [142]. In der hier durchgeführten Studie erwies sich Eplerenon in den Wildtyp Tieren (CD73+/+) als hoch protektiv, wenn dieses während der Reperfusion in Mäusen, die extrazelluläres Adenosin 83 Diskussion bilden können, appliziert wurde. Die Wirkung von Eplerenon, welches in den CD73+/+Mäusen zu einer Reduktion der Infarktgröße führte, konnte in den CD73-/--Mäusen nicht erzielt werden, da der endogene Mediator Adenosin fehlte. Hiermit konnte in beiden Spezies, in isolierten Rattenherzen und knockout-Mäusen bestätigt werden, dass für den durch Eplerenon vermittelten Schutz das Adenosin notwendig ist. Mit der hier durchgeführten Studie wurde mittels Eplerenon die signifikante Reduktion der Infarktgröße in beiden Tierspezies und die Eplerenon vermittelte Phosphorylierung der beiden kardioprotektiven Kinasen Akt und ERK 1/2 gezeigt. Somit wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass Eplerenon die Infarktgröße in der frühen Phase der Reperfusion erfolgreich senkt und zu dem Schutz die bekannten Elemente der Signalkaskade, wie PKC, PI3-Kinase, und die Kinasen Akt und ERK 1/2, sowie das extrazelluläre Adenosin, beitragen. Aufgrund dieser Befunde und der Befunde der zuvor durchgeführten EPHESUS-Studie eignet sich Eplerenon für den Einsatz in der Klinik. 4.3 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion Das oben untersuchte Eplerenon reduziert effektiv die Infarktgröße und erfüllt die meisten Voraussetzungen, ist allerdings wasserunlöslich und dadurch kann nur in Tablettenform verabreicht werden. Im klinischen Einsatz werden aber idealerweise Substanzen benötigt, die direkt - am besten als Spritze oder Infusion - verabreicht werden können und in wenigen Minuten die schützende Wirkung im Herzen ausüben. Einer von solchen vielversprechenden Kandidaten ist das Kalium-Canrenoat. Diese Substanz ist ein aktives Stoffwechselprodukt von Spironolacton und gehört genau wie Eplerenon zur Gruppe der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten). Die MR-Antagonisten haben eine ähnliche Struktur wie Aldosteron, jedoch eine entgegengesetzte Wirkung. Sie binden zwar an den gleichen MR-Rezeptor wie das Aldosteron, fördern aber die vermehrte Ausscheidung von Natriumchlorid und Wasser und verhindern somit die Freisetzung von Kalium. Da Canrenoat den Vorteil hat, dass es gut wasserlöslich ist, dh. kann es als Spritze intravenös angewendet werden. In dieser Form wird es bereits in der Klinik als kaliumsparendes Diuretikum bei Hyperaldosteronismus, Leberzirrhose und lebensbedrohlichen Ödemen eingesetzt. Die Wirksamkeit von Spironolacton wurde in der RALES-Studie untersucht. Dabei konnte bei Patienten mit chronischer systolischer 84 Diskussion Herzinsuffizienz im Stadium NYHA III und IV eine signifikante Reduktion der Mortalität und Morbidität belegt werden [99]. Tierexperimentelle Versuche zeigen, dass Spironolacton die Wirkung des Aldosterons unterbindet und dieser Effekt ist durch die MR Aktivierung vermittelt [80]. In diesem Teil der Arbeit wurde untersucht, inwieweit eine Behandlung mit Canrenoat zu einer Reduktion der Infarktgröße in der frühen Phase der Reperfusion beiträgt. Die Untersuchungen wurden in drei Tiermodellen durchgeführt: in einem in situ Mausmodell, in isolierten Rattenherzen und in einem in situ Kaninchenmodell. Als erstes wurde die kardioprotektiv wirkende Dosis von Canrenoat ermittelt. Danach wurden die schützenden Elemente der Signalkaskade untersucht. Unter Verwendung der CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse wurde die Rolle von Adenosin überprüft und mit der Western Blot Analyse die Phosphorylierung der Kinasen Akt und ERK 1/2. Bei den hier durchgeführten Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Canrenoat an den MR-Rezeptor die Infarktgröße in einem in situ Mausmodell signifikant reduziert. Bei einer dosenabhängigen Infarktgrößenbestimmung wurden fünf verschiedene Canrenoat-Konzentrationen (0,003 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg und 10 mg/kg) geprüft. Die größte Senkung des Infarktes von 6,7 ± 4,7 % konnte bei der Injektion von 1 mg/kg Canrenoat beobachtet werden. Die Infarktgröße war damit um ca. 80 % kleiner als die der Kontrollgruppe (37,8 ± 7,4 %). Am Ende des Experiments wurde der Maus Blut entnommen und zur Verifizierung der Ergebnisse der Infarktgrößen der kardiale Troponin ISpiegel im Blutserum bestimmt, da dieser den Grad der Schädigung des Herzens widerspiegelt. Troponin ist ein Proteinkomplex, welches aus den Herzmuskelzellen bei Schädigung in das Blut freigesetzt wird, wo es gemessen werden kann. Bei Patienten wird nach einem Herzinfarkt das Troponin langsam freigesetzt und erreicht mit der Zeit ein Plateau. Dieses ist bereits 3-6 Stunden nach einem Herzinfarkt messbar. Durch die Bestimmung des Troponin-Spiegels ab dem 3. oder 4. Tag kann ermittelt werden, wieviel Herzmuskelgewebe zerstört worden ist. Der akute Herzinfarkt kann auch mit der Messung der Kreatinkinase, einem Herzmuskelenzym, diagnostiziert werden. Troponin ist allerdings spezifischer und besitzt damit eine höhere Aussagekraft. In unseren Versuchen kann nach zwei Stunden Reperfusion nicht festgestellt werden, dass das Plateau erreicht ist, jedoch die erhaltenen Ergebnisse korrelieren mit den gemessenen Infarktgrößen. Bei Mäusen, die nach einem akuten Herzinfarkt mit 1 mg/kg Canrenoat behandelt wurden, war Troponin I-Spiegel signifikant kleiner. Eckle et al. konnten ebenfalls in einem in situ Mausmodell während der Präkonditionierung nach 60 Minuten der Ischämie und 2 Stunden Reperfusion eine Diskussion 85 signifikante Reduktion der Troponin-Werte messen [116]. Es scheint, dass bei der Maus die 2 Stunden Reperfusion ausreichend sind, um mit der Troponinmessung die Größe des Herzinfarktes zu bestätigen. Zusätzlich wurde untersucht, ob die kardioprotektive Dosis von 1 mg/kg Canrenoat auch bei verschiedenen Zeitpunkten der Reperfusion die entsprechende Wirkung zeigt. Die Ergebnisse belegen eine signifikante Reduktion der Infarktgröße nach der Injektion von Canrenoat nach 25 Minuten Ischämie. Die Injektion zu dem Zeitpunkt 0 Minuten Reperfusion und nach 15 Minuten Reperfusion zeigen jedoch keinen Myokardschutz mehr. Die im Blutplasma gemessenen Troponin-Werte bestätigen die Größen der Infarkte. Daraus lässt sich schließen, dass, um den Schaden nach einem Herzinfarkt möglichst klein zu halten, zum Zeitpunkt der Reperfusion, d.h. wenn das Gefäß wieder eröffnet wird, bereits therapeutische Interventionen erfolgt sein müssen. Die hier erhobenen Ergebnisse werden durch andere Studien gestützt, die berichten, dass die ischämische oder aber auch die pharmakologische Postkonditionierung direkt im Anschluss an die Ischämie gesetzt werden muss, da bereits 60-90 Sekunden nach der Ischämie kein Herzschutz mehr möglich ist [143, 144]. Die Untersuchungen zeigten eine erhöhte Konzentration des Adenosins im Herzen während der Präkonditionierung und Postkonditionierung. Adenosin kommt normalerweise intra- und extrazellulär in allen Geweben und Körperflüssigkeiten vor und seine extrazelluläre Konzentration liegt zwischen 30-300 nM. Bei Ischämie kann dieser Wert bis auf das 100fache ansteigen [145]. Dieser Befund konnte bereits in mehreren Tierspezies beobachtet werden [146, 147]. Der vermittelte Schutz ist aber auch von den Adenosinrezeptoren (AR) abhängig. Mit der Einführung verschiedener AR-Antagonisten und -Agonisten konnten viele Fragestellungen beantwortet werden. So zeigt der A1/A2b Agonist AMP579 eine kardioprotektive Wirkung in der Präkonditionierung und Postkonditionierung [35, 148]. Dieser Effekt konnte durch den selektiven A2aAR-Antagonisten ZM241385 aufgehoben werden. Die Infusion mit dem selektiven A2aAR-Agonisten CGS21680 oder mit dem selektiven A1AR Agonisten CCPA zeigte jedoch keinen Einfluss auf den AMP579 vermittelten Myokardschutz [149, 150, 151]. Dagegen konnte die mit dem A1ARAntagonisten DPCPX (8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine) erreichte schützende Wirkung des AMP579 nicht bewiesen werden [132, 35]. Deshalb wird vermutet, dass bei der Postkonditionierung der A2aAR und nicht der A1AR eine wichtige Aufgabe hat. Die Rolle des A2a-Adenosinrezeptors beim Myokardschutz wurde im Laufe der Zeit auch mit anderen Agonisten bestätigt. So konnte mit dem selektiven A2aAR Agonisten ATL146 die Infarktgröße in Mäuseherzen reduziert werden [152, 153] und in A2a knockout-Mäusen der 86 Diskussion Myokardschutz und die Beteiligung des A2aARs bei der Postkonditionierung gezeigt werden [153]. Kürzlich wurde berichtet, dass auch ein weiter A2aAR Agonist YT-146 (2-octynyladenosine) in isolierten Rattenherzen schützend wirkt [154]. Pharmakologische Studien zeigten zudem, dass eine ischämische Präkonditionierung über die Aktivierung von A2bAR während der Reperfusion kardioprotektiv wirkt. So konnte der Schutzmechanismus durch die spezifische Blockade des A2bAR mittels MRS1754 während der Reperfusion unterbunden werden [132]. Eine besondere Rolle wird jedoch dem A2bAR während der Postkonditionierung zugeschrieben. Dieser Rezeptor verfügt über eine niedrige Affinität zu Adenosin und hat eine besondere Bedeutung in Situationen, in denen große Mengen an Adenosin freigesetzt werden, wie z.B. beim Herzinfarkt. Yang et al. [29] zeigten, dass der nichtselektive AR-Antagonist SPT, aber auch der hochspezifische A2bAR-Antagonist MRS1754 die Wirkung der ischämischen Postkonditionierung blockierten [39]. Auch weitere Untersuchungen stützen die These, dass die A2b-Adenosinrezeptoren einen Schutz des Herzens vermitteln. So wurde gezeigt, dass eine Postkonditionierung mittels NECA, einem A1/A2-Adenosinrezeptoragonisten, durch zeitgleiche Applikation von MRS1754 inhibiert wurde [39]. Auch der seit kurzem verfügbare A2bAR-selektive Agonist BAY60-6583 zeigte sowohl in Kaninchenherzen [40], als auch in einem in situ Mausmodell eine Infarkt reduzierende Wirkung [155]. Die oben durchgeführten Untersuchungen mit Eplerenon zeigen ebenfalls eine rezeptorabhängige Wirkung von Adenosin bei dem kardioprotektiven Signalweg. In diesem Teil der Arbeit wurde geprüft, ob die durch Canrenoat vermittelte Kardioprotektion auch von Adenosin abhängig ist. Die Untersuchungen wurden zuerst in CD73-/--Mäusen und anschließend in A2bAR-/--Mäusen durchgeführt. Die C57BL/6N-Mäuse dienten in dieser Versuchsreihe als Kontrolle für die beiden Mausstämme. Die Aktivität von CD73 und die Adenosin Konzentration sind hauptsächlich verantwortlich für den Infarkt reduzierenden Effekt in der ischämischen Präkonditionierung [156]. In der hier durchgeführten Studie zeigte Canrenoat in den Wildtyp Tieren, die das extrazelluläre Adenosin bilden können, eine stark reduzierende Wirkung auf die Infarktgröße. Bei den CD73-/--Mäusen konnte dieser Effekt nicht gezeigt werden, wenn Canrenoat in der frühen Phase der Reperfusion appliziert wurde, da das benötigte Adenosin nicht in ausreichender Menge zur Verfügung stand. In unserer Arbeitsgruppe zeigten andere Versuche in CD73-/--Mäusen keine kardioprotektive Wirkung während der ischämischen Postkonditionierung, aber auch keinen Effekt nach der Behandlung mit dem selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6585. Wir vermuten, dass hier das Adenosin in einer nicht ausreichenden Menge vorkommt, um den niedrig affinen A2bAR zu aktivieren Diskussion 87 [155]. Um gezielt die Rolle des A2bARs bei dem durch Canrenoat vermitteltem Schutz zu ermitteln, wurden in dieser Arbeit zusätzlich die Untersuchungen in A2bAR-/--Mäusen durchgeführt. Hier konnte, im Gegensatz zu der Kontrollgruppe, ebenfalls keine Reduktion der Infarktgröße beobachtet werden. Des Weiteren wurde in einem in situ Kaninchenmodell die kardioprotektive Dosis von 1 mg/kg Canrenoat untersucht. Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen eine signifikante Senkung der Infarktgrößen nach 4 Stunden Reperfusion und überraschenderweise auch nach 72 Stunden Reperfusion. Die Daten konnten zusätzlich mit der Messung hämodynamischer Parameter untermauert werden. Hier wurden keine Unterschiede bei der Herzfrequenz und dem mittleren Blutdruck festgestellt. Die Ergebnisse belegen die Wirksamkeit von Canrenoat nach einem akuten Myokardinfarkt. Die kardioprotektive Wirkung von Canrenoat wurde in isolierten Rattenherzen geprüft. Die Konzentration von 10 µM, die auch bei MR-Antagonist Eplerenon benutzt wurde, hat sich auch in diesem Fall als kardioprotektiv erwiesen, jedoch konnte mit einer höheren Konzentration von 50 µM Canrenoat die Infarktgröße noch effizienter reduziert werden. Die Untersuchungen mit Eplerenon in dieser Arbeit zeigen, dass bei der Kardioprotektion die bekannten Elemente der Signalwege der Prä- und Postkonditionierung, wie PKC, PI3-Kinase, und die Kinasen Akt und ERK 1/2, beteiligt sind. Basierend auf diesen Befunden konnten wir mittels der Western Blot Analyse zeigen, dass die survival Akt-Kinase und die Kinase ERK 1/2 bei dem durch Canrenoat erreichten protektiven Schutz ebenfalls eine wichtige Rolle spielt. So konnte bei der Akt-Kinase eine über 3fach und bei den beiden Isoformen der ERKKinase eine über 4,5fach erhöhte Phosphorylierung im Vergleich mit den Kontrollherzen erzeugt werden. Die Mitwirkung von Akt und ERK 1/2 während der Präkonditionierung und Postkonditionierung konnte bisher in mehreren Tierspezies nachgewiesen werden [28, 127, 61, 62]. Zusammenfassend haben diese Untersuchungen gezeigt, dass der MR-Antagonist Canrenoat in allen drei Tierspezies zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt, und dass der Schutz von Adenosin und den beiden Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. 4.4 Wirkung von Aldosteron Seit langer Zeit wurden die negativen Effekte von Aldosteron als sekundäre Auswirkung renaler Elektrolyt- und Wasserregulation verstanden. Beobachtet wurde jedoch, dass 88 Diskussion Aldosteron neben seiner Wirkung auf die epithelialen Zielgewebe auch eine direkte Wirkung auf die nicht-epithelialen Gewebe, wie Gefäße und Herz und das gesamte kardiovaskuläre System, ausübt [76, 77]. Experimentelle Untersuchungen weisen darauf hin, dass Aldosteron bei einem akuten Myokardinfarkt sowie bei chronischer Herzinsuffizienz unmittelbar beteiligt ist und seine Wirkung entweder direkt über die Mineralokortikoidrezeptoren oder indirekt durch die Regulation des RAAS-Systems stimuliert wird [64, 157]. Aus diesem Grund wird angenommen, dass durch die Blockade der Aldosteron-Wirkungen im Herz der Reperfusionsschaden reduziert werden kann. Der Effekt von Aldosteron ist zelltypabhängig und kann im Herzen stark variieren. So konnten zwischen vaskulären glatten Muskelzellen, Endothelzellen und Kardiomyozyten Unterschiede demonstriert werden [90, 158, 159]. Es wird beschrieben, dass Aldosteron seine Wirkung über den Mineralokortikoidrezeptor (MR) „genomisch“ vermitteln kann. Dieser Effekt involviert die Bindung von Aldosteron an den intrazellulären MR und die Translokation von dem Steroid-MR Komplex in den Zellkern, der als ein transkriptioneller Regulator fungiert und nach mehreren Stunden die Proteinsynthese induziert. Immer mehr Studien jedoch beschreiben die „nicht-genomische“ Wirkung von Aldosteron im Herzen, die innerhalb von wenigen Minuten auftritt, eine kardiale Inotropie bewirkt und die Vasodilatation und Vasokonstriktion fördert [160, 161]. Während eines Herzinfarktes wird das Aldosteron im Herzen schnell akkumuliert. Die Experimente an isolierten perfundierten Rattenherzen belegen, dass durch die Bindung des Aldosterons an den Mineralokortikoidrezeptor eine Aldosteron-Konzentration von bis zu 2 ng/ml im Herzgewebe erreicht werden kann und damit fast 10mal höher als im Blutplasma vorhanden ist [129, 162]. Damit wird bestätigt, dass sich das Aldosteron an den im Herzen exprimierten MR bindet und gezielt seine Wirkung ausübt. Die beiden untersuchten MR-Antagonisten, Eplerenon und die aktive Form des Spironolactons, Canrenoat, haben die Fähigkeit, die unerwünschte Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu reduzieren. Die Experimente an isolierten Rattenherzen zeigen, dass die Wirkung von Eplerenon mit 50 nM Aldosteron nicht aufgehoben werden konnte und dieser Effekt erst mit höherer Aldosteron-Konzentration von 500 nM gezeigt werden konnte. Wie erwartet, zeigte das Aldosteron allein keine Auswirkung auf die Infarktgröße. Des Weiteren wurde die Aktivierung der Phosphorylierung von den Kinasen Akt und ERK 1/2 nach der Behandlung der Herzen mit Aldosteron untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass nach 10-minütiger Reperfusion der Rattenherzen mit Eplerenon oder Canrenoat die Phosphorylierung der beiden Kinasen Akt und ERK 1/2 signifikant erhöht war. Dagegen konnte nach der Koinkubation mit Diskussion 89 den jeweiligen MR-Antagonisten mit Aldosteron die Phosphorylierung abgehoben werden. Die Behandlung der Rattenherzen mit Eplerenon und Wortmannin führte ebenfalls zur Reduktion der Phosphorylierung. Daraus lässt sich schließen, dass es sich in diesen Untersuchungen um die nicht-genomische Wirkung des Aldosterons handelt, da dieser Effekt auch bereits nach wenigen Minuten sichtbar war. Die Studien belegen, dass Eplerenon die nicht-genomische Wirkung von Aldosteron auch in Mesenterialgefäßen blockiert und dieser Effekt von den Na+/H+-Kanälen, dem intrazellulärem Ca2+ und der Vasokonstriktion abhängig ist [161]. Die vorteilhafte Blockade der AldosteronWirkung durch die beiden MR-Antagonisten konnte in vielen Studien bestätigt werden. So wurde festgestellt, dass Spironolacton und Eplerenon zu einer verminderten Arrhythmie führen. Damit bewirkten beide MR-Antagonisten eine Funktionsverbesserung der isolierten Rattenherzen nach Ischämie und Reperfusion [80, 129]. Des Weiteren konnte, sowohl in Tiermodellen der Arteriosklerose als auch bei Herzinsuffizienz, eine Verbesserung der Endothelfunktion und eine Verminderung der vaskulären Sauerstoffradikalproduktion durch beiden MR-Antagonisten nachgewiesen werden [163, 164]. Zusätzlich lieferten die Untersuchungen zu den kardioprotektiven Mechanismen der Aldosteron-Blockade an salzsensitiven Dahl-Ratten unter Natrium angereichertem Futter Hinweise dafür, dass die Therapie mit Eplerenon zu einer deutlichen Verbesserung der kardialen Dysfunktion, sowie der endothelialen Funktion führt [133]. Außerdem reduzierte Eplerenon bei den Wistar-Ratten unmittelbar nach der Ischämie die Dilatation der infarzierten Myokardwand und es verbesserte die linksventrikuläre Funktion. Des Weiteren wurde Eplerenon eine Zunahme der Neovaskularisierung des heilenden Myokards, sowie eine vorübergehende Hochregulation heilungsfördernder Zytokine zugeschrieben [65]. Weitere experimentelle Hinweise belegen, dass auch Spironolacton die negative kardiale Aldosteron-Wirkung in isolierten Rattenherzen reduziert [165]. Es gibt jedoch auch eine andere Studie, die diesen Effekt nicht nachweisen konnte [160]. Die hier durchgeführte Studie beweist, dass die beiden MR-Antagonisten, Eplerenon und Canrenoat, die negative Aldosteron-Wirkung im Herzen erfolgreich reduzieren kann. 4.5 Postkonditionierung in der Klinik Die Postkonditionierung weist für den klinischen Einsatz ein besonders hohes Potenzial auf, da sie erst nach einer Ischämie durchgeführt wird. Alle bislang durchgeführten Analysen zur 90 Diskussion Postkonditionierung basieren zum größten Teil auf Untersuchungen in Tiermodellen. So konnte diese Methode bereits in der Maus [166, 137],, der Ratte [167, 27], dem Kaninchen [28] und dem Schwein [168, 127] erfolgreich durchgeführt werden. Allerdings muss dabei die Übertragbarkeit der laborkontrollierten Daten vom Tier auf den Menschen kritisch bewertet werden. In den Tierexperimenten konnte beobachtet werden, dass die Erfolgsrate der Postkonditionierung von der Anzahl und der Dauer der Ischämie/Reperfusion-Intervalle abhängt und ist von Spezies zu Spezies unterschiedlich. Ein anderer kritischer Punkt ist, dass die Patienten mit einem akuten Myokardinfarkt meist fortgeschrittenen Alters sind, auf eine Dauermedikation angewiesen sind und oft durch weitere Krankheiten, wie z.B. Diabetes mellitus, Bluthochdruck oder Atherosklerose begleitet werden. Alle diese Faktoren können einen Einfluss auf die Ergebnisse der Postkonditionierung haben. Die Versuche im Labor werden aber an jungen und meistens gesunden Tieren durchgeführt, die den komplexen Organismus eines älteren Menschen nicht widerspiegeln können. Erste Hinweise über erfolgreich durchgeführte ischämische Postkonditionierung bei Menschen, lieferte im Jahr 2005 die Arbeitsgruppe Ovize [122]. In den Untersuchungen mit 30 Patienten fanden sie heraus, dass vier Zyklen mit jeweils einer Minute Koronarverschluss und einer Minute Reperfusion mittels einer Ballonmanipulation in der frühen Reperfusion die Infarktgröße um 36 Prozent reduziert und über den 72 h gemessenen Kreatinkinase-Spiegel senkt. Darling et al. konnten anhand dieser Patientenbefunde feststellen, dass vier und mehr Ballonmanipulationen während der PTCA die Freisetzung der Kreatinkinase effektiver reduziert als nur ein bis drei Zyklen [169]. Anschießend bestätigte eine andere Studie die Langzeitwirkung dieses Verfahrens mit konstanten Infarktgrößen und die immer noch signifikant reduzierten Kreatinkinase- und Troponin I-Werte [170]. In klinischen Studien wurde auch pharmakologische Postkonditionierung durchgeführt, denn im Gegensatz zur ischämischer Postkonditionierung bietet dieses Verfahren mehrere Vorteile: es ist einfacher in der Durchführung und benötigt keine teure technische Ausstattung. Diese und viele andere Gründe sprechen für ein hohes Potential der pharmakologischen Postkonditionierung in der klinischen Anwendung. Während zwei klinischen Studien wurde Adenosin während der Reperfusion verabreicht (AMISTAD-I und-II, the Acute Myocardial Infarction STudy of ADenosine). Bei der ersten Studie konnte ein reduzierender Effekt bei Patienten, die einen Herzinfarkt erlitten haben, erzielt werden [171]. Die folgende AMISTAD-II Studie konnte dies nicht mehr zeigen. Erst die Infusion höherer Adenosindosen führte zu einer Reduktion der Infarktgrößen, nachgewiesen mittels SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) [172]. Aber auch die RALES- und EPHESUS-Studien mit Diskussion 91 Spironolacton und Eplerenon zur Wirksamkeit von Antagonisten des Mineralokortikoidrezeptors konnten positive Effekte einer direkten Aldosteronblockade belegen [99, 100], Eine weitere vielversprechende Studie zur pharmakologischen Postkonditionierung wurde mit Cyclosporin A, einem Inhibitor der mPTP, durchgeführt [123]. Hier konnte bei 58 Patienten nach akutem Myokardinfarkt eine signifikante Senkung der Infarktgrößen um bis zu 40 %, mit Hilfe der Messung des Kreatinkinase-Spiegels und Bestimmung in der kardialen MRT (Magnet-Resonance-Tomographie), nachgewiesen werden. Eine aktuelle multizentrische, randomisierte ALBATROSS-Studie zeigte, dass eine sehr frühe Rezeptorblockade zum Zeitpunkt der Reperfusion die Prognose bei Patienten nach einem akuten Myokardinfarkt allgemein verbessern kann. Dabei wurde den Patienten intravenös eine 200 mg KaliumCanrenoat Dosis appliziert, gefolgt durch eine Einnahme von 25 mg Spironolacton über weitere 6 Monate, um die negative Wirkung von Aldosteron zu blockieren [173]. Die beiden in dieser Arbeit untersuchten MR-Antagonisten reduzieren im Tiermodell signifikant die Infarktgrößen nach einem akuten Myokardinfarkt. Eplerenon kann nur in Tablettenform verabreicht werden und eignet sich daher eher für die Dauerapplikation. Dem gegenüber hat Canrenoat ein großes Potenzial für die klinische Anwendung, da diese Substanz schnell und effektiv nach einem akuten Myokardinfarkt wirkt, intravenös verabreicht werden kann und wie unsere Untersuchungen zeigen konnten, keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter hervorruft. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen liefern einen Beitrag zum Verständnis der Wirkung und dem zugrunde liegenden Schutzmechanismus der MR-Antagonisten in der frühen Reperfusion. 92 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Dieser entsteht überwiegend durch artherosklerotische oder entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße, welche zu einem thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung, der sogenannten Ischämie, führen. Um die entstehende Herzmuskelschädigung möglichst klein zu halten, ist die schnelle Wiedereröffnung des Koronargefäßes notwendig. Heute ist bekannt, dass diese gewünschte Reperfusion aber auch irreversible Herzschäden verursachen kann. Mit dem Verfahren der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Intervalle der Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes kann die Infarktgröße deutlich gesenkt werden. Für den klinischen Einsatz ist dieses Verfahren jedoch technisch zu aufwändig, sodass der Wunsch nach pharmakologischen Interventionen, die ein hohes Potenzial zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bieten, steigt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und in den klinischen Alltag einzubringen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten) Eplerenon und Canrenoat sowie der Charakterisierung wichtiger Elemente der Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der isolierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung dieser MRAntagonisten während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung bekannter Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung untersucht. Des Weiteren wurde ein in situ Mausmodell etabliert, um die Infarktgrößen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren wurden CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse verwendet. Die CD73-/--Mäuse können durch die fehlende 5’-Ektonukleotidase (CD73) kein endogenes Adenosin bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen der Adenosin-A2b-Rezeptor deletiert, welcher bei der Reperfusion eine Schlüsselrolle spielt. In einem in situ Kaninchenmodell haben weitere Untersuchungen des Canrenoats stattgefunden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eplerenon während der Reperfusion die Infarktgröße nach einem Myokardinfarkt signifikant reduziert und dass dieser Schutzmechanismus von PKC, PI3-Kinase und den weiteren Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. Weiterhin konnte sowohl bei der Infarktgrößenbestimmung in isolierten Zusammenfassung 93 Rattenherzen als auch im in situ Mausmodell, in den CD73-/--Mäusen, die Beteiligung des Adenosins bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz nachgewiesen werden. Mit Hilfe des in situ Mausmodells konnte gezeigt werden, dass Canrenoat ebenfalls eine Myokard schützende Wirkung zeigt. Dabei wurde die maximale Reduktion der Infarktgröße mit einer Konzentration von 1 mg/kg erreicht, wenn das Canrenoat 5 min vor Beginn der Reperfusion injiziert wurde. Anhand der Untersuchungen an den CD73-/-- und A2bAR-/-Mäusen konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Adenosin und der Adenosin-A2bRezeptor für den durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz essenziell sind. Canrenoat hat sich im in situ Kaninchenmodell ebenfalls als kardioprotektiv erwiesen und zeigte keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter. In dem Modell der isolierten Rattenherzen konnte die kardioprotektive Wirkung des Canreonats erneut bestätigt werden und der Schutzmechanismus war von den Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig. Die beiden MR-Antagonisten haben die Fähigkeit, die negative Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu senken. Die Untersuchungen zeigten, dass erst mit einer höheren Aldosteron-Konzentration die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten aufgehoben und die Phosphorylierung der Akt- und ERK 1/2-Kinase reduziert werden konnte. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse liefern neue Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes. 94 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis 1. Bundesamt S (2012) Statistisches Bundesamt. Sterbefälle nach den 10 häufigsten Todesursachen 2011 (abgerufen am 07.02.2013). 2. Van de Werf F, Ardissino D, Betriu A, Cokkinos DV, Falk E, Fox KA, Julian D, Lengyel M, Neumann FJ, Ruzyllo W, Thygesen C, Underwood SR, Vahanian A, Verheugt FW, Wijns W, Task Force on the Management of Acute Myocardial Infarction of the European Society of C (2003) Management of acute myocardial infarction in patients presenting with STsegment elevation. The Task Force on the Management of Acute Myocardial Infarction of the European Society of Cardiology. European heart journal 24 (1):28-66 3. Bopassa JC (2012) Protection of the ischemic myocardium during the reperfusion: between hope and reality. American journal of cardiovascular disease 2 (3):223-236 4. 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Kontrolle Eplerenon 1 µM Eplerenon 10 µM Eplerenon 10 µM + CHEL CHEL Eplerenon 10 µM + WORT WORT Eplerenon 10 µM + U0126 U0126 Eplerenon 10 µM + SPT SPT n 11 6 8 5 5 5 5 5 4 6 5 Mittelwert ± SD 40,8 ± 5,3 % 35,5 ± 2,8 % 10,9 ± 7,2 % 30,9 ± 9,6 % 43,3 ± 3,2 % 38,9 ± 6,3 % 34,8 ± 10,1 % 39,8 ± 3,1 % 39,1 ± 2,6 % 30,1 ± 8,4 % 33,8 ± 2,9 % Signifikanz vs. Kontrolle ns p < 0,001 ns ns ns ns ns ns ns ns Tab. 7.2: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Mausmodell (aus Abb. 3.9). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. C57BL/6N Kontrolle C57BL/6N Eplerenon 10 µM CD73-/Kontrolle CD73-/Eplerenon 10 µM n 10 10 6 6 Mittelwert ± SD 37,8 ±7,5 % 7,9 ± 3,8 % 33,0 ± 10,0 % 34,0 ± 6,1 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,001 ns Tab. 7.3: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes Akt (aus Abb. 3.10). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung der Akt Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Kontrolle Eplerenon n 6 6 Mittelwert ± SD 1,52 ± 0,57 8,24 ± 3,38 Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,001 110 Anhang Tab. 7.4: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes ERK 1/2 (aus Abb. 3.11). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung beider Isoformen der ERK 1 und ERK 2 Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. n Mittelwert ± SD Signifikanz vs. Kontrolle 6 6 1,87 ± 1,01 8,58 ± 2,27 p < 0,001 6 6 1,65 ± 0,69 6,23 ± 4,04 p < 0,001 ERK 1 Kontrolle Eplerenon ERK 2 Kontrolle Eplerenon 7.2 Rezeptorvermittelte Signalweiterleitung durch Canrenoat während der Reperfusion Tab. 7.5: Zusammenfassung der dosenabhängigen Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit unterschiedlichen Canrenoat-Konzentrationen (aus Abb. 3.12). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat 0,003 mg/kg Canrenoat 0,03 mg/kg Canrenoat 0,3 mg/kg Canrenoat 1 mg/kg Canrenoat 10 mg/kg n 10 6 6 6 6 6 Mittelwert ± SD 37,8 ± 7,4 % 35,4 ± 11,05 % 21,3 ± 9,9 % 17,8 ± 9,1 % 6,7 ± 4,7 % 11,08 ± 5,7 % Signifikanz vs. Kontrolle ns p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 Tab. 7.6: Zusammenfassung der kardialen Troponin I-Werte(cTnI) im Blutplasma der CD73-/--Maus Versuche (aus Abb. 3.15). Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat 0,003 mg/kg Canrenoat 0,03 mg/kg Canrenoat 0,3 mg/kg Canrenoat 1 mg/kg n 10 6 6 6 6 Mittelwert ± SD 244,5 ± 183,72 % 209,8 ± 168,71 % 200,7 ± 70,51 % 112,3 ± 103,81 % 67,3 ± 42,4 % Signifikanz vs. Kontrolle ns ns ns p < 0,05 111 Anhang Tab. 7.7: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat bei verschiedenen Zeitpunkten (aus Abb. 3.13). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat nach 25 min Ischämie Canrenoat nach 0 min Reperfusion Canrenoat nach 15 min Reperfusion n 10 6 6 6 Mittelwert ± SD 37,8 ± 7,4 % 6,7 ± 4,7 % 27,4 ± 8,3 % 27,0 ± 8,4 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,001 p < 0,01 p < 0,05 Tab. 7.8: Zusammenfassung der kardialen Troponin I-Werte (cTnI)im Blutplasma im in situ Mausmodell nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat bei verschiedenen Zeitpunkten (aus Abb. 3.13). Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat nach 25 min Ischämie Canrenoat nach 0 min Reperfusion Canrenoat nach 15 min Reperfusion n 10 6 6 6 Mittelwert ± SD 244,5 ± 58,1 % 42,4 ± 17,3 % 238,3 ± 46,2 % 274,2 ± 68,5 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,05 ns ns Tab. 7.9: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Mausmodell in CD73-/-Mäusen nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat (aus Abb. 3.14). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen . Wildtyp-Kontrolle Wildtyp-Canrenoat 1mg/kg CD73-/--Kontrolle CD73-/--Canrenoat 1mg/kg n 6 6 6 6 Mittelwert ± SD 32,0 ± 7,0 % 14,9 ± 8,8 % 33,0 ± 10,0 % 40,1 ± 6,2 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,01 ns Tab. 7.10: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Mausmodell in A2bAR-/-Mäusen nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat (aus Abb. 3.15). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. Wildtyp-Kontrolle Wildtyp-Canrenoat 1mg/kg A2bAR-/--Kontrolle A2bAR-/--Canrenoat 1mg/kg n 6 6 6 6 Mittelwert ± SD 32,0 ± 7,0 % 14,9 ± 8,8 % 41,7 ± 10,6 % 40,3 ± 9,2 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,01 ns 112 Anhang Tab. 7.11: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal im in situ Kaninchenmodell nach der Behandlung mit 1 mg/kg Canrenoat (aus Abb. 3.16). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. n 6 6 6 6 Kontrolle nach 4 h Reperfusion Canrenoat nach 4 h Reperfusion Kontrolle nach 72 h Reperfusion Canrenoat nach 72 h Reperfusion Mittelwert ± SD 55 ± 7,3 % 36 ± 8,9 % 49 ± 12 % 29 ± 13 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,05 p < 0,05 Tab. 7.12: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal in isolierten Rattenherzen (aus Abb. 3.17). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat 10 µM Canrenoat 50 µM Spironolacton 10 µM n 11 6 6 5 Mittelwert ± SD 40,8 ± 5,3 % 21,4 ± 9,6 % 10,2 ± 3,8 % 17,9 ± 6,3 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,01 p < 0,001 p < 0,01 Tab. 7.13: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes Akt (aus Abb. 3.18). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung der Akt Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. n 6 5 Kontrolle Canrenoat Mittelwert ± SD 1,52 ± 0,57 5,06 ± 3,54 Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,01 Tab. 7.14: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes ERK 1/2 (aus Abb. 3.19). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung beider Isoformen der ERK 1 und ERK 2 Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. n Mittelwert ± SD Signifikanz vs. Kontrolle 6 5 1,87 ± 1,01 8,67 ± 3,41 p < 0,001 6 5 1,65 ± 0,69 7,70 ± 2,85 p < 0,001 ERK 1 Kontrolle Canrenoat ERK 2 Kontrolle Canrenoat 113 Anhang 7.3 Wirkung von Aldosteron Tab. 7.15: Zusammenfassung der Infarktgrößen in Prozent vom Risikoareal in isolierten Rattenherzen (aus Abb. 3.20). Die Tabelle zeigt die jeweiligen Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die entsprechenden Signifikanzen. Kontrolle Eplerenon 10 µM Eplerenon 10 µM + ALDO 50 nM Eplerenon 10 µM + ALDO 500 nM ALDO 500 nM n 11 8 5 5 5 Mittelwert ± SD 40,8 ± 5,3 % 10,9 ± 7,2 % 15,2 ± 8,6 % 35,1 ± 3,5 % 36,4 ± 6,9 % Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,001 p < 0,001 ns ns Tab. 7.16: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes Akt (aus Abb. 3.21). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung der Akt Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe und Akt. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Kontrolle Eplerenon Eplerenon + Aldosteron Eplerenon + Wortmannin Aldosteron n 6 6 6 6 6 Mittelwert ± SD 1,52 ± 0,57 8,24 ± 3,38 2,83 ± 0,82 0,39 ±0,44 2,48 ±1,45 Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,001 ns ns ns Tab. 7.17: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes ERK 1/2 (aus Abb. 3.22). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung beider Isoformen der ERK 1 und ERK 2 Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Substanz ERK 1 Kontrolle Eplerenon Eplerenon + Aldosteron Wortmannin Aldosteron ERK 2 Kontrolle Eplerenon Eplerenon + Aldosteron Wortmannin Aldosteron n Mittelwert ± SD Signifikanz vs. Kontrolle 6 6 6 6 6 1,87 ± 1,01 8,58 ± 2,27 2,49 ± 2,60 1,71 ± 1,70 3,08 ± 1,57 p < 0,001 ns ns ns 6 6 6 6 6 1,65 ± 0,69 6,23 ± 4,04 1,40 ± 0,52 0,94 ± 0,34 1,75 ± 1,20 p < 0,001 ns ns ns 114 Anhang Tab. 7.18: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes Akt (aus Abb. 3.25). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung der Akt Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe und Akt. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. Kontrolle Canrenoat Canrenoat + Aldosteron Aldosteron n 6 5 5 6 Mittelwert ± SD 1,52 ± 0,57 5,06 ± 3,54 1,09 ± 0,66 2,48 ±1,45 Signifikanz vs. Kontrolle p < 0,01 ns ns Tab. 7.19: Zusammenfassung der Ergebnisse der Western Blot Analyse für phosphoryliertes ERK1/2 (aus Abb. 3.27). Die Tabelle zeigt die relative Änderung der Phosphorylierung beider Isoformen der ERK 1 und ERK 2 Kinase in der Reperfusion bezogen auf die Baselineprobe. Angegeben sind die Mittelwerte ± SD der einzelnen Gruppen und die Signifikanzen. ERK 1 Kontrolle Canrenoat Canrenoat + Aldosteron Aldosteron ERK 2 Kontrolle Canrenoat Canrenoat + Aldosteron Aldosteron n Mittelwert ± SD Signifikanz vs. Kontrolle 6 5 5 6 1,87 ± 1,01 8,67 ± 3,41 2,30 ±1,48 3,08 ± 1,57 p < 0,001 ns ns 6 5 5 6 1,65 ± 0,69 7,70 ± 2,85 2,61 ± 1,42 1,75 ± 1,20 p < 0,001 ns ns ___________________________________________________________________________ 115 Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der MathematischNaturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe. Katharina Schmidt ___________________________________________________________________________ 116 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei all denjenigen bedanken, die zum erfolgreichen Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben: Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Stephan B. Felix aus der Klinik für Innere Medizin B für die Möglichkeit, der Durchführung dieser Arbeit in seiner Abteilung und Herrn Prof. Dr. Heyo K. Kroemer aus dem Institut für Pharmakologie für die Überlassung des interessanten Promotionsthemas und Begutachtung dieser Arbeit. Herrn PD Dr. Thomas Krieg danke ich für die Betreuung der Arbeit und die sehr guten Forschungsbedingungen. Ein herzlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Marcus Dörr für die Betreuung der Arbeit in der Endphase und die Korrektur der Arbeit. Herrn Prof. Dr. Eltzschig danke ich für die Bereitstellung der knockout-Mäuse, die in dieser Arbeit Verwendung fanden. Für die Bestimmung des kardialen Troponin I-Spiegels möchte ich mich bei Herrn Dr. Tim Drogies aus dem Institut für Klinische Chemie und Labormedizin bedanken. Bedanken möchte ich mich auch bei der Versuchstierkunde der Universität Greifswald unter der Leitung von Frau Prof. Dr. Dr. Ingrid Klöting für die Zucht der knockout-Mäuse. Ein besonderer Dank gilt auch allen Mitarbeitern der kardiologischen Forschungsgruppe sowie dem gesamten Institut für Pharmakologie für die schöne Zeit und die gute Zusammenarbeit. Mein herzlicher Dank geht an Dr. Ute Gonnermann und Dr. Stefanie Samietz für die Korrektur meiner Doktorarbeit. Von ganzem Herzen danke ich meiner Familie, die mich in allen Lebenslagen unterstützt und mir ein großer Rückhalt ist.