Erfassung des mikrobiellen Abbaus von PAK in einem

Seminar
Umweltforschung im Brennpunkt Behandlung von Teeröl-S tandorten
8. Mai - 9. Mai 2014
Redoutensäle, Promenade 39, 4021 Linz
Thema:
Erfassung des mikrobiellen Abbaus von PAK
in einem kontaminierten Grundwasserleiter
mittels Isotopen- und Laboruntersuchungen
an BACTRAPS
Referentin:
Dr.in Petra Bombach
Erfassung des mikrobiellen Abbaus von
PAK in einem kontaminierten
Grundwasserleiter mittels Isotopen- und
Laboruntersuchungen an BACTRAPs
Dr. Petra Bombach
Fachtagung: Umweltforschung im Brennpunkt –
Behandlung von Teeröl-Standorten
Linz, 08.05.2014
Standortsituation Gaswerksgelände (DE)
Relevanz
biologischer
Schadstoffminderungsprozesse?
Betrieb des Gaswerkes 1848 – 1970
16-PAK: bis 36 mg/l
Sauerstoffkonzentrationen: 3,6 – 9,9 mg/l
SEITE 2
Mehrstufiges Untersuchungskonzept
BACTRAP®s
Labormikrokosmen
Foto: A. Künzelmann
Erkundung des mikrobiellen in
situ-Schadstoffabbaus für
Naphthalin und Fluoren
Quantifizierung der
mikrobiellen Mineralisierung für
Naphthalin, Fluoren,
Phenanthren und Acenaphthen
SEITE 3
BACTRAP®s
B.Schmidt-Brücken 2006
Trägermaterial
• mikrobielle Besiedlung
• Träger von Tracersubstanz
Geyer et al. (2005) Environ Sci Techn 39: 4983-4989
Stelzer et al. (2006) Org Geochem 37: 1394-1410
Bombach et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 86:839–852
SEITE 4
Nutzung stabiler Isotope als Tracer
13C-markierte
Schadstoffe
Natürliches KohlenstoffIsotopenverhältnis
13C:12C = 1:99
13C-CO
2
13C-Biomasse
SEITE 5
Konzept BACTRAP®s
Burkhard Schmidt-Brücken
2. Exposition
im Grundwasser
+ 13C-Substrat
1. Beladung mit isotopischmarkiertem Substrat (13C)
3. Einbau des 13C-Kohlenstoffes in die Biomasse
O
COOH
Fettsäuren
COOH
COOH
H2N
OH
Aminosäuren
RNA
DNA
Bombach et al. (2010) Appl Microbiol Biotechnol 86:839–852
SEITE 6
Flu Flu/Phe/Ace
GWM C
Nap
Nap
GWM F
Nap
Nap
GWM B
Nap
GWM E
GWM G
GWM A
GWM D
Nap
GWM H
Nap
Flu Flu/Phe/Ace
Flu Flu/Phe/Ace
Flu Flu/Phe/Ace
BACTRAPs & Labormikrokosmen, zentraler Fahnenbereich
BACTRAPs & Labormikrokosmen, Fahnenrandbereich
Einbau der BACTRAPs
SEITE 8
Nap
Analytik der BACTRAPs
Ausbau der BACTRAPs
Extraktion der Biomasse:
Aminosäuren
nach 68 bzw.
100-tägiger
Inkubation
GC
IRMS
GC-MSD
Identifizierung und Quantifizierung
der Aminosäuren
Analyse der 13C-Anreicherung
in den Aminosäuren
SEITE 9
Mikrobielle Besiedlung der BACTRAPs
Gaschromatographie-Massenspektrometrie der mikrobiellen Aminosäuren
Abundanz
Abundance
TIC: A65.D\data.ms
4e+07
3.5e+07
3e+07
2.5e+07
2e+07
1.5e+07
1e+07
5000000
4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00
Time-->
Retentionszeit [min]
SEITE 10
Einheiten von Isotopenanalysen
Isotopenverhältnisse werden in ‰ angegeben
Probe
C ‰
1
x 1000
Standard
(Unterschied gegenüber einem internationalen Standard;
in Tausendstel)
0 ‰ = 1,11 % 13C (Standard)
1000 ‰ = 2,20 % 13C
SEITE 11
Nachweis des in situ-Abbaus von Naphthalin
Gaschromatographie-Isotopen-Massenspektrometrie
13C-Gehalt der Aminosäuren in der aufgewachsenen Biomasse
50.000
45.000
40.000
Zentraler
Fahnenbereich
Fahnenrandbereich
Alanin
Glycin
Threonin
13C
AS
(‰)
35.000
Serin
Valin
30.000
Leucin
Isoleucin
25.000
Prolin
20.000
Asparagin
Methionin
15.000
Glutamin
10.000
Phenylalanin
Tyrosin
5.000
Lysin
0
UA 92005
GWM
A
UA 92003
GWM
B
UA
92009E
GWM
RKB
127F
GWM
Natürliche Kohlenstoffisotopensignaturen von Aminosäuren: 0 bis -74 ‰
Maximale Isotopenanreicherung: +38.000 ‰ (entspricht 30 % 13C-Gehalt)
SEITE 12
Nachweis des in situ-Abbaus von Fluoren
Gaschromatographie-Isotopen-Massenspektrometrie
13C-Gehalt der Aminosäuren in der aufgewachsenen Biomasse
3.400
2.900
Zentraler
Fahnenbereich
Fahnenrandbereich
Alanin
Glycin
Threonin
2.400
Serin
13C
AS
(‰)
Valin
1.900
Leucin
Isoleucin
1.400
Prolin
Asparagin
Glutamin
900
Phenylalanin
Tyrosin
400
-100
Lysin
GWM 3
GWM C
RKB 139
RKB 222
GWM D
GWM G
RKB 229
GWM H
Natürliche Kohlenstoffisotopensignaturen von Aminosäuren: 0 bis -74 ‰
Maximale Isotopenanreicherung: +2.500 ‰ (entspricht 4 % 13C-Gehalt)
SEITE 13
Vergleichende Betrachtung der Abbauaktivität
13C-Kohlenstoffgehalt
extrahierter Aminosäuren (µg 13C/BACTRAP)
Zentraler Fahnenbereich
Naphthalin-
A
B
90
90
C
D
Fahnenrandbereich
E
F
219
97
G
H
0,9
0,8
BACTRAPs
Fluoren-
-*
0,5
BACTRAPs
deutlich höherer Abbau von Naphthalin im Vergleich zu Fluoren
SEITE 14
Mehrstufiges Untersuchungskonzept
BACTRAP®s
Labormikrokosmen
Foto: A. Künzelmann
Erkundung des mikrobiellen in
situ-Schadstoffabbaus für
Naphthalin und Fluoren
Quantifizierung der
mikrobiellen Mineralisierung für
Naphthalin, Fluoren,
Phenanthren und Acenaphthen
SEITE 15
Konzept Labormikrokosmen-Untersuchungen
1
Mikrobielle
Besiedlung der
BACTRAPs
Einbringung von
BACTRAPs beladen
mit 12C-PAK
Kultivierung der
Mikroorganismen
mit 13C-markierten PAK
13CO
2
sensitive Erfassung des Abbaus
Bilanzierung der mikrobiellen Mineralisierung
SEITE 16
Flu Flu/Phe/Ace
GWM C
Nap
Nap
GWM F
Nap
Nap
GWM B
Nap
GWM E
GWM G
GWM A
GWM D
Nap
GWM H
Nap
Flu Flu/Phe/Ace
Nap
Flu Flu/Phe/Ace
Flu Flu/Phe/Ace
BACTRAPs & Labormikrokosmen, zentraler Fahnenbereich
BACTRAPs & Labormikrokosmen, Fahnenrandbereich
Umsetzung der Labormikrokosmen-Untersuchungen
13C-Naphthalin
Grundwasser
13C-Fluoren
13C-Phenanthren
13C-Acenaphthen
regelmäßiges Monitoring der
Sauerstoffkonzentration
regelmäßiges Monitoring der
Entwicklung an 13CO2
Inkubation bei 14°C im Dunklen
2 Lebendansätze, 1 Totkontrolle
in situ-nahe Bedingungen
SEITE 18
Mineralisierung von Naphthalin
Zentraler Fahnenbereich
kontinuierlich belastete Messstellen
7.000
6.000
5.000
3.000
GWM
A
UA
92005
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
GWM
B
UA
92003
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
13
C CO 2 (‰ )
4.000
2.000
1.000
0
-500
0
10
20
30
40
50
60
70
Inkubationszeit (d)
Fahnenrandbereich
intermittierend belastete Messstellen
7.000
hohe Mineralisierung
von Naphthalin
6.000
5.000
3.000
GWM
E
UA
92009
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
GWM
RKB 127F
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
13
C C O2 (‰ )
4.000
2.000
1.000
0
-500
0
10
20
30
40
50
60
70
Inkubationszeit (d)
SEITE 19
Mineralisierung von Fluoren
Zentraler Fahnenbereich
kontinuierlich belastete Messstellen
5.000
4.000
2.000
GWM
GWM
3C
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
RKB
139D
GWM
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
13
C C O2 (‰ )
3.000
1.000
0
0
10
20
30
40
50
60
70
generell hohe Mineralisierung
von Fluoren
Indizien für höhere
Mineralisierung
im Fahnenrandbereich
Inkubationszeit (d)
Fahnenrandbereich
intermittierend belastete Messstellen
5.000
4.000
2.000
GWM
RKB
222G
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
GWM
RKB
229H
Lebendansatz
Lebendansatz
Kontrolle
13
C CO 2 (‰ )
3.000
1.000
0
-500
0
10
20
30
40
Inkubationszeit (d)
SEITE 20
50
60
70
Bilanzierung der Mineralisierung
PAK
Herkunft
BACTRAP
Charakteristik
Messstelle
13
CO2
(mg/(l*62d))
PAKUmsatz
(µg/(l*62d))
MW PAKUmsatz
(µg/(l*62d))
PAKMineralisierung
(µg/(l*d))
MW PAKMineralisierung
(µg/(l*d))
Nap
UA
GWM
92005
A
kont. bel.
6,8
3,4
3,4
283
305
7,0
3,5
9,3
4,6
6,4
3,2
7,4
3,7
6,0
3,0
7,5
3,7
7,2
3,6
1,1
0,7
1,3
0,9
2,4
1,7
2,7
1,9
3,6
2,5
2,8
1,9
3,3
2,3
2,5
1,7
0,6
2,3
0,4
1,8
0,4
1,8
0,6
2,4
0,7
2,7
0,5
2,0
1,0
4,1
0,9
3,7
0,5
1,6
0,4
1,4
1,3
4,4
0,9
3,0
0,9
3,0
0,7
2,6
0,8
2,9
1,2
4,2
GWM
B
UA
92003
kont. bel.
UA
GWM
92009
E
int. bel.
GWM
F
RKB
127
Flu
int. bel.
GWM 3
GWM C
kont. bel.
RKB
139
GWM
D
kont. bel.
RKB
222
GWM
G
int. bel.
GWM
H
RKB
229
Phe
int. bel.
GWM 3
C
kont. bel.
RKB
139
GWM
D
Ace
kont. bel.
RKB
222
GWM
G
int. bel.
GWM
H
RKB
229
int. bel.
GWM
GWM 3
C
kont. bel.
RKB
139
GWM
D
kont. bel.
RKB
222
GWM
G
int. bel.
GWM
H
RKB
229
int. bel.
Mineralisierung:
328
3,9
1546
1592
1639
3,3
164
13C-PAK
160
156
3,7
262
+ O2
13CO
2
+ H2O
252
242
0,8
25
23
21
1,8
32
44
55
2,2
98
82
67
2,0
87
81
Mineralisierung:
75
2,0
46
45
45
2,1
50
40
18 – 1592 µg PAK l-1 d-1
30
2,3
63
3,9
136
51
39
128
120
1,5
17
18
20
3,7
104
86
68
2,8
71
67
62
3,5
95
99
104
SEITE 21
Protein-Stable Isotope
Probing (SIP) zur
Identifizierung der
Naphthalinabbauer
+
Extraction & Separation
gel-based
gel-free
1D
12C
LC-MS
2-DE
13C
12C
13C
12C
pI
MALDI-MS
13C
IPP
Time
Int.
MW
SMM
12C
Int.
large scale
m/z
MW
m/z
Int.
12C
low scale
m/z
13C
13C
Data analysis
98%
12C 13C
modifiziert nach Jehmlich et al. (2010) Nature Protocols 5(12): 1957-1966
SEITE 22
Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaften
Metaproteomanalyse
Dominanz von Burkholderiales, Actinomycetales und Rhizobiales
Herbst et al. (2012) Proteomics 13(18-19): 2910-2920
SEITE 23
Nachweis des aeroben
PAK-Abbaus
*
*
*
*
Burkholderiales als Keyplayer des aeroben
Naphthalinabbaus identifiziert
*
*
*
*
*13C-Einbau
Herbst et al. (2012) Proteomics 13(18-19): 2910-2920
SEITE 24
Zusammenfassung
Wirksamkeit der biologischen Schadstoffminderung wurde
am Standort qualitativ und quantitativ erfasst
intensive biologische Abbauprozesse sowohl in den
Fahnenrandbereichen als auch im Schadensherdbereich
zum Teil höhere Abbauaktivitäten in den
Fahnenrandbereichen als im Schadenherdbereich
der Naphthalinabbau erfolgt schneller als der Abbau anderer PAKs
SEITE 25
Zusammenfassung
hohe Sauerstoffkonzentrationen begünstigen den
mikrobiellen Schadstoffabbau
Dominanz aerober Abbauprozesse
Relevanz von Burkholderiales für Naphthalin-Abbau
nachgewiesen
Mineralisierungsraten: 18 – 1592 µg PAK l-1 d-1
Auf Grundlage der nachgewiesenen mikrobiellen Abbauprozesse
ist bei gleichbleibend hohen Sauerstoffkonzentrationen
von einer kontinuierlichen, deutlichen
Reduzierung der Schadstofffracht auszugehen.
SEITE 26
Danksagung
Thomas Brunner
Hans H. Richnow
Carsten Vogt
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
SEITE 27