Untersuchungen zur Struktur der Oxalacetat - ETH E
Werbung
Diss. ETHNr. 10654 Untersuchungen zur Struktur der Oxalacetat-Decarboxylase ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von Günther Woehlke Dipl. Biologe Philipps-Umversität Marburg/Lahn geboren am 6. Februar 1964 Bundesrepublik Deutschland Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. P. Dimroth, Referent Prof. Dr. G. Braus, Korreferent Zürich 1994 Zusammenfassung 1. Das 5 Zusammenfassung Enterobakterium Salmonella biotinhaltige Oxalacetat-Decarboxylase. die a-Untereinheit entsprechenden Ä,-Phagen im Gene Na+-translozierende, eine typhimurium besitzt Auf der Grundlage EMBL3 wurde einer Expressionsbank für die DNA-Sequenz der Es fanden sich drei offene Leseraster, die aufgeklärt. (in der ß (oadB) codieren. Vor diesen drei Genen findet sich ein weiteres offenes Leseraster, dessen sequenzierter Reihenfolge) (padG), für die Untereinheiten y Teil auf Aminosäureebene 66 % Identität Dehydratase ß-Untereinheit sich keine abgeleiteten Untereinheiten aus vor und dem C-terminalen Bereich der L-Tartrat- zu jedem für einen Promotor. Mögliche Ribosomen- offenen Leseraster. für Aminosäuresequenzen S. (padA) Escherichia coli besitzt. Vor den oad-Genen findet typische Konsensussequenz Bindungsstellen liegen Die aus a typhimurium sind stark Oxalacetat-Decarboxylase die homolog zum entsprechenden Klebsiella pneumoniae Enzym (71% Identität für die y- Untereinheiten, 92% für die ß-Untereinheiten). Untereinheiten und 93 % für die Ähnlichkeit auf die N-terminalen sich die konnte jedoch gezeigt werden, pneumoniae-Gene entstanden Zur Kontrolle der dass Klonierung chromosomale Kartierung sequenzierten Bereichs der und nicht auf dem Die zu Artefakt bei Klonierung irrtümlichen S. gefunden, stammeigenen Plasmid Oxalacetat-Decarboxylase-Gene zeigt, dass mit aus K. typhimurium gebracht proteinchemisch vorhergesagte chromosomalen ergaben zusammen mit dem gewonnenen und in Einklang mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz Peptidsequenzen wieder. ß-Untereinheit wurde ein das 9 Transmembranhelices voraussagt. Es wurde 'p/ioA-Genfusionen experimentell überprüft. Bereiche Karte weiterer Genlocus für die korrigiert werden. In der membranständige Oxalacetat-Decarboxylase Topologiemodell vorgeschlagen, von eine wurde dem Chromosom kloniert. Die DNA- des oadfi-Gens konnte durch diesen Klon mit Hilfe K. die Restriktionskarte des pneumoniae wurden aus aus die der pSLT. Sequenz Für oad-Gene der dass ein Sequenz finden sich sämtliche beschränken. Es vorhanden ist. Die Gencluster sind chromosomal codiert Gen für den anaeroben Citratcarrier (citS) S. der a- schien Ergebnissen führte. typhimurium typhimurium S. ß-Untereinheiten 314 Aminosäuren vorgenommen. Sie in übereinstimmt. Ausserdem wurde Oxalacetat-Decarboxylase ein war, was zu Bei den die erwarteten Vier zytoplasmatisch Phosphatase-negativen Fusionen, für 6 Zusammenfassung den fünften wurde keine Fusion erhalten 4 und 6 wurden erhalten in Übereinstimmung Die vermeintlich Fusion mit alkalischer Aus dem der Sequenzvergleich sequenziert Fragment werden, Aminosauresequenz Um aus das weist Na+-translozierenden aus Teil zu Untersuchungen durchgeführt an in Lactococcus Rohextrakt Es von werden Oxalacetat ergab Loops 2, Fusionen wider Erwarten keine zu im Polymerase Kettenreaktion Diplomarbeit einer modestum ein 750 bp amplifiziert, klomert und Die abgeleitete mmdB-Gens ist den drei sequenzierten ß-Untereinheiten auf Bakterien ssp Abbauwege ausserhalb einer lactis Organismen fand umgehen parvula wurden konservierte eine Rahmen Rahmen lactis Oxalacetat-Decarboxylasen und Veillonella eines Decarboxylasen In keinem der beiden Decarboxylierung im 65 % Identität finden, wurden der Pnmer für Propionigenium Oxalacetat-Decarboxylasen Enterobaktenen im spezifische Mit diesem Ansatz konnte grosses DNA erwarteten Phosphatase-positive Schleife 8 ß-Untereinheiten der penplasmatisch Modell Aktivität Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase konstruiert von penplasmatische Phosphatase Bereiche identifiziert und In den zum für und sich solche der physiologische Clostridium eine Citrat Klasse der Semesterarbeit sphenoides Enzymaktivitat beschritten, die die Zusammenfassung 1. 7 Summary The Enterobacterium Salmonella biotin-containing corresponing EMBL3 screened reading were frames immunologically were this order. Upstream with 66 % identity amino acid level in its on sequence (oadG), typhimurium reading identity 71 % identity to ß-subunits. exist only The control for the cloning of the S. chromosomal map. Furthermore, decarboxylase in S. pneumoniae oad-genes oadB gene was phoA identity model typhimurium binding sites subunits from pneumoniae enzyme with between the a-subunits, and 93 % the corresponding ß-subunits was pneumoniae-genes was additional gene locus identified. The were the shown that that led to oad-genes were mapped in accordance with the coding two for an oxaloacetate oarf-gene-clusters are strain-specific plasmid pSLT. cloned together with the gene encoding the (citS) from the chromosome. The nucleotide sequence of the now with all available for the integral in accordance with the peptide technique. give phosphatase-negative Four membrane-bound accordance with the model, in was loops predicted fusions. The fifth loops 2, corresponding S. sequences. 9 transmembrane helices. The model gene fusion genes, the sequenced part was not on corrected and is typhimurium-gene and topology an typhimurium the chromosome and anaerobic citrate carrier predicting ribosome of the oad- results. the chromosome. The map of the A Upsteam decarboxylase the Klebsiella of the K. during cloning a The K. in detected was with the C-terminal part putative similarity between As on to 92 % on located ß (oadB) and frame reading for the 314 N-terminal amino acid residues. It artifact had occured erroneous y-subunits, between the between the appeared an highly homologous are A.-phage frame. The deduced amino acid sequences for the oxaloacetate S. (oadA) a sequenced part found but in the of the oc-subunit. Three open from Escherichia coli. was the of sequences genomic libary a additional open an Na+-translocating, a nucleotide expression the subunits y of these genes, typical promotor no for the encoding identified before each open were the basis of on dehydratase ß-subunit of the L-tartrate genes established found The decarboxylase. oxaloacetate genes LT2 possesses typhimurium to subunit tested be cytoplasmic 4 and 6 the fusions ß was proposed, experimentally cytoplasmic fusion were were was not with the found to obtained. In phosphatase-positive. 8 Zusammenfassung Unexpectedly, the putative periplasmic loop 8 does not confer activity to Phosphatase fusions alignments From of the ß-subumts methylmalonyl-CoA decarboxylase identified and course of specific diploma a and to sequence part of three a a pnmers for bp DNA sequenced ß-subunits identify from Na+ oxaloacetate physiological investigations Clostridium sphenoides m showed enzymatic activity amino it was and conserved regions were possible Propionigenium to constructed amplify, to the were in the clone modestum which acid sequence shows 65 % identity is with the translocatmg decarboxylases performed the frame of in from decarboxylases were decarboxylases parvula chain-reaction approach, fragment mmdB gene The deduced In order to Polymerase thesis With this 750 of the oxaloacetate from Veillonella a in in bactena other than Lactococcus laboratory course Enterobactena, lactis ssp lactis and None of these organisms the crude extract In the anaerobic metabohsm of these bactena, the decarboxylation of oxaloacetate is circumvented
