Der Rotationsmechanismus und die elastische

Der Rotationsmechanismus und die elastische
Kopplung der F-ATP-Synthase
Dissertation zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
von
Hendrik Sielaff
vorgelegt dem Fachbereich Biologie/Chemie der
Osnabrück, im August 2007
Hauptberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Junge
Berichterstatter: apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht
Datum der Prüfung: 25.09.2007
„Der Kampf gegen Gipfel vermag ein Menschenherz auszufüllen.
Wir müssen uns Sisyphos als einen glücklichen Menschen vorstellen.“
ALBERT CAMUS
Inhaltsverzeichnis
_________________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
5
Abbildungsverzeichnis
9
Tabellenverzeichnis
11
Abkürzungsverzeichnis
13
1 Einleitung
15
1.1 Struktur der F-ATP-Synthase
1.1.1 Architektur des F1-Teils
1.1.2 Architektur des FO-Teils
17
19
20
1.2 Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase
1.2.1 Funktionsmechanismus des F1-Teils
1.2.2 Funktionsmechanismus des FO-Teils
21
22
27
1.3 Elastische Kopplung der beiden Motoren
29
1.3 Zielsetzung
31
2 Materialien und Methoden
33
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Geräte
2.1.1.1 Genetische Arbeiten
2.1.1.2 Biochemische Arbeiten
2.1.1.3 Rotationsassay
2.1.2 Puffer, Lösungen und Medien
2.1.3 Stämme und Plasmide
2.1.3.1 DH5α
2.1.3.2 DK8
2.1.3.3 pBluescript II SK (+)
2.1.3.4 pSE1
2.1.3.5 pGH11, pGH14, pGH18, pGH33
2.1.3.6 pKH7
33
33
33
34
35
35
37
37
37
38
38
38
38
2.2 Methoden
2.2.1 Gentechnische Methoden
2.2.1.1 Herstellung kompetenter Zellen
2.2.1.2 Transformation mit Plasmid-DNS
2.2.1.3 Isolierung von DNS
2.2.1.4 Agarose-Gelelektrophorese
2.2.1.5 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNS
2.2.1.6 Präparative Restriktionsschnittansätze
2.2.1.7 Ligation von DNS-Fragmenten
2.2.1.8 Mutagenese mittels Polymerasekettenreaktion
39
39
39
40
40
40
41
41
41
41
5
Inhaltsverzeichnis
_________________________________________________________________________
2.2.1.9 Sequenzierung von DNS-Sequenzen
2.2.1.10 Komplementationstest
2.2.2 Biochemische Methoden
2.2.2.1 Zellanzucht von DK8-Zellen
2.2.2.2 Präparation von EFOF1-Komplexen
2.2.2.3 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
2.2.2.4 Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten
2.2.2.5 SDS-Polyacrylgelelektrophorese
2.2.2.6 Immunoblot
2.2.2.7 Präparation von farbstoffmarkiertem F-Actin
2.2.2.8 Erstellung eines Homologiemodells für EF1
2.2.3 Rotationsassay
2.2.3.1 Aufreinigung von Magnetpartikeln
2.2.3.2 Herstellung von Durchflussküvetten
2.2.3.3 Beladung von Durchflussküvetten
2.2.3.4 Fluoreszenzvideomikroskopie
2.2.3.5 Digitalisierung von Videosequenzen
2.2.3.6 Auswertung von Einzelbildsequenzen
2.3 Software
3 Ergebnisse
56
57
3.1 Kontrollexperimente
3.1.1 120°-Periodizität und Verweilzeiten
3.1.2 Verankerung des Enzymkomplex auf der Oberfläche
3.1.3 Behinderung des Actinfilaments durch Kontakt mit der Oberfläche
3.1.4 Reversibilität der ADP-Inhibierung
3.1.5 Reversibilität der Disulfidbrückenbildung
59
59
61
62
63
64
3.2 Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der
F-ATP-Synthase
3.2.1 Insertion von Cysteinen in F1
3.2.2 Korrelation der Rotorpositionen im ADP-inhibierten und oxidierten
Enzym
3.2.3 Bestimmung der ATP- und der katalytischen Wartepositionen
3.2.4 Korrelation aller vier Haltepositionen
3.2.5 Energieprofil des aktiven und gehemmten Enzyms
65
3.3 Elastizität des Rotors der F-ATP-Synthase
3.3.1 Insertion von Cysteinen in FO
3.3.2 Bestimmung der Elastizität der Untereinheiten c und γ
76
77
79
4 Diskussion
6
42
43
43
43
44
44
45
45
45
46
47
48
48
48
49
51
53
53
65
68
71
73
75
81
4.1 Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
81
4.2 Die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase
90
4.3 Ausblick
93
Inhaltsverzeichnis
_________________________________________________________________________
5 Zusammenfassung
95
5.1 Die Teilschritte des aktiven Enzyms geeicht auf das molekulare
Koordinatensystem
95
5.2 Die inneren Elastizitätsparameter des Enzyms
96
6 Literaturverzeichnis
7 Anhang
97
105
7.1 DNS- und Aminosäuresequenz von pSE1
105
7.2 Matlab - Routinen
7.2.1 Programm: Kreuzkorrelation
7.2.2 Programm: Motorkontrolle
7.2.3 Programm: Rotationsanalys
7.2.4 Funktion: expo_dwell_time
7.2.5 Funktion: gaussfit
7.2.6 Script: auswertpixel
7.2.7 Script: flaeche
7.2.8 Script: mittelpunktfestlegung
7.2.9 Script: shift
112
113
113
114
131
131
131
133
133
134
Danksagung
135
7
Abbildungsverzeichnis
_________________________________________________________________________
Abbildungsverzeichnis
Strukturformel von Adenosintriphosphat
Prinzip der chemiosmotischen Theorie nach P. Mitchell
Struktur der F-ATP-Synthase aus E. coli
Der ‘binding change’ Mechanismus der ATP-Synthese nach P. D. BOYER
Drei Experimente zum Nachweis der Rotation der γ-Untereinheit in F1
Mechanismen der ATP-Hydrolyse während eines +120°-Schritts von γ
Modell der Protonentranslokation durch die a- und c-Untereinheiten von
FO nach W. JUNGE
Abb. 1.8: Simulation des winkelabhängigen freien Enthalpieprofils eines C3symmetrischen, rotierenden Motors mit einer elastischen
Kraftübertragung für verschiedene Elastizitätsmoduln
15
16
18
22
24
26
Abb. 2.1:
Abb. 2.2:
Abb. 2.3:
Abb. 2.4:
Abb. 2.5:
Abb. 2.6:
Abb. 2.7:
Abb. 2.8:
Abb. 2.9:
38
47
49
50
52
52
53
55
55
Abb. 1.1:
Abb. 1.2:
Abb. 1.3:
Abb. 1.4:
Abb. 1.5:
Abb. 1.6:
Abb. 1.7:
pSE1
Sequenzvergleich der Untereinheiten α und γ von MF1 und EF1
Komplexierung von His-tags mit der Ni-NTA-HRP
Aufbau des Rotationsassays
Transmissionsspektrum des Filterkubus U-MWIG
Strukturformel von TMR
Strahlengang im inversen Fluoreszenzmikroskop
Gemittelte Bilder von Einzelbildsequenzen rotierender Actinfilamente
Auswertung von Einzelbildern
Abb. 3.1: Bildsequenz eines Actinfilamentes
Abb. 3.2: Auswertung eines sich irregulär und eines sich deutlich schrittweise
drehenden Actinfilaments
Abb. 3.3: Histogramme der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten
und Verweilzeiten von schrittweise rotierenden Actinfilamenten bei
verschiedenen ATP-Konzentrationen
Abb. 3.4: Histogramme der gemittelte Werte der sechs Einzelmessungen
Abb. 3.5: Histogramm schrittweise rotierender Actinfilamente unter dem Einfluss
von Scherkräften
Abb. 3.6: Gaußverteilungen blockierter Filamente
Abb. 3.7: Reversibilität der ADP-Inhibierung
Abb. 3.8: Reversibilität der Disulfidbrückenbildung durch Oxidation und Reduktion
Abb. 3.9: SDS-Gel und Immunoblot einer SE1-Präperation
Abb. 3.10: SDS-Gele der Mutanten GH11, GH14 und GH18
Abb. 3.11: Immunoblots der Mutanten GH11, GH14 und GH18
Abb. 3.12: Positionen der inhibierten Enzyme der Mutanten GH14 und GH18
Abb. 3.13: Katalytische und oxidierte Wartezustände der Mutanten GH14, GH18
und GH11 und deren Homologiemodelle
Abb. 3.14: Trajektorien und Histogramme von in 80°/40°-Unterschritten
rotierenden Actinfilamenten
28
30
57
58
60
61
62
63
63
64
66
67
67
69
70
72
9
Abbildungsverzeichnis
_________________________________________________________________________
Abb. 3.15: Histogramme der ATP- und der katalytischen Wartezustände bei 50 µM
bzw. 5 mM ATP
Abb. 3.16: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Energieprofile der vier Haltepositionen des Enzyms
Abb. 3.17: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Profile der freien Enthalpie des
reduzierten und oxidierten Enzyms für verschiedene Zeiträume
Abb. 3.18: SDS-Gel und Immunoblot der Mutante GH33
Abb. 3.19: Seitenansicht des Homologiemodells von EFOF1 mit inserierten
Cysteinen
Abb. 3.20: Histogramm der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeit der
Mutante GH33 im oxidierten Zustand
Abb. 3.21: Gaußverteilungen der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten der EFOF1-Mutanten SE1, GH11, GH14, GH18 und GH33 in
verschiedenen Zuständen
Abb. 4.1: Schritte und Pausen während der Rotation von EFOF1
Abb. 4.2: Der katalytische Schritt im Modell von A. E. SENIOR und J. WEBER und
im Modell von R. I. MENZ et al.
Abb. 4.3: Modell für den Mechanismus der ATP-Hydrolyse nach J. WEBER,
modifiziert
Abb. 4.4: Kombination zweier Stäbe mit unterschiedlich elastischen Eigenschaften
Abb. 4.5: Modell der Rotoruntereinheiten mit gemessenen und berechneten
Torsions-Federkonstanten
10
73
74
76
78
78
79
80
83
87
89
90
92
Tabellenverzeichnis
_________________________________________________________________________
Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1: Molmassen und Gene der Untereinheiten von EFOF1
17
Tab. 2.1: PCR-Programm
Tab. 2.2: Sequenzierungs-Programm
Tab. 2.3: Beladungsschema der Durchflussküvetten
42
43
51
Tab. 3.1:
Torsions-Federkonstanten der EFOF1-Mutanten SE1, GH11, GH14,
GH18 und GH33 in den verschiedenen Zuständen
79
11
Abkürzungsverzeichnis
_________________________________________________________________________
Abkürzungsverzeichnis
4-AB
6-AHS
Ax
ADP
ADPγS
AMPPNP
ATP
Biotin-PEAC5Maleimid
bp
BSA
C
CIAP
CMOS
ddNTP
∆G
∆G0’
DMSO
DNS
dNTP
DTNB
DTT
E
E. coli
EDTA
EFOF1
EGTA
E. hirae
EM
F
FO
F1
F-Actin
FRET
g
G-Actin
HRP
I. tartaricus
κ
K
kB
l
4-Aminobenzamidin Dihydrochlorid
6-Aminohexansäure
Absorption bei einer Wellenlänge von x nm
Adenosindiphosphat
Adenosin-5’-[γ-thio]triphosphat
β,γ-Imidoadenosin-5’-triphosphat
Adenosintriphosphat
6-{N´-[2-(N-Maleimido)ethyl]-N-piperazinylamido}hexyl-D-biotinamid
Basenpaar(e)
bovines Serumalbumin
Torsionssteifigkeit
alkaline Phosphatase aus Kälberdärmen
(calf intestine alkaline phophatase)
komplementärer Metall-Oxid-Halbleiter
(complementary metal oxide semiconductor)
Didesoxynukleotide
freie Enthalpie
biochemische Standardenthalpie
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxynukleotide
5,5’-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)
Dithiothreitol
elastische Energie
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
F-ATP-Synthase aus Escherichia coli
Ethylengycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure
Enterococcus hirae
Elastizitätsmodul
Faraday-Konstante
hydrophober, membranintegrierter Teilkomplex der F-ATP-Synthase
hydrophiler, katalytisch aktiver Teilkomplex der F-ATP-Synthase
filamentöses Actin
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
(fluorescence resonance energy transfer)
Erdbeschleunigung
globuläres Actin
Meerrettich-Peroxidase (horse radish peroxidase)
Ilyobacter tartaricus
Torsions-Federkonstante
Torsions-Kraft
Boltzmann-Konstante
Länge
13
Abkürzungsverzeichnis
_________________________________________________________________________
LB-Medium
µ0
M
MSC
MFOF1
MOPS
NMR
NTA
ODx
OG
ox
φ
PAGE
PARAP
pBSK
PCR
Pfu
Pi
pmf
PTMR
PVDF
r
R
red
RT
σ
SDS
t
T
TBE
TEMED
TES
TFOF1
TIRFM
TRIS
U
üN
upm
UV
(v/v)
(w/v)
14
Medium nach GIUSEPPE BERTANI (lysogeny broth)
Standardpotential
Drehmoment
Multiklonierungsstelle (multiple cloning site)
F-ATP-Synthase aus Mitochondrien
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
kernmagnetische Resonanzspektroskopie
(nuclear magnetic resonance spectroscopy)
Nitrilotriessigsäure
optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm
N-octyl-β-D-glycopyranosid
oxidiert
Auslenkungswinkel
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
polarisierte Absorptionsrelaxation nach Photobleichung
(polarized absorption relaxation after photo-bleaching)
pBluescript II SK (+) Vektor
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
Pyrococcus furiosus
anorganisches Orthophosphat
protonenmotorische Kraft (protonmotive force)
Phalloidin-Tetramethylrhodamin-B-isothiocyanat
Polyvinylidendiflouridmembran
Radius
universelle Gaskonstante
reduziert
Raumtemperatur
Standardabweichung
Natriumlaurylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
Relaxationszeit
Temperatur in Kelvin
TRIS-Borat-EDTA-Puffer
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
2-{[2-Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino}-ethansulfonsäure
F-ATP-Synthase aus dem termophilen Bacillus PS3
Fluoreszenzmikroskopie basierend auf der internen Totalreflektion
(total internal reflection fluorescence microscopy)
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
enzymatische Aktivität (units)
über Nacht
Umdrehungen pro Minute
Ultraviolett
Volumenanteil
Gewichtsanteil (bezogen auf das Volumen einer Lösung)
Einleitung
_________________________________________________________________________
1
Einleitung
Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle Energieträger in allen Lebensformen und
spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle (Kalckar, 1937; Lipmann,
1947). ATP ist ein Nukleotid und setzt sich aus der Base Adenin, dem Zucker Ribose und
drei Phosphatresten zusammen (Abb. 1.1). Die Triphosphateinheit enthält zwei Phosphorsäureanhydridbindungen, die ein hohes, für die Energiebereitstellung wichtiges Phosphorylgruppenübertragungspotential besitzen.
Abb. 1.1: Strukturformel von Adenosintriphosphat.
Bei der Hydrolyse wird ATP in Adenosindiphosphat (ADP) und ein anorganisches
Orthophosphat (Pi) gespalten.
ATP + H2O → ADP + Pi
Gl. 1.1
Die freie Enthalpie dieser Reaktion unter biochemischen Standardbedingungen (∆G0’)
beträgt -30,5 kJ/mol. Die Konzentrationen der an der Reaktion beteiligten Substanzen in
der Zelle entsprechen jedoch nicht den Standardbedingungen. In einer Bakterienzelle von
Escherichia coli (E. coli) liegen ATP, ADP und Pi in Konzentrationen von 3 mM, 0,4 mM
und 6 mM vor (Kashket, 1982).
∏
G = G 0ATPdADP + 2, 3 $ RT $ log
[ADP]$[P i ]
[ATP ]
Gl. 1.2
Damit hat die Hydrolyse von ATP unter zellulären Bedingungen eine freie Enthalpie
von etwa ∆G = -43 kJ/mol. Diese Energie wird von der Zelle für endergone Prozesse
genutzt, z.B. für den Anabolismus von Makromolekülen, den aktiven Transport von Ionen
und Molekülen, die Reizweiterleitung oder die Muskelkontraktion. Dabei setzen die Zellen
große Mengen an ATP um. So verbraucht der Mensch täglich etwa 75 kg an ATP. Da der
menschliche Körper aber nur etwa 35 g an ATP besitzt, muss ATP konsequenterweise
wieder aus seinen Hydrolyseprodukten regeneriert werden (Neumüller, 1979). Neben der
Substratkettenphosphorylierung in exergonen Stoffwechselwegen wird dies hauptsächlich
durch den Enzymkomplex der ATP-Synthase in der oxidativen Phophorylierung oder der
Photophosphorylierung verwirklicht. Die ATP-Synthase nutzt dabei die elektrochemische
Energie eines transmembranen Ionengradientens zur Synthese von ATP aus ADP und Pi.
15
Einleitung
_________________________________________________________________________
Die Funktionsweise dieses Mechanismus wurde erstmals 1961 von P. MITCHELL in seiner
chemiosmotische Hypothese beschrieben (Mitchell, 1961) (Abb. 1.2).
Abb. 1.2: Prinzip der chemiosmotischen
Theorie nach P. MITCHELL.
Die in einem transmembranen Protonengradienten
gespeicherte Energie wird von der FOF1-ATPSynthase zur Synthese von ATP aus ADP und Pi
genutzt. Der Protonengradient wird durch eine
Protonenpumpe aufrechterhalten.
Er postulierte eine Kompartiment umschließende Membran, die für Protonen und
andere Ionen impermeabel ist. Solche Membranen sind z.B. die Thylakoidmembran in
Chloroplasten, die innere Mitochondrienmembran oder die prokaryotische Plasmamembran. Durch das Wirken einer exergonen Elektronentransportkette, z.B. in der Photosynthese oder in der Atmungskette, werden Protonen über die Membran gepumpt. Die daraus
resultierenden, unterschiedlichen Protonenkonzentrationen beiderseits der Membran erzeugen einen elek-trischen (∆φ) und einen chemischen (∆pH) Gradienten über die Membran.
Diese elektrochemische Potentialdifferenz des Protons konserviert somit die Energie, die
durch den Elektronenfluss frei wird und wurde von P. MITCHELL protonenmotorische Kraft
(protonmotive force, pmf) genannt. Unter isothermen und isobaren Bedingungen beschreibt
die pmf die maximal nutzbare Arbeit, die aus dem Fluss von einem Mol Protonen über die
Membran gewonnen werden kann.
pmf = 0 − 2, 3RTpH + F&
Gl. 1.3
Hierbei ist R die universelle Gaskonstante, T die Temperatur, F die Faraday-Konstante
und ∆µ0 die Differenz der Standardpotentiale. Haben die wässrigen Phasen beiderseits der
Membran die selben Eigenschaften, heben sich die Standardpotentiale aus (∆µ0 = 0). Unter
isothermen und isobaren Bedingungen beschreibt die pmf die maximal nutzbare Arbeit, die
aus der Translokation von einem Mol Protonen über die Membran gewonnen werden kann.
Die protonenmotorische Kraft wird von der ATP-Synthase zur Synthese von ATP genutzt,
indem Protonen von der sauren und elektrisch positiv geladenen Seite der Membran (H+P)
zur alkalischen und negativ geladenen Seite (H+N) durch den Enzymkomplex strömen und
als Antrieb für die nachfolgende Reaktion der ATP-Synthese dienen. Zusätzlich zu diesen
vektoriellen Protonen wird bei der Reaktion noch ein skalares Proton (H+#) freigesetzt. Das
Verhältnis von synthetisiertem ATP-Molekülen zu über die Membran geförderten Protonen (m) ist für verschiedene ATP-Synthasen unterschiedlich. Für die Synthese von ATP
ergibt sich die folgende Reaktionsgleichung:
ADP3-N + Pi2-N + H+#N + mH+P → ATP4-N + H2ON + mH+N
16
Gl. 1.4
Einleitung
_________________________________________________________________________
Im Gleichgewicht entspricht die freie Reaktionsenthalpie der elektrochemischen
Potentialdifferenz.
∏
[ATP]$[H+#]
G0ADPdATP + 2, 3RTlog [ADP]$[P ] = m $ (−2, 3RTpH + F&)
i
Gl. 1.5
In Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen kann die ATP-Synthase auch in
umgekehrter Richtung arbeiten, dabei wird die Hydrolyseenergie des ATPs genutzt, um
einen Ionengradienten aufzubauen. Im diesem Modus wird der ATP-hydrolysierende Teil
des Enzyms auch als ATPase bezeichnet.
Man unterscheidet drei Hauptklassen von ionengetriebenen ATPasen (Pedersen und
Carafoli, 1987). (i) P-Typ-ATPasen, wie z.B. die Na/K-ATPase, bilden in ihrem katalytischen Zyklus ein kovalent phosphoryliertes Intermediat. (ii) V-Typ-ATPasen sind
H+-transportierende ATPasen, die in Membranen von Vakuolen vorkommen und kein
phosphoryliertes Intermediat bilden. (iii) F-Typ-ATPasen sind H+-getriebene ATP-Synthasen aus Plastiden, Mitochondrien und Bakterien.
In dieser Arbeit habe ich mich mit der F-ATP-Synthase aus E. coli (EFOF1) beschäftigt.
Sie zählt zu den am besten untersuchten F-ATP-Synthasen. Aufgrund der genetischen und
funktionellen Homologie der F-ATP-Synthasen aus unterschiedlichen Organismen (s.u.)
und der Tatsache, dass sich Chimären mit Bestandteilen aus verschiedenen Spezies
konstruieren lassen (Richter et al., 1986; Lill et al., 1993; Kaim und Dimroth, 1995;
Claggett et al., 2007), ist der Schluss gerechtfertigt, dass sich aus allen vorliegenden Daten
ein universelles Modell der F-ATP-Synthase konstruieren lässt.
1.1
Struktur der F-ATP-Synthase
Die F-ATP-Synthase aus E. coli besteht aus acht verschiedenen Untereinheiten in der
Zusammensetzung α3β3γδεab2c10. Strukturell unterteilt man die F-ATP-Synthase in einen
FO- und einen F1-Teil. Der membranintegrierte, hydrophobe und Protonen leitende FO-Teil
(Oligomycin sensitiver Faktor) besteht aus den Untereinheiten ab2c10, während die Untereinheiten α3β3γδε den hydrophilen, ATP synthetisierenden bzw. hydrolysierenden F1-Teil
(Faktor 1) bilden. Mechanisch kann man die F-ATP-Synthase auch als ein Motorprotein
betrachten, in dem die Untereinheiten ab2α3β3δ den Stator und die Untereinheiten γεc10 den
Rotor bilden.
In E. coli wird die F-ATP-Synthase chromosomal durch das ca. 7 kb große atp-Operon
codiert (Walker et al., 1984). Es enthält neun Gene, acht für die verschiedenen Untereinheiten und ein neuntes (atpI) mit bisher unbekannter Funktion. Das Molmasse des Enzymkomplexes beträgt 530,3 kDa. Die Molmassen der einzelnen Untereinheiten und deren
Gene sind in Tab. 1.1 angegeben.
Tab. 1.1: Molmassen und Gene der Untereinheiten von EFOF1.
F1
FO
Untereinheit
a
b
c
α
β
γ
δ
ε
Molmassen / kDa
55,3
50,3
31,6
19,3
14,9
30,3
17,2
8,3
atpA atpD atpG atpH atpC atpB atpF atpE
Gen
17
Einleitung
_________________________________________________________________________
Die Struktur der F-ATP-Synthase wurde im wesentlichen durch die Röntgenstrukturanalyse an Kristallen des mitochondrialen Enzymkomplexes (MFOF1) bestimmt. Der
mitochondriale Enzymkomplex ist zu dem von E. coli homolog. Die Homologie zwischen
den beiden Komplexen reicht von 21% für die c-Untereinheit bis zu 70% für die β-Untereinheit (Walker et al., 1984). Ein Modell von EFOF1 ist in Abb. 1.3 gezeigt.
Abb. 1.3: Struktur der F-ATP-Synthase aus E. coli (Weber und Senior, 2003).
Hochauflösende Strukturen liegen für alle Untereinheiten vor, außer für Teile von δ und b
und für die a-Untereinheit, von der ein Modell gezeigt ist. Die Anzahl der c-Untereinheiten
variiert in verschiedenen Species zwischen 10-14, in E. coli findet man eine Stöchiometrie
von 10 c-Untereinheiten.
Unterschiede zwischen MFOF1 und EFOF1 gibt es in der Benennung der Untereinheiten.
Die mitochondriale Untereinheit OSCP entspricht der bakteriellen δ-Untereinheit, während
die δ-Untereinheit aus Mitochondrien der ε-Untereinheit des E. coli Enzyms entspricht
(Walker et al., 1984). Die beiden letzteren sind zu 60% homolog (Gibbons et al., 2000).
Mitochondriales ε hat keine Entsprechung in EF1. Des Weiteren besteht der MFO-Teil
zusätzlich aus den Untereinheiten d, e, f, g, F6 und A6L (Collinson et al., 1994a; Collinson et al., 1994b; Collinson et al., 1996). Alle weiteren bakteriellen Untereinheiten haben
in Mitochondrien die selbe Bezeichnung.
18
Struktur der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
1.1.1
Architektur des F1-Teils
Der Aufbau von F1 wurde zum ersten Mal in der Arbeitsgruppe von J. E. WALKER anhand
der Beugung von Röntgenstrahlen durch einen Kristall bestehend aus mitochondrialem F1
aus Rinderherzen mit einer Auflösung von 0,28 nm beschrieben (Abrahams et al., 1994).
Diese Struktur, die im Folgenden als originale Kristallstruktur bezeichnet wird, wurde
später durch weitere Röntgenstrukturanalysen am gleichen Enzymkomplex bestätigt
(Abrahams et al., 1994; Abrahams et al., 1996; van Raaij et al., 1996; Orriss et al., 1998;
Braig et al., 2000; Gibbons et al., 2000; Menz et al., 2001b; Kagawa et al., 2004;
Kabaleeswaran et al., 2006; Bowler et al., 2007). Der F1-Teil mit einer Höhe von 8 nm und
einem Durchmesser von 10 nm setzt sich demnach hauptsächlich aus den jeweils drei alternierend angeordneten α- und β-Untereinheiten, die zu 20% homolog sind. Eine α- und
eine β-Untereinheit bilden zusammen ein Paar. Drei solcher αβ-Paare ((αβ)3) bilden
zusammen einen hexagonalen Ring um die zentrale γ-Untereinheit. Jedes Paar besitzt ein
katalytisch aktives Zentrum mit einer Nukleotidbindungstasche, wobei β den Hauptteil
hierzu beiträgt. Deshalb wird β als die katalytische Untereinheit bezeichnet. Die α-Untereinheiten besitzen zwar auch Nukleotidbindungstasche, die allerdings katalytisch inaktiv
sind. Die α- und β-Untereinheiten bestehen am Membran abgewandten, N-terminalen
Ende aus einer fassartigen Struktur aus sechs β-Faltblättern (β-barrel) und am Membran
zugewandten, C-terminalen Ende aus sieben bzw. sechs α-Helices. Die zentrale, Nukleotid
bindende Domäne besteht aus neun β-Faltblättern und neun assoziierten α-Helices. In
dieser Domäne liegt auch die wichtige P-Schleife, die in β unter anderem von den Aminosäureresten β159-164 gebildet wird. Sie enthält das konservierte Nucleotidbindungsmotiv
GXXXXGKT/S, das man in vielen Nukleotid bindenden Enzymen findet und mit der
Phosphorylgruppe des ATPs in Wechselwirkung tritt. Die Aminosäuren βE188 und αR373
spielen eine wichtige Rolle bei dem nukleophilen Angriff auf das γ-Phosphat und somit bei
der Spaltung von ATP. In der α-Untereinheit ist das Glutamat durch ein Glutamin an der
Position 208 ersetzt, welches wesentlich die Inaktivität der α-Untereinheiten verursacht.
Ein weiterer wichtiger Bestandteil der β-Untereinheit ist die DELSEED-Sequenz (β394400) in einer Schleife zwischen der ersten und zweiten C-terminalen α-Helices. Dieser
Abschnitt interagiert mit der konvexen, superspiralisierten α-Helix der γ-Untereinheit,
dessen räumliche Stellung relativ zu (αβ)3 wesentlich den Öffnungszustand der drei
Bindungstaschen bestimmt. Im mechanischen Sinne ist die DELSEED-Sequenz ein Hebel,
der von der konvexen γ-Untereinheit aufgestoßen wird.
Der Innenraum des (αβ)3-Komplexes wird durch die γ-Untereinheit ausgefüllt. Das
C-terminale Ende von γ (γ209-272) besteht aus einer α-Helix, die von der Membranseite
bis zu 6,5 nm in das (αβ)3-Hexagon hineinragt. Die untere Hälfte dieser α-Helix bildet
zusammen mit der N-terminalen α-Helix eine antiparallele, superspiralisierte (coiled coil)
Struktur. Sie ist asymmetrisch konvex gebogen und zeigt in der originalen Kristallstruktur
auf die leere und offene Nukleotidbindungstasche. Die Sequenz zwischen den beiden
terminalen α-Helices wird von einem fünfsträngigem β-Faltblatt und sechs α-Helices
dominiert (Gibbons et al., 2000). Sie bildet den Fuß der γ-Untereinheit unterhalb des
(αβ)3-Hexagons.
Die Struktur der δ-Untereinheit aus MF1 wurde mittels Röntgenkristallographie
(Gibbons et al., 2000) und die Struktur der homologen ε-Untereinheit aus EF1 wurde
mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spektroscopy, NMR) (Wilkens et al., 1995) aufgeklärt. Die N-terminale Domäne besteht aus einem
19
Einleitung
_________________________________________________________________________
zehnsträngigem β-Faltblatt, dass eine β-sandwich-Struktur bildet. Die C-terminale
Domäne besteht aus zwei α-Helices. Sie liegen an der Außenseite von γ und interagieren
mit der DELSEED-Sequenz der β-Untereinheit (Zhang und Fillingame, 1995). Die N-terminale Domäne der ε-Untereinheit in EF1 (in MF1 die Untereinheiten δ und ε) bildet
zusammen mit dem Fuß der γ-Untereinheit den 4,7 nm hohen, zentralen Verbindungsstiel,
der den F1-Teil des Enzymkomplexes mit den c-Untereinheiten des FO-Teils verbindet
(Gibbons et al., 2000; Rodgers und Wilce, 2000). Experimente mit F1 aus Chloroplasten
(CF1) haben gezeigt, dass die ε-Untereinheit das Enzym inhibieren kann, und γ dann die
selbe Orientierung wie bei der Inhibierung durch ADP einnimmt (Konno et al., 2006).
Der Aufbau der δ-Untereinheit aus E. coli wurde von S. WILKENS et al. ebenfalls durch
NMR-Spektroskopie aufgeklärt (Wilkens et al., 1997). Das Protein besteht aus zwei
Domänen. Die etwa 100 N-terminalen Aminosäuren bilden sechs α-Helices. Die C-terminale Domäne, bestehend aus den letzten 70 Aminosäureresten, ist durch sieben α-Helices
charakterisiert. Beide Domänen sind durch eine Schleife voneinander getrennt. Die
Autoren und auch H. LILL et al. (Lill et al., 1996) konnten zeigen, dass die N-terminale
Domäne am oberen Ende der F-ATP-Synthase sitzt und mit dem N-terminalen Ende der
α-Untereinheit interagiert, während die C-terminale Domäne mit den b-Untereinheiten des
FO-Teils wechselwirkt.
1.1.2
Architektur des FO-Teils
Wichtigster Bestandteil von FO sind die Protonen leitenden und membrandurchspannenden
c-Untereinheiten. Mittels NMR wurde die Struktur eines c-Monomers aus E. coli bestimmt
(Girvin et al., 1998). Das Monomer besteht aus zwei hydrophoben, membrandurchspannenden α-Helices, die eine Haarnadelstruktur innerhalb einer ringförmigen Struktur bilden.
In dieser liegt die N-terminale Helix jedes Monomers auf der Innenseite und die C-terminale Helix auf der Außenseite des Rings. Eine polare Schleife, die in Richtung des F1-Teils
zeigt, verbindet die beiden Helices. Sie interagieren mit den Untereinheiten γ und ε in F1
(Watts et al., 1995; Hermolin et al., 1999). Die C-terminale Helix besitzt aufgrund des
Aminosäurerests P64 einen Knick von etwa 30°. Mehrere c-Monomere bilden ein ringförmiges Oligomer (Proteolipid) mit einem äußeren Durchmesser von ca. 4,2 nm bis 5,5 nm
und einen inneren Durchmesser von ca. 1,7 nm bis 2,7 nm in Mitochondrien (Stock et al.,
1999). Die Höhe des Proteolipids beträgt 0,73 nm. Die Anzahl der c-Monomere im Proteolipid variiert je nach Organismus. In Mitochondrien (Stock et al., 1999) und in dem
thermophilen Bacillus PS3 (TFOF1) (Mitome et al., 2004) besteht der c-Ring aus 10 Untereinheiten, während er in Ilyobacter tartaricus aus 11 (Stahlberg et al., 2001) und in Chloroplasten aus 14 Untereinheiten (Seelert et al., 2000; Seelert et al., 2003) besteht. In E. coli
beträgt die bevorzugte Stöchiometrie 10 Untereinheiten (Jiang et al., 2001). Essentiell für
die Protonenleitung ist das Aspartat an der Position 61 in der C-terminalen α-Helix (Zhang
und Fillingame, 1994). Durch die Punktmutation cD61G verliert FOF1 seine Protonenleitfähigkeit. Sie kann aber durch horizontale Verschiebung wiederhergestellt werden, indem
man das Alanin an der Position 24 in der N-terminaler Helix durch ein Aspartat ersetzt
(Miller et al., 1990).
Ebenso wie das Proteolipid liegt auch die hydrophobe a-Untereinheit in der Membran.
Nach dem Modell von S. B. VIK et al. (Long et al., 1998; Wada et al., 1999) und
F. I. VALIYAVEETIL und R. H. FILLINGAME (Valiyaveetil und Fillingame, 1998) besteht a aus
fünf transmembranen α-Helices, die durch extramembrane Schleifen verbunden sind. Das
20
Struktur der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
C-terminale Ende befindet sich auf der dem F1-Teil zugewandten Seite der Membran. Im
Zusammenhang mit dem Aminosäurerest cD61 spielt auch aR210 in der vierten transmembranen Helix eine kritische Rolle für die Protonenleitung (Valiyaveetil und Fillingame,
1997) (s.u.). Durch eine vertikale Verschiebung dieses Restes verliert das Protein seine
Protonenleitfähigkeit (Langemeyer und Engelbrecht, 2007).
Die beiden b-Untereinheiten bilden ein Dimer (McLachlin und Dunn, 1997; Fillingame
et al., 1998). Die 33 N-terminalen, hydrophoben Aminosäurereste durchspannen die
Membran, ihre Struktur konnte durch NMR aufgeklärt werden (Dmitriev et al., 1999). Das
α-helicale, C-terminale Ende von b ist dagegen sehr hydrophil und umspannt von der
Membran aus den gesamten F1-Teil bis zur δ-Untereinheit (Rodgers und Capaldi, 1998).
Verschiedene Experimente legen nahe, dass die hydrophilen α-Helices der beiden b-Untereinheiten zusammen eine parallele, coiled coil Struktur ausbilden (Revington et al., 2002;
Steigmiller et al., 2005).
Die Untereinheiten a und b liegen an der Außenseite des c-Rings (Birkenhäger et al.,
1995; Singh et al., 1996) und bilden zusammen mit der δ-Untereinheit den zweiten,
peripheren Verbindungsstiel, der den c-Ring in FO mit dem (αβ)3-Hexagon in F1
verbindet.
1.2
Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase
Die F-ATP-Synthase ist ein Motorenzym, das elektrochemische in mechanische und
anschließend in chemische Energie umwandelt. Sie ist einer der kleinsten in der Natur
vorkommenden Nanomotoren. Wie oben beschrieben, nutzt sie die protonenmotorische
Kraft zur Synthese von ATP. In Bakterien, wie z.B. dem gram-negativen E. coli, ist die
F-ATP-Synthase in der Cytoplasmamembran lokalisiert, wobei der F1-Teil in das
Cytoplasma ragt. Die Membran enthält eine Reihe von Membranproteinkomplexen, die
Redox-Reaktionen katalysieren. NADH, das in katabolen Stoffwechselwegen, wie z.B. der
Glykolyse, entsteht, dient als Elektronendonor und wird zu NAD+ oxidiert. Die Elektronen
werden mittels Reduktion/Oxidation von einem Proteinkomplex zum Nächsten entsprechend ihrer Reduktionspotentiale weitergereicht und schließlich auf molekularen Sauerstoff übertragen. Dabei werden Protonen über die Cytoplasmamembran aus dem
Cytoplasma heraus transportiert. Da die Membran für Protonen impermeabel ist, sinkt
außen der pH-Wert. Die daraus resultierende elektrochemische Potentialdifferenz wird von
der F-ATP-Synthase genutzt. Die Protonen fließen über den FO-Teil zurück in das
Cytoplasma und treiben dadurch die ATP-Synthese im F1-Teil an. In E. coli, dessen Proteolipid aus zehn c-Untereinheiten besteht, werden 3 ATP pro 10 H+ synthetisiert. Da der FOund der F1-Teil elastisch gekoppelt sind (Kap. 1.3), ist ein ganzzahliges ATP zu
H+-Verhältnis nicht zwingend erforderlich.
Im Prinzip lässt sich die Reaktion auch umkehren, d.h. die F-ATP-Synthase kann ATP
hydrolysieren, um Protonen zu pumpen. Es hängt von der Gewichtung der beiden Triebkräfte und damit von den jeweiligen Umweltbedingungen ab, welche Reaktionsrichtung in
der Zelle verwirklicht wird. Unter aeroben Wachstumsbedingungen betreibt das Enzym die
Synthese von ATP. Unter anaerober Fermentation dient die F-ATP-Synthase dagegen als
Protonenpumpe. Der Protonenrückfluss in die Zelle wird an Transportprozesse gekoppelt
oder zum Betrieb des Flagellenmotors benutzt. ATP wird in diesem Zustand nur über
Substratkettenphosphorylierung produziert.
21
Einleitung
_________________________________________________________________________
Als Substrat für die F-ATP-Synthase dienen entweder MgATP2- oder MgADP- und Pi
(Senior et al., 1992); im Folgendem der Einfachheit halber nur als ATP oder ADP
geschrieben. Ohne Magnesium ist das Enzym inaktiv. Mg2+ neutralisiert einen Teil der
negativen Ladungen der Polyphosphatkette. Dadurch stabilisiert es das ATP und verringert
die ionischen Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und dem Nukleotid. Außerdem
halten die Wechselwirkungen, die zwischen dem Magnesiumion und dem Sauerstoffatomen der Phosphorylgruppe bestehen, das Nukleotid in einer definierten Konformation fest,
die das Enzym binden kann. Des Weiteren liefert das Magnesiumion zusätzliche Kontaktstellen für das Enzym, so dass sich die Bindungsenergie erhöht.
1.2.1
Funktionsmechanismus des F1-Teils
Einen Mechanismus für die Synthese von ATP entwickelte P. D. BOYER (Boyer, 1993)
(Abb. 1.4). Grundlage seines ‘binding change’-Mechanismus sind zwei Merkmale. (i) Die
Energie für die ATP-Synthese wird für die Freisetzung von fest gebundenem ATP und die
Bindung von ADP und Pi in einer Art, die die Bildung von ATP ermöglich, benötigt.
Dagegen erfolgt die Bildung von ATP aus ADP und Pi in der Bindungstasche spontan. (ii)
Während der Bildung von ATP arbeiten alle drei katalytische Zentren der F-ATP-Synthase
positiv kooperativ zusammen. Alle drei katalytischen Untereinheiten durchlaufen phasenverschoben den selben Zyklus, während dessen ATP synthetisiert wird. Die verschiedenen
Zustände der katalytischen Zentren sind dadurch charakterisiert, dass sie ATP fest (tight,
T) oder lose (loose, L) binden, oder offen (open, O) sind. Die Zustände werden im ATP
synthetisierenden Enzym in der Reihenfolge O→L→T→O durchlaufen, moduliert durch
eine rotierende Bewegung der zentralen, asymmetrischen Untereinheiten γ.
Abb. 1.4: Der ‘binding change’ Mechanismus der ATP-Synthese nach P. D. BOYER
(Cross, 1981).
Im Ausgangszustand hat die T-Bindungstasche ATP gebunden, während die beiden anderen
Bindungstaschen leer sind. ADP und Pi binden an die L-Bindungstaschen. Unter Energiezufuhr öffnet sich die T-Bindungstasche (T→O), die daraufhin ATP freisetzt. Gleichzeitig
schließen sich die O- und die L-Bindungstasche weiter (O→L, L→T). Im nächsten Schritt
wird in der letzteren ATP synthetisiert. Jetzt ist wieder der um 120° gedreht Ausgangszustand erreicht und der Zyklus beginnt von neuem .
Die originale Kristallstruktur bestätigte den zweiten Punkt von P. D. BOYERs Mechanismus. Sie zeigte die drei katalytischen Zentren in β entweder leer (empty), mit AMPPNP,
einem nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogon, oder mit ADP besetzt. Dementsprechend
wurden die α/β-Untereinheiten mit αE/βE, αTP/βTP bzw. αDP/βDP bezeichnet und den Zuständen O, L bzw. T zugeordnet. Die zentrale γ-Untereinheit zeigte mit ihrer konvexen Seite
auf βE. Somit werden die drei im Prinzip symmetrischen αβ-Paare durch die unterschiedliche Belegung mit Nukleotiden und die Orientierung von γ jeweils in andere Stellungen
gezwungen, die bestimmte Zustände im Reaktionszyklus des Enzyms repräsentieren. Das
aktive Enzym liegt daher immer in einer asymmetrischen Struktur vor.
22
Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
Die Rotationsbewegung der zentralen γ-Untereinheit gegenüber (αβ)3 wurde schließlich
von drei Arbeitsgruppen durch verschiedene Experimente belegt (Abb. 1.5). (i) Die
Gruppe von L. A. CROSS benutzte eine Mutante, in der eine Disulfidbrücke zwischen je
einem Cystein in γ und β geschlossen werden konnte. Sie konnten zeigen, dass das aktive,
ATP hydrolysierende Enzym Disulfidbrücken zwischen dem Cystein in γ und den Cysteinen in allen drei β-Untereinheiten gleichermaßen ausbildet, während im inaktiven Zustand
γ nur mit einer β-Untereinheit eine Disulfidbrücke bildet (Duncan et al., 1995). In einem
weiteren Versuch zeigten sie dies auch für FOF1 (Zhou et al., 1996). Mit dem Experiment
konnte jedoch nicht zwischen einer gerichteten oder zufälligen Bewegung unterschieden
werden. (ii) In dem Labor von W. JUNGE wurde die Rotation von γ relativ zum immobilisierten (αβ)3-Komplex anhand des an γ kovalent gebundenen Fluoreszenzfarbstoffs Eosin
in Echtzeit mit Hilfe der Technik PARAP (polarized absorption relaxation after photobleaching) gemessen (Sabbert et al., 1996; Sabbert und Junge 1997; Sabbert et al., 1997).
Ein Hinweis für die Rotation war die Relaxation der Absorptionsanisotropy unter
ATP-Hydrolyse-Bedingungen. Diese Relaxation konnte wie erwartet im AMPPNP-gehemmten Enzym nicht gemessen werden. Die rotationsbedingte Relaxationszeit von etwa
100 ms stimmte mit der katalytischen Umsatzrate unter diesen Bedingungen von ca. 70 ms
gut überein. Es wurde eine Rotation über einen Winkel von mindestens 280° gemessen.
Insgesamt deuteten die Ergebnisse auf eine unidirektionale, aus drei Schritten bestehende
Bewegung hin. (iii) Einen direkten optischen Nachweis der Rotationsbewegung erbrachten M. YOSHIDA, K. KINOSITA Jr. und ihre Kollegen durch Experimente an Einzelmolekülen
(Noji et al., 1997). Für ihre Versuche benutzten sie die ATPase aus dem thermophilen
Bacillus PS3 (TF1). Ein fluoreszierendes und biotinyliertes Actinfilament wurde über eine
Streptavidin/Biotin- Bindung an ein Cystein in der frei beweglichen γ-Untereinheit gekoppelt, während das (αβ)3-Hexagon über einen His-tag in β auf einem mit Ni2+-Nitrilotriessigsäure-Meerrettich-Peroxidase (Ni-NTA-HRP) beschichteten Objektträger immobilisiert
wurde. Jede Bewegung von γ konnte durch die Bewegung des Actinfilaments im Fluoreszenzmikroskop detektiert und videographisch erfasst werden. Unter Zugabe von ATP
rotierte γ, von der Membranseite des Enzyms aus betrachtet, gegen den Uhrzeigersinn.
Dieser Rotationsassay entwickelte sich zu einem wichtigen Instrument der ATPase-Forschung. Das Actinfilament kann statt an γ auch über einen Strep-tag an den c-Ring gekoppelt werden und die Actinfilamente können durch Gold- (Yasuda et al., 2001; Ueno et al.,
2005) oder Magnetpartikel (Itoh et al., 2004; Rondelez et al., 2005) ersetzt werden. Der
Assay wurde auch an der F-ATP-Synthase aus E. coli in Kombination mit Actinfilamenten
(Sambongi et al., 1999; Pänke et al., 2000; Sielaff, 2002; Müller, 2004; Winkler, 2006)
und Magnetpartikeln (Rennekamp, 2006; Xie, 2006; Hilbers, 2007) angewandt. Mit dem
Rotationsassay konnte gezeigt werden, dass sowohl in TF1 (Yasuda et al., 1998) als auch
in TFOF1 (Ueno et al., 2005) die Untereinheit γ während einer vollen 360°-Umdrehung drei
120°-Schritte macht, entsprechend jeweils der Hydrolyse von einem Molekül ATP in einer
der drei katalytischen Zentren. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, dass jeder
120°-Schritt in einen 80°- und einen darauf folgenden 40°-Unterschritt unterteilt werden
kann. Die Halteposition vor dem 80°-Unterschritt wurde dem Wartezustand des Enzyms
auf die Bindung des nächsten ATPs an eine geöffnete und leere Bindungstasche zugeordnet. Demnach ist die Geschwindigkeit dieses Schritts ausschließlich von der Substratkonzentration, bzw. von der Diffusion von ATP in die Bindungstasche abhängig. Im
nachfolgenden katalytischen Wartezustand und mindestens 1 ms vor dem 40°-Unterschritt
erfolgt die Hydrolyse von ATP. Der nachfolgende 40°-Unterschritt ist mit der Freisetzung
23
Einleitung
_________________________________________________________________________
von Pi und/oder der Freisetzung von ADP assoziiert. Diese beiden Reaktionsschritte waren
zunächst ununterscheidbar (Yasuda et al., 2001; Shimabukuro et al., 2003; Nishizaka
et al., 2004).
Abb. 1.5: Drei Experimente zum Nachweis der Rotation der γ-Untereinheit in F1
(Junge et al., 1997).
A) Die Zeichnung zeigt die Spaltung und Neuformation einer Disulfidbrücke zwischen zwei
künstlich eingebrachten Cysteinen in β und γ. Unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen bildeten
sich neue Disulfidbrücken, ein Hinweis auf die Rotationsbewegung. B) Immobilisiertes F1 ist
an γ mit einer Eosin-Sonde markiert. Mittels PARAP wurde die Relaxation der Absorptionsanisotropie von Eosin beobachtet. Unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen konnte eine Rotation
von mindestens 280° nachgewiesen werden. C) F1 wurde auf einem Objektträger immobilisiert und die γ-Untereinheit mit einem fluoreszierendem Actinfilament versehen. Unter
Zugabe von ATP konnte die unidirektionale Rotation des Filaments im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden.
Auf den Grundlagen dieser Experimente wurden mehrere Modelle für die Funktionsweise der ATPase entwickelt. Diese beschreiben vorrangig die ATP-Hydrolyse, sie lassen
sich im Prinzip aber auch in Syntheserichtung lesen. Die Modelle haben gemeinsam, dass
die ATP-Hydrolyse im Prinzip in vier Schritten abläuft. Diese Schritte sind die (i) Bindung
von ATP an eine leere Bindungsstelle, (ii) hydrolytische Spaltung von ATP in ADP und Pi,
(iii) Freisetzung von Pi und (iv) Freisetzung von ADP, wobei die Abfolge der letzten
beiden Schritte auch vertauscht sein kann. Die Modelle unterscheiden sich in der Menge
der Nukleotidbindungstaschen, die entweder ATP oder ADP gebunden haben, und in der
Anzahl der aktiven katalytischen Zentren. L. A. CROSS veröffentlichte einen so genannten
bi-site Mechanismus, in dem, je nach Reaktionsschritt, entweder nur eine oder maximal
zwei Nukleotidbindungstaschen mit Nukleotiden besetzt sind (Cross, 1981). Auf diesen
Mechanismus berufen sich auch J. P. ABRAHAMS et al., um ihre Kristallstruktur des Enzyms
zu erklären (Abrahams, et al., 1994). In einem anderen Modell von R. I. MENZ et al. (Menz
et al., 2001) (Abb. 1.6A), das den Boyer’schen Mechanismus weiterentwickelt, sind
dagegen im zeitlichen Mittel alle drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden besetzt
(tri-site Mechanismus). Nur nach der Freisetzung von ADP, während das Enzym auf das
nächste ATP Molekül wartet, ist eine Nukleotidbindungstasche unbesetzt. Die originale
Kristallstruktur mit zwei besetzten und einer leeren Bindungstasche konnte also nicht
zwischen diesen beiden Mechanismen unterscheiden, da diese Konformation in beiden
Modellen vorkommt.
24
Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
Für den tri-site Mechanismus sprechen im wesentlichen drei Befunde. (i) A. E. SENIOR
und J. WEBER haben Mutanten von EF1 erzeugt, die Tryptophane in den katalytischen
Zentren besaßen. Anhand der Fluoreszenz der Tryptophane konnten sie unterscheiden, ob
ein katalytisches Zentrum unbesetzt, mit ADP oder mit ATP besetzt war. Die Ergebnisse
zeigten, dass im ATP-hydrolysierenden Enzym nach der Zugabe von millimolaren
Konzentrationen an ATP im Mittel alle drei Zentren mit Nukleotiden besetzt waren. Die
Belegung mit ADP oder ATP entsprach einem Verhältnis von 2:1 (Weber et al., 1996). (ii)
In der Kristallstruktur von R. I. MENZ et al. (Menz, et al., 2001) sind alle Nukleotidbindungstaschen besetzt. Die βTP- und die βDP-Bindungstasche sind mit ADP-Fluoroaluminat
(ADP.AlF4-) besetzt, einem ATP-Analogon, dass einen Übergangszustand repräsentiert.
Die βE-Bindungstasche ist halb geöffnet und mit ADP und einem Sulfat besetzt. Die
Autoren interpretieren diese Struktur als einen Zustand im Reaktionszyklus, in dem alle
drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden besetzt sind. Die originale Kristallstruktur
entspricht in ihrem Modell dem ATP-Wartezustand. (iii) Die Arbeitsgruppe von
M. YOSHIDA und K. KINOSITA Jr. verfolgte die Bewegung der γ-Untereinheit von TF1 mittels
eines gekoppelten Mikropartikels per Hellfeldmikroskopie. Simultan konnte die Bindung
eines fluoreszenzmarkierten ATPs (Cy3-ATP) an das Enzym mittels TIRFM (total internal reflection fluorescence microscopy) beobachten werden. Als Anregungslichtquelle für
den Fluoreszenzfarbstoff wurde ein rotierender und polarisierter Laserstrahl benutzt. Damit
konnte unterscheiden werden, an welcher der drei Bindungstaschen das Cy3-ATP gebunden hatte. Die Messungen an Einzelmolekülen ergaben, dass das Cy3-ATP mindestens
während einer 240°-Drehung von γ an das Enzym gebunden bleibt (Nishizaka et al., 2004).
Dagegen würde man in einem bi-site Mechanismus erwarten, dass das Nukleotid schon
vorher freigesetzt wird.
A. E. SENIOR und J. WEBER haben einen erweiterten, katalytischen tri-site Mechanismus
entworfen (Weber et al., 1996; Senior et al., 2002; Weber, und Senior, 2003) (Abb. 1.6B).
Er unterscheidet sich von dem Mechanismus von R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001)
dadurch, dass während des katalytischen Schritts nicht nur alle drei katalytischen Zentren
mit Nukleotiden besetzt, sondern diese auch alle aktiv sind. In dem Modell nach
R. I. MENZ et al. sind dagegen immer nur zwei Zentren aktiv. Obwohl es sich also strukturell um eine tri-site Mechanismus handelt, da alle drei Zentren besetzt sind, handelt es sich
funktionell betrachtet nur um einen bi-site Mechanismus. Des Weiteren sind im Mittel
zwei ATP und ein ADP gebunden, im Gegensatz zu den Befunden und dem Modell von
A. E. SENIOR und J. WEBER, in dem die Bindungstaschen im Mittel mit zwei ADP und
einem ATP besetzt sind. Ein weiterer Unterschied betrifft die Freisetzung der Produkt.
Während in dem MENZ-Modell ADP und Pi aus der selben Bindungstasche entlassen
werden, geschieht dies in dem SENIOR/WEBER-Model aus unterschiedlichen Bindungstaschen. Daraus resultieren in den beiden Modellen auch die entgegengesetzten Richtungen,
in denen die katalytischen Zentren jeweils den geöffneten (O) Zustand (und auch die
anderen Zustände) annehmen (Abb. 1.6). A. E. SENIOR und J. WEBER bezeichnen in ihrem
Model die Zustände der katalytischen Zentren aufgrund ihrer Affinität zu ATP mit H
(highest), M (medium) und L (lowest). Daneben gibt es noch einen weiteren, offenen
Zustand O (open). Während der Hydrolyse von ATP durchlaufen die Zentren die Zustände
in der Reihenfolge O→L→H→M→L→O. Die in E. coli gemessenen KD-Werte der
entsprechenden Zustände liegen bei etwa 1 nM, 1 µM, 30 µM und >10 mM (Weber et al.,
1993). Das Enzym zeigt also eine negative Kooperativität bezüglich der Substratbindung.
Die niedrige Affinität des O-Zustandes für ATP erklärt, warum eine Bindetasche in diesem
Zustand praktisch immer leer ist.
25
Einleitung
_________________________________________________________________________
Abb. 1.6: Mechanismen der ATP-Hydrolyse während eines +120°-Schritts von γ.
A) Modell nach R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001). 1) Im Ausgangszustand ist die βE-Bindungstasche leer und offen (O), während die βTP- (L) und die βDP-Bindungstasche (T) mit
ATP besetzt sind. Dieser Zustand repräsentiert die originale Kristallstruktur. 2) Ausgelöst
durch die Bindung von ATP an die O-Bindungstasche wird ATP in der βDP-Bindungstasche
hydrolysiert. Beide Bindungstaschen ändern in diesem katalytischen Schritt ihre Affinität
bzw. ihren Öffnungszustand (O→L’, T→T*). Dieser Zustand ist bisher noch nicht kristallisiert. 3) In dem darauf folgenden, nicht-katalytischen Schritt nehmen alle drei Bindungstaschen eine neue Konformationen ein (L’→L, T*→L’’, L→T), entsprechend der
Kristallstruktur von R. I. MENZ et al. Die L’’-Bindungstasche ist halb geöffnet. 4) Im letzten
Schritt des Reaktionszyklus werden ADP und Pi aus der βDP-Bindungstasche freigesetzt, die
dadurch zur βE-Bindungstasche wird (L’’→O). Damit ist der um 120° gedrehte Ausgangszustand erreicht. Die katalytischen Bindungstaschen durchlaufen zyklisch die Zustände
O→L’→L→Τ→T*→L’’→O. B) Modell nach A. E. SENIOR und J. WEBER (Weber und
Senior, 2003). 1) Im ATP-Wartezustand sind zwei Bindungstaschen mit ADP (M) bzw. ATP
(H) besetzt, während die dritte leer und offen ist (O). 2) ATP bindet an die offene Tasche,
die dadurch zur L-Bindungstasche wird (O→L). 3) Ausgelöst durch eine 80°-Rotation der
γ-Untereinheit (roter Pfeil) kommt es im katalytischen Schritt zur Spaltung von ATP in ADP
und Pi in der H-Bindungstasche. Dieser ist an einen Zustandswechsel aller Bindungstaschen
(L→H, H→M, M→L) und den Fluss von n Protonen durch FO gekoppelt. 4) Dieser Zustand
wird durch die Freisetzung von Pi aus der M-Bindungstasche erreicht. 5) Anschließend wird
ADP aus der L-Bindungstasche freigesetzt, die damit in den O-Zustand wechselt (L→O).
Damit ist wieder der um 120° gedrehte Ausgangszustand erreicht. Die katalytischen
Bindungstaschen durchlaufen zyklisch die Zustände O→L→Η→M→L→O.
Neben diesen Modellen gibt es noch einen langsam arbeitenden unisite Mechanismus,
bei dem immer nur eine Bindetasche aktiv ist (Grubmeyer et al., 1982; Kozlov et al., 1985;
Cunningham und Cross, 1988; Penefsky, 1988). Er tritt aber nur bei sehr niedrigen (< µM)
Substratkonzentrationen auf und ist daher physiologisch nicht relevant. Bei physiologischen, millimolaren ATP-Konzentrationen sind aufgrund der oben genannten Befunde und
der Tatsache, dass die KD-Werte deutlich kleiner als die ATP-Konzentration sind,
26
Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
höchstwahrscheinlich alle drei Bindungstaschen mit Nukleotiden besetzt. Der lösliche
F1-Teil kann mit einer Umsatzrate von bis zu Vmax = 300 s-1 arbeiten, das entspricht 100
Umdrehungen pro Sekunde.
1.2.2
Funktionsmechanismus des FO-Teils
Die Aufgabe von FO in der F-ATP-Synthase besteht darin, das Drehmoment zu generieren,
welches in F1 für die Synthese von ATP benötigt wird. Das Proteolipid bildet zusammen
mit a den Teil von FO, der diese Aufgabe übernimmt. Dazu wird eine über die Membran
anliegende elektrochemische Potentialdifferenz genutzt. Während der c-Ring mechanistisch zum Rotor gehört, sind die Untereinheiten a und b2 Teile des Stators, wobei b2 den
FO-Teil mit dem F1-Teil verbindet. Ein Mechanismus für die Funktion von FO wurde von
W. JUNGE entworfen und beschrieben (Junge et al., 1997). Dem Modell nach (Abb. 1.7)
befinden sich zwischen den Untereinheiten a und c zwei versetzt angeordnete Halbkanäle,
die jeweils nur zu einer Seite der Membran geöffnet sind und diese zur Hälfte durchspannen. Jede c-Untereinheit im Proteolipid trägt mittig eine Carboxylgruppe (cD61). Im protonierten, elektrisch neutralen Zustand zeigt diese Gruppe in die umgebende Lipidmembran,
während sie im deprotonierten, negativ geladenen Zustand der Untereinheit a zugewandt
ist. Stöße durch die umgebenen Wasser- und Lipidmoleküle verursachen eine ungerichtete,
rotierende Brown’sche Fluktuationsbewegung des c-Rings relativ zu a. Wenn sich eine
geladene c-Untereinheit von a in das Lipid dreht, wird sie aufgrund der elektrostatischen
Beschränkung wieder zurück zum Protein reflektiert. Nur wenn die Ladung durch die
stochastische Bindung eines Protons, das durch einen Halbkanal diffundiert, neutralisiert
wird, kann sich der c-Ring eine Untereinheit weit in die Membran drehen. Gleichzeitig
dreht sich auf der anderen Seite ein protoniertes c in Richtung der Kontaktfläche mit der
a-Untereinheit und gibt dort sein Proton über den zweiten Halbkanal an die andere Seite
der Membran ab, d.h. es wurde ein Protonen über die Membran transportiert. Die Dissoziation der Protonen wird durch die positiv geladene Aminosäure R210 in a begünstigt. Den
Zugang für die Protonen zum cD61 bilden die beiden Halbkanäle in a (Angevine et al.,
2003). Werden die Halbkanäle verlängert oder verkürzt, indem man diesen Aminosäurereste vertikal verschiebt, kommt es zu einer Beeinträchtigung bis zu einem völligem Erliegen der Protonenleitung (Langemeyer und Engelbrecht, 2007). Die Drehrichtung des
c-Rings wird allein durch die pH-Werte beiderseits der Membran bestimmt. Je niedriger
der pH-Wert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Proton in den Kanal eintritt
und eine c-Untereinheit protoniert. Bei hohen pH-Werten werden die c-Untereinheit
dagegen eher deprotoniert.
Die hochauflösenden Kristallstrukturen der entsprechenden Proteolipide aus I. tartaricus mit einer Auflösung von 0,24 nm (Meier et al., 2005) und Enterococcus hirae mit
einer Auflösung von 0,21 nm (Murata et al., 2005) unterstützen dieses Modell, das auch
als ‘Brownian Ratchet’ bezeichnet wird (Junge und Nelson, 2005). Der c-Ring der Natrium- transportierenden F-ATP-Synthase aus I. tartaricus besteht aus 11 Monomeren, die
jeweils einen Glutamat an der Position 65 besitzen. In dem Proteolipid der Natrium-transportierenden V-ATP-Synthase aus E. hirae befindet sich ein Glutamat an der Position 165.
Diese beiden Glutamatreste erfüllen die gleiche Funktion wie das cD61. Auch weisen die
Strukturen auf die Existenz zweier Halbkanäle zwischen dem Proteolipid und dem Stator
hin.
27
Einleitung
_________________________________________________________________________
Abb. 1.7: Modell der Protonentranslokation durch die a- und c-Untereinheiten von
FO nach W. JUNGE (Junge, 1997).
Die Grafik zeigt einen c-Ring aus 12 Monomeren und die a-Untereinheit in FO. Zusammen
bilden sie zwei Halbkanäle, die zu beiden Seiten der Membran zeigen und die Zugangskanäle für die Protonen zum c-Ring bilden. Die stochastische Bindung eines Protons an ein
c-Monomer bewirkt eine Drehung des Proteolipids um 360°/12 = 30° und anschließend die
Freisetzung eines Protons durch den anderen Halbkanal. Diese anliegende protonenmotorische Kraft erzeugt das für die ATP-Synthese benötige Drehmoment.
Die Rotationsbewegung des c-Rings wurde experimentell an EFOF1 (Sambongi et al.,
1999; Pänke et al., 2000; Sielaff, 2002) und an TFOF1 (Ueno et al., 2005) an isolierten
Enzymkomplexen in Gegenwart von Detergenzien und von M. FUTAI und seinen Kollegen
(Nishio et al., 2002) am membrangebundenen Enzym nachgewiesen. Alle Experimente
bedienten sich der Bindung eines Actinfilaments oder Mikropartikels an den c-Ring zum
Nachweis der Rotationsbewegung. Des Weiteren wurde gezeigt, dass γ, ε und die c-Untereinheiten zusammen rotieren und somit in FOF1 eine Einheit als Rotor bilden. In einem
Versuch, in dem diese Untereinheiten durch Disulfidbrücken miteinander verbunden
waren, zeigte der Enzymkomplex in entsprechenden Versuchsanordnungen sowohl
ATP-Hydrolyse als auch ATP-Synthese Aktivität (Tsunoda et al., 2001).
1.3
Elastische Kopplung der beiden Motoren
In der F-ATP-Synthase aus E. coli steht dem 10-Schritt Motor in FO ein 3-Schritt Motor in
F1 gegenüber. Während sich der c-Ring in FO in 36°-Schritten dreht, bewegen sich γ und ε
im F1-Teil immer in 120°-Schritten weiter. Dieses Symmetrie-Missverhältnis führt im
aktiven Enzym zu einer elastischen Verdrillung der beiden Verbindungsstiele zwischen FO
und F1, d.h. dem zentralen Stiel bestehend aus γ und ε und dem peripheren b2-Dimer
(Pänke et al., 2001). Diese elastische Deformation wird als wichtig für die katalytische
Funktion der F-ATP-Synthase angesehen (Junge et al., 1997; Wang und Oster, 1998;
Syroeshkin et al., 1998; Cherepanov et al., 1999; Junge, 1999; Pänke und Rumberg, 1999;
Leslie und Walker, 2000). Wenn die Drehbewegung des F1-Teils rigide mit der Drehung
28
Elastische Kopplung der beiden Motoren
_________________________________________________________________________
des c-Rings verbunden wäre, könnte die Aktivierungshürde des Enzyms auf die Summe
der Aktivierungsenergien des F1-Teils (40 kJ/mol) (Al-Shawi et al., 1997) und des FO-Teils
(60 kJ/mol) (Althoff et al., 1990) von etwa 100 kJ/mol ansteigen. Bezogen auf das Profil
der freien Enthalpie würde dies bedeuten, dass das Enzym zu lange auf stochastische,
thermische Stöße der Umgebung warten müsste, um die Arrhenius’sche Aktivierungsbarriere zu überwinden, bevor es zum nächsten Energieminimum voranschreiten kann. Das
elastisch gekoppelte Enzym dagegen kann auf die elastische Energie zurückgreifen, die
während der elastischen Kraftübertragung vorübergehend im Enzym gespeichert wurde.
Diese für das Enzym vorteilhafte Situation spiegelt sich theoretisch in einem geglätteten
Energieprofil wieder (Abb. 1.8A). Dies wurde von W. JUNGE und seinen Kollegen untersucht (Cherepanov et al., 1999; Cherepanov und Junge, 2001; Pänke et al., 2001). Dazu
untersuchten sie mit dem Rotationsassay die Verdrillung der γ-Untereinheit mittels eines
langen Actinfilaments (durchschnittlich 3 µm), das an den c-Ring der F-ATP-Synthase aus
E. coli gekoppelt war. Unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen erzeugte das Motorenzym ein
Drehmoment, das sich in der Krümmung des rotierenden Filaments widerspiegelte, verursacht durch seine Bewegung im viskosen Medium. Die viskose Dämpfung der Rotationsbewegung des Filaments erzeugt ein Gegenmoment zum Drehmoment des Enzyms,
welches die Drehbewegung typischerweise 1000-fach verlangsamt. Die Winkelabhängigkeit des äußere Drehmoments des Filaments unterscheidet sich von demjenigen des
inneren Drehmoment des Enzyms in Abhängigkeit von der in den Rotoruntereinheiten
gespeicherten elastischen Energie. Betrachtet man die γ-Untereinheit als einen elastischen,
zylindrischen Stab aus einem homogenen, isotropen Material mit den Radius r und der
Länge l, so ergibt sich für das resultierende Drehmoment (M) in Abhängigkeit von der
Winkelauslenkung des freien Endes (φ) folgende Beziehung:
M = Cl $ &
Gl. 1.6
Dabei ist C die Torsionssteifigkeit. Sie ist abhängig vom Radius r, dem Elastizitätsmodul EM und der Poisson-Zahl µ. Die Poisson-Zahl hat einen Wert von 0,5 für ein inkompressibles Medium und etwa 0,25 für ein Protein (Howard, 2001).
4 $EM
C = $r
(
4$ 1+ )
Gl. 1.7
Das Verhältnis von Torsionssteifigkeit (C) zur Länge (l) wird als Torsions-Federkonstante (κ) bezeichnet. Sie ist ein Maß für die elastischen Eigenschaften des Systems.
$r 4 $EM
= Cl = l$4$
(1+ )
Gl. 1.8
Damit gilt für elastische Energie (E) des Systems die folgende Beziehung:
E = 12 Cl & 2 = 2 & 2
Gl. 1.9
Eine bemerkenswerte Eigenschaft des rotierenden Enzym-Filament-Komplexes war die
nur schwache Variation um einen Faktor ≤ 2 der Änderung des Drehmoments in Abhängigkeit von der Winkelposition des Komplexes. Das daraus resultierende Energieprofil war
nahezu linear abfallend und zeigt keine Aktivierungshürden. Das mittlere Drehmoment
29
Einleitung
_________________________________________________________________________
wurde zu 56 pNnm berechnet. Dieser Wert multipliziert mit der Drehung von 2π/3 pro
hydrolisiertem ATP-Molekül ergibt eine scheinbare freie Enthalpiedifferenz von
∆G = 71 kJ/mol. Dieser Wert stimmt gut mit dem der freien Enthalpiedifferenz der
ATP Hydrolyse unter den im Experiment gegebenen Bedingungen von ∆G = 64 kJ/mol
überein.
Das Energieprofil des Systems ließ sich für verschiedene Elastizitätsmoduln simulieren
(Abb. 1.8A). Daraus ergaben sich verschiedene Torsionssteifigkeiten, von denen die
Umsatzrate des Enzyms abhängt (Abb. 1.8B).
Abb. 1.8: Simulation des winkelabhängigen freien Enthalpieprofils eines C3-symmetrischen, rotierenden Motors mit einer elastischen Kraftübertragung für verschiedene Elastizitätsmoduln (Pänke et al., 2001).
A) Im Falle einer inflexiblen Kraftübertragung entspricht das resultierende Profil der freien
Enthalpie genau dem inneren Profil (durchgezogene Linie). Der Motor muss die Aktivierungsbarrieren überwinden. Durch eine elastische Kraftübertragung wird das Profil geglättet,
die gestrichelten Linien geben die resultierenden Profile für verschiedene Elastizitätsmoduln
in Nm-2 wieder. B) Rotationsrate eines an ein Actinfilament gekoppelten Motors mit einem
durchschnittlichen Drehmoment von 56 pNnm bei der Bewegung durch ein viskoses
Medium. Der Strich gibt die angenommene Torsionssteifigkeit der γ-Untereinheit an und
entspricht einem Elastizitätsmodul von 2·109 Nm-2. Der Wert dient als grobe Abschätzung
für die elastische Kraftübertragung zwischen dem FO- und dem F1-Teil.
Bei einem vorgegebenen Radius von r = 0,8 nm, einer Länge von l = 6 nm und einem
Elastizitätsmodul von EM = 14,4·109 Nm-2 zeigt das Profil die Minima und Maxima der
Aktivierungsbarrieren. Wird dagegen ein Elastizitätsmodul von nur 0,4·109 Nm-2 angenommen, entspricht der Verlauf dem im Experiment gemessenen glatten, linearen Profil. Die
entsprechende Federkonstante eines solchen Komplexes hat einen Wert von etwa
14 pNnm, was für die elastische Kopplung spricht. Durch die niedrige Torsionssteifigkeit,
bzw. die hohe Elastizität erhöht sich auch die Umsatzrate und damit die Effizienz des
Enzyms (Abb. 1.8B). Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass das Enzym schlupffrei
mit nahezu 100% Effektivität arbeitet.
In der Zelle, wenn das Enzym ATP-Synthese betreibt, wird die Energie von mehreren
Protonen, die durch den FO-Teil fließen, elastisch gespeichert und akkumuliert, bis
genügend Energie für die Synthese eines ATP-Moleküls zur Verfügung steht. Bei einem
typischen transmembranen Protonenpotential von 150 mV (Kashket, 1985) liefert jedes
Proton etwa 14 kJ/mol. Somit werden etwas mehr als drei Protonen benötigt, um ein
ATP-Molekül zu synthetisieren.
30
Elastische Kopplung der beiden Motoren
_________________________________________________________________________
1.4
Zielsetzung
Die Ziele dieser Arbeit sind
y
die Korrelation des molekularen Koordinatensystems der Kristallstrukturdaten mit
dem Laborkoordinatensystem der aktiven F-ATP-Synthase, um die auf Daten unterschiedlicher Methoden beruhenden Modelle des Funktionsmechanismus auf ihre
Schlüssigkeit hin zu überprüfen.
y
die Untersuchung der elastischen Kopplung der beiden Motoren (F1 und FO) mittels
der Bestimmung von Torsions-Federkonstanten der γ- und c-Untereinheiten, um die
elastisch weichen Elemente des Enzyms und damit die Abschnitte, in denen die elastische Energie gespeichert wird, zu bestimmen.
31
Materialien
_________________________________________________________________________
2
Materialien und Methoden
2.1
Materialien
2.1.1
Chemikalien und Geräte
Lösungsmittel, Puffersubstanzen, Salze
Wasser, doppelt destilliert,
für genetische Arbeiten sterilisiert
Mikropipetten
Biomol (Hamburg), Riedel de Haën
(Seelze), Roth (Karlsruhe), Sigma
(Taufkirchen)
Reinstwasseraufbereitungssystem:
Milli-Q Academic System, Millipore
(Billerica, US)
Gilson (Middleton, US)
2.1.1.1 Genetische Arbeiten
ABI Prism BigDye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit
Ampicillin
1 kb DNS-Leiter, 6x Beladungspuffer,
peqGold Universal Agarose
CIAP + Puffer, Lambda DNA/PstI Marker, 24,
Restriktionsendonukleasen + Puffer
Ethidiumbromid, Tetracyclin
pBluescript II SK (+) Vektor
PCR-, Sequenzierungsprimer
Pfu-Polymerase (AccuzymeTM)
QIAprep Spin Miniprep Kit,
QIAquick Gel Extraction Kit
Restriktionsendonukleasen,
T4 DNA Ligase + Puffer, ThermoPol-Puffer,
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Select Peptone 140, Hefeextrakt, Agar,
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells
Agarose-Gelelektrophoreseapparatur
Horizon 11014
Autoklav Hiclave HV-50
Blockthermostat 5121
Blockthermostat Digi-Bloc
Digitales Photodokumentationssystem
mit Kamera Herolab EASY 429K
und Transilluminator UVP M-20E 302 nm
Heißluftsterilisator
Kühl-Tischzentrifuge Biofuge fresco
Applied Biosystems (Foster City, US)
Roth (Karlsruhe)
Peqlab (Erlangen)
MBI Fermentas (St. Leon-Rot)
Sigma (Taufkirchen)
Stratagene (Amsterdam, NL)
MWG-Biotech (Ebersberg)
Bioline (London, GB)
Qiagen (Hilden)
New England Biolabs (Frankfurt/Main)
Gibco BRL (Paisley, GB)
Gibco BRL (Gaithersburg, US)
Wolf (Geislingen)
Stuart Scientific (Redhill, GB)
Laboratory Devices (Holliston, US)
Herolab (Wiesloch)
UVP (San Gabriel, US)
Heraeus (Hanau)
Heraeus Instruments (Osterode)
33
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
Sequenziergerätes (ABI PRISM 310/377)
UV-Leuchttisch Fluo-Link TFL-20M 312 nm
Applied Biosystems (Foster City, US)
Biometra (Göttingen)
2.1.1.2 Biochemische Arbeiten
4-AB, 6-AHS, L-Asparagin, Avidin,
Desthiobiotin, DNase, DTT, DTNB, EGTA,
Low Range Marker (M.W. 6500 – 66000),
PTMR, TEMED, Thiamin, Thymin
Acrylamid, Bis-Acrylamid
Anti-Mouse Ig-POD
Biotin-PEAC5-Maleimid
Coomassie Brilliantblau R-250 / G-250, EDTA,
Glycerin, Magermilchpulver, D(+)-Saccharose
L-Isoleucin, L-Valin, OG
Proteaseinhibitortablette (EDTA-free
protease inhibitor cocktail tablets)
Spectra/Por Dialysemembran, MWCO: 3500
Streptactin-Sepharose
Tween 20
Blotkammer + Spannungsquelle + Transfertank
French-Press
Gelfiltrationssäulen NAP-5, NAP-10, PD-10
Homogenisator RZR1
Kühl-Tischzentrifuge 5402
Kühlzentrifuge Avanti J-30 I,
Ultrazentrifuge Optima L-70K,
Zentrifugen-Rotoren Ti 45, JA10 JA30.50
Lumi LightPlus Western Blotting-Reagenz,
Plus Western Blotting Kit, PVDF Membran
Magnetrührer MR 3001 K und MR 2000
Mikrowelle
Negativentwickler Konica SRX-101A
PCR-Gerät Mastercycler gradient
pH-Meßgerät Knick 766 Calimatic
Photosensitiver Film (Hyperfilm ECL)
Schlauchpumpe Easy-Load Masterflex XX80
ELO 05
SDS-PAGE-Kammer + Spannungsquelle
Schüttelinkubator Gio Gyrotory Shaker
Spektrophotometer Hewlett-Packard 8453 E
Waage Mettler Toledo AG 285
Waage Sartorius BL 1500 S
Wasserbad Haake W13, Thermostat Haake D2
Wippschüttler WS 5
34
Sigma (Taufkirchen)
Bio-Rad Laboratories (München)
Roche Diagnostic (Mannheim)
Dojindo Laboratories (Kumamoto, JP)
Roth (Karlsruhe)
Biomol (Hamburg)
Roche Diagnostics (Mannheim)
Spectrum Laboratories (Breda, NL)
IBA (Göttingen)
Fluka (Buchs, CH)
Roth (Karlsruhe)
Polytec (Waldbronn)
Amersham Biosciences (Piscataway, US)
Heidolph (Schwabach)
Eppendorf (Hamburg)
Beckman Coulter (Krefeld)
Roche Diagnostics (Mannheim)
Heidolph (Schwabach)
Siemens (München)
Konica (Langenhagen)
Eppendorf (Hamburg)
Knick (Dülmen)
Amersham Pharmacia Biotech
(Wien, AT)
Millipore (Billerica, US)
Bio-Rad Laboratories (München)
New Brunswick Scientific (Edison, US)
Hewlett-Packard (Böblingen)
Mettler Toledo(Greifensee, CH)
Sartorius (Göttingen)
Thermo Haake (Karlsruhe)
Edmund Bühler (Hechingen)
Materialien
_________________________________________________________________________
2.1.1.3 Rotationsassay
ADP
ATP, Kreatin-Kinase, Kreatin-Phosphat
BSA - Fraktion V, Glucose, Glucose-Oxidase,
Hexokinase
Hellmanex II
Katalase
MagStrep Kit
2-Mercaptoethanol, NaN3
Ni-NTA-HRP
Quantum-Dots
Streptactin
Calbiochem (San Diego, US)
Roche Diagnostics (Mannheim)
Argonplasma-Reiniger
Bildprozessor ARGUS
CMOS-Kamera Hamamatsu C 2400-08,
Kamera-Kontrolleinheit C 2400
Filterpapier
Fluoreszenzmikroskop IX70,
Quecksilberlampe USHIO USD-102D 100W
Linsenreinigungstücher
Monitor PVM-145E
Objekttischsteuerung MCL-3
Objektträger, Deckgläser
Pinnacle DV500 Plus
Photofilm
Vakuumpumpe
Videorekorder Panasonic NV-HS 950
Ultraschallbad
Harrick Scientific (Pleasantville, US)
2.1.2
Sigma (Taufkirchen)
Hellma (Mühlheim)
Fluka (Buchs, CH)
IBA (Göttingen)
Merck (Darmstadt)
Qiagen (Hilden)
tebu-bio (Offenbach)
IBA (Göttingen)
Hamamatsu Photonics (Hamamatsu, JP)
Roth (Karlsruhe)
Olympus Optical (Tokio, JP)
Whatman (Dassel)
Sony (Köln)
Lang (Hüttenberg)
Prolabor (Georgsmarienhütte)
Pinnacle (Braunschweig)
tesa (Hamburg)
Franklin Electric (Bluffton, US)
Matsushita Electric (Osaka, JP)
Transsonic 460/H Elma (Singen)
Puffer, Lösungen und Medien
ADP-Reaktionslösung
Ampicillinlösung (500x)
Blockpuffer
Elektrodenpuffer
Elutionspuffer
Ethidiumbromidlösung
Extraktionspuffer
Gel-Entfärbelösung
Gel-Färbelösung
Lagerungspuffer
20 mM Glucose; 0,2 mg/ml Glucose-Oxidase; 50 µg/ml
Katalase; 0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol; 5 mM ADP;
1 U/ml Hexokinase; in Puffer MD
50 mg/ml Na-Ampicillin in 50% (v/v) Ethanol
50 mM TRIS/HCl (pH 7,4); 0,9 % (w/v) NaCl; 5 % (w/v)
Magermilchpulver
3 mg/ml Tris; 14,4 mg/ml Glycin; 0,1 % SDS
10 mM TRIS/HCl (pH 8,5)
10 mg/ml Ethidiumbromid in H2O
50 mM TRIS/HCl pH 8,0; 5 mM MgCl2; 0,2 mM EGTA;
1 mM ADP; 10% (v/v) Glycerin
25% (v/v) Methanol; 5% (v/v) Essigsäure
0,05% Coomassie Brilliantblau R-250; 50% (v/v)
Methanol; 5% (v/v) Essigsäure
5 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 10 mM MgCl2; 70 mM KCl;
20% (v/v) Glycerin
35
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
Laemmli-Sammelgel (5%)
Laemmli-Trenngel (12,5%)
LB-Medium
LB/Agar-Medium
Lösung A
Lösung B
Lösung C
Mangelmedium
Natriumacetatpuffer
Oxidationslösung
Probenpuffer
Puffer 1
Puffer BMKM
Puffer G
Puffer G2
Puffer MD
Puffer MKM
Puffer Streptactin A
Reaktionslösung
S+G-Reagenz
Succinat-Medium
36
0,126 M TRIS/HCl (pH 6,8); 1 mg/ml SDS; 39,6 mg/ml
Acrylamid; 0,99 mg/ml Bis-Acrylamid; 0,52 mg/ml
Ammoniumpersulfat; 0,0012 ml/ml TEMED
0,375 M TRIS/HCl (pH 8,8); 1 mg/ml SDS; 125,1 mg/ml
Acrylamid; 3,1275 mg/ml Bis-Acrylamid; 0,5 mg/ml
Ammoniumpersulfat; 0,0005 ml/ml TEMED
5 g Select Peptone 140; 2,5 g Hefeextrakt; 5 g NaCl;
ad 0,5 l H2O (pH ca. 7,5)
500 ml LB-Medium; 7,5 g Agar
0,25% (w/v) CuSO4 • 5 H2O; 4,6% (w/v) Natriumacetat •
3 H2O in 2 M Essigsäure (pH 4,0)
5% (w/v) (NH4)6Mo7O24 • 4 H2O
2% (w/v) C7H9NO • ½ H2SO4; 5% (w/v) Na2SO3
34 mM KH2PO4; 64 mM K2HPO4; 0,3 mM MgSO4;
20 mM (NH4)2SO4; 1 µM FeSO4; 1 µM ZnCl2; 10 µM
CaCl2; 50 µg/ml L-Isoleucin; 50 µg/ml L-Asparagin;
50 µg/ml L-Valin; 2 µg/ml Thiamin; 50 µg/ml Thymin;
0,5% (v/v) Glycerin
3 M Natriumacetat/Essigsäure (pH 5,2)
20 mM Glucose; 0,2 mg/ml Glucose-Oxidase; 50 µg/ml
Katalase; 0,2 mg/ml Kreatin-Kinase; 2,5 mM KreatinPhosphat; 2 mM DTNB; 5 mM ATP; in Puffer MD
100 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 2% (w/v) SDS; 12,5% (v/v)
Glycerin; 2% (v/v) 2-Mercaptoethanol; 1 mM EDTA;
0,01% Bromphenolblau;
100 mM TES/NaOH (pH 7,0); 40 mM 6-AHS; 0,25 mM
EGTA; 6 mM 4-AB; 20 mM Magnesiumacetat; 10% (v/v)
Glycerin
20 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2;
10 mg/ml BSA
2 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 0,2 mM CaCl2; 2 mM ATP
2 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 2 mM CaCl2; 0,5 mM ATP;
0,5 mM DTT
50 mM MOPS/KOH (pH 7,5); 50 mM KCl; 5 mM MgCl2;
10% (v/v) Glycerin; 0,5% (w/v) OG
20 mM MOPS/KOH (pH 7,0); 5 mM MgCl2; 50 mM KCl
20 mM TES/NaOH (pH 7,0); 5 mM MgCl2; 1 mM ADP;
15% (v/v) Glycerin
20 mM Glucose; 0,2 mg/ml Glucose-Oxidase; 50 µg/ml
Katalase; 0,2 mg/ml Kreatin-Kinase; 2,5 mM Kreatinphosphat; 0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol; 5-5000 µM
ATP; in Puffer MD
0,6% (w/v) Coomassie Brilliantblau G-250; 3%
Perchlorsäure
34 mM KH2PO4; 64 mM K2HPO4; 0,3 mM MgSO4;
20 mM (NH4)2SO4; 1 µM FeSO4; 1 µM ZnCl2; 10 µM
CaCl2; 50 µg/ml L-Isoleucin; 50 µg/ml L-Asparagin;
50 µg/ml L-Valin; 2 µg/ml Thiamin; 50 µg/ml Thymin;
Materialien
_________________________________________________________________________
TBE-Elektrophoresepuffer
Testlösung
Tetracyclinlösung (625x)
TFB 1
TFB 2
Transferpuffer
Waschpuffer
YT-Medium
2.1.3
0,4% (w/v) Natriumsuccinat; 3% (w/v) Agar
0,1 M TRIS/Borsäure (pH 8,3); 0,09 M Borsäure; 1 mM
EDTA
50 mM Tris/HCl (pH 8,0); 3 mM MgCl2; 10 mM ATP
6,25 mg/ml Tetracyclin in 50% (v/v) Ethanol
30 mM Kaliumacetat/Essigsäure (pH 5,8); 10 mM CaCl2;
100 mM RbCl; 50 mM MnCl2; 15% (v/v) Glycerin
10 mM MOPS/HCl (pH 7,0); 75 mM CaCl2; 10 mM
RbCl; 15% (v/v) Glycerin
10 mM NaHCO3; 3 mM Na2CO3; 20 % (v/v) Methanol
5 mM TRIS/HCl (pH 8,0); 10 mM MgCl2; 0,2 mM EGTA;
10% (v/v) Glycerin
4 g Select Peptone 140; 2,5 g Hefeextrakt; 1,25 g NaCl;
ad 0,5 l H2O (pH ca. 7,5)
Stämme und Plasmide
2.1.3.1 DH5α
Genotyp: F−, deoR, recA1, endA1, phoA, relA1, supE44, hsdR17(rK−mK+), λ−thi-1,
gyrA96, φ80dlacZ∆M15, ∆(lacZYA-argF)U169
Dieser von HANAHAN (Hanahan, 1983) beschriebene E. coli-Stamm enthält die Mutationen recA1 und endA1, durch die homologe Rekombinationsprozesse verhindert und die
Aktivität der nicht-spezifischen Endonuklease I beseitigt werden. Dies ermöglicht eine
stabile Replikation von Plasmiden in hoher Kopienzahl. Dieser Stamm wurde für sämtliche Klonierungsarbeiten verwendet.
2.1.3.2 DK8
Genotyp: bglR, thi-1, rel-1, HfrPO1, D(atpB-atpC), ilv::Tn10
Dieser von D. J. KLIONSKY et al. (Klionsky et al., 1984) hergestellte E. coli-Stamm kann
aufgrund der Deletion ∆(atpB-atpC) im ATP-Synthase-Operon keine ATP-Synthase
produzieren. Er ist deshalb auf eine plasmidcodierte ATP-Synthase für das Wachstum auf
nichtvergärbaren Kohlenstoffquellen wie Succinat angewiesen. Ein niedriges ATP/ADPVerhältnis führt zu einer Spiralisierung der DNS. Das begünstigt die Expression eines
Repressors des Succinat-Transporter-Gens, es kommt zu einer Hemmung der Expression
des Succinat-Transporters. Da den Zellen in diesem Zustand Succinat nicht als Energiequelle zur Verfügung steht, müssen sie auf das plasmidcodierte atp-Operon zurückgreifen,
um ATP zu produzieren. Dies wiederum bewirkt eine Unterdrückung des Repressors,
wodurch es zu einer Expression des Succinat-Transporters und einer steigenden Succinatkonzentration kommt (Boogerd et al., 1998).
Des Weiteren verleiht das Transposon Tn10 dem Stamm eine Tetracyclinresistenz
(Foster et al., 1981). Dieser Stamm wurde für die Expression von plasmidcodierten FOF1Mutanten verwendet.
37
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
2.1.3.3 pBluescript II SK (+)
Der Vektor pBluescript II SK (+) (pBSK) ist ein 2961 bp langer high copy-Standardklonierungsvektor und verfügt über eine multiple cloning site (MSC) und eine Ampecillinresistenz. Dieser Vektor wurde für die Mutagenese mittels PCR eingesetzt.
2.1.3.4 pSE1
Der Vektor pSE1 (Pänke et al., 2000) enthält das komplette atp-Operon sowie einen His6tag (Aminosäuresequenz: RGSHHHHHHGMATG...) am N-Terminus der Untereinheit β
und einen Strep-tag (Aminosäuresequenz: ...AVASWSHPQFEK) am C-Terminus der
c-Untereinheit (Pänke et al., 2000). In dem Genprodukt wurden alle zehn Wildtyp-Cysteine durch Alanine ersetzt (bC21A, αC47A, αC90A, αC193A, αC243A, βC137A,
γC87A, γC112A, δC65A, δC141A) (Kuo et al., 1998). Neben der Expression von EFOF1Komplexen diente dieser Vektor auch als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Plasmide pGH11, pGH14, pGH18 und pGH33. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz ist im
Anhang aufgeführt (Kap. 7.1).
Abb. 2.1: pSE1.
2.1.3.5 pGH11, pGH14, pGH18, pGH33
Die Vektoren pGH11, pGH14, pGH18 und pGH33 sind Derivate von pSE1. Sie besitzen
jeweils zwei Cysteine an den Stellen γK266C/αD336C, γL276C/αE284C,
γQ274C/αΕ284C bzw. cL72C/aI223C. Die Plasmide wurden von G. HIKADE (Abt. Biophysik, Universität Osnabrück) hergestellt.
2.1.3.6 pKH7
Der Vektor pKH7 (Noji et al., 1999) diente der Expression des F1-Teils der F-ATP-Synthase. Wie pSE1 enthält er einen His6-tag in β (Aminosäuresequenz:
RGSHHHHHHGMATG...) und alle Wildtyp-Cysteine wurden durch Alanine ersetzt. Ein
zusätzliches Cystein in γ an der Position 109 (γK109C) kann biotinyliert werden, um dann
über Streptavidin Actinfilamente oder Magnetpartikel zu binden.
38
Methoden
_________________________________________________________________________
2.2
Methoden
2.2.1
Gentechnische Methoden
Sämtliche gentechnischen Arbeiten wurden von G. HIKADE (Abt. Biophysik, Universität
Osnabrück) durchgeführt. Für die Klonierungsarbeiten wurden Plasmide in DH5α-Zellen
verwendet.
Die Punktmutationen γK266C und αD336C wurden bereits von M. MÜLLER im Rahmen
seiner Promotion an der Universität Osnabrück in den Vektor pMM24, ein pKH7-Derivat,
eingeführt. Das KpnI/SacI-Fragment wurde mittels Restriktionsenzymen und anschließender Agarose-Gelelektrophorese aus pSE1 entfernt und gegen das entsprechende Fragment
aus pMM24, das die Mutation γK266C enthielt, durch eine Ligation ersetzt. In das Ligationsprodukt wurde auf gleiche Art und Weise das KpnI/XhoI-Fragment aus pMM24, das
die Punktmutation αD336C enthielt, eingesetzt. Das daraus resultierende Plasmid erhielt
den Namen pGH11.
K. GUMBIOWSKI (Apt. Biophysik, Universität Osnabrück) stellte das Plasmid pKG11, ein
pKH7-Derivat, zur Verfügung, das die Punktmutationen γL276C und αE284C enthielt. Die
Mutationen in γ und α wurden wie oben beschrieben mit den Fragmenten KpnI/SacI und
KpnI/XhoI in pSE1 überführt. Das daraus resultierende Plasmid wurde pGH14 genannt.
Die Punktmutation γQ274C wurde durch eine spezifische Mutagenese mittels PCR
erzeugt. Dazu wurde das KpnI/SacI-Fragment aus pSE1 zunächst in pBSK überführt. Das
Plasmid diente als Template für eine PCR mit dem sense-Primer
5'-GCTCGTCAGGCCAGCATTACTTGTGAACTCACCGAGATCGTCTCG-3'
und
seinem Komplement 5'-CGAGACGATCTCGGTGAGTTCACAAGTAATGCTGGCCTG
ACGAGC-3' (die das Cystein codierenden Basen sind unterstrichen). Das KpnI/SacI-Fragment des PCR-Produkts wurde durch eine Ligation in einen pSE1-Subklon inseriert.
Anschließend wurde die Mutation αΕ284C aus pKG11 wie oben beschrieben in den
Subklon überführt. Das daraus resultierende pSE1-Derivat erhielt die Bezeichnung
pGH18.
Die Punktmutationen cL72C und aI223C wurden nach demselben Verfahren wie für die
Mutation γQ274C in pSE1 eingebracht. Für die Mutation cL72C wurde das DNS-Fragment BsrGI/PpuMI und die Primer 5'-CGCTGTAGGTCTGGGTTGCTACGTGATGTTC
GCTGTC-3' und 5'-GACAGCGAACATCACGTAGCAACCCAGACCTACAGCG-3'
benutzt. Für die Mutation aI223C wurde das DNS-Fragment BamHI/HindIII, der sensePrimer 5'-CCGGTGAGCTGATTTTCTGTCTGATTGCTGGTCTGTTGC-3' und der
antisense-Primer 5'-GCAACAGACCAGCAATCAGACAGAAAATCAGCTCACCGG-3'
benutzt. Das daraus resultierende Plasmid erhielt den Namen pGH33.
Die Ergebnisse aller Mutationen wurden durch eine Restriktionsanalyse und eine DNSSequenzierung überprüft. Anschließend wurden die Plasmide zur Zellanzucht in DK8-Zellen transformiert. Das Wachstum der Mutanten wurde in einem Komplementationstest
überprüft.
2.2.1.1 Herstellung kompetenter Zellen
Kompetente E. coli DK8-Zellen wurden nach der Rubidiumchlorid-Methode hergestellt.
Dazu wurden 200 ml tetracyclinhaltiges YT-Medium mit 2 ml einer E. coli DK8-LB-Kultur über Nacht (üN) angeimpft und bei 37 °C auf einem Schüttelinkubator bis zu einer
OD600 von ca. 0,5 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert (10 min, 4.000 x g,
39
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
4 °C), in 50 ml TFB 1 resuspendiert, 10 min auf Eis gekühlt und erneut unter gleichen
Bedingungen zentrifugiert. Das Pellet wurde in 8 ml TFB 2 resuspendiert, aliquotiert, in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
2.2.1.2 Transformation mit Plasmid-DNS
Ein 100 µl-Aliquot kompetenter Zellen wurde auf Eis aufgetaut, mit 1 µl einer PlasmidDNS-Lösung (ca. 10-20 ng DNS) versetzt und 10 min auf Eis inkubiert. Handelte es sich
um DNS aus Ligationsansätzen wurden die Zellen 30 min auf Eis inkubiert, für 2 min bei
42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt, und nochmals 2 min auf Eis inkubiert. Schließlich
wurde der Transformationsansatz auf einer auf 37 °C vorgewärmten, ampicillinhaltigen
LB-Agarplatte ausgestrichen und üN bei 37 °C inkubiert.
2.2.1.3 Isolierung von DNS
Plasmid-DNS für präparative Schnittansätze, Transformationen oder Restriktionsanalysen
wurde aus antibiotikahaltigen üN-Kulturen isoliert. Für üN-Kulturen wurden 10 ml
LB-Medium mit einer Bakterienkolonie von eine LB-Platte angeimpft. Für die Isolierung
von Plasmid-DNA wurde das „Spin Miniprep Kit“ nach den Angaben des Herstellers
verwendet. Pro Säule wurden 6 ml Bakteriensuspension eingesetzt. Aus diesem Volumen
konnten bis zu ca. 20 µg Plasmid-DNS isoliert werden. Die Elution erfolgte mit 30-50 µl
Elutionspuffer. Zur DNS-Konzentrationsbestimmung wurde die Absorption der DNS-Lösung bei 260 nm (A260) gemessen. Proteinverunreinigungen wurden anhand des Verhältnisses A260/A280 bestimmt. Die Probe galt dann als rein, wenn der Wert hierfür größer als 1,8
war.
Aufgetrennte DNS-Fragmente aus einer Agarose-Gelelektrophorese wurden unter
UV-Licht (312 nm) mit einem Skalpell aus dem Gel herausgeschnitten. Die Isolation der
DNS aus den Gelstücken erfolgte mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction Kits“ nach
Angaben des Herstellers. Die Elution der Fragmente erfolgte mit jeweils 30 µl Elutionspuffer pro Säule. Eine anschließende Konzentrationsabschätzung erfolgte per
Agarose-Gelelektrophorese.
2.2.1.4 Agarose-Gelelektrophorese
In der Agarose-Gelelektrophorese werden DNS-Fragmente nach ihrer Größe aufgetrennt.
Die Trenneigenschaft des Gels ist von der Agarosekonzentration abhängig. Der hier
verwendete Agarosegehalt von 1% (w/v) ist zur Auftrennung von DNS-Fragmenten mit
einer Länge von 0,5-7 kb geeignet. Die Fragmente werden durch den Fluoreszenzfarbstoff
Ethidiumbromid markiert, der mit der DNS interkaliert. Ethidiumbromid wird durch
UV-Licht angeregt, sein Emissionsmaximum liegt bei 590 nm. Analytische Gelelektrophoresen dienten der Kontrolle der Reaktionsergebnisse von Restriktionsanalysen und PCRAnsätzen. Präparative Gelelektrophoresen wurden zur Aufreinigung von DNS-Fragmenten
eingesetzt.
Agarose wurde durch mehrmaliges Aufkochen in TBE-Elektrophoresepuffer gelöst und
mit 0,8 µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die Proben wurden vor der Auftragung mit einem
‘6x Beladungspuffer’ vermischt. Bei analytischen Gelelektrophoresen wurde ein Probenvolumen von 10-20 µl bei einer Spannung von 130 V eingesetzt, und die Positionen der
DNS-Fragmente wurden bei einer Anregungswellenlänge von 302 nm dokumentiert. In
40
Methoden
_________________________________________________________________________
präparativen Gelelektrophoresen wurden ca. 80 µl Probenvolumen bei einer Spannung von
80 V eingesetzt.
2.2.1.5 Restriktionsanalyse von Plasmid-DNS
Für eine Restriktionsanalyse wurden in einem 20 µl-Reaktionsansatz 2 µl Plasmid-DNS
aus einer Plasmidisolierung mit 10 U Restriktionsenzym und einem entsprechenden Puffer
(nach Angaben des Herstellers) versetzt, die Ansätze mit H2O aufgefüllt und 1 h bei 37 °C
inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsergebnis in einer Agarose-Gelelektrophorese
überprüft.
2.2.1.6 Präparative Restriktionsschnittansätze
Für die Klonierung von DNS-Fragmenten wurden in 70 µl-Ansätzen ca. 8-10 µg PlasmidDNS mit jeweils 35 U der gewünschten Restriktionsenzyme versetzt, die Ansätze mit H2O
aufgefüllt und bis zu 4 h bei 37 °C inkubiert. Eine Dephosphorylierung verhinderte die
mögliche Religation von geschnittener Vektor-DNS. Dazu wurden die im Ansatz enthaltenen Restriktionsenzyme während einer 20 minütigen Inkubation bei 65 °C inaktiviert und
die Ansätze anschließend mit 3 U alkalischer Phosphatase (CIAP) und 7 µl CIAP-Puffer
versetzt. Nach 30 min Inkubation bei 37 °C wurden die Reaktionsansätze mit 10 µl ‘6x
Beladungspuffer’ versetzt und auf einem präparativen Agarosegel aufgetragen.
2.2.1.7 Ligation von DNS-Fragmenten
Ligationen dienten dem Einsetzen einer Insert-DNS in eine Vektor-DNS. Die beiden DNSFragmente wurden durch eine Ligase miteinander verbunden. In Reaktionsansätzen von
10 µl wurden 3-7 µl Insert-DNS (1 bp = 660 g/mol), 1 µl Vektor-DNS, 1 µl
T4 DNS Ligase (400 U/µl) und 1 µl 10x T4 DNA Ligase-Puffer eingesetzt und der Ansatz
mit H2O aufgefüllt. Die Ligationsansätze wurden üN bei 16 °C inkubiert.
2.2.1.8 Mutagenese mittels Polymerasekettenreaktion
Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Methode zur
Synthese von DNS-Fragmenten in vitro, bei der nach Hitzedenaturierung eines genomischen oder plasmidären Nukleotidabschnittes (Template) zwei kurze, einzelsträngige
DNS-Stücke (sense-Primer, antisense-Primer) an den jeweils entgegengesetzen Strängen
des Templates hybridisieren. Durch Zugabe von Desoxynukleotiden verlängern thermostabile DNS-Polymerasen den einzelsträngigen Bereich zwischen den Hybridisierungsstellen
der Primer. Es kommt zu einer exponentiellen Vervielfältigung der durch die eingesetzten
Primer definierten Zielsequenz durch zyklische Wiederholung von Hitzedenaturierung und
komplementärer Bindung der Primer an das Template (Hybridisierung) und ihrer Verlängerung (Elongation) entlang desselben. Bei der hier verwendeten DNS-Polymerase
handelte es sich um eine rekombinante Form der aus dem hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isolierten thermostabilen Pfu-DNS-Polymerase. Sie besitzt eine
3´-5´-Exonukleaseaktivität, d.h. sie ist in der Lage, falsch eingebaute Nukleotide in
3´-5´-Richtung wieder aus dem neu synthetisierten Strang zu entfernen. Durch diese
Korrekturaktivität (proofreading) besitzt das Enzym eine nur geringe Fehlerrate pro
41
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
eingebauter Base von ca. 1:10-6, aber auch nur eine geringe Synthesegeschwindigkeit von
ca. 550 Nukleotiden pro Minute.
Für eine PCR wurden 50 µl-Ansätze pipettiert. Sie enthielten je 5 µl 10x ThermoPolPuffer, 1 µl Template (ca. 50 ng), 1 µl sense-Primer (25 pM), 1 µl antisense-Primer
(25 pM), 2,5 µl dNTP-Mix (je 5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 38,5 µl H2O und 1 µl
Pfu-DNS-Polymerase (2 U/µl). Die Ansätze durchliefen folgendes Temperaturprogramm:
Tab. 2.1: PCR-Programm.
Die mit einem ‘*’ gekennzeichneten Schritte wurden 17 mal durchlaufen.
PCR-Schritt
Primäre Denaturierung
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Terminale Elongation
Kühlung
Temperatur / °C
95
50-60
72
95
72
4
Zeit / s
300
60
480
60
600
bis zur weiteren Verwendung
Anschließend wurden die PCR-Reaktionsansätze mit jeweils 20 U DpnI versetzt und
1 h bei 37 °C inkubiert. Nach dem Verdau der Template-DNA durch DpnI erfolgte die
Transformation von kompetenten E. coli DH5α-Zellen mit jeweils 6 µl der PCR-Ansätze.
2.2.1.9 Sequenzierung von DNS-Sequenzen
Das Prinzip der DNS-Sequenzierung beruht auf dem Kettenabbruchverfahren von
F. SANGER et al. (Sanger et al., 1977), bei der eine DNS-Polymerase-Reaktion durch den
Einbau von Didesoxynukleotiden stochastisch abgebrochen wird. Bei der automatischen
Sequenzierungsmethode sind die vier verschiedenen Didesoxynukleotide jeweils mit
einem anderen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, so dass nach der elektrophoretischen
Trennung der einzelnen ssDNS-Fragmente eine Detektion der Fragmente, die jeweils mit
ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP enden, möglich ist. Die Sequenzierung erfolgt ähnlich
einer PCR. Eine Probe der zu sequenzierenden DNS wird mit dem Sequenzierungsprimer,
ein ca. 20-25 bp langes Oligonukleotid, das den Startpunkt der Sequenzierung festlegt, und
einer Lösung, die neben den markierten ddNTPs auch dNTPs sowie eine thermostabile
DNS-Polymerase enthält, versetzt. Anschließend durchläuft der Ansatz ein Temperaturprogramm, das aus einem Denaturierungs-, einem Hybridisierungs- und einem Elongationsschritt besteht. Im Unterschied zur PCR wird die Sequenzierung mit nur einem Primer
durchgeführt, wodurch auch nur ein DNA-Strang jeweils bis zum Kettenabbruch kopiert
wird. Die Kopien können daher in den nachfolgenden Zyklen des Temperaturprogramms
nicht als Template genutzt werden.
Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Sequenzierungen wurde das „PRISM
BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction“-Kit verwendet. Jeder Reaktionsansatz enthielt mindestens 1 µg DNS-Template, 1 µl Sequenzierungsprimer (10 pM), 4 µl
Reaktions-Mix und wurde mit H2O auf 20 µl aufgefüllt. Das verwendete Temperaturprogramm ist in Tabelle 2.2 angegeben.
Nach der Sequenzierungsreaktion wurden überschüssige, mit Fluoreszenzfarbstoff
markierte ddNTPs durch eine Fällung entfernt. Dazu wurden die 20 µl-Sequenzierungsansätze mit H2O auf 100 µl aufgefüllt und für 30 min mit 10 µl 3 M Natriumacetatpuffer und
250 µl Ethanol auf Eis gefällt. Nach einer Zentrifugation (20 min, 16.000 x g, RT) wurde
42
Methoden
_________________________________________________________________________
der Überstand dekantiert und das Pellet mit 300 µl 70% (v/v) Ethanol durch kurzes
Schwenken gewaschen. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt (10 min, 16.000 x g,
RT) wurde der Überstand dekantiert, Lösungsmittelreste vorsichtig abgesaugt und das
Pellet im Dunkeln an der Luft getrocknet. Die Proben wurden anschließend von U. COJA
(Abt. Spezielle Botanik, Universität Osnabrück) mit Hilfe eines Sequenziergeräts
sequenziert.
Tab. 2.2: Sequenzierungs-Programm.
Die mit einem ‘*’ gekennzeichneten Schritte wurden 30 mal durchlaufen.
Sequenzierungsschritt
Primäre Denaturierung
Hybridisierung*
Elongation*
Denaturierung*
Terminale Elongation
Kühlung
Temperatur / °C
96
50
60
96
72
4
Zeit / s
60
15
240
30
300
bis zur weiteren Verwendung
2.2.1.10Komplementationstest
Mit dem Komplementationstest wurde auf Mangel- und Vollmedien das Wachstum von
DK8-Kulturen, die die erzeugten Plasmide enthielten, überprüft. Dazu wurden Einzelkolonien der Mutanten sukzessiv auf einer Succinat-, Glucose- und LB-Mediumplatte ausgestrichen. Als Positivkontrolle diente ein DK8-Stamm mit dem EF1-Plasmid pKH7, als
Negativkontrolle dienten DK8-Zellen ohne Plasmid.
2.2.2
Biochemische Methoden
2.2.2.1 Zellanzucht von DK8-Zellen
Die Zellanzucht wurde von G. HIKADE (Abt. Biophysik, Universität Osnabrück) durchgeführt. Für die Anzucht von plasmidhaltigen DK8-Zellen wurden 50 µl ampicillinhaltiges
LB-Medium mit 50 µl einer entsprechenden Stammkultur angeimpft und für 8 h bei 37 °C
aerob auf einem Schüttelinkubator (ca. 200 upm) inkubiert. Mit 10 ml dieser Kultur wurde
1 l ampecillinhaltiges Mangelmedium angeimpft und üN bei 37 °C aerob inkubiert. Diese
Vorkultur diente dem Animpfen von 12 l Hauptkultur. Die Hauptkultur bestand aus
12 x 1 l Mangelmedium, die mit der Vorkultur bis zu einer OD600 von 0,1 angeimpft
wurde. Die Zellen wurden über Tag bei 37 °C aerob inkubiert und bei einer OD600 von
mindestens 0,8 geerntet. Die Bakterien wurden pelletiert (15 min, 4.000 x g, 4 °C) und in
100 ml Puffer 1 pro 20-25 g Biofeuchtmasse resuspendiert und homogenisiert. Zu der
Suspension wurde eine Proteaseinhibitortablette pro 20-25 g Biofeuchtmasse gegeben.
Eine Anzucht lieferte etwa 20-25 g Biofeuchtmasse. Diese Bakteriensuspension wurde mit
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert.
43
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
2.2.2.2 Präparation von EFOF1-Komplexen
Die Isolierung und Präparation von EF1-Komplexen aus DK8-Zellen wurde von J. G. WISE
(Wise, 1990) beschrieben und von G. HIKADE (Abt. Biophysik, Universität Osnabrück)
vorgenommen. Das Protokoll wurde mit einigen Abwandlungen für die Aufreinigung von
EFOF1-Komplexen verwendet. Nach dem Auftauen der Bakteriensuspension und der
Zugabe einer Spatelspitze DNase wurden die Zellen in 1-2 Zyklen in einer French-Press
bei einem Druck von 138.000 kPa und einer Temperatur von 4 °C aufgeschlossen und die
Zelltrümmer abzentrifugiert (20 min, 25.000 x g, 4 °C). Der Überstand wurde erneut zentrifugiert (60 min, 235.000 x g, 4 °C) und das membranhaltige Pellet in 100 ml Waschpuffer pro 20 g Biofeuchtmasse resuspendiert und homogenisiert. Das Homogenisat wurde für
30 min im Eisbad gerührt und danach zentrifugiert (60 min, 235.000 x g, 4 °C). Das Pellet
wurde anschließend in 100 ml Waschpuffer aufgenommen, 30 min im Eisbad gerührt und
zentrifugiert (90 min, 235.000 x g, 4 °C). Nach Resuspension des Pellets in Lagerungspuffer bis zu einer Endkonzentration von 30 mg/ml wurde die Membransuspension in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
Für die Extraktion der Proteine wurden 8 ml der Suspension in Extraktionspuffer aufgenommen, so dass die Endkonzentration 5 mg/ml betrug. Die Lösung wurde auf Eis gerührt
und tröpfchenweise mit einer 25%igen (w/v) N-octyl-β-D-glycopyranoside-Lösung (OG)
versetzt bis zu einer Konzentration von 1% OG. Nach einer 15 minütigen Inkubationszeit
unter Rühren auf Eis wurden die OG-Konzentration tröpfchenweise auf 2,2% erhöht und
die Lösung für weitere 30 Minuten auf Eis gerührt. Danach wurde sie für 90 Minuten bei
108.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Der EFOF1-haltige Überstand wurde mit 20 µl einer
1 mg/ml Avidin-Stammlösung versetzt, 30 min bei 4 °C inkubiert und anschließend mit
Puffer Streptactin A verdünnt, bis die OG-Konzentration nur noch 1% betrug. Das Avidin
diente dem Binden von freiem Biotin, damit dieses die nachfolgende Reinigung über eine
Streptactin-Säule nicht störte. Dazu wurde die Lösung mit 5 ml Puffer Streptactin A-äquilibriertem Streptactin-Sepharosematerial mit einem Streptactingehalt von 5 mg/ml versetzt,
30 min bei RT auf einem Schüttler inkubiert und anschließend auf eine leere NAP-10
Säule gegeben. Das Säulenmaterial wurde mit 5 ml Puffer Streptactin A mit 1% (w/v) OG
gewaschen und mit 10 ml Puffer Streptactin A mit 2,5 mM Desthiobiotin in 0,5 ml Fraktionen eluiert. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Der Proteingehalt lag
üblicherweise bei etwa 0,24 mg/ml. Das Eluat wurde entweder direkt für SDS-Gele,
Immu- noblotts und Aktivitätstests oder im Rotationsassay eingesetzt oder zur späteren
Verwendung im Rotationsassay mit 70% Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei -80 °C gelagert.
2.2.2.3 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Die Proteinkonzentration von Proben wurde nach der von J. J. SEDMAK und S. E. GROSSBERG (Sedmak und Grossberg, 1977) beschriebenen Methode bestimmt. Die Methode
beruht auf der unspezifischen Anlagerung des sauren Farbstoffs Coomassie Brilliantblau
G 250 an kationische und unpolare Aminosäurereste.
Proteinhaltige Lösungen wurden mit Wasser auf 500 µl aufgefüllt und mit 500 µl
S+G-Reagenz versetzt. Die Absorption der Probe bei 595 nm gegen einen Leerwert wurde
spektrophotometrisch gemessen. Die Kalibrierung erfolgte durch die Messung einer
Eichkurve mit Lysozym in einem Konzentrationsbereich von 5-40 µg/ml.
44
Methoden
_________________________________________________________________________
2.2.2.4 Bestimmung von ATP-Hydrolyseaktivitäten
Bei der ATP-Hydrolyse wird in Abhängigkeit von der ATP-Synthase Aktivität Phosphat
freigesetzt, dessen Konzentration nach D. LEBEL (LeBel et al., 1978) spektrophotometrisch
gemessen werden kann. Das Verfahren beruht auf der Reduktion des entstandenen Phosphomolybdat-Komplexes durch p-Methyl-Aminosulfat in einem Kupferacetat-Puffer.
Die zu vermessenden Proben wurden auf eine Proteinkonzentration von 0,01 mg/ml
verdünnt. 10 µl, 20 µl und 30 µl der Proben wurden mit Wasser auf 400 µl aufgefüllt.
Nach der Zugabe von 100 µl Testlösung wurden die Reaktionsansätze in einem Wasserbad
5 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 500 µl eiskalter, 0,5 M
(w/v) TCA und Inkubation in einem Eisbad gestoppt. Anschließend wurden 500 µl LeBelReagenz, das aus der Lösung A, der Lösung B und der Lösung C in einem Verhältnis von
6:1:1 bestand, in die Proben pipettiert. Die Absorption der Proben (A745) wurde gegen
einen Leerwert spektrophotometrisch bei 745 nm in einem Bereich von 0,1-0,5 gemessen.
Die Absorption von 1 µmol Pi (A*745) wurde durch die Messung einer K2HPO4 Standardkurve in einem Konzentrationsbereich von 0,022-0,175 µM ermittelt. Die spezifische
ATP-Hydrolyseaktivität a (U/mg) in Abhängigkeit von der eingesetzten Proteinmenge x in
µg und auf 1 min bezogen berechnete sich nach Gleichung 2.1.
A
$200
a = A745
& $x
745
Gl. 2.1
2.2.2.5 SDS-Polyacrylgelelektrophorese
Proteine lassen sich in einer SDS-Polyacrylgelelektrophorese (SDS-PAGE) entsprechend
ihrer Molmasse auftrennen und anschließend mittels Coomassie Brilliantblau R 250 quantitativ färben.
Proben, die ca. 60 µg Protein enthielten, wurden durch die Zugabe von 10% TCA (w/v)
während einer mindestens einstündigen Inkubation bei 4 °C präzipitiert. Das Präzipitat
wurde mindestens 10 min bei 14.000 upm und 4 °C in einer Tischzentrifuge zentrifugiert.
Das Pellet wurde in 1 ml eiskaltem Aceton gewaschen und anschließend unter gleichen
Bedingungen nochmals zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der luftgetrocknete Niederschlag in 20 µl Probenpuffer aufgenommen und 4 min gekocht.
Für die Verwendung des Laemmli-Systems (Laemmli, 1970) wurden 6-12 µg Protein
auf einem 5%igen Sammelgel aufgetragen und in einem 12,5%igen Trenngel getrennt. Die
Trennung erfolgte für 1 h bei 200 V in einer mit Elektrodenpuffer gefüllten
Elektrophoresekammer.
Die Färbung der Gele erfolgte üN in einer Gel-Färbelösung. Überschüssiger Farbstoff
wurde durch Waschen in Gel-Entfärbelösung entfernt.
2.2.2.6 Immunoblot
Im Immunoblot (Western Blot) werden elektrophoretisch aufgetrennte Proteine immunochemisch selektiv nachgewiesen. Dazu wurden die Proteine zunächst von einem SDS-Polyacrylamidgel auf eine Polyvinylidendiflouridmembran (PVDF Western Blotting
Membrane) gleicher Größe übertragen. Die zuvor mit Methanol aktivierte PVDF-Membran und das SDS-Gel, sowie Filterpapier und Schwammtücher wurden für 15 min in
Transferpuffer äquilibriert. Anschließend wurden die Membran und das Gel luftblasenfrei
aufeinandergelegt, zwischen zwei Filterpapieren und Schwammtüchern geklemmt und in
45
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
einen mit Transferpuffer gefüllten Transfertank nach Angaben des Herstellers eingesetzt.
Der Transfer erfolgte für 60 min und 500 W bei 4 °C. Danach wurde die Membran für
etwa 60 min bei RT in Blockpuffer inkubiert, um nicht mit Protein besetzte Stellen mit
Magermilchpulver zu blockieren.
Der Nachweis der Proteine erfolgte durch die Zugabe von spezifischen, an eine Untereinheit bindenden Antikörpern. Als primäre Antikörper dienten in Blockpuffer verdünnte
(1:800 bis 1:200.000, Kap. 3), polyklonale Maus-Antikörper (anti-a, anti-b, anti-c, anti-α,
anti-β, anti-δ, anti-ε: J. GREIE, Abt. Mikrobiologie, Universität Osnabrück; anti-γ: S. D.
DUNN, Dept. of Biochemistry, University of Western Ontario). Die PVDF-Membran wurde
üN bei 4 °C mit den Antikörpern inkubiert. Zur Entfernung überschüssiger Antikörper
wurde die Membran zehnmal für je 10 min mit Waschpuffer gewaschen. Anschließen
wurde der 1:10.000 in Blockpuffer verdünnte, sekundäre und monoklonale anti-Maus-Antikörper zugegeben. Nach einer Inkubationsdauer von 60 min bei RT wurde die Membran
erneut zehnmal für je 10 min mit Waschpuffer mit 0,05% Tween 20 gewaschen. Für die
Detektion des sekundären Antikörpers wurde die Membran für 1 min in „Lumi-LightPlus
Western Blotting“-Reagenz (Substrat 1 + 2) geschwenkt. Der sekundäre Antikörper war an
eine Meerrettich-Peroxidase aus dem „Plus Western Blotting“-Kit konjugiert. Diese setzte
das in dem Blotting-Reagenz enthaltene Substrat unter Lichtemission um. Die Chemielumineszenz wurde mit einem photosensitiven Film in einen Zeitraum von 2-60 s detektiert.
Die Negativentwicklung erfolgte in einem Entwickler.
2.2.2.7 Präparation von farbstoffmarkiertem F-Actin
Actin kann in zwei Formen vorliegen, entweder als globuläres, 42 kDa großes Monomer
(G-Actin), oder als filamentöses Polymer (F-Actin). Actinfilamente haben einen Durchmesser von etwa 8 nm, während ihre Länge variiert. Unter physiologischen Bedingungen
polymerisiert G-Actin unter Beteiligung von ATP zu F-Actin in einem tretmühlenartigen
Prozess. Die Geschwindigkeit der Polymerisation richtet sich nach der Geschwindigkeit,
nach der am Plus-Ende Monomere angelagert und am Minus-Ende Monomere abgespalten
werden. Die Dissoziation von G-Actin wird durch Phalloidin aus dem Knollenblätterpilz
Amanita phalloides inhibiert.
Die in dem Rotationstest verwendeten Actinfilamente wurde aus Kaninchenmuskelzellen nach einer von J. D. PARDEE und J. A. SPUDICH (Pardee und Spudich, 1982) beschriebenen Methode gewonnen. Als Ausgangsmaterial zur Isolierung von Actin diente Muskelacetonpuder, das von G. HIKADE (Abt. Biophysik, Universität Osnabrück) bereitgestellt
wurde. Zunächst wurden 10 g Acetonpuder, das bei -80 °C gelagert wurde, üN aufgetaut,
in 200 ml Puffer G2 resuspendiert und 40 min bei RT gerührt. Danach wurde die Suspension zentrifugiert (30 min, 108.000 x g, 4 °C), und der Überstand mit 100 mM KCl und
5 mM MgCl2 versetzt und für 2 h bei RT gerührt. Dabei polymerisierte G-Actin zu
F-Actin. Anschließend wurde KCl bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mM dazugegeben und die Probe für 2 h bei 108.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die F-Actin enthaltenden
Pellets wurden in einer möglichst geringen Menge Überstand resuspendiert und homogenisiert. In einer anschließenden Dialyse gegen Puffer G2 bei 4 °C für 18 h (Wechsel des
Puffers alle 4 h) wurde das F-Actin wieder in G-Actin überführt. Reste an F-Actin wurden
abzentrifugiert (1 h, 108.000 x g, 4 °C) und der Überstand bei -80 °C gelagert. Es wurden
etwa 40 mg G-Actin pro 10 g Acetonpuder gewonnen.
H. KENNEWEG (Abt. Biophysik, Universität Osnabrück) führte die Biotinylierung von
gereinigtem G-Actin durch. Etwa 10 mg aufgetautes G-Actin wurden in 1 ml Puffer G
46
Methoden
_________________________________________________________________________
aufgenommen, 1 min im Ultraschallbad behandelt und durch Gelfiltration über eine
NAP10-Säule gegen Puffer G von DTT gereinigt. Das Eluat wurde mit einem 6-fachen
molaren Überschuss an Biotin-PEAC5-Maleimid versetzt und für 3,5 h bei RT inkubiert.
Überschüssiges Biotin-PEAC5-Maleimid wurde durch Dialyse gegen 2 l Puffer G üN bei
4 °C und anschließender zweifacher Gelfiltration über eine NAP10- und eine PD10-Säule
gegen Puffer G entfernt. Das biotinylierte G-Actin wurde in 50 µl-Aliquots
(0,6-0,7 mg/ml) bei -80 °C gelagert.
Die Polymerisation von G-Actin zu F-Actin erfolgte in einem aufgetauten Aliquot nach
der Zugabe von 20 mM MOPS/KOH (pH 7,0), 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 und einer
äquimolaren Konzentration an in Methanol gelöstem Phalloidin-Tetramethylrhodamin-Bisothiocyanat (PTMR) bei 4 °C während einer mindestens dreistündigen Inkubation im
Dunkeln. Es wurden etwa 200-250 PTMR-Moleküle pro µm an das Actinfilament gebunden. Die Probe wurde bei 4 °C lichtgeschützt gelagert und konnte für etwa für 4-5 Wochen
verwendet werden.
2.2.2.8 Erstellung eines Homologiemodells für EF1
Das Modell von EF1 basiert auf den Daten der Kristallstruktur von MF1, die von
J. P. ABRAHAMS et al. (Abrahams et al., 1994) gemessen wurde. Das Homologiemodell
wurde mit den Programmen WhatIf (Vriend, 1990) und O (Jones et al., 1991) von
S. ENGELBRECHT (Abt. Biochemie, Universität Osnabrück) erstellt. Die Koordinaten des
Modells (1bmf) sind online verfügbar (http://www.biologie.uni-osnabrueck.de/Biophysik/
Engelbrecht/se/data/ef1). Die Sequenz des bovinen Enzyms wurde mit der von E. coli
abgeglichen (Abb. 2.2). Die in dieser Arbeit dargestellten Strukturen wurden mit dem
Programm ‘Rasmol’ erstellt.
Abb. 2.2: Sequenzvergleich der Untereinheiten α und γ von MF1 und EF1.
Die Striche kennzeichnen die Aminosäuren, die in dieser Arbeit durch Cysteine ersetzt
wurden.
2.2.3
Rotationsassay
Die Rotation der Rotoruntereinheiten relativ zu den Statoruntereinheiten der F-ATP-Synthase wurde in einem Rotationsassay nachgewiesen und mikrovideographisch aufgezeichnet. Hierzu wurden EFOF1-Komplexe mittels His-tags in den β-Untereinheiten auf dem
47
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
Boden einer Durchflussküvette immobilisiert, während ein fluoreszierendes Actinfilament
oder Quantum-Dot dotiertes Magnetpartikel über Streptactin und einen Strep-tag in den
c-Untereinheiten an den c-Ring gekoppelt wurde. Die Rotation von Filamenten und Partikeln konnte unter Zugabe von ATP fluoreszenzmikroskopisch beobachtet und videographisch aufgezeichnet werden. Die Filamente hatten unter dem Mikroskop eine durch die
Lichtbeugung bedingt Breite von 400 nm.
2.2.3.1 Aufreinigung von Magnetpartikeln
Streptactin beschichtete, paramagnetische Magnetpartikel wurden vor den Versuchen nach
ihrer Größe selektiert. Der Durchmesser der verwendeten Partikel sollte 1 µm nicht übersteigen. Zur Aktivierung wurden 50 µl einer homogenen Magnetpartikel-Suspension
(0,05 mg/µl) in einer Tischzentrifuge für 3 min bei 4 °C mit 10.000 x g zentrifugiert. Das
Pellet mit den Magnetpartikeln wurde nach Angaben des Herstellers dreimal mit 0,1 ml/mg
MagBuffer A gewaschen und in 0,05 ml/mg MagBuffer W/l äquilibriert („MagStrep“-Kit).
Nach einer weiteren Zentrifugation (3 min, 10.000 x g, 4 °C) wurde das Pellet in 50 µl/mg
Puffer MD aufgenommen. Für die Größenselektion wurden die äquilibrierten Magnetpartikel fünffach in Puffer MD verdünnt und abzentrifugiert (3 min, 10.000 x g, 4 °C). Das
Pellet wurde in 1 ml Puffer MD resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension für
2 min bei RT in einem Ultraschallbad inkubiert und für ca. 10 s zentrifugiert. Der Überstand mit den kleinen Magnetpartikeln wurde abgenommen und erneut zentrifugiert (3
min, 10.000 x g, 4 °C). Die pelletierten, kleinen Magnetpartikel wurden in 500 µl Puffer
MD aufgenommen und für 2 min im Ultraschallbad behandelt. Sie konnten für eine Woche
bei 4 °C gelagert werden. Direkt vor der Verwendung wurden die Magnetpartikel-Stammlösung nochmals für 1 min in einem Ultraschallbad behandelt, um aggregierte Partikel zu
trennen.
2.2.3.2 Herstellung von Durchflussküvetten
Für den Rotationstest wurden Durchflussküvetten benötigt. Die Grundfläche der Küvetten
bestand aus einem 26 x 76 mm² großen Deckglas mit einer Dicke von 0,15 mm. Die Deckgläser wurden zunächst 30 min in einer 2%igen Hellmanex-Lösung bei 40 °C in einem
Ultraschallbad gereinigt. Anschließend wurden die Deckgläser getrocknet bevor sie für
20 min einem Argonplasma ausgesetzt wurden. Das Argonplasma wurde in einer Kammer
in einem Argonplasma-Reiniger erzeugt. Dazu wurde als erstes der Druck in der Kammer
mittels einer Vakuumpumpe auf 10 Pa abgesenkt. Als nächstes wurde langsam Argongas
bis zu einem Druck von 30 Pa in die Kammer geleitet. Das Gas wurde durch eine Heizspirale gezündet, es bildet sich ein Argonplasma, das wie ein Sandstrahlgebläse auf die Glasplatten wirkte. Die Prozedur diente der Reinigung der Deckgläser von Schmutz und fluoreszierenden Teilchen. Auf einen gereinigtes Deckglas wurden zwei ca. 36 mm lange,
beidseitig haftende Photofilmstreifen (Dicke: 0,08 mm) geklebt, so dass zwischen ihnen
ein Kanal von ca. 3 mm Breite parallel zur Längsseite des Deckglases entstand. Auf die
Klebestreifen wurde ein 26 x 26 mm² großes Deckglas (Dicke: 0,15 mm) aufgesetzt. Der
so entstandene Kanal konnte ein Volumen von ca. 10 - 20 µl fassen.
48
Methoden
_________________________________________________________________________
2.2.3.3 Beladung von Durchflussküvetten
Die Beladung der Durchflussküvetten erfolgte, indem Lösungen auf einer Seite in den
Kanal pipettiert und auf der anderen Seite des Kanals mit einem Filterpapier abgesaugt
wurden. Wenn nicht anders beschrieben, wurden im Rotationsassay alle Chemikalien in
Puffer MD verdünnt und auf Eis gelagert. Die Beladung der Durchflussküvetten mit den
verschiedenen Lösungen erfolgte bei ca. 19 °C mit einer jeweils 4 minütigen Inkubationszeit und anschließender Spülung mit Puffer MD (Tab. 2.3). Die Spülungen dienten dem
Entfernen nicht gebundener Komponenten.
Zunächst wurden die Küvetten mit einer 0,8 µM Ni-NTA-HRP-Lösung beschichtet. Die
Ni-NTA-Funktion der Meerrettich-Peroxidase diente als Anker für EFOF1. Die Essigsäurereste und die N-terminalen His-tags der β-Untereinheiten komplexierten mit dem Nickelion (Abb. 2.3).
Abb. 2.3:
Komplexierung
von
His-tags
mit
der
Ni-NTA-HRP.
Die
Meerrettich-Peroxidase
bindet an die Oberfläche der
Durchflussküvette. Die drei
Essigsäurereste
komplexieren
über ein zentrales Ni2+-Atom
zwei Histidine der His-tags in
den .
Nicht von der Meerrettich-Peroxidase belegte Bindungsstellen für Proteine auf der
Glasoberfläche wurden anschließend von BSA in MKM Puffer (10 mg/ml) blockiert. In
den nächsten Schritten wurden zunächst 3-8 µg/ml EFOF1, danach 0,5 µM Streptactin und
abschließend 200 nM F-Actin in die Küvette pipettiert. Das Streptactin band an den C-terminalen Strep-tag der c-Untereinheiten von EFOF1. Das biotinylierte und fluoreszenzmarkierte Actinfilament wiederum band an Streptactin. Das F-Actin wurde zuvor mehrmals
mit einer 200 µl Pipette pipettiert. Durch die so erzeugten Scherkräfte wurden die Filamente auf eine Länge von ca. 0,4-1,0 µm verkürzt. Durch die sukzessive Beladung der
Küvetten wurde die korrekte Bindung der verschiedenen Komponenten sichergestellt und
überschüssiges Material weggespült. Die Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Komponenten war dabei zwingend notwendig. Wurde sie verändert oder wurden einzelne Komponenten weggelassen, konnten keine rotierenden Filamente beobachtet werden. Der
Versuchsaufbau stellte somit auch eine Kopplungskette dar und zeigte, dass sich die Actinfilamente nicht zufällig drehten (Abb. 2.4).
Abschließend wurde eine 50-5000 µM ATP enthaltende Reaktionslösung in die Küvette
pipettiert. Die Reaktionslösung enthielt außerdem 20 mM Glucose, 0,2 mg/ml GlucoseOxidase und 50 µg/ml Katalase. Diese Komponenten eliminierten den freien Sauerstoff in
der Reaktionslösung (Gl. 2.2-2.3). Dieser würde ansonsten eine schnelle Oxidation und
Bleichung des Fluoreszenzfarbstoffs TMR bewirken. Des Weiteren enthielt die Reaktionslösung 0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol, ein Reduktionsmittel welches das Ausbleichen von
TMR wesentlich verlangsamte.
49
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
Glucose-Oxidase: β-D-Glucose + O2
→ D-Glucono-D-lacton + H2O2 Gl. 2.2
Katalase:
H2 O 2
↔ H2O + ½ O2
Nettoreaktion:
β-D-Glucose + ½ O2
↔ D-Glucono-D-lacton + H2O Gl. 2.4
Gl. 2.3
Abb. 2.4: Aufbau des Rotationsassays.
Die Beladung der Durchflussküvetten im Rotationsassay erfolgte sukzessiv mit Ni-NTAHRP (grün), BSA (gelb), F-ATP-Synthase (blau: Statoruntereinheiten, rot: Rotoruntereinheiten), Streptactin (hellgelb) und F-Actin (orange). Das Actinfilament bindet an mehrere
Streptactin-Moleküle bzw. Strep-tags. In Gegenwarte von ATP drehte sich der Enzym-Filament-Komplex gegen den Uhrzeigersinn von der Membranseite des Enzyms aus betrachtet.
Niedrige ATP-Konzentrationen in der Reaktionslösung (< 1 mM) wurden durch die
Zugabe von 0,2 mg/ml Kreatin-Kinase und 2,5 mM Kreatinphosphat konstant gehalten.
Die Kreatin-Kinase regeneriert ATP aus ADP und Kreatinphosphat (Gl. 2.5).
Kreatin-Kinase:
Kreatinphosphat + ADP ↔ Kreatin + ATP
Gl. 2.5
Je nach Versuchsansatz wurden die Küvetten mit weiteren Reaktionslösungen gespült.
Dabei wurde die Position der Durchflussküvette nicht verändert und das selbe Actinfilament im Fokus gehalten.
Um ADP-inhibierte EFOF1-Komplexe zu beobachten, wurden 5 mM ADP und 1 U/ml
Hexokinase zu einer Reaktionslösung gegeben, die kein ATP, kein Kreatinphosphat und
keine Kreatin-Kinase enthielt (ADP-Reaktionslösung). Hexokinase wandelt ATP in
Gegenwart von Glucose in ADP und Glucose-6-Phosphat um (Gl. 2.6), wodurch jegliches
ATP in der Lösung eliminiert wurde.
Hexokinase:
β-D-Glucose + ATP → β-D-Glucose-6-Phosphat + ADP Gl. 2.6
Zur Oxidation von cysteinhaltigen EFOF1-Komplexen wurde das 2-Mercaptoethanol in
der Reaktionslösung durch 2 mM DTNB ersetzt, das zuvor frisch in DMSO gelöst und bei
RT gelagert wurde (Oxidationslösung). Durch das DTNB blich der Fluoreszenzfarbstoff
sehr schnell aus. Um das Bleichen zu verlangsamen, wurde die Lichtintensität im
50
Methoden
_________________________________________________________________________
Mikroskop mittels einer Blende verringert und das TMR-markierte Actinfilament nur kurzzeitig zwischen längeren Dunkelphasen belichtet. Dadurch war es möglich, das Filament
im oxidierten Zustand über einen Zeitraum von bis zu 10 min zu beobachten, wobei die
Nettobelichtungs- und Aufnahmezeit allerdings nur etwa 30-60 s betrug.
In einigen Experimenten wurden mit Streptactin beschichtete Magnetpartikel an Stelle
von Actinfilamenten an die Enzyme gekoppelt. Dabei wurden die Küvetten nach der Beladung mit den EFOF1-Komplexen für 20 min mit 50 µl einer zehnfach verdünnten Magnetpartikel-Stammlösung inkubiert. Zur Markierung der Partikel wurden anschließend 50 µl
einer 1:2·106 verdünnten Quantum-Dot-Lösung in die Küvette pipettiert und für 20 min
inkubiert. Die Quantum-Dots waren biotinyliert und konnten so an die Streptactin
beschichteten Magnetpartikel binden. Das Emissionsmaximum der Quantum-Dots lag bei
565 nm. Besonders gut wurden sie durch kurzwelliges Licht angeregt. Abschließend wurde
die Reaktionslösung wie oben beschrieben dazugegeben.
Die Enzym-Magnetpartikel-Komplexe wurden magnetisch gedreht. Dazu wurde über
der Küvette ein schwaches, in Hydrolyserichtung rotierendes Magnetfeld angelegt. Das
Magnetfeld wurde durch zwei Stabmagneten erzeugt und mit einem Schrittmotor gedreht.
Der Motor machte 200 Schritte pro Umdrehung, verweilte 20 ms zwischen jedem Schritt
und wurde mit einem Matlab-Programm (Kap. 7.2.2) gesteuert.
Tab. 2.3: Beladungsschema der Durchflussküvetten.
Volumen /µl
25
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Komponente
Inkubationszeit /min
0,8 µM Ni-NTA-HRP in Puffer MD
4
Puffer MD
Spülung
Puffer BMKM
4
Puffer MD
Spülung
4 µg/ml EFOF1-Komplex in Puffer MD
4
Puffer MD
Spülung
0,5 µM Streptactin in Magnetpartikel 1:10
4 / 20
Puffer MD
in Puffer MD
Puffer MD
Puffer MD
Spülung
6
7 / 20
200 nM F-Actin in Quantum-Dots 1:2·10
Puffer MD
in Puffer MD
Puffer MD
Puffer MD
Spülung
Reaktionslösung in Puffer MD
sofortige Messung
Puffer MD
Spülung
ADP-Reaktionslösung in Puffer MD
sofortige Messung
Puffer MD
Spülung
Oxidationslösung in Puffer MD
Messung nach 4-5 min
51
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
2.2.3.4 Fluoreszenzvideomikroskopie
Zur Beobachtung von fluoreszierenden Actinfilament/Magnetpartikel-Enzym-Komplexen
wurde ein inverses Fluoreszenzmikroskop (IX70) benutzt. Die Durchflussküvetten wurden
in einem Mikroskoptisch eingespannt und gegen Verrutschen gesichert. Als Lichtquelle
diente eine 100 W Quecksilberdampflampe. Das Licht passierte eine Blende und eine
Sammellinse, bevor es auf den Filterkubus U-MWIG traf. Der Filterkubus bestand aus
einem Anregungsfilter (BP520-550), einem dichroitischen Teilerspiegel (DM565) und
einem Sperrfilter (BA580IF), sein Transmissionsspektrum ist in Abb. 2.5 gezeigt. Der
Anregungsfilter selektierte Licht der Wellenlängen 520-550 nm, das über den dichroitischen Teilerspiegel durch das Öl-Immersionsobjektiv (Vergrößerung: 100x, Apertur: 1,4)
in die Probe gelenkt wurde. Dort regte es den Fluoreszenzfarbstoff TMR an (Abb. 2.6).
Das Anregungsmaximum von PTMR liegt im Bereich von 540-545 nm, das Emissionsmaximum im Bereich von 570-573 nm. Das Emissionslicht passierte im Filterkubus den
dichroitischen Spiegel und den Sperrfilter, kurzwelligeres Licht wurde vom Sperrfilter
absorbiert. Danach passierte das Licht weitere Linsen und wurde von einem Spiegel auf
ein Photoprojektiv reflektiert, dass das Bild auf den CMOS-Chip einer digitalen Kamera
projektierte. Der Strahlengang im inversen Fluoreszenzmikroskop ist in Abb. 2.7 skizziert.
Die Gesamtvergrößerung betrug 150x (Objektiv: 100x, Linse: 0,3x, Photoprojektiv: 5x) für
die Kamera oder 2900x auf dem Monitor. Das Beobachtungsfeld hatte eine Größe von
54 x 42 µm². Die Bilder wurden mit einem VHS-PAL Videorekorder mit einer Geschwindigkeit von 25 Bildern/s (entsprechend 1 Bild pro 40 ms) aufgezeichnet.
Abb. 2.5: Transmissionsspektrum des
Filterkubus U-MWIG.
Die drei Elemente des Filterkubus sind
der Anregungsfilter (BP520-550, rot), der
dichroitische Teilerspiegel (DM565,
grün) und der Sperrfilter (BA580IF,
blau).
Abb. 2.6: Strukturformel von TMR.
52
Methoden
_________________________________________________________________________
Abb. 2.7: Strahlengang im inversen Fluoreszenzmikroskop.
Das weiße Licht der Quecksilberdampflampe passiert mehrere Linsen und eine Blende und
trifft dann auf den Filterkubus. Dieser lässt nur Anregungslicht im grünen Wellenlängenbereich passieren und lenkt es durch das Objektiv in die Küvette. Rotverschobenes Fluoreszenzlicht passiert den Filterkubus, verschiedene Linsensysteme und wird schließlich von
dem CMOS-Chip der Kamera detektiert.
2.2.3.5 Digitalisierung von Videosequenzen
Die Digitalisierung der Videosequenzen erfolgte mit einer Videokarte und dem Programm
‘Premiere 6.0’ in das avi-Format (Microsoft RLE codec) mit einer Bildrate von
25 Bildern/s. Für die weitere Analyse wurden die Filmsequenzen als Einzelbilder im
Windows-Bitmap-Format mit einer Farbtiefe von 8 bit gespeichert. Die quadratischen
Bilder hatten eine Kantenlänge von 32 Bildpunkten. Unscharfe und verrauschte Bilder
wurden manuell ausselektiert, da diese Bilder das Auswerteprogramm gestört hätten.
2.2.3.6 Auswertung von Einzelbildsequenzen
Die digitalisierten Einzelbildsequenzen wurden Bild für Bild mit einer Auswertroutine
analysiert. Das Programm wurde mit ‘Matlab 7.0’ geschrieben und ist im Anhang zusammen mit den anhängigen Funktionen und Scripten wiedergegeben (Kap. 7.2.3-7.2.8).
Nach der manuellen Vorgabe der Startparameter mittelte das Programm die Helligkeit
jedes einzelnen Bildpunkts über die gesamte Bildsequenz. Da der Rotationsmittelpunkt des
fluoreszierenden Actinfilaments in jedem Bild am selben Ort lag, erschienen die Punkte in
diesem Ausschnitt in dem übereinander gelagerten Bild heller als die Punkte des rotierenden Abschnitts des Filaments oder des Hintergrunds. Diese Eigenschaft nutzte das
Programm für die Bestimmung des Rotationsmittelpunkts, in dem es in diesem Ausschnitt
nach dem hellsten Ort suchte. Alternativ konnte der Rotationsmittelpunkt auch manuell
53
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
festgelegt werden. Irregulär rotierende Actinfilamente erschienen in dem gemittelten Bild
als gräuliche Scheibe (Abb. 2.8A, A’). Im Gegensatz dazu waren bei den schrittweise
rotierenden oder blockierten Filamenten die Haltepositionen deutlich sichtbar
(Abb. 2.8B, B’). Im nächsten Schritt wurden anhand der übereinander gelagerten Bilder
die für die Auswertung geeigneten Bildpunkte automatisch oder manuell selektiert. So
waren z.B. die Bildpunkte um den Rotationsmittelpunkte für die Auswertung nicht geeignet, da sie dem Programm eine falsche Lage des Filaments vorgetäuscht hätten. Danach
wurde der Kontrast der Einzelbilder erhöht und ein Grenzwert für die Helligkeit festgelegt,
der die hellen, dem Filament zugeordneten Bildpunkte von dem dunklen Hintergrund
abgrenzte. Anschließend erfolgte für jedes Einzelbild der Sequenz die Analyse der positiv
selektierten Bildpunkte mit einem Helligkeitswert über dem Grenzwert (Abb. 2.9).
Entsprachen in einem Bild weniger als sechs Bildpunkte diesen Kriterien, wurde es nicht
ausgewertet und stattdessen die Werte vom vorhergehenden Bild übernommen. Mittels
linearer Regression wurde die Richtung und der entsprechende Winkel bestimmt, in die
das Filament in einem Referenzkoordinatensystem zeigte. Dazu wurden 36 jeweils um 10°
gedrehte Koordinatensysteme eingeführt. In jedem Koordinatensystem wurde eine lineare
Regression für die relevanten Bildpunkte durchgeführt. Für das Koordinatensystem, in
dem die Summe der Fehlerquadrate den kleinsten Wert hatte, wurde die Steigung und
daraus der Winkel des Actinfilaments berechnet. Dieser Wert wurde anschließend auf das
Referenzkoordinatensystem zurückgerechnet. Die Winkelstellung des Filaments in allen
Bildern wurde in einem Histogramm mit einer Klassenbreite von 5° eingetragen. Die Rotationsbewegung wurde durch die Winkeldifferenzen aufeinander folgender Bilder ermittelt
und gegen die Zeit aufgetragen. Dabei wurden Vorwärtsdrehungen von 240° oder größer
als Rückwertsdrehungen von 120° oder kleiner interpretiert. Der Endpunkt des Filaments
wurde für jedes Bild anhand der mittleren Entfernung der vier am weitesten von Mittelpunkt entfernt liegenden Bildpunkte berechnet und auf die Regressionsgerade projektiert.
Die Länge des Filaments ergab sich aus der mittleren Entfernung aller Endpunkte vom
Mittelpunkt abzüglich des Radius des Beugungsscheibchens von 200 nm.
Nachdem die Auswertung für das rotierende Filament abgeschlossen war, konnte nach
dem gleichen Verfahren noch eine zweite Bildsequenz des gleichen Filaments im geblockten Zustand ausgewertet werden. Die Winkelpositionen des Filaments aus dieser Sequenz
wurden ebenfalls in das Histogramm eingetragen. Zeigte das Histogramm mehrere Maxima, konnten diese mit Gaußkurven angepasst und die Fitparameter abgelesen werden.
Dabei wurde das Maximum des geblockten Zustands automatisch auf einen Wert von 180°
verschoben. Alle anderen Werte wurden relativ dazu auch verschoben.
Wurde eine Verweilzeitauswertung gewünscht, ließen sich in dem Histogramm die
Winkelbereiche um die drei Maxima herum markieren, die für die Auswertung herangezogen werden sollten. Nur wenn das Filament sich in diesen Bereichen befand, wurde das
Bild in der Auswertung berücksichtigt. Somit konnten Bilder, in denen sich das Filament
von einer Position zur nächsten bewegt und nicht ruht, von der Auswertung ausgeschlossen werden. Anschließend ermittelte das Programm, wie viele Millisekunden das Filament
an einer Position verweilte, bevor es zur Nächsten voranschritt. Die Verweilzeiten wurden
schließlich in ein Histogramm mit einer Klassenbreite von 80 ms eingetragen und mit einer
exponentiellen Zerfallsfunktion erster Ordnung angepasst. Aus dem Exponenten ergab sich
die mittlere Verweilzeit.
Zuletzt wurden alle Ergebnisse in ascii-Dateien gespeichert. Mittels Kreuzkorrelation
(Kap. 7.2.1) wurden zwei Histogramme in Phase gebracht. Die anschließende Verarbeitung und grafische Darstellung der Daten erfolgte mit dem Programm ‘Origin Pro 7.5’.
54
Methoden
_________________________________________________________________________
Abb. 2.8: Gemittelte Bilder von Einzelbildsequenzen rotierender Actinfilamente.
A) Bild eines sich irregulär drehenden Filaments. B) Bild eines sich schrittweise drehenden
Filaments. A’, B’) Kontrastverstärke Bilder von A bzw. B.
Abb. 2.9:
Auswertung
Einzel- bildern.
von
Auf den kontrastverstärkten Bildern
ist das Actinfilament in Grautönen
auf schwarzem Hintergrund zu
sehen. Aus den blau markierten
Bildpunkten wird mittels linearer
Regression die Steigung und die
Winkelstellung
des
Filaments
bestimmt. Die Regressions- gerade
ist durch die rote Linie dargestellt.
Der Rotationsmittelpunkt ist durch
einen roten Kreis, der Filamentendpunkt durch einen grünen Kreis
gekennzeichnet.
55
Materialien
und Methoden
_________________________________________________________________________
2.3
Software
Bildbearbeitung
Datenauswertung
Textverarbeitung
Videobearbeitung
56
CorelDraw Graphics Suite X3, Rasmol 2.7.2.1.1
Matlab 7.0, Origin Pro 7.5
Lotus WordPro 9.8, MS Word 2003, Referenz Manager 10.0
Adobe Premiere 6.0
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
3
Ergebnisse
In dieser Arbeit habe ich mich mit zwei Schwerpunkten beschäftigt. Diese waren zum
einem die Korrelation der Kristallstrukturdaten mit dem dynamischen Verhalten der
F-ATP-Synthase und zum anderen die Bestimmung der Elastizität des Enzymkomplexes,
insbesondere der Rotoruntereinheiten. Alle Experimente wurden mit der FOF1-ATP-Synthase aus E. coli unter ATP-Hydrolyse-Bedingungen durchgeführt. Dazu wurde das Enzym
im Rotationsassay (Kap. 2.2.3) auf einem Objektträger immobilisiert, während die Rotationsbewegung durch ein an den c-Ring gekoppeltes, kurzes (0,4-1,0 µm) und mit dem
Fluoreszenzfarbstoff TMR markiertes Actinfilament im Fluoreszenzmikroskop sichtbar
gemacht wurde (Pänke et al., 2000). Da der c-Ring aus zehn c-Monomeren besteht, ist es
wahrscheinlich, dass das Filament an mehrere Monomere gebunden war. Nach Zugabe der
ATP-haltigen Reaktionslösung konnte ich gleichmäßig oder schrittweise rotierende Actinfilamente über einen Zeitraum von einigen Minuten beobachten. Die Filamente drehten
sich wie erwartet in Hydrolyserichtung, d.h. gegen den Uhrzeigersinn von der Membranseite des Enzyms aus betrachtet. Im Folgenden sind Drehungen in Hydrolyserichtung mit
positiven Gradzahlen, Drehungen in Syntheserichtung mit negativen Gradzahlen gekennzeichnet. Durch Zugabe einer ADP- oder Oxidationslösung ließ sich die Rotationsbewegung stoppen. In Abb. 3.1 ist ein solches Actinfilament gezeigt, dass sich zunächst
schrittweise dreht und anschließend durch Oxidation gestoppt wurde.
Abb. 3.1: Bildsequenz eines Actinfilamentes.
Die oberen drei Reihen zeigen die Bildfolge (40 ms/Bild) eines sich schrittweise gegen den
Uhrzeigersinn drehenden Actinfilaments (0,8 µm) bei einer ATP-Konzentration von 50 µM.
Die Schrittweite beträgt 120°. Die untere Reihe zeigt das selbe Filament nach der Zugabe
einer Oxidationslösung. Die Bewegung des Enzyms wird dadurch gehemmt und das
Filamentende zeigt nach rechts. Das feststehende, kurze Filament an der rechten Seite dient
als Fixpunkt.
Die Ausbeute an Rotatoren richtete sich nach der ATP-Konzentration, der Behandlung
der Probe und der verwendeten Mutante. Bei direkt nach der Aufreinigung untersuchten
Proteinen der Mutante SE1 haben sich bei einer ATP-Konzentration von 5 mM bis zu 10%
aller Filamente gedreht. Wurde die Probe zuvor eingefroren, die ATP-Konzentration
auf µM-Mengen gesenkt oder mit cysteinhaltigen Mutanten gemessen, sank die Ausbeute
57
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
an Rotatoren auf einige wenige Prozent, zum Teil sogar auf unter ein Prozent ab. Schrittweise rotierende Filamente waren noch seltener zu beobachten, nur etwa jeder zehnte
Rotator zeigte dieses Verhalten. Deshalb waren viele Experimentieransätze notwendig, um
eine ausreichende Anzahl von Enzymen mit den gewünschten Rotationseigenschaften zu
finden. Alle Experimente erfolgten ausschließlich an Molekülen, die mindestens fünf
ununterbrochene Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn ausgeführt hatten. Dadurch war
gewährleistet, dass die Rotationseigenschaften nur an korrekt immobilisierten und funktionstüchtigen Enzymen gemessen wurde (Winkler, 2001).
420
66
120
Umdrehungen
400
418
300
200
416
80
60
62
40
100
0
414
20
60
0
40
80
120
0
0
160
10
412
30
40
56
A
408
156
1
54
D
52
160 18
158
20
Zeit / s
22
Zeit / s
E
B
0
-120
0
+120
-120
Winkel / °
8
Y-Koordinate / Bildpunkte
20
58
410
relative Wahrscheinlichkeit
100
64
C
0
Winkel / °
+120
F
4
0
-4
-8
-8
-4
0
4
8
X-Koordinate / Bildpunkte
-8
-4
0
4
8
X-Koordinate / Bildpunkte
Abb. 3.2: Auswertung eines sich irregulär (A, B, C; dunkelrot) und eines sich
deutlich schrittweise (D, E, F; hellrot) drehenden Actinfilaments.
A, D) Gesamte Trajektorien und ein vergrößerter Ausschnitt; B, E) Histogramme der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Filamentendes; C, F) ortsabhängige Punkteverteilungen, jeder Punkt entspricht der Position des Filamentendes eines Einzelbildes. Die
ATP-Konzentration betrug jeweils 50 µM.
58
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Die Rotation von Actinfilamenten unter dem Fluoreszenzmikroskop wurde 1-3 Minuten
lang mikro-videographisch und analog aufgezeichnet. Die Filmsequenzen wurden
anschließend digitalisiert und in Einzelbilder zerlegt. Die Richtung, in die das Actinfilament vom Rotationsmittelpunkt aus zeigt, wurde für jedes Einzelbild bestimmt. Die so
berechneten Daten sind in Abb. 3.2 dargestellt. In Abb. 3.2A ist die zeitabhängige Rotation
(Trajektorie) eines sich irregulär, im Mittel kontinuierlich drehenden Actinfilaments dargestellt. Darunter ist die winkelabhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Filamentendes
als Histogramm (Abb. 3.2B) und als ortsabhängige Punkteverteilung dargestellt
(Abb. 3.2C). Das Histogramme hat eine Klassenbreite von 5°. In den Abb. 3.2D, 3.2E und
3.2F sind die entsprechenden Graphen für ein schrittweise rotierendes Filament gezeigt,
bei dem die Schrittweite 120° betrug. Die ATP-Konzentration betrug in beiden Fällen
50 µM. In den Abb. 3.2A und 3.2D ist zum einen jeweils die gesamte Trajektorie und zum
anderen ein vergrößerter Ausschnitt zu sehen. Die Steigung der beiden Geraden ist mit 2,6
bzw. 3,0 Umdrehungen/s in etwa gleich groß. Unterschiede gibt es im Sprungverhalten. In
Abb. 3.2A drehte sich das Filament irregulär ohne Pausen, nur gelegentlich blieb es an
einer 120°-Position stehen. Dagegen verweilte das Filament in Abb. 3.2D für einige millisekunden an fast jeder 120°-Position. Dieses Verhalten machte sich auch in der Form der
Histogramme und der Punkteverteilungen bemerkbar. Histogramme schrittweise rotierender Filamente haben drei ausgeprägte Maxima (Abb. 3.2E), d.h. die Punkteverteilung
konzentriert sich um drei Areale (Abb. 3.2F).
3.1
Kontrollexperimente
Es wurden verschiedene Kontrollexperimente durchgeführt, um die Relevanz der ermittelten Daten sicherzustellen. Insgesamt zeigen die folgenden Ergebnisse der Kontrollexperimente, dass die untersuchten Artefakte die Messungen nicht beeinflussten. Die
gemessenen Winkelpositionen und Breiten der Verteilungen sind somit nur durch die
Rotations- und Elastizitätseigenschaften der Enzym-Filament-Komplexe bedingt.
3.1.1
120°-Periodizität und Verweilzeiten
Die Interpretation der Daten beruht auf der Annahme, dass das Enzym während der
Rotation eine 120°-Periodizität aufweist, entsprechend der Dreier-Symmetrie des F1-Teils.
Um diese Periodizität nachzuweisen, habe ich die Bewegung schrittweise rotierender
Actinfilamente bei ATP-Konzentrationen von 5 µM bis 5 mM ausgewertet. Die Ergebnisse
sind in den Histogrammen in Abb. 3.3AI-FI dargestellt. Die Position des jeweils größten
Maximums wurde willkürlich auf -120° gelegt. Die Verteilungen wurden jeweils mit drei
Gaußfunktionen angepasst und anschließend der Abstand der Maxima zueinander berechnet. Der mittlere Abstand der Maxima zueinander betrug 120° ± 9°.
Des Weiteren wurden mit Hilfe der Trajektorien (nicht gezeigt) die Verweilzeiten der
Enzyme an den jeweils drei Stopppositionen bestimmt. Die entsprechenden Histogramme
sind in Abb. 3.3AII, AIII, AIV bis FII, FIII, FIV abgebildet. Die Daten wurden mit einer
exponentiellen Zerfallsfunktion angepasst. Die Zerfallsrate ist in den jeweiligen Graphen
angegeben und gibt die mittlere Verweilzeit an den jeweiligen Positionen an. Die Verweilzeiten variieren zwischen 0,05 s und 0,68 s. Bei einem einzelnen Enzym haben die
59
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Verweilzeiten der drei Positionen aber in etwa die gleiche Größe und variierten maximal
um den Faktor 5.
1
relative Wahrscheinlichkeit
0
1
0
1
0
1
0
1
0
1
0
-120°
AI
5 mM
BI
BIII
BIV
τ = 0,23 s
τ = 0,07 s
τ = 0,05 s
CII
CIII
CIV
τ = 0,42 s
τ = 0,48 s
τ = 0,23 s
DII
DIII
DIV
τ = 0,34 s
τ = 0,14 s
τ = 0,17 s
EII
EIII
EIV
τ = 0,40 s
τ = 0,68 s
τ = 0,52 s
FII
FIII
FIV
τ = 0,40 s
τ = 0,14 s
τ = 0,08 s
5 µM
-120
0
+120
Winkel / °
0,06
AIV
BII
50 µM
FI
+120°
τ = 0,05 s
100 µM
EI
AIII
τ = 0,05 s
500 µM
DI
0°
τ = 0,06 s
1 mM
CI
AII
0,54
1,02 0,06
0,54
1,02 0,06
0,54
1,02
Zeit / s
Abb. 3.3: Histogramme der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und
Verweilzeiten von schrittweise rotierenden Actinfilamenten bei verschiedenen
ATP-Konzentrationen.
AI, BI, CI, DI, EI, FI) Die Histogramme in der linken Spalte zeigen die Aufenthaltswahrscheinlichkeit bei ATP-Konzentrationen von 5 mM bis 5 µM. Die jeweils drei Maxima
wurden mit einer Gaußverteilung bestimmt. AII, AIII, AIV bis FII, FIII, FIV) Daneben
sind die Histogramme der jeweiligen Verweilzeiten des Actinfilaments an den drei Positionen und die über einen exponentiellen Zerfall bestimmte mittlere Verweilzeit dargestellt.
60
Kontrollexperimente
_________________________________________________________________________
rel. Wahrscheinlichkeit
Die Abb. 3.4 repräsentiert die gemittelten Daten aus den vorherigen sechs Einzelmessungen (Abb. 3.3A-F). Der Abstand der drei Maxima zueinander im Histogramm in Abb.
3.4AI beträgt 120°. Die mittlere Verweilzeit an diesen drei Positionen (Abb. 3.4AII, AIII,
AIV) beträgt 0,09 s ± 0,015 s.
1
-120°
+120°
0°
AII
AIII
AIV
τ = 0,11 s
τ = 0,08 s
τ = 0,09 s
AI
0
-120
0
Winkel / °
+120
0,06
0,54
1,02 0,06
0,54
1,02 0,06
0,54
1,02
Zeit / s
Abb. 3.4: Histogramme der gemittelte Werte der sechs Einzelmessungen
AI) Das gemittelte Histogramm aus den sechs Einzelmessungen aus Abb. 3.3 zeigt, dass die
drei Aufenthaltsmaxima eines schrittweise rotierenden Actinfilaments jeweils 120° voneinander entfernt sind. AII, AIII, AIV) Die Histogramme geben die jeweiligen Verweilzeiten
des Actinfilaments an den drei Positionen und die über einen exponentiellen Zerfall
bestimmte mittlere Verweilzeit an.
Diese Ergebnisse zeigen zum einen, dass sich die Aufenthaltspositionen symmetrisch
zueinander verhalten, und zum anderen, dass keine der drei Wartepositionen gegenüber
den beiden anderen besonders ausgezeichnet ist. Damit ist die Annahme einer Periodizität
von 120° über den gesamten Bereich der eingesetzten ATP-Konzentrationen berechtigt. Da
die enzymbedingten mittleren Verweilzeiten einige 1-100 ms (entsprechend 1-3 Einzelbildern) betrugen, ließen sie sich gut von dem ADP-inhibierten Zustand unterscheiden. Das
Enzym kann auch in Gegenwart von 5 mM ATP spontan durch ADP inhibiert werden. Die
Lebensdauer des ADP-inhibierten Zustands betrug typischerweise 10s bis zu einigen
Minuten bei 5 mM ATP. Bei der Auswertung der Daten habe ich Verweilzeiten von mehr
als 5 s (> 125 Einzelbilder) in Gegenwart von ATP nicht mit berücksichtigt, da diese die
Häufigkeitsverteilungen der aktiv rotierenden Enzyme verzerrt hätten.
3.1.2
Verankerung des Enzymkomplex auf der Oberfläche
Ein weiteres Problem kann sich durch die Verankerung des Proteins auf der Oberfläche
des Objektträger ergeben. Durch den wiederholten Wechsel von Lösungen war der
Enyzmkomplex in der Durchflussküvette Scherkräften ausgesetzt. Es ist denkbar, dass sich
der Komplex durch diese Kräfte von der Oberfläche löste und in einer anderen Orientierung wieder band, was sich in einem Versatz der Aufenthaltspositionen des Filaments
bemerkbar gemacht hätte. Diese Fehlerquelle konnte ausgeschlossen werden, indem die
Bewegung zweier schrittweise rotierender Actinfilamente vor (Abb. 3.5, rotes
Histogramm) und nach (Abb. 3.5, graues Histogramm) dem Spülen mit der selben Reaktionslösung dokumentiert wurde. Die absoluten Positionen der drei Maxima in den Histogrammen blieben dabei, abgesehen von unerheblichen Abweichungen, unverändert.
61
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Weiterhin zeigte H. RENNEKAMP in Experimenten mit EF1-Magnetpartikel-Komplexen,
dass eine von außen wirkende Kraft in Form eines angelegten Magnetfelds keine Auswirkung auf die Haltepositionen des Enzyms hat. Das Magnetfeld wurde in Hydrolyse- und in
Syntheserichtung gedreht. In beiden Fällen waren die 120°-Schritte des Enzyms zu erkennen. Die Orientierung der drei Wartepositionen wurde durch die Drehrichtung des Magnetfelds nicht verändert (Rennekamp, 2006).
rel. Wahrscheinlichkeit
1
0
-120
0
Winkel / °
+120
Abb. 3.5: Histogramm schrittweise rotierender Actinfilamente unter dem Einfluss
von Scherkräften.
Die Daten von zwei Filamenten wurden gemittelt. In rot ist die winkelabhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeit der Actinfilamente in Gegenwart von 50 µM ATP gezeigt. Der graue
Graph zeigt das Rotationsverhalten derselben Moleküle nach einem Spülschritt und erneuter
Zugabe der Reaktionslösung mit 50 µM ATP.
Diese Experimente zeigten, dass die Enzyme durch die His-tags stabil auf der
Oberfläche verankert waren. Ein strukturiertes Bewegungsmuster gab daher die inneren
Eigenschaften der Enzyme wieder.
3.1.3
Behinderung des Actinfilaments durch Kontakt mit der Oberfläche
Auch unter einem anderen Aspekt kann die Oberfläche des Objektträgers zu Fehlmessungen beitragen. Die bis zu 1 µm langen Actinfilamente bewegten sich nur etwa
10-20 nm über dessen Oberfläche. Es war daher durchaus möglich, dass die Bewegung des
Filaments durch Kontakte mit der Oberfläche gestört oder gestoppt wurde. Ein solches
Ereignis machte sich in der Breite der Histogramme bemerkbar. Filamente, die an den
Enden festhängen, können sich nicht mehr thermisch frei bewegen, sodass die Kurven
ihrer Aufenthaltswahrscheinlichkeiten im Histogramm im Vergleich mit denen der
inhibierten Enzyme deutlich schmaler sind. Eine solche Kurve ist in Abb. 3.6 gezeigt
(schwarz) und einer Kurve eines durch das Schließen einer Disulfidbrücke gestoppten
Enzyms (grün) gegenübergestellt. Die Breiten (2σ) der Gaußverteilungen betragen 8° bzw.
21°. Die Wechselwirkung des Filaments mit der Oberfläche hatte demnach eine deutlich
schmalere Gaußverteilung zur Folge. Über dieses Kriterium ließen sich solche Artefakte
ausselektieren.
62
Abb. 3.6:
Gaußverteilungen blockierter Filamente.
Die Histogramme zeigen die
winkelabhängige
Aufenthaltswahrscheinlichkeit
zweier Actinfilamente im
Rotationsassay, die entweder
durch Kontakt mit der
Küvettenoberfläche
(schwarz, 2σ = 8°) oder
durch Schließen einer Disulfidbrücke im Enzym (grün,
2σ = 21°) in ihrer Bewegung
blockiert wurden.
3.1.4
rel. Wahrscheinlichkeit
Kontrollexperimente
_________________________________________________________________________
1
0
-20
0
Winkel / °
+20
Reversibilität der ADP-Inhibierung
Für die später zu ziehenden Schlüsse war es essentiell, dass sich die F-ATP-Synthase
durch die Zugabe von ADP inhibieren ließ. Dies habe ich überprüft, indem ich die
ADP-Inhibierung durch sukzessives Spülen mit ATP- oder ADP-haltigen Reaktionslösungen auf Reversibilität getestet habe (Abb. 3.7). Zunächst wurde ein rotierendes Actinfilament in Anwesenheit von 50 µM ATP beobachtet. Nun wurde ATP durch die Zugabe
einer ADP-Reaktionslösung entfernt und durch 5 mM ADP ersetzt. Dies führte zu einem
sofortigem Stillstand des Filaments. Im nächsten Schritt wurde durch eine weitere Spülung
ADP durch 5 mM ATP ersetzt. Nach einer kurzen Inkubationszeit von etwa 1 min fing das
Filament wieder an zu rotieren. Anschließend konnte die Rotation des Filaments durch
erneute Zugabe der ADP-Reaktionslösung wieder gestoppt werden. Dieser Versuch bestätigte, dass sich das Enzyms durch ADP reversibel inhibieren ließ.
125
Umdrehungen
100
5 mM ADP
75
50 50 µM ATP
5 mM ADP
5 mM ATP
25
0
0
50
100
Zeit / s
150
Abb. 3.7: Reversibilität der ADP-Inhibierung.
Die Trajektorie zeigt die zeitabhängige Rotation eines Actinfilaments unter dem sukzessiven
Einfluss verschiedener ATP- und ADP-Konzentrationen (50 µM ATP, 5 mM ADP,
5 mM ATP, 5 mM ADP). Zu den mit Pfeilen gekennzeichneten Zeitpunkten wurden die
ATP- oder ADP-haltige Reaktionslösungen in die Durchflussküvette pipettiert.
63
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
3.1.5
Reversibilität der Disulfidbrückenbildung
Rotatoren / Wahrscheinl.
Der Frage nach der Reversibilität der Disulfidbrückenbildung bin ich mit einem negativen
und einem positiven Kontrollexperiment nachgegangen. Im ersten Fall wurde die cysteinfreie Mutante SE1 im Rotationsassay eingesetzt und die Bewegung des Actinfilaments
unter Zugabe von 50 µM ATP beobachtet. Wie erwartet konnte die Rotationsbewegung
dieser Enzyme nicht durch die anschließende Zugabe einer 5 mM ATP enthaltenden
Oxidationslösung (2 mM DTNB) gestoppt werden. Für das positive Kontrollexperiment
wurde die Mutante GH14 benutzt. Es ließ sich allerdings nicht mit fluoreszenmarkierten
Actinfilamenten durchführen, da der Flureszenzfarbstoff nach einmaliger Oxidation
schnell ausbleicht und somit die Filamente in den nachfolgenden Messungen nicht mehr
sichtbar sind. Daher habe ich die Actinfilamente durch mit Quantum-Dots dotierte
Magnetpartikel ersetzt und deren Bewegung in Gegenwart von 5 mM ATP unter reduzierenden (red) oder oxidierenden (ox) Bedingungen beobachtet. Unter reduzierenden Bedingungen (0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol) ließen sich die Magnetpartikel durch ein äußeres,
in Hydrolyserichtung rotierendes Magnetfeld (1,8° und 40 ms pro Schritt) drehen. Nach
der Zugabe der Oxidationslösung (2 mM DTNB) blieben mehr 71 von 86 der Magnetpartikel trotz rotierendem Magnetfeld stehen. Nach anschließender Reduktion mit 20 mM
DTT drehten sich 5 von 33 der noch vorhandenen Magnetpartikel wieder mit. Leider
waren nach dem letzten Lösungswechsel die meisten Magnetpartikel abgerissen, so dass
dieser Wert nicht sehr genau ist. Die Reversibilität der Disulfidbrückenbildung wurde aber
auch durch H. RENNEKAMP an Messungen mit dem EF1-Magnetpartikel-Komplex bestätigt.
Er fand, dass sich bis zu 80% der Enzyme nach Oxidation re-reduzieren ließen
(Rennekamp, 2006). Abb. 3.8 zeigt den Anteil der rotierenden Magnetpartikel in Abhängigkeit von den Redoxbedingungen.
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
red
ox
re-red
Zustand
Abb. 3.8: Reversibilität der Disulfidbrückenbildung durch Oxidation und Reduktion.
Die Abbildung zeigt die Wahrscheinlichkeit rotierender Magnetpartikel unter dem sukzessiven Einfluss von reduzierenden (0,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol), oxidierenden (2 mM
DTNB) und re-reduzierenden (20 mM DTT) Bedingungen. Die Rotation wurde bei 5 mM
ATP unter Anlegen eines äußeren, sich in Hydrolyserichtung drehenden Magnetfelds
gemessen.
Diese beiden Versuche machen es wahrscheinlich, dass das Oxidationsmittel nur das
Schließen der Disulfidbrücke bewirkt und ansonsten keine Auswirkungen auf das Rotationsverhalten der Enzyme hat.
64
Kontrollexperimente
_________________________________________________________________________
3.2
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem
der F-ATP-Synthase
In den folgenden Experimenten habe ich versucht, das absolute Koordinatensystem der
F-ATP-Synthase, gewonnen aus mitochondrialen Kristallstrukturdaten, mit dem relativen,
laborbezogenen Koordinatensystem aus dem Rotationsassay zu korrelieren. Dafür wurden
mittels Mutagenese Cysteine an gegenüberliegenden Positionen im Rotor (γ) und im Stator
(α) von F1 eingebaut. Durch die spezifische Anordnung der jeweiligen Cysteinpaare wurde
innerhalb einer 120°-Periode nur eine bestimmte Stellung des Rotors fixiert. Diese war so
gewählt, dass sie der Kristallstruktur entsprach und somit als Referenzposition für die
Eichung im absoluten Koordinatensystem dienen konnte. Diese künstlich erzeugten Stopppositionen wurde in Bezug gesetzt zu den intrinsischen Haltepositionen des Enzyms, zuerst
zu derjenigen im ADP-inhibierten Zustand, und anschließend zu den katalytischen Wartepositionen. Unter der Annahme, dass es nur eine ADP-inhibierte Position des Enzyms
innerhalb einer Periode von 120° gibt, konnten die relativen Koordinaten des Laborsystems damit kalibriert werden. Die Annahme ist insofern berechtigt, als dass in der Literatur
bisher nicht mehrere verschiedene ADP-inhibierte Zustände beschrieben sind. Des
Weiteren konnten Y. HIRONO-HARA et al. (Hirono-Hara et al., 2001) in ihren Experimenten
nur eine ADP-inhibierte Position finden, die immer um +80° gegen den ATP-Wartezustand versetzt war. In weiteren Versuchen wurde die Lage der enzymbedingten Haltepositionen bestimmt. Das waren die ATP-Warteposition, in der das Enzym auf die Bindung des
nächsten ATP-Moleküls wartet, und die katalytische Warteposition, während der ATP in
ADP und Pi gespalten wird. Abschließend wurden alle künstlichen und natürlichen Haltepositionen des Enzyms miteinander korreliert.
3.2.1
Insertion von Cysteinen in F1
Die originale Kristallstruktur der F-ATP-Synthase diente als Referenzstruktur, anhand
derer ein Homologiemodell für die F-ATP-Synthase aus E. coli erstellt wurde
(Kap. 2.2.2.8). In dem Homologiemodell wurden sich gegenüberstehende Aminosäurereste
in der rotierenden γ-Untereinheit und der zum Stator gehörenden α-Untereinheit ausgewählt und durch Cysteine ersetzt. Diese Cysteine sollten durch Oxidation Disulfidbrücken
ausbilden und so das Enzym in einer Position festhalten, die möglichst genau die Kristallstruktur abbildet. Es wurde zwei Aminosäurepaare ausgewählt, nämlich γK266C/αD336C
(GH11) und γL276C/αE284C (GH14). Ein weiteres Cystein in γ wurde gegenüber dem
letzteren um zwei Aminosäuren versetzt in der C-terminalen α-Helix eingebracht, während
das Cystein in α unverändert bliebt. Eine Disulfidbrücke konnte sich somit auch zwischen
den Cysteinen in γQ274C/αE284C (GH18) ausbilden. Die Punktmutationen wurde mittels
PCR in die Gensequenz des Enzyms eingebracht. Dabei diente das cysteinfreie Plasmid
pSE1 als Ausgangsmaterial.
Das Wachstum von E. coli DK8-Zellen mit den jeweiligen Plasmiden wurde in einem
Komplementationstest überprüft. Alle Mutanten wuchsen auf Succinat-Medium, d.h. alle
Mutanten expremierten das plasmidcodierte ATP-Synthase-Gen. Die Genprodukte ließen
sich in SDS-Gelen und Immunoblots nachweisen. Auf dem SDS-Gel einer SE1-Präperation sind alle Untereinheiten von EFOF1 zu erkennen (Abb. 3.9A). Die einzelnen Untereinheiten ließen sich in einem Immunoblot auch durch spezifische Antikörper nachweisen
(Abb. 3.9B).
65
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Abb. 3.9: SDS-Gel und Immunoblot einer SE1-Präperation.
A) SDS-Gel des Eluat der EFOF1-Präparation mit allen Untereinheiten von EFOF1. B)
Immunoblots gegen jede Untereinheit von EFOF1. Die eingesetzten primären Antikörper
wurden 1:140.000 (α, β, γ), 1:2.000 (δ, ε) oder 1:800 (a) verdünnt oder hatten eine Konzentration von 20 µg/ml (b) oder 100 µg/ml (c). Die oberen Blots wurden 5 min, die unteren
30 s belichtet.
Die quantitative Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen γ und α in den Mutanten
GH11, GH14 und GH18 wurde anhand von SDS-Gelen (Abb. 3.10) und Immunoblots
(Abb. 3.11) nachgewiesen. Dazu wurden die Eluate der Enzympräparationen mit 10 mM
DTT (reduzierende Bedingungen) oder 100 µM DTNB (oxidierende Bedingungen)
versetzt, für 70-120 min bei Raumtemperatur inkubiert, und anschließend auf SDS-Gelen
aufgetragen. Die oxidierten Proben zeigen jeweils eine hochmolekulare Bande, die in den
reduzierten Proben fehlt. Die Bande entspricht der gemeinsamen Molmasse von α und γ
(86,9 kDa). Dagegen ist in den reduzierten Proben die γ-Untereinheit zu erkennen, die im
oxidierten Zustand fehlt. Auf den Blots mit Antikörpern gegen die γ-Untereinheit ist eine
niedermolekulare Bande in den reduzierten Proben zu erkennen. Unter oxidierenden
Bedingungen verschwindet diese Bande, stattdessen erscheint eine hochmolekulare Bande
entsprechend der Molmasse von α und γ (86,9 kDa). In den Blots mit Antikörpern gegen
die α-Untereinheit ist ein entsprechendes Ergebnis für α zu sehen, allerdings verschwindet
die α-Bande unter oxidierenden Bedingungen nicht vollständig, da nur eine der drei
α-Untereinheiten eine Disulfidbrücke mit der γ-Untereinheit bilden kann. Zum Vergleich
ist auch das unbehandelte Eluat der Präparation auf den SDS-Gelen und Blots aufgetragen.
Das Eluat von GH18 zeigt eine schwache, hochmolekulare αγ-Bande. Es ist anzunehmen,
das diese unbehandelte Probe allein durch den im Wasser gelösten Sauerstoff zum Teil
oxidiert wurde.
66
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
Abb. 3.10: SDS-Gele der Mutanten GH11, GH14 und GH18.
Für jede Mutante ist das unbehandelte Eluat der EFOF1-Präparation, eine reduzierte und eine
oxidierte Probe aufgetragen. Die hochmolekulare αγ-Bande ist nur in den oxidierten Proben
und zum Teil in dem Eluat von GH18 sichtbar. Dagegen fehlt bei den oxidierten Proben die
γ-Bande fast vollständig und die α-Bande erscheint gegenüber der reduzierten Probe
schwächer.
Abb. 3.11: Immunoblots der Mutanten GH11, GH14 und GH18.
In den Blots wurden Antikörper (Verdünnung 1:200.000) gegen die Untereinheiten α und γ
eingesetzt. Zu sehen ist jeweils eine oxidierte und eine reduzierte Probe und bei GH11 und
GH18 auch das unbehandelte Eluat. Die Banden erscheinen bzw. fehlen an den entsprechend
der SDS-Gelen erwarteten Positionen. Der GH11-Blot wurde 5 min, der GH14-Blot 15 s und
der GH18-Blot 10 s belichtet.
Obwohl mit den SDS-Gelen und den Immunoblots gezeigt wurde, dass die Enzyme unter
oxidierenden Bedingungen Disulfidbrücken ausbilden können, führt dies nicht zwangsläufig zu einer Inhibierung der Rotationsbewegung. Die C-terminale α-Helix der γ-Untereinheit könnte sich oberhalb der Disulfidbrücke aufwinden, so dass die Enzyme weiter
ATP hydrolysieren können (Müller et al., 2004). Deshalb wurde die Aktivität der F-ATPSynthase im reduzierten und im oxidierten Zustand mit dem Aktivitätstest überprüft. Die
Aktivität der Mutante SE1 diente hierbei als Referenzwert, sie lag im Mittel bei 23 U/mg.
Für die Mutanten GH11, GH14 und GH18 ergab sich eine mittlere Aktivität der
67
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
reduzierten Proben von 28 U/mg, während die mittleren Aktivitäten unter oxidierenden
Bedingungen mit 4 U/mg deutlich niedriger lagen. Das unbehandelte Eluat hatte eine
Aktivität von 6 U/mg, d.h. diese Probe wurde schon durch den im Wasser gelösten
Sauerstoff fast vollständig oxidiert. Diese Werte belegen, dass sich die verwendeten
Mutanten durch Oxidation inhibieren ließen.
3.2.2
Korrelation der Rotorpositionen im ADP-inhibierten und oxidierten Enzym
Das Ziel dieses Versuchs war es, das molekulare Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
aus den originalen Kristallstrukturdaten mit dem Laborkoordinatensystem zu korrelieren.
Durch das Schließen der Disulfidbrücke wurde das Enzym in einer Stellung fixiert, die das
molekulare Koordinatensystem repräsentierte. Als Referenzpunkt für das Laborkoordinatensystem diente das ADP-inhibierte Enzym. Diese Positionen habe ich im Rotationsassay
mit der Mutante GH14 bestimmt (Abb. 3.12). Zunächst wurden gleichmäßig rotierende
Actinfilamente unter Zugabe von 50 µM ATP beobachtet. Anschließend wurde die
ATP-haltige Reaktionslösung gegen eine mit 5 mM ADP ausgetauscht, dasselbe Enzym im
Fokus behaltend. Die Rotationsbewegung wurde durch das ADP sofort gehemmt und die
Stellung des Actinfilaments des ADP-inhibierten Enzyms aufgezeichnet (gelbes Histogramm, Abb. 3.12). Im darauf folgenden Schritt wurde das ADP gegen 5 mM ATP und
2 mM DTNB ersetzt, wieder dasselbe Molekül im Fokus behaltend. Das ATP bewirkte,
dass das Filament wieder zu rotieren begann, bevor es durch die oxidative Wirkung des
DTNBs zur Ausbildung der Disulfidbrücke zwischen den beiden Cysteinen
(γL276C/αE284C) kam. Dies geschah durchschnittlich nach 4-5 Minuten. Die Stellung des
Actinfilaments im oxidierten Zustand wurde ebenfalls dokumentiert (grünes Histogramm,
Abb. 3.12). Die Auswertung der Daten ergab, dass die Position des oxidierten Zustands
entweder genau mit der Position des ADP-inhibierten Zustands übereinstimmte, oder um
+120° oder +240° gedreht war. Im ersten Fall habe ich die Daten verworfen, da nicht
ausgeschlossen werden konnte, dass es sich hierbei in Wirklichkeit nur um denselben,
ADP-inhibierten Zustand handelte. Aufgrund der Dreiersymmetrie des F1-Teils sind alle
Positionen mit einer Periodizität von 120° die gleichen. Daher handelte es sich bei den
beiden letzteren Fällen in Wirklichkeit um die gleiche Position, man kann sie durch eine
Drehung um 120° zur Deckung bringen. Daraus folgt, dass innerhalb der Periodizität von
120° die ADP-inhibierte Position genau der oxidierten Position entspricht.
Um zu zeigen, dass die Position des oxidierten Zustands tatsächlich durch die Bildung
einer Disulfidbrücke an der entsprechenden Stelle geprägt ist, wurde das Cystein in γ um
zwei Aminosäurereste versetzt, und zwar von γL276C nach γQ274C, während das Cystein
in α (αE284C) beibehalten wurde. Der Versatz um zwei Aminosäurereste auf der C-terminalen α-Helix entspricht einer Drehung um +200° unter der Annahme, dass eine
360°-Windung einer α-Helix im Mittel aus 3,6 Aminosäurereste besteht. Durch die
Drehung des Cysteins um +200° muss sich γ theoretisch um weitere +40° drehen, damit
sich eine Disulfidbrücke zwischen γQ274C und dem nächstgelegenen Cystein in α an
Position +240° bilden kann. Die Position des oxidierten Zustands dieser Mutante (GH18)
wurde in gleicher Weise wie bei der Mutante GH14 in Relation zum ADP-inhibierten
Zustand gemessen. Die Messungen ergaben, dass diese Position wie erwartet um +40°,
+160° oder +280° gegenüber der des ADP-inhibierten Enzyms versetzt waren. Durch
Drehung um 120° wurden die drei Oxidationspositionen einheitlich auf +160° ausgerichtet
(orangefarbenes Histogramm, Abb. 3.12).
68
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
rel. Wahrscheinlichkeit
1
0
-120
ADP-Inhibierung
Disulfidbrücke
GH14
GH18
0 Winkel / ° +120 +160
Abb. 3.12: Positionen der inhibierten Enzyme der Mutanten GH14 und GH18.
Die Daten aus drei Einzelmessungen mit der Mutante GH14 und vier Einzelmessungen mit
der Mutante GH18 wurden per Kreuzkorrelation in Phase gebracht und gemittelt. Das gelbe
Histogramm gibt die mittlere Position des ADP-inhibierten Enzyms aus den sieben Einzelmessungen an, deren Maxima per Kreuzkorrelation in Phase gebracht wurden. Diese Daten
wurden mit einer Gaußverteilung angepasst, deren Maximum willkürlich auf 0° gesetzt
wurde. Im Verhältnis dazu sind die Positionen der oxidierten Enzyme der Mutante GH14
(grün) und GH18 (orange) gezeigt, die um +120° bzw. +160° gegenüber dem ADP-inhibierten Zustand verschoben sind.
Die Ausrichtung der Disulfidbrücken habe ich außerdem noch in einem weiteren Experiment überprüft. Zunächst wurde im Rotationsassay mit der Mutante GH11 die Orientierung des oxidierten Enzyms mit denen des aktiven Enzyms bei 50 µM ATP verglichen.
Anschließend wurde diese Orientierung aller drei Mutanten (GH14, GH18, GH11) zur
katalytischen Warteposition des aktiven Enzyms bei 50 µM ATP (Kap. 3.2.3) in Bezug
gesetzt. In Abb. 3.13A, C, E ist jeweils eine der drei katalytischen Wartepositionen in Rot
gezeigt. Die Haltepositionen im oxidierten Zustand sind in Grün, Orange bzw. Cyan dargestellt. Die Maxima stimmen entweder genau mit denen der katalytischen Warteposition
überein (GH14) oder sind um +40° (GH18) oder -15° (GH11) dagegen versetzt. In den
Homologiemodellen für drei Mutanten (Abb. 3.13B, D, F) sind die Positionen der Cysteine
in γ und α gezeigt. Der Versatz der Maxima spiegelt sich ungefähr in der Stellung der
jeweiligen Cysteine zueinander wider.
Diese Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass die Ausrichtung der Enzyme im
oxidierten Zustand ihre Orientierung in der Kristallstruktur wiedergeben, und dass die
Übersetzung der Kristallstrukturdaten von MF1 in das Homologiemodell von EF1 mit
keinen groben Fehlern behaftet ist. Die Mutante GH14 repräsentiert hierbei am besten die
originale Kristallstruktur.
69
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
rel. Wahrscheinlichkeit
1
0
1
0
1
GH14
A
B
γL276C
αE284C
C
GH18
D
γQ274C
αE284C
GH11
E
0
-40
F
γK266C
αD336C
0
+40
+80
Winkel / °
Abb. 3.13: Katalytische und oxidierte Wartezustände der Mutanten GH14, GH18
und GH11 und deren Homologiemodelle.
A, C, E) Die roten Histogramme zeigen die winkelabhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeit
des aktiven Enzyms (50 µM ATP) für jeweils eine der drei katalytischen Wartepositionen
der Mutanten GH14, GH18 und GH11. Das Maximum wurde willkürlich auf 0° gesetzt.
Außerdem ist die Halteposition der Enzyme unter oxidierenden Bedingungen in Grün,
Orange bzw. Cyan gezeigt. Die Histogramme ergeben sich aus den Mittelwerten aus vier,
einer bzw. zwei Einzelmessungen. B, D, F) Querschnitte durch die Homologiemodelle der
drei Mutanten von der Membranseite aus betrachtet. In Hellgrau sind jeweils die drei αsowie die γ-Untereinheit, in Dunkelgrau die β-Untereinheiten zu sehen. Die Cysteine an den
angegebenen Positionen sind farbig dargestellt, wobei das Schwefelatom in jedem Cystein in
Gelb gezeichnet ist.
70
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
3.2.3
Bestimmung der ATP- und der katalytischen Wartepositionen
Messungen an TF1 haben gezeigt, dass das Enzym bei millimolaren ATP-Konzentrationen
in +120°-Schritten rotiert (Yasuda et al., 1998). Wird die ATP-Konzentration in den
nanomolaren Bereich abgesenkt, werden Unterschritte von abwechselnd +80° und +40°
sichtbar (Shimabukuro et al., 2003). Die Pausen zwischen den Schritten wurden als
ATP-Warteposition bzw. als katalytische Warteposition identifiziert. Für den Versuch,
diese Unterschritte im Rotationstest mit EFOF1 zu dokumentieren, habe ich die Mutante
SE1 verwendet, da sich mit dieser die höchste Ausbeute an rotierenden Actinfilamenten
erzielen ließ. Ein komplexes Schrittverhalten wurde bei einer Konzentration von 50 µM
ATP beobachtet. Bei nanomolaren ATP-Konzentrationen konnten keine rotierenden
Filamente mehr beobachtet werden, während bei millimolaren ATP-Konzentrationen nur
noch 120°-Sprünge zu sehen waren. Aus den Abständen der Maxima der blauen und roten
Histogramme in Abb. 3.14B, sowie aus Abb. 3.15 und 3.16A ließen sich die Schrittweiten
der Unterschritte bestimmen. Sie betrugen im Mittel +84° bzw. +36°. Die Ergebnisse
stimmen gut mit den Messungen an TF1 überein. Im Folgenden werde ich daher die
Sprünge als +80°- bzw. +40°-Unterschritt bezeichnen.
An drei Einzelmolekülen traten diese Unterschritte abwechselnd aber reproduzierbar
über eine lange Trajektorie von jeweils 1-2 min Dauer auf. Bei anderen Einzelmolekülen
traten nur +120°-Sprünge mit der einen oder der anderen Phase auf (s.u.). Hier wurde die
Phasenlage durch den Vergleich mit derjenigen des ADP-inhibierten Zustands ermittelt
(Kap. 3.2.4).
Die Unterschritte waren nicht immer sehr ausgeprägt. Es gab Segmente, in denen
entweder nur die ATP-Wartepositionen oder nur die katalytischen Wartepositionen zu
sehen waren. Ein Wechseln zwischen diesen beiden Positionen, einhergehend mit sukzessiven +80°/+40°-Unterschritten, gab es eher selten. Die Abb. 3.14A zeigt die Trajektorie
eines sich schrittweise drehenden Actinfilaments. In der Abbildung sind drei kurze
Ausschnitte einer insgesamt 1,5 Minuten langen Trajektorie zu sehen. Die beiden linken
Graphen sind größtenteils durch +120°-Schritte geprägt, zueinander sind sie jedoch um 40°
versetzt. In diesen Segmenten springt das Enzym nur innerhalb von einem der beiden
möglichen Wartezustände. In dem rechten Graph sind Sprünge von +80° und +40°
sichtbar. Entsprechen den Ergebnissen mit TF1 habe ich die Pausen vor dem +80°-Unterschritt dem ATP-Wartezustand (blau) und die Pause vor dem +40°-Unterschritt dem
katalytischen Wartezustand (rot) zugeordnet. In Abb. 3.14B sind die gemittelten Daten aus
drei Einzelmessungen gezeigt, in denen die Filamente die +80°/+40°-Sprünge zeigten. Die
Position des Filaments in jedem Einzelbild habe ich wie in Abb. 3.14A dem ATP-Wartezustand (blau) oder dem katalytischen Wartezustand (rot) zugeordnet und anschließend die
Sequenzen der beiden Wartezustände getrennt ausgewertet. Innerhalb jeder Sequenz waren
immer +120°-Schritte zu erkennen, während bei dem Vergleich der beiden Sequenzen die
+80°- bzw. +40°-Unterschritte zum Vorschein kamen. Die Daten der Einzelmessungen
habe ich per Kreuzkorrelation in Phase gebracht und gemittelt.
Nach den Messungen mit 50 µM ATP habe ich die Rotationsbewegung derselben
Moleküle bei 5 mM ATP beobachtet. Waren zuvor beide Wartepositionen sichtbar, waren
bei dieser sättigenden ATP-Konzentration nur noch Sprünge von +120° zu erkennen,
wobei die Pausen den katalytischen Wartezuständen entsprachen. Wie zu erwarten, waren
die ATP-Wartezustände durch den schnellen Austausch von Nukleotiden so stark verkürzt,
dass sie sich zeitlich nicht mehr auflösen ließen. Die katalytischen Wartezustände waren
weiterhin sichtbar, da diese diffusionsunabhängig sind und allein von den katalytischen
Eigenschaften des Enzyms abhängen. Die Histogramme in Abb. 3.15 zeigen die drei
71
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
ATP-Wartepositionen des Enzyms bei 50 µM ATP in Blau und die drei um +80°
versetzten katalytischen Wartepositionen bei 5 mM ATP in Rot.
A
Umdrehungen
5
4
3
2
1
0
0
2
4
6
Zeit / s
rel. Wahrscheinlichkeit
1
B
0
-120 -80
0
+40
+120 +160
Winkel / °
Abb. 3.14: Trajektorien und Histogramme von in 80°/40°-Unterschritten rotierenden Actinfilamenten.
A) Drei kurze Ausschnitte einer 1,5 min langen Trajektorie, in denen sich das Filament
entweder in der Phase der ATP-Wartezustände (blau, links) oder der katalytischen Wartezustände (rot, mittig) bewegte, oder zwischen den beiden Phasen wechselte (rechts). B)
Gemitteltes Histogramm aus drei Einzelmessungen, in denen neben den +120°-Schritten
auch die +80°/+40°-Unterschritte sichtbar waren. Die Position des katalytischen Wartezustandes (rot) wurde willkürlich auf 0° (bzw. -120°, +120°) gesetzt. Die Positionen des
ATP-Wartezustands (blau) sind dem gegenüber im Mittel um etwa +40° verschoben, die
Maxima liegen bei -80°, +40° bzw. +160°.
72
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
rel. Wahrscheinlichkeit
1
0
-120 -80
0
+40
+120 +160
Winkel / °
Abb. 3.15: Histogramme der ATP- und der katalytischen Wartezustände bei 50 µM
bzw. 5 mM ATP.
Die Histogramme wurden aus den Mittelwerten von Einzelmolekülmessungen an drei
schrittweise rotierenden Actinfilamenten gewonnen. Die Positionen der ATP-Wartezustände
(blau) wurde in Gegenwart von 50 µM ATP, die der im Mittel um +80° versetzten katalytischen Wartezustände (rot) bei 5 mM ATP bestimmt. Die Festlegung der absoluten Winkelpositionen ist willkürlich innerhalb der dreier-Periodiziät in 360°, im Bereich von 120°
liegen sie jedoch fest durch den Vergleich mit der ADP-inhibierten Position (Kap. 3.2.4),
welche auf 0° gesetzt wurde.
3.2.4
Korrelation aller vier Haltepositionen
Nach der Bestimmung der ADP-inhibierten und der oxidierten Positionen einerseits und
der ATP- und der katalytischen Wartepositionen andererseits, habe ich versucht, die
verschiedenen Ruhepositionen relativ zueinander an ein und demselben Einzelmolekül zu
bestimmen. Dazu habe ich im Rotationsassay mit der Mutante SE1 bei 50 µM ATP
zunächst schrittweise rotierende Actinfilamente beobachtet und deren Bewegung anschließend durch Zugabe von 5 mM ADP gestoppt. In acht Experimenten konnte ich Sprünge
von +120°, aber nicht die +80°/+40°-Unterschritte beobachten. Es war daher nicht eindeutig, ob das Filament nur an den ATP-Wartepositionen oder nur an den katalytischen Wartepositionen hielt. Mit Hilfe des ADP-inhibierten Zustands ließen sich diese Positionen
jedoch den zwei Wartezuständen zuordnen. Die Wartepositionen des aktiven Enzyms
stimmte in vier der acht Fälle entweder genau mit der Position des ADP-inhibierten
Enzyms überein, oder sie war um +40° gegenüber dieser Position verschoben. Daraus
folgt, dass es sich bei dem ersten Ereignis um den katalytischen und bei dem zweiten
Ereignis um den ATP-Wartezustand handelte, da dieser um +40° gegenüber den katalytischen Wartezustand versetzt ist. Im umgekehrten Fall würde man neben der Übereinstimmung bei dem zweiten Ereignis einen Versatz von +80° erwarten.
73
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Die Ergebnisse aller Experimente sind in Abb. 3.16A zusammengefasst. Die Positionen
aller ADP-inhibierter Zustände (gelb) aus den acht Messungen an Einzelmolekülen wurden
normiert und mittels Kreuzkorrelation übereinander gelagert. Die Aufenthaltsverteilung
des aktiven Enzyms relativ zu der des inhibierten Enzyms blieb dabei unverändert. Bei den
vier in Rot dargestellten Fällen stimmten die Warteposition des aktiven Enzyms mit der
Position des ADP-inhibierten Zustand überein, während in den anderen vier in Blau
gekennzeichneten Fällen die beiden Positionen gegeneinander um 40° versetzt waren. Im
ersten Fall handelte es sich um den katalytischen Wartezustand (rot), im zweiten Fall
handelte es sich um den ATP-Wartezustand (blau). Daraus folgt, dass der ADP-inhibierte
Zustand dem katalytischen Wartezustand entspricht.
frei Enthalpie / kBT
rel. Wahrscheinlichkeit
1
kat.-Pause
ATP-Pause
ADP-Inhib.
SS-Brücke
A
0
2
0
B
-120
0
Winkel / °
+120
Abb. 3.16: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Energieprofile der vier Haltepositionen des Enzyms.
A) Aufenthaltswahrscheinlichkeit entlang des Winkels der Reaktionskoordinate von EFOF1.
Die katalytischen (kat.-Pause) bzw. ATP-Wartepositionen (ATP-Pause) des aktiven Enzyms
(50 µM ATP) sind in Rot bzw. Blau, die ADP-inhibierte Stellung ist in Gelb und die
oxidierte Stellung der Mutante GH14 ist in Grün gezeigt. Die Winkelposition des ADP-inhibierten Zustands wurde willkürlich auf 0° gesetzt. B) Profil der freie Enthalpie der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten in Einheiten von kBT. Die Minima wurden auf 0 kBT gesetzt.
Vier weiteren Messungen an der Mutante GH14 zeigten, dass die Halteposition des
durch Disulfidbrückenbildung gehemmten Proteins (grünes Histogramm) in diesem Fall
immer mit einer Warteposition des aktiven Enzyms (50 µM ATP) übereinstimmt. Da die
Haltepositionen des ADP-inhibierten und des oxidierten Enzyms einander entsprechen
(Abb. 3.12), entspricht folglich der oxidierte Zustand dem katalytischen Wartezustand.
74
Korrelation des absoluten mit dem relativen Koordinatensystem der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
3.2.5
Energieprofil des aktiven und gehemmten Enzyms
In den Histogrammen in Abb. 3.16A (wie auch in allen anderen beschriebenen Histogrammen) repräsentiert die Abszisse die Reaktionskoordinate des Enzyms. Mit der Boltzmannverteilung kann die winkelabhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeit (p(α)) als Profil der
freien Enthalpie des Enzyms (∆G0(α)) beschrieben werden:
p() =
e
−
G 0 ()
kBT
2 − G 0 ()
1
k B T d
2 e
0
Gl. 3.1
¶
Abb. 3.16B zeigt die Profile der freien Enthalpie der EFOF1-Mutante GH14 im katalytischen (rot) und im ATP-Wartezustand (blau), sowie im ADP-inhibierten (gelb) und im
oxidierten (grün) Zustand. Die Maxima der Wahrscheinlichkeitsverteilungen entsprechen
den Minima der Profile und vice versa. Während sich das Enzym in einem Energieminima
befindet, ist es elastisch relaxiert und ohne Drehmoment. Die beobachtete Stellung des
Actinfilaments in diesem Zustand ist dementsprechend nur durch die Orientierung der
γ-Untereinheit und des c-Rings bestimmt. In allen anderen Stellungen, in denen sich das
Enzym nicht in einem Energieminimum befindet, kann der Rotor in sich, d.h. der c-Ring
gegen das C-terminale Ende von γ, verdreht sein.
Die Breiten der Profile der freien Enthalpie sind nicht nur abhängig von dem Zustand,
in dem sich das Enzym befindet, sondern auch von dem Zeitintervall, in dem das Profil
gemessen wurde (Abb. 3.17). Die Trajektorie eines aktiven Enzyms (GH14), welches in
Gegenwart von 50 µM ATP für etwa 1 min in einem reduzierten Wartezustand verharrte,
zeigt nur einen geringen Ausschlag, wenn sie nur über einen Zeitraum von 5 s betrachtet
wird (Abb. 3.17AI). Dementsprechend haben die Verteilung der Aufenthaltswahrscheinlichkeit (Abb. 3.17AII) und das Profil der freien Enthalpie (Abb. 3.17AIII) eine geringe
Breite. Erweitert man das Intervall jedoch um das 10fache (50 s), so zeigt die Trajektorie
deutlich größere Schwankungen (Abb. 3.17CI), und die Verteilung der Aufenthaltswahrscheinlichkeit (Abb. 3.17BII) und das Profil der freien Enthalpie (Abb. 3.17BIII) haben
eine große Breite. Dies lässt sich dahingehend interpretieren, dass das globale Energieminimum aus vielen lokalen Energiesenken besteht, zwischen denen das Enzym in kurzen
Zeitintervallen hin- und herspringt. Das globale Minimum umfasst also alle lokalen
Minima. Verfolgt man die Bewegung des Enzyms im Sekundenbereich, lassen sich die
einzelnen Minima abtasten. Wird das Enzym oxidiert, so dass sich eine Disulfidbrücke
schließt, sind die entsprechenden Verteilungen (Abb. 3.17BII, DII) und Profile
(Abb. 3.17BIII, DIII) sehr viel schmaler, obwohl der Unterschied zwischen dem beiden
Zeitintervallen noch zu erkennen ist. Die kovalente Bindung zwischen den beiden
Cysteinen hält das Enzym an der Position fest und hindert es an einer stärkeren Auslenkung. Ein großer Energiebetrag (264 kJ/mol) wäre nötig, um das Enzym gegen die Stärke
der kovalenten Bindung aus dieser Position hinaus zu bewegen.
75
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
1
rel. Wahrscheinl.
0
red
0
1
rel. Wahrscheinl.
0
-50
ox
0
2.5
50
rel. Wahrscheinl.
Winkel / °
0
red
rel. Wahrscheinl.
Winkel / °
-25
0
25
0
ox
0
25
Zeit / s
BIII
0
50 -50
-25
0
25
50
0
25
Winkel / °
50
3,5
CII
0
1
DI
-50
0
5 -50
1
CI
-50
50
BII
CIII
freie Enthalpie / kBT
Winkel / °
BI
AIII
0
3.5
freie Enthalpie / kBT
-50
50
3.5
AII
0
3,5
DII
0
50 -50
freie Enthalpie / kBT
Winkel / °
AI
freie Enthalpie / kBT
50
-25
0
25
Winkel / °
DIII
0
50 -50
-25
Abb. 3.17: Aufenthaltswahrscheinlichkeiten und Profile der freien Enthalpie des
reduzierten und oxidierten Enzyms für verschiedene Zeiträume.
AI-AIII) Trajektorie, Aufenthaltswahrscheinlichkeit und Profil der freien Energie für ein
reduziertes Enzym (GH14) in einem Wartezustand in Gegenwart von 50 µM ATP, gemessen
über einen Zeitraum von 5 s. BI-III) Die Auslenkungen und Verteilungen desselben Enzyms
im oxidierten Zustand. CI-CIII) Die Daten des reduzierten Enzyms über einen Zeitraum von
50 s. DI-DIII) Die Daten des oxidierten Enzyms für einen Zeitraum von 50 s.
3.3
Elastizität des Rotors der F-ATP-Synthase
In den folgenden Kapiteln habe ich mich der Bestimmung der Elastizität des Rotors von
EFOF1 zugewandt. Durch die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinen im
Stator und im Rotor wird die Drehbewegung des aktiven Enzyms gestoppt. Das Maximum
der Aufenthaltswahrscheinlichkeit in diesem Zustand entspricht einem Energieminimum,
in dem die Rotoruntereinheiten elastisch relaxiert sind (Kap. 3.2.5). In diesem Zustand, in
dem kein inneres Drehmoment anliegt, wird die Winkelauslenkung des Filaments allein
76
Elastizität des Rotors der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
durch thermische Stöße verursacht. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung p(φ) als eine
Funktion der Winkelauslenkung φ, der Standardabweichung σ und der Temperatur T wird
durch die Boltzmannverteilung beschrieben.
p(&) = Konstante $ e
− k ET
B
&2
−
= 1 $ e 2" 2
" 2
Gl. 3.2
Setzt man für E die Gleichung 1.9 ein und löst nach κ auf, erhält man für die TorsionsFederkonstante (κ) die in Gl. 3.3 beschriebene Abhängigkeit von der Varianz σ2.
k T
(") = "B2
Gl. 3.3
Der Fehler von κ lässt sich mit der Gauß’schen Fehlerfortpflanzung berechnen.
2$k T
(") = " B3 $ "
Gl. 3.4
Je größer die Torsions-Federkonstante ist, desto rigider ist das Protein. Durch
Einbringen von Cysteinen an verschiedenen Positionen lässt sich die Elastizität des Rotors
vermessen.
3.3.1
Insertion von Cysteinen in FO
Die Biegsamkeit des Rotors am C-terminalen Ende von γ konnte ich mit den drei bereits
beschriebenen Mutanten vermessen. Um auch die Biegsamkeit am anderen Ende des
Rotors, dem c-Ring, bestimmen zu können, wurden Cysteine in den FO-Teil inseriert, und
zwar an den Positionen cL72C und aI223C. Die Cysteine wurden mittels PCR in das
Plasmid pSE1 eingebracht. Die Fähigkeit der neuen Mutante GH33, unter oxidierenden
Bedingungen eine Disulfidbrücke auszubilden, wurde in einem SDS-Gel und einem
Immunoblot nachgewiesen. Auf dem SDS-Gel (Abb. 3.18A) sind im reduzierten Zustand
(10 mM DTT) alle EFOF1-Untereinheiten zu erkennen. Durch Oxidation (100 µM DTNB)
entstand eine neue Bande, die der gemeinsamen Molmasse von a und c (38,6 kDa)
entspricht. Die a-Bande ist deutlich schwächer, während sich die Intensität der c-Bande
aufgrund der zehn Kopien von c nicht ändert. Im Immunoblot (Abb. 3.18B) gegen c ist
unter oxidierenden Bedingungen deutlich die ac-Bande zu erkennen, die im reduzierten
Zustand nicht existiert. Zusätzlich erscheint eine weitere Bande, die durch die Bildung
einer Disulfidbrücke zwischen zwei c-Untereinheiten entstanden sein könnte. Im Immunoblot gegen a ist im oxidierten Zustand nur die schwächere a-Bande zu sehen, eine
ac-Bande ließ sich leider nicht nachweisen. Insgesamt betrachtet kann davon ausgegangen
werden, dass GH33 zur Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen a und c fähig ist.
Die Positionen der Cysteine aller untersuchten Mutanten sind in der Seitenansicht des
Homologiemodells von EFOF1 in Abb. 3.19 dargestellt.
77
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
Abb. 3.18: SDS-Gel und Immunoblot der Mutante GH33.
A) Auf dem SDS-Gel ist das unbehandelte Eluat der EFOF1-Präparation und die üN oxidierte
(100 µM DTNB) und reduzierte (10 mM DTT) Probe aufgetragen. B) In den Immunoblots
wurden die Antikörper gegen a in einer Verdünnung von 1:800 eingesetzt, die Antikörper
gegen c hatte eine Konzentration von 100 µg/µl. Es wurden die gleichen Proben wie auf dem
SDS-Gel aufgetragen. Die Blots wurde 15 min belichtet.
Abb. 3.19: Seitenansicht des Homologiemodells von EFOF1 mit inserierten
Cysteinen.
Die Untereinheiten, in denen Cysteine
eingebaut wurden, sind in Dunkelgrau
gezeichnet. Alle anderen Untereinheiten
sind entweder in Hellgrau oder wurden der
Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt.
Die Cysteine in den Statoruntereinheiten a
(aI223C) und α (αD336C, αΕ284C) sind
Rot, die Cysteine in den Rotoruntereinheiten c und γ sind in Purpur (cL72C,
GH33), Cyan (γK266C, GH11), Orange
(γQ274C, GH18) oder Grün (γL276C,
GH14) gekennzeichnet.
78
Elastizität des Rotors der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
3.3.2
Bestimmung der Elastizität der Untereinheiten c und γ
Die Biegsamkeit des Proteolipids habe ich experimentell mit der Mutante GH33 bestimmt.
Im Rotationsassay mit GH33 wurden zunächst unter reduzierenden Bedingungen und in
Gegenwart von 5 mM ATP rotierende Actinfilamente beobachtet. Nach der Zugabe der
Oxidationslösung (2 mM DTNB) stoppten dieselben Filamente bedingt durch die Ausbildung einer Disulfidbrücke zwischen aI223C und cL72C ihre Bewegung. Die winkel-abhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeit dieses Zustandes, gemittelt aus vier
Einzelmessungen, ist in Abb. 3.20 wiedergegeben. Die mittlere Breite der Standardabweichungen (2σ) beträgt 10,5° ± 1,5°.
Die Wahrscheinlichkeitsverteilungen der Mutanten GH11, GH14 und GH18 im
oxidierten Zustand wurden schon im Kapitel 3.2.2 beschrieben. Zusätzlich habe ich aus
den Messdaten auch die Torsions-Federkonstanten von EFOF1 im ADP-inhibierten Zustand
und während des ATP- und des katalytischen Wartezustands berechnet. Die Ergebnisse für
alle Mutanten aller Einzelmessungen und Zustände sind in Tab. 3.1 und in Abb. 3.21
zusammengefasst.
Das Histogramm stellt den
Mittelwert aus vier Einzelmessungen dar, die per Kreuzkorrelation in Phase gebracht
wurden.
1
rel. Wahrscheinlichkeit
Abb. 3.20: Histogramm der
winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeit der
Mutante
GH33
im
oxidierten Zustand.
0
-20
-10
0
Winkel / °
10
20
Tab. 3.1: Torsions-Federkonstanten der EFOF1-Mutanten SE1, GH11, GH14, GH18
und GH33 in den verschiedenen Zuständen.
Die Torsions-Federkonstanten (κ) ergeben sich aus den gemittelten Standardabweichungen
der Gaußverteilungen aller Einzelmessungen. Sie wurden an den oxidierten oder ADP
inhibierten Enzymen oder während der ATP- und der katalytischen Wartezustände
gemessen.
Mutanten, Zustand
Breite der Gaußverteilung (2σ) / °
11 ± 1,5
GH33, oxidiert (cL72C)
20 ± 3,3
GH11, oxidiert (γK266C)
31 ± 8,1
GH18, oxidiert (γQ274C)
33 ± 8,9
GH14, oxidiert (γL276C)
SE1/GH14/GH18,
ADP-inhibiert
28 ± 7,6
SE1/GH11/GH14/GH18,
katalytische Pause
42 ± 11,0
SE1, ATP-Pause
47 ± 14,4
κ / pNnm
480 ± 137
134 ± 44
54 ± 28
48 ± 26
66 ± 36
30 ± 16
23 ± 14
79
rel. Wahrscheinlichkeit
Ergebnisse
_________________________________________________________________________
1
0
-40
-20
0
+20
+40
Winkel / °
Abb. 3.21: Gaußverteilungen der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten der EFOF1-Mutanten SE1, GH11, GH14, GH18 und GH33 in verschiedenen
Zuständen.
Die Verteilungen der oxidierten Enzyme ergaben sich aus den normierten Mittelwerten der
Histogramme aus zwei (GH11 (αD336C/γK266C), cyan), sechs (GH14 (αΕ284C/γL276C),
grün), fünf (GH18 (αΕ284C/γQ274C), orange) oder vier (GH33 (aI223C/cL72C), purpur)
Einzelmessungen. Die Verteilung des ADP inhibierten Zustands (gelb) setzt sich aus acht
Einzelmessungen an SE1 und GH14 zusammen. Mit diesen Mutanten wurde ebenfalls die
Verteilung des katalytischen (rot) und des ATP-Wartezustands (blau) bestimmt (je zwölf
Einzelmessungen).
Die Ergebnisse zeigen die Abhängigkeit der Torsions-Federkonstanten von der Position
der Disulfidbrücke. Die durch die Vernetzung der Untereinheiten c und a beobachtete
Biegsamkeit stellt eine Obergrenze für den verankerten EFOF1-Filament-Komplex dar. Je
größer der Abstand zwischen der Disulfidbrücke und dem Anheftungspunkt des Actinfilaments ist, desto weicher ist der Rotor in dem Bereich dazwischen (480-48 pNnm). Das
ADP-inhibierte Enzym zeigte eine ähnliche Biegsamkeit wie das durch eine Disulfidbrücke zwischen γ und α gestoppte Enzyme. Verharrte das Enzym dagegen an den intrinsischen Wartepositionen (katalytische Pause, ATP-Pause), hatte es eine etwa doppelt so
hohe Biegsamkeit, wie im ADP-inhibierten Zustand. Die mittlere Federkonstante der
intrinsischen Wartepositionen beträgt 26,5 pNnm, die des ADP-inhibierten Zustand
66 pNnm. Dies deutet an, dass die Elastizität der Wechselwirkung des konvexen Teils von
γ mit der DELSEED-Domäne von β zusätzliche Biegsamkeit beisteuert.
80
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
4
Diskussion
4.1
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
Die F-ATP-Synthase ist einzigartig unter den in der Natur vorkommenden Nanomotoren.
Einerseits gibt es auf der Basis der Kristallstrukturdaten von MF1 hochaufgelöste Bilder
des inhibierten Enzyms, andererseits liegen Filmsequenzen des aktiven Enzyms vor. Es hat
sich allerdings als schwierig herausgestellt, aus den unterschiedlichen Datensätzen einen
gemeinsamen Funktionsmechanismus für die ATP-Hydrolyse zu entwickeln. Die Bilder
der Kristallstrukturen lassen sich nicht ohne weiteres als ein Zustand des aktiven Enzyms
interpretieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Datensätze mit- einander zu
korrelieren.
In fast allen bisher untersuchten Kristallstrukturen der F-ATP-Synthase (Abrahams
et al., 1994; Abrahams et al., 1996; van Raaij et al., 1996; Orriss et al., 1998; Braig et al.,
2000; Gibbons et al., 2000; Kagawa et al., 2004; Kabaleeswaran et al., 2006; Bowler et
al., 2007) zeigte die konvexe Seite der γ-Untereinheit stets auf eine geöffnete und leere
Bindungstasche (βE), bei gleicher Winkelstellung von γ über die gesamte Länge. Eine
Ausnahme bildete lediglich die Struktur von R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001), in der
die γ-Untereinheit im Bereich der konvexen, superspiralisierten Doppelhelix um +20°
gegenüber der Stellung in allen anderen Kristallstrukturen verdreht war, während die
Orientierung der C-terminalen α-Helix unverändert war. Die γ-Untereinheit kann daher im
Kristall in sich verdreht sein. Es ist bisher die einzige Struktur, in der alle drei katalytischen Zentren besetzt waren, entweder mit ADP⋅AlF4- in βTP und βDP, von dem angenommen wird, dass es sich hierbei um das Analogon eines Übergangszustands handelt, oder
mit ADP (und möglicherweise einem Sulfat) in βE. Die Bindungstasche in βE war in
diesem Fall halb geschlossen. Aufgrund der Belegung der katalytischen Zentren wurde
diese Struktur als ein Hinweis auf einen strukturellen tri-site Mechanismus angesehen. Es
ist allerdings fraglich, ob diese Struktur einen Zustand im katalytischen Zyklus des aktiven
Enzyms repräsentiert. Wie aus Abb. 3.16B ersichtlich ist, befindet sich das Enzym, wenn
es eine Halteposition einnimmt, immer in einer Energiesenke, in der das Enzym, insbesondere γ, elastisch relaxiert ist, was in der MENZ-Struktur möglicherweise nicht der Fall war.
Die Verdrillung von γ in dieser Struktur erstaunt um so mehr, als dass gezeigt wurde, dass
das C-terminale Ende von γ frei drehbar ist (Sabbert et al., 1996; Sabbert et al., 1997;
Müller et al., 2004) und ohne Funktionsverlust deletiert werden kann (Müller et al., 2002;
Hossain et al., 2006). Sie beruhte deshalb möglicherweise auf einen durch den Kristallisationsvorgang ausgelösten Zwang. Des Weiteren zeigten alle Kristallstrukturen das Enzym
in einem inhibierten Zustand. Bei den Inhibitoren handelte es sich um ADP, AMPPNP,
ADP ⋅AlF3, ADP ⋅AlF4-, Aurovertin, Efrapeptin, NBD-Cl, DCCD, (ADP.BeF-3)2 und
immer Azid (Abrahams et al., 1994; Abrahams et al., 1996; van Raaij et al., 1996; Orriss
et al., 1998; Braig et al., 2000; Gibbons et al., 2000; Menz et al., 2001; Kagawa et al.,
2004; Bowler et al., 2006). Die Übersetzung der aus den Kristallstrukturen gewonnenen
Erkenntnisse auf den Funktionsmechanismus des aktiven Enzyms ist daher nicht ohne
weiteres möglich.
Messungen am aktiven TF1 (α3β3γ) haben gezeigt, dass die Rotoruntereinheiten des
ATP-hydrolysierenden Enzyms in +120°-Schritten rotieren (Yasuda et al., 1998). Drei
+120°-Schritte, entsprechend den drei katalytischen Zentren in (αβ)3, ergeben eine volle
Umdrehung. Jeder +120°-Schritt ist in zwei Unterschritte von +90° und +30° unterteilt
81
Diskussion
_________________________________________________________________________
(Yasuda et al., 2001), wobei die Schrittweite in späteren Experimenten auf +80° bzw. +40°
revidiert wurde (Shimabukuro et al., 2003). Dasselbe Verhalten ließ sich auch mit TFOF1
beobachten (Ueno et al., 2005). Einhergehend mit der Bindung eines ATP-Moleküls an
eine leere Bindungstasche dreht sich γ um +80° weiter. Dann erfolgt eine Pause von
mindestens 1 ms, die durch die Hydrolyse von ATP gekennzeichnet ist. Anschließend
erfolgt eine Drehung um +40°. Die Freisetzung der Produkte ADP und Pi geschieht entweder in der Pause vor dem +40°-Unterschritt oder mit ihm zusammen, wobei die Reihenfolge der Freisetzung unbekannt ist. Nun muss das Enzym auf die Bindung des nächsten
ATP-Moleküls warten, bevor der Zyklus von vorne beginnen kann. Die Unterschritte
waren nur bei niedrigen ATP-Konzentrationen, bei Verwendung des langsam hydrolysierbaren ATP-Analogon ATPγS oder bei Mutanten, die ATP aufgrund einer Mutation in den
katalytischen Zentren langsamer hydrolysierten, sichtbar. Bei millimolaren ATP-Konzentrationen verkürzte sich die Verweilzeit des ATP-Wartezustands so stark, dass er sich
zeitlich nicht mehr auflösen ließ. Nur der von der ATP-Konzentration unabhängige katalytische Wartezustand blieb bestehen (Yasuda et al., 2001; Shimabukuro et al., 2003; Nishizaka et al., 2004; Ueno et al., 2005).
Bei hohen ATP-Konzentrationen kann man aufgrund der KD-Werte für die F-ATP-Synthase von E. coli (Weber et al., 1996) davon ausgehen, dass alle drei Bindungstaschen in
(αβ)3 mit ATP oder ADP besetzt sind (Weber et al., 1993). Unterstützt wird dies durch
Messungen von T. NISHIZAKA et al. (Nishizaka et al., 2004), die mit Hilfe von fluoreszenzmarkiertem ATP zeigen konnten, dass ein Nukleotid während einer Drehung von γ um
mindestens +240° in der Bindungstasche gebunden bleibt. Die Besetzung einer katalytischen Bindungstasche mit ADP verursacht den ADP-inhibierten Zustand und lässt das
Enzym in der katalytischen Warteposition verweilen (Hirono-Hara et al., 2001). Das
Drehmoment während des 80°-Kraftschlags ist unabhängig von der ATP-Konzentration im
nanomolaren bis millimolaren Bereich (Sakaki et al., 2005). Dies lässt vermuten, dass das
ATP zunächst an einen ‘Vorhof’ der Bindungstasche bindet. Das schwach an den ‘Vorhof’
gebundene ATP könnte über Wasserstoffbrückenbindungen, die an die Phosphatgruppen
angreifen, in die Bindungstasche gezogen werden (Wang und Oster, 1998). Erst durch die
stärkere Bindung an die Bindungstasche wird der 80°-Kraftschlag ausgelöst. Ansonsten
würde bei nanomolaren ATP-Konzentrationen das ATP die offene Bindungstasche mit
geringer Affinität sofort nach der Bindung in wenigen Mikrosekunden wieder verlassen, so
dass keine Zeit für die den +80°-Unterschritt auslösende Reaktion bliebe.
Meine Experimente an EFOF1 gehen mit diesen Ergebnissen konform und sind in
Abb. 4.1 zusammengefasst. In Gegenwart von 5-5000 µM ATP führte das Enzym während
einer Umdrehung drei +120°-Schritte aus, die bei Messungen mit 50 µM ATP jeweils in
einen +36°- und einen +84°-Unterschritt unterteilt waren. Die Weiten der Unterschritte
wurden bei TF1 anhand der Orientierung von an das Enzym gekoppelten Mikropartikeln
mit einem Durchmesser von zunächst 0,04 µm und in späteren Experimenten mit 0,2 µm
bestimmt und betrugen +40° bzw. +80°. Die Bestimmung der Winkelstellung war bei
diesen kleinen, kugelförmigen Objekten schwierig (Shimabukuro et al., 2003). In meinen
Experimenten mit 0,4 µm bis 1 µm langen, an EFOF1 gekoppelten Actinfilamenten war
eine genauere Messung der Winkelposition möglich. Die Ergebnisse stimmen bis auf eine
Abweichung von +/- 4° gut mit den Werten der thermophilen F-ATP-Synthase überein und
zeigen, dass der +120°-Schritt in beiden Enzymen in einen kleinen und einen großen
Unterschritt unterteilt ist. Ausgehend von der 12-Uhr-Stellung in Abb. 4.1 befindet sich
das Enzym in einem der drei katalytischen Wartezustände. Es folgt ein +40°-Unterschritt
im positiven Sinn. Danach befindet sich das Enzym in einem ATP-Wartezustand, dem der
82
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
+80°-Unterschritt folgt. Bei millimolaren ATP-Konzentrationen, bei denen den Bindungskonstanten nach alle drei Bindungstaschen mit Nukleotiden besetzt sind, sind die Unterschritte zeitlich nicht mehr auflösbar, das Enzym stoppt nach einem +120°-Schritt nur
noch an den drei katalytischen Wartepositionen. Obwohl die F-ATPase in Lösung bis zu
300 ATP-Moleküle pro Sekunde (entspricht 100 upm) hydrolysieren kann (Pänke et al.,
2001), verläuft die Reaktion bei den auf der Küvettenoberfläche gebundenen Enzymen
deutlich langsamer (1-5 upm), so dass sich auch bei 5 mM ATP die katalytischen Wartezustände bemerkbar machen. Durch die Zugabe von 5 mM ADP ließ sich die F-ATP-Synthase inhibieren. Die Orientierung des ADP-inhibierten Enzyms ist mit der im
katalytischen Wartezustand identisch.
Abb. 4.1: Schritte
Pausen
während
Rotation von EFOF1.
und
der
In der 12-Uhr-Stellung befindet sich das Enzym im katalytischen Wartezustand (katal.Pause). Nach der Hydrolyse
von ATP folgt ein +40°-Unterschritt gegen den Uhrzeigersinn, das Enzym befindet sich
im
ATP-Wartezustand
(ATP-Pause). Daran schließt
sich nach der Bindung eines
ATPs ein +80°-Unterschritt
an.
Bei
millimolaren
ATP-Konzentrationen wird der
ATP-Wartezustand übersprungen und es sind nur
+120°-Schritte sichtbar. Der
ADP-inhibierte Zustand und
die Ausrichtung des Rotors im
oxidierten Zustand (GH14)
stimmen mit dem katalytischen
Wartezustand überein. Der
oxidierten Zustand repräsentiert die Orientierung des
kristallinen Enzyms.
Die Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Enzyms hängt von der Reaktionskoordinate ab,
die durch die Winkelstellung des Actinfilaments wiedergegeben wird. Sie lässt sich auch
als freie Enthalpie beschreiben (Abb. 3.16B). Hierbei entspricht jedes Maximum der
Aufenthaltswahrscheinlichkeit einem Energieminimum, d.h. der Enzym-Filament-Komplex ist elastisch relaxiert. Die Vorraussetzung dafür ist, dass die Relaxationszeit des
Komplexes kleiner als die durchschnittliche Verweilzeit an den jeweiligen Maxima ist. Die
Relaxationszeit t ist abhängig von der Federkonstanten κ, der Länge l und des Radius r des
Actinfilaments und der Viskosität η (Hunt et al., 1994; Pänke et al., 2001).
t=
4$$$l 3
3$$ ln rl −0,447
Gl. 4.1
83
Diskussion
_________________________________________________________________________
Die maximale Länge der Filamente in diesen Komplexen betrug 1 µm. Der effektive
Radius von F-Actin beträgt 2,8 nm (Mendelson und Morris, 1997) und Wasser hat eine
Viskosität von 10-3 Nm-2s. Bei einer Federkonstanten von 26,5 pNnm, entsprechend der
Ergebnisse für den ATP- und den katalytischen Wartezustand, lässt sich die Relaxationszeit für den Komplex auf 33 ms abschätzen. Dieser Wert liegt deutlich unter der durchschnittlichen Verweilzeit des Enzyms von 90 ms und erfüllt damit die oben genannte
Vorraussetzung.
Durch mehrere verschiedene Kontrollexperimente (Kap. 3.1) konnte ich das Auftreten
von Artefakte während meiner Messungen weitestgehend ausschließen und damit die
Relevanz meiner Ergebnisse absichern. Die Kontrollen ergaben, dass die Proteinkomplexe
über die His-tags fest auf der Oberfläche der Durchflussküvette verankert waren und sich
nicht durch die beim Spülen auftretenden Scherkräfte ablösten. Wenn die Bewegung der
Actinfilamente durch Interaktion mit der Oberfläche gestört wurde, ließ sich dies in den
Histogrammen an den schmalen Gaußverteilungen erkennen. Des Weiteren ließ sich die
Reversibilität der ADP-Inhibierung dadurch überprüfen, dass sie sich durch Zugabe von
ATP wieder aufheben ließ. Die im Rotationsassay beobachteten rotierenden Actinfilamente gaben demnach gut die Bewegung der Enzyme wieder.
Die Arbeitsgruppe von K. KINOSITA Jr. (Yasuda et al., 2003) hat versucht, das dynamische Verhalten von TF1 mit den Kristallstrukturdaten von MF1 zu korrelieren. Dazu untersuchten sie in Einzelmolekülexperimenten den Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
(FRET) zwischen dem Donor an einem der drei β-Untereinheiten und dem Akzeptor an der
γ-Untereinheit. Aufgrund der Stärke der Fluoreszenzsignale konnten sie die Positionen von
γ relativ zu β während der schrittweisen Rotation der γ-Untereinheit bestimmen und mit
den Kristallstrukturdaten (Gibbons et al., 2000; Menz et al., 2001) vergleichen. Sie fanden,
dass die Orientierung des kristallinen Enzyms am besten mit der Orientierung des aktiven
Enzyms im katalytischen Wartezustand übereinstimmt. Wie die Autoren jedoch selbst
bemerkten, war die Genauigkeit ihrer Messungen durch mehrere Umstände eingeschränkt.
(i) Der Abschnitt von γ, an den der Akzeptor-Fluorophor gekoppelt war, war in den
Kristallstrukturen nicht aufgelöst, daher konnte die Position des Farbstoffs nur geschätzt
werden. (ii) Die Länge der Verbindungsstücke zwischen den Fluorophoren und den
Kopplungsstellen im Enzym betrugen 1,2 nm und 1,7 nm. Da der Radius von F1 etwa 5 nm
beträgt, impliziert das einen Fehler bezüglich der Winkelstellung der beiden Farbstoffe
zueinander von +/-19°. (iii) Da der Orientierungsfaktor zwischen den beiden Farbstoffen
nicht bekannt war, wurde angenommen, dass jeder Fluorophor mit einer Rotationskorrelationszeit, die der des freien Fluorophors in Wasser entspricht, konisch wobbelt. Diese
Annahme ist weder plausibel noch gerechtfertigt. Studien, in denen der Fluoreszenzfarbstoff Eosin an CF1 gekoppelt war, zeigten nicht nur die limitierte Rotationsfreiheit des
Farbstoffs im Nanosekundenbereich, sondern auch, dass die Relaxationszeit der Rotationsbewegung sehr lang ist und in der Größenordnung von einigen 10 µs liegen kann (Sabbert
et al., 1997), also deutlich außerhalb des für den Resonanz-Energietransfer relevanten
Zeitfensters von einigen Nanosekunden.
Die Positionsmessungen in dieser Arbeit erfolgten wesentlich präziser durch das Schließen von Disulfidbrücken. Nach C. L. CAREAGA und J. J. FALKE gilt als Vorraussetzung für
die Bildung einer Disulfidbrücke unter anderem ein Abstand zwischen den beiden Cβ-Atomen der Cysteine von mindestens 0,34 nm und höchstens 0,46 nm (Careaga und Falke,
1992a; Careaga und Falke, 1992b). In dem Homologiemodell der Mutante GH14
(Abb. 3.13B) beträgt der Abstand zwischen dem Cβ von γL276C und dem Cβ des nächsten
84
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
αE284C 0,65 nm. Berücksichtigt man, dass der Abstand auch von der Orientierung der
Cα-Cβ-Bindungen mit einer Bindungslänge von 0,15 nm abhängt, kann der nötige Abstand
zur Ausbildung einer Disulfidbrücke hier erreicht werden. In den Homologiemodellen der
Mutanten GH18 (Abb. 3.13D) und GH11 (Abb. 3.13F) betragen die Abstände zwischen
dem Cβ von γQ274C und dem Cβ des nächsten αE284C und dem Cβ von γK266C und dem
Cβ des nächsten αD336C 0,79 nm bzw. 0,99 nm. Die Abstände sind auch unter Berücksichtigung der Cα-Cβ-Bindungslänge zu groß, als dass sich Disulfidbrücken ausbilden
könnten. Allerdings zeigen die Ergebnisse, dass sich die γ-Untereinheit in GH18 um +40°
und in GH11 um -15° drehen muss, um dieselbe Stellung der Cysteine zueinander wie in
der Mutante GH14 zu erreichen. Hierdurch verkürzt sich der Abstand zwischen den beiden
Cysteinen und ermöglicht somit die Bildung einer Disulfidbrücke. Es ist zu beachten, dass
das Homologiemodell nur einen Anhaltspunkt für die Möglichkeit der Ausbildung von
Disulfidbrücken gibt. Das Modell wurde nach der zeitgemittelten Kristallstruktur von MF1
in EF1 übersetzt (Kap. 2.2.2.8). Außerdem ist die Orientierung der Cysteinreste nicht genau
bekannt, da sich in der originalen Struktur an diesen Stellen andere Aminosäurereste befinden, und die Strukturen in Abb. 3.13 nicht energieminimiert sind. Das Modell berücksichtigt auch nicht die thermischen Fluktuationen im Enzym. Deshalb war es notwendig, die
Ausbildung von Disulfidbrücken in den E. coli-Mutanten auch biochemisch zu überprüfen.
Das Wachstum der cysteinhaltigen Mutanten auf Succinatplatten im Komplementationstest
entsprach dem der cysteinfreien Mutante SE1. Dies belegt, dass die Funktion der F-ATPSynthase durch die inserierten Cysteine nicht beeinträchtigt wurde. Die SDS-Gele
(Abb. 3.10) und Immunoblots (Abb. 3.11) zeigen, dass die cysteinhaltigen Proteinkomplexe zwar unter oxidierenden, nicht aber unter reduzierenden Bedingungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den jeweiligen γ- und α-Untereinheiten fähig waren.
Dies wurde auch durch die Aktivitätstests bestätigt, in denen die Aktivitäten der Proben
von 28 U/mg im reduzierten Zustand auf 4 U/mg im oxidierten Zustand sanken. Im Rotationsassay dauerte die Oxidation der Proben in Gegenwart von 2 mM DTNB typischerweise
4-5 min. Dies stimmt mit den Ergebnissen von H. RENNEKAMP gut überein, der für diese
Reaktion eine Halbwertszeit von 3 min bestimmt hat (Rennekamp, 2006). Die Ausbildung
von Disulfidbrücken im Rotationsassay wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass sich
unter oxidativen Bedingungen gestoppte Enzym-Magnetpartikel-Komplexe nach Zugabe
eines Reduktionsmittels wieder mittels eines externen, rotierenden Magnetfelds drehen
ließen. Aufgrund dieser Überlegungen und Messungen ist die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen γ und α unter oxidierenden Bedingungen hinreichend genau belegt.
Die Positionsmessungen mit den Mutanten GH11, GH14 und GH18 zeigen, dass die
Positionen der oxidierten aktiven Enzyme gut die Orientierung des kristallinen Enzyms
widerspiegeln. Sie lässt sich somit in Beziehung zu den Reaktionszuständen des rotierenden, ATP hydrolysierenden Enzyms setzen. Für die Kristallstruktur wurde angenommen,
dass es sich um einen ADP-inhibierten Zustand handelt (Abrahams et al., 1994). Die
Diskrepanz besteht jedoch darin, dass im katalytischen Wartezustand des aktiven Enzyms
alle drei Bindungstaschen mit Nukleotiden belegt sind, während in der Kristallstruktur eine
Bindungstasche unbesetzt ist. Es wurde daher angenommen, dass die Kristallstruktur den
ATP-Wartezustand repräsentiert. Dies widerspricht aber den Ergebnissen dieser Arbeit.
Diese zeigen, dass γ im ATP-Wartezustand um +40° (bzw. -80°) sowohl gegenüber dem
katalytischen Wartezustand als auch gegenüber dem ADP-inhibierten Zustand gedreht ist.
Es ist daher nahe liegend, und meine Ergebnisse belegen dies, dass die Kristallstruktur
einen Zustand repräsentiert, der dem des aktiven Enzyms im katalytischen Wartezustand
und im ADP-inhibierten Zustand entspricht (Abb. 4.1).
85
Diskussion
_________________________________________________________________________
Der ADP-inhibierte Zustand entsteht zufällig während der Katalyse durch eine stabile
und lang anhaltende Besetzung einer katalytischen Bindungstasche mit ADP. Unklar ist
bisher, bei welchem Schritt des Reaktionszyklus die F-ATP-Synthase durch die ADP-Inhibierung blockiert wird. Grundsätzlich lässt sich der Reaktionszyklus in vier Schritte
gliedern: (i) die Bindung von ATP an eine freie Bindungstasche, (ii) die Hydrolyse von
ATP in ADP und Pi, (iii) die Freisetzung von Pi und (iv) die Freisetzung von ADP, wobei
die Reihenfolge der beiden letzten Schritte noch nicht geklärt ist. Die Experimente von
A. E. SENIOR und J. WEBER implizieren jedoch, dass das Phosphat vor dem ADP freigesetzt
wird (Weber et al., 1996). Es ist offensichtlich, dass das ADP-Molekül, dass in Schritt (iv)
die ADP-freisetzende Bindungstasche besetzt, nicht mit der ADP-Inhibierung assoziiert
ist, sonst würde das Enzym nach jedem Reaktionszyklus in den ADP-inhibierten Zustand
verfallen. Es ist aufgrund des folgenden Arguments auch unwahrscheinlich, dass die
Bindung von ADP an die leere Bindungstasche für eine lang anhaltende ADP-Inhibierung
sorgt. Prinzipiell kann eine Nukleotidbindungstasche, die ATP binden kann, auch das
kleinere aber ansonsten identische ADP binden. Analog zur Bindung von ATP muss auch
die Bindung von ADP eine Konformationsänderung auslösen, die γ um +80° rotieren lässt,
wie die Experimente von Y. HIRONO-HARA et al. implizieren (Hirono-Hara et al., 2001).
Wäre dies nicht der Fall, würde gar keine Reaktion stattfinden und das ADP-Molekül
könnte wieder aus der Bindungstasche heraus diffundieren. Nach der Bindung eines
ATP-Moleküls könnte dann der Zyklus fortgesetzt werden. Damit kommen nur noch
Schritt (ii) oder Schritt (iii) für eine ADP-Inhibierung in Frage. Das steht mit meinen
Daten im Einklang. Sie belegen, dass der ADP-inhibierte Zustand dem katalytischen
Wartezustand entspricht. Es ist vorstellbar, dass die Freisetzung von Phosphat (Schritt (iii))
die Reaktion vorantreibt und den +40°-Kraftschlag auslöst. Ist kein Phosphat vorhanden,
da aufgrund der Bindung von ADP die Hydrolyse von ATP in ADP und Pi nicht stattgefunden hat, könnte der Reaktionszyklus an dieser Stelle unterbrochen sein. Y. HIRONO-HARA et
al. (Hirono-Hara et al., 2005) konnten die ADP-Inhibierung aufheben, in dem sie das
Enzym artifiziell um +40° aus dem ADP-inhibierten Zustand heraus weiter drehten. Diese
artifizielle Drehung könnte den durch die Phosphatfreisetzung ausgelösten Kraftschlag
ersetzen und es dem Enzym damit ermöglichen, mit der ATP-Hydrolyse fortzufahren.
Andererseits ist es auch möglich, dass die ADP-Inhibierung mit Schritt (ii) assoziiert ist.
Die Hydrolyse von ATP ist exergon und treibt die Reaktion voran. Dies wird unterbunden,
wenn statt ATP ein ADP gebunden ist. Allerdings ist diese Reaktion nicht mit einem Kraftschlag verbunden. Das Enzyms verweilt während der Hydrolyse an der katalytischen
Warteposition, dies geschieht 1 ms vor dem darauf folgenden +40°-Unterschritt (Shimabukuro et al., 2003). Ebenso wird während der ATP-Synthese nach P. D. BOYER (Boyer,
1993) die Energie nicht für die Bildung von ATP aus ADP und Pi benötigt, sondern für die
Produktfreisetzung. Die Reaktion ATP ↔ ADP + Pi befindet sich in der Bindungstasche
im Gleichgewicht. Für das Enzym macht es demnach in diesem Zustand keinen Unterschied, ob in der katalytisch aktiven Bindungstasche ATP oder ADP vorliegt.
Die ADP-Inhibierung lässt sich besser verstehen, wenn man den Reaktionszyklus im
Lichte eines funktionellen tri-site Mechanismus nach A. E. SENIOR und J. WEBER (Weber et
al., 1996) betrachtet, in dem alle drei Bindungstaschen positiv kooperativ zusammenarbeiten. Nach diesem Mechanismus wechseln alle drei Bindungstaschen während des katalytischen Schritts ihre Affinitäten (Abb. 4.2A). Die Bindungstasche, in der die Hydrolyse von
ATP geschieht, wechselt ihre Affinität von H nach M. Da ADP das Produkt der Reaktion
ist, kann man annehmen, dass die Tasche auch in den Zustand mittlerer Affinität (M)
wechseln kann, wenn sie statt ATP ein ADP gebunden hat. Die Bindungstasche, die als
86
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
nächstes ADP freisetzt, wechselt ihre Affinität von M nach L. Da sie aufgrund des Reaktionszyklus schon ein ADP gebunden hat, wirkt die ADP-Inhibierung nicht, wie oben diskutiert, an dieser Stelle. Hat jedoch die dritte, vormals leere Bindungstasche statt eines ATPein ADP-Molekül gebunden, ist es ihr vermutlich nicht möglich, während des katalytischen Schritts aus einem Zustand geringer Affinität in einen Zustand hoher Affinität zu
wechseln (L→H). Ein in dieser Tasche gebundenes ADP lässt das Enzym nach dem
+80°-Unterschritt im katalytischen Wartezustand verharren, da die Reaktion nur fortgesetzt werden kann, nachdem alle drei Bindungstaschen kooperativ ihre Affinitäten gewechselt haben. Da die originale Kristallstruktur in Gegenwart von ADP und AMPPNP, aber in
Abwesenheit von ATP, gewonnen wurde, könnte sich das kristalline Enzym genau in
diesem Zustand befinden. In diesem Fall besitzt die βE-Bindungstasche noch eine niedrige
Affinität (L). Es ist daher möglich, dass sich ADP während des Kristallisationsprozesses
aus dieser Bindungstasche gelöst hat, da die Affinität der F-ATP-Synthase zu ADP (KD =
20 µM) viel geringer ist als seine hohe Affinität zu ATP (KD = 1 nM) (Weber et al., 1993).
Dies würde erklären, warum in der originalen Kristallstruktur eine Bindungstasche (βE)
leer war, was den Anschein eines ATP-Wartezustands erweckt. Es ist auch möglich, dass
die originale Kristallstruktur nicht wie angenommen durch ADP in der
βDP-Bindungstasche, sondern durch AMPPNP in der βTP-Bindungstasche inhibiert wurde.
Da AMPPNP nicht hydrolysiert werden kann, kann diese Bindungstasche, und folglich
auch die beiden anderen, nicht ihre Affinität wechseln. Das Enzym wäre auch in diesem
Fall in seinem katalytischen Zustand gehemmt und ein an βE gebundenes Nukleotid könnte
diese während des Kristallisationsprozesses verloren haben. Auch hier würde die leere
βE-Bindungstasche den Anschein eines ATP-Wartezustands erwecken. Außerdem würde
das auch bedeuten, dass sich AMPPNP in der Bindungstasche befindet, die als nächstes
ATP hydrolysieren würde, d.h. βTP wäre die Bindungstasche mit hoher Affinität, in der die
Hydrolyse stattfindet. Dies stünde im Widerspruch zu dem Modell von J. E. WALKER, in
dem die βDP-Bindungstasche das Nukleotid fest gebunden hat (T) und die Katalyse betreibt
(Abrahams et al., 1994).
Abb. 4.2: Der katalytische Schritt im
Modell von A. E. SENIOR und J. WEBER
(Weber und Senior, 2003) und im
Modell von R. I. MENZ et al. (Menz et
al., 2001).
A) Im SENIOR/WEBER-Modell arbeiten alle
drei Bindungstaschen im katalytischen
Schritt, während der Hydrolyse von ATP in
der unteren rechten Bindetasche, zusammen und wechseln gemeinsam ihre Affinitäten (H→M, M→L, L→H). B) Im
MENZ-Modell findet die Hydrolyse von
ATP in der T-Bindungstasche unten rechts
(T→T*) gleichzeitig mit der Bindung von
ATP an die offene Bindungstasche (O→L’)
statt. Die obere L-Bindungstasche ist an
dieser Reaktion nicht beteiligt (L→L).
A
B
87
Diskussion
_________________________________________________________________________
Das modifizierte Modell von R. I. MENZ et al. (Menz et al., 2001) ist nicht geeignet, die
Übereinstimmung des katalytischen Wartezustands mit dem der ADP-Inhibierung zu erklären (Abb. 4.2B). Dieses Modell geht davon aus, dass die originale Kristallstruktur den
ATP-Wartezustand darstellt. Gleichzeitig mit der Bindung von ATP an βE (O) erfolgt der
katalytische Schritt, die Hydrolyse von ATP in βDP, da diese Bindungstasche ATP fest (T)
gebunden hat. Damit unterscheidet das Modell nicht zwischen dem +80°-Unterschritt und
dem katalytischen Wartezustand. Die βTP-Bindungstasche ändert bei diesem Schritt ihre
Konformation nicht (L→L), und die βDP-Bindungstasche vollzieht nur eine geringfügige
Konformationsänderung (T→T*). Damit ist es schwierig, das Zustandekommen des
ADP-inhibierten Zustands zu verstehen. Ein ADP in der passiven βTP-Bindungstasche
würde keine ADP-Inhibierung verursachen. Die Bindung von ADP an βE würde wie oben
diskutiert ebenfalls nicht zum ADP-inhibierten Zustand führen. Erfolgt die Inhibierung
dagegen durch ein ADP in βDP, wie von den Autoren angenommen wird, folgt daraus, dass
außer der ATP-Hydrolyse auch die gleichzeitig Bindung eines Nukleotids an βE nicht stattfindet. In dem ADP-inhibierten Zustand wären demnach nur zwei Bindungstaschen besetzt
und βE wäre immer noch geöffnet. Entspricht jedoch der ADP-inhibierte Zustand des
Enzyms dem katalytischen Wartezustand, sollte sich βE nicht mehr in einem geöffneten
Zustand befinden und ein Nukleotid gebunden haben. Des Weiteren arbeiten die katalytischen Zentren in diesem Modell entgegen der zweiten Bedingung des ‘binding change’Mechanismus auch nicht positiv kooperativ zusammen.
Mit dem Funktionsmechanismus nach A. E. SENIOR und J. WEBER (Weber et al., 1996)
lassen sich die Ergebnisse dagegen gut erklären (Abb. 4.3). Das Modell geht auf die vier
u.a. auch in dieser Arbeit beobachteten Reaktionsschritte ein. In (1) befindet sich die
F-ATP-Synthase im ATP-Wartezustand. Entsprechend der originalen Kristallstruktur hat
βTP ATP und βDP ADP gebunden, während βE leer und offen ist. Es folgt die Bindung von
ATP an βE (O→L). Das ATP bindet zunächst an den ‘Vorhof’ der Bindungstasche mit
geringer Affinität, die jetzt halb geschlossen (half closed, βHC) ist (2). Erst wenn das ATP
fest an die Bindungstasche gebunden hat, erfolgt der +80°-Kraftschlag (2→3). Das Enzym
befindet sich jetzt im katalytischen Wartezustand (3). Wie in der originalen Kristallstruktur
zeigt die γ-Untereinheit mit ihrer konvexen Seite auf die Bindungstasche, die zuvor ATP
gebunden hat. Jetzt erfolgt der katalytische Schritt, in dem alle drei Bindungstaschen
positiv kooperativ zusammenarbeiten. In der Bindungstasche mit hoher Affinität (βTP) wird
ATP zu ADP und Pi hydrolysiert. Gleichzeitig wechselt βTP seine Affinität von H nach M
und entspricht jetzt βDP. Die βDP-Bindungstasche wird als nächstes ADP freisetzen und geht
in den halb geschlossenen Zustand (βHC) über. Dabei verringert sich die Affinität von M
nach L. βHC bindet jetzt ATP mit hoher Affinität (L→H) und wird zur βTP-Bindungstasche,
die als nächstes ATP hydrolisieren wird. Die Reaktionen stehen im Gleichgewicht, es
kommt nicht zu einem Kraftschlag. Der +40°-Unterschritt erfolgt erst nach der Katalyse
zusammen mit der Freisetzung von Pi aus der katalytischen Bindungstasche. Das Enzym
geht dabei aus dem Zustand (3) in den Zustand (4) über und hat nun zwei ADP und ein
ATP gebunden. Hier hat es wieder einen Gleichgewichtszustand eingenommen, aus dem
ADP ohne Energieverbrauch freigesetzt werden kann. Die Bindetasche mit geringer
Affinität (βHC) wird hierbei zur offenen und leeren Tasche (βE) (L→O). Das Enzym befindet sich nun wieder im Ausgangszustand, allerdings um +120° gedreht (5 = 1).
88
Modell für einen Mechanismus der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
Abb. 4.3: Modell für den Mechanismus der ATP-Hydrolyse nach J. WEBER (persönliche Kommunikation), modifiziert.
Das Modell beschreibt in den 4 Schritten (1-4) die Reaktionen während einer
+120°-Drehung der γ-Untereinheit. Die Affinitäten der Bindungstaschen sind mit O, L, M
und H gekennzeichnet und den Zuständen in den Kristallstrukturen (βE, βTP, βDP und βHC)
zugeordnet. Die einzelnen Schritte sind im Text genauer erläutert. Das rote Dreieck repräsentiert die γ-Untereinheit, wobei die Spitze die konvexe Seite von γ darstellt. Die Orientierung
von γ wurde von mir entsprechend meinen Ergebnissen verändert, so dass die konvexe Seite
während des katalytischen Wartezustands (3) vor dem +40°-Unterschritt auf die Bindungstasche zeigt, die zuletzt ATP gebunden hat.
Das Modell kann, wie oben diskutiert, das mögliche Zustandekommen des ADP-inhibierten Zustands und die Nukleotidbelegung der katalytischen Zentren in der originalen
Kristallstruktur erklären. Die oben getroffene Schlussfolgerung, dass sich AMPPNP in der
βTP-Bindungstasche befindet, die als nächstes ATP hydrolysiert, wird durch die aktuellen
Ergebnisse von J. WEBER bestätigt (J. Weber, persönliche Kommunikation). Die Messungen seiner Arbeitsgruppe ergaben, dass βTP und nicht βDP die Bindungstasche mit der
hohen Affinität (H) zu ATP ist, in der nach dem Modell auch die Hydrolyse von ATP stattfindet. Die drei Schritte jedes Reaktionszyklus (Substratbindung, Katalyse, Produktfreisetzung) erfolgen somit nicht nur zeitlich versetzt, sondern auch räumlich in je einer der drei
Bindungstaschen. Damit ist die Forderung von P. D. BOYER erfüllt, dass die katalytischen
Zentren positiv kooperativ zusammenwirken. In dem Funktionsmechanismus zeigt die
konvexe Seite der γ-Untereinheit im katalytischen Wartezustand immer auf die
89
Diskussion
_________________________________________________________________________
Bindungstasche, die zuletzt ATP gebunden hat. Von dort aus wird γ immer von der
Bindungstasche mit hoher Affinität (H) in Richtung der Bindungstasche mit niedriger
Affinität (L) gedrückt. Verursacht durch die Konformationsänderungen in allen drei
Bindungstaschen während des Reaktionszyklus bewegt sich γ in +80°/+40°-Unterschritten
und fällt dabei aus thermodynamischer Sicht immer in ein Energieminimum.
4.2
Die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase
Eine starre Kopplung der beiden Schrittmotoren der F-ATP-Synthase (FO und F1) setzt eine
genaue Abstimmung der jeweiligen Reaktionsteilschritte voraus. Dies ist allein schon
wegen der zwischen Enzymen aus unterschiedlichen Spezies variablen Stöchiometrie der
Untereinheiten (c10-14 in FO, (αβ)3 in F1) unwahrscheinlich. Deshalb wurde eine elastische
Kraftübertragung postuliert (Junge et al., 1997) und entsprechende kinetische Modelle
durchgerechnet (Cherepanov et al., 1999; Pänke und Rumberg, 1999). Demnach erzeugt
ein Protonenfluss durch FO ein Drehmoment. Aufgrund des Symmetrie-Missverhältnisses
zwischen FO und F1 kann die Energie nicht direkt übertragen werden. Stattdessen wird sie
elastisch zwischengespeichert. Erst wenn das Enzym durch das Wirken von FO genügend
Energie akkumuliert hat, schreitet die Reaktion in F1 voran. Unklar ist bisher, in welchem
Bereich der Rotoruntereinheiten die elastische Energie gespeichert wird. In dieser Arbeit
konnte durch die Vermessung von Torsions-Federkonstanten (κ) mittels Schließen von
Disulfidbrücken an verschiedenen Positionen in dem Enzymkomplex der Bereich genauer
lokalisieren werden. Betrachtet man den Rotor als einen isotropen, homogenen, zylindrischen Stab, so gilt für die Verbindung zweier unterschiedlich elastischer Stäbe mit unterschiedlichen Torsions-Federkonstanten (κ1, κ2) (Abb. 4.4), dass ein Drehmoment (M)
einzeln auf die beiden Stäbe wirkt (Gl. 4.2). Die resultierende Gesamtauslenkung (φges)
entspricht der Summe der einzelnen Auslenkungen (φ1, φ2) der beiden Stäbe (Gl. 4.3).
Abb. 4.4: Kombination zweier Stäbe mit unterschiedlich elastischen Eigenschaften.
Werden zwei Stäbe mit unterschiedlich elastischen
Eigenschaften kombiniert und durch eine TorsionsKraft K ausgelenkt, so entspricht die Gesamtauslenkung (φges) der Summe der einzelnen Auslenkung der
beiden Stäbe. Das resultierende Drehmoment wirkt
einzeln auf die beiden Stäbe und verdrillt sie
entsprechend
ihrer
Torsions-Federkonstanten
(Gl. 4.2).
M = 1 $ & 1 = 2 $ & 2 = ges $ & ges
Gl. 4.2
& ges = & 1 + & 2
Gl. 4.3
Daraus ergibt sich für die Gesamtenergie (Eges) des Systems nach Gl. 1.9
90
Die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
E ges = E 1 + E 2 = 12 1 $ & 21 + 12 2 $ & 22 = 12 M2 $ 11 + 12
Gl. 4.4
Setzt man diesen Ausdruck für E in Gl. 3.2 ein und löst nach σ2 auf, so erhält man
zusammen mit Gl. 4.2 die Gl. 4.5.
"2 =
k B T$& 2ges
M2 $ 11 + 12
=
kBT
2ges $ 11 + 12
Gl. 4.5
Setzt man Gl. 4.5 mit Gl. 3.3 gleich, so erhält man Gl. 4.6.
kBT
2ges $ 11 + 12
k T
= Bges
Gl. 4.6
Folglich entspricht der Kehrwert der Torsions-Federkonstante über den gesamten Stab
bzw. Abschnitt des Rotors (κges) der Summe der Kehrwerte der Federkonstanten an den
einzelnen Positionen (κ1, κ2) der beiden Teilstäbe (Gl. 4.7).
1
1
1
ges = 1 + 2
Gl. 4.7
Der elastisch biegsamere Stab wird durch die Torsion stärker deformiert, speichert mehr
elastische Energie und trägt stärker zu den thermalen Fluktuationen beiträgt.
Die gemessenen Torsions-Federkonstanten hängen nicht nur von der Elastizität des
Enzyms ab, sondern auch von dessen Kopplung an die Oberfläche und das Actinfilament
sowie von der Elastizität des Actinfilaments. Berechnet man allerdings nach Gl. 4.7 die
Torsions-Federkonstante für einen Bereich zwischen zwei Disulfidbrücken, so heben sich
die letzteren Effekte auf, und man erhält die Biegsamkeit des Enzyms in dem entsprechenden Abschnitt. Dabei bedeutet eine kleine Federkonstante eine große Biegsamkeit. Für die
Berechnung der Torsions-Federkonstanten habe ich die Messungen an den EFOF1-Mutanten GH11, GH14, GH18 und GH33 herangezogen (Tab. 3.1) und mit den Werten für EF1
verglichen. Die Messungen an EF1 erfolgten an Mutanten mit Cysteinen an den Positionen γA270C/αE284C, γC87/βD380C (Rennekamp, 2006) und γL276C/αE284C (Hilbers,
2007). Statt Actinfilamenten wurden in diesen Experimenten an γ gekoppelte Magnetpartikel benutzt, deren Winkelausschlag in Abwesenheit eines Magnetfelds nach Schließen der
jeweiligen Disulfidbrücken gemessen wurde. Außerdem wurde die Federkonstante für die
EFOF1-Mutante γC87/βD380C mit Actinfilamenten im Rahmen der Masterarbeit von
H. XIE bestimmt. In dem Modell der Rotoruntereinheiten von EFOF1 (Abb. 4.5) sind die
Positionen der Disulfidbrücken mit deren Torsions-Federkonstanten, sowie die berechneten Federkonstanten für die Zwischenbereiche eingetragen.
Die Untersuchungen sowohl an EFOF1 als auch an EF1 zeigen, dass die Biegsamkeit
zunimmt, je weiter die Disulfidbrücke zum C-terminalen Ende der α-Helix von γ verschoben wird. In EF1 sinkt die Torsions-Federkonstante von 522 pNnm (γA270C) auf
319 pNnm (γL276C), in EFOF1 sinkt sie von 134 pNnm (γK266C) auf 48 pNnm (γL276C).
Auffällig ist, dass die Werte für EFOF1 deutlich unter denen von EF1 liegen, selbst wenn
sich die Disulfidbrücke an derselben Position befindet (γL276C). Dagegen ist der Komplex
sehr rigide, wenn eine Disulfidbrücke am anderen Ende, nahe dem Anheftungspunkt des
Actinfilaments in FOF1 (cL72C) oder des Magnetpartikels in F1 (γC87), geschlossen wird.
91
Diskussion
_________________________________________________________________________
Die entsprechenden Federkonstanten betragen 480 pNnm bzw. 1510 pNnm. Berechnet
man nach Gl. 4.7 die Torsions-Federkonstanten für den Bereich zwischen den beiden
Enden, so erhält man eine Federkonstante von ([1/48 - 1/480]-1) 53 pNnm für FOF1 bzw.
von ([1/319 - 1/1510]-1) 404 pNnm für F1. Der gesamte Bereich über FOF1 ist demnach 7-8
mal weicher, als der gesamte Bereich über F1. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin,
dass die große Biegsamkeit an der Grenze zwischen F1 und FO lokalisiert ist. Dieses Ergebnis bestätigt die Vorhersage, dass es eine elastische Kopplung zwischen FO und F1 gibt, in
der die Energie elastisch zwischengespeichert wird. Die weiche Stelle ist für die Erzeugung des Drehmoments wichtig. Sie kommt durch die Wechselwirkung des c-Rings mit
der γ- und der ε-Untereinheit zustande.
Abb. 4.5: Modell der Rotoruntereinheiten mit gemessenen und berechneten
Torsions-Federkonstanten.
In dem Modell der Rotoruntereinheiten von EFOF1 (γεc10) sind die Cysteine der einzelnen
Mutanten in Grün (γL276C), Orange (γQ274C), Pink (γA270C), Cyan (γK266C), Schwarz
(γC87) und Purpur (cL72C) dargestellt. Die Torsions-Federkonstanten sind in pNnm
angegeben. Sie wurden an oxidierten Enzym-Komplexen für die Abschnitte zwischen der
jeweiligen Disulfidbrücke und dem Actinfilament (FOF1-Mutanten) oder dem Magnetpartikel
(F1-Mutanten) gemessen. Die Federkonstanten für Bereiche zwischen zwei Cysteinen
wurden nach Gl. 4.7 berechnet.
92
Die elastische Kopplung der F-ATP-Synthase
_________________________________________________________________________
Die niedrigsten Torsions-Federkonstanten von 23 pNnm bzw. 30 pNnm hat die F-ATPSynthase im ATP- bzw. im katalytischen Wartezustand (Tab. 3.1). Nach Gleichung 1.8
entsprechen diese Werte einem Elastizitätsmodul für γ von etwa 0,6·109 Nm-2, was erstaunlich gut mit dem Wert von 2·109 Nm-2 der simulierten elastischen Kraftübertragung
übereinstimmt (Pänke et al., 2001). Die zusätzliche Biegsamkeit des Enzyms während der
intrinsischen Wartezustände (ca. 26,5 pNnm) gegenüber der Biegsamkeit des Rotors
(53 pNnm) verdeutlicht den Beitrag der DELSEED-Domäne zum elastischen Funktionsmechanismus des Enzyms. Nach Gl. 4.7 berechnet sich die Torsions-Federkonstante zu
([1/26,5 - 1/53]-1) 53 pNnm. Interessanterweise hat die Federkonstante des durch eine
Disulfidbrücke in der DELSEED-Domäne (γC87/βD380C) fixierten Holoenzyms den
gleichen Wert (54 pNnm).
Im ADP-inhibierten Zustand beträgt die Torsions-Federkonstante 66 pNnm (Tab. 3.1).
Obwohl diese Position mit der des katalytischen Wartezustands übereinstimmt, unterscheiden sich jedoch die Federkonstanten etwa um den Faktor 2. Dies kann verschiedene
Ursachen haben. Vermutlich laufen im katalytischen Wartezustand zwei Reaktionen in der
katalytisch aktiven Bindungstasche ab, bevor das Enzym den nachfolgenden +40°-Unterschritt ausführt (Shimabukuro et al., 2003; Ueno et al., 2005). Diese beiden Reaktionen
könnten die Hydrolyse von ATP und die Freisetzung von Phosphat sein. Erstere könnte die
Biegsamkeit des katalytischen Wartezustands bestimmen, während im zweiten Fall die
Abwesenheit von Phosphat den ADP-inhibierten Zustand auslösen und seine Biegsamkeit
bestimmen könnte. Alternativ könnte die ADP-Inhibierung auch dadurch zustande
kommen, dass die βE-Bindungstasche ADP gebunden hat und deshalb ihre Affinität nicht
von L nach H wechseln kann. In diesem Fall wäre nicht nur eine andere Reaktion für den
ADP-inhibierten Zustand verantwortlich. Vielmehr würde diese Reaktion auch noch in
einer anderen Bindungstasche stattfinden. Dies könnte auch eine Erklärung für die unterschiedlichen Federkonstanten sein. Außerdem ist es möglich, dass in den beiden Zuständen
die Untereinheiten γ und β jeweils an anderer Stelle miteinander wechselwirken und
deshalb γ im ADP-inhibierten Zustand eine eingeschränktere Bewegungsfreiheit und damit
auch eine geringere Biegsamkeit hat.
4.3
Ausblick
Trotz des umfangreichen Datenmaterials sind einige Details des Funktionsmechanismus
der F-ATP-Synthase noch nicht verstanden. Es ist ungeklärt, wie der ADP-inhibierte
Zustand entsteht und welche Schritte des Reaktionszyklus dadurch gehemmt werden. Auch
die Reihenfolge der Freisetzung von ADP und Pi ist noch nicht geklärt.
Die Biegsamkeit der Rotoruntereinheiten wurde in dieser Arbeit untersucht. Durch
weitere Messungen ließe sich der weiche Bereich der elastischen Kopplung noch genauer
lokalisieren. So ließe sich der elastische Beitrag der ε-Untereinheit durch das Schließen
einer Disulfidbrücke zwischen ε und b bestimmen.
Die Klärung dieser Fragen ist interessant für das Verständnis des Reaktionsmechanismus und zukünftigen Experimenten vorbehalten.
93
Zusammenfassung
_________________________________________________________________________
5
Zusammenfassung
In dieser Arbeit habe ich mich mit der F-ATP-Synthase aus Escherichia coli beschäftigt. In
vivo nutzt dieses Enzym, das den am besten untersuchten Nanomotor darstellt, die
elektrochemische Differenz des Protons über eine Membran zur Synthese von ATP aus
ADP und Pi. Es setzt sich aus dem wasserlöslichen F1-Teil ((αβ)3γδε) und dem membranständigen FO-Teil (ab2c10) zusammen. Mechanisch gesehen besteht das Motorenzym aus
einem Rotor (γεc10), der sich gegen einen Stator ((αβ)3δab2) dreht. F1 ist der katalytisch
aktive Teil mit drei aktiven Zentren. In FO wird durch den Protonenfluss ein Drehmoment
erzeugt, das zur Synthese von ATP in den katalytischen Untereinheiten genutzt wird. In
dieser Arbeit wurde das Holoenzym im Rotationsassay eingesetzt. Ein an den c-Ring
gekoppeltes, fluoreszierendes Actinfilament diente als Reporter für die Orientierung und
Biegsamkeit der Rotoruntereinheiten in den untersuchten Zustände.
5.1
Die Teilschritte des aktiven Enzyms geeicht auf das molekulare
Koordinatensystem
Ich habe versucht, das molekulare Koordinatensystem, das aus der Kristallstruktur der
mitochondrialen F-ATP-Synthase (MF1) gewonnen wurde, mit den Laborkoordinatensystem des aktiven Enzyms aus E. coli (EFOF1) zu korrelieren. Im Rotationsassay drehte sich
das Holoenzym nach Zugabe von ATP in +120°-Schritten. Bei mikromolaren ATP-Konzentration konnten zusätzlich die +80°/+40°-Unterschritte aufgelöst werden. Einem
Funktionsmechanismus der F-ATP-Synthase nach folgt nach der Bindung eines ATP-Moleküls an eine leere Bindungstasche der +80°-Unterschritt. In dem sich anschließenden
katalytischen Wartezustand wird ATP hydrolysiert. Einhergehend mit der Freisetzung von
Pi und ADP erfolgt der +40°-Unterschritt. Das Enzym befindet sich nun wieder in seiner
(um +120° gedrehten) Ausgangsposition, dem ATP-Wartezustand, der bei millimolaren
ATP-Konzentrationen nicht beobachtet werden konnte. Die drei katalytischen Untereinheiten arbeiten in diesem Prozess positiv kooperativ zusammen. Im Experiment verharrte das
Enzym nach der Zugabe von ADP in einem ADP-inhibierten Zustand, in dem es die
gleiche Orientierung wie im katalytischen Wartezustand hatte. Da es im Enzym nur einen
ADP-inhibierten Zustand mit einer Periodizität von 120° gibt, diente diese Position der
Kalibrierung des Laborkoordinatensystems. Um einen Bezug zum molekularen Koordinatensystem herzustellen, wurden, nach einem auf den Kristallstrukturdaten beruhenden
Modell der F-ATP-Synthase, an gegenüberliegenden Positionen im Stator (αΕ284C) und
im Rotor (γL276C) Cysteine eingebaut. Unter oxidierenden Bedingungen konnten die
Cysteine eine Disulfidbrücke mit einer durchschnittlichen Länge von nur 0,4 nm
ausbilden. Daher entsprach die Orientierung des Enzyms im oxidierten Zustand der des
kristallinen Enzyms und repräsentierte das molekulare Koordinatensystem. Zur Kontrolle
wurde das Cystein auf der C-terminalen Helix von γ um zwei Aminosäuren verschoben
(γL276C→γQ274C), entsprechend einem Winkel von +200°. Das Enzym musste sich
somit um weitere +40° drehen, damit unter oxidierenden Bedingungen eine Disulfidbrücke
mit dem nächsten Cystein in α (αΕ284C) an der Winkelposition von +240° geschlossen
werden konnte. Dieser Versatz von +40° konnte experimentell nachgewiesen werden. Alle
95
Zusammenfassung
_________________________________________________________________________
vier Zustände wurden an einem Einzelmolekül gemessen, und die jeweiligen Orientierungen des Enzym-Filament-Komplexes wurden in Relation zueinander gesetzt. Demnach
hatte der Komplex während des katalytischen, des ADP-inhibierten und des oxidierten
Zustand die selbe Orientierung. Die Position des ATP-Wartezustand war demgegenüber
um +40° versetzt.
In Anbetracht dieser Ergebnisse müssen die originalen Kristallstrukturdaten neu interpretiert werden. Die Kristallstrukturen des inhibierten Enzyms entsprechen demnach nicht
dem ATP-Wartezustand, sondern dem katalytischen Wartezustand. Unklar ist allerdings,
warum in den meisten Kristallstrukturen nur zwei Bindungstaschen mit Nukleotiden
besetzt sind, wohingegen unter physiologischen Bedingungen zu erwarten wäre, und wie
auch verschiedene Experimente darauf hindeuten, dass im katalytischen Wartezustand alle
drei katalytischen Zentren mit Nukleotiden belegt sind. Möglicherweise handelt es sich um
ein Artefakt bedingt durch den Kristallisationsprozess und/oder die Inhibierung des
kristallinen Enzyms. In diesem Zusammenhang bedarf auch der von J. E. WALKER favorisierte ‘bi-site’-Mechanismus einer Überprüfung. Des Weiteren ist auch ungeklärt, durch
welchen Vorgang die ADP-Inhibierung ausgelöst wird. Möglich wäre, das im katalytischen Wartezustand kein Phosphat freigesetzt werden kann, oder dass die aktiven Zentren
aufgrund der Bindung eines ADP-Moleküls ihre Affinitäten nicht wechseln können. Insgesamt lassen sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse besser mit dem von A. E. SENIOR und
J. WEBER entwickelten, strukturellen und funktionellen ‘tri-site’-Mechanismus erklären.
5.2
Die inneren Elastizitätsparameter des Enzyms
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der elastischen Parameter der Teildomänen des Enzyms. Verweilt das Enzym in einem inhibierten oder Wartezustand, befindet
es sich in einem Energieminimum, d.h. es ist vollkommen relaxiert und wird nur durch
thermische Stöße mit der Umgebung aus seiner Position ausgelenkt. Die Stärke der
Auslenkung ist dabei abhängig von der Biegsamkeit des Komplexes. Ein Maß für die
Elastizität ist die Torsions-Federkonstante. Je kleiner die Federkonstante, desto weicher ist
der entsprechende Bereich im Enzym. Besonders biegsam erschien das Enzym, wenn es
durch Schließen einer Disulfidbrücke zwischen Stator und Rotor am C-terminalen Ende
von γ fixiert wurde (48 pNnm in FOF1, 319 pNnm in F1). Wurde dagegen eine Disulfidbrücke am gegenüberliegenden Ende geschlossen, erschien das Enzym deutlich rigider
(480 pNnm in FOF1, 1510 pNnm in F1). Für den gesamten Komplex ergeben sich Federkonstanten von 53 pNnm in FOF1 bzw. 404 pNnm in F1. Dies zeigt, dass der elastisch biegsame
Bereich durch die Wechselwirkung des c-Rings mit der γ- und der ε-Untereinheit zustande
kommt. Einen Beitrag zur Biegsamkeit leistet auch die DELSEED-Domäne. Für seine
Federkonstante wurde ein Wert von 53 pNnm bestimmt. Für den Funktionsmechanismus
der F-ATP-Synthase bedeutet dies, dass die Energie des Drehmoments in den Rotoruntereinheiten elastisch gespeichert werden kann. Erst wenn genügend Energie akkumuliert
wurde, wird sie zur Synthese eines ATP-Moleküls in einem katalytischen Zentrum genutzt.
Damit kann das Enzym jedes Übersetzungsverhältnis zwischen dem c-Ring in FO und den
katalytischen Zentren in F1 verwirklichen. Des Weiteren sorgt die elastische Kopplung für
eine Glättung des Energieprofils, da das Enzym nicht mehr auf thermische Stöße zur
Überwindung der hohen Arrhenius’schen Aktivierungsbarrieren angewiesen ist. Das zeigt
auch das experimentell ermittelte Elastizitätsmodul des aktiven Enzyms von 0,6·109 Nm-2,
das erstaunlich gut mit der Simulation eines elastisch gekoppelten Enzyms übereinstimmt.
96
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
6
Literaturverzeichnis
Abrahams, J. P., Leslie, A. G. W., Lutter, R. und Walker, J. E. (1994), "The structure of
F1-ATPase from bovine heart mitochondria determined at 2.8 Å resolution", Nature 370,
621-8.
Abrahams, J. P., Buchanan, S. K., van Raaij, M. J., Fearnley, I. M., Leslie, A. G. W. und Walker,
J. E. (1996), "The structure of bovine F1-ATPase complexed with the peptide antibiotic
efrapeptin", Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 9420-4.
Ahlbrink, S. (2006), "Mutagenesestudien an F-ATPasen aus E. coli", Doktorarbeit - Universität
Osnabrück, 1-147.
Al-Shawi, M. K., Ketchum, C. J. und Nakamoto, R. K. (1997), "Energy coupling, turnover, and
stability of the FOF1-ATP synthase are dependent on the energy of interaction between
gamma and β subunits", J. Biol. Chem. 272, 2300-6.
Althoff, G., Lill, H. und Junge, W. (1990), "The single channel conductance of CFO", Curr. Res.
Photosynth., 8th Proc. Int. Conf. Photosynth. 3, 133-6.
Angevine, C. M., Herold, K. A. und Fillingame, R. H. (2003), "Aqueous access pathways in
subunit a of rotary ATP synthase extend to both sides of the membrane", Proc. Natl. Acad.
Sci. 100, 13179-83.
Birkenhäger, R., Deckers-Hebestreit, G. und Altendorf, K. (1995), "The FO complex of the
Escherichia coli ATP synthase investigation by electron spectroscopic imaging and
immunoelectron microscopy", Eur. J. Biochem. 230, 58-67.
Boogerd, F. C., Boe, L., Michelsen, O. und Jensen, P. R. (1998), "atp Mutants of Escherichia coli
fail to grow on succinate due to a transport deficiency", J. Bacteriol. 180, 5855-9.
Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. und Walker, J. E. (2006), "How azide inhibits
ATP hydrolysis by the F-ATPases", Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 8646-9.
Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. und Walker, J. E. (2007), "Ground state
structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution", J. Biol. Chem.
282, 14238-42.
Boyer, P. D. (1993), "The binding change mechanism for ATP synthase - Some probabilities and
possibilities", Biochim. Biophys. Acta 1140, 215-50.
Braig, K., Menz, R. I., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. und Walker, J. E. (2000), "Structure of
bovine mitochondrial F1-ATPase inhibited by Mg2+ADP and aluminium fluoride", Structure
8, 567-73.
Careaga, C. L. und Falke, J. J. (1992a), "Structure and dynamics of Escherichia coli
chemosensory receptors. Engineered sulfhydryl studies", Biophys. J. 62, 209-16.
Careaga, C. L. und Falke, J. J. (1992b), "Thermal motions of surface alpha-helices in the
D-galactose chemosensory receptor. Detection by disulfide trapping", J. Mol. Biol. 226,
1219-35.
Cherepanov, D. A., Mulkidjanian, A. und Junge, W. (1999), "Transient accumulation of elastic
energy in proton translocating ATP synthase", FEBS Lett. 449, 1-6.
Cherepanov, D. A. und Junge, W. (2001), "Viscoelastic dynamics of actin filaments coupled to
rotary F-ATPase: Curvature as an indicator of the torque", Biophys. J. 81, 1234-44.
97
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Claggett, S. B., Grabar, T. B., Dunn, S. D. und Cain, B. D. (2007), "Functional Incorporation of
Chimeric b Subunits into F1FO-ATP Synthase", J. Bacteriol. 189, 5463-71.
Collinson, I. R., Runswick, M. J., Buchanan, S. K., Fearnley, I. M., Skehel, J. M., Vanjaaij, M. J.,
Griffiths, D. E. und Walker, J. E. (1994a), "FO membrane domain of ATP synthase from
bovine heart mitochondria - purification, subunit composition, and reconstitution with
F1-ATPase", Biochem. 33, 7971-8.
Collinson, I. R., van Raaij, M. J., Runswick, M. J., Fearnley, I. M., Skehel, J. M., Orriss, G. L.,
Miroux, B. und Walker, J. E. (1994b), "ATP synthase from bovine heart mitochondria. In
vitro assembly of a stalk complex in the presence of F1-ATPase and in its absence", J. Mol.
Biol. 242, 408-21.
Collinson, I. R., Skehel, J. M., Fearnley, I. M., Runswick, M. J. und Walker, J. E. (1996), "The
F1FO-ATPase complex from bovine heart mitochondria - the molar ratio of the subunits in the
stalk region linking the F 1 and FO domains", Biochem. 35, 12640-6.
Cross, R. L. (1981), "The mechanism and regulation of ATP synthesis by F1-ATPases", Annu. Rev.
Biochem. 50, 681-714.
Cunningham, D. und Cross, R. L. (1988), "Catalytic site occupancy during ATP hydrolysis by
MF1-ATPase. Evidence for alternating high affinity sites during steady-state turnover", J.
Biol. Chem. 263, 18850-6.
Dmitriev, O. Y., Jones, P. C., Jiang, H. und Fillingame, R. H. (1999), "Structure of the membrane
domain of subunit b of the Escherichia coli FOF1-ATP synthase", J. Biol. Chem. 274,
15598-604.
Duncan, T. M., Bulygin, V. V., Zhou, Y., Hutcheon, M. L. und Cross, R. L. (1995), "Rotation of
subunits during catalysis by Escherichia coli F1-ATPase", Proc. Natl. Acad. Sci. 92,
10964-8.
Fillingame, R. H., Jones, P. C., Jiang, W., Valiyaveetil, F. I. und Dmitriev, O. Y. (1998), "Subunit
organization and structure in the F0 sector of Escherichia coli F1FO-ATP synthase", Biochim.
Biophys. Acta 1365, 135-42.
Foster, T. J., Davis, M. A., Roberts, D. E., Takeshita, K. und Kleckner, N. (1981), "Genetic
Organization of Transposon Tn10", Cell 23, 201-13.
Foster, D. L. und Fillingame, R. H. (1982), "Stoichiometry of subunits in the proton-ATPase
complex of Escherichia coli", J. Biol. Chem. 257, 2009-15.
Gibbons, C., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. und Walker, J. E. (2000), "The structure of the
central stalk in bovine F1-ATPase at 2.4 Å resolution", Nat. Struct. Biol. 7, 1055-61.
Girvin, M. E., Rastogi, V. K., Abildgaard, F., Markley, J. L. und Fillingame, R. H. (1998),
"Solution structure of the transmembrane H+-transporting subunit c of the F1FO-ATP
synthase", Biochem. 37, 8817-24.
Grubmeyer, C., Cross, R. L. und Penefsky, H. S. (1982), "Mechanism of ATP hydrolysis by beef
heart mitochondrial ATPase. Rate constants for elementary steps in catalysis at a single
site.", J. Biol. Chem. 25, 12092-120100.
Hanahan, D. (1983), "Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids", J. Mol. Biol.
166, 557-80.
Hermolin, J., Dmitriev, O. Y., Zhang, Y. und Fillingame, R. H. (1999), "Defining the domain of
binding of F1 subunit ε with the polar loop of FO subunit c in the Escherichia coli ATP
synthase", J. Biol. Chem. 274, 17011-6.
98
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Hilbers, F. (2007), "Energielandschaft und Elastizität der F1-ATPase", Bachelorarbeit - Universität
Osnabrück, 1-105.
Hirono-Hara, Y., Noji, H., Nishiura, M., Muneyuki, E., Hara, K. Y., Yasuda, R., Kinosita, K., Jr.
und Yoshida, M. (2001), "Pause and rotation of F1-ATPase during catalysis", Proc. Natl.
Acad. Sci. 98, 13649-54.
Hirono-Hara, Y., Ishizuka, K., Kinosita, K., Jr., Yoshida, M. und Noji, H. (2005), "Activation of
pausing F1 motor by external force", Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 4288-93.
Hossain, M. D., Furuike, S., Maki, Y., Adachi, K., Ali, M. Y., Huq, M., Itoh, H., Yoshida, M. und
Kinosita, K., Jr. (2006), "The rotor tip inside a bearing of a thermophilic F1-ATPase is
dispensable for torque generation", Biophys. J. 90, 4195-203.
Howard, J. (2001), "Mechanics of motor proteins and cytoskeleton".
Hunt, A. J., Gittes, F. und Howard, J. (1994), "The force exerted by a single kinesin molecule
against a viscous load", Biophys. J. 67, 766-81.
Itoh, H., Takahashi, A., Adachi, K., Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M. und Kinosita, K. (2004),
"Mechanically driven ATP synthesis by F1-ATPase", Nature 427, 465-8.
Jiang, W., Hermolin, J. und Fillingame, R. H. (2001), "The preferred stoichiometry of c subunits in
the rotary motor sector of Escherichia coli ATP synthase is 10", Proc. Natl. Acad. Sci. 98,
4966-71.
Jones, T. A., Zou, J. Y., Cowan, S. W. und Kjeldgaard (1991), "Improved methods for binding
protein models in electron density maps and the location of errors in these models", Acta
Crystallogr. A 47, 110-9.
Junge, W., Lill, H. und Engelbrecht, S. (1997), "ATP synthase: an electrochemical transducer with
rotatory mechanics", Trends Biochem. Sci. 22, 420-3.
Junge, W. (1999), "ATP synthase and other motor proteins", Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4735-7.
Junge, W. und Nelson, N. (2005), "Nature’s rotary electromotors", Science 308, 642-4.
Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G. und Müller, D. M. (2006), "Novel
features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase",
EMBO J. 25, 5433-42.
Kagawa, R., Montgomery, M. G., Braig, K., Leslie, A. G. W. und Walker, J. E. (2004), "The
structure of bovine F1-ATPase inhibited by ADP and beryllium fluoride", EMBO J. 23,
2734-44.
Kaim, G. und Dimroth, P. (1995), "Construction, expression and characterization of a plasmidencoded Na+-specific ATPase hybrid consisting of Propionigenium modestum FO-ATPase
and Escherichia coli F1-ATPase", Eur. J. Biochem. 222, 615-23.
Kalckar, H. (1937), "Phosphorylation in kidney tissues", Enzymologia 2, 47-52.
Kashket, E. R. (1982), "Stoichiometry of the H+-ATPase of growing and resting, aerobic
Escherichia coli", B 21, 5534-8.
Kashket, E. R. (1985), "The proton motive force in bacteria: a critical assessment of methods",
Annu. Rev. Microbiol. 39, 219-42.
Klionsky, D. J., Brusilow, W. S. A. und Simoni, R. D. (1984), "In vivo evidence for the role of the
epsilon subunit as an inhibitor of the proton-translocating ATPase of Escherichia coli", J.
Bacteriol. 160, 1055-60.
99
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Konno, H., Murakami-Fuse, T., Fujii, F., Koyama, F., Ueoka-Nakanishi, H., Pack, C. G., Kinjo,
M. und Hisabori, T. (2006), "The regulator of the F1-motor: inhibition of rotation of
cyanobacterial F1-ATPase by the epsilon subunit", EMBO J. 25, 4596-604.
Kozlov, I. A., Milgrom, Y., Murataliev, M. B. und Vulfson, E. N. (1985), "The nucleotide binding
site of F1-ATPase which carries out unisite catalysis is one of the alternating active sites of
the enzyme", FEBS Lett. 189, 286-90.
Kuo, P. H., Ketchum, C. J. und Nakamoto, R. K. (1998), "Stability and functionality of
cysteine-less F1FO-ATP synthase from Escherichia coli", FEBS Lett. 426, 217-20.
Langemeyer, L. und Engelbrecht, S. (2007), "Essential arginine in subunit a and aspartate in
subunit c of FOF1-ATP synthase. Effect of repositioning within Helix 4 of subunit a and
Helix 2 of subunit c", Biochim. Biophys. Acta 1767, 998-1005.
LeBel, D., Poirier, G. G. und Beaudoin, A. R. (1978), "A convenient method for the ATPase
assay", Anal. Biochem. 85, 86-9.
Leslie, A. G. und Walker, J. E. (2000), "Structural model of F1-ATPase and the implications for
rotary catalysis", Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 355, 465-71.
Lill, H., Burkovski, A., Altendorf, K., Junge, W. und Engelbrecht, S. (1993), "Complementation of
Escherichia coli unc mutant strains by chloroplast and cyanobacterial F1-ATPase subunits",
Biochim. Biophys. Acta 1144, 278-84.
Lill, H., Hensel, F., Junge, W. und Engelbrecht, S. (1996), "Cross-linking of engineered subunit
delta to (alpha-beta)3 in chloroplast F-ATPase", J. Biol. Chem. 271, 32737-42.
Lipmann, F. (1941), "Metabolic generation and utilization of phosphate bond energy" Adv.
Enzymol. 1, 99-162.
Long, J. C., Wang, S. und Vik, S. B. (1998), "Membrane topology of subunit a of the F1FO-ATP
synthase as determined by labeling of unique cysteine residues", J. Biol. Chem. 273,
16235-40.
McLachlin, D. T. und Dunn, S. D. (1997), "Dimerization interactions of the b subunit of the
escherichia coli F1FO-ATPase", J. Biol. Chem. 272, 21233-9.
Mendelson, R. und Morris, E. P. (1997), "The structure of the acto-myosin subfragment 1
complex: results of searches using data from electron microscopy and x-ray
crystallography", Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8533-8.
Meier, T., Polzer, P., Diederichs, K., Welte, W., und Dimroth, P. (2005), "Structure of the rotor
ring of F-Type Na+-ATPase from Ilyobacter tartaricus", Science 308, 659-62.
Menz, R. I., Walker, J. E. und Leslie, A. G. (2001), "Structure of bovine mitochondrial F1-ATPase
with nucleotide bound to all three catalytic sites: implications for the mechanism of rotary
catalysis", Cell 106, 331-41.
Miller, M. J., Oldenburg, M. und Fillingame, R. H. (1990), "The essential carboxyl group in
subunit c of the F1FO-ATP synthase can be moved and H+-translocating function retained",
Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 4900-4.
Mitchell, P. (1961), "Coupling of photophosphorylation to electron and hydrogen transfer by a
chemiosmotic type of mechanism", Nature 191, 144-8.
Mitome, N., Suzuki, T., Hayashi, S. und Yoshida, M. (2004), "Thermophilic ATP synthase has a
decamer c-ring: indication of noninteger 10:3 H+/ATP ratio and permissive elastic coupling",
Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 12159-64.
100
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Müller, M., Pänke, O., Junge, W. und Engelbrecht, S. (2002), "F1-ATPase: The C-terminal end of
subunit γ is not required for ATP hydrolysis-driven rotation", J. Biol. Chem. 277, 23308-13.
Müller, M. (2004), "Das molekulare Drehlager der ATP-Synthase", Doktorarbeit - Universität
Osnabrück, 1-144.
Müller, M., Gumbiowski, K., Cherepanov, D. A., Winkler, S., Junge, W., Engelbrecht, S. und
Panke, O. (2004), "Rotary F1-ATPase. Is the C-terminus of subunit gamma fixed or
mobile?", Eur. J. Biochem. 271, 3914-22.
Murata, T., Yamato, I., Kakinuma, Y., Leslie, A. G., und Walker, J. E. (2005), "Structure of the
rotor of the V-Type Na+-ATPase from Enterococcus hirae", Science 308, 654-9.
Neumüller, O. A. (1979), "Römpps Chemie-Lexikon", 8. Auflage, Georg Thieme Verlag.
Nielsen, J., Hansen, F. G., Hoppe, J., Friedl, P. und von Meyenburg, K. (1981), "The
nucleotide sequence of the atp genes coding for the FO subunits a, b, c and the F1
subunit delta of the membrane bound ATP synthase of Escherichia coli", Mol. Gen.
Genet. 184, 33-9.
Nishio, K., Iwamoto-Kihara, A., Yamamoto, A., Wada, Y. und Futai, M. (2002), "Subunit rotation
of ATP synthase embedded in membranes: a or beta subunit rotation relative to the c subunit
ring", Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13448-52.
Nishizaka, T., Oiwa, K., Noji, H., Kimura, S., Muneyuki, E., Yoshida, M. und Kinosita, K., Jr.
(2004), "Chemomechanical coupling in F1-ATPase revealed by simultaneous observation of
nucleotide kinetics and rotation", Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 142-8.
Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M. und Kinosita, K., Jr. (1997), "Direct observation of the rotation
of F-ATPase", Nature 386, 299-302.
Noji, H., Häsler, K., Junge, W., Kinosita, K., Jr., Yoshida, M. und Engelbrecht, S. (1999),
"Rotation of Escherichia coli F1-ATPase ", Biochem. Biophys. Res. Comm. 260,
597-9.
Orriss, G. L., Leslie, A. G. W., Braig, K. und Walker, J. E. (1998), "Bovine F1-ATPase covalently
inhibited with 4-chloro-7-nitrobenzofurazan - the structure provides further support for a
rotary catalytic mechanism", Structure 6, 831-7.
Pänke, O. und Rumberg, B. (1999), "Kinetic modeling of rotary CFOF1-ATP synthase: storage of
elastic energy during energy transduction", Biochim. Biophys. Acta 1412, 118-28.
Pänke, O., Gumbiowski, K., Junge, W. und Engelbrecht, S. (2000), "F-ATPase: specific
observation of the rotating c subunit oligomer of EF OEF1", FEBS Lett. 472, 34-8.
Pänke, O., Cherepanov, D. A., Gumbiowski, K., Engelbrecht, S. und Junge, W. (2001),
"Viscoelastic dynamics of actin filaments coupled to rotary F-ATPase: Torque profile of the
enzyme", Biophys. J. 81, 1220-33.
Pardee, J. D. und Spudich, J. A. (1982), "Purification of muscle actin", Meth. Enzymol. 85,
164-70.
Pedersen, P. L. und Carafoli, E. (1987), "Ion motive ATPases. I. Ubiquity, properties and
significance to cell function", Trends Biochem. Sci. 12, 146-50.
Penefsky, H. S. (1988), "Rate of chase-promoted hydrolysis of ATP in the high affinity catalytic
site of beef heart mitochondrial ATPase", J. Biol Chem 263, 6020-2.
Rennekamp, H. (2006), "Redox-Kontrolle der Magnetfeld-getriebenen Rotation der F1-ATPase",
Diplomarbeit - Universität Osnabrück, 1-77.
101
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Revington, M., Dunn, S. D. und Shaw, G. S. (2002), "Folding and stability of the b subunit of the
F1FO-ATP synthase", Protein Sci. 11, 1227-38.
Richter, M. L., Gromet-Elhanan, Z. und McCarty, R. E. (1986), " Reconstitution of the
proton-ATPase complex of Rhodospirillum rubrum by the β subunit of the chloroplast
coupling factor 1", J. Biol. Chem. 261, 12109-13.
Rodgers, A. J. und Capaldi, R. A. (1998), "The second stalk composed of the b- and
delta-subunits connects FO to F1 via an alpha-subunit in the Escherichia coli ATP synthase",
J. Biol. Chem. 273, 29406-10.
Rodgers, A. J. und Wilce, M. C. (2000), "Structure of the gamma-varepsilon complex of ATP
synthase", Nat. Struct. Biol. 7, 1051-4.
Rondelez, Y., Tresset, G., Nakashima, T., Kato-Yamada, Y., Fujita, H., Takeuchi, S. und Noji, H.
(2005), "Highly coupled ATP synthesis by F1-ATPase single molecules", Nature 433, 773-7.
Sabbert, D., Engelbrecht, S. und Junge, W. (1996), "Intersubunit rotation in active F-ATPase",
Nature 381, 623-5.
Sabbert, D., Engelbrecht, S. und Junge, W. (1997), "Functional and idling rotatory motion within
F-ATPase", Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 4401-5.
Sabbert, D. und Junge, W. (1997), "Stepped versus continuous rotatory motors at the molecular
scale", Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 2312-7.
Sakaki, N., Shimo-Kon, R., Adachi, K., Itoh, H., Furuike, S., Muneyuki, E., Yoshida, M. und
Kinosita, K., Jr. (2005), "One rotary mechanism for F1-ATPase over ATP concentrations
from millimolar down to nanomolar", Biophys. J. 88, 2047-56.
Sambongi, Y., Iko, Y., Tanabe, M., Omote, H., Iwamoto-Kihara, A., Ueda, I., Yanagida, T., Wada,
Y. und Futai, M. (1999), "Mechanical rotation of the c subunit oligomer in ATP synthase
(FOF1): direct observation", Science 286, 1722-4.
Sanger, F., Nicklen, S. und Coulson, A. R. (1977), "DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-7.
Sedmak, J. J. und Grossberg, S. E. (1977), "A rapid, sensitive, and versatile assay for protein
using Coomassie brilliant blue G250", Anal. Biochem. 79, 544-52.
Seelert, H., Poetsch, A., Dencher, N. A., Engel, A., Stahlberg, H. und Müller, D. J. (2000),
"Proton-powered turbine of a plant motor", Nature 405, 418-9.
Seelert, H., Dencher, N. A. und Müller, D. J. (2003), "Fourteen protomers compose the oligomer
III of the proton-rotor in spinach chloroplast ATP synthase", J. Mol. Biol. 333, 337-44.
Senior, A. E., Lee, R. S., Al-Shawi, M. K. und Weber, J. (1992), "Catalytic properties of
Escherichia coli F1-ATPase depleted of endogenous nucleotides", Arch. Biochem. Biophys.
297, 340-4.
Senior, A. E., Nadanaciva, S. und Weber, J. (2002), "The molecular mechanism of ATP synthesis
by F1FO-ATP synthase", Biochim. Biophys. Acta 1553, 188-211.
Shimabukuro, K., Yasuda, R., Muneyuki, E., Hara, K. Y., Kinosita, K., Jr. und Yoshida, M.
(2003), "Catalysis and rotation of F1 motor: cleavage of ATP at the catalytic site occurs in
1 ms before 40 degree substep rotation", Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 14731-6.
Sielaff, H. (2002), "Viscoelastic properties of the system F-ATP synthase / F-actin", Diplomarbeit Universität Osnabrück, 1-59.
102
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Singh, S., Turina, P., Bustamante, C. J., Keller, D. J. und Capaldi, R. A. (1996), "Topographical
structure of membrane-bound Escherichia coli F1FO-ATP synthase in aqueous buffer", FEBS
Lett. 397, 30-4.
Stahlberg, H., Müller, D. J., Suda, K., Fotiadis, D., Engel, A., Meier, T., Matthey, U. und Dimroth,
P. (2001), "Bacterial Na+-ATP synthase has an undecameric rotor", EMBO Rep. 2, 229-33.
Steigmiller, S., Börsch, M., Gräber, P. und Huber, M. (2005), "Distances between the b-subunits in
the tether domain of FOF1-ATP synthase from E. coli", Biochim. Biophys. Acta 1708, 143-53.
Stock, D., Leslie, A. G. und Walker, J. E. (1999), "Molecular architecture of the rotary motor in
ATP synthase", Science 286, 1700-5.
Syroeshkin, A. V., Bakeeva, L. E. und Cherepanov, D. A. (1998), "Contraction transitions of
F1-FO-ATPase during catalytic turnover", Biochim. Biophys. Acta 1409, 59-71.
Tsunoda, S. P., Aggeler, R., Yoshida, M. und Capaldi, R. A. (2001), "Rotation of the c subunit
oligomer in fully functional F 1FO-ATP synthase", Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 898-902.
Ueno, H., Suzuki, T., Kinosita, K., Jr. und Yoshida, M. (2005), "ATP-driven stepwise rotation of
FOF1-ATP synthase", Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 1333-8.
Valiyaveetil, F. I. und Fillingame, R. H. (1997), "On the role of Arg-210 and Glu-219 of subunit a
in proton translocation by the Escherichia coli FOF1-ATP synthase", J. Biol. Chem. 272,
32635-41.
Valiyaveetil, F. I. und Fillingame, R. H. (1998), "Transmembrane topography of subunit a in the
Eescherichia coli F1FO-ATP synthase", J. Biol. Chem. 273, 16241-7.
van Raaij, M. J., Abrahams, J. P., Leslie, A. G. W. und Walker, J. E. (1996), "The structure of
bovine F1-ATPase complexed with the antibiotic inhibitor aurovertin B", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93, 6913-7.
Vriend, G. (1990), "WHAT IF: a molecular modeling and drug design program", J. Mol. Graph. 8,
52-6, 29.
Wada, T., Long, J. C., Zhang, D. und Vik, S. B. (1999), "A novel labeling approach supports the
five-transmembrane model of subunit a of the Escherichia coli ATP synthase", J. Biol Chem.
274, 17353-7.
Walker, J. E., Saraste, M. und Gay, N. J. (1984), "The unc operon. Nucleotide sequence,
regulation and structure of ATP synthase", Biochim. Biophys. Acta 768, 164-200.
Wang, H. Y. und Oster, G. (1998), "Energy transduction in the F1 motor of ATP synthase", Nature
396, 279-82.
Watts, S. D., Zhang, Y., Fillingame, R. H. und Capaldi, R. A. (1995), "The gamma subunit in the
Escherichia coli ATP synthase complex (ECF1FO) extends through the stalk and contacts the
c subunit of the FO part", FEBS Lett. 368, 235-8.
Weber, J., Wilke-Mounts, S., Lee, R. S. F., Grell, E. und Senior, A. E. (1993), "Specific placement
of tryptophan in the catalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase provides a direct probe of
nucleotide binding: maximal ATP hydrolysis occurs with three sites occupied", J. Biol.
Chem. 268, 20126-33.
Weber, J., Bowman, C. und Senior, A. E. (1996), "Specific tryptophan substitution in catalytic
sites of Escherichia coli F1-ATPase allows differentiation between bound substrate ATP and
product ADP in steady-state catalysis", J. Biol. Chem. 271, 18711-8.
Weber, J. und Senior, A. E. (2003), "ATP synthesis driven by proton transport in F1FO-ATP
synthase", FEBS Lett. 545, 61-70.
103
Literaturverzeichnis
_________________________________________________________________________
Wilkens, S., Dahlquist, F. W., Mcintosh, L. P., Donaldson, L. W. und Capaldi, R. A. (1995),
"Structural features of the epsilon subunit of the Escherichia coli ATP synthase determined
by NMR spectroscopy", Nature Struct. Biol. 2, 961-7.
Wilkens, S., Dunn, S. D., Chandler, J., Dahlquist, F. W. und Capaldi, R. A. (1997), "Solution
structure of the N-terminal domain of the delta subunit of the E. coli ATP synthase", Nature
Struct. Biol. 4, 198-201.
Winkler, S. (2001), "Viskoelastische Eigenschaften von F-Aktin und die rotierende ATPSynthase", Diplomarbeit - Universität Osnabrück, 1-82.
Wise, J. G. (1990), "Site-directed mutagenesis of the conserved beta subunit tyrosine 331 of
Escherichia coli ATP synthase yields catalytically active enzymes", J. Biol. Chem. 265,
10403-9.
Xie, H. (2006), "Winkelabhängiges Energieprofil der FOF1-ATPase", Bachelorarbeit - Universität
Osnabrück, 1-42.
Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., Jr. und Yoshida, M. (1998), "F1-ATPase is a highly efficient
molecular motor that rotates with discrete 120° steps", Cell 93, 1117-24.
Yasuda, R., Noji, H., Yoshida, M., Kinosita, K., Jr. und Itoh, H. (2001), "Resolution of distinct
rotational substeps by submillisecond kinetic analysis of F 1-ATPase", Nature 410, 898-904.
Yasuda, R., Masaike, T., Adachi, K., Noji, H., Itoh, H. und Kinosita, K., Jr. (2003), "The
ATP-waiting conformation of rotating F1-ATPase revealed by single-pair fluorescence
resonance energy transfer", Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 9314-8.
Zhang, Y. und Fillingame, R. H. (1994), "Essential aspartate in subunit c of F1FO-ATP synthase.
Effect of position 61 substitutions in helix-2 on function of Asp24 in helix-1", J. Biol. Chem.
269, 5473-9.
Zhang, Y. und Fillingame, R. H. (1995), "Subunits coupling H+ transport and ATP synthesis in the
Escherichia coli ATP synthase - cys-cys cross-linking of F 1 subunit epsilon to the polar loop
of FO subunit c", J. Biol. Chem. 270, 24609-14.
Zhou, Y. T., Duncan, T. M., Bulygin, V. V., Hutcheon, M. L. und Cross, R. L. (1996), "ATP
hydrolysis by membrane-bound Escherichia coli F0F1 causes rotation of the gamma subunit
relative to the beta subunits", Biochim. Biophys. Acta 1275, 96-100.
104
pSE1 - Sequenz
_________________________________________________________________________
7
Anhang
7.1
DNS- und Aminosäuresequenz von pSE1
Die Nukleinsäuren sind in Rot, die Aminosäuren in den codierenden Bereichen in Blau
nummeriert (Nielsen et al., 1981).
-27
1
o
CGGCCCTCAT TCGTGCGCTC TAGGATCAAG CTTTCAAAGT TCTGGCGATG TTGGTGTTAC
HindIII
34
TGGTGGTGGC GTTGGCGGTT TTAAAGGCGG TATTCTTGCC GCTGATCGTT ACGTGGGTTT
atpB2 Promotor aus uncI
94
TGGTGCTGGT GGTTCAGATA CTGGCACCGG CTGTAATTAA CAACAAAGGG TAAAAGGCAT
> a 155
20
oM A S
E N M
T P Q D
Y I G
H H L
N N L Q
CATGGCTTCA GAAAATATGA CGCCGCAGGA TTACATAGGA CACCACCTGA ATAACCTTCA
214
40
L D L
R T F
S L V D
P Q N
P P A
T F W T
GCTGGACCTG CGTACATTCT CGCTGGTTGA TCCACAAAAC CCCCCAGCCA CCTTCTGGAC
274
60
I N I
D S M
F F S V
V L G
L L F
L V L F
AATCAATATT GACTCCATGT TCTTCTCGGT GGTGCTGGGT CTGTTGTTCC TGGTTTTATT
334
80
R S V
A K K
A T S G
V P G
K F Q
T A I E
CCGTAGCGTA GCCAAAAAGG CGACCAGCGG TGTGCCAGGT AAGTTTCAGA CCGCGATTGA
394
110
L V I
G F V
N G S V
K D M
Y H G
K S K L
GCTGGTGATC GGCTTTGTTA ATGGTAGCGT GAAAGACATG TACCATGGCA AAAGCAAGCT
454
130
I A P
L A L
T I F V
W V F
L M N
L M D L
GATTGCTCCG CTGGCCCTGA CGATCTTCGT CTGGGTATTC CTGATGAACC TGATGGATTT
514
150
L P I
D L L
P Y I A
E H V
L G L
P A L R
ACTGCCTATC GACCTGCTGC CGTACATTGC TGAACATGTA CTGGGTCTGC CTGCACTGCG
574
170
V V P
S A D
V N V T
L S M
A L G
V F I L
TGTGGTTCCG TCTGCGGACG TGAACGTAAC GCTGTCTATG GCACTGGGCG TATTTATCCT
634
190
I L F
Y S I
K M K G
I G G
F T K
E L T L
GATTCTGTTC TACAGCATCA AAATGAAAGG CATCGGCGGC TTCACGAAAG AGTTGACGCT
694
210
Q P F
N H W
A F I P
V N L
I L E
G V S L
GCAGCCGTTC AATCACTGGG CGTTCATTCC TGTCAACTTA ATCCTTGAAG GGGTAAGCCT
754
230
L S K
P V S
L G L R
L F G
N M Y
A G E L
GCTGTCCAAA CCAGTTTCAC TCGGTTTGCG ACTGTTCGGT AACATGTATG CCGGTGAGCT
814
250
I F I
L I A
G L L P
W W S
Q W I
L N V P
GATTTTCATT CTGATTGCTG GTCTGTTGCC GTGGTGGTCA CAGTGGATCC TGAATGTGCC
874
270
W A I
F H I
L I I T
L Q A
F I F
M V L T
GTGGGCCATT TTCCACATCC TGATCATTAC GCTGCAAGCC TTCATCTTCA TGGTTCTGAC
934
970
105
Anhang
_________________________________________________________________________
I V Y
L S M
A S E E
H
o
GATCGTCTAT CTGTCGATGG CGTCTGAAGA ACATTAATTT ACCAACACTA CTACGTTTTA
994
> c 1017
12
oM E
N L N M
D L L
Y M A
ACTGAAACAA ACTGGAGACT GTCATGGAAA ACCTGAATAT GGATCTGCTG TACATGGCTG
1054
32
A A V M
M G L
A A I
G A A I
G I G
I L G
CCGCTGTGAT GATGGGTCTG GCGGCAATCG GTGCTGCGAT CGGTATCGGC ATCCTCGGGG
1114
52
G K F L
E G A
A R Q
P D L I
P L L
R T Q
GTAAATTCCT GGAAGGCGCA GCGCGTCAAC CTGATCTGAT TCCTCTGCTG CGTACTCAGT
1174
72
F F I V
M G L
V D A
I P M I
A V G
L G L
TCTTTATCGT TATGGGTCTG GTGGATGCTA TCCCGATGAT CGCTGTAGGT CTGGGTCTGT
1234
1286
Y V M F
A V A
S W S
H P Q F
E K
o
ACGTGATGTT CGCTGTCGCT AGCTGGAGCC ACCCGCAGTT CGAGAAATAG TAAGCGATGC
NheI Strep-tag
NsiI
1294
> b 1345
3
oM N L
ATTTATTTAA AGAGCAATAT CAGAACGTTA ACTAAATAGA GGCATTGTGC TGTGAATCTT
1354
23
N A T
I L G Q
A I A
F V L
F V L F
A M K
AACGCAACAA TCCTCGGCCA GGCCATCGCG TTTGTCCTGT TCGTTCTGTT CGCCATGAAG
1414
43
Y V W
P P L M
A A I
E K R
Q K E I
A D G
TACGTATGGC CGCCATTAAT GGCAGCCATC GAAAAACGTC AAAAAGAAAT TGCTGACGGC
1474
63
L A S
A E R A
H K D
L D L
A K A S
A T D
CTTGCTTCCG CAGAACGAGC ACATAAGGAC CTTGACCTTG CAAAGGCCAG CGCGACCGAC
1534
83
Q L K
K A K A
E A Q
V I I
E Q A N
K R R
CAGCTGAAAA AAGCGAAAGC GGAAGCCCAG GTAATCATCG AGCAGGCGAA CAAACGCCGC
1594
103
S Q I
L D E A
K A E
A E Q
E R T K
I V A
TCGCAGATTC TGGACGAAGC GAAAGCTGAG GCAGAACAGG AACGTACTAA AATCGTGGCC
1654
123
Q A Q
A E I E
A E R
K R A
R E E L
R K Q
CAGGCGCAGG CGGAAATTGA AGCCGAGCGT AAACGTGCCC GTGAAGAGCT GCGTAAGCAA
1714
143
V A I
L A V A
G A E
K I I
E R S V
D E A
GTTGCTATCC TGGCTGTTGC TGGCGCCGAG AAGATCATCG AACGTTCCGT GGATGAAGCT
1774
1815
> δ 1830 1
A N S
D I V D
K L V
A E L
o
oM
GCTAACAGCG ACATCGTGGA TAAACTTGTC GCTGAACTGT AAGGAGGGAG GGGCTGATGT
1834
21
S E F I
T V A
R P Y
A K A A
F D F
A V E
CTGAATTTAT TACGGTAGCT CGCCCCTACG CCAAAGCAGC TTTTGACTTT GCCGTCGAAC
1894
41
H Q S V
E R W
Q D M
L A F A
A E V
T K N
ACCAAAGTGT AGAACGCTGG CAGGACATGC TGGCGTTTGC CGCCGAGGTA ACCAAAAACG
1954
61
E Q M A
E L L S G A
L A P E
T L A
E S F
AACAAATGGC AGAGCTTCTC TCTGGCGCGC TTGCGCCAGA AACGCTCGCC GAGTCGTTTA
2014
81
I A V A
G E Q
L D E
N G Q N
L I R
V M A
TCGCAGTTGC TGGTGAGCAA CTGGACGAAA ACGGTCAGAA CCTGATTCGG GTTATGGCTG
106
pSE1 - Sequenz
_________________________________________________________________________
2074
101
E N G R
L N A
L P D
V L E Q
F I H
L R A
AAAATGGTCG TCTTAACGCG CTCCCGGATG TTCTGGAGCA GTTTATTCAC CTGCGTGCCG
2134
121
V S E A
T A E
V D V
I S A A
A L S
E Q Q
TGAGTGAGGC TACCGCTGAG GTAGACGTCA TTTCCGCTGC CGCACTGAGT GAACAACAGC
2194
141
L A K I
S A A
M E K
R L S R
K V K
L N A
TCGCGAAAAT TTCTGCTGCG ATGGAAAAAC GTCTGTCACG CAAAGTTAAG CTGAATGCCA
2254
161
K I D K
S V M
A G V
I I R A
G D M
V I D
AAATCGATAA GTCTGTAATG GCAGGCGTTA TCATCCGAGC GGGTGATATG GTCATTGATG
2314
2263
G S V R
G R L
E R L
A D V L
Q S
o
GCAGCGTACG CGGTCGTCTT GAGCGCCTTG CAGACGTCTT GCAGTCTTAA GGGGACTGGA
> α 2377
19
oM Q L
N S T
E I S
E L I K
Q R I
A Q F
GCATGCAACT GAATTCCACC GAAATCAGCG AACTGATCAA GCAGCGCATT GCTCAGTTCA
2434
39
N V V S
E A H
N E G
T I V S
V S D
G V I
ATGTTGTGAG TGAAGCTCAC AACGAAGGTA CTATTGTTTC TGTAAGTGAC GGTGTTATCC
2494
59
R I H G
L A D
A M Q
G E M I
S L P
G N R
GCATTCACGG CCTGGCCGAT GCTATGCAGG GTGAAATGAT CTCCCTGCCG GGTAACCGTT
2554
79
Y A I A
L N L
E R D
S V G A
V V M
G P Y
ACGCTATCGC ACTGAACCTC GAGCGCGACT CTGTAGGTGC GGTTGTTATG GGTCCGTACG
XhoI
2614
99
A D L A
E G M
K V K
A T G R
I L E
V P V
CTGACCTTGC CGAAGGCATG AAAGTTAAGG CTACTGGCCG TATCCTGGAA GTTCCGGTTG
2674
119
G R G L
L G R
V V N
T L G A
P I D
G K G
GCCGTGGCCT GCTGGGCCGT GTGGTTAACA CTCTGGGTGC ACCAATCGAC GGTAAAGGTC
ApaLI
2734
139
P L D H
D G F
S A V
E A I A
P G V
I E R
CGCTGGATCA CGACGGCTTC TCTGCTGTAG AAGCAATCGC TCCGGGCGTT ATCGAACGTC
2794
159
Q S V D
Q P V
Q T G
Y K A V
D S M
I P I
AGTCCGTAGA TCAGCCGGTA CAGACCGGTT ATAAAGCCGT TGACTCCATG ATCCCAATCG
2854
179
G R G Q
R E L
I I G
D R Q T
G K T
A L A
GTCGTGGTCA GCGTGAATTG ATCATCGGTG ACCGTCAGAC AGGTAAAACC GCACTGGCTA
2914
199
I D A I
I N Q
R D S
G I K A
I Y V
A I G
TCGATGCCAT CATCAACCAG CGCGATTCCG GTATCAAAGC TATCTATGTC GCTATCGGCC
2974
219
Q K A S
T I S
N V V
R K L E
E H G
A L A
AGAAAGCGTC CACCATTTCT AACGTGGTAC GTAAACTGGA AGAGCACGGC GCACTGGCTA
3034
239
N T I V
V V A
T A S
E S A A
L Q Y
L A P
ACACCATCGT TGTGGTAGCA ACCGCGTCTG AATCCGCTGC ACTGCAATAC CTGGCACCGT
3094
259
Y A G A
A M G
E Y F
R D R G
E D A
L I I
ATGCCGGTGC CGCCATGGGT GAATACTTCC GTGACCGCGG TGAAGATGCG CTGATCATTT
3154
279
Y D D L
S K Q
A V A
Y R Q I
S L L
L R R
ACGATGACCT GTCTAAACAG GCTGTTGCTT ACCGTCAGAT CTCCCTGCTG CTCCGTCGTC
107
Anhang
_________________________________________________________________________
3214
299
P P G R
E A F
P G D
V F Y L
H S R
L L E
CGCCAGGACG TGAAGCATTC CCGGGCGACG TTTTCTACCT CCACTCTCGT CTGCTGGAGC
3274
319
R A A R
V N A
E Y V
E A F T
K G E
V K G
GTGCTGCACG TGTTAACGCC GAATACGTTG AAGCCTTCAC CAAAGGTGAA GTGAAAGGGA
3334
339
K T G S
L T A
L P I
I E T Q
A G D
V S A
AAACCGGTTC TCTGACCGCA CTGCCGATTA TCGAAACTCA GGCGGGTGAC GTTTCTGCGT
3394
359
F V P T
N V I
S I T
D G Q I
F L E
T N L
TCGTTCCGAC CAACGTAATC TCCATTACCG ATGGTCAGAT CTTCCTGGAA ACCAACCTGT
3454
379
F N A G
I R P
A V N
P G I S
V S R
V G G
TCAACGCCGG TATTCGTCCT GCGGTTAACC CGGGTATTTC CGTATCCCGT GTTGGTGGTG
3514
399
A A Q T
K I M
K K L
S G G I
R T A
L A Q
CAGCACAGAC CAAGATCATG AAAAAACTGT CCGGTGGTAT CCGTACCGCT CTGGCACAGT
3574
419
Y R E L
A A F
S Q F
A S D L
D D A
T R K
ATCGTGAACT GGCAGCGTTC TCTCAGTTTG CATCCGACCT TGACGATGCA ACACGTAAGC
3634
439
Q L D H
G Q K
V T E
L L K Q
K Q Y
A P M
AGCTTGACCA CGGTCAGAAA GTGACCGAAC TGCTGAAACA GAAACAGTAT GCGCCGATGT
3694
459
S V A Q
Q S L
V L F
A A E R
G Y L
A D V
CCGTTGCGCA GCAGTCTCTG GTTCTGTTCG CAGCAGAACG TGGTTACCTG GCGGATGTTG
3754
479
E L S K
I G S
F E A
A L L A
Y V D
R D H
AACTGTCGAA AATTGGCAGC TTCGAAGCCG CTCTGCTGGC TTACGTCGAC CGTGATCACG
3814
499
A P L M Q E I
N Q T
G G Y N
D E I
E G K
CTCCGTTGAT GCAAGAGATC AACCAGACCG GTGGCTACAA CGACGAAATC GAAGGCAAGC
3874
3917
L K G I
L D S
F K A
T Q S W
o
TGAAAGGCAT CCTCGATTCC TTCAAAGCAA CCCAATCCTG GTAACGTCTG GCGGGTACCC
> γ 3941
8
o(M)A
G A K
E I R S
TTAGGGCAGG CCGCAAGGCA TTGAGGAGAA GCTCATGGCC GGCGCAAAAG AGATACGTAG
3934
3994
28
K I A
S V Q
N T Q K
I T K
A M E
M V A A
TAAGATCGCA AGCGTCCAGA ACACGCAAAA GATCACTAAA GCGATGGAGA TGGTCGCCGC
4054
48
S K M
R K S
Q D R M
A A S
R P Y
A E T M
TTCCAAAATG CGTAAATCGC AGGATCGCAT GGCGGCCAGC CGTCCTTATG CAGAAACCAT
4114
68
R K V
I G H
L A H G
N L E
Y K H
P Y L E
GCGCAAAGTG ATTGGTCACC TTGCACACGG TAATCTGGAA TATAAGCACC CTTACCTGGA
4174
88
D R D
V K R
V G Y L
V V S
T D R
G L A G
AGACCGCGAC GTTAAACGCG TGGGCTACCT GGTGGTGTCG ACCGACCGTG GTTTGGCGGG
MluI
SexAI
4234
108
G L N
I N L
F K K L
L A E
M K T
W T D K
TGGTTTGAAC ATTAACCTGT TCAAAAAACT GCTGGCGGAA ATGAAGACCT GGACCGACAA
4294
128
A M I G
S K G
V S F
F N S V
G V Q
A D L
AGGCGTTCAA GCCGACCTCG CAATGATCGG CTCGAAAGGC GTGTCGTTCT TCAACTCCGT
108
pSE1 - Sequenz
_________________________________________________________________________
4354
148
G G N
V V A
Q V T G
M G D
N P S
L S E L
GGGCGGCAAT GTTGTTGCCC AGGTCACCGG CATGGGGGAT AACCCTTCCC TGTCCGAACT
4414
168
I G P
V K V
M L Q A
Y D E
G R L
D K L Y
GATCGGTCCG GTAAAAGTGA TGTTGCAGGC CTACGACGAA GGCCGTCTGG ACAAACTTTA
RsrII
4474
188
I V S
N K F
I N T M
S Q V
P T I
S Q L L
CATTGTCAGC AACAAATTTA TTAACACCAT GTCTCAGGTT CCGACCATCA GCCAGCTGCT
4534
208
P L P
A S D
D D D L
K H K
S W D
Y L Y E
GCCGTTACCG GCATCAGATG ATGATGATCT GAAACATAAA TCCTGGGATT ACCTGTACGA
4594
228
P D P
K A L
L D T L
L R R
Y V E
S Q V Y
ACCCGATCCG AAGGCGTTGC TGGATACCCT GCTGCGTCGT TATGTCGAAT CTCAGGTTTA
4654
248
Q G V
V E N
L A S E
Q A A
R M V
A M K A
TCAGGGCGTG GTTGAAAACC TGGCCAGCGA GCAGGCCGCC CGTATGGTGG CGATGAAAGC
4714
268
A T D
N G G
S L I K
E L Q
L V Y
N K A R
CGCGACCGAC AATGGCGGCA GCCTGATTAA AGAGCTGCAG TTGGTATACA ACAAAGCTCG
4774
4831
Q A S
I T Q
E L T E
I V S
G A A
A V
o
TCAGGCCAGC ATTACTCAGG AACTCACCGA GATCGTCTCG GGGGCCGCCG CGGTTTAAAC
> β 4858
11
o(M)R
G S H
H H H H
H G M
AGGTTATTTC GTAGAGGATT TAATATGAGA GGATCGCATC ATCATCATCA TCATGGTATG
His-tag
4834
4894
31
A T G
K I V Q
V I G
A V V
D V E F
P Q D
GCTACTGGAA AGATTGTCCA GGTAATCGGC GCCGTAGTTG ACGTCGAATT CCCTCAGGAT
4954
51
A V P
R V Y D A L E
V Q N
G N E R
L V L
GCCGTACCGC GCGTGTACGA TGCTCTTGAG GTGCAAAATG GTAATGAGCG TCTGGTGCTG
Primer A3
5014
71
E V Q
Q Q L G
G G I
V R T
I A M G
S S D
GAAGTTCAGC AGCAGCTCGG CGGCGGTATC GTACGTACCA TCGCAATGGG TTCCTCCGAC
5074
91
G L R
R G L D
V K D
L E H
P I E V
P V G
GGTCTGCGTC GCGGTCTGGA TGTAAAAGAC CTCGAACACC CGATTGAAGT CGGTCGACAT
5134
111
K A T
L G R I
M N V
L G E
P V D M
K G E
CCCGGTAGGT AAAGCGACTC TGGGCCGTAT CATGAACGTA CTGGGTGAAC GAAAGGCGAG
5194
131
I G E
E E R W
A I H
R A A
P S Y E
E L S
ATCGGTGAAG AAGAGCGTTG GGCGATTCAC CGCGCAGCAC CTTCCTACGA AGAGCTGTCA
5254
151
N S Q
E L L E
T G I
K V I
D L M A
P F A
AACTCTCAGG AACTGCTGGA AACCGGTATC AAAGTTATCG ACCTGATGGC TCCGTTCGCT
5314
171
K G G
K V G L
F G G
A G V
G K T V
N M M
AAGGGCGGTA AAGTTGGTCT GTTCGGTGGT GCGGGTGTAG GTAAAACCGT AAACATGATG
5374
191
E L I
R N I A
I E H
S G Y
S V F A
G V G
GAGCTCATTC GTAACATCGC GATCGAGCAC TCCGGTTACT CTGTGTTTGC GGGCGTAGGT
SacI
5434
211
109
Anhang
_________________________________________________________________________
E R T
R E G N
D F Y
H E M
T D S N
V I D
GAACGTACTC GTGAGGGTAA CGACTTCTAC CACGAAATGA CCGACTCCAA CGTTATCGAC
5494
231
K V S
L V Y G
Q M N
E P P
G N R L
R V A
AAAGTATCCC TGGTGTATGG CCAGATGAAC GAGCCGCCGG GAAACCGTCT GCGCGTTGCT
5554
251
L T G
L T M A
E K F
R D E
G R D V
L L F
CTGACCGGTC TGACCATGGC TGAGAAATTC CGTGACGAAG GTCGTGACGT TCTGCTGTTC
5614
271
V D N
I Y R Y
T L A
G T E
V S A L
L G R
GTTGACAACA TCTATCGTTA CACCCTGGCC GGTACGGAAG TATCCGCACT GCTGGGCCGT
5674
291
M P S
A V G Y
Q P T
L A E
E M G V L Q E
ATGCCTTCAG CGGTAGGTTA TCAGCCGACC CTGGCGGAAG AGATGGGCGT TCTGCAGGAA
5734
311
R I T
S T K T
G S I
T S V
Q A V Y
V P A
CGTATCACCT CCACCAAAAC TGGTTCTATC ACCTCCGTAC AGGCAGTATA CGTACCTGCG
5794
331
D D L
T D P S
P A T
T F A
H L D A
T V V
GATGACTTGA CTGACCCGTC TCCGGCAACC ACCTTTGCGC ACCTTGACGC AACCGTGGTA
5854
351
L S R
Q I A S
L G I
Y P A
V D P L
D S T
CTGAGCCGTC AGATCGCGTC TCTGGGTATC TACCCGGCCG TTGACCCGCT GGACTCCACC
5914
371
S R Q
L D P L
V V G
Q E H
Y D T A
R G V
AGCCGTCAGC TGGACCCGCT GGTGGTTGGT CAGGAACACT ACGACACCGC GCGTGGCGTT
5974
391
Q S I
L Q R Y
Q E L
K D I
I A I L
G M D
CAGTCCATCC TGCAACGTTA TCAGGAACTG AAAGACATCA TCGCCATCCT GGGTATGGAT
6034
411
E L S
E E D K
L V V
A R A
R K I Q
R F L
GAACTGTCTG AAGAAGACAA ACTGGTGGTA GCGCGTGCTC GTAAGATCCA GCGCTTCCTG
6094
431
S Q P
F F V A
E V F
T G S
P G K Y
V S L
TCCCAGCCGT TCTTCGTGGC AGAAGTATTC ACCGGTTCTC CGGGTAAATA CGTCTCCCTG
6154
451
K D T
I R G F K G I
M E G
E Y D H
L P E
AAAGACACCA TCCGTGGCTT TAAAGGCATC ATGGAAGGCG AATACGATCA CCTGCCGGAG
6214
6273
Q A F
Y M V G
S I E
E A V
E K A K
K L
o
CAGGCGTTCT ACATGGTCGG TTCCATCGAA GAAGCTGTGG AAAAAGCCAA AAAACTTTAA
> ε 6294
12
o(M)A M
T Y H L
D V V
S A E
CGCCTTAATC GGAGGGTGAT ATGGCAATGA CTTACCACCT GGACGTCGTC AGCGCAGAGC
6274
6334
32
Q Q M F
S G L
V E K
I Q V T
G S E
G E L
AACAAATGTT CTCTGGTCTG GTCGAGAAAA TCCAGGTAAC GGGTAGCGAA GGTGAACTGG
6394
52
G I Y P
G H A
P L L
T A I K
P G M
I R I
GGATCTACCC TGGCCACGCA CCGCTGCTCA CCGCCATTAA GCCTGGTATG ATTCGCATCG
6454
72
V K Q H
G H E
E F I
Y L S G
G I L
E V Q
TGAAACAGCA CGGTCACGAA GAGTTTATCT ATCTGTCTGG CGGCATTCTT GAAGTGCAGC
6514
92
P G N V
T V L
A D T
A I R G
Q D L
D E A
CTGGCAACGT GACCGTTCTG GCCGACACCG CAATTCGCGG CCAGGATCTC GACGAAGCGC
110
pSE1 - Sequenz
_________________________________________________________________________
6574
112
R A M E
A K R
K A E
E H I S
S S H
G D V
GAGCCATGGA AGCGAAACGT AAGGCTGAAG AGCACATTAG CAGCTCTCAC GGCGACGTAG
6634
132
D Y A Q
A S A
E L A
K A I A
Q L R
V I E
ATTACGCTCA GGCGTCTGCG GAACTGGCCA AAGCGATCGC GCAGCTGCGC GTTATCGAGT
6694
6713
L T K K
A M
o
TGACCAAAAA AGCGATGTAA CACCGGCTTG AAAAGCACAA AAGCCAGTCT GGAAACAGGC
Terminator?
6754
TGGCTTTTTT TTGCGCGTGT GACCCGTCCT GAATAGCGTT CACATAGATC CTGCTGATAT
6774
AAAACCCCCC TGTTTTCCTG TTTATTCATT GATCGAAATA AGAGCAAAAA CATCCACCTG
6874
ACGCTTAAAT TAAGGTACTG CCTTAATTTT CTGCAGACAA AAGGCGTGAC GATGGTCGAA
6924
AATGGCGCTT TCGTCAGCGG GGATAATCCG TTATTGAACA ATTTATCCTC TGTCCATTTC
6974
ACGATGAAAA AAATGTAGTT TTTTCAAGGT GAAGCGGTTT GACTCTAGAG TCGACTCTAG
XbaI
7034
CGGAGTGTAT ACTGGCTTAC TATGTTGGCA CTGATGAGGG TGTCAGTGAA GTGCTTCATG
7094
TGGCAGGAGA AAAAAGGCTG CACCGGTGCG TCAGCAGAAT ATGTGATACA GGATATATTC
7154
CGCTTCCTCG CTCACTGACT CGCTACGCTC GGTCGTTCGA CTGCGGCGAG CGGAAATGGC
7214
TTACGAACGG GGCGGAGATT TCCTGGAAGA TGCCAGGAAG ATACTTAACA GGGAAGTGAG
7274
AGGGCCGCGG CAAAGCCGTT TTTCCATAGG CTCCGCCCCC CTGACAAGCA TCACGAAATC
7334
TGACGCTCAA ATCAGTGGTG GCGAAACCCG ACAGGACTAT AAAGATACCA GGCGTTTCCC
7394
CCTGGCGGCT CCCTCGTGCG CTCTCCTGTT CCTGCCTTTC GGTTTACCGG TGTCATTCCG
7454
CTGTTATGGC CGCGTTTGTC TCATTCCACG CCTGACACTC AGTTCCGGGT AGGCAGTTCG
7514
CTCCAAGCTG GACTGTATGC ACGAACCCCC CGTTCAGTCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG
ApaLI?
7574
TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGAAAG ACATGCAAAA GCACCACTGG CAGCAGCCAC
7634
TGGTAATTGA TTTAGAGGAG TTAGTCTTGA AGTCATGCGC CGGTTAAGGC TAAACTGAAA
7694
GGACAAGTTT TGGTGACTGC GCTCCTCCAA GCCAGTTACC TCGGTTCAAA GAGTTGGTAG
7754
CTCAGAGAAC CTTCGAAAAA CCGCCCTGCA AGGCGGTTTT TTCGTTTTCA GAGCAAGAGA
7814
TTACGCGCAG ACCAAAACGA TCTCAAGAAG ATCATCTTAT TAAGGGGTCT GACGCTCAGT
7874
GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT
7934
AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA AAGTATATAT GAGTAAACTT
7994
8004
o
GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC
Amp-Resistenz auf antisense-Strang
111
Anhang
_________________________________________________________________________
8054
GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC
8114
CATCTGGCCCC AGTGCTGCA TGTCTATTTC ATGATACCGC GAGACCCACG CTCACCGGCT
8174
CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA
8234
ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG
8294
CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTGCAG GCATCGTGGT GTCACGCTCG
8354
TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT CAAGGCGAGT TACATGATCC
8414
CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC CGATCGTTGT CAGAAGTAAG
8474
TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC ATAATTCTCT TACTGTCATG
8534
CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA CCAAGTCATT CTGAGAATAG
ScaI
8594
TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAACAC GGGATAATAC CGCGCCACAT
8654
AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG
8714
ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC GTGCACCCAA CTGATCTTCA
ApaLI
8774
GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA CAGGAAGGCA AAATGCCGCA
8834
8874
o
AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA TACTCTTCCT TTTTCAATAT
8894
TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT ACATATTTGA ATGTATTTAG
8954
AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA AAGTGCCACC TGACGTCTAA
9014
GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC GTATCACGAG GCCCTTTCGT
9074
CTTCAAGAAT TTTATAAACC GTGGAGCGGG CAATACTGAG CTGATGAGCA ATTTCCGTTG
9134
CACCAGTGCC CTTCTGATGA AGCGTCAGCA CGACGTTCCT GTCCACGGTA CGCCTGCGGC
9194
CAAATTTGAT TCCTTTCAGC TTTGCTTCCT GTCGGCCCTC ATTCGTGCGC TCTAGGATC
7.2
Matlab - Routinen
Die folgenden Abschnitte umfassen die Matlab-Programme sowie die anhängigen
Funktionen und Scripte. Die einzelnen Programmschritte werden durch Kommentare
(grün) erläutert.
112
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
7.2.1
Programm: Kreuzkorrelation
clear all
close all
directory=''; % Verzeichnis mit den Referenzdaten
hist50_1=strcat(directory,'\kreuz1.dat'); % Referenzdaten
directory=''; % Verzeichnis mit den anzupassenden Daten
fhist50_2=strcat(directory,'\kreuz2.dat'); % anzupassende Daten
hist50_1=load(fhist50_1);
hist50_2=load(fhist50_2);
bin=72;
% Anzahl der Bins im Histogramm
figure(1)
set(gcf,'Position',[650 540 560 420])
subplot(1,2,1)
bar(hist50_1(:,1),hist50_1(:,2))
xlim([0 360])
title('Histogramm - Referenz')
subplot(1,2,2)
bar(hist50_2(:,1),hist50_2(:,2))
xlim([0 360])
title('Histogramm - wird angepasst')
% Kreuzkorrelation
f=zeros(1,bin);
for k=1:bin
for i=1:bin
j=i+k;
if j>bin; j=j-bin; end
f(k)=f(k)+(hist50_2(i,2)*hist50_1(j,2));
end
end
[wert,index]=max(f)
ergebnis=strcat('Fitwert:',num2str(index)); % Ausgabe des Ergebnises
figure(2)
set(gcf,'Position',[650 30 560 420])
plot(f)
xlim([1 bin])
title(ergebnis)
7.2.2
Programm: Motorkontrolle
%
%
%
%
%
Motorsteuerungsprogramm, Befehle für den 200-Schrittmotor
1) Programmmodus m: mv/r#1/#2
v/r: Drehrichtung: vorwärts (v) oder rückwärts (r)
#1: Anzahl von Schritten (00000-65000), die der Motor ausführt
#2: Zeit (ms), die der Motor zwischen Steps pausieren soll
%
%
%
%
2) Programmmodus x: xv/r#2
v/r: Drehrichtung: vorwärts (v) oder rückwärts (r)
#2: (1-99) Zeit (1-99 ms), die der Motor zwischen Steps pausieren soll
Der Motor dreht sich kontinuierlich bis ein serieller Interrupt kommt
%
%
%
%
3) Programmmodus y: yv/r#2
v/r: Drehrichtung: vorwärts (v) oder rückwärts (r)
#2: (1-99) Zeit (10-990 ms), die der Motor zwischen Steps pausieren soll
Der Motor dreht sich kontinuierlich bis ein serieller Interrupt kommt
% Nach jedem Schritt sendet der Controller ein akustisches Signal mit 5 kHz und
% 20 Schwingungen
% Initialisierung des seriellen Ports und Auflistung der Porteigenschaften
s1=serial('com1','terminator','CR','BAUD',9600);
get(s1,{'BAUD','Type','Name','Port','Terminator','Parity'})
s1
fclose(s1);
113
Anhang
_________________________________________________________________________
% Befehlseingabe und Übergabe an den seriellen Port zum starten des Motors
n='t';
while n~='q' % Die Eingabe von 'q' beendet das Programm
n=input('Befehlseingabe: ', 's');
fopen(s1); fprint(s1,n); fclose(s1);
end
7.2.3
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
Programm: Rotationsanalys
Routine zur Analyse rotierender Actinfilamente
Stand: Juli 2007, Programmierer: Hendrik Sielaff, Oliver Pänke
Eigenschaften:
Automatische Mittelpunktssuche
Auswahl der analysierbaren Pixel
Kontrastverstärkung der Bilder
Lineare Regression zur Winkelbestimmung des Filaments
Projektion des entferntesten Punktes auf die Regressionsgerade
maximal erlaubte Vorwärtsdrehung des Filaments einstellbar
Analyse von zwei Bildsequenzen des selben Filaments
Entweder Max der 2. Seq auf 180° oder globales Max der 1. Seq 63° legen
Klassenbreite der Histogramme frei wählbar
Darstellung: Trajektorie (Umdrehungen vs Zeit)
Darstellung: Endpunkte
Darstellung: Histogramm der winkelabhängigen Aufenthaltswahrscheinlichk.
der beiden Bildseq (rot bzw. blau) und Gaußfit der Maxima
Darstellung: Verweilzeiten an den Maxima + Fit mit exp. Zerfall 1. Ordnung
Ausgabe der Histogramme/Fitergebnisse/Fitkurven/ als ascii-Dateien
Ausgabe der gemittelten Bilder (normal + kontrastverstärkt)
Funktionen:
Scripte:
gaussfit (Fit der Histogrammdaten mit Gaußkurven)
expo_ dwell _time (Fit der Verweilzeiten mit exp. Zerfall)
shift (Verschieben des Histogramms um einen best. Winkel)
flaeche (Fläche unter Gaußkurven zur Begrenzung der
Verweilpositionen schattieren)
mittelpunktfestlegung (Bestimmung des Rotationsmittelpunkts)
auswertpixel (Bestimmung der auswertbaren Pixel)
%-------------------------------------------------------------------------------% Graphen, Speicher, Command Window schließen bzw. löschen
clear all
close all
clc
% Initialisierung der Startparameter durch manuelle Eingabe der Werte
% Verzeichnis + Bilder
directory='';
% Verzeichnis der Bilddateien festlegen
fnameoriginal=strcat(directory,'\frame0001.bmp'); % Name der 1. Bilddatei
h=findstr(fnameoriginal,'0001'); % Start der Zählerposition
Nmax=0;
% Anzahl aller Bilder (0=automatisch), max=9999
Fshift=0;
% Anzahl der Bilder, die übersprungen werden sollen
% Parameter für die Auswertung der 1. Bildseq
Xzentrum_red=0;
% x-Wert des Rotationszentrums, 0=automatische Suche
Yzentrum_red=0;
% y-Wert des Rotationszentrums, 0=automatische Suche
radius_in=1.5;
% Radius um den Rotatationsmittelpunkt nicht auswerten
Helligkeit=120;
% unteren Helligkeitsgrenze
Grenze=5;
% Mindestanzahl an auswertbaren Bildpunkten pro Bild
Qualitaet=7;
% Qualität: Regression/Anzahl der auswertbaren Bildpunkten
% Größe des Bildausschnitts bestimmen
manuell=0;
% manuell (1) oder automatisch (0) bestimmen
XachseMin=5;
% Untergrenze der X-Achse
XachseMax=28;
% Obergrenze der X-Achse
YachseMin=5;
% Untergrenze der Y-Achse
YachseMax=28;
% Obergrenze der Y-Achse
% Parameter für die Auswertung der 2. Bildseq, 0=Parameter der 1. Bildseq
Oxpics=0;
% Anzahl der Bilder in der 2. Seq
114
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
xzentrum_ox=0;
yzentrum_ox=0;
Radius_in_ox=0;
Helligkeit_ox=0;
Grenze_ox=0;
Qualitaet_ox=0;
%
%
%
%
%
%
x-Wert des Rotationszentrums, 0=automatische Suche
y-Wert des Rotationszentrums, 0=automatische Suche
Radius um den Rotatationsmittelpunkt nicht auswerten
unteren Helligkeitsgrenze
Mindestanzahl an auswertbaren Bildpunkten pro Bild
Qualität: Regression/Anzahl der auswertbaren Bildpunkten
% Generelle Parameter
sysmax=36;
% Anzahl von Koordinatensystemen (linearen Regression)
rotation=240;
% max. Vorwärtsdrehung [°], sonst Rückwärtsdrehung
cluster=4;
% Anzahl der Bildpunkte zur Bestimmung des Filamentendes
grad=5;
% Klassenbreite der Histogramme [°]
P=0.0;
% Zeit [s] zwischen d. Anzeige d. analysierten Bilder
mag=0.125;
% Vergrößerungsfaktor [µm/Bildpunkte]
dt_analysis=0;
% Verweilzeit-Analyse ein- (1) oder ausschalten (0)
fiterg_ausgabe=1; % Ausgabe der Fitparameter ein- (1) oder ausschalten (0)
ausgabe=1;
% Speichern der Ergebnisse ein- (1) oder ausschalten (0)
darstellung=1;
% Auswertung anzeigen ein- (1) oder ausschalten (0)
%-------------------------------------------------------------------------------% Bilder für die Auswertung vorbereiten
% Bestimmung der Anzahl der Bilddateien im Verzeichnis
if Nmax>9999; Nmax=9999; end;
if Nmax==0 fname=fnameoriginal; % Arbeitsdateiname k=0;
while exist(fname,'file')==2 % Suche nach Datei mit dem höchsten Zähler
k=k+100;
if k==10000; k=9999; break; end;
fname(h+1)=int2str(floor(mod((k),1000)/100));
fname(h)=int2str(floor((k)/1000));
end
fname(h+3)=int2str(mod((k),10));
while exist(fname,'file')==0 k=k-1; fname(h+3)=int2str(mod((k),10));
fname(h+2)=int2str(floor(mod((k),100)/10));
fname(h+1)=int2str(floor(mod((k),1000)/100));
fname(h)=int2str(floor((k)/1000));
end
Nmax=k-fshift
end
% Vorbereitung der 1. Bildseq zur Auswertung
superimpose_red=0;
Fname=fnameoriginal;
% Arbeitsdateiname
for k=1:Nmax-oxpics
% Einlesen aller Bilder der 1. Seq
fname(h+3)=int2str(mod((k+fshift),10));
fname(h+2)=int2str(floor(mod((k+fshift),100)/10));
fname(h+1)=int2str(floor(mod((k+fshift),1000)/100));
fname(h)=int2str(floor((k+fshift)/1000)); [A,MAP]=imread(fname,'BMP');
originalbild_red=double (A(:,:,1));
% Summe der Helligkeiten der Bilder
superimpose_red=superimpose_red + originalbild_red;
if mod(k,100)==0
Nmax-oxpics-k
% Zähler
end
end
superimpose_red=superimpose_red/(Nmax-oxpics); % gemitteltes Bild
% Rand schwarz färben
for z=1:size(superimpose_red,1)
superimpose_red(z,1)=0;
superimpose_red(z,size(superimpose_red,2))=0;
end
for z=1:size(superimpose_red,2)
Superimpose_red(1,z)=0; Superimpose_red(size(superimpose_red,1),z)=0;
end
for z=1:3; SI_red(:,:,z)=(superimpose_red); end
SI_red=uint8(SI_red);
115
Anhang
_________________________________________________________________________
% Darstellung des Mittelwertbildes
figure(1)
set(gcf,'Position',[0 540 560 420])
subplot(2,2,1)
colormap(MAP)
image (SI_red)
title('Superimposed Image 1. state')
axis image
% Helligkeitsvert. des gemittelten Bildes in Matrix konvertieren und norm.
Hverteilung=reshape(superimpose_red,1,size(superimpose_red,1)*
size(superimpose_red,2));
Hvertnorm=1/(max(Hverteilung)-min(Hverteilung))*(Hverteilung-min(Hverteilung));
% Helligkeitsw., bei der die Häufigkeit auf 1/e des max. Rauschens abgefallen ist
A1=find(hist(Hvertnorm,50)<max(hist(Hvertnorm,50))/exp(1));
% Untergrenze als normierter und absoluter Helligkeitswert
Ugrenzenorm=a1(1,min(find(a1>find(hist(Hvertnorm,50)==
Max(hist(Hvertnorm,50))))))*0.02;
Ugrenzereal_red=Ugrenzenorm*(max(Hverteilung)-min(Hverteilung))+min(Hverteilung);
H=[];
for z=1:size(Hvertnorm,2)
if Hvertnorm(z)>=Ugrenzenorm; H=[H Hvertnorm(z)]; end
end
% Helligkeitsverteilung: max=255, Untergrenze=0
Hvertabs=255/(1-Ugrenzenorm)*(H-Ugrenzenorm);
% autom. Festlegung des Rotationsmittelpunkts mit 'Mittelpunktfestlegung'
superimpose=superimpose_red;
xzentrum=xzentrum_red;
yzentrum=yzentrum_red;
mittelpunktfestlegung;
% berechnete Werte nur übernehmen, wenn keine Werte vorgegeben wurden
if xzentrum_red>0
xcenter_red=xzentrum_red
else
xcenter_red=xcenter_proc
end
if yzentrum_red>0
ycenter_red=yzentrum_red
else
ycenter_red=ycenter_proc
end
i1_red=i1; % i = Reihen bzw. y-Werte der Matritzen/Bilder
j1_red=j1; % j = Spalten bzw. x-Werte der Matritzen/Bilder
i=i1; j=j1; Ugrenzereal=Ugrenzereal_red; superimpose=superimpose_red;
% Entweder auswertbare Bildpunkte aus Datei laden, wenn vorhanden, ...
fpospixel_red=strcat(directory,'\pospixel_red.dat');
if exist(fpospixel_red,'file')==2 & manuell==0
matrix=dlmread(fpospixel_red,'\t');
i=matrix(1,:); j=matrix(2,:);
fehlerbild=zeros(size(superimpose_red,1),size(superimpose_red,2));
for z=1:size(i,2); fehlerbild (i(1,z),j(1,z))=1;end
elseif manuell==1 % oder auswertbare Bildpunkte manuell deklarieren
fehlerbild=zeros(size(superimpose_red,1),size(superimpose_red,2));
for z=YachseMin:YachseMax
for zz=XachseMin:XachseMax
fehlerbild(z,zz)=1; i=[i z]; j=[j zz];
end
end
else % oder autom. Suche nach auswertbaren Bildpunkten mit 'auswertpixel'
auswertpixel;
end
116
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
% auswertbare Bildpunkte speichern
fehlerbild_red=fehlerbild; i_red=i; j_red=j;
% Ermittlung und speichern des maximalen Helligkeitswerts des Filaments
maxHell=[];
for z=1:size(i_red,2);
maxHell=[maxHell superimpose_red(i_red(1,z),j_red(1,z))];
end
maxHell=max(maxHell);
% kontrastverstärktes Bild des Filaments (Graustufenbild 0-255)
for zi=1:size(superimpose_red,1)
for zj=1:size(superimpose_red,2)
if fehlerbild_red(zi,zj)==1
Bild_red(zi,zj)=255/(maxHell-Ugrenzereal_red)*
(superimpose_red(zi,zj)-Ugrenzereal_red);
else
bild_red(zi,zj)=0;
end
end
end
for z=1:3; B_red(:,:,z)=(bild_red); end
B_red=uint8(B_red);
% Darstellung des kontrastverstärkten Bilds: Rotationsmittelpunkt (roter Kreis,
% xcenter, ycenter), Zentrumsbildpunkte (blaue Punkte, j1/i1), auswertbare
% Bildpunkte (grüne Punkte, j/i)
figure(2)
set(gcf,'Position',[0 30 560 420])
colormap(MAP)
image (B_red)
hold on
Bild=plot(j_red,i_red,'.g',j1_red,i1_red,'.b',xcenter_red,ycenter_red,'or')
title('Selected pixel 1. state')
axis image
PPx=[0];
while size(PPx,1)==1 % manuell auswertbare Bildpunkte ergänzen oder löschen
Ppx=[];
[PPx PPy]=ginput(1);
if PPx<1 | PPy<1 | PPx>size(bild_red,2) | PPy>size(bild_red,1); break; end
PPx=round(PPx); PPy=round(PPy); delete(Bild);
if fehlerbild_red(PPy,PPx)==0
j_red=[j_red Ppx]; i_red=[i_red Ppy]; fehlerbild_red(PPy,PPx)=1;
Bild=plot(j1_red,i1_red,'.b',j_red,i_red,'.g',xcenter_red,ycenter_red,'or')
elseif fehlerbild_red(PPy,PPx)==1
Fehlerbild_red(PPy,PPx)=0; loeschen=find((i_red==PPy)&(j_red==PPx));
I_red(loeschen)=[]; j_red(loeschen)=[];
Bild=plot(j1_red,i1_red,'.b',j_red,i_red,'.g',xcenter_red,ycenter_red,'or')
end
end
hold off
% auswertbare Bildpunkte in Datei speichern
matrix=[i_red; j_red]; dlmwrite(fpospixel_red,matrix,'\t');
% Vorbereitung der 2. Bildseq zur Auswertung, wenn vorhanden
if oxpics>0
superimpose_ox=0;
fname=fnameoriginal; % Arbeitsdateiname
for k=Nmax-oxpics+1:Nmax % Einlesen aller Bilder der 2. Seq
fname(h+3)=int2str(mod((k+fshift),10));
fname(h+2)=int2str(floor(mod((k+fshift),100)/10));
fname(h+1)=int2str(floor(mod((k+fshift),1000)/100));
fname(h)=int2str(floor((k+fshift)/1000));
[A,MAP]=imread(fname,'BMP');
originalbild_ox=double (A(:,:,1));
% Summe der Helligkeiten der Bilder
superimpose_ox=superimpose_ox + originalbild_ox;
if mod(k,100)==0
Nmax-k-mod((Nmax-oxpics),100)+100 % Zähler
117
Anhang
_________________________________________________________________________
end
end
superimpose_ox=superimpose_ox/(oxpics); % gemitteltes Bild
% Rand schwarz färben
for z=1:size(superimpose_ox,1)
Superimpose_ox(z,1)=0; superimpose_ox(z,size(superimpose_ox,2))=0;
end
for z=1:size(superimpose_ox,2)
Superimpose_ox(1,z)=0; superimpose_ox(size(superimpose_ox,1),z)=0;
end
for z=1:3; SI_ox(:,:,z)=(superimpose_ox); end
SI_ox=uint8(SI_ox);
% Darstellung des Mittelwertbildes
figure(1)
set(gcf,'Position',[0 540 560 420])
subplot(2,2,2)
colormap(MAP)
image (SI_ox)
title('Superimposed Image 2. state')
axis image
% Helligkeitsvert. des gemittelten Bildes in Matrix konvert. und norm.
Hverteilung=reshape(superimpose_ox,1,size(superimpose_ox,1)*
size(superimpose_ox,2));
Hvertnorm=1/(max(Hverteilung)-min(Hverteilung))*
(Hverteilung-min(Hverteilung));
% Helligkeitswert, bei der die Häufigkeit 1/e des max. Rauschens entspricht
a1=find(hist(Hvertnorm,50)<max(hist(Hvertnorm,50))/exp(1));
% Untergrenze als normierter und absoluter Helligkeitswert
Ugrenzenorm=a1(1,min(find(a1>find(hist(Hvertnorm,50)==
max(hist(Hvertnorm,50))))))*0.02;
Ugrenzereal_ox=Ugrenzenorm*(max(Hverteilung)-min(Hverteilung))+
min(Hverteilung);
H=[];
for z=1:size(Hvertnorm,2)
if Hvertnorm(z)>=Ugrenzenorm; H=[H Hvertnorm(z)]; end
end
% Helligkeitsverteilung: max=255, Untergrenze=0
Hvertabs=255/(1-Ugrenzenorm)*(H-Ugrenzenorm);
% autom. Festlegung d. Rotationsmittelpunkts mit 'Mittelpunktfestlegung'
superimpose=superimpose_ox; xzentrum=xzentrum_ox; yzentrum=yzentrum_ox;
mittelpunktfestlegung;
% berechnete Werte nur übernehmen, wenn keine Werte vorgegeben wurden
if xzentrum_ox>0
xcenter_ox=xzentrum_ox
else
xcenter_ox=xcenter_proc
end
if yzentrum_ox>0
ycenter_ox=yzentrum_ox
else
ycenter_ox=ycenter_proc
end
i1_ox=i1; % i: Reihen bzw. y-Werte der Matritzen/Bilder
j1_ox=j1; % j: Spalten bzw. x-Werte der Matritzen/Bilder
i=i1; j=j1; Ugrenzereal=Ugrenzereal_ox; superimpose=superimpose_ox;
% Entweder auswertbare Bildpunkte aus Datei laden, wenn vorhanden, ...
fpospixel_ox=strcat(directory,'\pospixel_ox.dat');
if exist(fpospixel_ox,'file')==2 & manuell==0
matrix=dlmread(fpospixel_ox,'\t');
i=matrix(1,:); j=matrix(2,:);
fehlerbild=zeros(size(superimpose_ox,1),size(superimpose_ox,2));
118
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
for z=1:size(i,2); fehlerbild (i(1,z),j(1,z))=1; end
elseif manuell==1 % oder auswertbare Bildpunkte manuell deklarieren, ...
fehlerbild=zeros(size(superimpose_ox,1),size(superimpose_ox,2));
for z=YachseMin:YachseMax
for zz=XachseMin:XachseMax
fehlerbild(z,zz)=1; i=[i z]; j=[j zz];
end
end
else % oder autom. Suche nach auswertb. Bildpunkten mit 'auswertpixel'
auswertpixel;
end
% auswertbare Bildpunkte speichern
fehlerbild_ox=fehlerbild; i_ox=i; j_ox=j;
% Ermittlung und speichern des maximalen Helligkeitswerts des Filaments
maxHell=[];
for z=1:size(i_ox,2)
maxHell=[maxHell superimpose_ox(i_ox(1,z),j_ox(1,z))];
end
maxHell=max(maxHell);
% kontrastverstärktes Bild des Filaments (Graustufenbild 0-255)
for zi=1:size(superimpose_ox,1)
for zj=1:size(superimpose_ox,2)
if fehlerbild_ox(zi,zj)==1
bild_ox(zi,zj)=255/(maxHell-Ugrenzereal_ox)*
(superimpose_ox(zi,zj)-Ugrenzereal_ox);
else
bild_ox(zi,zj)=0;
end
end
end
for z=1:3; B_ox(:,:,z)=(bild_ox); end
B_ox=uint8(B_ox);
% Darstellung des kontrastverstärkten Bilds mit Rotationsmittelpunkt (xcenter,
% ycenter), Zentrumsbildpunkten (j1/i1) und auswertbaren Bildpunkten (j/i)
figure(2)
set(gcf,'Position',[0 30 560 420])
colormap(MAP)
image (B_ox)
hold on
Bild=plot(j_ox,i_ox,'.g',j1_ox,i1_ox,'.b',xcenter_ox,ycenter_ox,'or');
title('Selected pixel 2. state')
axis image
PPx=[0];
while size(PPx,1)==1 % manuell auswertb. Bildpunkte ergänzen od. löschen
Ppx=[]; [PPx PPy]=ginput(1);
if PPx<1 | PPy<1 | PPx>size(bild_ox,2) | PPy>size(bild_ox,1); break; end
PPx=round(PPx); PPy=round(PPy); delete(Bild);
if fehlerbild_ox(PPy,PPx)==0
j_ox=[j_ox Ppx]; i_ox=[i_ox Ppy]; fehlerbild_ox(PPy,PPx)=1;
Bild=plot(j1_ox,i1_ox,'.b',j_ox,i_ox,'.g',xcenter_ox,ycenter_ox,'or');
elseif fehlerbild_ox(PPy,PPx)==1
Fehlerbild_ox(PPy,PPx)=0; loeschen=find((i_ox==PPy)&(j_ox==PPx));
i_ox(loeschen)=[]; j_ox(loeschen)=[];
Bild=plot(j1_ox,i1_ox,'.b',j_ox,i_ox,'.g',xcenter_ox,ycenter_ox,'or');
end
end
hold off
% auswertbare Bildpunkte in Datei speichern
matrix=[i_ox; j_ox]; dlmwrite(fpospixel_ox,matrix,'\t');
end % Ende Vorbereitung der 2. Bildsequenz
%--------------------------------------------------------------------------------
119
Anhang
_________________________________________________________________________
% Parameterinitialisierung und Datenauswertung
sysmax=sysmax-1;
% Korrektur von sysmax (s.u.)
interval=[];
% Klassenbreite des Histogramms initialisieren
for z=0:360/grad-1; interval=[interval 0.5*grad+z*grad]; end
nummer_fehlerbild=[];
Anzahlfehlerbilder=0;
ialt=0; jalt=0;
Time=[];
Ep_x_red=[];
Ep_y_red=[];
Ep_x_ox=[];
Ep_y_ox=[];
Fname=fnameoriginal;
% Anzahl der nicht auswertbaren Bilder initialisieren
%
%
%
%
%
%
Zeitachse in [s]
x-Werte von Filamentendpunkten
y-Werte von Filamentendpunkten
x-Werte von Filamentendpunkten
y-Werte von Filamentendpunkten
Arbeitsdateiname
der
der
der
der
1.
1.
2.
2.
Seq
Seq
Seq
Seq
for k=1:Nmax
% sukzessive Analyse aller Bilder
if k>(Nmax-oxpics) % Entweder Parameter für Auswertung der 2. Seq init., ...
if radius_in_ox>0; radius_in=radius_in_ox;
end
if Helligkeit_ox>0; Helligkeit=Helligkeit_ox; end
if grenze_ox>0;
grenze=grenze_ox;
end
if qualitaet_ox>0; qualitaet=qualitaet_ox;
end
xcenter=xcenter_ox; ycenter=ycenter_ox;
fehlerbild=fehlerbild_ox; Ugrenzereal=Ugrenzereal_ox;
else % oder Parameter für Auswertung der 1. Seq initialisieren
xcenter=xcenter_red; ycenter=ycenter_red;
fehlerbild=fehlerbild_red; Ugrenzereal=Ugrenzereal_red;
end
% Einlesen der Bilddatei
fname(h+3)=int2str(mod((k+fshift),10));
fname(h+2)=int2str(floor(mod((k+fshift),100)/10));
fname(h+1)=int2str(floor(mod((k+fshift),1000)/100));
fname(h)=int2str(floor((k+fshift)/1000));
[A,MAP]=imread(fname,'BMP');
originalbild=double (A(:,:,1));
% auswertbare Bildpunkte im kontrastverstärkten Bild deklarieren, andere
% Bildpunkte schwärzen
for zi=1:size(originalbild,1)
for zj=1:size(originalbild,2)
if fehlerbild(zi,zj)==1 & (originalbild(zi,zj)-Ugrenzereal)>0
bildauswertung(zi,zj)=255/(max(max(originalbild))-Ugrenzereal)*
(originalbild(zi,zj)-Ugrenzereal);
else
bildauswertung(zi,zj)=0;
end
end
end
% Helligkeitswerte des gemittelten Bildes in 1D-Matrix konvertieren
Hverteilung=reshape(bildauswertung,1,size(bildauswertung,1)*
size(bildauswertung,2));
% Helligkeitsgrenze cutoff = kleinster Wert der oberen 10% der hellsten
% Bildpunkte (>0)
B2=sort(Hverteilung);
Cutoff=b2(1,size(Hverteilung,2)-10);
% manuell festgelegte Helligkeitsgrenze berücksichtigen
if cutoff > Helligkeit; cutoff=Helligkeit; end
% Speichern der Bildpunkte, die über der Helligkeitsgrenze und außerhalb
% von radius_in liegen
i0=[]; j0=[];
for zi=1:size(bildauswertung,1)
for zj=1:size(bildauswertung,2)
if bildauswertung(zi,zj)>=cutoff
r=sqrt((zj-xcenter)*(zj-xcenter)+(ycenter-zi)*(ycenter-zi));
if r>radius_in
j0=[j0 zj-xcenter]; i0=[i0 ycenter-zi];
end
end
end
120
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
end
th=[]; R=[]; x=[]; y=[];
if size(i0,2)<grenze; i0=round(ycenter); j0=round(xcenter); end
% Koordinatentransformation: kartesisch <--> polar
for z=1:(sysmax+1) % da index=0 nicht möglich -> 1:1-sysmax+1, statt 0:sysmax
[th,R]=cart2pol(j0(1,:),i0(1,:));
% Winkel 0° - 360° mit 1 - sysmax+1 Koordinatensystemen
th=th+(2*pi)/sysmax*(z-1);
[x(z,:),y(z,:)]=pol2cart(th,R);
Rsort=sort(R);
if size(Rsort,2)>cluster
% Speichern der Bildpunkte mit max.
Rmaxmean=mean(Rsort((size(Rsort,2)-cluster):size(Rsort,2)));
else
% Entfernung vom Mittelpunkt
Rmaxmean=Rsort(size(Rsort,2));
end
% lineare Regression der selektierten Bildpunkte
Xxsum(z)=sum(x(z,:).*x(z,:)); Xysum(z)=sum(x(z,:).*y(z,:));
M(z)=xysum(z)/xxsum(z); F(z)=sum((y(z,:)-m(z).*x(z,:)).^2);
end
% Qualität (Streuung): Regression/Anzahl der Punkte
[Fmin(1,k),imin]=min(F); Fmin(2,k)=Fmin(1,k)/size(i0,2);
% Behält vorheriges Bild, wenn zu wenig Bildpunkte vorhanden sind oder
% die Streuung zu groß ist => Bildverdoppelung!
if Fmin(2,k)>qualitaet | size(i0,2)<grenze
nummer_fehlerbild=[nummer_fehlerbild k]; % nicht auswertbare Bilde
xfalsch=x; yfalsch=y; % nicht auswertbare Bildpunkte speichern
i0=ialt; j0=jalt;
% Werte des vorherigen Bilds laden
th=[]; R=[]; x=[]; y=[];
% Berechnung mit den Daten des letzten auswertbaren Bilds wiederholen
for z=1:(sysmax+1)
[th,R]=cart2pol(j0(1,:),i0(1,:));
th=th+(2*pi)/sysmax*(z-1);
[x(z,:),y(z,:)]=pol2cart(th,R);
Rsort=sort(R);
if size(Rsort,2)>cluster
Rmaxmean=mean(Rsort((size(Rsort,2)-cluster):size(Rsort,2)));
else
Rmaxmean=Rsort(size(Rsort,2));
end
% lineare Regression der selektierten Bildpunkte
Xxsum(z)=sum(x(z,:).*x(z,:)); xysum(z)=sum(x(z,:).*y(z,:));
M(z)=xysum(z)/xxsum(z); F(z)=sum((y(z,:)-m(z).*x(z,:)).^2);
end
[Fmin2,imin]=min(F);
Frameverdoppelung=1; % Bild als nicht auswertbar deklarieren
anzahlfehlerbilder=anzahlfehlerbilder+1;
else
ialt=i0; jalt=j0; Frameverdoppelung=2; % Bild als auswertbar deklarieren
end
% Winkelzuordnung in Abhängigkeit vom Quadranten
if sum(x(imin,:))<0 % Quadranten II und III
winkel(k)=atan(m(imin))+pi;
else
if m(imin)<0 % Quadrant IV
winkel(k)=atan(m(imin))+2*pi;
else
winkel(k)=atan(m(imin)); % Quadrant I
end
end
% Winkelberechnung (imin-1 wegen Zuordnung der 0°-360° auf 1-sysmax+1
% Koordinatensystemen)
winkel(k)=winkel(k)-(2*pi)/sysmax*(imin-1);
if winkel(k)<0; winkel(k)=winkel(k)+2*pi; end
% Richtung der Regressionsgeraden festlegen
if cos(winkel(k))>=0
121
Anhang
_________________________________________________________________________
fx=0:20;
else
fx=-20:0;
end
fy=tan(winkel(k))*fx; fy=ycenter-fy; fx=fx+xcenter;
[xm,ym]=pol2cart(winkel(k),Rmaxmean); % Endpunkt berechnen
time=[time k*0.04]; % Zeitachse [s] deklarieren
% Darstellung des ausgewerteten Bilds: Mittelpunkt = roter Kreis, Filamentende
% = grüner Kreis, ausgewertete Bildpunkte = blaue Punkte, nicht auswertbare
% Bildpunkte = magenta Kreuze, Regressionsgerade = rote Linie
if darstellung==1
B(:,:,1)=(bildauswertung);B(:,:,2)=(bildauswertung);
B(:,:,3)=(bildauswertung); B=uint8(B);
if exist('H4')==1; delete(H4); end
if exist('H5')==1; delete(H5); end
figure(2)
clf
set(gcf,'Position',[0 30 560 420])
colormap(MAP)
H4=image(B);
hold on
% Endpunkte nur bei auswertbaren Bildern darstellen
if Frameverdoppelung==2
H5=plot(xcenter,ycenter,'or',(x(1,:)+xcenter),(ycenter-y(1,:)),'.b',
fx,fy,'-r', (xm+xcenter),(ycenter-ym),'og');
else
H5=plot(xcenter,ycenter,'or',(x(1,:)+xcenter),(ycenter-y(1,:)),'.b',
fx,fy,'-r', (xfalsch(1,:)+xcenter),(ycenter-yfalsch(1,:)),'xm');
end
hold off
% Darstellung der kumulativen Winkelpositionen im Histogramm
winkel_aktuell(1:k)=360/2/pi*winkel(1:k); % winkel = Winkelposition
histogram=hist(winkel_aktuell(1:k),interval);
figure(1)
subplot(2,2,4)
bar(interval,histogram,'r')
title('Histogram: Distribution of filament positions')
grid on
xlim([0 360])
set(gca,'XTick',0:60:360)
xlabel('\itangle /°')
ylabel('\itcounts')
% Berechnung der Winkeldifferenz zwischen zwei sukzessiven Winkeln
delta_a_aktuell=diff(winkel_aktuell);
for kk=1:k-1
if delta_a_aktuell(kk)<=(rotation-360)
delta_a_aktuell(kk)=delta_a_aktuell(kk)+360;
end
if delta_a_aktuell(kk)> rotation
delta_a_aktuell(kk)=delta_a_aktuell(kk)-360;
end
end
% Berechnung des kumulierten Winkels (= Umdrehungen)
acs_gesamt_aktuell=cumsum(delta_a_aktuell);
% wenn acs_gesamt_aktuell=[] + gleiche Länge wie time, dann
% fehlerhafte Darstellung
if k>1
acs_gesamt_aktuell(k)=acs_gesamt_aktuell(k-1);
else
acs_gesamt_aktuell(k)=0;
end
acs_aktuell(1:k)=acs_gesamt_aktuell(1:k)/360; % Umdrehungen der 1. Seq
% Darstellung der Trajektorie
subplot(2,2,3)
plot(time,acs_aktuell,'r')
title('Trajectory')
122
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
grid on
xlabel('\ittime /s')
ylabel('\itrevolutions')
pause(p); % Pause zwischen der Auswertung zweier Bilder
end
% Speichern der Endpunkte nur wenn das Bild auswertbar war
if Frameverdoppelung==2
if k>=Nmax-oxpics+1
ep_x_ox=[ep_x_ox xm]; ep_y_ox=[ep_y_ox ym];
% Endpunkte der 2. Seq
else
ep_x_red=[ep_x_red xm]; ep_y_red=[ep_y_red ym]; % Endpunkte der 1. Seq
end
end
if mod(k,50)==0
Nmax-k % Zähler
end
end % Ende Bildauswertung -> nächstes Bild
winkel(1:Nmax)=360/2/pi*winkel(1:Nmax); % Winkelposition
delta_a=diff(winkel); % Differenz zwischen 2 aufeinander folgenden Winkeln
for k=1:(Nmax-1)
if delta_a(k)<=(rotation-360); delta_a(k)=delta_a(k)+360; end
if delta_a(k)> rotation ; delta_a(k)=delta_a(k)-360; end
end
acs_gesamt=cumsum(delta_a); % kumulierter Winkel
acs_gesamt(Nmax)=acs_gesamt(Nmax-1);
delta_a(Nmax)=0;
acs(1:Nmax)=acs_gesamt(1:Nmax)/360; % Umdrehungszahl
% Berechnung der Filamentlänge
[th,Rad]=cart2pol(ep_x_red(1,:),ep_y_red(1,:));
radius=round(mean(Rad)*mag*10)/10;
%-------------------------------------------------------------------------------% Darstellung der Ergebnisse + Anpassen der Gaußkurven + Berechnung der
% Verweilzeiten; rot : Daten der 1. Seq, blau: Daten der 2. Seq
% Ausgabe der Ergebnisse
Ugrenzereal=(round(Ugrenzereal*10))/10
Radius
Umdrehungen=(round(max(acs))*10)/10
Geschwindigkeit=(round((umdrehungen/max(time))*10))/10
Anzahlfehlerbilder
Nummer_fehlerbild
% Darstellung der Trajektorien
figure(1)subplot(2,2,3)
hold on
plot(time(1:Nmax-oxpics),acs(1:Nmax-oxpics),'r')
if oxpics>0 plot(time(Nmax-oxpics+1:Nmax),acs(Nmax-oxpics+1:Nmax),'b'); end
hold off
axis([0 max(time) min(acs) max(acs)])
title('Trajectory')
grid on
xlabel('\ittime /s')
ylabel('\itrevolutions')
% Darstellung der Endpunkte
figure(5)
set(gcf,'Position',[0 30 560 420])
plot(ep_x_red, ep_y_red, 'or')
if oxpics>0
hold on
plot(ep_x_ox, ep_y_ox, 'ob')
hold off
end
title('Endpoint Positions')
xlabel('\itdistance /px')
ylabel('\itdistance /px')
123
Anhang
_________________________________________________________________________
axis ([-(size(bildauswertung,2))/2 (size(bildauswertung,2))/2
-(size(bildauswertung,1))/2(size(bildauswertung,2))/2])
% Darstellung der winkelabhängige Aufenthaltswahrscheinlichkeiten (Histogramm)
histogram=hist(winkel(1:Nmax-oxpics),interval);
if oxpics>0; histogram_ox=hist(winkel(Nmax-oxpics+1:Nmax),interval); end
figure(1)
subplot(2,2,4)
bar(interval,histogram,'r')
if oxpics>0
hold on
bar(interval,histogram_ox,'b')
hold off
end
title('Histogram: Distribution of filament positions')
grid on
xlim([0 360])
set(gca,'XTick',0:60:360)
xlabel('\itangle /°')
ylabel('\itcounts')
% Verschieben der Histogramme mit dem Script 'shift'=>kleinster Wert auf 0°
delta_total=0; [minhist,iminhist]=min(histogram); delta=iminhist-1;
delta_total=delta_total+delta*grad; % Speichern des ges. Verschiebung [°]
n=size(histogram,2); altwerte=histogram; shift; histogram=neuwerte;
if oxpics>0
n=size(histogram_ox,2); altwerte=histogram_ox; shift;
histogram_ox=neuwerte;
end
% Darstellung der verschobenen Histogramme
figure(2)
clf
set(gcf,'Position',[560 540 560 420])
bar(interval,histogram,'r')
if oxpics>0
hold on
bar(interval,histogram_ox,'b')
hold off
end
title('Standard Histogram')
grid on
xlim([0 360])
set(gca,'XTick',0:60:360)
xlabel('\itangle /°')
ylabel('\itcounts')
hold on
drawnow
% x/y-Werte der Maxima vorgeben: die ersten 3 Werte für die 1. Seq, alle
% weiteren für die 2. Seq
Px=[];Py=[];PPx=[0];
while size (PPx,1)==1
Ppx=[];
[PPx PPy]=ginput(1); % Eingabe der Positionen per Mausklick
if Px<0 | Py<1 | Px>360; break; end
Px=[Px, PPx]; Py=[Py, PPy];
end
hold off
% Anpassen des Histogramms der 1. Seq mit 3 Gaußkurven
if size(Py,2)>2 % mind. 3 Maxima vorgeben
% Speichern der eingegebenen Startparameter
parameter=[Py(1) Px(1) 20 Py(2) Px(2) 20 Py(3) Px(3) 20];
% Übergabe der Startparameter an die Funktion 'gaussfit' und Berechnung
% der Fitwerte
[fitresult,r,J]=nlinfit(interval,histogram,'gaussfit',parameter);
% Fehlerrechnung / Konfidenzintervall
124
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
ci = nlparci(fitresult,r,J);
for z=1:size(fitresult,1); fehler(z,1)=(round(fitresult(z)-ci(z,1)))/10; end
fehlerwerte=fehler;
% Initialisierung der x-Achse
xkurve=[];
for z=1:360; xkurve=[xkurve z]; end
% Berechnung der Gaußkurve mit den Fitwerten von 0° bis 360°
gauss3=feval('gaussfit',fitresult,xkurve);
% Speichern der Fitparameter (Amplituden, x-Werte, sigma der Gaußkurven)
for z=1:3
fitAmp(z)=fitresult(z*3-2); fitxgauss(z)=fitresult(z*3-1);
fithalbweite(z)=fitresult(z*3);
end
fitresult=(round(fitresult*10))/10; fitergebnis=fitresult;
if size(Py,2)>3 % Anpassen des Histogramms der 2. Seq mit Gaußkurven
% Speichern der eingegebenen Startparameter
parameter_ox=[];
for z=4:size(Py,2); parameter_ox=[parameter_ox Py(z) Px(z) 20]; end
% Übergabe der Startparameter an die Funktion 'gaussfit' und
% Berechnung der Gaußkurve
[fitresult_ox,r_ox,J_ox]=nlinfit(interval,histogram_ox,'gaussfit',
parameter_ox);
% Fehlerrechnung/Konfidenzintervall
ci_ox=nlparci(fitresult_ox,r_ox,J_ox);
for z=1:size(fitresult_ox,1)
fehler_ox(z,1)=(round(fitresult_ox(z)-ci_ox(z,1)))/10;
end
for z=1:size(fehler_ox); fehlerwerte(9+z)=fehler_ox(z); end
% Berechnung der Gaußkurve mit den Fitwerten von 0° bis 360°
gauss_ox=feval('gaussfit',fitresult_ox,xkurve);
% Speichern der Fitwerte (Amplituden, x-Werte, sigma der Gaußkurven)
for z=4:size(Py,2)
fitAmp(z)=fitresult_ox((z-3)*3-2);
fitxgauss(z)=fitresult_ox((z-3)*3-1);
fithalbweite(z)=fitresult_ox((z-3)*3);
end
fitresult_ox=(round(fitresult_ox*10))/10;
for z=1:size(fitresult_ox); fitergebnis(9+z)=fitresult_ox(z); end
end
fitergebnis=num2str(fitergebnis); fehlerwerte=num2str(fehlerwerte);
% Fläche der 3 Maxima der 1. Seq bestimmen
Amp1=[fitergebnis(1,:)]; Amp2=[fitergebnis(4,:)];
Amp3=[fitergebnis(7,:)]; xgauss1=[fitergebnis(2,:)];
xgauss2=[fitergebnis(5,:)]; xgauss3=[fitergebnis(8,:)];
halbweite1=[fitergebnis(3,:)]; halbweite2=[fitergebnis(6,:)];
halbweite3=[fitergebnis(9,:)];
% String der gefitteten Funktion für Flächenberechung
gausskurve=[Amp1,'*exp(((x-',xgauss1,')/',halbweite1,').^2/(-2))+',Amp2,
'*exp(((x-',xgauss2,')/',halbweite2,').^2/(-2))+',Amp3,'*exp(((x-',
xgauss3,')/',halbweite3,').^2/(-2))'];
g=inline(gausskurve);
% Festlegung der Grenzen/Breite der Maxima
for z=1:3
if fithalbweite(z)>=25
ugrenze(1,z)=fitxgauss(z)-50; ogrenze(1,z)=fitxgauss(z)+50;
else
ugrenze(1,z)=fitxgauss(z)-2*fithalbweite(z);
ogrenze(1,z)=fitxgauss(z)+2*fithalbweite(z);
125
Anhang
_________________________________________________________________________
end
if ugrenze(1,z)< 1; ugrenze(1,z)= 1; end
if ogrenze(1,z)>360; ogrenze(1,z)=360; end
ogrenze(2,z)=370; ugrenze(2,z)=-10;
end
for z=1:2
if ogrenze(1,z)>=ugrenze(1,z+1)
ospeicher=ogrenze(1,z); uspeicher=ugrenze(1,z+1);
ogrenze(1,z)=(ospeicher+uspeicher)/2-1;
ugrenze(1,z+1)=(ospeicher+uspeicher)/2+1;
end
end
% numerische Berechnung der Intervalle zwischen den Grenzen
for z=1:3; flaecheninhalt(z)=quad(g,ugrenze(1,z),ogrenze(1,z)); end
[maxflaecheninhalt, imaxflaecheninhalt]=max(flaecheninhalt);
% Verschieben der Histogramme und Gaußkurven mit dem Script 'shift'%.
% Entweder Max der 2. Seq auf 180°, oder größtes Max der 1. Seq auf 60°
if size(Py,2)>3
delta=ceil(fitxgauss(4)/grad)-round(round(180+grad/2)/grad);
n=size(histogram,2); altwerte=histogram; shift; histogram=neuwerte;
n=size(histogram_ox,2); altwerte=histogram_ox; shift;
histogram_ox=neuwerte;
else
delta=ceil(fitxgauss(imaxflaecheninhalt)/grad)round(round(60+grad/2)/grad);
n=size(histogram,2); altwerte=histogram; shift; histogram=neuwerte;
if oxpics>0
n=size(histogram_ox,2); altwerte=histogram_ox; shift;
histogram_ox=neuwerte;
end
end
% Speichern des Wertes der gesamte Verschiebung in [°]
delta=delta*grad; delta_total=delta_total+delta;
% Gaußkurven
n=size(gauss3,2); altwerte=gauss3; shift; gauss3=neuwerte;
if size(Py,2)>3
n=size(gauss_ox,2); altwerte=gauss_ox; shift; gauss_ox=neuwerte;
end
% Fitwerte an die Verschiebung anpassen
for z=1:3 % Unter- und Obergrenze der Integrale verschieben
ugrenze(1,z)=round(ugrenze(1,z)-delta);
if ugrenze(1,z)< 0; ugrenze(1,z)=ugrenze(1,z)+360; end
if ugrenze(1,z)>360; ugrenze(1,z)=ugrenze(1,z)-360; end
ogrenze(1,z)=round(ogrenze(1,z)-delta);
if ogrenze(1,z)< 0; ogrenze(1,z)=ogrenze(1,z)+360; end
if ogrenze(1,z)>360; ogrenze(1,z)=ogrenze(1,z)-360; end
end
for z=1:size(Py,2) % Position der Maxima der Gaußfits verschieben
fitxgauss(z)=fitxgauss(z)-delta;
if fitxgauss(z)< 0; fitxgauss(z)=fitxgauss(z)+360; end
if fitxgauss(z)>360; fitxgauss(z)=fitxgauss(z)-360; end
end
% Markierung der Fläche zwischen den Grenzwerten mit dem Script 'flaeche'
flaeche % Ausgabe: xflaeche, yflaeche
% Ausgabe der Fitwerte mit Fehlern
if fiterg_ausgabe==1
for z=1:size(Py,2)
Peak=z
xGauss=[num2str((round(fitxgauss(z)*10))/10),' +/- 'fehlerwerte
(3*z-1,:)]
Halbweite=[fitergebnis(3*z,:),' +/- ' fehlerwerte(3*z,:)]
Amplitude=[fitergebnis(3*z-2,:),' +/- ' fehlerwerte(3*z-2,:)]
end
end
126
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
% Darstellung der Histogramme und Gaußkurven der 1. und 2. Seq, wenn vorhanden
figure(2) bar(interval,histogram,'r') % Histogramme
if oxpics>0
hold on
bar(interval,histogram_ox,'b')
hold off
end
drawnow
title('Standard Histogram, shaded Peaks: 2 sigma')
grid on
xlim([0 360])
set(gca,'XTick',0:60:360)
xlabel('\itangle /°')
ylabel('\itcounts')
hold on
plot(xkurve,gauss3,'k','LineWidth',1.5) % Gaußkurven
if size(Py,2)>3; plot(xkurve,gauss_ox,'k','LineWidth',1.5); end
% Flächen zwischen den Grenzen der 3 Max der 1. Seq
H1=area(xflaeche1,yflaeche1,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
H2=area(xflaeche2,yflaeche2,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
H3=area(xflaeche3,yflaeche3,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
PPPx=[0];
while size(PPPx,1)>0 % Verschieben der Grenzen per Mausklick
PPPx=[]; PPPy=[];
drawnow
[PPPx,PPPy]=ginput(1);
% Falls neuer Grenzwert eingegeben wird, Bild mit den neuen Wert aufbauen
if size(PPPx,1)==1 & PPPx>=0 & PPPx<=360
grenzwerte=[ugrenze(1,:) ugrenze(2,:) ogrenze(1,:) ogrenze(2,:)];
naechste_grenze=abs(grenzwerte-PPPx);
[minnaechste_grenze iminnaechste_grenze]=min(naechste_grenze);
grenzwerte(iminnaechste_grenze)=round(PPPx);
ugrenze(1,:)=grenzwerte(1:3); ugrenze(2,:)=grenzwerte(4:6);
ogrenze(1,:)=grenzwerte(7:9); ogrenze(2,:)=grenzwerte(10:12);
flaeche
delete (H1); delete (H2); delete (H3);
H1=area(xflaeche1,yflaeche1,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
H2=area(xflaeche2,yflaeche2,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
H3=area(xflaeche3,yflaeche3,'FaceAlpha',0.45,'FaceColor','k');
end
end
hold off
grid on
% Gaußkurven und Grenzwerte auf das ursprüngliche Histogramm übertragen
delta=-delta_total;
n=size(gauss3,2); altwerte=gauss3; shift; gauss3_ori=neuwerte;
if size(Py,2)>3
n=size(gauss_ox,2); altwerte=gauss_ox; shift; gauss_ox_ori=neuwerte;
end
% Rückrechnen der Grenzwerte auf das ursprüngliche Histogram, aber nicht der
% angepassten % Maximawerte, damit die Zuordnung der ausgegebenen Werte zu den
% Gaußkurven möglich ist
for z=1:3
if ugrenze(2,z)==1; ogrenze(1,z)=ogrenze(2,z); end
ugrenze(1,z)=ugrenze(1,z)-delta;
if ugrenze(1,z)< 0; ugrenze(1,z)=ugrenze(1,z)+360; end
if ugrenze(1,z)>360; ugrenze(1,z)=ugrenze(1,z)-360; end
ogrenze(1,z)=ogrenze(1,z)-delta;
if ogrenze(1,z)< 0; ogrenze(1,z)=ogrenze(1,z)+360; end
if ogrenze(1,z)>360; ogrenze(1,z)=ogrenze(1,z)-360; end
end
flaeche
% Darstellung der Gaußkurven im ursprünglichen Histogramm
figure(1)
subplot(2,2,4)
hold on
127
Anhang
_________________________________________________________________________
plot(xkurve,gauss3_ori,'k','LineWidth',1.5)
if size(Py,2)>3; plot(xkurve,gauss_ox_ori,'k','LineWidth',1.5); end
hold off
% Auswertung der Verweilzeiten der 1. Seq, wenn eingeschaltet
if dt_analysis==1
% Zuordnung der Bilder zu einem der 3 Max, wenn die Winkelstellung
% (winkel(2,:))des Filaments innerhalb der jeweiligen Grenzen liegt
for z=1:Nmax-oxpics
for zz=1:3
if ugrenze(2,zz)==1
if (winkel(1,z)>=ugrenze(1,zz) & winkel(1,z)<=360) |
(winkel(1,z)>=0 & winkel(1,z)<=ogrenze(2,zz))
winkel(2,z)=zz;
end
elseif winkel(1,z)>=ugrenze(1,zz) & winkel(1,z)<=ogrenze(1,zz)
winkel(2,z)=zz;
end
end
end
% Bilder, die sich nicht zuordnen lassen, zuordnen, wenn das vorrausgehende
% und folgende % Bild die selben Winkelstellungen haben
for z=1:Nmax-oxpics
zz=1;
if winkel(2,z)~=0 & z+zz<=Nmax-oxpics
while winkel(2,z+zz)==0
zz=zz+1;
if z+zz>Nmax-oxpics; break; end
end
if z+zz>Nmax-oxpics; break; end
if winkel(2,z)==winkel(2,z+zz)
for zzz=z+1:z+zz-1; winkel(2,zzz)=winkel(2,z); end
end
end
end
% Berechnen der Verweilzeiten für alle 3 Max und speichern in 'verweilzeit'
% Initialisierung, damit der 1. Wert jeder Reihe nicht 0 ist (wegen find)
verweilzeit=[1; 1; 1];
if winkel(2,1)~=0; verweilzeit(winkel(2,1),2)=1; end
for z=2:Nmax-oxpics % Start ab dem 2. Wert, damit Position z-1 möglich ist
if winkel(2,z)==winkel(2,z-1) & winkel(2,z)~=0
verweilzeit(winkel(2,z),max(find(verweilzeit(winkel(2,z),:))))=
verweilzeit(winkel(2,z),max(find(verweilzeit(winkel(2,z),:))))+1;
else
for zz=1:3
if winkel(2,z)==zz
verweilzeit(winkel(2,z),
max(find(verweilzeit(winkel(2,z),:)))+1)=1;
end
end
end
end
verweilzeit(:,1)=[]; % die 1. Werte der Verweilzeiten wieder löschen
verweilzeit=verweilzeit*0.04; % Umrechnung der Verweilzeiten in [ms]
% Nur Verweilzeiten berücksichtigen, die zwischen 0 und 5 Sekunden liegen
verweilzeit1=[]; verweilzeit2=[]; verweilzeit3=[];
for z=1:size(verweilzeit,2)
if verweilzeit(1,z)>0 & verweilzeit(1,z)<=5
verweilzeit1=[verweilzeit1 verweilzeit(1,z)];
end
if verweilzeit(2,z)>0 & verweilzeit(2,z)<=5
verweilzeit2=[verweilzeit2 verweilzeit(2,z)];
end
if verweilzeit(3,z)>0 & verweilzeit(3,z)<=5
verweilzeit3=[verweilzeit3 verweilzeit(3,z)];
end
128
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
end
% Initialisierung der Diagrammachsen
interval2=[];
for z=0:24; interval2=[interval2 0.06+z*0.08]; end
x2kurve=[];
for z=1:200; x2kurve=[x2kurve z/100]; end
% Erzeugung der Histogramme
histogram_dwell_time(1,:)=hist(verweilzeit1,interval2);
histogram_dwell_time(2,:)=hist(verweilzeit2,interval2);
histogram_dwell_time(3,:)=hist(verweilzeit3,interval2);
parameter=[20 0.5];
% Berechnung der Verweilzeiten mit exponentieller Zerfallsfunktion 1. Ordn
for zz=1:3
zz % Zähler
[fitresult,r,J]=nlinfit(interval2,histogram_dwell_time(zz,:),
'expo_dwell_time',parameter);
fit_dwell_time(zz,:)=feval('expo_dwell_time',fitresult,x2kurve);
fitresult_dwell_time(:,zz)=fitresult;
end
% Ausgabe der Fitergebnisse
if fiterg_ausgabe==1
fitresult_dwell_time=(round(fitresult_dwell_time*100))/100;
Dwell_time_1=num2str(fitresult_dwell_time(2,1))
Dwell_time_2=num2str(fitresult_dwell_time(2,2))
Dwell_time_3=num2str(fitresult_dwell_time(2,3))
end
% Darstellung der Histogrammdaten und angepassten Exponentialfunktionen
figure(4)
set(figure(4),'Position',[560 30 560 420])
for z=1:3
subplot(3,1,z)
bar(interval2,histogram_dwell_time(z,:),'r')
if z==1; title('Dwell Time'); end
xlim([0 2])
set(gca,'XTick',0:0.2:2)
ylabel('\itcounts')
hold on
plot(x2kurve,fit_dwell_time(z,:),'k','LineWidth',1.5)
hold off
end
xlabel('\ittime /s')
end % Ende Verweilzeitauswertung
end % Ende Gaußkurvenberechnung
%-------------------------------------------------------------------------------% Speichern der Ergebnisse in ascii-Dateien, wenn eingeschaltet
if ausgabe==1
% ascii-Dateien werden im gleichen Pfad wie Bilddateien erzeugt
fname=strcat(directory,'\');
% Daten der 1. Seq speichern
filename=strcat(fname,'superimposed_red.bmp');
imwrite(SI_red,filename,'bmp');
% Mittelwertsbild
filename = strcat(fname,'superimposed_kontrast_red.bmp');
imwrite(B_red,filename,'bmp');
% kontrastverstärktes Mittelwertsbild
matrix=[interval; histogram]; % Histogramm der Winkelpositionen
filename=strcat(fname,'angle_histogram_red.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%3.0f %3.0f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix=[ep_x_red; ep_y_red]; % Endpunktpositionen
filename=strcat(fname,'endpoint_red.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f %4.2f \n',matrix);
129
Anhang
_________________________________________________________________________
status=fclose(fid);
matrix=[time; acs]; % Trajektorie
filename=strcat(fname,'trajektorie.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f %4.3f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix=[radius; umdrehungen; geschwindigkeit]; % Radius, Umdrehungen, Geschw.
filename=strcat(fname,'r_u_v.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%1.1f %3.1f %1.1f',matrix);
status=fclose(fid);
if exist('parameter','var')==1 % falls Gaußfit existiert
matrix=[xkurve; gauss3]; % Gaußfit-Kurve
filename=strcat(fname,'gaussfit_red.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%3.0f %3.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix=[]; % Gaussfitmaxima
for z=1:3; matrix=[matrix; round(fitxgauss(z))]; end
filename=strcat(fname,'fitwerte.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
end
if oxpics>0 % Daten der 2. Seq speichern, wenn vorhanden
filename=strcat(fname,'superimposed_ox.bmp');
imwrite(SI_ox,filename,'bmp');
% Mittelwertsbild
filename = strcat(fname,'superimposed_kontrast_ox.bmp');
imwrite(B_ox,filename,'bmp');
% kontrastverst. Mittelwertsbild
matrix=[interval; histogram_ox]; % Histogramm der Winkelpositionen
filename=strcat(fname,'angle_histogram_ox.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%3.0f %3.0f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix=[ep_x_ox; ep_y_ox]; % Endpunktpositionen
filename=strcat(fname,'endpoint_ox.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f %4.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
if size(Py,2)>3
matrix=[xkurve; gauss_ox]; % Gaußfit-Kurve
filename=strcat(fname,'gaussfit_ox.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%3.0f %3.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix=[]; % alle Gaussfitmaxima
for z=1:size(Py,2); matrix=[matrix; round(fitxgauss(z))]; end
filename=strcat(fname,'fitwerte.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
end
end
if dt_analysis==1 % falls Verweilzeit-Analysis existiert
matrix_fit=[];
for z=1:3
% Histogramm der Verweilzeiten
matrix=[interval2; histogram_dwell_time(z,:)];
filename=strcat(fname,'dwell_time_histo_',num2str(z),'.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%1.2f %3.0f \n',matrix);
status=fclose(fid);
% exponentieller Zerfall - Fitkurve
matrix=[x2kurve; fit_dwell_time(z,:)];
filename=strcat(fname,'dwell_time_fit_',num2str(z),'.dat');
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%1.2f %4.2f \n',matrix);
status=fclose(fid);
matrix_fit=[matrix_fit; fitresult_dwell_time(2,z)];
end
filename = strcat(fname,'dwell_time.dat'); % Verweilzeiten - Fitergebnisse
130
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
fid=fopen(filename,'w'); fprintf(fid,'%4.2f \n',matrix_fit);
status=fclose(fid);
end
end % Ende Datenspeicherung
7.2.4
Funktion: expo_dwell_time
% Histogramm der Verweilzeiten mit einem exp Zerfall 1. Ordnung anpassen
function g=expo_dwell_time(param,x);
A=param(1);
t=param(2);
g=A*exp(-x/t);
7.2.5
Funktion: gaussfit
% Anpassen von Histogrammdaten mit beliebig vielen Gaußkurven
% Eingabe: Startparameter; Ausgabe: Fitwerte
function f=gaussfit(param,x);
f=0;
for z=1:size(param,1)/3 % Einlesen von 3 Startparameter pro Gaußfunktion
% Gaußfunktion erzeugen
f=f+param(z*3-2)*exp(((x-param(z*3-1))/param(z*3)).^2/(-2));
end
7.2.6
Script: auswertpixel
% Prozedur zur Festlegung der auszuwertenden Bildpunkte
% Eingabevariablen: Bildpunktkoordinaten (i,j), Ugrenzereal, superimpose
% Ausgabevariablen: Bildpunktkoordinaten (i,j), fehlerbild (Liste aller
% auszuwertenden Bildpunkte)
% Vorgabe der Bildpunkthelligkeit nur bei Auswertung von Magnetpartikeln (mb=1)
ph=0;
if exist('mb')==1
if mb==1; ph=pixelhelligkeit; end
end
% 1) Suche nach hellen Bildpunkten unter- und oberhalb der in i/j deklarierten
% Bildpunkten. Wenn ein Bildpunkte unter- oder oberhalb der aktuellen
% Suchposition heller als die Untergrenze und dunkler als der hellste
% Mittelpunktspixel ist, werden die Bildpunke in i/j ergänzt.
dim=size(i,2); % Bestimmung der Anzahl der Reihen, in denen gesucht wird
maxi=max(i);
% unterste Reihe
mini=min(i);
% oberste Reihe
for z=1:dim % Bildpunkte unterhalb den in i/j deklarierten Bildpunkten suchen
if ismember(i(1,z),maxi)==1
ni=i(1,z); nj=j(1,z);
while superimpose(ni+1,nj)>Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni+1:ni+2,nj)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
ni=ni+1;
i=[i ni]; j=[j nj]; % neue Bildpunktkoordinaten in i/j ergänzen
end
end
end
for z=1:dim % Bildpunkte oberhalb den in i/j deklarierten Bildpunkten suchen
if ismember(i(1,z),mini)==1
ni=i(1,z); nj=j(1,z);
while superimpose(ni-1,nj)>Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni-2:ni-1,nj)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
ni=ni-1;
i=[i ni]; j=[j nj]; % neue Bildpunktkoordinaten in i/j ergänzen
end
end
end
% Erstellen einer Matrix ('fehlerbild') entsprechend der Größe der Bilder mit
% Werten von 1 (auswertbare Bildpunkte) und 0 (nicht auswertbare Bildpunkte),
% entsprechend nach den in i/j gespeicherten Koordinaten.
131
Anhang
_________________________________________________________________________
fehlerbild=zeros(size(superimpose,1),size(superimpose,2));
for z=1:size(i,2); fehlerbild (i(1,z),j(1,z))=1; end
% 2) Suche nach hellen Bildpunkten rechts und links der in i/j deklarierten
% Bildpunkten. Wenn ein Bildpunkte rechts oder links von der aktuellen
% Suchposition heller als die Untergrenze % und dunkler als der hellste
% Mittelpunktspixel ist, werden die Bildpunkte in i2/j2 gespeichert.
dim=size(j,2); % Bestimmung der Anzahl der Reihen, in denen gesucht wird
i2=[]; j2=[];
for z=1:dim % Bildpunkte rechts von den in i/j deklarierten Bildpunkten suchen
if fehlerbild(i(1,z),j(1,z)+1)==0
ni=i(1,z); nj=j(1,z);
while superimpose(ni,nj+1)>=Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni,nj+1:nj+2)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
nj=nj+1;
i2=[i2 ni]; j2=[j2 nj]; % neue Bildpunktkoordinaten in i2/j2 speichern
end
end
end
for z=1:dim % Bildpunkte links von den in i/j deklarierten Bildpunkten suchen
if fehlerbild(i(1,z),j(1,z)-1)==0
ni=i(1,z); nj=j(1,z);
while superimpose(ni,nj-1)>=Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni,nj-2:nj-1)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
nj=nj-1;
i2=[i2 ni]; j2=[j2 nj]; % neue Bildpunktkoordinaten in i2/j2 speichern
end
end
end
% Matrix 'fehlerbild' um die neu gefundenen Bilpunktkoordinaten i2/j2 ergänzen
for z=1:size(j2,2); fehlerbild (i2(1,z),j2(1,z))=1; end
% 3) Suche nach hellen Bildpunkten unter- und oberhalb der in i2/j2 deklarierten
% Bildpunkten. Wenn ein Bildpunkte rechts oder links von der aktuellen Such% position heller als die Untergrenze und dunkler als der hellste Mittelpunkts% pixel ist, werden die Bildpunkte in i3/j3 gespeichert.
dim=size(i2,2); % Bestimmung der Anzahl der Spalten, in denen gesucht wird
i3=[]; j3=[];
for z=1:dim % Bildpunkte unterhalb den in i2/j2 deklarierten Bildpunkten suchen
if fehlerbild(i2(1,z)+1,j2(1,z))==0
ni=i2(1,z); nj=j2(1,z);
while superimpose(ni+1,nj)>=Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni+1:ni+2,nj)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
ni=ni+1;
i3=[i3 ni]; j3=[j3 nj]; % neue Bildpunktkoordinaten in i3/j3 speichern
end
end
end
for z=1:dim % Bildpunkte oberhalb den in i2/j2 deklarierten Bildpunkten suchen
if fehlerbild(i2(1,z)-1,j2(1,z))==0
ni=i2(1,z); nj=j2(1,z);
while superimpose(ni-1,nj)>=Ugrenzereal&(sum(superimpose(ni-2:ni-1,nj)))/
2-ph<superimpose(ni,nj)
ni=ni-1;
i3=[i3 ni]; j3=[j3 nj];% neue Bildpunktkoordinaten in i3/j3 speichern
end
end
end
% Matrix 'fehlerbild' um die neu gefundenen Bilpunktkoordinaten i3/j3 ergänzen
for z=1:size(j3,2); fehlerbild (i3(1,z),j3(1,z))=1; end
i=[i i2 i3]; % y-Werte der auswertbaren Bildpunkte in i speichern
j=[j j2 j3]; % x-Werte der auswertbaren Bildpunkte in j speichern
132
Matlab - Routinen
_________________________________________________________________________
7.2.7
Script: flaeche
% Legt die drei Bereiche für die Schattierung im Histogramm fest
% Eingabe: Untergrenze (ugrenze(1-3)), Obergrenze (ogrenze(1-3))
% Verhindern, dass die Untergrenze > als die Obergrenze ist
for z=1:3
if ugrenze(1,z)>ogrenze(1,z)
ogrenze(2,z)=ogrenze(1,z); ugrenze(2,z)=1; ogrenze(1,z)=360;
end
end
% Festlegung der x- und y-Werte der 3 Flächen, die schattiert werden sollen
xflaeche1=[]; yflaeche1=[];
if ugrenze(2,1)==1
for z=ugrenze(2,1):ogrenze(2,1);
xflaeche1=[xflaeche1 z]; yflaeche1=[yflaeche1 gauss3(z)];
end
for z=ogrenze(2,1)+1:ugrenze(1,1)-1
xflaeche1=[xflaeche1 z]; yflaeche1=[yflaeche1 0];
end
end
if ugrenze(1,1)==0; ugrenze(1,1)=1; end
for z=ugrenze(1,1):ogrenze(1,1);
xflaeche1=[xflaeche1 z];
yflaeche1=[yflaeche1 gauss3(z)];
end
xflaeche2=[]; yflaeche2=[];
if ugrenze(2,2)==1
for z=ugrenze(2,2):ogrenze(2,2);
xflaeche2=[xflaeche2 z]; yflaeche2=[yflaeche2 gauss3(z)];
end
for z=ogrenze(2,2)+1:ugrenze(1,2)-1
xflaeche2=[xflaeche2 z]; yflaeche2=[yflaeche2 0];
end
end
if ugrenze(1,2)==0; ugrenze(1,2)=1; end
for z=ugrenze(1,2):ogrenze(1,2);
xflaeche2=[xflaeche2 z]; yflaeche2=[yflaeche2 gauss3(z)];
end
xflaeche3=[]; yflaeche3=[];
if ugrenze(2,3)==1
for z=ugrenze(2,3):ogrenze(2,3);
xflaeche3=[xflaeche3 z]; yflaeche3=[yflaeche3 gauss3(z)];
end
for z=ogrenze(2,3)+1:ugrenze(1,3)-1
xflaeche3=[xflaeche3 z]; yflaeche3=[yflaeche3 0];
end
end
if ugrenze(1,3)==0; ugrenze(1,3)=1; end
for z=ugrenze(1,3):ogrenze(1,3);
xflaeche3=[xflaeche3 z]; yflaeche3=[yflaeche3 gauss3(z)];
end
7.2.8
%
%
%
%
Script: mittelpunktfestlegung
Bestimmung des Rotationsmittelpunkts
Eingabe: gemitteltes Bild (superimpose), Zentrumsbildpunkte (xzentrum,
yzentrum)
Ausgabe: Mittelpunktsbildpunkte (xcenter_proc, ycenter_proc, i1, j1)
i=[]; j=[];
% Ausschnitt aus der Mitte des Bildes zur Mittelpunktsbestimmung festlegen
% Höhe und Breite müssen eine gerade Anzahl von Bildpunkten sein
superimpose1=zeros(size(superimpose,1),size(superimpose,2));
133
Anhang
_________________________________________________________________________
for zi=size(superimpose,1)/2-6:size(superimpose,1)/2+6
for zj=size(superimpose,2)/2-6:size(superimpose,2)/2+6
superimpose1(zi,zj)=superimpose(zi,zj);
end
end
% Max. Helligkeit innerhalb dieses Ausschnitts, Mittelpunktsfenster um diesen
% Bildpunkt legen
[maximum imaxj]=max(max(superimpose1,[],1));
[maximum imaxi]=max(max(superimpose1,[],2));
for zi=imaxi-3:imaxi+3
for zj=imaxj-3:imaxj+3
i=[i zi]; j=[j zj];
end
end
% Speichern der Mittelpunktsbildpunkte
i1=i; j1=j;
% Bestimmung des Rotationszentrums mit den Helligkeitsgewichteten
% Mittelpunktsbildpunkten (i1/j1)
zentrum=[]; xcenter_proc=[]; ycenter_proc=[];
for z=1:size(i1,2)
if superimpose(i1(1,z),j1(1,z))>=maximum*0.90
xcenter_proc=[xcenter_proc j1(1,z)*superimpose(i1(1,z),j1(1,z))];
ycenter_proc=[ycenter_proc i1(1,z)*superimpose(i1(1,z),j1(1,z))];
zentrum=[zentrum superimpose(i1(1,z),j1(1,z))];
end
end
xcenter_proc=sum(xcenter_proc)/sum(zentrum);
ycenter_proc=sum(ycenter_proc)/sum(zentrum);
7.2.9
Script: shift
% Parallelverschiebung von Daten
% Eingabe: Originale x-Werte (altwerte), Wert der Verschiebung (delta)
% Ausgabe: verschobene x-Werte (neuwerte)
if delta<0; delta=delta+n; end
if delta>n; delta=delta-n; end
for z=1:n
index=z-delta;
if index<1; index=index+n; end
if index>n; index=index-n; end
neuwerte(index)=altwerte(z);
end
134
Danksagung
___________________________________________________________________________
Danksagung
Ich danke
Prof. Dr. Wolfgang Junge für die hervorragende Betreuung und Unterstützung meiner
Arbeit und die Hilfe dabei, das Ziel trotz aller Widrigkeiten immer im Fokus zu behalten,
apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht-Vandré für die umfassende Beratung in allen
Fragen und die Erstellung ‘nobelpreisverdächtiger’ Skizzen,
Prof. Dr. Holger Lill und Dr. Michael Börsch für die Bereitschaft, als Prüfer zu meiner
Promotionsprüfung zu kommen,
Dr. Oliver Pänke für die kompetente Hilfe in allen wissenschaftlichen Fragen und viel
Spaß während und nach der Arbeit,
Gabriele Hikade für die Herstellung der Mutanten, die Anzucht und Aufreinigung der
Proteinkomplexe sowie für die Hilfe bei allen biochemischen Arbeiten,
Hella Kenneweg für die Biotinylierung des Actins und die Hilfe und den Zeitvertreib
während der dunklen Stunden im Keller,
Dr. Martin Müller und Tilman Linn für das Korrekturlesen meiner Arbeit,
Dr. Karin Bernhardt, Hendrik März, Andreas Müller und Georg Zimmermann für
die Beratung und Hilfe im EDV-Bereich,
Norbert Spreckelmeier, Werner Domanski und Holger Heine für die Hilfe bei der
technischen Umsetzung meiner Ideen,
Dr. Ulrich Kunze für die gute Laune, ein offenes Ohr und die gute Versorgung der
Arbeitsgruppe mit allem, was ein ‘User-Herz’ begehrt,
Claudius Walter für die ausführlichen und immer interessanten fachlichen und
nichtfachlichen Diskussionen,
Dr. Jürgen Clausen für die kurzweiligen Schlachten und Duelle bei SC, GW, AoE, HdR,
WL, AGOT, Eve, WC, SQ, A&A, ...,
Lars Becker für die unterhaltsame Gesellschaft beim mensen und vielen anderen
Gelegenheiten,
Tobias Heidelmann für die Mensagespräche,
sowie allen ehemaligen und aktuellen MitarbeiterInnen der Biophysik für die gute
Zusammenarbeit und die schöne Zeit während meiner Promotion.
135