Lokalisation und Blockade der Serinprotease uPA

Aus der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik
Der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. K. Roosen
Lokalisation und Blockade der Serinprotease uPA
Im C6-Glioblastom-Modell der Ratte
Inaugural - Dissertation
Zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Vorgelegt von
Patrick Schuler
aus Würzburg
Würzburg, Dezember 2005
Referent:
Prof. Dr. K. Roosen
Koreferent:
Prof. Dr. W. Roggendorf
Dekan:
Prof. Dr. G. Ertl
Tag der mündlichen Prüfung:
Der Promovend ist Arzt
20. Juli 2006
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1
Tumoren des Zentralen Nervensystems
___________
1
1.2
Die Gruppe der Astrozytome
___________
1
1.3
Das Glioblastoma multiforme
___________
3
1.4
Mechanismus der Zellmigration
___________
6
1.5
Die Kaskade der Proteolyse
___________
7
1.6
Das Enzym uPA und sein Rezeptor
___________
9
1.7
Die physiologische Inhibition von uPA
___________
11
1.8
Der uPA-Inhibitor WX-UK 1
___________
14
1.9
Die Bedeutung von uPA in der Klinik
___________
14
1.10
Die Entstehung und Differenzierung von Tiermodellen
___________
15
1.11
Zielsetzung
___________
18
2. Geräte, Materialien, Chemikalien
2.1
Geräte und Laborhilfen
___________
20
2.2
Verbrauchsmaterialien
___________
21
2.3
Chemikalien
___________
22
2.4
Antikörper und Reagenzien für die Immunhistochemie
___________
22
2.5
Enzyme, Puffer und Nukleinsäuren für die PCR
___________
23
2.6
Medikamente
___________
23
2.7
Puffer und Lösungen
___________
24
2.8
Reagenzien für die Zellkultur
___________
24
3. Methoden
3.1
Zellbiologische Methoden
___________
26
3.1.1
Ursprung und Transfektion der C6-Zelllinie
___________
26
3.1.2
Monolayerzellkultur der C6 Gliomzellen
___________
26
3.1.3
Einfrieren und Auftauen der Gliomzellen
___________
27
3.1.4
Die Anlage von Sphäroidkulturen
___________
28
3.2
Tierversuche
___________
29
3.2.1
Implantation der Tumorsphäroide
___________
29
3.2.2
Verabreichung des uPA-Inhibitors WX-UK 1
___________
30
3.2.3
Kernspintomographie MRT
___________
31
3.2.4
Explantation
___________
32
3.3
Färbungen
___________
32
3.3.1
Hämalaun-Eosin Färbung
___________
32
3.3.2
Immunhistochemischer Nachweis von uPA
___________
33
3.3.3
Peroxidasefärbung
___________
33
3.4
Die Polymerasekettenreaktion PCR
___________
35
3.4.1
Isolierung der RNA
___________
35
3.4.2
Die Reverse Transkription
___________
36
3.4.3
Amplifikation von cDNA mittels PCR
___________
37
3.4.4
Die spezifischen Primerpaare für GAPDH und uPA
___________
38
3.4.5
Auftrennung der cDNA mittels Gelelektrophorese
___________
39
3.5
Synthese und Messung des radioaktiven H³WX-UK1
___________
40
4. Ergebnisse
4.1
Nachweis von uPA in C6-Gliomzellen mittels PCR
___________
42
4.2
In vitro-Nachweis von uPA in der Glioblastomzelle
___________
44
4.3
Nachweis von uPA im C6-Gliommodell der Ratte
___________
44
4.4
Zeitlicher Verlauf der Proteasen-Expression
___________
45
4.5
Sphäroidimplantation und WX-UK 1-Applikation
___________
46
4.6
Einfluss von WX-UK 1 auf das Tumorwachstum
___________
46
4.7
Biodistribution von WX-UK1 in der Ratte
___________
47
5. Diskussion
5.1
Tiermodelle in der Erforschung von Hirntumoren
___________
50
5.2
Das Sphäroidmodell der Ratte
___________
51
5.3
Die C6-Gliomzelllinie
___________
53
5.4
Die Rolle von uPA in der Zellmigration
___________
54
5.5
Die Malignität des Glioblastoma multiforme
___________
55
5.6
Auswirkungen der Applikation von WX-UK 1
___________
55
5.7
Ausblick
___________
56
6. Zusammenfassung
___________
58
7. Abkürzungsverzeichnis
___________
60
8. Literaturverzeichnis
___________
62
Danksagung
Lebenslauf
1.
EINLEITUNG
1.1
Tumoren des Zentralen Nervensystems (ZNS)
Dem Engländer Victor Horsley gelang es, vor über hundert Jahren seinem Patienten ein
Gliom in der rechten Hemisphäre operativ zu entfernen. Wie sein deutscher Kollege
v.Bergmann berichtete, haben ihm dazu „außer den Celebritäten seines Vaterlandes auch
Charcot und Andere mit vollem Rechte gratulirt“. Die Geschichte der neurochirurgischen
Tumortherapie hatte begonnen. (HORSLEY, 1886)
Heutzutage steht die Neurochirurgie vor dem Herausforderung, dass Hirntumoren zwar
operativ entfernt, aber nicht komplett geheilt werden können und es, ähnlich wie bei
Horsley’s Patient, zu Rezidiverscheinungen kommt. Die Gruppe der Hirntumoren wird nach
histopathologischen Gesichtspunkten klassifiziert und unterschiedlichen Ursprungsgeweben
zugeordnet. Prinzipiell können fast alle Gewebearten des Gehirns als Grundlage für eine
Neoplasie dienen, aber die Gliome weisen die höchste Inzidenz der Tumoren im ZNS auf. Sie
haben ihren Ursprung in den Zellen des neuronalen Stützgewebes und werden mit den
Ependymomen zu den neuroepithelialen Tumoren zusammengefasst. Weiterhin werden die
Medulloblastome mit embryonalem Ursprung und die Meningeome differenziert, welche sich
aus den Zellen der Hirnhäute bilden.
1.2
Die Gruppe der Astrozytome
Über 60 % der intrakraniellen Hirntumoren werden als Gliom identifiziert und die jährliche
Inzidenz liegt bei 6-7 von 100.000 Menschen. Das Gliom hebt sich durch sein besonders
infiltratives Wachstum in das umgebende Hirngewebe hervor, welches den Übergang von
Tumorgewebe zu Hirngewebe verwischt. Die Tatsache, dass im Normalfall keine scharfe
Tumorgrenze erkennbar ist, schließt eine komplette chirurgische Resektion und bis auf
wenige Ausnahmen eine vollständige Heilung aus.
Das Astrozytom, welches die größte Gruppe innerhalb der Gliome bildet, tritt gehäuft in den
Großhirnhemisphären und seltener in den Basalganglien, im Hirnstamm oder im Spinalkanal
auf. Die WHO teilt die Gruppe der Astrozytome mittels Malignität und Morphologie nach
folgendem Schema ein:
1
Grad
I
WHO-Bezeichnung
Morphologie
Malignität
ÜL
Pilozytisches Astrozytom
Zellarm, Rosenthalfasern,
benigne
> 50 J
Hochdifferenziert, zellarm,
niedrig
5-8 J
geringe Polymorphie
maligne
Anaplastische Zellen , Mitosen,
semi-
Einzelnekrosen
maligne
Flächennekrosen, hohe
hoch
Polymorphie, viele Mitosen
maligne
Zystenbildung, wenige Mitosen
II
III
Diffuses Astrozytom
Anaplastisches
Astrozytom
IV
Glioblastoma multiforme
2-5 J
<1J
Abb 1. Tumours of the Nervous System (Kleihues et al., 2002)
Bei der Einschätzung der Malignität spielen diejenigen morphologischen Merkmale eine
bedeutende Rolle, welche auf ein schnelles Größenwachstum des Tumors hinweisen. Hierzu
zählen die Anzahl von Mitosen, die endotheliale Proliferation, die Zelldichte und die
Anwesenheit von zentralen Gewebsnekrosen, welche Zeichen von unzureichender
Blutversorgung bei zu schnellem Größenwachstum sind. Die Infiltrationsmerkmale des
Tumors geben Hinweise auf die Erfolgsaussichten einer kompletten Resektionsoperation.
(Giese and Westphal, 2001)
Um aber den Wachstumsverlauf des Tumors und die Prognose für den Patienten korrekt
einschätzen zu können, müssen außerdem biologische Merkmale, wie Alter und
Allgemeinzustand des Patienten, sowie Lokalisation des Tumors zu lebenswichtigen
Hirnstrukturen berücksichtigt werden. (Buckner, 2003)
Das pilozytische Astrozytom ist ein Tumor des Kinder- und Jugendalters und wird aufgrund
seiner Benignität in der aktuellen Gradierung der WHO nicht der Gruppe der Astrozytome
zugeteilt. Wahrscheinlich unterscheidet sich das pilozytische Astrozytom in seinem Urpsrung
wesentlich von den höhergradigen Astrozytomen und wird deshalb als eigenständiger Tumor
gerechnet.
Das niedriggradige Astrozytom des jungen Erwachsenenalters wird den diffusen
Astrozytomen WHO-Grad II zugeteilt. Seine ausgeprägte Tendenz zur malignen Entartung
grenzt es von benignen Hirntumoren ab. Schon hier zeigt sich die Bereitschaft der
Tumorzellen das angrenzende Tumorgewebe zu infiltrieren. Ein hohes Maß an zellulärer
Differenzierung grenzt es aber von den hochmalignen Astrozytomen ab.
2
Das anaplastische Astrozytom zeichnet sich durch seine erhöhte Anaplasie und vermehrt
auftretende Mitosen auf. Die Proliferationstendenz ist hoch und mikroskopisch erkennbare
Einzelnekrosen, sowie Gefäßproliferate sind für diesen Tumor charakteristisch. Im
Kernspintomogramm kommt es meist zu unregelmäßiger Kontrastmittelaufnahme, die
Prognose ist durch den geringen Differenzierungsgrad der Zellen und die häufigen Rezidive
erheblich schlechter, als bei dem niedriggradigen Astrozytom.
1.3
Das Glioblastoma multiforme GBM
Die Ätiologie des GBM ist wie bei den meisten anderen Hirntumoren weitgehend unbekannt.
Molekulargenetisch konnte ein Allelverlust auf Chromosom 10 nachgewiesen werden,
welcher bei ca 75% aller Glioblastome auftritt. Sowohl beim GBM als auch bei Astrozytomen
WHO II und III finden sich in vielen Fällen zusätzlich Allelverluste auf den Chromosomen
17p, 19q und 9p und eine Mutation des p53-Gens. (von Deimling et al., 1992). Diese
genetischen
Veränderungen
führen
zu
einer
Deletion
oder
Mutation
von
Tumorsuppressorgenen und bedingen somit das Wachstum des Tumors. Weiterhin gibt es
Hinweise dafür, dass die Genotypisierung Information enthält, welche die Prognose des
Patienten beeinflusst. (Schmidt et al., 2002)
Das Glioblastom weist unter den glialen Hirntumoren die höchste Malignität auf und wird
deshalb als WHO-Grad IV eingestuft. Es liegt eine vollständige morphologische
Entdifferenzierung der Tumorzellen vor, so dass sie embryonalen Zellen sehr ähnlich sind.
Die hohe Teilungsfähigkeit und das stark infiltrierende, unkontrollierbare Wachstum in das
benachbarte Hirngewebe machen das GBM zu dem gefährlichsten uns bekannten Hirntumor.
Über die Expression von angiogenetischen Faktoren wird die Neoangiogenese zur
Sicherstellung
der
eigenen
Blutversorgung
angeregt.
Die
Ausschüttung
von
proinflammatorischen Zytokinen führt zu einem perifokalen Ödem, sowie zur erhöhten
Gefäßpermeabilität, was zu der lokalen Anreicherung von Medikamenten und der typischen
gesteigerten Kontrastmittelaufnahme bei der Magnetresonanztomographie führt. Bevorzugt
tritt das GBM in den Hemisphären auf und neigt auch schon im Frühstadium zum
sogenannten Schmetterlingsgliom, bei welchem beide Hemisphären unter Einschluss des
Balkens symmetrisch betroffen sind. Hat der Tumor das corpus callosum befallen, so ist dies
prognostisch ungünstig und vermindert die mediane Überlebenszeit des Patienten. (Steltzer et
al., 1997)
3
1.3.1 Histologie
Makroskopisch und histophatologisch fällt das GBM durch ausgeprägte Zell- und
Kernpolymorphie auf, welche zu einem multiformen Bild aus flächenhaften Gewebsnekrosen,
Einblutungen und Zysten führt. Die hohe Anzahl der Mitosen spiegelt die vielen parallel
ablaufenden Zellteilungen und somit das rasche Wachstum des Tumors wider. Die
Infiltrationtendenz des Tumors zeigt sich an den Tumorzellnestern, welche weit in das
gesunde Nachbargewebe hineinreichen und die so genannte Infiltrationszone bilden. (Burger
et al., 1988) Auch die Proliferation der Endothelzellen und die hohe Gefäßdichte tragen zum
äußerst heterogenen Erscheinungsbild des GBM bei, welches bei kleinen stereotaktisch
gewonnenen Gewebsproben zu Schwierigkeiten bei der Diagnose führen kann. (Kleihues et
al., 1995)
1.3.2 Klinik
Die Adaption des Gehirns an die Raumforderung ist mäßig, da das Gliom im Normalfall ein
rasch progredientes Größenwachstum aufweist. Infolgedessen tritt das Glioblastom klinisch
durch ausgeprägte Hirndruckzeichen in Erscheinung, welche Kopfschmerzen, Schwindel,
Erbrechen und Sehstörungen mit sich führen können. Im weiteren Verlauf treten Epilepsien
und neurologische Ausfälle, wie Sprachstörung und Hemiparese auf, deren Symptomatik
stark von der Lokalisation des Tumors im Gehirn abhängt.(Salcman, 1985) Der Altersgipfel
für das GBM liegt im sechsten Lebensjahrzehnt (53 Jahre) und tritt bei Männern und Frauen
mit etwa der gleichen Häufigkeit auf. Mit Hinblick auf die Malignität des Glioblastoms ist die
relativ kurze Anamnese von wenigen Wochen bis Monaten verständlich. Eine Ausnahme
bildet hier die Patientengruppe mit einem sekundären GBM, welches sich aus einem
Astrozytom zweiten oder dritten Grades mit den entsprechenden Symptomen entwickelt.
1.3.3 Diagnosestellung
Die klinische und anamnestische Diagnosestellung wird wesentlich unterstützt durch die
modernen radiologischen Bildgebungsverfahren und Kontrastmittelgabe. Hierbei bietet die
Magnetresonanztomographie (MRT) gegenüber der Computertomographie (CT) den Vorteil
der besseren anatomischen Auflösung der intrakraniellen Strukturen. In der T1-gewichteten
Aufnahme ist eine ringförmige Kontrastmittelanreicherung im Tumorgewebe sichtbar, welche
4
durch die Störung der Bluthirnschranke im Bereich des Tumors entsteht. Da sich nur das
solide Tumorgewebe strukturell im MRT abhebt, stimmt die radiologisch bestimmte
Abgrenzung des Tumors nicht mit der tatsächlichen Ausdehnung des Tumors überein. Die
oftmals mehrere Zentimeter betragende Differenz zur anatomischen Ausdehnung wird durch
die T2-gewichtete MRT-Aufnahme verdeutlicht, welche zusätzlich das angrenzende Ödem,
sowie die Infiltrationszone des Glioms abbildet. Die Darstellung der soliden Tumorgrenze ist
hierbei allerdings nicht mehr möglich. Außerdem finden sich auch außerhalb der im T2-MRT
dargestellten Invasionszone vereinzelt Tumorzellen, welche der diagnostischen Bildgebung
entgehen. (Giese and Westphal, 2001)
1.3.4 Therapie
Die Standardtherapie des Glioblastoma multiforme besteht aus einer Kombination von
radikaler Tumorresektion und anschließender Bestrahlung. Die offene chirurgische Resektion
wird mit dem Ziel der maximal möglichen Reduktion der Tumormasse unter gleichzeitiger
Schonung der wichtigen angrenzenden Hirnstrukturen durchgeführt. Somit wird die
Ausgangssituation für die adjuvante Radiotherapie verbessert und das Auftreten von
unerwünschten Nebenwirkungen
vermindert. Das
bei der
Operation entnommene
Tumorgewebe wird zur histologischen Diagnostizierung des Tumors verwendet.
Aufgrund der ausgeprägten Invasionstendenz der Tumorzellen ist die komplette Resektion des
GBM bisher definitiv nicht möglich. Die Einführung modernster Operationsmethoden, wie
3D-Neuronavigation und Stereotaxie, haben zwar die Resektionstechnik verfeinert, konnten
aber die mediane Überlebenszeit des Patienten nicht entscheidend verlängern und die
anschließende Radiotherapie ist weiterhin obligatorisch. Durch die Gesamtstrahlendosis von
bis zu 60 Gray (Gy) soll das Auftreten eines Tumorrezidives verhindert oder zumindest
verzögert werden. Die mittlere Überlebenszeit für das Glioblastoma multiforme nach OP und
Bestrahlung liegt bei etwa 12 Monaten. (Fine et al., 1993), (Jeremic et al., 2004)
Im Bereich der Chemotherapie verdient vor allem die Forschungsarbeit der Arbeitsgruppe
Stupp Beachtung.(Stupp et al., 2005) Der Einsatz des Alkylanziums Temozolomid führt bei
Patienten mit histologisch gesichertem GBM im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer
Verlängerung der Überlebenszeit um durchschnittlich 2,5 Monate.
5
Das zytotoxische Alkylanzium vernetzt durch Übertragung einer Alkylgruppe zwei DNAStränge miteinander und verhindet so eine korrekte Replikation des Genmaterials während der
Zellteilung. Neben den Tumorzellen selbst wirkt Temozolomid auch auf das DNAReparaturenzym Methyl-Guanin-DNA-Methyltransferase (MGMT). Wahrscheinlich wird
durch die Gamma-Radiotherapie die Expression von MGMT induziert, dessen DNAReparaturmechanismus die Wirkung der Alkylantien antagonisiert. Ein niedriger MGMTLevel korreliert also mit einer längeren Überlebenszeit bei GBM-Patienten, welche eine
adjuvante
Chemotherapie
auf
Alkylantienbasis
erhalten.
Bemerkenswert
ist,
dass
Temozolomid in fast allen prognostischen Untergruppen der Studie eine Verlängerung der
Überlebenszeit hervorgerufen hat. Somit kann sich die zusätzliche Temozolomidtherapie
schon bald zur Standardbehandlung bei Glioblastoma multiforme entwickeln. Große
Erwartungen werden an neue Therapiemethoden gerichtet, welche aber bisher keine
entscheidende Verlängerung der Überlebenserwartung bewirkt haben. Hier sind vor allem die
Gentherapie, die Immuntoxintherapie (Vallera et al., 2002) und die intraoperative Diagnostik
(Giese, 2004) zu nennen.
Durch eine radikale Einschränkung der Tumorzellinvasion in das benachbarte Hirngewebe
könnte die Abgrenzbarkeit des Tumors und der Erfolg einer Resektionsoperation erheblich
verbessert werden. Dieser Therapieansatz soll in dieser Arbeit näher diskutiert und auf seine
praktische Durchführbarkeit untersucht werden.
1.4
Mechanismus der Zellmigration
Die Zellmigration spielt im Wachstumsverlauf des Tumors eine bedeutende Rolle. Ohne die
Zellwanderung wäre der Tumor auf präformierte Höhlen im menschlichen Körper beschränkt
und hätte keine Möglichkeit, sich weiter auszubreiten. Auch die Versorgung mit Nährstoffen
könnte nicht sichergestellt werden, da auch der Zugang zu den körpereigenen Blutgefäßen auf
die Migration der Tumorzellen angewiesen ist.
Die Zellen des Glioblastoma multiforme haben diese Eigenschaft perfektioniert und sind in
Bezug auf Geschwindigkeit und Reichweite ihrer Migration anderen Tumorarten weit
überlegen. Dies spiegelt sich in der rasanten Ausbreitung von Tumorzellnestern bis in die
kontralaterale Hirnhälfte und der enormen Größenzunahme des Tumors innerhalb kurzer Zeit
wider.(Lefranc et al., 2005) Die Zellmigration basiert im Wesentlichen auf der strukturierten
Proteolyse der Extrazellulärmatrix (ECM) und muss zur erfolgreichen Therapie des GBM
weiter untersucht werden.
6
1.5
Die Kaskade der Proteolyse
Die Umstrukturierung von Extrazellulärmatrix ist ein physiologischer Vorgang, welcher in
vielen Bereichen des menschlichen Körpers abläuft. Besonders eindrücklich geschieht dies
zum Beispiel bei der Wundheilung, der Embryogenese und der Abkapslung von
entzündlichen Prozessen. (Rabbani, 1998c) Der Abbau der ECM wird unter anderem durch
das Enzym Urokinaseplasminogen-Aktivator (uPA) induziert und häufig bei hochmalignen
Tumoren beobachtet. Die Tumorzellen induzieren die Degeneration der Matrixproteine, um
die gewonnenen Freiräume selbst zu infiltrieren. Im Falle des GBM entsteht so im gesunden
Hirngewebe eine Infiltrationszone mit multiplen malignen Tumorzellnestern, aus denen sich
das Rezidiv entwickelt. Eine adjuvante Bestrahlungstherapie ist hier nur sehr schwer und mit
äußerster
Zurückhaltung
durchführbar,
da
die
mitbetroffenen
Gehirnzellen
oft
überlebenswichtige Funktionen ausführen.
Die Infiltration der ECM verläuft typischer Weise in drei Schritten, welche durch die
Anheftung der Tumorzelle (1), die Degeneration der ECM (2) und die Migration der
Tumorzellen in das umliegende Hirngewebe (3) charakterisiert werden. (MacDonald et al.,
1998).
Die Adhäsion der Tumorzelle an die ECM erfolgt maßgeblich über den uPA-Rezeptor
(uPAR), welcher neben der uPA-Bindungsstelle eine weitere Bindungsstelle für das
matrixeigene Protein Vitronectin besitzt. Verstärkt wird die Bindungsaffinität zwischen uPAR
und Vitronectin durch eine Anbindung von uPA an uPAR. PAI-I hingegen schwächt die
Affinität des Komplexes ab. Der Rezeptor uPAR bindet sowohl an uPA als auch pro-uPA und
potenziert dessen Aktivität bei der Proteolyse von Plasminogen auf das zehnfache. Die
Aktivierung von uPA durch den ortsgebundenen uPA-Rezeptor, sowie die hohe Affinität von
uPAR zu Vitronectin und dem Zellwandintegrin αvβ3 konzentrieren die proteolytische
Aktivität des uPA-Systems auf die Extrazellulärmatrix in unmittelbarer Nähe des Tumors.
(Mazar, 2001b) Folglich werden die höchsten Konzentrationen von uPA und uPAR im
Anfangsstadium im gesamten Tumor, später überwiegend in der Grenzzone des Tumors
gemessen und ermöglichen im weiteren Verlauf die Migration der Tumorzellen in die
Infiltrationszone. (Sandstrom et al., 1999) Der uPA-Rezeptor kann also als Bindeglied
zwischen dem Substrat Matrixprotein und dem Enzym uPA-Protease bezeichnet werden.
Erhöhte Werte des Matrixproteins Vitronectin führen zu einer Konzentrationssteigerung des
uPA-uPAR-Komplexes und unterstützen die Zentrierung der Proteaseaktivität auf die
7
Extrazellulärmatrix. (Mohanam et al., 1999) Das Zusammenspiel der Proteolysen uPA und
Plasmin, sowie der Gruppe der MMP’s führt zur Degeneration der Matrixproteine durch
Proteinspaltung und ermöglicht die anschließende Migration der Tumorzelle.
Gliomzellen weisen eine erhöhte Affinität zu Myelin auf, welches vermehrt in der ECM der
weißen Substanz, z.B. corpus callosum, vorkommt. Diese Affinität beeinflusst die
Migrationstendenz
der
Tumorzellen
und
erklärt
die
häufige
Beobachtung
von
Schmetterlingsgliomen mit Verbindung über den Balken. Nach dem gleichen Prinzip erfolgt
die Migration entlang von Blutgefäßen, wobei hier die Affinität von uPAR zu Vitronectin und
dessen erhöhte Konzentration in der vaskulären Basalmembran entscheidend sind. Ungeklärt
bleibt bisher, warum Gliomzellen zwar eine hohe Affinität zur Basalmembran aufweisen,
nicht aber die Fähigkeit besitzen deren endothelialen Anteil zu durchdringen. Die
ungewöhnliche Einhaltung dieser Grenzschicht durch die hochmalignen Tumorzellen ist der
Grund für die fehlende vasale Metastasierung des Tumors. (Bernstein and Woodard, 1995)
Die an der Degeneration beteiligten Enzyme werden unterteilt in die Plasmin-Einheit, die
Gruppe der Matrixmetalloproteasen (MMPs) und den uPA-uPAR-Komplex. uPA spielt nach
bisherigen Erkenntnissen die hervorstehende Rolle, da es außer seiner eigenen proteolytischen
Aktivität die Eigenschaft besitzt, weitere beteiligte Proteasen zu aktivieren. So wird die
Vorstufe Plasminogen durch uPA in aktives Plasmin gespalten, welches wiederum die Gruppe
der MMPs aktiviert. Die Stellung des uPA zu Anfang der proteolytischen Kaskade bietet
einen geeigneten therapeutischen Ansatz, um die degenerative Aktivität des Tumors zu
unterbinden.
Abb 2. Die Proteolytische Kaskade
8
1.6
Das Enzym uPA und sein Rezeptor
Der Urokinase-Plasminogen-Aktivator uPA wird zu der Gruppe der Serinproteasen gerechnet
und besteht aus zwei aktiven Regionen. Die enzymatische LMW-Region (low molecular
weight) bewirkt die proteolytische Aktivität von uPA und induziert die ECM-Degeneration
sowie die Plasminogenspaltung. Die ATF-Region (amino terminal fragment) des uPA ist über
eine Disulfidbrücke an die größere LMW-Region gebunden und beinhaltet die
Verbindungsstelle zum proteaseeigenen Rezeptor uPAR. (Rabbani, 1998d)
Die aktive Protease uPA in ihrer Zweikettenform entsteht durch limitierte Proteolyse aus dem
zymogenen pro-uPA. Da die Aktivierung von uPA prinzipiell durch jede Protease erfolgen
kann, ist der physiologische Ablauf noch nicht vollständig geklärt. Wahrscheinlich kommt
aber der Protease Plasmin bei der Aktivierung des zymogenen uPA die größte Bedeutung zu.
Aktives uPA kann wiederum Plasminogen aktivieren und führt so zu einer Potenzierung der
uPA-Kaskade. (Mazar, 2001c)
Die Protease uPA wird von verschiedenen physiologischen und malignen Zellen des Körpers
aus der Zirkulation aufgenommen, sowie von lokalen Stromazellen und den Tumorzellen
selbst exprimiert. Wachstumsfaktoren, Calcitonin und TNF-α steigern die Expression von
uPA, wohingegen Glukokortikoide, und der Östrogenrezeptorblocker Tamoxifen die
Produktion von uPA vermindern. (Rabbani, 1998b). Seine volle Aktivität entfaltet uPA aber
erst in Verbindung mit seinem Rezeptor uPAR, welcher verstärkt in den Randzonen des GBM
nachweisbar ist. Der Regulierungsmechanismus von uPAR erfolgt hierbei nicht über eine
Beeinflussung
der
proteolytischen
uPA-Domäne,
sondern
über
die
beschleunigte
Umwandlung von pro-uPA in uPA. (Mohanam et al., 1999)
Abb 3. Bausteine des uPA-Systems und ihre Funktion (WILEX München, 2002)
9
Der uPA-Rezeptor uPAR setzt sich aus drei ähnlichen, stark glycosylierten Domänen
zusammen, welche wahrscheinlich aus Duplikation der Grunddomäne entstanden sind. Die
Domänen sind jeweils ca. 90 Aminosäuren lang und durch Disulfidbrücken miteinander
verbunden. (Mazar, 2001f) Die Domäne D1 befindet sich am NH2-Ende des Proteins und
enthält die Mehrzahl der Rezeptorbausteine für uPA. Besonders die Aminosäure Tyrosin an
Stelle 57 scheint für die Bindung wichtig zu sein. (Mohanam et al., 1999) Da aber die
Isolierung der Domäne 1 zu einer Abschwächung der Affinität zu uPA um den Faktor 1000
führt, müssen die Domänen D2 und D3 weitere Determinanten besitzen, welche für die
Komplexbildung mit uPA benötigt werden. Die Bindungsstellen für Vitronectin und Integrine
werden ausschließlich von den Domänen D2 und D3 gebildet. Die Domäne D3 ist über einen
Glycosylphosphatidylinositol-Anker (GPI) fest mit der Zellmembran verbunden. In
vergleichbaren Proteinen mit GPI-Anker spielt dieser eine Rolle in der T-Zell-Aktivierung
und der Mobilität des Proteins in der Membran. Die Ankerstruktur ersetzt hierbei das COOHEnde des funktionellen Proteins mit 20 – 30 Aminosäuren. (Moller, 1993)
Die Komplexbildung zwischen uPA und uPAR ermöglicht es dem Inhibitor PAI-I, die
akzessorische Bindungsstelle an uPA zu besetzen (s.u.), was zu einer raschen Endozytose des
trimetrischen Komplexes führt. Während uPA und PAI-I durch Lysosome degradiert werden,
wird uPAR unverändert an die Zelloberfläche re-exprimiert. Durch die Komplexendozytose
wird die proteolytische Aktivität von uPA reguliert, und durch die Freisetzung des
ungebundenen uPAR an der Zelloberfläche wird die invasive Zone des Tumors effizient
reorganisiert. (Magdolen et al., 2000)
Die Induktion der Endozytose wird von uPAR über einen Rezeptor-Protein-Komplex (α
2MR/LRP) vermittelt und stimuliert die Proliferation der Zelle, sowie die Aktivierung
verschiedener Kinasen (Janus-Kinase, Adhäsions-Kinase, Thyrosin-Kinase) im Zellinnern.
(Koolwijk et al., 2001) Vermutlich steht die Signaltransduktion von uPAR auch im
Zusammenhang mit Neovaskularisation, da verschiedene Experimente zeigen, dass Hypoxie
und der angionetische Wachstumsfaktor VEGF eine Hochregulierung der uPAR-Expression
bewirken. (Mazar, 2001e)
Von Interesse sind die Bindungseigenschaften des uPA-uPAR-Komplexes. Die Halbwertszeit
des Komplexes liegt bei etwa 2-6 Stunden bei 37°C, welche unter anderem vom Zelltypus
abhängig ist. Während der Zelldifferenzierung steigt sowohl die Zahl der uPA-Rezeptoren an
der Oberfläche der Zelle, als auch die Affinität des Rezeptors zu uPA. Ein Experiment mit
10
U937, welches Zelldifferenzierung induziert, ergibt aber keine Proportionalität zwischen
beiden Vorgängen. (Bernstein et al., 1998)
Die Protease uPA besitzt die Fähigkeit, ihren Rezeptor uPAR durch Proteolyse zwischen der
ersten und zweiten Domäne zu inaktivieren, ohne dass hierfür eine Komplexbildung nötig ist.
Sowohl der Nachweis dieses Vorgangs in vitro, als auch der Nachweis von isolierten D1Segmenten im Urin von Tumorpatienten unterstützen die These, dass uPA durch
Inaktivierung von uPAR regulatorisch in den Proteolysevorgang eingreifen kann. (Mazar,
2001d)
Abb 4. Die Struktur von uPA und uPA–Rezeptor (Moller, 1993)
1.7
Die physiologische Inhibition von uPA
Der spezifische uPA-Inhibitor PAI-I gehört zu der Gruppe der Serpine und ist ein
Proteolysefaktor mit vielfältigen Eigenschaften. Der physiologische Inhibitor von uPA bindet
an das proteolytische Zentrum von uPA und führt so zu einer kompetitiven Blockade der
Plasminogenproteolyse. Außerdem beeinflusst PAI-I durch seine Inhibition auch die
Zelladhäsion, Migration und intrazelluläre Signaltransduktion des uPA-uPAR-Komplexes.
(Harbeck et al., 2001) Im Glioblastoma multiforme ist PAI-I vermehrt in den Randzonen des
Tumors nachweisbar. (Landau et al., 1994) Die Wirkungsweise von PAI-I ist bisher noch
umstritten und basiert auf folgenden zwei Theorien.
11
Effekt 1 – Inhibition der Proteolyse
Für eine optimale Migration der Tumorzelle ist ein Grundgerüst der ECM erforderlich,
welches als Leitschiene dient. Eine übermäßige Aktivität von uPA in der Invasionszone
zerstört diese Leitschiene durch Proteolyse und verhindert die Migration der Tumorzelle. Die
Inhibition durch PAI-I senkt die proteolytische Aktivität von uPA, führt zum Erhalt des
Grundgerüstes in der ECM und ermöglicht die Migration. Auch für die Vaskularisierung des
Tumors scheint dieser Vorgang von Bedeutung zu sein (Bajou et al., 2001)
Effekt 2 – Inhibition von Vitronectin
Neben der Fähigkeit inhibitorisch an uPA zu binden, besitzt PAI-I am aminoterminalen Ende
eine Bindungsstelle für das Matrixprotein Vitronectin. Da sich die Bindungsstellen am
Vitronectin für PAI-I, uPAR und Integrin αvβ3 teilweise überlappen, kommt es zur
kompetitiven Verdrängung der Bindungspartner, (Magdolen et al., 2000) und die
integrinvermittelte Adhäsion von uPAR an das Matrixprotein Vitronectin wird gestört.
Zeitgleich wird die Migrationstendenz der Tumorzelle zu Fibronectin erhöht. Dies geschieht
vermutlich über eine spezifische Stimulation des Fibronectins durch PAI-I, welche bei
anderen Matrixproteinen nicht nachgewiesen werden kann. Während Vitronectin bevorzugt in
Nähe der Mikrogefäße und Endothelzellen nachgewiesen wird, ist die Konzentration von
Fibronectin im Tumorgewebe und im Verbindungsgewebe zwischen den infiltrativen
Tumorzellnestern erhöht. PAI-I fördert somit die Mobilität der Tumorzellen und deren
Migration in nicht infiltriertes Hirngewebe. Eine Beteiligung von uPAR oder der
proteolyseinhibitorischen Domäne von PAI-I an der Migration in Richtung Fibronectin
konnte über Blockierungsversuche mit spezifischen Antikörpern ausgeschlossen werden.
Sowohl die Expression, als auch die Aktivität von PAI-I stehen im Zusammenhang mit
Hypoxie und Neoangiogenese, welche weitere Ansatzpunkte für Forschung und Therapie
bilden. (Isogai et al., 2001)
Die Theorie, dass PAI-I die Invasion fördert, wird gestützt durch die Beobachtung, dass PAI-I
defiziente knockout-Mäuse keine lokale Infiltration unterstützen und maligne Tumore in
diesen Tieren keine nachweisbare Invasionszone bilden. Auch die Vaskularisierung des
Tumors ist bei diesen Tieren herabgesetzt. (Magdolen et al., 2000) Auf Grund ihrer hier
beschriebenen Eigenschaften ist die erhöhte Konzentration von PAI-I, trotz seiner
inhibitorischen Wirkung auf uPA, ein Zeichen für die gesteigerte Malignität des Tumors. Der
strukturell mit PAI-I verwandte Proteaseinhibitor PAI-2 agiert nur als reiner uPA-Inhibitor
12
und führt im Gegensatz zu PAI-I nicht zur Endozytose des uPA-uPAR-PAI-Komplexes. PAI2 wird als prognostisch günstiger Faktor betrachtet.
Die Serinprotease Plasmin entsteht durch limitierte Proteolyse aus dem Proenzym
Plasminogen. Die wichtigsten Aktivatoren sind der Plasminaktivator vom Gewebetyp (tPA),
sowie uPA und Streptokinase. Das aktive Plasmin ist sowohl in der Lage durch Proteolyse die
Proteine der ECM zu degenerieren, als auch agonistische Proteasen (MMP) zu aktivieren. Die
Degeneration der ECM ist, wie oben beschrieben, wesentliche Voraussetzung für das maligne
infiltrative Wachstum. Auch die Freisetzung des eigenen Aktivators uPA wird durch Plasmin
induziert und führt so zu einer positiven Rückkopplung des Aktivierungsmechanismus.
(Heckl, 2003) Plasmin setzt durch die Degeneration der ECM matrixgebundene
Wachstumsfaktoren, wie VEGF, TGF-β und FGF-2, frei, welche die Progression und
Neoangiogenese des Tumors unterstützen können. (Mazar, 2001a)
Die Matrixmetalloproteasen (MMP) sind untereinander strukturell eng verwandt und
charakterisieren sich alle über ein Zink-Ion im aktiven Proteolysezentrum. Im GBM konnten
bisher die Untergruppe der Gelatinasen (MMP-2 und MMP-9), MMP-12, MMPs vom
Membrantyp (MT) sowie der physiologische Inhibitor TIMP-1 nachgewiesen werden. (Vince
et al., 1999) In der uPA-Kaskade spielen besonders die Gelatinasen die ausführende Rolle bei
der Degeneration der ECM, da sie die stärkste proteolytische Aktivität aufweisen. Ähnlich
wie uPA werden auch die MMPs über limitierte Proteolyse aktiviert und sind im Folgenden
fähig, Laminin, Fibronectin, Elastin und Kollagene zu spalten. (Rabbani, 1998a) In vitro führt
eine erhöhte Konzentration dieser Proteolysesubstrate in Abhängigkeit zu einer von der
jeweiligen Zelllinie verstärkten Adhäsion der Tumorzellen an die ECM. (Goldbrunner, 2000)
Die Ergebnisse mehrerer Forschungsgruppen lassen vermuten, dass die Integrine der β2Familie
(mac-1
bzw
complement
receptor
3)
eine
wesentliche
Rolle
bei
der
Signaltransduktion von uPAR spielen. Die Blockade der Integrine mit CR3-Antikörpern
mindert die Adhäsion von uPAR an Vitronectin und eine Signalinduktion durch uPA kann bei
fehlenden β-Integrinen in neutrophilen Leukozyten nicht nachgewiesen werden. (Mohanam et
al., 1999) Durch Reorganisation des Zytoskeletts, welche über eine Integrin-vermittelte
Signalkaskade erfolgt, bildet die Tumorzelle zunächst Pseudopodien in die entstehende Lücke
der ECM aus und zieht den Rest des Zellvolumens durch weitere Umstrukturierung des
Zytoskeletts nach. (Goldbrunner, 2000) Sowohl uPA und sein Rezeptor uPAR, als auch der
13
Inhibitor PAI-I werden in der klinischen Tumortherapie als unabhängige Marker für eine
schlechte Prognose des Patienten betrachtet. Sie korrelieren mit höherer pathologischer
Malignität, einem kürzeren rezidivfreien Intervall und einer kürzeren Überlebenszeit. (Bindal
et al., 1994)
Die Bedeutung des uPA-Systems für die Malignität des Tumors ist unumstritten, und es bleibt
zu hoffen, dass ein weitgehendes Verständnis der Zusammenhänge in diesem System in einer
effektiven Therapie für die betroffenen Patienten resultiert.
1.8
Der uPA-Inhibitor WX-UK 1
WX-UK 1 wurde aus den bisher bekannten uPA-Inhibitoren entwickelt, indem der
Grundstruktur ein TIPPS-Komplex hinzugefügt wird. Dieser Komplex verhindert durch seine
Größe, dass der uPA-Inhibitor im proteolytischen Zentrum von uPA an die klassische ArylBindungsstelle bindet. Die alternative Bindungsstelle am uPA-Molekül, welche keine
sterischen Hindernisse aufweist, scheint eine bessere Blockade des Moleküls zu ermöglichen.
Daraus folgt, dass Inhibitoren mit TIPPS-Erweiterung potentiell eine effektivere Inhibition
von uPA erreichen können, als ihre Vorgänger. Ein Nachteil der molekulären Variation ist
allerdings die verringerte Spezifität des Inhibitors für uPA. (Abbenante and Fairlie, 2005) Der
Wirkstoff WX-UK 1 wurde uns freundlicherweise von der Firma Wilex, München für unsere
Experimente zur Verfügung gestellt.
1.9 Die Bedeutung von uPA in der Klinik
Das proteolytische System mit den Bestandteilen PAI-I, uPA und seinem Rezeptor spielt
schon heute in der Onkologie eine große Rolle. Vor allem bei Brustkrebspatientinnen ist die
Bedeutung von uPA für die Metastasierung des Tumors bekannt und mittlerweile
ausschlaggebend für die postoperative Therapie. Bei Patientinnen mit niedrigem uPA-Level
im resektierten Tumorgewebe und tumorfreien Lymphknoten geht man von einem geringen
Metastasenrisiko aus, und den Patienten bleibt die belastende Chemotherapie erspart.
Tumorgewebe mit hohem uPA-Level muss postoperativ nachbestrahlt werden, um ein
Metastasenwachstum zu verhindern. Dieses Vorgehen wird gestützt durch mehrere Studien,
bei denen der Level von uPA mit dem klinischen Verlauf der Patientinnen verglichen wurde.
(Harbeck et al., 2004)
14
Allerdings erschwert die große Menge an Tumorgewebe von 300 mg, welche für den uPAELISA-Test benötigt wird, die routinemäßige Anwendung. Die Weiterentwicklung der
Methode führte zu der Multigenanalyse, welche neben uPA auch andere relevante Gene, wie
Hormonrezeptoren und HER-2, untersucht und dessen Ergebnis die Prognose der Patienten
noch besser vorhersagen kann (Hayes, 2005).
Bei dem hochmalignen Pankreastumor, sowie dem Karzinom des Kolons scheint ein erhöhter
uPA-Spiegel mit der Malignität des Tumors und dessen Metastasenwachstum stark zu
korellieren. Über die Prognose der Patienten und über alternative Therapieansätze könnte mit
Hilfe des uPA-Spiegels entschieden werden. (Berger, 2002;Garcea et al., 2005). In der
Kardiologie wird der Einfluss von uPA auf die Migration von glatten Muskelzellen nach
Revaskularisierung der Herzkranzgefäße untersucht. Eine Behandlung mit uPA-Inhibitoren
könnte hier die Migration unterbinden und die Restenoserate der Gefäße deutlich senken.
(Kusch and Gulba, 2001)
In Anbetracht dieser Ergebnisse wird deutlich, dass das uPA-System im gesamten Körper für
die Zellmigration von großer Bedeutung ist. Das Zusammenspiel von uPA und Glioblastom
im menschlichen Gehirn bietet zwar mehrere potentielle Therapieansätze, ist aber im
Vergleich zu den Fortschritten in der Brustkrebstherapie noch relativ unerforscht. Dieses
Missverhältnis gilt es zu beheben, um in der Behandlung von Gliobalstomen einen Erfolg zu
erzielen.
15
1.10
Entstehung und Differenzierung von Tiermodellen
Schon 1965 gelang es dem Freiburger Chirurgen Herman Druckley durch Injektion von
Dimethylsulfat maligne Karzinome in Rattenhirnen zu induzieren. Aufgrund seiner
Beobachtungen verfasste er eine Liste von Kriterien, welche eine Substanz erfüllen muss, um
karzinogen wirksam zu sein.(Druckrey et al., 1965) Somit war der Grundstein für den Einsatz
von Tiermodellen in der Erforschung von Hirntumoren gelegt.
Für die Entwicklung einer erfolgreichen Therapie von Hirntumoren ist das Verständnis der
Entstehung, Progression und Angiogenese essentiell. Diese Mechanismen resultieren aus der
Interaktion zwischen Tumorzelle und ECM, wobei in vitro Beobachtungen nur als Hinweise
auf das tatsächliche Verhalten der Tumorzellen in vivo betrachtet werden können. (Corcoran
et al., 2003) Die Komplexität des Tumorwachstums kann nur an einem Tiermodell
ausreichend erforscht werden. Allerdings muss hierbei einschränkend berücksichtigt werden,
dass die Darstellung von humanem Tumorwachstum in einem Tier immer mit Abweichungen
einhergeht. Aus diesem Grund sind in den letzten Jahrzehnten unterschiedliche Tiermodelle
entwickelt worden, welche sich durch Stärken und Schwächen in unterschiedlichen Bereichen
charakterisieren. Diese müssen je nach Fragestellung des Experiments berücksichtigt werden.
(Barth, 1998)
Bei der Entwicklung eines Tiermodells für die Erforschung von Gliomen sollten folgende
Prinzipien eingehalten werden, um die Bedingungen in der Realität so weit wie möglich zu
imitieren. Die implantierten Tumorzellen sollen glialer Herkunft sein, und die Implantation
der Tumorzellen soll orthotop erfolgen, da nur dort die Interaktion mit der spezifischen ECM
erfolgen kann. Die Wachstumsraten sollen reproduzierbar sein um Ergebnisse verschiedener
Studien vergleichen zu können. Außerdem soll das Wachstum des Tumors dem klinischer
Gliome entsprechen, und das Wirtstier soll den Tumor möglichst lange tolerieren um
Therapiestudien zu erlauben. Weiterhin soll die immunologische Reaktion durch das
Tiermodell minimal sein um die Ergebnisse des Tierversuches nicht zu überschatten.
Abschließend soll die Möglichkeit der in vivo Kontrolle des Tumors gegeben sein um den
Wachstumsverlauf beurteilen zu können.
In den letzten Jahren hat sich die Sphäroidimplantation als eine der erfolgreichsten Methoden
unter den Tiermodellen herausgestellt. Viele Arbeitsgruppen verwenden das primär
avaskuläre Modell zur Untersuchung der Tumorangiogenese (Goldbrunner et al., 2004;Farrell
et al., 1987;Abramovitch et al., 1999;Read et al., 2001), zur Messung der Proteasenexpression
16
im Astrozytom (Vaithilingam et al., 1992) oder zur Erforschung von neuen Substanzen im
Kampf gegen den Tumor. (Farrell et al., 1988;Del Maestro et al., 1991). Alternative
Therapieansätze lassen sich aus dem Modell im Hinblick auf die spontane Tumorregression
und dessen Mechanismus für die Zukunft entwickeln. (Vince et al., 2004)
Besonders für Studien, welche die Tumorinvasion untersuchen, liefert die Implantation der
Tumorsphäroide aussagekräftige Ergebnisse. (Grobben et al., 2002) Sphäroide sind kleine,
solide Komplexe, welche aus Tumorzellen gezüchtet werden. Die kugelartige Struktur
entsteht durch direkte Zell-Zell-Kontakte zwischen den Tumorzellen, wenn ihnen die
Möglichkeit zur Oberflächenadhäsion genommen wird. Die Größe des Tumors ist einfach
über den Durchmesser der Sphäroide standardisierbar und beträgt zwischen 100 und 600 µm.
Erreicht der Tumor eine gewisse Größe, so bildet sich eine zentrale Nekrose aus, welche im
weiteren Verlauf den Zerfall des Sphäroid einleitet.
Der große Vorteil des Sphäroidmodells besteht in der dreidimensionalen Struktur des
implantierten Tumors. Die Wachstumsbedingungen des klinischen GBM werden möglichst
realistisch wiedergegeben, da die Interaktion mit der ECM hauptsächlich über die peripheren
Zellen stattfindet. (Santini and Rainaldi, 1999) Die Ausbildung der charakteristischen
Nekrose ist ein Zeichen für die Unterversorgung der avaskulären der Tumoranteile im
Zentrum des Sphäroids und ist besonders bei schnell wachsenden Malignomen zu beobachten.
Die leichte Reproduzierbarkeit des Tumorwachstums wird durch die sicher orthotope
Implantation unter optischer Kontrolle sichergestellt. Eine extragliale Implantation führt in
jedem Fall zu einem differenzierten Wachstumsverhalten der Tumorzellen. (Vajkoczy et al.,
1999) Durch die exakte Bestimmung der Sphäroidgröße über den Durchmesser wird
außerdem die Vergleichbarkeit verschiedener Studien präzisiert.
17
1.11
Zielsetzung
In der Klassifizierung der WHO wird das Glioblastoma multiforme als der Hirntumor mit der
höchsten Malignitätsrate eingestuft. Obwohl sich in den letzten Jahren zahlreiche
Forschungsansätze mit dessen Therapie beschäftigt haben, ist es bisher nicht gelungen, die
mediane Überlebenszeit der Patienten mit einem Glioblastom wesentlich zu verbessern. Das
weit verbreitete Tiermodell der C6-Sphäroidimplantation bietet die Basis, um das Wachstum
des Glioblastoms weiter zu untersuchen. Dabei ist es von großer Wichtigkeit, eine
weitgehende Übereinstimmung von klinischen und experimentellen Wachstumsbedingungen
zu erzielen.
Da der Plasminaktivator uPA im humanen Glioblastom vermehrt nachweisbar ist und dort
eine bedeutende Rolle bei der Invasion der Tumorzellen spielt, führt ein Nachweis von uPA
im Tiermodell zur weiteren Angleichung der experimentellen Voraussetzungen an die
klinische Bedingungen.
Daher lautet die Hypothese für unsere Versuche:
Der Nachweis von uPA und dessen Expressionsmuster in der C6-Zelle und am
implantierten Glioblastom trägt entscheidend zur Weiterentwicklung des orthotopen
C6-Implantationsmodells bei. Die Entwicklung und Erforschung neuer Therapieansätze
wird ermöglicht.
Im folgenden Teil der Arbeit weisen wir die Funktion des Proteasehemmers WX-UK 1 nach.
Die
Aktivität
der Protease uPA ermöglicht den Tumorzellen ein
hochgradiges
Invasionsverhalten. Dies spiegelt sich in den Tumorzellnestern wider, welche mitunter eine
große Distanz zum Haupttumor aufweisen und die radikale Resektion des Tumors verhindern.
Eine rezidivfreie Heilung ist daher bisher noch nicht möglich.
Die Hypothese lautet:
Der Proteasehemmer WX-UK 1 blockiert die Protease uPA im Tumorgewebe und
minimiert die Invasion der Tumorzellen.
Diese Hypothesen zu prüfen, ist das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit.
18
Das Expressionsmuster der C6-Tumorzellen wird mittels reverser RNA-Transkription und
anschließender PCR untersucht.
Für die in-vivo Untersuchungen werden den Versuchstieren orthotop Zellsphäroide
implantiert, aus welchen sich innerhalb von drei Wochen manifeste C6-Glioblastome im
Hirngewebe entwickeln.
Mittels MRT-Untersuchung mit Kontrastmittelgabe werden die Volumina der soliden
Tumoren gemessen. Im Anschluss werden an den explantierten Gehirnen histochemische
Färbungen
zum
Nachweis
und
zur
Lokalisation
von
uPA
durchgeführt.
Der
Expressionsverlauf von uPA, uPAR, MMP2 und MMP 9 im Glioblastoma multiforme wird
anhand von fortlaufenden Peroxidasefärbungen bestimmt.
Mit Hilfe von radioaktiver Markierung und Szintillation wird die Konzentration des
Medikaments WX-UK1 im Gehirn gemessen. Die Wirkung des Proteasehemmers wird auf
der Basis der Volumenmessung der Tumoren im MRT und der Konzentration von uPA im
Tumorgewebe untersucht.
Der beschriebene Versuchsaufbau ermöglicht eine Weiterentwicklung des Tiermodells auf
Basis der Sphäroidimplantation und eine sichere Dokumentation der Wirkungsweise des
Proteasehemmers auf das Wachstum des Glioblastoms.
19
2.
Geräte, Materialien und Chemikalien
2.1
Geräte und Laborhilfen
Biofuge Pico
Heraeus Instruments, Hanau
Brutschrank
Nuaire, Plymouth, USA
(IR Autoflow CO2 water-jacketed Incubator)
Digitalkamera Camedia C-3040 Zoom
Olympus, Deutschland
Einbettmaschine Citadel 1000
Shandon, Pittburgh, USA
Gelelektrophorese-Apparatur,
Gibco-BRL-Life Technologies, Eggenstein
Mini-V8.10 vertical
Gelelektrophoresekammern, Horizon 11.14
Gibco-BRL-Life Technologies, Eggenstein
und Horizon 58
Gen Amplifier PCR System 2400
Perkin Elmer, Weiterstadt
Hohlmeißelzange FO 409
Aesculap, Tuttlingen
Inkubator Function Line
Heraeus Instruments, Hanau
Instrumente, mikrochirurgische
Aesculap, Tuttlingen
Kopfhalter
Werkstatt Neurologie, Universität Würzburg
Kryostat
Leica, Wetzlar
Magnetrührer MR 3001 K
Heidolph, Schwabach
Magnetrührstäbchen, div. Größen
Heinse und Ziller, Würzburg
Megafuge 1.0 R
Heraeus Instruments, Hanau
Messzylinder, div. Volumina
Schott, Mainz
Mikropipetten
Eppendorf, Hamburg
Mikroskop BX 41
Olympus
Mikroskop, Wilovert
Hund, Wetzlar
Mikroskoplaser U-RFL-T
Olympus
Mikrowellenherd R-2V26
Sharp, Hamburg
Multipipette plus
Eppendorf, Hamburg
Operationsmikroskop OPMi II
Zeiss, Oberkochen
pH-Meter 525
WTW, Weilheim
Photometer Fluorolite 1000
Dynex Laboratories, Denkendorf
Pipetten, Glas, 5, 10, 20 ml
Hartenstein, Würzburg
20
Pipettor (Stripettor)
Costar, Bodenheim
Skalpell Cutfix
B.Braun, Melsungen
Sterilbank (Biol.Safety Cabinet)
Nuaire, Plymouth, USA
Thermomixer 5434
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5417 C
Eppendorf, Hamburg
Vortex-Genie 2
Scientific Industries, Bohemia, USA
Waage Sartorius BP 300 S
Sartorius, Göttingen
Wärmeplatte
Medex, Kiel
Wasserbad
Hartenstein, Würzburg
2.2
Verbrauchsmaterialien
Cryoröhrchen
Nalgene, Brüssel
Deckgläser
Hartenstein, Würzburg
Einmalkanülen, div. Größen
B.Braun, Melsungen
Einmalspritzen, div. Größen
B.Braun, Melsungen
Faltenfilter
Schleicher und Schüll, Dassel
Histowachs
Cambridge Instruments, Nussloch
Hautklammergerät
B.Braun, Melsungen
Metalleinbettschälchen
Dia Tec, Hallstadt
Objektträger
Hartenstein, Würzburg
Pasteurpipette
Samco, San Fernando, USA
Petrischalen
Becton Dickinson, Oxuard, USA
Pipettenspitzen, Plastik, 10, 100, 1000 µl
Greiner, Würzburg
Tubes, Plastik, 15, 50 ml
Becton Dickinson, Oxuard, USA
Zellkultur-24-Well-Platten
Costar, Bodenheim
Zellkulturflaschen (75 cm²)
Costar, Bodenheim
Reaktionsgefäße für PCR (0,2 ml)
Biozym, Oldendorf
21
2.3
Chemikalien
Aceton
Roth, Karlsruhe
Agar Noble
Nordwald, Hamburg
Chloroform
Merck, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Roth, Karlsruhe
Fluorescent Mounting Medium
Zymed, San Francisco, USA
Eosin
Merck, Darmstadt
Ethanol absolut (EtOH)
J.T.Baker, Deventer, NL
Methanol (MetOH)
J.T.Baker, Deventer, NL
Natriumchlorid
Merck, Darmstadt
Isotonische Kochsalzlösung (NaCl)
Braun, Melsungen
Natriumcitrat
Merck, Darmstadt
Natronlauge (NaOH)
Merck, Darmstadt
Poly-L-Lysin
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Paraformaldehyd (PFA)
Sigma, St.Louis, USA
Rnase Erase
ICN, Eschwege
Salzsäure (HCl)
Merck, Darmstadt
Tissue Tek
Saluna, Torrance, USA
Wasserstoffperoxid, 30 % (H2O2)
Sigma-Aldrich, Steinheim
2.4
Antikörper und Reagenzien für die Immunhistochemie
Vector Elite ABC Kit, Goat
Vector Laboratories, Burtingame, USA
Histostain® - Plus (AEC)
Zymed Laboratories, San Francisco, USA
uPA (M-20) sc-6831
Santa Cruz Biotech, USA
22
2.5
Enzyme, Puffer und Nukleinsäuren für die PCR
RNeasy® Mini Kit
Qiagen, Valencia, USA
uPA-Primer, rattus norvegicus
Tib Molbiol, Berlin
GAPDH-Primer, rattus norvegicus
Tib Molbiol, Berlin
M-MLV-reverse Transkriptase
Gibco-Life-Technologies, Eggenstein
5 x first strand buffer
Gibco-Life-Technologies, Eggenstein
PCR – Optimizer Kit
Invitrogen, De Schelp, NL
rRNasin, RNase –Inhibitor
Promega, Heidelberg
Taq-DNA-Polymerase
USB-Amersham Life Science, Braunschweig
10x PCR-Puffer
USB-Amersham Life Science, Braunschweig
123 bp DNA Ladder
Gibco-Life-Technologies, Eggenstein
Oligo-p-d(T)12-18
Pharmacia-Biotech, Freiburg
Random Hexamer Primer
Promega, Heidelberg
Ultrapure dNTP Set
Pharmacia-Biotech, Freiburg
Oligonukleotide für PCR
TIB Molbiol, Berlin
2.6
Medikamente
Äther
Chinosol, Seelze
Ketamin Ketanest®
Parke-Davis, Berlin
Magnevist® Gadolinium DTPA
Schering, Berlin
Neo-Kodan Hautantiseptikum
Schülke und Maye, Norderstedt
Rompun® Xylazin
Bayer, Leverkusen
uPA-Inhibitor WX-UK 1
Wilex, München
23
2.7
Puffer und Lösungen
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS):
8g
NaCl
+ 0,20 g
KCl
+ 1,44 g
Na2HPO4 * 12 H2O
+ 0,24 g
KH2PO4
werden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und auf pH 7,4 eingestellt.
Trispuffer: 2,42g Tris (MW=121,1) ad 100ml Aqua dest.
2.8
Reagenzien für Zellkultur
Amphotericin B
Gibco-BRL-Life Technologies, Eggenstein
100x BME nicht essentielle Aminosäuren
Cytogen, Berlin
Dulbecco’s modified Eagle’s Medium
Cytogen, Berlin
(DMEM) mit 1g/l Glucose
Fetales Kälberserum (FCS)
Bio Whittaker über Boeringer Ingelheim
Genetecin G418
Gibco-BRL-Life Technologies, Eggenstein
L-Glutamin (200 mM in 0,85% NaCl)
Cytogen, Berlin
Penicillin (10000 U) /
Cytogen, Berlin
Streptomycin (10 mg/ml)
Phosphate Buffered Saline (PBS)
Bio Whittaker über Boeringer Ingelheim
Trypsin-EDTA (0,05 M / 0,02 %)
Cytogen, Berlin
Ultrareines Wasser (Seromed)
Biochrom, Berlin
100x MEM Vitamine
Gibco-BRL-Life Technologies, Eggenstein
24
Zellkulturmedien
Für C6 sense VEGF transfizierte Zellen:
500 ml DMEM mit 1g/l Glukose
60 ml FCS, hitzeinaktiviert
10 ml NEAs (= 1x)
10 ml L-Glutamin (0,65 mM)
2 ml Penicillin (= 32 u / ml) / Streptomycin (=32 mg / ml)
4 ml Genetcin G418
Einfriermedium:
50 ml DMEM-Vollmedium mit 20 % FCS
40 ml FCS
-> Lagerung bei 4°C
bei Gebrauch 9 ml mit 1 ml DMSO ansetzen.
(= 10% DMSO und 50 % FCS)
Alle Medien und Zusätze werden, sofern nicht anders angegeben, bei einer Temperatur von
37°C verwendet. Die Medienzusätze werden aliquotiert bei -20°C aufbewahrt. Erst kurz vor
Gebrauch werden sie aufgetaut und anschließend bei 4°C für maximal 2 Wochen gelagert.
25
3.
Methoden
3.1
Zellbiologische Methoden
3.1.1 Ursprung und Transfektion der C6-Zellinie
Die Gliomzelllinie C6 wurde erstmals in Ratten des Wistar-Stammes gezüchtet, welche dem
Zellgift N,N-Methylnitrosamid ausgesetzt wurden. (Benda et al., 1971)
Bei orthotoper
Implantation in ein Rattenhirn entwickeln die C6-Zellen einen Tumor, der morphologisch
dem undifferenzierten Glioblastoma multiforme gleicht. (Whittle et al., 1998). Die C6Zelllinie wurde von ATCC (Rockville, USA) käuflich erworben.
Die Transfektion der C6-Rattengliomzellinie wurde von Dr.Masato Sasaki (Department of
Neurosurgery, Kobe Medical School, Japan) durchgeführt. Dem Genom der C6-Zellen wird
hierbei der Genabschnitt für das Protein VEGF164 in sense Richtung (#8 RS) und in antisense
Richtung (#8 AS) beigefügt. Die für dieses Verfahren benötigten virusproduzierenden
Zellinien wurden von Dr.Wizigmann-Voss (W.G.Kerkhoff-Institut, Bad Nauheim) zur
Verfügung
gestellt.
Die
Vektorkonstruktion
für
VEGF164
wird
mit
der
Calciumphosphatmethode in die retrovirusproduzierenden Zellen transfiziert. Da der Vektor
außerdem mit der Information für Neomycinresistenz versehen ist, können nicht erfolgreich
transfizierte
Zellen
durch
Gabe
von
Neomycin
ausgesondert
werden.
Die
antibiotikaresistenten Zellen werden im Folgenden zur Virustransfektion der C6-Zellen
verwendet, wobei nichtinfizierte Zellen ohne Resistenz mit dem Antibiotikum Genetcin G418
eliminiert werden (Sasaki and Patek, 1999).
3.1.2 Monolayerzellkultur der C6 VEGF-sense transfizierten Gliomzellen
Medium für C6 sense VEGF transfizierte Zellen:
500 ml DMEM mit 1g/l Glukose
60 ml FCS, hitzeinaktiviert
10 ml NEAs (= 1x)
10 ml L-Glutamin (0,65 mM)
2 ml Penicillin (= 32 u / ml) / Streptomycin (=32 mg / ml)
4 ml Genetcin G 418
26
Die Gliomzellinien (C6 #8) werden in Zellkulturflaschen mittlerer Größe (75 cm²) mit 15 ml
des jeweiligen Zellkulturmediums zu einem Zellrasen, so genannten Monolayern,
herangezüchtet. Die Standardkulturbedingungen entsprechen hierbei 37°C, 5% CO² und
100% Luftfeuchtigkeit im Brutschrank.
Bei Konfluenz des Zellrasens werden die Zellen unter sterilen Bedingungen passagiert. Das
alte Medium wird verworfen und die Kulturflasche kurz mit 3 ml Trypsin-EDTA gespült.
Nach zweiminütiger Inkubation mit 1,5 ml Trypsin lösen sich die Zellen unter leichtem
Klopfen vom Flaschenboden. Zur Neutralisierung des zytotoxischen Trypsins wird die
Zellsuspension mit 8,5 ml vorgewärmtem Medium aufgenommen, wovon 1/10 oder 1/20
wieder in die Flasche gegeben und mit frischem Kulturmedium aufgefüllt wird. Der
Überstand wird für neue Zellkulturen verwendet, eingefroren oder verworfen. Das
Passagieren der Zellen erfolgt alle drei bis vier Tage und ist abhängig von der
Prolifrationsrate und der Anzahl der Zellen, welche zu Beginn ausgesät wurden.
3.1.3 Einfrieren und Auftauen der Gliomzellen
Vollmedium: 500 ml DMEM 1g/l Glucose
120 ml FCS
6 ml Vitamine
6 ml nichtessentielle Aminosäuren
2 ml L - Glutamin (0,65 mM)
Einfriermedium:
50 ml DMEM-Vollmedium mit 20 % FCS
40 ml FCS
-> Lagerung bei 4°C
vor Gebrauch 9 ml + 1 ml DMSO ansetzen (= 10% DMSO + 50 % FCS)
Um Zellsuspensionen längerfristig aufzubewahren, werden diese eingefroren und bei -196°C
in flüssigem Stickstoff gelagert. Hierzu wird eine konfluente Kulturflasche nach oben
beschriebener Methode trypsiniert, in kaltem Vollmedium (ad 10ml) aufgenommen und bei
4°C mit 880 rpm 10 min ungebremst zentrifugiert. Währenddessen wird das Einfriermedium
mit DMSO auf Eis angesetzt und die Kryoröhrchen beschriftet. Der Zentrifugenüberstand
27
wird abgekippt und das Zellpellet blasenfrei mit 1ml Einfriermedium + DMSO in die
Röhrchen pipettiert. Die Zellen werden umgehend bei -80°C tiefgekühlt und nach 24 Stunden
in flüssigen Stickstoff überführt.
Das Auftauen der Zelllinien erfolgt in einem 37°C warmen Wasserbad bis nur noch ein
kleiner Eisrest im Röhrchen zu erkennen ist. Um das bei Raumtemperatur zytotoxische
DMSO zu entfernen wird die Zellsuspension mit 10 ml Kulturmedium aufgenommen und
zentrifugiert (10 min, 800 rpm, 4°C). Das in 5 ml Kulturmedium aufsuspendierte Zellpellet
wird in eine Kulturflasche mittlerer Größe gegeben, mit 10 ml vorgewärmtem Medium
aufgefüllt und unter Standardbedingungen im Brutschrank inkubiert.
3.1.4 Die Anlage von Sphäroidkulturen
Agarbeschichtung:
1g
Agar Noble
20 ml Ultra Pure Water
80 ml DMEM 10% FCS
Sphäroide der C6-Zellreihe sind dreidimensionale kugelähnliche Zellaggregate, die in ihrem
Verhalten hohe Ähnlichkeit mit humanen Glioblastomen aufweisen. Die Sphäroide bilden
sich durch Zell-Zell-Adhäsion aus Monolayern, denen unter Kulturbedingungen die
Möglichkeit zum Kontakt mit dem Kulturgefäß genommen wird. Um das adhärente
Wachstum der Zellen zu unterbinden, wird der Boden der Kulturflasche mit 1%igem Agar
nach der Yuhas-Methode (Yuhas et al., 1977) ausgegossen. Die besten Ergebnisse werden
erreicht, wenn 1g Agar Noble in 20 ml Ultra Pure Water aufgekocht und mit 80 ml 60°C
warmem Medium gemischt werden. Die Kulturflaschen (75 cm²) werden dann unter einer
sterilen Werkbank mit je 8 ml Agar ausgegossen, welcher sich durch leichtes Schwenken
gleichmäßig auf dem Flaschenboden verteilt. Nach weiteren 10 Minuten ist der Agar
ausgehärtet, die Flaschen werden verschlossen und bei 4°C bis zu 3 Wochen gelagert.
Zum Anlegen der Sphäroidkultur werden die zu einem konfluenten Zellrasen gewachsenen
Zellen wie im Fall des Passagierens trypsiniert und in Kulturmedium aufgenommen. In eine
agarbeschichtete und mit 22 ml warmem Medium gefüllte Flasche werden 8 ml der
Zellsuspension hinzu gegeben und unter Standardbedingungen inkubiert. Am folgenden Tag
wird der Inhalt der Flasche auf zwei neue, beschichtete Flaschen verteilt um die Anzahl der
28
Sphäroide pro Flasche zu halbieren. Nach 4 Tagen erreicht ein Großteil der Sphäroide eine
Größe von 300 µm und es ist eine deutliche Verlangsamung des Wachstums erkennbar. Ein
weiterer Teil der Sphäroide bildet zentrale Nekrosen aus, die sich unter dem
Phasenkontrastmikroskop deutlich als schwarze lichtundurchlässige Kerne zu erkennen
geben. Die nekrotischen Sphäroide sind für die folgende Implantation ungeeignet. Sphäroide
aus lebenden Zellen erscheinen hingegen hell und durchscheinend.
Unter Mikroskopsicht können die Sphäroide nun steril vereinzelt und in beschichteten 24well-Platten für weitere 3 Tage aufbewahrt werden. Hierfür wird in einen beschichteten well
1,5 ml warmes Medium vorgelegt und der Sphäroid mittig auf den Agar platziert. Für die
Implantation sind ausschließlich die Sphäroide auszuwählen, die die vorgegebene Größe von
300 µm ± 30µm besitzen und eine kugelförmige Struktur aufweisen.
3.2
Tierversuche
3.2.1 Implantation der Tumorsphäroide
Die folgende Vorgehensweise wurde unter der Projektnummer AZ-621-2531.01 28/99 vom
Ausschuss für Tierschutz der Universität Würzburg genehmigt. Die Implantation wurde im
Tier-OP der Neurochirurgie Würzburg durchgeführt.
Im Rahmen dieser Studie wurden 40 männliche Sprague-Dawley-Ratten als Tumorwirte
verwendet, welche zum Zeitpunkt der Implantation ein Körpergewicht von 300 – 400g
aufwiesen. Sie wurden in Übereinstimmung mit den Institutsrichtlinien unter regelmäßigem
Tag/Nacht-Lichtrhythmus gehalten und erhielten spezielles Nagerfutter und Wasser ad
libidum. Während der gesamten Versuchsdauer erfolgte eine neurologische Überwachung
(Lähmungen, Störungen der Perzeptionsfähigkeit und motorische Koordination), sowie
Kontrolle des Körpergewichts KG.
Zur Implantation werden die Ratten mit Ketaminhydrochlorid (Ketanest®) in einer Dosis von
100 mg/kg Körpergewicht in Kombination mit Xylazin (Rompun®) in einer Dosis von 10
mg/kg KG narkotisiert, welche intramuskulär in den Hinterlauf injiziert wird. Zur
Verbesserung der postoperativen Wundheilung wird der Kopf der Tiere mit Betaisadona
desinfiziert, bevor der Schädel in einem Kopfhalter mit Oberkieferfixation eingespannt wird.
Nach einem Hautschnitt entlang der Schädelmittellinie wird das Periost abgeschoben und eine
linksseitige Trepanation des Schädels in Höhe der Koronarnaht durchgeführt. Unter
fortlaufender Spülung wird mit einem Rosenbohrer (Ø=4mm) die Dura mater freigelegt und
29
an den Trepanationsrändern reseziert um eine spätere, unphysiologische Vaskularisation des
Tumors durch durale Gefäße zu verhindern. Unter mikroskopischer Kontrolle wird die Pia
mater und Kortex x-förmig inzidiert und ein einzelner Sphäroid subkortikal in die Inzission
implantiert. Anschließend wird das Bohrloch mit Knochenwachs bedeckt und die Haut mittels
Klammergerät verschlossen. Die Tiere werden auf 37°C Wärmeplatten vor dem Auskühlen
bewart und nach dem Aufwachen in ihre Käfige zurückgesetzt.
3.2.2 Verabreichung des uPA-Inhibitors WX-UK 1
Jeweils 5 Tiere waren in einem Käfig untergebracht und durchgehend nummeriert. Am ersten
postoperativen Tag wurden die Ratten lediglich beobachtet um eventuelle Beeinträchtigungen
durch die Operation festzustellen und um den Ratten einen Erholungszeitraum zu geben. Ab
dem zweiten postoperativen Tag wurde den Tieren im Rahmen eines Doppelblindversuches
entweder der uPA-Blocker WX-UK1 (A1, B1, A2) oder eine Zuckerlösung ohne Wirkung
(C1, B2) verabreicht. Die Gruppe, der das Placebo verabreicht wurde, simulierte ein malignes
Tumorwachstum ohne Blockade des uPA-Enzyms.
Um experimentellen Fehlern durch die getrennte Unterbringung vorzubeugen, wurden die
Behandlungsgruppen gemischt auf die verschiedenen Käfige aufgeteilt. Jeden zweiten Tag
wurden die Tiere gewogen und aufgrund des jeweiligen Gewichtes die Tagesdosis mit
1,5mg/kg des reinen Wirkstoffes WX-UK1 berechnet. Täglich wurde die jeweilige Menge des
Substanzpulvers in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und in Einmalspritzen aufgezogen. Die
intraperitoneale Verabreichung der Substanz, stellte sich als zuverlässigere Methode
gegenüber der oralen Fütterung heraus, da die Substanz direkt über das Peritoneum
aufgenommen und nicht durch Erbrechen wieder ausgeschieden werden konnte. Sowohl eine
Injektion in die Blase als auch in den Darm wurde verhindert, indem die Tiere im Rücken
überstreckt und die Injektionsnadel senkrecht im unteren Drittel des Bauches platziert wurde.
Eine Schädigung des Peritoneums sowie angrenzender Organe durch die Injektion konnte
nicht festgestellt werden. Die erfolgreiche Resorption von intraperitoneal applizierten
Serpinen konnte im Zusammenhang mit der Therapie von intracerebralen Thrombosen
(Tamao and Kikumoto, 1997) und Arthritis (Kakimoto et al., 1995) nachgewiesen werden.
Der Behandlungszeitraum von 21 Tagen für die erste bzw. 19 Tagen für die zweite Serie
resultiert aus frühren Erkenntnissen (Vince et al., 2004), wonach das C6-Gliom im Rattenhirn
nach ca. 3 Wochen die Maximalgröße erreicht und anschließend in einigen Fällen eine
Remission eintritt.
30
3.2.3 Kernspintomographie MRT
19 bzw. 21 Tage nach der Tumorimplantation erfolgt die MRT-Untersuchung an einem 1,5
Tesla Gerät der Firma Siemens (Magnetom Vision®) in Kooperation mit Dr.Martin Bendszus,
Abt. Für Neuroradiologie, Universität Würzburg.
Der Eigendrehimpuls der Wasserstoffatome im Körper wird bei dieser Untersuchung durch
Anlegen eines starken Magnetfeldes zeitweilig außer Kraft gesetzt. Nach Abschalten des
Feldes geben die unterschiedlich gemessenen Relaxationszeiten T1 und T2 der Atome zum
Eigenimpuls sowie deren Protonendichte Hinweise auf den Wassergehalt und die
Morphologie des Gewebes. Durch dieses Verfahren eignet sich die MRT besonders gut zur
Untersuchung und Differenzierung von Weichteilgeweben wie dem Gehirn. In einer T1gewichteten Aufnahme erscheinen Gewebe mit einer langen T1-Relaxationszeit, wie z.B.
Flüssigkeiten und pathologische Strukturen signalarm, während diese in einer T2-Aufnahme
signalreich abgebildet werden.
Unter dem Einfluss von Gadolinium DTPA (Prohance 0,1/kg), welches unmittelbar vor der
Untersuchung intrakardial verabreicht wird, kann die Relaxationszeit der Atome verkürzt und
ein insgesamt stärkeres Gewebesignal hervorgerufen werden. Da sich das Kontrastmittel auf
Grund der gestörten Funktion in der Blut-Hirn-Schranke besonders im Tumor anreichert, wird
hierdurch eine deutliche Abgrenzung zum Normalgewebe möglich.
Die Versuchstiere werden auf dem Rücken liegend in einer selbst gefertigten Kopfhalterung
fixiert und mit einer intramuskulären Anästhesie mit Ketamin (100mg/kg KG) und Xylazin
(10mg/kg KG) versehen. Zur Untersuchung der Rattenhirne wird eine Spule mit 40 mm
Durchmesser verwendet. Das MRT-Protokoll setzt sich zusammen aus einer T2-gewichteten
TSE-Sequenz (TE 3000 ms, TR 96 sm, Schichtdicke 2 mm) und einer T1-gewichteten SESequenz (TE 460 ms, TR 14 ms, Schichtdicke 2 mm). Zusätzlich wird in der CISS-Sequenz
(TR 12,2 ms, TE 5,9 ms, Schichtdicke 0,5 mm) ein dreidimensionaler Datensatz (3D)
erhoben, welcher zur Tumorvolumetrie anhand multiplanarer Rekonstruktion verwendet wird.
Die Tumoroberfläche wird hierfür in koronaren, axialen und sagitalen Schichten manuell
markiert und daraufhin mittels einer speziellen Software (Siemens Virtuoso®) die
intrakranielle Tumorausdehnung errechnet.
31
3.2.4 Explantation
Im direkten Anschluss an die MRT-Untersuchung werden die Tiere durch intramuskuläre
Injektion von 2 ml T61 getötet und das Gehirn mittels Hohlmeisselzange und Skalpell
entnommen. Auf Höhe der Tumorläsion wird das Gewebe der linken Gehirnhälfte in
Sagitalrichtung geteilt und beide Hälften in stickstoffgekühltem Isopentan schockgefroren.
Die anschließende Lagerung des Gewebes erfolgt in einer -80°C Kühltruhe.
Von den schockgefrorenen Gewebeblöcken werden mit Hilfe eines Kryostates 7µm dicke
Schnitte angefertigt, wobei der Tumor möglichst in seiner maximalen Ausdehnung
angeschnitten werden soll. Die Schnitte werden mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern
aufgenommen, bei -20°C gelagert und später für immunhistochemische Nachweise und
Färbungen verwendet.
Vier Gewebeblöcke aus der zweiten Versuchsreihe werden zur späteren Verwendung in 5%
Paraformaldehyd fixiert.
Außerdem erfolgt bei je zwei Tieren aus jeder Behandlungsgruppe eine Untersuchung des
Peritoneums und der Bauchorgane um lokale Reizungen und Verletzungen durch die
intraperitoneale Injektion des WX-UK1 auszuschließen.
Die vier Tiere der Behandlungsgruppe A1 wurden nach der MRT-Untersuchung an Herrn
Stürzebecher,
Erfurt
weitergereicht,
welcher
die
Messung
der
organspezifischen
Anreicherung von WX-UK1 durchführte.
3.3
Färbungen
3.3.1 Hämalaun-Eosin-Färbung
Die bei -20°C gelagerten Kryoschnitte werden 40 min lang bei Raumtemperatur aufgetaut und
getrocknet. Nach dreiminütiger Färbung in Hämalaun werden die Schnitte 10 Minuten unter
fließendem Leitungswasser gespült und kurz in aqua dest. gewaschen. Die Gegenfärbung
erfolgt 25 Sekunden mit Eosin, welche mit zweimaligem Waschen in aqua dest. beendet wird.
Zur Entwässerung durchwandern die Objektträger die aufsteigende Alkoholreihe (70%, 96%,
100%) und werden abschließend 10 Minuten in Xylol eingestellt sowie mit Eukitt eingedeckt.
32
3.3.2 Immunhistochemischer Nachweis von uPA mittels Fluoreszenz-Färbung
Zum immunhistochemischen Nachweis von uPA auf den Sphäroidschnitten wird der gegen
das uPA der Ratte gerichtete polyklonale Antikörper (sc-6831) mit dem sekundären
lichtempfindlichen Fluoreszenz-Antikörper (Fitc) kombiniert. Die hohe Spezifität und die
niedrige Sensitivität des Antikörpers sind ideal für die Färbung der in-vitro-Präparate, bei
denen wenig Hintergrundsignal zu erwarten ist.
Die Kryoschnitte werden wie oben beschrieben bei Raumtemperatur aufgetaut und 10
Minuten lang bei -20°C mit Wasserstoffperoxid versetztem Methanol fixiert. Nach
zweimaligem Waschen in PBS-Puffer werden die unspezifischen Bindungsstellen des
Hirngewebes mit Normalserum der Ziege 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert.
Nach dem Abklopfen des Ziegenserums wird der uPA-Antikörper (sc-6831) in einer
Verdünnung von 1:20 aufgetragen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Gewebeproben
dürfen nicht austrocknen und werden daher ständig in einer feuchten Kammer gehalten. Nach
nochmaligem Waschen in PBS wird der Fitc-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100
aufgeträufelt und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert. Dem abschließenden Waschen
in PBS und Aqua dest. folgt das Eindecken mit dem fluoreszenzbewahrenden FMMEindeckmittel. Die fertig gefärbten Schnitte werden dunkel abgedeckt bei 4°C gelagert und
unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
3.3.3 Peroxidase-Färbung
Bei der Färbung der Gewebeschnitte aus dem Rattenhirn wird anstelle des FluoreszenzAntikörpers ein ABC-Komplex aus Avidin, Biotin und Peroxidase zur Entwicklung
verwendet, welcher eine höhere Sensitivität für uPA aufweist. Da die Lokalisation der uPAMoleküle bei der in vivo-Färbung das entscheidende Kriterium ist, muss parallel zu dem
Antikörpersignal auch die Anatomie des Objektes sichtbar sein. Diese Möglichkeit ist nur bei
der DAB-Färbung gegeben. Der erste uPA-spezifische Antikörper (sc-6831) bindet mit seiner
konstanten Region an den zweiten biotinierten Antikörper. Das kovalent angekoppelte Biotin
stellt hierbei die Brücke zwischen dem Antikörper und dem Avidin des ABC-Komplexes her.
Die Affinität zwischen Avidin und Biotin ist, wie von Su-Ming Hsu (Hsu et al., 1981)
beschrieben, äußerst stark und eignet sich durch die geringe Größe des Gesamtkomplexes sehr
gut für die immunhistochemische Färbung am Gehirn. Die im Anschluss daran hinzugefügte
DAB-H2O2-Lösung (Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid) ruft in Verbindung mit der
33
Peroxidase des ABC-Komplexes eine lokale Braunfärbung hervor, welche in diesem Fall
spezifisch für uPA im Gewebe ist.
DAB-Lösung:
2,5 ml Trispuffer (0,2M)
3,9 ml HCl (0,1N)
3,6 ml Aqua dest.
10 mg Diaminobenzidin Tablette
7,5 µl
Wasserstoffperoxid
Wiederum werden die Schnitte aus -20°C 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut
und getrocknet. Im Anschluss erfolgt die Fixierung in reinem Aceton (10 min, RT) und kurzes
Waschen in PBS-Puffer. Es folgen zwei Blockierungsschritte in mit Wasserstoffperoxid 0,6%
versetztem MetOH (10 min) und in goat-Normalserum (20 min) um die unspezifischen
Bindungsstellen im Gewebe zu inaktivieren. Die erste Blockierung wird durch kurzes Spülen
in PBS beendet, das Normalserum wird lediglich abgetupft.
Der primäre uPA-Antikörper wird mit PBS 1:50 verdünnt, sowie mit 0,1% BSA und tween20
versetzt, bevor er für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach zehnminütigem Spülen in PBS
wird der biotinierte zweite Antikörper appliziert (30 min, RT) und nach nochmaligem Spülen
der ABC-Komplex aufgetropft. Die Inkubation erfolgt 30 Minuten bei RT und wird durch
Spülen in PBS, sowie Applizieren der DAB-Lösung beendet. Der nun einsetzende
Färbevorgang muss genauestens beobachtet werden und wird bei deutlich zu erkennender
lokaler Braunfärbung im Gewebe durch Spülen in Leitungswasser abgesetzt. Die
Gegenfärbung der Schnitte erfolgt mit Hämalaun nicht länger als 10 Sekunden, bevor sie mit
Leitungswasser gewässert (10 min) und mit einem wasserlöslichen Eindeckmittel eingedeckt
werden.
Abb 5. Färbung von uPA mit Peroxidase
34
3.4
Die Polymerasekettenreaktion PCR
3.4.1 Isolierung der RNA
Bei der Isolierung der RNA aus den Zellen wird sich die Eigenschaft einer
Silikongelmembran zu Nutze gemacht, dass sie unter den vorgegebenen Konditionen selektiv
freie RNA bindet.
Die Monolayer der C6-Zellinie in der konfluenten Kulturflasche wird wie oben beschrieben
mit Trypsin vom Flaschenboden gelöst und unter Zugabe von 10 ml Vollmedium zentrifugiert
(2000 rpm, 4°C, 5 min). Der Überstand wird abpipettiert und die Zellen mit βMercaptoethanol sowie Guanidine-Isothiozyanat lysiert. Neben der Lyse werden bei diesem
Schritt gleichzeitig die unerwünschten RNasen (RNA-zersetzende Enzyme) inaktiviert.
Um die Anbindungskonditionen für freie RNA zu optimieren werden dem Lysat 600µl
Ethanol 70% zugegeben, bevor es auf die Silikonsäule gegeben wird. Durch die Bindung der
freien RNA an die Gelmembran innerhalb der Säule kann die RNA selektiv von den übrigen
Zellbestandteilen getrennt werden, welche im weiteren Verlauf ausgewaschen werden.
Da hierbei nur RNA mit einer Mindestgröße von 200 nt die nötigen Bindungsvoraussetzungen
besitzt, wird die erwünschte mRNA auch von tRNA sowie rRNA isoliert, welche mit dem
Auslauf verworfen werden. Das Durchlaufen des Homogenisats wird ermöglicht, indem die
Säule kurzzeitig zentrifugiert wird (10.000 rpm, 15 sec).
Nach dreimaligem Waschen der Gelmembran mit Ethanolpuffer (500µl) wird die gebundene
RNA mit 100 µl DEPC-versetztem H2O gelöst und im anschließenden Trennschritt
abzentrifugiert (10.000 rpm, 1 min).
Die Konzentration der RNA im Zentrifugat ergibt sich aus der Dichtemessung im
Deuteriumphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm und wird nach folgender Formel
berechnet:
Delta 260nm
Faktor für RNA
Verdünnung
Gesamtvolumen = KONZRNA
0,142 g
x4
x 0,01
x 0,1 1/ml
= 0,57 µg / µl
Die wassergelöste RNA kann nun bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert werden, bei -80°C
entsprechend länger.
35
3.4.2 Die Reverse Transkription mRNA -> cDNA
Durch die Kombination von reverser Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist
es möglich, auch sehr kleine Mengen an mRNA auf einfache Weise nachzuweisen. Reverse
Transkriptasen (RT) besitzen die Fähigkeit mRNA in komplementäre DNA (cDNA)
umzuschreiben. Das hierbei verwendete RT-Enzym wurde aus dem murinen MaloneyLeukämie-Virus (MMLV) isoliert (Kotewicz, 1985).
Die cDNA-Synthese wird mit ca. 1µg reiner mRNA durchgeführt. Der Primer-RNA-Mix
(s.u.) wird für 10 min. bei 65°C inkubiert und anschließend auf Eis schockgekühlt.
Primer–RNA –Mix: 1 µg
mRNA
2 µl
Oligo-dT12-18-Primer (1µg/µl)
1 µl
Random-Hexamer-Primer
5 µl
DEPC-H2O
Daraufhin werden 17 µl des Mastermix hinzugegeben und der gesamte Ansatz für 70 min bei
37°C inkubiert.
Mastermix:
5,0 µl first strand buffer
2,5 µl DTT (0,1 M)
2,5 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
0,8 µl RNasin
1,0 µl MMLV-Reverse Transkriptase (200U/µl)
5,2 µl DEPC- H2O
Durch dreiminütiges Erhitzen auf 95°C wird das RT-Enzym denaturiert und die cDNA
anschließend bei -20°C gelagert. Der Erfolg der cDNA-Synthese ist nachweisbar, indem 3 µl
des Endproduktes in einer semiquantitativen PCR mit GAPDH-spezifischen Primern
amplifiziert werden.
36
3.4.3 Amplifikation von cDNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die 1984 von Kary Mullies entwickelte Methode der PCR ermöglicht es, kleinste DNAStränge
durch
millionenfache
Vervielfältigung
nachzuweisen.
Kernpunkt
jeder
Polymerasekettenreaktion ist das hitzestabile Enzym Taq-Polymerase, welches aus dem
Bakterium Thermus aquaticus isoliert wurde (Saiki et al., 1988) und komplementär zu der
jeweiligen Vorlage DNA-Sequenzen aufbaut. Außer dem zu vervielfältigenden DNA-Strang,
der so genannten Zielsequenz, werden zwei Oligonukleotide (Primer) benötigt, welche sich
durch ihren komplementären Aufbau beidseitig an den Enden der Zielsequenz anlagern. Ein
großer Vorteil der PCR ist, dass durch die Verwendung der Primer nicht die genaue Kenntnis
der Zielsequenz sondern nur ihrer Anschlussstellen erforderlich ist.
Im ersten Schritt des PCR-Zyklus wird der DNA-Doppelstrang des gesamten Stranges bei
95°C aufgelöst und die Einzelstränge der Reaktion zugänglich gemacht.
Im zweiten Schritt wird durch rasches Absenken der Reaktionstemperatur eine Hybridisierung
der
Einzelstränge
mit
den
komplementären
Primerpaaren
erreicht.
Die
exakte
Anlagerungstemperatur (Ta) hängt von der Länge und Basensequenz der Primer ab. Da diese
dem Mix in großem Überschuss zugegeben werden, kommt es nicht zur erneuten Reversion
des ursprünglichen DNA-Doppelstranges.
Im abschließenden dritten Schritt synthetisiert die Taq-Polymerase ausgehend von den
Primern die neuen komplementären DNA-Stränge in Richtung des 3´-Endes des
Einzelstranges, welcher als Vorlage dient. Die neusynthetisierten Stränge enthalten somit in
jedem Fall die gewünschte Zielsequenz. Die für die Primerextension optimale Temperatur
liegt bei 72°C. Nach mehreren durchlaufenen Zyklen hat sich Zielsequenz exponentiell
vervielfacht und ist so z.B. durch die Gelelektrophorese nachweisbar.
Die optimale Anlagerungstemperatur (Ta) der Primer wird bestimmt durch deren Länge und
Basensequenz und lässt sich annäherungsweise mit folgender Formel berechnen:
Ta = (GC-Gehalt) x 4 + (AT-Gehalt) x 2
Für Primer mit einer Länge von 22 Nukleotiden trifft sie relativ genau zu, muss aber für
längere Primer entsprechend nach unten korrigiert werden.
Beispiel: GAPDH as (22 nt): Ta = (11) x 4 + (11) x 2 = 66°C
37
Zur Auswahl geeigneter Oligonukleotidprimer können die mRNA-Sequenzen des
nachzuweisenden Genes in der EMBL-Genbank eingesehen werden. Oligonukleotide von
mindestens 20 Nukleotiden Länge werden so ausgewählt, dass sie als Primerpaare die
Zielsequenz einschließen und diese somit in der PCR amplifizieren. Die Zielsequenz sollte
nicht kleiner als 150 Nukleotide lang sein um einen sinnvollen Nachweis durchführen zu
können. Besteht die Zielsequenz aus weniger als 150 Basenpaaren besteht das Risiko, die
Bande der gesuchten Sequenz mit Banden von Primerdimeren zu verwechseln. Primerdimere
bilden sich zu geringem Maße bei jeder PCR und bilden sich als Banden ab, welche einer
Länge von ca. 20 Nukleotiden entsprechen.
3.4.4 Die spezifischen Primerpaare für GAPDH und uPA
GAPDH (Fragmentgröße: 262 Basenpaare)
Sense:
TgTCAgCAATgCATCCTgCA
20 nt
Antisense:
gCATgTCAgATCCACAACggAT
22 nt
uPA (Fragmentgröße: 157 Basenpaare)
Sense:
AggTggCAgTgAACTTggAg
20 nt
Antisense:
gTATTggCCTTTCCTCggTAA
21 nt
Die PCR wird mit Primerpaaren durchgeführt, welche eine Zielsequenz aus dem GAPDHGen amplifizieren, um den Erfolg der Reversen Transkription (RT-Schritt) zu verifizieren.
Die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) ist ein Stoffwechselenzym,
welches an der für die Zelle essentiellen Glykolyse beteiligt ist. Da die mRNA für GAPDH in
jeder Zelle konstitutiv exprimiert wird, eignet sich der Nachweis der für GAPDH spezifischen
cDNA besonders gut zur Kontrolle der reversen Transkription.
Der positive Nachweis von u-PA in den C6-Zellen ist Voraussetzung für den folgenden
Versuch der u-PA Inhibierung in vivo. Bei optimalen Voraussetzungen verläuft die PCR
exponentiell bis sie nach einer Anzahl von Zyklen eine Plateauphase erreicht. Um Signale
durch unspezifische Amplifikationen oder gering exprimierte Transkripte minimal zu halten,
sollte die PCR vor Erreichen der Plateauphase beendet werden.
38
Potentielle Kontaminationen werden ausgeschlossen, indem zusätzlich eine H2O-Leerprobe
ohne cDNA mitgeführt wird. Für einen 1x PCR-Ansatz von 50µl werden folgende
Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge zum Mastermix gegeben:
0,5 µl sense uPA-Primer (50 µM)
0,5 µl antisense uPA-Primer (50 µM)
1,0 µl dNTP Mix
10 µl Master Taq Mix (MgCl2-Lsg. mit Zusätzen)
5,0 µl PCR Puffer 10-fach
ad 47 µl
DEPC-H2O
0,2 µl Taq-Polymerase (5U/µl)
3,0 µl cDNA
3.4.5 Auftrennung der cDNA mittels Gelelektrophorese
Material:
Agarose
Ethidiumbromid-Lösung (10mg/ml H2O)
DNA-Ladepuffer (50% TAE, 50% Glycerin, je 0,4% BPB und XC)
DNA-Längenstandard (123 bp DNA ladder)
TAE-Puffer (50x):
242 g Tris
51 ml Eisessig
100 ml EDTA (0,5 M, pH 8,0)
Mit Hilfe der Gelelektrophorese werden cDNA-Fragmente nach der Anzahl ihrer Nukleotide
aufgetrennt. In dem unter Spannung stehenden Agarosegel ist die elektrophoretische
Wandergeschwindigkeit VE der Fragmente umgekehrt proportional zu deren Größe. Kleine
Fragmente passieren die Poren des Gels auf Grund des geringeren Reibungswiderstandes (Fr)
schneller als große, und legen so in der gleichen Zeit eine größere Strecke zurück. Im direkten
Vergleich mit dem Längenstandard, welcher verschiedene standardisierte DNA-Fragmente
enthält, wird so die Größe der in der PCR amplifizierten cDNA bestimmt.
Zur Herstellung von 1,5%-igem Gel werden 1,5g Agarose mit 100ml TAE-Puffer (1x)
aufgekocht. Unter Zugabe von EtBr-Lösung wird das Gel in die Gelkammer gegossen und
nach Erkalten mit TAE-Puffer bedeckt. In die Geltaschen werden jeweils 17µl des PCR39
Produktes in Kombination mit 3µl Ladepuffer pipettiert und eine separate Tasche mit 3 µl des
Längenstandards als alleinige Probe gefüllt. Nach ca. 60-minütiger Elektrophorese bei 100 V
werden die Banden der cDNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar und mittels Digitalkamera
dokumentiert.
3.5
Synthese und Messung des radioaktiven H³WX-UK1
Die radioaktive Markierung des Wirkstoffes WX-UK1 und die Konzentrationsmessung nach
Ablauf des Tierversuches wurden freundlicherweise von Prof. Dr. Stürzebecher, Zentrum für
vaskuläre Biologie und Medizin in Erfurt, durchgeführt. (Sturzebecher et al., 1999)
Die Grundstruktur der bisher bekannten uPA-Inhibitoren ist das 3-Amidino-PhenylalaninAmid. Im Falle des Inhibitors WX-UK1 wird die Grundstruktur durch Nα-TriisopropylPhenylsulfonyl (TIPPS) stabilisiert. Die Modifikation des Amidanteils am C-terminalen Ende
des Komplexes durch die TIPPS-Substitution führt zu einer höheren Blockierungsaktivität im
Vergleich zur Grundstruktur. Die klassische Bindung des Inhibitors an die ArylBindungsstelle wird durch die Größe des TIPPS-Komplexes verhindert. Stattdessen weicht
der TIPPS-Inhibitor auf eine alternative Bindungsstelle innerhalb des proteolytischen
Zentrums von uPA aus, welche eine effektivere Blockade der Proteolyseaktivität ermöglicht.
Eine weitere Potentzierung der Inhibitionsaktivität wird durch die Veränderung der RStruktur erreicht, wobei sich hier die Substitution durch ein Ethoxycarbonyl-Derivat (EXO)
als am effektivsten herausstellt. Allerdings wird die Selektivität des Inhibitors für uPA durch
die Modifikation der R-Struktur negativ beeinflusst, und der Kreis der inhibierten Enzyme
wird um Proteasen, wie Trypsin und Plasmin erweitert.
Abb 6. Strukturformel des uPA-Inhibitors WX-UK1 mit uPA-Bindungsstelle.
Nα-Triisopropyl-Phenylsulfonyl (TIPPS), Ethoxycarbonyl-Derivat (EXO)
40
Die radiochemische Markierung des WX-UK1 erfolgt durch die Hydrisierung mit TritiumGas. Freie Tritiumionen werden anschließend durch Lyophilisation entfernt. (Amersham
Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg). Um die Substanz H³WX-UK1* mit der spezifischen
Aktivität von 0,05 – 0,06 mCi/µmol zu erhalten, wird der reine Wirkstoff WX-UK1 mit dem
radioaktiven H³WX-UK1 titriert.
Nach Ablauf des Behandlungszyklus mit H³WX-UK1* wird den Tieren in narkotisiertem
Zustand retroorbital venöses Blut und über einen Choledochuskatheter Gallenflüssigkeit
entnommen. Die Entnahme der repräsentativen Organe wie Milz, Leber, Niere, Herz,
Lymphknoten, sowie der beiden Gehirnhälften erfolgte nach der Tötung der Tiere.
Die Radioaktivität wird mittels Szintillation gemessen, bei welcher strahlungsempfindliche
Szintillatormolleküle durch die radioaktive Betastrahlung des H³WX-UK1 energetisch
angeregt werden um unter Aussendung von Photonen wieder zu relaxieren. Die Photonen sind
als Lichtimpulse messbar und verhalten sich in ihrer Anzahl näherungsweise proportional zur
spezifischen Aktivität der zu messenden Probe.
41
4.
Ergebnisse
4.1
Nachweis der uPA-Expression der C6-Zellinie in vitro
Die Expression von uPA in den Tumorzellen wird durch das Vorhandensein von uPAspezifischer mRNA in den Zellen der C6-Zellinie (WT) und dessen VEGF-transfizierten Klon
(#8) nachgewiesen.
Hierfür wird die hochspezifische Methode der Polymerasekettenreaktion mit vorhergehender
reverser Transkription der mRNA (RT-PCR) angewendet.
Um die mRNA für das uPA-Protein in den Zellen der murinen C6-Zellinie nachzuweisen,
werden die Bedingungen ausgehend vom PCR-Standardprogramm für humanes uPA (Stegen,
1996) schrittweise an die rattenspezifischen Primer und die C6-Zellinie angepasst. Hierbei
werden
die
Anzahl
der
PCR-Zyklen,
die
Anlagerungstemperatur
(Ta)
und
die
Zusammensetzung der Reaktionslösung derart variiert bis der erwünschte Nachweis erzielt
wird.
Faktoren, welche das unbegrenzte Fortlaufen der Reaktion behindern, sind die zugegebene
Menge an Taq-Polymerase, die Menge an Primern und Nukleotidbausteinen, die
Ausgangsmenge an cDNA, sowie die eventuelle Rehybridisierung der gebildeten
Einzelstränge bei Absenken der Reaktionstemperatur. Während der Optimierung der PCRKonditionen erwiesen sich die humanen uPA-Primer als nicht rattengängig und wurden durch
rattenspezifische uPA-Primer der Firma Tib Molbiol ersetzt. (Ragno et al., 1992)
Folgendes Protokoll führt zu einer spezifischen Amplifikation der cDNA für uPA:
Abb 7. Amplifikationszyklus für uPA
42
Optimalbedingungen:
1 min Vorinkubation bei 94°C
40 x : 1:00 min 94,0°C
1:00 min 56,7°C
1:30 min 72,0°C
10 min Nachinkubation bei 72°C
Das Ergebnis der Amplifikation wird mittels Gelektrophorese veranschaulicht. Das Gel in der
folgenden Abbildung zeigt sowohl für die Zellen des C6-Wildtyps (WT) als auch für den
VEGF-Klon (#8) eine positive Expression der cDNA, welche für das uPA-Gen spezifisch ist.
Die Banden für GAPDH liegen gemessen am Längenstandard bei 260 Basenpaaren, die
Banden für uPA bei 150 Basenpaaren.
Im unteren Teil der Abbildung sind die Banden für den GAPDH-Nachweis zu sehen. Der
Nachweis des Stoffwechselenzyms verifiziert den Erfolg der reversen Transkriptase für die
beiden verwendeten Zelllinien und wird der uPA-PCR vorgeschaltet.
Abb 8. mRNA Expression in Rattengliomzellen (RT-PCR)
43
4.2
in vitro-Nachweis von uPA in der Gliomzelle
Um die Hypothese zu bestätigen, dass die Blockierung von uPA in der Tumorzelle das
infiltrative Wachstum verhindert, muss der in vitro-Nachweis von uPA in der Tumorzelle
unbedingt erbracht werden. Nur falls die implantierten Tumorzellen der C6-Zelllinie auch
uPA produzieren, kann durch dessen Blockade eine Verminderung der Tumorinfiltration
erreicht werden. Der Nachweis von uPA erfolgt über die Färbung von implantationsfertigen
Sphäroiden (VEGF+) mittels uPA-Antikörper und Fitc-Antikörper.
Die HE-Färbung lässt deutlich die sphäroide Struktur der Tumorzellen erkennen. Die FitcFärbung hingegen zeigt die hohe uPA-Konzentration in den Sphäroiden. In der
Negativkontrolle erfolgt die Färbung unter Ausschluss des uPA-Antikörpers in einer
separaten Kammer (Abb. 11).
4.3
Nachweis von uPA im C6-Gliommodell der Ratte
Die explantierten Rattenhirne beider Serien werden in Isopentan schockgefroren und bei
-80°C gelagert. Die dunklen Kerne der Tumorzellen präsentieren sich in der HE-Färbung
entlang eines Strangs von Myelin, zu dem die Tumorzellen eine erhöhte Affinität aufweisen.
Somit dienen Myelinstränge, wie sie in der weißen Hirnsubstanz vorkommen, als ideale
Invasionsstraßen für die Glioblastomzellen (Abb. 12a).
Auf den Kryoschnitten kann mittels Fitc-Färbung die erhöhte Konzentration von uPA im
Tumorareal nachgewiesen werden. In der Positivfärbung stellen sich die uPA-Moleküle dann
wie in Abbildung 12b als hell leuchtend dar, die Negativkontrolle bleibt hingegen dunkel. Die
starke Vaskularisierung
als Charakteristikum
des Gliobalstoms
ist
auch
in
der
Übersichtsaufnahme in Abbildung 13 gut zu erkennen.
Mit Hilfe der Peroxidasefärbung kann eindrucksvoll gezeigt werden, wie sich das Enzym uPA
hochkonzentriert in den neuronalen Zellen des Rattenhirns ansammelt. Dunkelbraun färben
sich die Axone und der Intrazellularraum unter Auslassung des Zellkerns (Abb. 14).
Die Affinität der Tumorzellen zur Basalmembran ist verantwortlich für das Migrationsmuster
des Tumors entlang von Gefäßen und Plexus in Abbildung 15. Die Basalmembran kann von
den Zellen nicht durchdrungen werden und wird als Invasionsgrenze respektiert.
44
In Abbildung 16 ist durch die Braunfärbung zu erkennen, dass die Konzentration von uPA
besonders an der Invasionszone erhöht ist. Dort wird es durch den membranständigen
Rezeptor uPAR gebunden und aktiviert. Die Zellnester entstehen durch Tumorzellen, welche
weit in das angrenzende Hirngewebe migrieren und dort die Infiltration des Tumors
vorantreiben. Der Umstand, dass diese vom Haupttumor weit entfernten Gliomzellen nicht
operativ entfernt werden können, ist verantwortlich für die hohe Rezidivrate unter den
Glioblastomen. Das Tumorzentrum weist außerhalb der nekrotischen Areale eine sehr geringe
Konzentration von uPA auf, da hier die Invasionskräfte der Tumorzellen nicht zum Einsatz
kommen.
4.4
Zeitlicher Verlauf der Proteasen-Expression im Glioblastom
Wird die Expression der Proteasen in den Gliomzellen unter dem Aspekt des zeitlichen
Verlaufes beobachtet, so zeigt sich, dass uPA und MMP-2 schon frühzeitig im Tumor gebildet
werden. Die Expression von uPAR nimmt proportional zum Tumorwachstum kontinuierlich
zu, wohingegen die Expression von uPA nach anfänglich erhöhten Werten stabil bleibt.
Abb 9.
Verlauf von MMP-2, MMP-9, uPA und u-PAR nach semiquantitativer Auswertung der
Peroxidasefärbung. (Vince et al., 2002)
1 - schwaches DAB-Signal, 2 - mittelstarke Färbung und 3 - starkes Signal
45
4.5
Sphäroidimplantation und WX-UK 1-Applikation
Alle Tiere der Serie I überstanden die Implantation des C6-Sphäroids ohne Ausfälle und
erholten sich in den darauf folgenden Tagen gut. Während des Beobachtungszeitraumes von
21 Tagen verstarb ein Tier nach 12 Tagen post-op (1C-Nr.6), und bei zwei Tieren wurde der
Versuch aus ethischen Gründen nach 14 Tagen abgebrochen (1B-Nr.9, 1C-Nr.18). In der
zweiten Serie verstarben sowohl ein Tier bei der Implantation (2B-Nr.4), als auch 14 Tage
post-op (2B-Nr.16). Die restlichen Tiere der Serie tolerierten die Implantationsoperation
sowie die Aufnahme der MRT-Bilder gut. Insbesondere wurden während des 21 bzw. 19 Tage
dauernden Versuchs keine neurologischen Ausfälle und kein signifikanter Gewichtsverlust
beobachtet (Abb 18).
4.6
Einfluss des Serinproteaseinhibitors WX-UK 1 auf das Tumorwachstum
Um den Einfluss des Serinproteaseinhibitors WX-UK 1 auf das Tumorvolumen zu
untersuchen, wurden die tumortragenden Tiere nach folgendem Schema in Gruppen
eingeteilt. Die Gruppen 1A, 1B und 2A erhielten täglich den Wirkstoff WX-UK 1. Den
Kontrollgruppen 1C und 2B wurde reines Mannitol als Placebo verabreicht.
SERIE I – 21 Tage
SERIE II – 19 Tage
1A - Nummer 1–4
WX-UK1
1B – Ungerade
WX-UK1
2A - Ungerade
WX-UK 1
1C – Gerade
Mannitol
2B – Gerade
Mannitol
Abb 10. Tierversuch, Gruppeneinteilung
Die Gehirne der Tiere in Gruppe 1A wurden am 20. postoperativen Tag mittels MRTAufnahme unter Kontrastmittelgabe vermessen. Durch manuelle Markierung des Tumors in
allen drei Schnittebenen wurde das Tumorvolumen berechnet, welches zur Bestimmung des
Wirkungsgrades von WX-UK 1 herangezogen werden kann. Im MRT wiesen 75% einen
Tumorherd auf, makroskopisch war dies bei 100 % der Fall. Das mittlere Gewicht der
explantierten Tumoren lag in der Gruppe 1A bei 52,5 mg.
46
Die Tumoren der Serie II (Tiere 1-15) wurden am 19.Tag nach Implantation im MRT
vermessen. Bei sechs Tieren gelang der Nachweis eines Tumorherdes mit einer Verteilung der
Volumina zwischen 0,18 bis 78 mm³.
Der Volumenmittelwert lag in Gruppe 2A bei 19,8 mm³ und in Gruppe 2B bei 11,2 mm³. Die
große Streubreite der Tumorvolumina und die geringe Anzahl von messbaren Tumoren ließen
in diesem Fall keinen direkten Rückschluss auf die Wirkung von WX-UK 1 zu. Allerdings
konnten mittels der MRT-Bilder die Befunde der Histochemie überprüft und ergänzt werden.
Die Gehirne von jeweils zwei Tieren aus den Gruppen 2A und 2B wurden zur späteren
Verwendung in Parafin eingelegt und bei 4°C gelagert.
Die implantierten Sphäroide weisen nach 20 Tagen eine starke Volumenzunahme auf, welche
zur Verdrängung benachbarter Strukturen führt. Die Ventrikel sind erheblich verkleinert und
die Mittellinie des Gehirns ist deutlich zur Gegenseite verlagert. Hinweise für Einblutungen
und intratumorale Nekrosen finden sich in T2-gewichteten Aufnahmen. Der Zusammenbruch
der Blut-Hirn-Schranke und die erhöhte Vaskularisierung des Tumors werden durch das
ausgedehnte perifokale Ödem sowie die inhomogene Aufnahme von Kontrastmittel in
Abbildung 17 deutlich.
4.7
Biodistribution von WX-UK1 in der Ratte
Zur Messung der Biodistribution von radioaktivem WX-UK 1 wurden vier Tiere der Gruppe
1A und zwei Kontrolltiere untersucht. Zum Zeitpunkt der Messung befanden sich die Tiere im
22.POD an dem die letzte Verabreichung des Wirkstoffes WX-UK 1 sieben Tage zurück lag.
Die radioaktive Aktivität von reinem H³WX-UK1* wurde mit 39 mCi/µmol beziffert und per
Szintillation gemessen.
Die Messdaten stammen von Prof. Dr. Stürzebecher, Erfurt und wurden aus den
repräsentativen Organen Milz, Herz, Leber und Niere, sowie aus den beiden gesunden
Gehirnhälften der Tiere gewonnen. Eine weitere Messung entstammt dem Tumorgewebe. Ein
signifikanter Unterschied der Radioaktivität zwischen den behandelten Tieren und den
Kontrolltieren war weder in den Organen, noch im Gehirn festzustellen.
47
Figur 11. C6-Sphäroid VEGF+: a) HE-Färbung, b) Fitc-positiv, c) Fitc-negativ
Figur 12. Nachweis
von uPA im
Gliommodell der
Ratte.
a) HE-Färbung
b) Fitc-Färbung
uPA-positiv
Figur 13. Tumorübersicht mit zahlreichen Gefäßanschnitten
Figur 14. uPA in den neuronalen Zellen des Rattenhirns
48
Figur 15. uPA-Nachweis von Tumorzellen mit hoher Affinität zum Blutgefäß
Figur 16. Nachweis von uPA in der Grenzzone des Tumors, Zellnest
Figur 17. MRT-Aufnahmen der intrakranial gewachsenen Glioblastome nach 20 Tagen
420,0
410,0
350
400,0
345
390,0
340
Gruppe A
Gruppe B
Mittelwert
380,0
335
370,0
330
360,0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
350,0
Gruppe A
Gruppe B
Gruppe C
2
4
6
8
10
Figur 18. Gewichtskurven der Serie I und Serie II
49
12
14
16
18
5. Diskussion
5.1
Tiermodelle in der Erforschung von Hirntumoren
Das in diesem Experiment verwendete Tiermodell soll möglichst viele Rückschlüsse auf das
komplexe Wachstumsverhalten von Glioblastomen ermöglichen. Daher muss es sich stark an
den Voraussetzungen orientieren, welche von Gliomzellen im humanen Gehirn vorgefunden
werden. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Tiermodelle erprobt, welche es heute
ermöglichen, das Ausbreitungsmuster und die Infiltration des Hirngewebes durch das
Glioblastoma multiforme detailliert zu erforschen. Aufgrund der Vor- und Nachteile jedes
Modells muss sich die Wahl des Tiermodells jedoch an der Fragestellung des Experiments
orientieren und, das Ergebnis muss unter Berücksichtigung der suboptimalen Bedingungen
interpretiert werden. Folgende Merkmale zeichnen ein Tiermodell aus, welches das humane
Wachstum des Glioblastoms möglichst realistisch imitiert:
1. Die Tumorzellen sollen glialer Herkunft sein
2. Das orthotope Wachstum soll durch das Implantationsverfahren sichergestellt werden
3. Die Wachstumsrate der Tumorzellen soll vorhersagbar und reproduzierbar sein
4. Die Wachstumseigenschaften sollen mit denen klinischer Gliome übereinstimmen
5. Die Wachstumsdauer des Tumors soll für Therapiestudien ausreichend sein
6. Die Immunreaktion des Wirtsgewebes auf die Tumorzellen soll minimal sein
7. Das Tiermodell soll die Möglichkeit der in vivo Beobachtung des Tumorwachstums
beinhalten
Die meisten Modelle erfüllen die Punkte 1, 3 und 5, erzeugen aber nicht die gliomartigen
Wachstumseigenschaften und vor allem nicht die Unterdrückung der Immunantwort. Auch
das Kriterium der orthotopen Implantation wird wegen des großen operativen Aufwandes nur
von wenigen Tiermodellen erfüllt. (Goldbrunner, 2000)
Gliale Tumorzellen unterliegen einer regen Interaktion mit der Extrazellulärmatrix, welche
das Wachstums- und Immigrationsverhalten des Tumors stark beeinflusst. Aus diesem Grund
finden nur Tumorzellen, die orthotop implantiert wurden, die gleichen Voraussetzungen vor,
wie humane Glioblastome. Die Möglichkeit zur Interaktion mit der ECM ist bei Wachstum
außerhalb des Gehirns nicht gegeben, und die Beobachtung von extracerebral wachsenden
Glioblastomen gibt Hinweise auf ein verändertes Verhalten, wie zum Beispiel ein schnelleres
50
Größenwachstum. (Watanabe et al., 2002) Da die Wachstumseigenschaften des Tumors also
stark von der organspezifischen ECM abhängen, ist es von äußerster Wichtigkeit, den
Sphäroid sicher subdural in das Hirngewebe zu implantieren, um realistische Ergebnisse zu
erhalten.
Die in vivo Beobachtung mittels MRT bleibt auf Gruppen beschränkt, die Zugang zu
radiologischen Einheiten haben. Dies setzt sich immer mehr durch und erhöht somit die
Qualität der Forschungsergebnisse. (Goldbrunner et al., 2000)
5.2
Das Sphäroidmodell der Ratte
Die Ergebnisse dieser Arbeit basieren auf dem Modell der Sphäroidimplantation in der Ratte.
Dies ist das Tiermodell, welches zum heutigen Zeitpunkt die besten Ergebnisse in Bezug auf
das Invasionsverhalten und die Vaskularisierung des humanen Glioblastoms liefert und in der
Anwendung weit verbreitet ist. (Grobben et al., 2002) Sphäroide sind standardisierbare, solide
Tumoren, die aus vielen Tumorzelllinien, aber auch aus chirurgisch gewonnenen Nativproben
generiert werden können. Nimmt man kultivierten Monolayerzellen die Möglichkeit zur
Adhäsion an der Kulturflasche, so bilden diese durch Zell-Zell-Adhäsion kugelige Strukturen
mit Durchmessern von 100 – 600 µm.
Diese
Sphäroide
entsprechen
Wachstumsgeschwindigkeit,
organotypischen
einen
ähnlichen
Kulturen,
welche
Stoffwechsel
und
die
gleiche
Aufbau
der
Extrazellulärmatrix aufweisen, wie Tumoren in situ. Wird der Sphäroid in gesundes
Hirngewebe implantiert, so lässt sich an dem Tumorherd die Ausbildung der Infiltrationszone,
sowie die Vaskularisierung des primär avaskulären Tumors beobachten. (Khoshyomn et al.,
1998;Corcoran et al., 2003)
Besonders im Vergleich zur Injektion von Zellsuspensionen bietet das Sphäroidmodell
entscheidende Vorteile im Bezug auf die Wachstumsbedingungen der Tumorzellen. Das
Sphäroidmodell realisiert ein regelmäßiges, zentralorientiertes Wachstum, in dem die Zellen
der Peripherie eine größere Angriffsfläche nach außen bieten als im Zentrum. Die Zellen im
Kern des Sphäroids sind auf Grund des Missverhältnisses von Tumorwachstum und
Neoangiogenese einer steigenden Sauerstoffunterversorgung ausgesetzt, welche im Zentrum
zu ausgedehnten, für das GBM charakteristischen Zellschäden und Nekrosen führt. (KunzSchughart et al., 2004). In MRT-Aufnahmen zeigen sich die Nekrosen in vivo als zentrale
51
Verschattungen, in vitro resultiert die Zellnekrose nach einigen Wochen im Untergang des
Sphäroids.
Um dem Anspruch der Reproduzierbarkeit gerecht zu werden, muss bei jeder Wiederholung
des Experiments eine definierte Tumormasse implantiert werden, welche über den
Durchmesser des Sphäroids bestimmt wird. (Farrell et al., 1987) Die implantierten Sphäroide
sollten einen Durchmesser von 300 bis 400µm und keine zentralen Nekrosezeichen
aufweisen. Die Implantation des Sphäroids erfolgt unter dem Mikroskop subdural, und die
Lage des Tumors wird anschließend optisch kontrolliert. Der sofortige Wunderverschluss
verhindert das Ausschwemmen des implantierten Tumors.
Die Vorteile des Sphäroidmodells sind also:
1. dreidimensionale Struktur des Sphäroids
2. leichte Reproduzierbarkeit des Wachstums
3. Implantation einer definierten Tumormasse
4. sicher orthotope Implantation
5. gute Vergleichbarkeit mit anderen Studien
Allerdings ist es bei der Implantation des Sphäroids unumgänglich, den Schädel mittels
Bohrer zu penetrieren und die Hirnhäute zu eröffnen. Außerdem wird das kortikale
Hirngewebe inzissiert, um ein Wegspülen des Tumors durch Liquorfluss zu verhindern. In
seltenen Fällen verhindert die dreidimensionale Struktur des Sphäroids, dass kleine zentrale
Nekrosen nicht als solche erkannt werden. Daher kann fälschlicherweise ein nekrotischer
Sphäroid implantiert werden, der veränderte Wachstumseigenschaften aufweist.
Ein potentieller Schwachpunkt des Sphäroidsmodells ist die Implantation eines fertigen
Tumors in das Trägertier. Humane solide Tumoren haben ihren Ausgangspunkt in einer
einzelnen malignen Zelle und geben ihrer Umgebung während ihres Wachstums die
Möglichkeit zur Adaption. Bei der Sphäroidimplantation wird der Wachstumsvorgang des
Tumors übergangen, und der Wirtsorganismus wird sofort mit einer strukturierten Masse von
Tumorzellen konfrontiert. Alle Abwehrmechanismen, welche den Tumor eventuell im
Frühstadium der Entwicklung beeinflussen könnten, fallen somit weg.
52
Folgende Nachteile ergeben sich hieraus für das Sphäroidmodell:
1. großer Implantationsaufwand
2. Setzen einer großen Läsion mit einhergehender Entzündungsreaktion
3. Risiko der Implantation eines nekrotischen Sphäroids
4. Implantation einer strukturierten Tumormasse
Tumorzellen, welche als Zellsuspension gezüchtet und implantiert werden, haben sich als
weniger effizient in der Tumorforschung erwiesen. Dies beruht darauf, dass jede Zelle in
Suspensionen in Bezug auf Sauerestoffversorgung, Nährstoffangebot und Einfluss von
Stressfaktoren weitgehend die gleichen Voraussetzungen vorfindet. (Goldbrunner et al., 2004)
Das Migrationsverhalten der Zellen und die Expression von Wachstumsstoffen werden
beeinträchtigt und das Ausbilden der Nekrose im Tumorzentrum entfällt völlig. Hieraus
resultiert, dass Zellsuspensionen exponentiell wachsen, während bei Sphäroiden aufgrund der
mangelnden Versorgung im Zentrum ein vermindertes Wachstum beobachtet werden kann.
(Bell et al., 2001) Während der Implantation der Suspension ist es außerdem nicht möglich zu
verhindern, dass einzelnen Zellen verschleppt werden und sich zusätzliche Tumorherde
bilden. Die stereotaktische Infusion von Zellsuspensionen ist somit für Invasions- und
Vaskularisierungsexperimente nur als zweitrangig anzusehen.
5.3
Die C6-Gliomzelllinie
Die Wahl der Tumorzellreihe C6 für die Simulation des humanen Gliomwachstums hat den
Vorteil, dass ihr Wachstumsverhalten den klinischen Gliomen sehr nahe kommt. Besonders
bei der Implantation in Ratten des Wistar-Stammes können homolog zum humanen
Glioblastom die Invasion des Parenchyms, Die Neovaskularisierung und die zentrale
Nekrotisierung beobacht werden.
Das stetige Wachstum der C6-Tumorzellen wird in den ersten 28 Tagen beschrieben, bevor
sich der Tumor wieder zurück bildet. Dieser Zeitraum erlaubt es, die Ausbildung der
Invasionszone ausreichend zu beobachten und eine bildgebende Diagnostik zu durchzuführen.
(Vince et al., 2004)
53
Nachteilhaft wirkt sich die immunogene Abwehrreaktion des Gastgewebes auf die C6Tumorzellen aus. Da die C6-Zellreihe in Ratten eines Wistar-Auszuchtstammes generiert
wurde, steht der syngene Host für die Implantation heute nicht mehr zu Verfügung. Bei
Implantation der C6-Zellen in einen allogenen Wirt muss auf jeden Fall mit einer
Abstoßungsreaktion gerechnet
werden.
Dies
kann die Ergebnisse
besonders
bei
Überlebensstudien verfälschen und muss bei der Interpretation berücksichtigt werden. (Parsa
et al., 2000)
5.4
Die Rolle von uPA in der Zellmigration
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die Serinprotease uPA im C6-Gliommodell der
Ratte nachzuweisen. Anhand der Immunhistochemie an den extrahierten Tumoren konnte das
charakteristische Verteilungsmuster von uPA gezeigt werden, wobei die höchsten
Konzentrationen von uPA in der Peripherie des Tumors und in den tumorösen Satellitenzellen
im gesunden Hirngewebe gemessen wurden. Dies untermauert die These, dass uPA besonders
beim infiltrativen Wachstum des Glioblastoms eine tragende Rolle spielt. (Andreasen et al.,
2000)
Die C6-Tumorzellen erwirken durch die eigenständige Synthese von uPA die Degration der
umliegenden Extrazellulärmatrix, welche für ihre Migration erforderlich ist. Durch die hohe
Affinität des uPA-Rezeptors uPAR zu den Proteinen der Extrazellulärmatrix wird die
Hauptaktivität der uPA-Proteolyse auf den Randbereich des Tumors gerichtet.
Neben der direkten proteolytischen Aktivität existiert für uPA aber noch ein zweiter Weg,
über welchen es Einfluss ausüben kann. Über den Rezeptor uPAR wird eine intrazelluläre
Signalkette induziert, welche noch weitgehend unerforscht ist. In Zusammenhang wird diese
gebracht mit der Reorganisation des Zytoskeletts (Goldbrunner, 2000) und mit der
Freisetzung von Vaskularisierungsfaktoren in hypoxischen Tumorzellen. (Kroon et al., 2000)
Die Serinprotease uPA und dessen Membranrezeptor uPAR eignen sich sehr gut als
Angriffspunkt für eine inhibitorische Therapie, da sie am Anfang der proteolytischen
Aktivierungskaskade stehen, über welche weitere Proteasen wie die MMP’s und Plasmin
aktiviert werden. Mehrfach wurde nachgewiesen, dass die Blockade von uPA in vitro zu einer
verminderten Migration der Tumorzellen führt. (Gondi et al., 2003;Mohanam et al., 1997).
Die Komplexität des uPA-Systems bietet jedoch mehr als eine Möglichkeit zur Intervention.
Sowohl die Synthese eines uPAR-Inhibitors auf Basis der uPA-Aminosequenz (Kobayashi et
54
al., 1994) als auch die Zyklisierung der uPA-Bindungsstelle für uPAR (Burgle et al., 1997)
verhindern die Komplexbildung und die korrekte Funktion der Protease. Mittels eines
Bakteriophagen, welcher einer Reihe von randomisierten Peptiden ausgesetzt wurde, gelang
es, einen uPAR-Inhibitor zu identifizieren, dessen Affinität weit stärker als die von uPA ist.
(Goodson et al., 1994) Außerdem existieren weitere uPA-Antagonisten, wie Suramin, welche
einen nicht-kompetitiven Mechanismus aufweisen. (Behrendt et al., 1993)
Die Verlaufsmessungen der verschiedenen Proteasen im Tumorgewebe (Vince et al., 2002)
zeigen in Kombination mit den Messungen der Tumorvolumina am Tag der Explantation,
dass eine Verlaufsdauer von 19 bzw. 21 Tagen bei Studien mit dem C6-Gliommodell ideal ist.
Zu Beginn des Tumorwachstums wird der uPA-Rezeptor uPAR, welcher als Aktivator von
uPA dient, nur ungenügend exprimiert. Wahrscheinlich als Reaktion auf den uPAR-Mangel
zeigt uPA zum gleichen Zeitpunkt eine Überexpression. Steigt die uPAR-Expression an, so
nimmt die Expression von uPA parallel dazu ab.
5.5
Die Malignität des Glioblastoma multiforme
Die Malignität der C6-Glioblastome konnte im Rahmen dieser Arbeit durch den Nachweis
von uPA-exprimierenden Tumorzellen hervorgehoben werden, welche sich weit entfernt vom
makroskopisch abgrenzbaren Tumor befanden. Die Inoperabilität dieser Zellnester in der
Infiltrationszone ist die Hauptursache für die extrem hohe Rezidivrate und die geringe
Lebenserwartung von 12 Monaten bei GBM. (Parney et al., 2000)
Insgesamt helfen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis des
Tumorwachstums innerhalb des C6-Gliommodells und führen zu einem effektiven Einsatz der
Tierversuche. Der Nachweis, dass das infiltrative Wachstum des C6-Glioms, gleichsam wie
das des humanen GBM, auf der Funktion der Enzymprotease uPA basiert, validiert die
Forschung mit dem C6-Gliommodell und die Übertragung der Ergebnisse auf klinische
Studien.
5.6
Auswirkungen der Applikation von WX-UK 1
Der Wirkstoff WX-UK1 ist ein uPA-Inhibitor, welcher kompetitiv an die proteolytische
Domäne des uPA bindet. (Stuerzebecher et al., 1999) Nachdem sich WX-UK1 an uPA
angelagert hat, kann uPA zwar noch über das aminoterminale Ende eine Verbindung mit
55
seinem Rezeptor uPAR eingehen, die proteolytische Aktivität wird aber unterbunden. Die
Degeneration der ECM wird stark eingeschränkt, und die Tumorzellen können nicht in das
gesunde Hirngewebe vordringen. Im Idealfall kann der solide Tumor restlos entfernt werden,
ohne dass eine Infiltrationszone die scharfe Trennung vom Hirngewebe erschwert.
Die intraperitoneale Gabe von WX-UK1 über einen Zeitraum von 19 bzw. 21 Tagen hat in
diesem Versuchsaufbau keinen signifikanten Einfluss auf das Wachstum des C6-Glioblastoms
erkennen lassen. Bei der Ursachensuche muss in Betracht gezogen werden, dass die Dosis des
Wirkstoffes, welche das Gehirn erreicht, zu gering ist. Einerseits kann hier die mangelnde
Passage der Peritonealschranke zu Grunde liegen, andererseits kann aber auch der
beschleunigte Abbau des WX-UK1 im Blut oder die ungleichmäßige Verteilung im Körper
die Ursache sein.
Die Berechnung der injizierten Dosis beruht auf Daten, welche von der Firma Wilex,
München in vorausgegangenen in vitro-Untersuchungen erhoben wurden. Für die
intraperitoneale Injektion ergab sich somit eine empfohlene Dosis von 1,5 mg/kg täglich. In
Zukunft sollte die Dosisberechnung außerdem mit vergleichbaren Daten zur i.p.-Injektion,
sowie zur zerebralen Biodistribution abgeglichen werden und gegebenenfalls eine Erhöhung
der Tagesdosis erfolgen.(Carpentier, 2005)
Bei Glioblastomen wird regelmäßig eine lokale Störung der Bluthirnschranke beobachtet. Das
Eindringen von H2O-Molekülen und Kontrastmittel führt zu ausgeprägten Ödemen in der
Umgebung des Tumors und zur eindeutigen Markierung des Tumors in der CT-Untersuchung.
Der Einfluss des Tumors bedeutet allerdings keinesfalls die vollständige Auflösung der
Bluthirnschranke. So ist möglicherweise die Permeabilität der Bluthirnschranke auch bei
voller Tumoraktivität nicht ausreichend, um den Wirkstoff WX-UK 1 in therapeutisch
wirksamer Menge penetrieren zu lassen. (Kato et al., 2005;Carpentier, 2005) Die Tumorzellen
werden sozusagen durch die Bluthirnschranke vor äußeren Angriffen geschützt und können
ihr Wachstum ungehindert fortsetzen.
Weiterhin kann im Tumorgewebe selbst eine gehäufte Komplexbildung zwischen WX-UK1
und unspezifischen Proteasen auftreten. Besonders die Substitution des naiven uPA-Inhibitors
mit Ethoxycarbonyl-Derivat (EXO) beeinflusst die Spezifität für uPA (k = 0.49) negativ und
bewirkt sowohl für Plasmin (k = 0.39), als auch für Trypsin (k = 0.037) eine größere Affinität.
Das Resultat kann eine unzureichende Inhibition von uPA sein ohne weiteren Einfluss auf das
Wachstum des Tumors. Außerdem ist es denkbar, dass die Tumorzellen in Anbetracht der
uPA-Inhibition alternative Wege entwickeln, um ihre Migration zu beschleunigen. Dies
56
könnte über eine direkte Aktivierung der Matrixmetalloproteasen (MMPs) oder eine
verstärkte Autoaktivierung des Plasminogens erfolgen.
5.7
Ausblick
Die erfolgreiche Funktion von WX-UK1 wurde sowohl in vitro (Ertongur et al., 2004) als
auch in vivo bei mehreren Tierstudien besonders für das Mamma-CA bewiesen. Weitere
Bemühungen, welche den Einfluss von WX-UK1 auf das Wachstum von GBM untersuchen,
müssen eine ausreichende Biodistribution des Wirkstoffes an den Wirkort sicherstellen. Mit
Blick auf die bisherigen Ergebnisse ist dann eine Abnahme der Tumorinvasion auch beim
GBM zu erwarten. Eine höhere Spezifität des Wirkstoffes würde verhindern, dass neben der
eigentlichen Zielsubstanz uPA auch andere Proteasen, wie Plasmin und Trypsin blockiert
werden.
57
6.
Zusammenfassung
Gegenstand dieser Doktorarbeit war die Beschreibung des Urokinaseplaminaktivators uPA im
C6-Sphäroidmodell der Ratte und dessen Lokalisation in Bezug auf den Primärtumor.
Das hierbei verwendete Tiermodell basiert auf der C6-Tumorzellreihe, welche durch
Transfektion von Rattengliomzellen mit dem Vaskularisierungsfaktor VEGF entwickelt
wurde. Die gesteigerte Expression von VEGF resultiert in einer stärkeren Vaskularisierung
und einer erhöhten Wachstumsrate des Tumors.
Im Vorfeld der Tumorimplantation konnte die Expression von uPA durch die C6-Tumorzellen
mittels reverser RNA-Transkription und Polymerasekettenreaktion nachgewiesen werden. In
vitro gelang der Nachweis von uPA im C6-Sphäroiden mittels Fluoreszenz-Färbung.
Im Rahmen des Tierversuches wurden aus den Tumorzellen ca. 300µm große Sphäroide
hergestellt, welche den Ratten in den Kortex des linken Frontallappens implantiert wurden
und dort solide Hirntumoren bildeten. Die Versuchstiere wurden anschließend in zwei
Gruppen aufgeteilt. Der Positivgruppe wurde täglich über einen Zeitraum von 19 bzw. 21
Tagen der Proteasehemmer WX-UK1 in die Bauchhöhle injiziert, die Kontrollgruppe erhielt
ein Placebo.
Nach Ablauf des Behandlungszeitraumes konnte an den explantierten Gehirnen mittels
histochemischer Peroxidasefärbung die Protease uPA im Tumorgewebe nachgewiesen
werden. Die Konzentration von uPA war besonders im invasionsaktiven Bereich des Tumors
erhöht. Dieser entspricht der Randzone des soliden Tumors, sowie den distanzierten
Tumorzellnestern im gesunden Hirngewebe, welche als so genannte Invasionszone
zusammengefasst werden. Die tragende Rolle von uPA bei der Invasion der Tumorzellen in
das gesunde Hirngewebe konnte somit bestätigt werden.
Die Messung von erhöhten uPA-Konzentrationen an der Basalmembran von Hirngefäßen
korreliert mit Beobachtungen, dass die Tumorzellen entlang von Gefäßen und Plexus
migrieren, aber nicht in der Lage sind, in das Gefäßlumen einzudringen.
Der Nachweis der erfolgreichen orthotopen Sphäroidimplantation mittels MRT-Bildgebung
der Hirntumoren unterstreicht den Vorteil der offenen Implantationstechnik gegenüber der
Zellinjektion.
58
Die peritoneale Verabreichung des Proteasehemmers WX-UK1 führte im Rahmen dieser
Untersuchungen zu keiner signifikanten Reduktion des Tumorwachstums, welches mittels
Volumenmessung im MRT dokumentiert wurde. Des Weiteren konnte keine Minderung der
uPA-Konzentration in den Tumoren der Positivgruppe gegenüber der Kontrollgruppe
gemessen werden. Neben der fehlenden Biodistribution des Wirkstoffes kommen hierfür auch
eine mangelnde Spezifität von WX-UK1 für uPA oder ein alternativer Aktivierungsweg der
Proteolyse innerhalb der Tumorzellen in Betracht.
Diese Arbeit führt zur Weiterentwicklung des C6-Sphäroidmodells und unterstützt die
zukünftige Entwicklung von Wirkstoffen gegen das Tumorwachstum auf Basis der antiinvasiven Therapie.
59
7.
Abkürzungsverzeichnis
α 2MR/LRP
A.d.
Ang.
α 2-Makroglobulin-Rezeptor/low density lipoprotein-related protein
Aqua dest.
Angiotensin
BSA
Bovines Serum Albumin
°C
CISS
CR 3
CT
Grad Celsius
Constructive interference in steady state
Complement Rezeptor 3
Computertomographie
DAB
DMEM
DMSO
DTT
p-Dimethyl-Aminoazobenzol
Dulbecco’s modified Eagle’s Medium
Dimethylsulfoxid
Dithiothreitol
ECM
EDTA
ELISA
EXO
Extrazellulärmatrix
Ethylendiamintetraacetat
Enzyme linked immune sorbent assay
Ethoxycarbonyl-Derivat
FCS
FMM
FGF-2
Fetal calf serum
Fluorescent Mounting Medium
Fibroblast growth factor 2
GBM
GPI
Glioblastoma multiforme
Glykosyl Phosphatidylinositol
i.m.
Intramuscular
µm
Mikrometer
MMP
MMLV
mRNA
MRT
Matrixmetalloprotease
Mariner Maloney-Leukämie-Virus
Messenger-RNA
Magnetresonanztomographie
NMR
NaCl
NO
Nuclear magnetic resonance
Natriumchlorid
Stickoxid
PAI-I
PBS
PDGF
POD
Plasminogen Aktivator Inhibitor 1
Phosphate buffered Saline
Platelet derived growth factor
Tage nach Implantation
Rpm
RNA
Rounds per minute
Ribonucleic Acid
60
Serpin
Serinprotease-Inhibitor
TIPPS
TNF-α
TGF-β
tPA
Nα-Triisopropyl-Phenylsulfonyl
Tumor Nekrose Faktor α
Tumor Growth Faktor β
Tissue Plasminogen Aktivator
uPA
uPAR
Urokinase Plasminogen Aktivator
Urokinase Plasminogen Aktivator Rezeptor
VEGF
Vascular endothelial growth factor
WHO
WX-UK 1
World Health Organisation
Wilex® Wirkstoff Serinproteasehemmer
ZNS
Zentrales Nervensystem
61
8.0
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67
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben.
Herrn Prof. K. Roosen danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im
tumorbiologischen Labor der Neurochirurgischen Klinik Würzburg.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Giles Vince. Durch seine Geduld und dauernde
Unterstützung ermöglichte er diese Arbeit. Auch seine konstruktive Kritik und seine
Anregungen waren eine wertvolle Hilfe.
Herrn Prof. Dr. W. Roggendorf danke ich für die Übernahme des Korreferates.
Dank schulde ich auch Herrn Priv.-Doz. Dr. M. Bendszus für die Durchführung der
kernspinntomographischen Versuche.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei den biologischen Mitarbeitern Herrn Dr. S. Wagner
und Frau Dr. V. Hummel für ihren motivierenden Humor und die Hilfe bei der Durchführung
der Experimente.
Frau Brünner danke ich für die Unterstützung bei der Pflege der Versuchstiere und Frau
Kerkau für die gründliche Einweisung in die Zellkultur.
Allen biologischen und medizinischen Mitarbeitern des tumorbiologischen Labors der
Neurochirurgie danke ich für die wissenschaftliche Zusammenarbeit und die freundschaftliche
Unterstützung während meiner gesamten Doktorarbeit.
Meinen Eltern und Geschwistern danke ich herzlich für den dauernden familiären Rückhalt
und die alternativen Sichtweisen, welche die Lösung vieler Probleme ermöglichten.
Curriculum vitae
Patrick Johannes Schuler
Sartoriusstrasse 14
97072 Würzburg
Persönliche Daten
Familienstand:
ledig
Nationalität:
deutsch / amerikanisch
Religion:
römisch-katholisch
Alter:
27
Geburtsort:
San Diego / California
Schulausbildung
09/1984 - 06/1988
Grundschule Neckargemünd
09/1988 – 06/1998
Gymnasium Neckargemünd
01/1995 – 01/1996
Glossop Highschool / South Australia
06/1998
Abitur
Wehrdienst
06/1998 – 08/1998
Grundausbildung Marineoperationsschule Bremerhaven
09/1999 – 04/1999
Fregatte Rheinland-Pfalz, Zerstörerflottille Wilhelmshaven
Hochschulausbildung
05/1999 – 03/2001
Vorklinisches Medizinstudium an der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
03/2001
Physikum
03/2001 – 11/2005
Klinisches Studium an der Universität Würzburg
08/2002 – 08/2003
Klinisches Studium an der Uppsala Universitetet / Schweden
10/2004
Scarborough Grace Hospital in Toronto / Canada
01/2005
Neurochirurgische Klinik der Universität Würzburg
07/2005
Centralsjukhuset Karlstad / Schweden
11/2005
Approbation
Würzburg, den 06. Dezember 2005