Fraktionierung Aufreinigung des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) aus einem E.-coli-Lysat durch Säulenchromatographie 1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie Aufgabe 1: Prüfen Sie ihr Tube mit dem E.-coli-Lysat im UV-Feld auf Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen! 1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie 1.1 Zentrifugieren Sie das Zelllysat 10 min. bei 13000 rpm. TE-Puffer Überstand 1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie 1.2 Schütteln Sie die Säule um das Säulenmaterial zu durchmischen. 1.3 Warten Sie etwa 2 min. bis sich das Säulenmaterial abgesetzt hat. 1.4 Öffnen Sie die Chromatographiesäule zunächst oben, dann unten. 1. Vorbereitungen zur Chromatographie 1.5 Lassen Sie die Flüssigkeit in der Säule vollständig heraustropfen. 1.6 Pipettieren Sie 2 ml Ausgleichspuffer (AP) an der Wand entlang in die Säule. 1.7 Lassen Sie den Ausgleichspuffer bis zur 1 ml-Markierung durch die Säule laufen. 1.8 Verschließen Sie die Säule. (Unten gelben Verschluss benutzen!) 1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie 1.9 Entnehmen Sie Ihr Tube aus der Zentrifuge. Aufgabe 2: Prüfen Sie Ihr Tube mit dem zentrifugierten E. coli-Lysat im UV-Feld auf Fluoreszenz ohne das Pellet aufzuwirbeln! Notieren Sie Ihre Beobachtung! 1.10 Pipettieren Sie in Ihr gelbes Tube, das 250 µl Bindepuffer (BP) enthält, 250 µl Überstand des Bakterienlysats. 2. Durchführung der Säulenchromatographie 2.1 Nummerieren Sie Ihre Sammelröhrchen. 2.2 Öffnen Sie die Chromatographiesäule und lassen Sie die Säule leer laufen. 2.3 Stecken Sie die Säule auf Sammelröhrchen 1 um. 2. Durchführung der Säulenchromatographie 2.4 Pipettieren Sie 250 µl des verdünnten Bakterienlysats aus dem gelben Tube BP an der Wand entlang in die Säule. Legen Sie beim Einpipettieren die Spitze der Pipette an den oberen Rand der Säule an. 2.5 Lassen Sie die Säule leer laufen. 2. Durchführung der Säulenchromatographie Aufgabe 3: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UVFeld auf GFPFluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen! 2. Durchführung der Säulenchromatographie 2.6 Stecken Sie die Säule auf Sammelröhrchen 2 um. 2.7 Pipettieren Sie 250 µl Waschpuffer (WP) an der Wand entlang in die Säule. 2. Durchführung der Säulenchromatographie Aufgabe 4: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UVFeld auf GFPFluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen! 2. Durchführung der Säulenchromatographie 2.8 Stecken Sie die Säule um auf das Sammelröhrchen 3. 2.9 Pipettieren Sie 750 µl Elutionspuffer (EL) in die Säule. Hinweis: Unter Beobachtung der Elution im UV-Feld kann GFP in hoher Konzentration fraktioniert werden, indem die Säule, sobald GFP austropft, auf ein neues Sammelröhrchen umgesteckt wird. 2. Durchführung der Säulenchromatographie Aufgabe 5: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule während der Elution im UV-Feld auf GFP-Fluoreszenz. Notieren Sie ihre Beobachtungen! Aufbewahrung der Fraktionen bis zur Reinheitsprüfung Die Fraktionen in den Sammelröhrchen werden in entsprechend beschriftete Tubes umgefüllt und bis zur Reinheitsprüfung mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei –18°C aufbewahrt. 3. Reinigung und Aufbewahrung der Chromatographiesäulen Reinigung: Die Säule wird mit 2 ml 70%-tigem Ethanol nachgespült. Aufbewahrung: Die Säule wird mit 2 ml 20%-tigem Ethanol versetzt und kann so bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.