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Shikimatbiosyntheseweg: Mikrobielle Produktgewinnung der Metabolite Chorismat und SHCHC und Einsatz des Enzyms MenD als Biokatalysator für asymmetrische C-C-Bindungsknüpfung Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg vorgelegt von Anja Kurutsch aus Erlangen Freiburg, Januar 2009 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt sowie Zitate kenntlich gemacht habe. Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Rolf Schubert Dekan: Prof. Dr. Andreas Bechthold Referent: Prof. Dr. Michael Müller Koreferent: Prof. Dr. Thorsten Friedrich Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 07.05.2009 Für Dominik Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Januar 2005 bis Januar 2009 am Lehrstuhl für Pharmazeutische und Medizinische Chemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. M. Müller angefertigt. Mein Dank gilt: Prof. Dr. Michael Müller für die interessante Themenstellung, die sehr gute fachliche Betreuung und die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen. Prof. Dr. Thorsten Friedrich für die Übernahme des Korreferats. Prof. Dr. Georg Fuchs für die Mitwirkung bei der Promotionsprüfung. Herrn Prof. Dr. Georg Sprenger für die gute Kooperation und Bereitstellung von Plasmiden und Fermentationen. Dr. Simon Esser für die Einarbeitung in das Themengebiet. Prof. Gunther Schneider für die Ermöglichung des Forschungsaufenthalts am Karolinska Institut. Besonderer Dank gilt hierbei Jolanta Kopec für die engagierte Einführung in die Proteinkristallisation. Dr. Michael Richter für die Einführung in Klonierungsarbeiten und Unterstützung bei molekularbiologischen Fragestellungen. Volker Brecht für sein Engagement und seine fachliche Hilfe bei zahlreichen NMR- Messungen sowie für die effektive Zusammenarbeit an der LCMS/MS. Oliver Rieder für die Hilfe und Unterstützung bei chemisch-synthetischen Fragestellungen. Andreas Präg und Katharina Hesselbach für ihr Engagement bei den Proteinaufreinigungen. Frau Wagner für die sehr gute Zusammenarbeit bei der Praktikumsbetreuung des 2. Semesters und die "Versüssung" von langen Nachmittagen im 6.Stock. Frau Breitling für ihre stete Hilfsbereitschaft bei laborpraktischen Fragen aller Art. Patrizia Lehwald, Dr. Wolfgang Hüttel, Dr. Silke Bode und Dr. Michael Richter für das aufmerksame Korrekturlesen des Manuskripts. Dem Arbeitskreis für die sehr gute und persönliche Arbeitsatmosphäre. Meiner Familie für die Ermöglichung meiner Ausbildung und den stets gewährten Rückhalt bei allen Entscheidungen. Dominik für seine bedingungslose Unterstützung, sein Verständis und alles andere. Veröffentlichungen aus dieser Arbeit: Poster: A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Richter, M. Müller; MenD as catalyst for asymmetric chemical synthesis, Chemical Biology of Thiamine, Mai/Juni 2008, Lutherstadt Wittenberg. A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for asymmetric chemical synthesis, 20. Irseer Naturstofftage, Februar 2008, Irsee. A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for chemical synthesis, 4th Status Seminar Chemical Biology, Chem Bio Net, November 2007, Frankfurt. P P A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for chemical synthesis, Day of science, July 2007, Freiburg. A. Kurutsch, S. Esser, S. Kozak, N. Trachtmann, Volker Lorbach, G.A. Sprenger, M Müller; New metabolites of the shikimate pathway as chiral building blocks, VAAM International Workshop "Biology of Bacteria Producing Natural Products", Oktober 2006, Tübingen. A. Kurutsch, S. Esser, S. Kozak, N. Trachtmann, Volker Lorbach, G.A. Sprenger, M Müller; New metabolites of the shikimate pathway as chiral building blocks, 3th Summer School Medicinal Chemistry 2006, September 2006, Regensburg. P TP T Kurzvorträge: A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for asymmetric chemical synthesis, 20. Irseer Naturstofftage, Februar 2008, Irsee. A. Kurutsch, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for chemical synthesis, 4th Status Seminar Chemical Biology, Chem Bio Net, November 2007, Frankfurt. P P Zeitschriftenbeiträge A. Kurutsch, M.Richter, V. Brecht, G.A. Sprenger, M. Müller; MenD as catalyst for asymmetric chemical synthesis, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. (Manuskript eingereicht). J. Bongaerts, S. Esser, V. Lorbach, L. Al-Momani, M. A. Müller, D. Franke, C. Grondal, A. Kurutsch, R. Bujnicki, R. Takors, L. Raeven, M. Wubbolts, R. Bovenberg, M. Nieger, M. Schürmann, N. Trachtmann, S. Kozak, G. A. Sprenger, M. Müller; Biosynthesis as a model: Diversity-oriented production of chorismate-derived metabolites and its use in organic synthesis (Manuskript in Vorbereitung). 1. TU Zusammenfassung ........................................................................... 1 UT TU 2. UT TU Allgemeiner Teil................................................................................ 3 UT TU 2.1. Der Shikimisäureweg ................................................................................. 3 TU TU UT TU UT TU UT TU UT TU UT TU UT TU UT TU 2.2. UT UT Von Chorismat zu den Derivaten des Vitamin K...................................... 4 TU 2.3. UT "Weiße Biotechnologie" ............................................................................ 6 TU 2.4. UT Biokatalyse ................................................................................................. 8 TU 2.5. UT Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme ................................................... 9 TU 2.6. UT Synthese von α-Hydroxyketonen und 1,4-Diketonen............................ 12 TU 2.7. UT MenD ......................................................................................................... 18 TU 2.8. UT Aufgabenstellung ..................................................................................... 19 TU 3. TU UT UT Spezieller Teil ................................................................................. 21 UT TU 3.1. UT Molekularbiologische Arbeiten ............................................................... 21 TU UT TU UT 3.1.1. Klonierung von entC .......................................................................................21 TU TU UT TU UT TU UT TU 3.1.2. UT Expression und Reinigung von EntC ..............................................................23 TU 3.1.3. 3.1.4. TU UT TU 3.3. UT UT Mikrobielle Produktgewinnung ............................................................... 34 TU UT 3.3.1. In vivo-Produktion von SHCHC und Chorismat ..............................................34 TU TU UT TU UT TU UT TU 3.3.2. UT 3.3.3. UT Untersuchungen zur Stabilität von Chorismat und SHCHC ............................39 TU 3.3.4. UT Versuche zur Folgechemie .............................................................................41 TU 3.4. UT Isolierung der Metabolite durch Ionenaustauschchromatographie .................37 TU UT MenD als Biokatalysator .......................................................................... 44 TU UT TU UT 3.4.1. 1,2-Addition von α-Ketoglutarat an Aldehyde .................................................44 TU TU UT TU UT TU UT TU UT TU UT TU 3.4.2. UT 3.4.3. UT Carboligation von α-Ketosäuren .....................................................................56 TU 3.4.4. UT Nachweis der spezifischen Aktivität von MenD durch Leervektorexpression .59 TU 3.4.5. UT In vitro-Darstellung von SHCHC .....................................................................63 TU 3.4.6. UT Untersuchungen zur Selektivität der physiologischen 1,4-Addition ................64 TU 3.5. UT 1,2-Addition von unphysiologischen α-Ketosäuren an Aldehyde....................54 TU UT Arbeiten zur Strukturaufklärung von MenD ........................................... 70 TU UT TU UT 3.5.1. Versuche zur Proteinmodellierung mit SWISS MODEL .................................70 TU TU UT TU UT TU 3.5.2. UT 3.5.3. UT Strukturaufklärung von MenD .........................................................................76 TU UT UT Kristallisation von MenD .................................................................................70 TU UT Alignments ................................................................................................ 80 TU 3.6.1. TU UT Analyseverfahren zur Identifizierung der Metabolite ............................ 30 TU 3.6. UT Aufreinigung von MenD ..................................................................................28 TU TU UT Klonierung von menD .....................................................................................24 TU 3.2. UT UT UT MenD-Proteine aus verschiedenen Organismen ............................................80 TU UT 3.6.2. MenD und homologe Proteine ........................................................................80 TU 4. TU TU TU UT 5. Experimenteller Teil ....................................................................... 83 UT TU 5.1. UT Chemikalien .............................................................................................. 83 TU TU UT TU UT TU 5.2. UT UT Analytik ..................................................................................................... 83 TU 5.3. UT Molekularbiologische und biochemische Arbeiten ............................... 88 TU UT 5.3.1. Verwendete E. coli-Stämme, Vektoren und Plasmide ....................................88 TU TU UT TU UT TU UT TU 5.3.2. UT 5.3.3. 5.3.4. UT TU UT 5.4.1. Kultivierung im Schüttelkolben ........................................................................99 TU TU UT TU UT TU 5.4.2. UT 5.4.3. UT Enzymatische Reaktionen und Synthesen .......................................... 104 TU UT TU UT 5.5.1. Nachweis und Bestimmung von Aktivität ......................................................104 TU TU UT TU UT TU 5.5.2. UT 5.5.3. UT 2,3-CHD als unnatürlicher Akzeptor der 1,4-Addition ...................................119 TU 5.6. UT Substratspektrum von MenD-1,2-Additionen ................................................106 TU UT Chemische Synthesen ........................................................................... 120 TU UT TU UT 5.6.1. Derivatisierungsversuche von Chorismat und SHCHC.................................120 TU TU UT TU UT TU 5.6.2. UT 5.6.3. UT Vergleichsubstanzen und Enzymsubstrate ...................................................124 TU 5.7. UT Methylester der 5-Hydroxy-4-oxopentansäurederivate .................................121 TU UT Kristallisation ......................................................................................... 128 TU UT TU UT 5.7.1. Stabilität von MenD in Lösung ......................................................................128 TU TU UT TU UT TU 5.7.2. UT 5.7.3. TU 6. UT Se-Met-MenD ...............................................................................................129 TU UT Kristallisationsbedingungen ..........................................................................130 UT Abkürzungsverzeichnis ................................................................131 UT TU UT 7. Anhang .........................................................................................133 UT TU 7.1. TU UT TU UT TU 7.2. UT 7.3. UT Sequenz MenD ........................................................................................ 133 TU TU UT Sequenz EntC ......................................................................................... 133 TU UT UT Isolierung und Aufreinigung der Metabolite ..................................................102 TU 5.5. UT Fermentation .................................................................................................102 TU 8. UT Untersuchungen zur mikrobiellen Produktgewinnung ......................... 99 TU TU UT Proteinbiochemische Methoden .....................................................................94 TU TU UT Allgemeine molekularbiologische Arbeitstechniken ........................................89 TU 5.4. UT Stammhaltung .................................................................................................89 TU TU UT Diskussion und Ausblick ................................................................ 81 UT TU UT UT Alignments .............................................................................................. 133 UT Literaturverzeichnis ...................................................................... 139 TU UT T 1. Zusammenfassung 1. 1 Zusammenfassung Chiralität ist eine der wesentlichen Eigenschaften von vielen bioaktiven Stoffen. In diesem Zusammenhang erlangt die stereoselektive Synthese eines bestimmten Enantiomeres einer Substanz immense Bedeutung. Denn oftmals ist nur ein Enantiomer wirksam, während das andere inaktiv ist, oder sich sogar als toxisch herausstellt. In dieser Arbeit wurden die chiralen Naturstoffe Chorismat und 2-Succinyl-6-hydroxy-2,4cyclohexadiene-1-carboxylat (SHCHC) als Synthesebausteine verfügbar gemacht sowie die Enzyme Isochorismat Synthase (EntC) und 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3- cyclohexen-1-carboxylat Synthase (MenD) aus dem Shikimisäure-Biosyntheseweg auf ihre Eignung als Biokatalysatoren zur asymmetrischen Synthese untersucht. Chorismat und SHCHC wurden durch "Metabolic Engineering" veränderter E. coli-Stämme produziert, gereinigt, isoliert und charakterisiert. Die Enzyme EntC und MenD wurden mit His-tag kloniert und stehen aufgereinigt zum Einsatz als Biokatalysatoren zu Verfügung. Das thiamindiphosphat-abhängige Enzym MenD aus E. coli wurde dabei eingehend auf unphysiologische C-C-Bindungsknüpfungsreaktionen untersucht. α-Ketoglutarat wird nach erfolgter Decarboxylierung mit Hilfe des Cofaktors umgepolt und reagiert als (Elektronen-)Donor mit einem breiten Spektrum von Aldehyden (Akzeptoren). Aus diesen Carboligationen resultierten chirale α-Hydroxyketone mit isolierten Ausbeuten von 26-87%. Mit aromatischen Aldehyden konnten darüber hinaus hohe Enantiomerenüberschüsse von bis zu 98% erreicht werden. Charakteristisch für die durch MenD-Katalyse gebildeten Produkte ist eine hohe, konservierte Regioselektivität. α-Ketoglutarat fungiert gewöhnlich als Donor und es entstehen durch Addition an Aldehyde 5-Hydroxy-4-oxopentansäurederivate. Die einzige bislang beobachtete Ausnahme stellt die Carboligation zwischen den zwei Ketosäuren Pyruvat und α-Ketoglutarat dar. Bei dieser Reaktion kehrt sich die Regioselektivität um und es entsteht racemisches 4-Hydroxy-5oxohexanoat. Der Donor α-Ketoglutarat kann wie der Akzeptor ebenfalls ausgetauscht werden. Kleinere Donoren wie Oxalacetat und Pyruvat werden von MenD prinzipiell akzeptiert, jedoch mit deutlich geringeren Umsätzen. Die physiologische 1,4-Addition von α-Ketoglutarat an die ungesättigte Carbonsäure Isochorismat wurde im Hinblick auf die Substratbreite untersucht. Das durch mikrobielle Fermentation erhältliche 2,3-Dihydroxy-cyclohexa-4,6-diencarboxylat (2,3-CHD) ist das 2 1. Zusammenfassung einzige bisher bekannte, nicht-physiologische Substrat, das in einer 1,4-Addition von MenD umgesetzt wird. (5S,6S)-2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2-encarboxylat (SDHCHC) konnte dabei als nicht-physiologisches 1,4-Addukt identifiziert werden. Im Gegensatz zur 1,2-Additon ist das Spektrum der Substrate, die in 1,4-Addition reagieren, sehr eingeschränkt. Die Testung einer Reihe weiterer ungesättigter Carbonsäuren, sowie Carbonsäureestern und Ketone ergab keinen Hinweis auf katalytischen Umsatz durch das Enzym MenD. MenD bietet mit seinem breiten Substratspektrum, sowie der Eigenschaft zwei unterschiedliche Reaktionstypen zu katalysieren, großes Potential als Biokatalysator in der enzymatischen Synthese. Zusammen mit den fermentativ im Grammmaßstab zugänglichen Naturstoffen Chorismat und SHCHC stehen nun bislang nicht zugängliche, chirale Substanzen als interessante Bausteine zur Synthese von pharmakologisch aktiven Substanzen zur Verfügung (Abbildung 1). CO2- O - O CO2- CO2OH O2C CO2- O - OH O2 C OH OH Chorismat SHCHC OH CO2O R aromatische Hydroxyketone Abbildung 1 SDHCHC OH OH CO2 O aliphatische Hydroxyketone - CO2- R O ungesättigte Hydroxyketone Im Rahmen dieser Arbeit zugängliche, chirale Synthesebausteine. 2. Allgemeiner Teil 2. 3 Allgemeiner Teil 2.1. Der Shikimisäureweg Der Shikimisäureweg stellt einen wichtigen Weg für die Biogenese von Aromaten dar. Die Startermoleküle stellen dabei die Substanzen D-Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat (PEP) dar. Sie reagieren unter Enzymkatalyse zu 3-Deoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat (DAHP). In weiteren enzymatischen Schritten entstehen Dehydrochinasäure, Dehydroshikimisäure und schließlich Shikimisäure, der Namensgeber des Biosyntheseweges. Am Ende dieses linearen Weges steht Chorismat (1). 1 als Molekül ist ausgestattet mit einer hohen synthetischen Flexibilität durch eine hohe Funktionalisierung, die den Weg für eine außerordentliche Produktdiversität ebnet. Bei 1 verzweigt sich der Biosyntheseweg zu unterschiedlichen Produkten [1]. CO2 CO2 NH3 Tryptophan Ubichinone Anthranilat OH 4-Hydroxybenzoat Enterobactin Salicylate CO2 CO2 CO2 OH Folsäure O NH3 CO2 O OH Chorismat (1) 4-Aminobenzoat Menachinone CO2 Phyllochinone Isochorismat (2) OH CO2 O2C - O2C O Phenylalanin Tyrosin OH OH 1,4-Dihydroxy-6-naphthoat Prephenat Abbildung 2 Chorismat (1) als Verzweigungsstelle im Shikimisäureweg. Wichtige Produkte stellen zum Beispiel die Aminosäure L-Tryptophan dar, sowie die über das Zwischenprodukt Prephenat gebildeten Aminosäuren L-Tyrosin und L-Phenylalanin. Der Shikimisäureweg ist aber nicht nur für den Aminosäure- beziehungsweise Proteinaufbau 4 2. Allgemeiner Teil wichtig. 1964 kamen Cox und Gibson [2] durch Experimente mit markierter Shikimisäure zu dem Schluss, dass die Synthese der Phyllochinone und Menachinone von 1 als Produkt des Shikimisäureweges verläuft. Auch die Biosynthese der Ubichinone, der Folate und der Enterobactine (Abbildung 2) [1, 3] gehen aus dem Shikimisäure-Biosyntheseweg hervor. Zu den Menachinonen führen zwei Biosynthesewege: Grundlage dieser Arbeit ist der erste Weg zu den Menachinonen. Dieser ist bereits seit längerem aufgeklärt [4] und verläuft über die Substanz Isochorismat (2), welche den gemeinsamen Vorläufer von Salicylat, der Enterobactine, Phyllochinone und Menachinone darstellt [5]. Dieser Biosynthesewegabschnitt ist sowohl aufgrund der stark funktionalisierten Metabolite interessant, als auch aufgrund der Enzyme, die außergewöhnliche Transformationen katalysieren. Das Fehlen dieses Biosyntheseweges bei Menschen und Säugetieren macht diese Enzyme zu einem interessanten Angriffspunkt für Antibiotika, Fungizide und Herbizide [6]. Über den zweiten Weg, den sogenannten Futalosinweg werden ausgehend von 1 die Menachinone über das Zwischenprodukt 1,4-Dihydroxy-6-naphthoat gebildet [7, 8]. Erste Hinweise darauf gab es durch die Entdeckung, dass bestimmte Bakterienstämme wie zum Beispiel Streptomyces coelicolor [9] und Helicobacter pylori [10] Menachinone produzierten, obwohl ihnen die hierfür als notwendig erachteten menD-Gene fehlen. Anhand von Markierungsexperimenten mit [U-13C6]-Glucose und verschiedenen knock-out-Experimenten P P B B wurden schließlich von Dairi et al. verschiedene Zwischenprodukte und Enzyme bis zu einer Vorstufe der Menachinone, dem 1,4-Dihydroxy-6-naphthoat identifiziert [7]. 2.2. Von Chorismat zu den Derivaten des Vitamin K Der Focus dieser Arbeit liegt auf den Metaboliten Chorismat (1), Isochorismat (2) und 2Succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylat (SHCHC, 5), sowie auf den an der Umsetzung der Substanzen beteiligten Enzyme EntC und MenD (Abbildung 3). Im ersten Schritt isomerisiert 1 unter Enzymkatalyse von EntC zu 2. Diese Reaktion von 1 wurde bereits 1969 von Gibson et al. im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Biosynthese von 2,3-Dihydroxybenzoaten als Vorstufe zu den Enterobactinen entdeckt [11]. EntC ist als Monomer aktiv (Mr = 43 kDa) und katalysiert die Isomerisierung zu 2 als reversible B B Gleichgewichtsreaktion. Das Gleichgewicht liegt dabei auf der Seite des Edukts 1, so dass nur bei Bedarf 2 nachgeliefert wird und der "Pool" an 1 in der Zelle geschont wird. Die Hydroxylgruppe stammt bei dieser Reaktion nach Experimenten mit Deuteriumoxid aus dem Lösungsmittel Wasser [12]. 2. Allgemeiner Teil 5 Der nächste Schritt ausgehend von 2, welcher gleichzeitig den ersten Schritt in Richtung Menachinonbiosynthese darstellt, wird katalysiert von dem Thiamindiphosphat (ThDP)abhängigen Enzym MenD. MenD aus E. coli K12 besteht aus 556 Aminosäuren und liegt in Lösung als Homodimer vor. Jede Untereinheit ist 65 kDa schwer. Die Reaktion benötigt als Cofaktoren ThDP und ein zweifach geladenes Metallion, wobei die Aktivität für Mangan(II) etwas höher liegt als bei Bindung von Magnesium(II) [13]. MenD katalysiert die Umsetzung von 2 mit α-Ketoglutarat (3) zu dem Produkt 2-Succinyl-5enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexen-1-carboxylat (SEPHCHC, 4). ThDP wird regeneriert und unter Abspaltung von Pyruvat entsteht SHCHC (5). Erste Hinweise auf das scheinbare Produkt 5 gab Bentley et al. bereits 1983 [14], bestätigte es 1985 [15] und daraufhin war 5 lange als das Katalyseprodukt von MenD akzeptiert [13, 16]. Jedoch bereits 1991 beobachteten Leistner et al. bei der Durchführung von Umsetzungen von 2 mit zellfreiem Proteinextrakt ein nicht identifizierbares Zwischenprodukt [17]. In neusten Untersuchungen von Guo et al. [18] konnte dieses Zwischenprodukt isoliert werden. Sie zeigten NMR-spektroskopisch, dass nicht SHCHC (5), sondern SEPHCHC (4) das eigentliche Produkt des Enzyms MenD darstellt. Ein weiteres Enzym, MenH, welches in nachfolgenden Arbeiten von Guo et al. charakterisiert und kristallisiert wurde [19], katalysiert die Umsetzung von 4 zu 5. Da 5 auch nicht-enzymatisch bereits im schwach basischen durch Abspaltung der Abgangsgruppe Pyruvat aus 4 entsteht, ist 4 als das eigentliche Produkt schwer nachweisbar und wurde deshalb lange Zeit übersehen. CO2 CO2 EntC O CO2- MenD OH [Mg2+] O OH O - CO2OH O2C 2+, CO2- [Mg ThDP] O CO2 SEPHCHC (4) Isochorismat (2) Chorismat (1) H Ketoglutarat (3) MenH Pyruvat O Menaquinone - CO2- O2C OSB (6) Abbildung 3 OSB-Synthase H2O O - O2C CO2 OH SHCHC (5) Beteiligte Enzyme an der Biosynthese der Menachinone. Aus 5 wird durch das Enzym o-Succinylbenzoat (OSB) Synthase enzymatisch Wasser abgespalten und der Aromat o-Succinylbenzoat (OSB, 6) gebildet. Weitere enzymatische 6 2. Allgemeiner Teil Schritte folgen, bis am Ende der Kaskade die Menachinone entstehen. Vitamin-K-Derivate (Abbildung 4) leiten sich chemisch gesehen von dem in der Natur nicht vorkommenden 2-Methyl-1,4-naphthochinon (Menadion, Vitamin K3, Provitamin K) ab. B B Vitamin K1, die so genannten Phyllochinone, kommen in den Chloroplasten von Pflanzen als B B Bestandteil des Photosyntheseapparates vor. Vitamin K2 bzw. Menachinon wird von B B Bakterien produziert und übernimmt dort Funktionen im Elektronentransport zwischen Membranproteinen bei der anaeroben Atmung. Für den Menschen spielen sowohl Vitamin K1, B B das er durch die Nahrung aufnimmt, als auch Vitamin K2, das die Darmbakterien produzieren, B B B B eine essentielle Rolle bei der Blutgerinnung durch Beteiligung an der Synthese von Prothrombin. Auch bei der Biosynthese von Proteinen im Knochen, in der Niere und Bindegewebe spielt Vitamin K eine wichtige Rolle. Im Folgenden wird speziell auf die Biosynthese der bakteriell vorkommenden Vitamin K2-Derivate eingegangen, die B B Menachinone. CH3 CH3 H Vitamin K1: R = O 3 R CH3 CH3 Vitamin K2: R = O CH3 H Menachinon 3 Vitamin K3: R = H Abbildung 4 Phyllochinon Menadion Vitamin K-Derivate. 2.3. "Weiße Biotechnologie" "Weiße Biotechnologie", auch Industrielle Biotechnologie genannt, ist nach einer Definition der europäischen Industrievereinigung "EuropaBio" die Verwendung der Werkzeuge der Natur in der industriellen Produktion. In der Weißen Biotechnologie werden Organismen (= Fermentation) oder deren Bestandteile, zum Beispiele Enzyme (= Biokatalyse), als Grundlagen für die industrielle Produktion verwendet. Neue biotechnologische Methoden und Verfahren tragen dazu bei, diese Produkte effizienter im Vergleich zu manchen herkömmlichen Verfahren zu erzeugen. Die Vorteile liegen dabei auf der Hand: außergewöhnlich hohe Regio– und gleichzeitige Stereoselektivität ist in der Biosynthese häufig anzutreffen. Im Zeitalter der Resourcenknappheit ist das Verwenden von regenerativen Rohstoffen, wie zum Beispiel Glucose, nachhaltig und zukunftsweisend. 2. Allgemeiner Teil 7 Fermentative Produktgewinnung Ein Schwerpunkt innerhalb der sogenannten weißen Biotechnologie ist die Fermentation. Dabei werden im großtechnischen Maßstab Bakterien oder Pilze kultiviert, die nachwachsende Rohstoffe ressourcenschonend in Produkte umsetzen. Eines der ältesten Verfahren ist die Umsetzung von Milchzucker zu Milchsäure durch Milchsäurebakterien, oder die alkoholische Gärung von Zucker zu Alkoholen. Aber auch komplexere Strukturen, wie zum Beispiel Insulin, können in grossem Maßstab gewonnen werden. Wenn die Gene identifiziert sind, welche die für die einzelnen Schritte verantwortlichen Enzyme codieren, kann durch "Metabolic Engineering" die Genexpression beeinflusst werden und so die Produktion des gewünschten Stoffes gezielt gesteuert werden. Aus dem Shikimisäureweg konnten bereits einige Stoffe, wie zum Beispiel Shikimat [20], in E. coli fermentativ im Gramm- bis Kilogrammmaßstab zugänglich gemacht werden. Diese fermentativ zugängliche Ausgangsverbindung wurde schließlich von der Firma ROCHE als Grundlage der industriellen Herstellung des Neuraminidaseinhibitors Tamiflu® eingesetzt. P P Nicht minder interessant sind die Metabolite Chorismat (1) und die daraus ableitbaren Cyclohexadiene (5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure (2,3-CHD 7), (5S,6S)6-Amino-5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure (2,3-CHA, 8) und (3R,4R)-3,4- Dihydroxycyclohexa-1,5-diencarbonsäure (3,4-CHD, 9) im Hinblick auf ihre hohe Funktionalität und naturgegebene Chiralität. Die Ausbeuten an 1 durch chemische Synthese sind mit 7% [21] und 8% [22] jedoch für die rationelle Nutzung nicht zufriedenstellend. Um Chorismat (1) und die Cyclohexadiene als Synthesebausteine marktfähig zu machen mußte deren Zugänglichkeit garantiert werden. Die Fermentation dieser Stoffe in hohen Ausbeuten geschah im Rahmen des CHORUS-Projektes in Zusammenarbeit mit DSM-BIOTECH und den Arbeiten von Dirk Franke [23], Volker Lorbach [24] und Simon Eßer [25] (Tabelle 1). 8 2. Allgemeiner Teil CO2- CO2- CO2- O CO2- CO2OH NH2 OH OH OH OH OH 1 7 8 9 Produkt Menge Durchführende Chorismat (1) > 20 g/L J. Bongaerts et al.,,unveröffentlicht 2,3-CHD (7) > 10 g/L R. Bujnicki, R. Takors, unveröffentlicht 2,3-CHA (8) > 10 g/L 3,4-CHD (9) > 10 g/L Tabelle 1 P P V. Lorbach [24] R. Bujnicki, R. Takors, unveröffentlicht In E.coli zugängliche Metabolite aus dem Shikimisäureweg im Rahmen des CHORUS-Projekts mit DSM-BIOTECH. 2.4. Biokatalyse Biokatalyse ist ebenfalls Teil der weissen Biotechnologie. Hier werden nicht lebende Organismen zur Produktgewinnung eingesetzt, sondern es werden mit isolierten Enzymen gezielt einzelne Reaktionsschritte katalysiert. Dabei macht man sich die Eigenschaft dieser natürlichen Katalysatoren zu nutze, enantioselektiv und gleichzeitig regioselektiv zu arbeiten. Die Theorie, jedes Enzym katalysiert die Umsetzung von nur einem Substrat, ist inzwischen überholt. Durch Untersuchen des Substratspektrums und gezielte Mutagenese von Enzymen kann ein breites Spektrum von chiralen Synthesebausteinen generiert werden. In der chemischen Wirkstoffentwicklung wird diversitätsorientierte Synthese (DOS) [26] mit dem Ziel eine strukturell größtmögliche Diversität zu erreichen, propagiert. Diese Idee ist von der Natur im Sinne von komplexen, enzymatischen Netzwerken längst erfunden und muss nur entdeckt und genutzt werden [27]. Die Vorteile gegenüber der rein organisch synthetisch orientierten Katalyse liegen auf der Hand. Enzyme stellen gegenüber chemischen Katalysatoren die umweltfreundlichere Alternative dar: Schwermetallfreiheit und das Arbeiten in vorwiegend wässrigen Systemen bei physiologischen Temperaturen chrakterisieren enzymatisch katalysierte Reaktionen. Diese schonenden Synthesebedingungen führen zu einer verminderten Anzahl an Nebenprodukten, was wiederum die Effektivität verbessert und die Aufreinigung erleichtert [28]. 2. Allgemeiner Teil 9 2.5. Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme ThDP Der Cofaktor Thiamindiphosphat (ThDP) leitet sich von Thiamin ab. Die Biosynthese des für den Menschen essentiellen Thiamins (Vitamin B1) in Mikroorganismen wurde gut untersucht B B [29]. Das Diphosphat wird unter ATP-Verbrauch durch das Enzym Thiamin-Diphosphokinase gebildet [30]. ThDP ist auch bekannt unter dem Namen Cocarboxylase, da es bei der Decarboxylierung von α-Ketosäuren als Katalysator wirkt. Bereits vor über 60 Jahren wurde katalytische Aktivität von ThDP entdeckt [31]. 1958 beschreibt Breslow mechanistische Einzelheiten zur Katalyse, indem er die katalytische Aktivität des Thiamins, genauer der Thiazoliumsubstruktur, auf die Bildung eines Zwitterions mit negativer Ladung am C2-Atom zurückführt, welches dann als Carbanion nukleophil reagieren kann (Abbildung 5) [32]. Diese negative Ladung am C2 entsteht durch Abspaltung des aciden C2–Protons. Dieses wird indirekt aktiviert durch Abspaltung eines Protons vom Stickstoff in Position 1' am Pyrimidin, katalysiert durch einen Glutamatrest, und einer folgenden Aktivierung der Aminogruppe am C4', die dann nuklephil das Proton des C2 aufnimmt [33]. O Glu O O Glu H N 1' H3C N HN Abbildung 5 O H H3C 4' N H 2 S CH3 N PP 1' N 4' NH2 N 2 S CH3 PP Aktivierung von ThDP durch konserviertes Glutamat als Protonenakzeptor. Der Cofaktor ThDP ist im Enzym in V-Konformation [34] über den Pyrimidinring und den über ein zweiwertiges Metall-Ion koordinierten Diphosphat-Rest im Enzym verankert [35]. Unter den ThDP-abhängigen Enzymen ist diese V-Konformation des ThDP ein spezifisches Merkmal [36, 37]. Reaktionsmechanismen ThDP abhängiger Enzyme ThDP-abhängige Enzyme sind in der Natur weit verbreitet und kommen in den unterschiedlichsten Stoffwechselwegen vor. Innerhalb der ThDP-abhängigen Enzyme trifft man dabei auf ein ausgedehntes Substrat- und Reaktionsspektrum. Besonderes Augenmerk liegt im Folgenden auf den Decarboxylierungs- und Bindungsknüpfungsreaktionen (Tabelle 2). 10 2. Allgemeiner Teil 1. Substrat (ThDPgebunden) Enzym 2. Substrat Stoffwechselweg Referenz Alkoholische Gärung König, 1998 [38] Mandelsäureabbau Polovnikova et al., 2003 [39] Decarboxylierung Pyruvatdecarboxylase (PDC) Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) Pyruvat Benzoylformiat H+ P P + H P P C-C-Knüpfung in α-Position zur Carbonylfunktion Synthese verzweigtkettiger Aminosäuren Duggleby et al., 2003 [40] Liponamid Citratzyklus Jordan, 2003 [36] α-Ketoglutarat Liponamid Citratzyklus Jordan, 2003 [36] Xylulose-5phosphat D-Ribose-5- Pentosephosphatweg Schörken et al., 1998 [41] Acetolactat-Synthase (AHAS) Pyruvat Pyruvatdehydrogenase Pyruvat α-Ketoglutaratdehydrogenase Transketolase Pyruvat α-KetobutyratP phosphat P C-C-Knüpfung an ungesättigte Carbonyle in β-Position zur Carbonylfunktion 3-AcetyloctanalSynthase Pyruvat Thioester des Oct-2-enal (postuliert) Prodigiosinweg Dresen, Dissertation 2008 SEPHCHC-Synthase α-Ketoglutarat Isochorismat Shikimisäureweg Palmer et al., 2003 [13] Clavulansäuresynthese Schofield et al., 2004 [42] C-N-Knüpfung N2-(2-Carboxyethyl) arginin Synthase P P Tabelle 2 Glyceralphosphat Arginin Reaktionstypen verschiedener ThDP-abhängiger Enzyme und deren natürliche Substrate. 2. Allgemeiner Teil 11 Dem Mechanismus der C-C-Bindungsknüpfungen liegt folgendes Schema zugrunde: zuerst erfolgt eine Bindung am C2 des ThDP. Im Fall eines α-Ketosäure erfolgt dies unter Spaltung einer C-C-Bindung des Donorsubstrats, Aldehyde werden direkt gebunden. Dabei wird die Carbonylfunktion umgepolt und damit elektronenreich. Anschliessend fungiert das an ThDP gebundene Substrat als Nukleophil und reagiert mit einem elektrophilen Akzeptor unter Ausbildung einer neuen Bindung (Abbildung 6) [41, 43]. Die einzige bekannte Reaktion eines Thiamindiphosphataddukts als Elektrophil für die C-N Bindungsknüpfung ist die der N2-(2P P Carboxyethyl)-arginin Synthase [42]. H+ R R1 N O A Substrat 1 S R2 HO R A aktiviertes ThDP R1 N R1 N S R2 HO -A S R R2 ThDP-Addukt A = H, CO2 1 R = Pyrimidinring R2 = Diphosphatrest R1 N E (Elektrophil) HO R Substrat 2 Abbildung 6 HO S R2 ThDP-Addukt E R R1 N O S R2 E R Produkt R1 N S R2 aktiviertes ThDP Reaktionsschema für Thiamindiphosphatabhängige Enzyme mit Aldehyden oder α-Ketosäuren als Substrat 1 und einem Elektrophil (= Akzeptor) als Substrat 2. Aldehyde und ungesättigte Carbonylverbindungen als Elektrophile Je nachdem ob das Elektrophil ein Aldehyd oder eine ungesättigte Carbonylverbindung darstellt, würden bei der Übertragung des umgepolten Donorsubstrates α-Hydroxyketone oder 1,4-Diketone entstehen. Bei Einsatz von Aldehyden wird ein neues Stereozentrum, im Falle von substituierten, ungesättigten Carbonylverbindungen werden bis zu zwei neue Stereozentren generiert (Abbildung 7). 12 2. Allgemeiner Teil R1 N O R' HO H S R Substrat 2' OH R * 2 1,2-Addition O Hydroxyketone ThDP-Addukt R1 N O R' HO R''' R R" Substrat 2'' R''' O S R 2 * R' 1,4-Addition ThDP-Addukt Abbildung 7 R R' R" * R O 1,4-Diketone Produkte aus 1,2- und 1,4-Additionen des Thiaminadduktes. 2.6. Synthese von α-Hydroxyketonen und 1,4-Diketonen α-Hydroxyketone Chirale α-Hydroxyketone sind wichtige Ausgangsverbindungen für eine Vielzahl von bioaktiven Stoffen wie zum Beispiel Pharmazeutika [44]. Aus einem α-Hydroxyketon leitet sich unter anderem der Arzneistoff L-Ephedrin ab, der auch heute noch zur Behandlung von asthmatischen Erkrankungen eingesetzt wird (siehe unten). Auch der Synthese von (-)-Cytoxazon, einem Antiallergikum [45] und Bupropion, dem Wirkstoff der Antiraucherpille Zyban®, [46], liegen als Ausgangsstrukturen α-Hydroxyketone zugrunde (Abbildung 8). P P O HN OH O O HN NHCH3 L-Ephedrin Abbildung 8 OH MeO (-)-Cytoxazon Cl Bupropion Pharmakologisch aktive Substanzen abgeleitet von aromatischen α-Hydroxyketonen. Die α-Hydroxyketoneinheit kann darüberhinaus durch einfache Folgechemie wie reduktive Aminierung oder enantioselektive Reduktion der Ketogruppe in chirale Aminoalkohole oder Diole überführt werden, die breite Anwendung als chirale Liganden in der Organokatalyse finden [47]. Chemische Synthese Zur Darstellung von chiralen α-Hydroxyketonen auf chemischem Wege gibt es eine Vielzahl von Methoden: Enantioselektiv können Enolether mit verschiedenen elektrophilen Sauerstoffdonoren oxidiert werden. Mit Osmiumtetraoxid als Donor wurden in chiraler Umgebung ee- 2. Allgemeiner Teil 13 Werte von 86-95% erreicht [48]. Durch selektive Reduktion von 1,2-Diketoverbindungen wie 1-Phenyl-1,2-propandion durch asymmetrische Transferhydrierung konnten an chiralen Rutheniumkatalysatoren Werte von 99% ee und 89% Ausbeute bei 10 °C erzielt werden [49]. Eine der ältesten Synthesemethoden von chiralen α-Hydroxyketonen geht auf die Benzoinkondensation von zwei aromatischen Aldehyden zurück. Bereits 1832 beobachteten Liebig und Wöhler die cyanidkatalysierte Kondensation von Benzaldehyd (10) zu Benzoin [50]. Dabei erfolgt durch Cyanid eine Umpolung der Aktivität des einen Carbonylkohlenstoffes [51]. Dieser greift als Donor nukleophil den zweiten Aldehyd an, Cyanid wird abgespalten, und Benzoin freigesetzt. Erst der Austausch von Cyanid gegen die schonendere Reaktionsbedingungen erlaubenden Thiazoliumsalze machte die Reaktion zu einer breitangewendeten Synthese. Aliphatische Aldehyde und Gemische aus aliphatischen und (hetero)-aromatischen Aldehyden konnten nun analog zu sogenannten Acyloinen verknüpft werden. Auch die Synthese von chiralen Produkten wurde durch Verwendung von Thiazoliumsalzen möglich. Sheehan et. al gelang 1966 die erste asymmetrische Benzoinkondensation mit N-(2-Phenyl-2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumbromid. Es wurden nur niedrige ee-Werten von maximal 22% erzielt [52]. Durch Einsatz von stetig verbesserten chiralen Katalysatorsalzen synthetisierten Enders et al. 2002 aromatische Benzoine mit ee = 80-95% nach Rekristallisation [53]. Speziell funktionalisierte Hydroxyketone wie 5-Hydroxy-4-oxo-5-phenylpentansäurederivate sind zwar in guten Ausbeuten, aber ohne asymmetrische Induktion durch Reduktion mit "Fischer"-Carbenen zugänglich. Durch "Ein-Elektron-Reduktion" mit Chromphenylcarben und Samariumiodid in THF wird Ethyl 5-methoxy-4-oxo-5-phenylpentanoat in einer Ausbeute von 75% erhalten [54]. (CO)5Cr=(Ph)OMe O OEt Ethyl acrylat Abbildung 9 OMe SmI2, Methanol THF, -78 °C O OEt Ausbeute 75% O Ethyl 5-methoxy-4-oxo-5-phenylpentanoat Ein-Elektronen-Reduktion mit Chromphenylcarben und Samariumiodid zu 5-Hydroxy-4-oxo5-phenylpentansäurederivaten nach Kohei Fuchibe [54]. Enzymatische Synthese Auf dem enzymatischen Weg sind chirale α-Hydroxyketone inzwischen mit einer Vielzahl von Enzymen unter Ausnutzung unterschiedlichster Mechanismen zugänglich. Beispielweise können sie durch enantioselektive Oxidation von cis-1,2-Diolen oder durch kinetische Racematspaltung von α-Hydroxyketonen durch R-selektive Reduktion (ee = 99%) 14 2. Allgemeiner Teil mit dem Biokatalysator Glyceroldehydrogenase erhalten werden [55]. Auch Adam et al. verwendeten das Prinzip der enzymatischen Racematspaltung durch enantioselektive Acylierung oder selektive Hydrolyse von racemischen α-Hydroxyketonen mit Lipasen (ee = 66-69%) [56]. Ein breitgefächertes Produktspektrum an α-Hydroxyketonen wird durch den Einsatz von ThDP-abhängigen Enzymen erreicht. Hierbei reagieren zur Synthese von α-Hydroxyketonen formal zwei Aldehyde miteinander unter Bildung eines neuen Stereozentrums. Die enzymatische Benzoinkondensation mit dem Enzym Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens wurde unter Zusatz des Lösungsvermittlers DMSO mit ee > 99% und einer Ausbeute von 70% von Demir et.al. veröffentlicht [57]. Werden durch C-CKnüpfungen unterschiedliche Aldehyde miteinander verknüpft, zum Beispiel aliphatische und aromatische Aldehyde, können, je nachdem welcher Aldehyd als Donor und welcher als Akzeptor fungiert, zwei zueinander tautomere Produkte entstehen [58]. Es sind beispielsweise Enzyme bekannt, welche die Substrate Acetaldehyd und Benzaldehyd (10) jeweils regioselektiv zu (R)-1-Hydroxy-1-phenylpropan-2-on (PAC, 11) oder zu dem Tautomer (R)2-Hydroxy-1-phenylpropan-1-on (HPP, 12) umsetzen (Abbildung 10). OH CH3 O PDC O H 10 Abbildung 10 H3 C H Acetaldehyd (R)-1-Hydroxy-2-phenylpropan-2-on [(R)-PAC, 11] O O CH3 BAL OH (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropan-1-on [(R)-HPP, 12] Bildung der tautomeren α-Hydroxyketone (R)-PAC (11) und (R)-HPP (12) aus Benzyladehyd (10) und Acetaldehyd durch Kondensation mit den Enzymen Pyruvatdecarboxylase (PDC) und Benzaldehydlyase (BAL). Das Enzym Benzaldehydlyase (BAL) katalysiert die Umsetzung von 10 mit Acetaldehyd zu 12 mit Ausbeuten von 95% und ee > 99% [59]. Die Bildung von 11 wurde erstmals bei der Umsetzung von Benzaldehyd (10) und Pyruvat mit Saccharomyces cerevisiae als Biokatalysator beobachtet. Hierbei wird Pyruvat zu Acetaldehyd decarboxyliert und umgepolt. Bereits 1921 wiesen Neuberg und Hirsch die Bildung von (R)-PAC (11) nach [60]. Aus dieser Entdeckung ging 1932 die erste kommerzielle Ganzzellbiotransformation hervor: Hildebrandt und Klavehn ließen sich die Produktion von 11 mit Saccharomyces cerevisiae, Glucose und Benzaldehyd (10) patentieren. 11 dient seitdem als Ausgangsstoff für die Synthese von L-Ephedrin. Die zweistufige Synthese wurde von der Knoll AG, Ludwigshafen, 2. Allgemeiner Teil 15 etabliert [61] (Abbildung 11). O H Hefe HO O Abbildung 11 CH3NH2 O -CO2 Pyruvat 10 OH OH O 11 H2, Pt NHCH3 L-Ephedrin Darstellung von (R)-PAC mittels Hefe und Folgechemie zum L-Ephedrin. 1956 wurde die Bildung von 11 als Nebenprodukt eines isolierten Hefeenzyms, der Pyruvatdecarboxylase (PDC), beobachtet [62], jedoch konnten auch spätere Arbeiten mit isoliertem Enzym keine befriedigenden Ausbeuten an 11 erzielen. Hauptgrund schienen die Enzyminaktivierung durch entstandenes Acetaldehyd nach Decarboxylierung zu sein, welches das natürliche Produkt darstellt, sowie Instabilität bei Raumtempratur [63]. Ein vielversprechendes Enzym zur Synthese von (R)-PAC (11) stellt die Acetolactatsynthase (AHAS) dar. Pyruvat wird nach Decarboxylierung mit Umsatzraten > 99% an ein breites Spektrum aliphatischer, aromatischer und heteroaromatischer Aldehyde addiert [64]. Das PAC-Derivat 5-Hydroxy-4-oxo-5-phenylpentansäure (13) wurde 1974 von Wetzel et al. aus einem Pilz, zu der Tubercularia-Spezies Z1497 gehörig, isoliert. Die Substanz zeigt optische Aktivität, sowie in Tierversuchen mit Ratten analgetische Wirkung, die Aspirin gleich kommt [65]. 13 könnte durch Kondensation von α-Ketoglutarat (3) nach Decarboxylierung mit Benzaldehyd (10) entstehen. OH * CO2O 13 Abbildung 12 PAC-Derivat 5-Hydroxy-4-oxo-5-phenylpentansäure (13) aus Tubercularia-Spezies Z1497 [65]. Bislang ist noch kein ThDP Enzym bekannt, das α-Ketoglutarat (3) als Donor an Aldehyde zu addieren vermag und Derivate von 13 generiert. Die natürliche Reaktion von dem Enzym MenD, in der 3 als Donor fungiert, legt den Verdacht nahe, dass die Bildung von αHydroxyketonen auch mit dem ThDP-abhängigen Enzym MenD möglich ist. Dahingehende Untersuchungen sind Teil dieser Arbeit. 16 2. Allgemeiner Teil 1,4-Dicarbonylverbindungen Chirale, substituierte 1,4-Dicarbonylverbindungen stellen sowohl vielversprechende Substrate in der Naturstoffsynthese [66] als auch interessante Ausgangsstoffe zur Synthese von Heterocyclen wie substituierte Furane und Pyrrole dar [67]. Als chirale Verbindungen sind sie darüberhinaus als Bausteine in der Synthese von bioaktiven Substanzen von grossem Interesse [68]. Chemische Synthese von γ-Ketocarbonsäureestern mittels nickelkatalysierter Monoalkylierung von cyclischen Anhydriden Durch nickelkatalysierte Monoalkylierung von cyclischen Anhydriden entstehen chirale γKetocarbonsäurederivate, die Anwendung als chirale Auxiliare finden könnten [69]. H O O H Ethyl-Zn-(CH2)2CO2Et H O Ni(COD)2 Styren CO2Et THF, 0 °C O H 77% Ausbeute cis-1,2-Cyclohexadicarbonsäureanhydrid Abbildung 13 CO2H Beispiel für die Monoalkylierung von cyclischem Anhydrid mit Zinkreagenz [69]. Chemische Synthese - Asymmetrische Stetter-Reaktion Die Stetter-Reaktion beschreibt die 1,4-Addition von Aldehyden an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen [70]. Sie ermöglicht die Synthese von 1,4-Diketonen, γ-Ketocarbonsäuren und γ-Ketocarbonitrilen aus einem Aldehyd und einer α,β-ungesättigten Verbindung mittels Cyanid-Ion- oder Thiazolium-Salz-Katalyse [71]. Dabei verläuft sie ähnlich der Benzoinkondensation, ist jedoch irreversibel. Nach Christmann et al. begrenzten die schlechten Enantioselektivitäten der chemisch durchgeführten Stetterreaktion bislang den Einsatz dieser interessanten Reaktion und nur wenige Beispiele finden sich in der Literatur [68]: Trost publizierte 1979 den Einsatz einer intramolekularen Stetterreaktion in der Naturstoffsynthese des antibiotisch und antitumoral wirkenden Sesquiterpenlactons Hirsutsäure [66]. In der Naturstoffsynthese von Roseophilin zeigte Harrington und Tius die Durchführbarkeit einer diastereoselektiven, intermolekularen Stetterreaktion unter Einsatz des Katalysators 3-Benzyl-5-(hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid. Das erhaltene 1,4Diketon diente dabei als Vorläufer für die zentrale Pyrroleinheit des Roseophilins [72]. Die enantioselektive intermolekulare Stetter-Reaktion [73] stellte für den Synthetiker jedoch lange Zeit eine große Herausforderung dar. Um die Enantioselektivität der intermolekularen 2. Allgemeiner Teil 17 Reaktion zu verbessern wurden verschiedene chirale Katalysatoren entwickelt [68, 74], die jedoch nur zu mäßigen Erfolgen führten, was Ausbeute und Enantioselektivität betraf (Enders et al 2004: Ausbeute 4%, ee = 39% [75]). Erklärt wurden die schlechten Ergebnisse mit der Entstehung von stabilen Additionsprodukten aus Thiazoliumsalz und Substrat [76]. 2008 gelangen Enders et al. durch Einsatz eines neuen, ebenfalls von Thiazoliumsalzen abgeleiteten Katalysators Ausbeuten zwischen (49-98%) and moderate bis gute Enantiomerenüberschüsse (56-78% ee), die durch Rekristallisation noch zu sehr guten Werten zwischen 90-99% ee gesteigert werden konnten. Die Kondensation zwischen Benzaldehyd (10) und (E)-Chalkon ist in Abbildung 14 gezeigt [77]. 10 mol% N N Ph H + Ph Benzaldehyd (10) Abbildung 14 Ph THF, 0 °C, 6 h BF4 N O O 10 mol% Cs2CO3 OTBDPS Ph (E)-Chalkon 65% 40% nach Rekrist. O Ph Ph * Ph O ee = 66% ee > 99% nach Rekrist. Asymmetrische Stetter Synthese mit chemischen Katalysatoren (Enders, 2008 [77]). Enzymatische Synthese Die stereoselektive Addition eines Donors in 1,4-Position einer ungesättigten Carbonsäure oder Carbonylverbindung und Bildung von 1,4-Diketoverbindungen würde in einem Reaktionschritt bis zu zwei neue Stereozentren aufbauen (Abbildung 7). Es ist bisher nur ein Fall bekannt, in welchem ungesättigte Carbonylfunktionen als Akzeptorsubstrate in einer Michael-artigen Addition unter Enzymkatalyse reagieren. PigD, ein Enzym aus dem Biosyntheseweg von Prodigiosin, katalysiert stereo- und regioselektiv die ThDP-abhängige 1,4-Addition von Pyruvat nach Decarboxylierung an verschiedene α,β-ungesättigte Ketone. Das natürliche Substrat des Enzymes ist vermutlich der von (E)-Oct-2-enal abgeleitete Thioester [78]. Eine enzymkatalysierte Addition in 1,4-Position an ungesättigte Carbonsäuren und die Bildung von asymmetrischen γ-Ketocarbonsäuren ist bisher nur für das Enzym MenD gezeigt [13, 79] und wird im Rahmen dieser Arbeit untersucht. 18 2. Allgemeiner Teil 2.7. MenD Mechanismus Bereits 1985 publizierten Bentley et al. [15] einen Mechanismus von MenD der bis heute Gültigkeit hat, abgesehen von der Tatsache, dass MenD nur den Schritt zum Intermediat SEPHCHC (4) katalysiert und für die Eliminierung von Pyruvat ein zweites Enzym, MenH, zuständig ist. Die Enzymkatalyse beginnt klassisch mit der Decarboxylierung der α-Ketosäure α-Ketoglutarat (3). Die Carbonylfunktion wird umgepolt und erhält dadurch nukleophilen Charakter. Das formal entstehende Succinylsemialdehyd kann vom Enzym nicht freigesetzt werden, ein Proton agiert hier nicht als Akzeptor [13]. Das Thiaminaddukt reagiert mit dem Akzeptor Isochorismat (2) und es kommt zu einer stereoselektiven C-C-Bindungsknüpfung in β-Position zur Säurefunktion. Der Katalysator ThDP wird regeneriert und das Produkt 4 entsteht. O R'' N H H S - R' O2 C O H O2C CO2OH O SEPHCHC (4) Abbildung 15 +H CO2 - R' S R'' N O2 C O O ThDP Ketoglutarat (3) R' HO +H N O ThDP - R'' O - S N R'' O2 C OH O CO2 O R'' O- N HO CO2 - O 2C O OH S OH O R' S R' Enamin "Aktiver Aldehyd" O CO2 Isochorismat (2) Mechanismus von MenD unter Berücksichtigung der Rolle des Cofaktors ThDP [13, 15, 18]. Sequenz Das menD-Gen kommt nur in einem Viertel der bekannten Genome von Bakterien vor [13]. Aufgrund der sauerstoffarmen Uratmosphäre würde man unter diesen Urlebewesen eine weitaus größere Verbreitung von MenD annehmen. Für die relativ geringe Verbreitung könnte es zwei Ursachen geben. Zum einen sind durch den neu entdeckten "zweiten Weg" über 1,4-Dihydroxy-6-naphthoat, Menachinone auch ohne MenD-Katalyse zugänglich. Aerobe Bakterien weichen außerdem oftmals auf Ubichinone als System für den Elektronentransport in der Atmungskette aus. Neben dem Nachweis in Pflanzen (Oryza sativa, Arabidopsis thaliana) kommt MenD T T hauptsächlich in Actinomyceten, Cyanobakterein, Bacillusarten und den Gammaproteobakterien vor, zu denen unter anderen auch E. coli zählt. Die Sequenzidentitäten von MenD 2. Allgemeiner Teil 19 aus E. coli zu MenD Proteinen aus Prokaryonten reichen von 99% (Shigella boydii) [80] bis zu Identitäten von nur 20-30% [79], wie zum Beispiel 29% für MenD aus Staphylococcus aureus [80]. Als konservierte Region bei thiaminabhängigen Enzymen gilt die Thiaminbindestelle. Nach Hawkins et al. [81] beginnt die Sequenz mit einer hochkonservierten GDG Abfolge, nach etwa zehn Positionen folgt eine negativ geladene Aminosäure wie Glutamat (E) oder Aspartat (D), fünf Positionen weiter Alanin (A) und elf Aminosäuren weiter ein Prolin (P). Das Ende der Bindungsstelle wird durch zwei Asparagine (NN) eingeleitet, welchen hydrophobe Aminosäuren folgen. MenD stimmt mit dieser postulierten Leitstruktur in groben Zügen überein, wobei der signifikante und für alle MenD Proteine konservierte Unterschied darin besteht, dass die Abfolge mit GDL beginnt. Ausserhalb der ThDP-Bindestelle gibt es nur wenige konservierte Bereiche. Die wichtigste ist das Glutamat E55 (Nummerierung der Aminosäuren nach MenD aus E. coli), welches eingebettet zwischen Asparat und Arginin vorliegt. Diese so genannte "DER" Stelle (AS 54-56) (Anhang 7.3) kann auch als Charakteristikum für MenD Proteine gelten. Deletionen an E55 führen zu Aktivitätsverlust [13]. Es wird postuliert, dass Glutamat über eine Wasserstoffbrücke eine Wechselwirkung zum N1' des ThDP ausbildet. Die dem konservierten Glutamin Q118 von Bhasin et al. zugeschriebene Rolle bei der Bindung von Isochorismat (2) [13], konnte von der Gruppe Dawson et al.durch Kristallisation von MenD und anschliessendem Substratmodelling nicht bestätigt werden [79]. 2.8. Aufgabenstellung In der hier vorliegenden Arbeit sollen fermentativ mit E. coli Stämmen die Metaboliten Chorismat (1) und SHCHC (5) zugänglich gemacht und Derivatisierungen durchgeführt werden, um die chiralen Metabolite als neue Bausteine der Synthese zur Verfügung zu stellen. Dazu werden verschiedene rekombinante Stämme von Prof. Georg A. Sprenger in Stuttgart zur Verfügung gestellt. Neben in vivo Versuchen zur Produktgewinnung soll die Reaktionskaskade von 1 zu Isochorismat (2) mit dem Enzym EntC und die thiamindiphosphatabhängige Reaktion von 2 zu SHCHC (5) bzw SEPHCHC (4) in vitro mit den isolierten und aufgereinigten Enzymen nachvollzogen werden. Das Enzym MenD soll hinsichtlich seines Potentials für C-C-Knüpfungsreaktionen mit α-Ketocarbonsäuren als Donoren und verschiedenen Aldehyden als Akzeptoren untersucht werden. Der natürliche Reaktionsmechanismus, eine Stetter-ähnliche Addition von nach Decarboxylierung umgepolten Aldehyden an die ungesättigte Carbonsäure Isochorismat, könnte enantioselektive, intermolekulare Stetterreaktionen mit unphysiologischen Substraten ermöglichen. 20 2. Allgemeiner Teil 3. Spezieller Teil 3. 21 Spezieller Teil 3.1. Molekularbiologische Arbeiten Ausgangsmaterial für die Arbeit waren die plasmidal vorliegenden Gene entC und menD aus E. coli K12. Das den Genabschnitt entC kodierende Plasmid pDF2 wurde von Dirk Franke, Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich, erhalten [82], das entC und menD kodierende Plasmid pC120 wurde freundlicher Weise von Prof. Georg Sprenger, Universität Stuttgart, zur Verfügung gestellt und ging aus den Arbeiten von Stefan Kozak hervor. Beide Gene wurden nach Standardmethoden in Expressionsvektoren kloniert und danach homolog in E. coli-Zellen exprimiert, wodurch die Bildung von Inclusionbodies vermieden werden konnte. 3.1.1. Klonierung von entC Um das Enzym als Biokatalysator für in vitro Umsetzungen in reiner Form einsetzen zu können, wurde das Gen entC durch Umklonierung an einen His-tag fusioniert. Das dazu eingesetzte Plasmid pDF2 resultierte aus Klonierung des Genes entC (1177 bps) in das Plasmid pJF119EH1 [83]. Mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde die DNA, die dem Protein EntC aus E.coli K12 entspricht, vervielfältigt. Zur Einführung eines 6 x His-tag am C-terminus wurde das Gen in die Multi-Cloning Site eines pET22b(+) Vektors (Abbildung 16) insertiert. NdeI Xho I T7 Histag f1 5000 lacI 1000 pET22b(+) 4000 Amp 5493 bps 2000 3000 ori Abbildung 16 pET22b(+)-Vektor von Novagen. 22 3. Spezieller Teil Durch die dabei verwendeten Primer entC_forward und entC_reverse wurde außerdem am 5`Ende eine NdeI, sowie am 3`-Ende eine XhoI Restriktionsschnittstelle generiert, da der Vektor pET22b(+) in seiner Multi Cloning Site diese Schnittstellen enthält. Sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt wurden mit den beiden Restriktionsenzymen verdaut, mit Agarosegelelektrophorese gereinigt und im Anschluss mit T4 DNA-Ligase zu dem Plasmid entC_C-term ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde in E. coli DH5α-Zellen transformiert und einzelne Kolonien auf Insertion untersucht, indem nach Isolierung der DNA aus den Transformanten zur Kontrolle eine Restriktionsanalyse durchgeführt wurde (Abbildung 17). Als Anhaltspunkt zur Größenbestimmung wurde ein Marker (1 kb, PEQLAB) in Gelspur 4 herangezogen. Das insertierte Gen entC wurde zum einen durch einfachen Verdau mit NdeI linearisiert (6540 bps, Gelspur 1), zum anderen wird mit NdeI und XhoI doppelt geschnitten, so dass der pET22b(+)-Vektor (5363 bps) und das entC-Insert (1177 bps) in Gelspur 2 sichtbar sind. Der leere, geschnittene Vektor wurde in Gelspur 3 zur Kontrolle aufgetragen. Damit war die Insertion des Genabschnitts entC in den pET22b(+)-Vektor qualitativ nachgewiesen. Nde I 10 kb 8 kb 6 kb 5 kb 4 kb 3.5 kb 3 kb T7 entC Xho I 6000 lacI 2 kb His-Tag 1000 2.5 kb 5000 entC_C-term f1 6540 bps 2000 1.5 kb 4000 3000 1 kb 1 2 3 Amp ori 4 Abbildung 17 Agarosegel Restriktionsanalyse der Abbildung 18 Rekombinantes Plasmid entC_C-term. Klonierung von entC. 1: einfach geschnittener Vektor mit NdeI (6540 bps). 2: doppelt geschnittener Vektor (NdeI und XhoI, Vektor mit 5363 bps und Insert mit 1177 bps). 3: Kontrolle, Vektor pET22b(+) geschnitten mit NdeI und XhoI. Die "in-frame" Klonierung (Insertion unter Beibehalt des korrekten Leserahmens) wurde durch vollständige Sequenzierung mit T7 Primern bestätigt (4BASELAB). Die erhaltene 3. Spezieller Teil 23 Nukleotid-Sequenz ist im Anhang abgebildet. Das rekombinante Plasmid entC_C-term (Abbildung 18) wurde in E. coli DH5α Zellen zur Vektorproduktion transformiert. Nach Zellaufschluss und Reinigung der Plasmid-DNA steht der rekombinate Vektor entC_C-term zur Expression des Proteins EntC in verschiedenen Expressionszelllinien zur Verfügung. 3.1.2. Expression und Reinigung von EntC Das Plasmid entC_C-term wurde in E. coli BL21(DE3)pLysS und E. coli BL21(DE3) Zellen zur Expression des Fusionsproteins mit 6 x His-tag transformiert. Nach Animpfen mit Vorkultur wurden diese Expressionszellen in LB-Medium (100 µg/mL Ampicillin) bei 37 °C und 120 Upm im Schüttelkolben (2 x 800 mL) inkubiert und bei OD600 = 0.6 nach IPTGB B Zugabe (0.4 mM Endkonzentration) bei 20 °C über Nacht für 12 h exprimiert. Nach Zellaufschluss wurde EntC über Nickel-NTA unter Verwendung von "Gravity-flow"-Säulen oder für größere Volumina ab 20 mL Lysat mit ÄKTAprimeTMplus (5.3.4) aufgereinigt. Die P P Proteindetektion erfolgte im Falle der Verwendung der "Gravity-flow"-Säulen mittels Bradfordreagenz, bei Verwendung der ÄKTAprimeTMplus mittels UV-Detektion bei einer P P Wellenlänge von 254 nm. Die Bindung von EntC an Nickel-NTA ist relativ schwach. Deswegen wurde zum Auftragen ein imidazolfreier Puffer gewählt, gewaschen wurde mit einem Puffer der 10 mM Imidazol enthält und schließlich mit 250 mM Imidazol im Puffer eluiert. 170 kDa 130 kDa 100 kDa 100 kDa 70 kDA 55 kDa EntC 45 kDa 35 kDa EntC EntC 25 kDa Marker Marker Abbildung 19 Lysat+Pellet Lysat+Pellet Lysat Waschfraktion . Elution SDS-PAGE: Links: Überexpression des Proteins EntC (42 kDa) im Zellaufschluss (Pellet und Lysat); Protein-Marker High range (PEQLAB). Rechts: Aufreinigung EntC aus Lysat über Nickel-NTA. 24 3. Spezieller Teil Die höchsten Expressionsraten mit E. coli BL21(DE3) beliefen sich aus 2 g Zellen einer Schüttelkolben-Expression von 500 mL auf durchschnittlich 2-5 mg hochangereichertes EntC (Abbildung 19). 3.1.3. Klonierung von menD menD wurde sowohl mit C-terminalen 6 x His-tag, als auch mit 10 x His-tag am N-terminalen Ende kloniert. Ein His-tag am jeweiligen Ende der Aminosäuresequenz könnte sowohl die Protein-Expression, die Stabilität oder die Aktivität beeinflussen [84]. Es wird außerdem diskutiert, dass sich ThDP-abhängige Enzyme mit N-terminalem His-tag besser kristallisieren lassen [85]. Diese Hypothese konnte für das Enzym MenD nicht bestätigt werden (3.5.2). Jedoch standen somit mit zwei verschiedenen N-terminal His-tag tragenden Konstrukten und einem C-terminal His-tag tragenden letzendlich drei unterschiedliche Konstrukte zur Verfügung, die für Biokatalyse- und Kristallisationsexperimente genutzt werden konnten. MenD mit C-terminalen 6 x His-tag Der menD-kodierende Abschnitt des Vektors pC120 wurde mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Durch die dabei verwendeten Primer (menD_forward, menD_reverse) wurden außerdem am 5`-Ende eine NdeI, sowie am 3`-Ende eine XhoI Restriktionsschnittstelle generiert, die ebenfalls in der Multi Cloning Site des Vektors pET22b(+) enthalten sind. Sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt wurden mit den beiden Restriktionsenzymen verdaut und nach Reinigung mittel Agaorsegelelektrophorese mit T4 DNA-Ligase zu dem Plasmid menD_C-term ligiert. Das Plasmid wird in DH5α-Zellen transformiert und einzelne Kolonien auf Insertion untersucht. Durch positive Restriktionskontrolle und vollständige Sequenzierung (4BASELAB) bestätigt, wurde analog zu entC_C-term das rekombinante Plasmid menD_C-term erhalten (Abbildung 20). MenD ist damit als Fusionsprotein mit C-terminal 6 x His-tag zugänglich. 3. Spezieller Teil 25 NdeI T7 menD 7000 lacI 1000 6000 menD_C-term 7038 bps 5000 4000 ori Abbildung 20 Xho I Histag 2000 3000 Amp Rekombinantes Plasmid menD_C-term. MenD mit N-terminalen 10 x His-tag Um einen 10 x His-tag am N-terminalen Ende einzuführen, wurde der Vektor pET19b verwendet. Die analog erhaltenen PCR-Produkte aus der Klonierung des C-terminalen menDs werden mit dem Vektor mittels T4 DNA-Ligase legiert und das Plasmid menD_N-term_1 erhalten. Zur Kontrolle wurden eine Restriktionsanalyse und eine vollständige Sequenzierung durchgeführt. NdeI Nde I Xho I T7 T7 Histaq M enD 7000 lacI 1000 Amp 5000 lacI Xho I 6000 1000 menD_N-term_1 pET19b 2000 7382 bps 5717 bps Stop 5000 4000 2000 3000 4000 3000 Amp ori ori Abbildung 21 Vektor pET19b von Novagen. Abbildung 22 Rekombinanter Vektor menD_Nterm_1. 26 3. Spezieller Teil MenD mit N-terminalen His-tag und verkürztem C-terminus menD_N-term_1 enthält zusätzliche, nicht zu menD gehörende 22 Aminosäuren, die durch die Beschaffenheit des Vektors an das zu exprimierende Protein fusioniert wurden. Um das Ablesen dieser unnötigen Aminosäuren von der XhoI-Schnittstelle bis zum Stopcodon des pET19b–Vektors zu vermeiden, wurde ein zusätzliches Stopcodon direkt am C-terminus eingeführt. Dabei standen zwei Strategien zur Auswahl. Entweder kann das Stopcodon am C-terminus durch die für die Amplifikation durch PCR benötigten Primer direkt am Genabschnitt von menD eingefügt werden und danach in den pET19b-Vektor insertiert werden. Oder aber es wird als gerichtete Mutation durch Quickchange PCR mittels geeigneter Primer nachträglich in das bereits erhaltene Konstrukt menD_N_term_1 eingefügt [86]. Stopcodon durch PCR des Genabschnitts menD Für die erste Variante wurde ein Primer menD_reverseSTOP konstruiert, der unmittelbar vor der XhoI Schnittstelle ein Stopcodon trug und dieses an das menD-Fragment generiert. Während die Amplifikation problemlos lief, stellte sich die Ligation des menD-Fragments mit Stopcodon am C-terminus als problematisch heraus und ließ sich nach Standardherstellerangaben (Vektor/Insertverhältnis 1:1 bis 1:10) nicht bewerkstelligen. Die DNA Konzentration für die Ligation wurde mittels UV-Meter bestimmt und dann wie folgt variiert. 5 ng Vektor wurden kombiniert mit 60, 90 und 120 ng Insert sowie 10 ng Vektor mit 90 ng Insert. Das entspricht einem auf die Masse bezogenen ungefähren Vektor- zu Insertverhältnis von 1:30, 1:40, 1:60 und 1:80. Nach Transformation in E. coli TG1-Zellen wurden 2 Kolonien aus Ansatz 1:60 und eine Kolonie aus dem Ansatz 1:80 durch Restriktionskontrolle positiv getestet und somit der Vektor menD_N-term_2 erhalten (Abbildung 23). Anschließend wurde der rekombinante Vektor in E. coli TG1-Zellen amplifiziert. Auf diese Weise ist MenD als Fusionsprotein mit N-terminal 10 x His-tag zugänglich. Dies wurde ebenfalls durch vollständige Sequenzierung bestätigt (4BASELAB). 3. Spezieller Teil 27 NdeI T7 menD 7000 lacI 1000 Xho I 6000 menD_N-term_2 Stop 2000 7385 bps 5000 3000 4000 Amp ori Abbildung 23 Rekombinanter Vektor menD_N-term_2. Einführung des Stopcodons mittels Quickchange-PCR Für die nachträgliche Insertion des Stopcodons mittels Quickchange-PCR wird das Konstrukt menD_N-term_1 herangezogen. Es wurden spezielle Primer, menD_N_qc_f und menD_N_qc_rev konstruiert, die sich im Gegensatz zu den Primern für Standard-PCR durch eine deutlich höhere Annealingtemperatur und eine Länge von ca 30 bps auszeichnen. Die amplifizierte DNA ist nicht methyliert, wohingegen die Templat-DNA methylierte Basenpaare enthält. Nach der Durchführung der PCR kann deshalb die Templat-DNA (isoliert aus E. coli), der Vektor menD_N-term_1 durch das Enzym DpnI verdaut werden, da es selektiv methylierte Basenpaare spaltet. Der rekombinante Vektor wurde in TG1-Zellen amplifiziert und somit ist das gleiche Konstrukt, menD_N-term_2 erhalten worden (Abbildung 23). Das Konstrukt wurde durch Restriktionskontrolle bestätigt und von 4BASELAB sequenziert. Aufgrund von Punktmutationen, wurde das Konstrukt jedoch nicht zur Expression verwendet. Expression der MenD-Konstrukte Zur Expression der Konstrukte wurden die rekombinant erhaltenen Plasmide in E. coli BL21(DE3)pLysS- und BL21(DE3)-Zellen transformiert. Diese Zellen wurden in LB-Medium (100 µg/mL Ampicillin) bei 37 °C und 120 Upm im Schüttelkolben (2 x 800 mL) inkubiert und nach IPTG-Zugabe (0.4 mM Endkonzentration) bei 20 °C über Nacht für 12 h exprimiert. Steigerung der IPTG-Konzentration auf bis zu 1.5 mM brachte keine Steigerung der Expressionsrate. Die Lage des His-tags brachte keine signifikante Änderung der Expressionsrate - für alle drei Konstrukte konnten hohe Überexpressionen für MenD erzielt werden, etwas höher lag die Expression stets für die N-terminalen Varianten. Ab IPTG 28 3. Spezieller Teil Zugabe (0 h) wurden in einem Zeitraum von 6 h stündlich sowie nach abgeschlossener Übernachtexpression 200 µL Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen und zentrifugiert. Im aufgetragenen Lysat lässt sich bereits nach 1 h eine Überexpression von MenD im Gel als Bande bei etwa 65 kDa erkennen. Nach der Übernachtexpression ist schließlich bei allen eine deutliche Überexpression des Proteins MenD erkennbar (Abbildung 24). Abbildung 24 Expressionsscreen der drei klonierten rekombinanten MenD-Konstrukte: (1) MenD mit Nterminalem His-tag ohne nachträglich eingefügtes Stopcodon, menD_N-term_1; (2) MenD mit C-terminalem His-tag, menD_C-term; (3) MenD mit N-terminalem His-tag und nachträglich mittels PCR eingefügtem Stopcodon, menD_N-term_2. 3.1.4. Aufreinigung von MenD Nach der Expression wurden die nach Zentrifugation erhaltenen Zellen in Phosphatpuffer (pH 8), der die Kofaktoren ThDP und Mg2+ enthielt, mittels Ultraschall aufgeschlossen. Das P P Lysat mit MenD als löslichem Protein wurde über "Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie" (IMAC) nach Porath et al. [87] gereinigt. Für den analytischen Maßstab bis 20 mL Lysat wurde manuell mit maximal 2 mL Nickel-NTA enthaltenden "Gravity-flow" Säulen gearbeitet. Für grosse Mengen und zur Etablierung eines geeigneten Imidazolgradienten wurden die ÄKTAprimeTMplus P P eingesetzt. Es wurde eine Gradientenelution mit aufsteigender Imidazolkonzentration von 20 mM bis 300 mM in KPiB B Puffer über 200 Minuten durchgeführt (5.3.4). MenD wird relativ fest gebunden und eluiert erst ab einer Imidazolkonzentration von 150 mM. Daraus wurde eine Stufenelution entwickelt. Nach dem Auftragen der Proteinlösung mit 20 mM Imidazol wird der 3. Spezieller Teil 29 unspezifischen Bindung von Zellproteinen vorab vorgebeugt. Bis zum Erreichen einer Nullinie (UV-Absorption bei 254 nm) wird mit 50 mM Imidazol gewaschen. Das Protein lässt sich mit 300 mM Imidazollösung schließlich in reiner Form von der Säule eluieren. Diese Methode wurde für kleinere Mengen (400 mL Kultur, 20 mL Lysat) wegen der einfacheren Handhabung auf die "Gravity-flow" Säulen übertragen. Die aktuelle Proteinkonzentration in den einzelnen Fraktionen wurde hier qualitativ durch Tüpfeln mit Bradfordreagenz in 96 well Platten verfolgt (Abbildung 25). Abbildung 25 Moitoring der Proteinkonzentrationen während der einzelnen Aufreinigungsschritte. Höchste Proteinkonzentration ist in der ersten und zweiten Elutionsfraktion zu sehen (von links nach rechts). Die einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE getrennt. Die hohe Reinheit des Enzymes MenD in den Elutionsfraktionen ist deutlich erkennbar (Abbildung 26). 170 kDa 130 kDa 100 kDa 70 kDA 55 kDa 45 kDa 35 kDa 25 kDa 15kDa M Lysat Abbildung 26 W1 W3 W5 Elu1 Elu2 Elu3 Elu4 Elu5 Elu6 SDS-Page von einzelnen Fraktionen einer Reinigung von MenD-N-term_2. Aufgetragen sind der Marker (M), das Lysat vor der Aufreinigung, 3 Waschfraktioinen (W1, W3, W5) und 6 Elutionsfraktionen (Elu 1-6). Die höchsten Expressionsraten von 35-70 mg MenD (MenD_N-term_1) pro Liter gelangen in E. coli BL21(DE3) Zellen. Das gereingte Enzym kann im Kühlschrank bis zu 4 Wochen ohne 30 3. Spezieller Teil signifikanten Aktivitätsverlust in Entsalzungspuffer gelagert werden. 3.2. Analyseverfahren zur Identifizierung der Metabolite RP-HPLC Zur Detektion der Metabolite Chorismat (1), Isochorismat (2) und SHCHC (5) sind Analyseverfahren sinnvoll, welche die UV-Absorption der Substanzen ausnutzen, sowie gleichzeitig der hohen Polarität der Substanzen Rechnung tragen. Der HPLC-Assay von D. Franke [82] wurde speziell für einen den zu detektierenden Substanzen ähnlichen Stoff, 2,3-CHD (7), entwickelt. Auf diesem Assay bassierend wurde die HPLC-Analytik aufgebaut. Es wurde eine RP8-Phase als stationäre Phase, und ein Gradient aus Wasser, versetzt mit 0.1% Trifluoressigsäure, und Methanol als mobile Phase verwendet. Detektiert wird mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) bei den Wellenlängen 230, 275, 290 nm. Bei 275 nm werden die konjugierten Diene von 1 und 2 selektiv erfasst, 290 nm ist als Maximum für 5 charakteristisch. Die wichtigsten Metabolite und deren Abbauprodukte konnten mit diesem System nachgewiesen und differenziert werden (Tabelle 3). Substanz UV-Max [nm] Retentionszeiten [min] Chorismat (1) 273 21.5 Isochorismat (2) 278 19.0 3-Hydroxybenzoat 298; 237 22.1 4-Hydroxybenzoat 255 20.1 2,3,-Dihydroxybenzoat 238 23.2 3,4,-Dihydroxybenzoat 255; 295 16.5 Benzoat 275 27.8 Na-Phenylpyruvat 230 32.4 Phenol 270 20.6 Salicylsäure 230 29.4 SHCHC (5) 205; 289 15.1 OSB (6) 202; 235 23.1 232 27.4 3-Benzoylpropionsäure (14) Tabelle 3 Retentionszeiten und UV-Maxima der Metabolite und Nebenprodukte. Bei ähnlichen Retentionszeiten kann zusätzlich jeweils das DAD-Spektrum im Bereich von λ = 190-400 nm zur Identifizierung herangezogen werden (Abbildung 27). 3. Spezieller Teil mAU 31 Maximum 1 (202 nm) 1000 O - 800 600 O 2C 6 Maximum 2 (235 nm) 400 CO2- 200 0 200 Abbildung 27 225 250 275 300 325 350 375 nm DAD-Spektrum von 2-Succinylbenzoat (6) mit Maxima bei λ = 202 und 235 nm. Durch gezielte Wahl der für die fermentativ gewonnen Substanzen Chorismat (1) und SHCHC (5) charakteristischen Wellenlängen, konnten die bei Fermentationsprozessen anwesenden Proteine und organischen Säuren weitgehend ausgeblendet und die Produktbildung in situ durch RP-HPLC sehr gut verfolgt werden. Am besten eignete sich zur Bestimmung von Isochorismat (2) die Wellenläne 275 nm, für die SHCHC-(5)-Bildung während der Fermentation die Messung bei 290 nm (Abbildung 28). Bei der Wellenlänge 275 nm wurden bereits Spuren von Nebenprodukten sichtbar, die Messung bei 230 nm ist durch starke Absorption von Begleitstoffen, wie unter anderem den Abbauprodukten aus (5), OSB (6) und 3-Benzoylpropionsäure (14), für das Monitoring der Produktbildung unbrauchbar. 32 3. Spezieller Teil mAU 15.3 min 275 nm 1000 SHCHC (5) 800 600 400 200 0 0 mAU 5 10 290 nm 1400 15 20 25 30 35 min 25 30 35 min 35 min 15.3 min SHCHC (5) 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 mAU 230 nm 300 SHCHC (5) 250 OSB (6) 200 22.2 min 15.3 min 150 O - O2C 27.9 min 14 100 50 0 0 Abbildung 28 5 10 15 20 25 30 RP-HPLC-Chromatogramm von SHCHC (5) während der Fermantation bei λ = 275, 290 und 230 nm. HPLC-MS-MS Zusätzlich zu HPLC-DAD wurden Methoden zur Erkennung der Metabolite und Nebenprodukte mittels HPLC-MS-MS entwickelt. Am Beispiel Chorismat (1) werden durchgeführte MS-MS-Experimente vorgestellt. Die Ionisation von 1 mittels der Turblonspray® Quelle durch Elektronensprayionisation (ESI) gelang im negativen "Scan Modus" und wurde als "Scan Modus" für die folgenden Experimente herangezogen. Rückschlüsse auf die strukturellen Merkmale von 1 ließen der "Produkt Scan" und der "Neutral loss Scan" zu. Mit Hilfe des "Produkt Scan" konnten unter Optimierung von Fragmentierungsparametern, wie Kollisionsgas und -energie, die verschiedenen Fragmente, in die 1 zerfällt, als spezifisches Muster identifiziert werden (Abbildung 29). Anwendung des "Neutral loss Scan" zeigte Fragmente auf, welche "neutrale" Fragmente, wie Wasser oder Kohlendioxid, elliminieren. 1 elliminierte sowohl aus der Hauptmasse 225, als auch aus dem aus 1 durch Wasserverlust hervorgegangenen Fragment 207 jeweils zweifach Kohlendioxid (Abbildung 30). 3. Spezieller Teil 33 “Product Scan”, negativer Modus: [M - H+, CO2, H2O ] - [M - H+] - CO2H O CO2- OH [M - H+, CO2] - 1 [M - H+]- [M - H+, H2O]- [M - H+, 2 x CO2] - [M - H+, 2 x CO2, -H2O] - Abbildung 29 "Product Scan" von Chorismat (1). Fragmente von 1 im negativen Modus. “Neutral loss Scan” auf M = 88 elliminieren Fragmente die 2 x CO 2 (88) verlieren [M - H+, H 2O] 207 CO2H O CO 2- OH +1 [M - H ] [M - H+ ] 225 Abbildung 30 "Neutral loss Scan" von Chorismat (1). 1 und Fragment mit der Masse 207 elliminieren jeweils 2 Moleküle CO2 im negativen Modus. B B 34 3. Spezieller Teil 3.3. Mikrobielle Produktgewinnung 3.3.1. In vivo-Produktion von SHCHC und Chorismat Sowohl für die in vivo Produktion von Chorismat, als auch für die in vivo Produktion von SHCHC sollen E. coli Stämme zur Verfügung gestellt werden, die durch Stoffflussregulierung (Metabolic engineering) so verändert wurden, dass sie aus dem nachwachsenden Rohstoff Glucose die gewünschten Produkte produzieren und unter geeigneten Fermentationsbedingungen im Überstand anreichern. Diese Produkte können anschließend isoliert werden (Abbildung 31). CO2 O H OH HO HO H H H CO2 OH O Chorismat (1) H OH OH O CO2 OH O2C SHCHC (5) E.coli –Stämme, modifiziert durch ““Metabolic engineering” Glucose Abbildung 31 chirale Synthesebausteine Prinzip der Produktgewinnung mittels Fermentation mit modifizierten E. coli Stämmen. Chorismat (1) Für die fermentative Produktgewinnung im Schüttelkolben wurde durch Dr. Peter Kast, ETH Zürich, der E. coli Stamm KA12 zur Verfügung gestellt, der ursprünglich für kombinatorische Mutagenese- und Selektionsexperimente konstruiert wurde [88]. Bei diesem Stamm sind der Weg zu den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin sowie verschiedene Feedbackmechanismen deletiert, so dass sich 1 im Fermentationsüberstand anreichert. Durch Expression im Schüttelkolben in Minimalmedium [89] konnten Chorismatkonzentrationen im Bereich von 400 mg/L erreicht werden. Diese Konzentration wurde mit RP-HPLC-DAD bei 275 nm über eine Kalibriergerade mit der Reinsubstanz 1 (Gehalt >95%) bestimmt. SHCHC (5) Die Stämme zur fermentativen Gewinnung von 5 wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Sprenger, Universität Stuttgart, konstruiert und zur Verfügung gestellt. In den beiden 3. Spezieller Teil 35 Stämmen, F1 und F97, ist das Gen menC deletiert, so dass die Eliminierung von Wasser aus 5 und somit die Bildung des Produktes OSB (6) verhindert und 5 angereichert wird. Während im Stamm F1 nur menC chromosomal deletiert ist, enthält der Stamm F97 umfassendere Deletionen: Enzyme des Enterbactinweges (entA, entB, entC, entE), sowie die Enzyme zu den aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin (pheA, tyrA, aroF) sind chromosomal deletiert (Abbildung 32). CO2NH3 CO2- Tryptophan Menachinone Anthranilat Ubichinone OH 4-Hydroxybenzoat TrpE TrpD UbiC SHCHC (5) CO2- CO2 CO2 PabA O NH3 4-Aminobenzoat O O2 C MenD SEPHCHC (4) CO2 Isochorismat (2) EntB CO2 Phenylalanin Tyrosin CO2- O OH OH OH Prephenat Abbildung 32 CO2 OH Chorismat (1) TyrA/PheA - OH EntC Folsäure - 2,3-CHD (7) Chromosomale Deletionen im Stamm F97 (Sprenger, Trachtmann [90]). Die Gene entC und menD, welche die Bildung von 5 aus 1 katalysieren, wurden mit Hilfe des Plasmids pC120 (pJF119EH1-entC-menD) in diesen Stamm transformiert und der Stamm E. coli F97 erhalten. Die Expression der Gene auf diesem Plasmid ist über ein lac-Operon durch IPTG induzierbar. Die Produktion des Metaboliten 5 wurde zuerst in LB-Medium durchgeführt. Die Produktbildung wurde durch RP-HPLC-Messungen verfolgt. Während für den Stamm F1 keine Produktion von 5 nachgewiesen werden konnte, zeigte sich bei dem transformierten Stamm nach Induktion mit IPTG deutliche Bildung von 5. Um die Aufarbeitung des Produktes zu ermöglichen und um dessen Synthese gezielter beeinflussen zu können, wurde eine Expression in Minimalmedium mit Zusätzen von Spurenelementen, 36 3. Spezieller Teil Aminosäuren und einer definierten Kohlenstoffquelle durchgeführt. Ein erhebliches Problem bei der Herstellung geeigneter Medien war das Ausfallen von Magnesiumverbindungen. Die 1 M Magnesiumsalz-Stammlösung wurde daraufhin getrennt von der Spurenelementlösung autoklaviert. Dem Medium wurde sie dann in verminderter Menge von 1 mM Endkonzentration als letztes zugesetzt. Fünf verschiedene Minimalmedien, nach Pan [91], Panmod [91], Leistner [92], M9 [93] und B B Tanaka [94], sowie als Vergleich LB-Vollmedium [93] wurden mit einer Übernachtkultur des Stammes F97 angeimpft. Nach Induktion mit IPTG (1 mM Endkonzentration) wurden in bestimmten Abständen Proben zur HPLC-Analyse gezogen (Abbildung 33). Glucose Glucose mAUs ] (290 nm) SHCHC [mg/L] 25000 500 Glucose Glucose 20000 400 Pan Pan PanModif Pan mod Glucose Glucose 15000 300 Leistner Leistner 10000 200 M9 M9 LB LB Integral [ 5000 100 Tanaka Tanaka 00 0 0 20 20 40 40 60 60 Fermentationsdauer Fermentationsdauer [h] Abbildung 33 80 80 100 100 120 120 [h] Bildung von SHCHC (5) in unterschiedlichen Minimalmedien. Die Punkte kennzeichnen den Zeitpunkt der Probenentnahmen, die Pfeile Zugabe von 350 mg Glucose zu 100 mL Fermentation. Wenngleich sich die Produktionsrate von 5 in den verschiedenen Minimalmedien nicht wesentlich unterschied, wurden die höchsten Produktbildungsraten im Medium nach Tanaka und in M9 Medium erreicht, die schlechtesten, mit Werten unter 100 mg/L, in LB-Medium (Abbildung 33). Die Bestimmung der absolut gebildeten Menge an 5 erfolgte durch RPHPLC-Messungen über eine Kalibriergerade mit 5 als Referenzsubstanz bei 290 nm. Der absolute Gehalt an SHCHC der verwendeten Referenzsubstanz wurde vorher durch 1H-NMR P P in D2O, welches 4 mM des internen Standards 3-(Trimethylsilyl)-propionsäure-2,2,3,3-d4 B B B B Natriumsalz (TSP) enthält, über das Verhältnis der Integrale berechnet. Ein Integral von 50 mAUs entspricht dabei 1 µg/mL SHCHC (5). In den durchgeführten Schüttelkolbenanzuchten C C entspricht das Produktbildungsraten von bis zu 400 mg SHCHC (5) pro Liter Medium in 110 h. 3. Spezieller Teil 37 SHCHC (5) [mg] 480 Ferm1 Ferm2 400 Ferm3 320 Ferm4 240 Ferm5 Ferm6 160 Ferm7 80 Ferm8 0 Ferm9 15 35 55 75 95 115 135 155 Ferm10 Zeit [h] Abbildung 34 Produktkonzentrationen an SHCHC (5) in Abhängigkeit von der Zeit. Verfolgt wurden 10 Anzuchten in Minimalmedium M9 mit Zusätzen. Bei gleichzeitiger Fermentation von zehn verschiedenen Ansätzen konnte gezeigt werden, dass sich die SHCHC-(5)-Bildung reproduzieren ließ. Bis auf Fermentation 7 wurden etwa Konzentrationen von 400 mg/L 5 erreicht, wobei sich ab 90 h die Produktkonzentration nicht weiter steigerte (Abbildung 34). 3.3.2. Isolierung der Metabolite durch Ionenaustauschchromatographie Die Bindung von 2,3-CHD (7) und 3,4-CHD (9) an Polystyrolharze mit anionenaffiner Oberfläche im analytischen Maßstab wurde bereits von E. Leistner et al. gezeigt [92], die Isolierung von Chorismat (1) im Bereich von 0.18 – 0.61 g/L von Hilvert et al. [89]. Dirk Franke [82] und auf dessen Arbeiten aufbauend Volker Lorbach [24] und Simon Esser [25] gelang es, Metabolite wie 1 und 7 chromatographisch in hoher Reinheit im Grammmaßstab zu isolieren. Extraktions- und Reextraktionsverfahren reichten in ihrer Effiziens nicht an das chromatographische Verfahren heran. Deswegen wurde im Folgenden die Aufarbeitung von 1 und der neu zugänglichen Substanz SHCHC (5) an das Verfahren von Franke und Lorbach angelehnt. Das stark basische Anionenaustauschersalz Dowex 1x8 ist ein Harz mit Polystyrengrundgerüst. An dieses Gerüst sind quartäre Ammoniumsalze gebunden, die selektiv Anionen zu binden vermögen. Proteine und Zucker aus der Fermentation werden nicht gebunden und können so abgetrennt werden. Das Harz wird mit einem neutralen Puffer oder Wasser equilibriert. Im schwach Basischen, pH 8, werden Carbonsäuren stabil gebunden. Eluiert werden kann entweder über eine pH-Wert Senkung oder über eine Verdrängungsreaktion mit an dieses Harz hochaffin bindendem Chlorid. Für die Aufarbeitung von 1 und 5 wurde letztere Variante gewählt, da beide Substanzen säurelabil sind und sich unter Aromatisierung 38 3. Spezieller Teil zersetzen. Regeneriert werden kann das Harz durch Behandlung mit Salzsäure und Natronlauge und anschließendem Spülen mit Wasser. Chorismat (1) Mit diesem Verfahren konnte sowohl das im Schüttelkolben mit dem Chorismatmutasedefizienten Stamm KA12 (Peter Kast, Zürich, 3.3.1) produzierte Chorismat (1) (400 mg/L) isoliert werden, als auch das aus den von Sprenger erhaltenen Fermentationsüberständen, die mit einer Produktkonzentration von 7-9 g/L deutlich höhere Mengen an 1 enthielten. Der 1 enthaltende, zellfreie Rohextrakt wurde bei einem pH-Wert von 8.5 auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurden mit Wasser Proteine und Zucker entfernt und mit einer 2 M Ammoniumchloridlösung, pH 8, 1 als Ammoniumsalz eluiert. Die Fraktionen wurden per RPHPLC auf Produkt untersucht, da andere Indikationsmethoden versagten. Mit Dünnschichtchromatographie bespielsweise konnte keine befriedigende Trennung erzielt werden - sowohl Trennung an SiO2 mit Ethylacetat/Cyclohexangemischen und 1% AmeisenB B säure, als auch an DC Platten aus RP-Phase mit verschiedenen Wasser/Methanolgemischen und 1% Ameisensäure brachte keine anwendbare Trennung der Stoffgemische. Die chorismathaltigen Fraktionen werden auf pH 1.5 angesäuert und mit Ether extrahiert. Nach Entfernung eines Großteils des Lösungsmittels wird 1 mit Cyclohexan als weißer Niederschlag ausgefällt. Trotz der thermischen Instabilität gelangen mit Fällung bei Raumtemperatur höhere Reinheiten (> 95%) als bei Fällung in der Kälte. Für die erhaltene hohe Reinheit wurde eine geringe Ausbeute von ca 10% in Kauf genommen. Bestimmt wurde die Reinheit und der Gehalt über 1H-NMR und Einsatz von TSP-Natrium als Standart. P P SHCHC (5) Das Vorgehen bei der Aufarbeitung von SHCHC (5) entspricht dem Verfahren für Chorismat (1) bis auf den Elutionsschritt. Im Gegensatz zu 1 weist 5 eine deutlich geringere Affinität zu dem Anionenaustauscherharz auf. Durch Elutionversuche mit 2 M, 1 M und 0.5 M Ammoniumchloridlösungen zeigten sich deutliche Verunreingungen in den Fraktionen. Im Vergleich zu anderen, im Fermentationsprozess entstehenden Substanzen löst sich 5 bereits bei einer geringeren Chloridkonzentration von dem quartären Ammoniumsalz. Deswegen wurde für die Isolierung von 5 ein Ammoniumchloridgradient entwickelt. Manuell wurde ein Stufengradient mit Konzentrationen von 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 1 M aufgetragen. Ein positiver Nebeneffekt ist die geringere Salzkonzentration der Elutionsfraktionen. Das Ausschütteln aus sauerer Lösung in Ether analog 1 war mit extremen Produktverlusten verbunden und wurde als möglicher Aufreinigungsschritt verworfen. Da den größten Teil der 3. Spezieller Teil 39 Verunreinigungen anorganische Salze darstellten, wurde stattdessen die Entsalzung durch Größenausschlusschromatographie mit Sephadex LH20 und dem Fließmittel Methanol durchgeführt. Dies führte zu einer deutlichen Reduktion des Salzgehaltes und damit zu einer Steigerung der Reinheit des Produktes SHCHC (5) von 27% auf 56% bei einer Gesamtausbeute der Reinigung von 15-20% bestimmt durch 1H-NMR mit Standard. P P 3.3.3. Untersuchungen zur Stabilität von Chorismat und SHCHC Chorismat (1) und SHCHC (5) neigen aufgrund des Diensystems leicht zu Aromatisierung unter Wasserabspaltung, beziehungsweise Abspaltung von Pyruvat. Um Folgechemie entwickeln zu können wurde vorab die Stabiltät der Verbindungen bei verschiedenen pHWerten getestet und Nebenprodukte identifiziert. Chorismat (1) 1 zerfällt bei neutralem pH 7.0 in Kaliumphosphatpuffer innerhalb von 35 Tagen nahezu vollständig. Das Hauptabbauprodukt wurde dabei durch Vergleich mit Referenzsubstanz über RP-HPLC als 4-Hydroxybenzoesäure identifiziert. Weitere Nebenprodukte konnten nicht eindeutig identifiziert werden. Zersetzung Chorismat (1) 2,5 Konzentration mmol/l Chorismat a) 2 Chorismat b) Chorismat c) 1,5 1 0,5 0 0 10 20 30 40 Zeit [d] Abbildung 35 Drei Lösungen von Chorismat (1) (Chorismat a, b und c) bei pH 7 werden auf Zersetzung von 1 bei neutralen pH untersucht. 40 3. Spezieller Teil SHCHC (5) Die Stabilität von 5 wurde im Sauren (pH 4), Neutralen (pH 7) und Alkalischen (pH 10), über die Zeit beobachtet. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Salzsäure beziehungsweise Natronlauge eingestellt. Die SHCHC-Konzentration in der Lösung wurde über RP-HPLC bei λ = 290 nm verfolgt (Abbildung 36). Abbau von SHCHC (5) µg SHCHC (5) /mL 140 120 100 pH 4 80 pH 7 60 pH 10 40 20 0 0 100 200 300 400 Zeit [h] Abbildung 36 Abbau von SHCHC (5) in Abhängigkeit von der Zeit bei verschiedenen pH-Werten, 25 °C, bestimmt über RP-HPLC bei 290 nm. Im alkalischen und neutralen Bereich ist 5 über mehr als 340 h stabil. Im Sauren jedoch findet eine rasche Zersetzung statt (t½ = 75 h). Als Hauptzersetzungsprodukt wurde die aromatische B B Substanz 3-Benzoylpropionat (14) durch Coinjektion mit Reinsubstanz identifiziert. Sauer katalysiert erfolgt Dehydratisierung und Decarboxylierung begünstigt durch die Aromatisierungstendenz der Substanz (Abbildung 37). O HO O O OH H - O2 C + - CO2, -H2O - O2C + [H ] 14 5 Abbildung 37 Reaktion von SHCHC (5) im Sauren. Das RP-HPLC-Chromatogram zeigt nach 174 h Inkubation bei pH 4 die Bildung von 14 als Hauptprodukt (Abbildung 38). Die Bildung von OSB (6) nach Wasserabspaltung konnte bei pH 4 nicht beobachtet werden. 3. Spezieller Teil mAU 41 275 nm SHCHC (5) 14.7 min O 50 - 40 O2C 27.4 min 30 14 20 10 0 0 mAU 80 70 60 50 40 5 10 290 nm 15 20 14.7 min 25 30 27.4 min 0 5 10 min 35 min 35 min SHCHC (5) 30 20 10 0 mAU 35 15 20 230 nm 25 14 30 27.4 min 120 14 100 80 60 40 20 0 0 Abbildung 38 5 10 15 20 25 30 Inkubation von SHCHC (5) bei pH 4. RP-HPLC-Chromatogram mit dem Abbauprodukt 14 nach 174 h bei den Wellenlängen 275, 290 und 230 nm. 3.3.4. Versuche zur Folgechemie Versuche die funktionellen Gruppen der Verbindungen Chorismat (1) und SHCHC (5) unter Erhaltung des Diensystems zu schützen sowie die Doppelbindung in Position 5, 6 zu epoxidieren scheiterten alle an der ausgeprägten Aromatisierungstendenz der Diencarbonsäuren. Chorismat (1) Untersucht wurde die Epoxidierung von 1 an der elektronenereicheren Doppelbindung in Position 5,6 mit m-Chlorperbenzoesäure in Diethylether bei 0 °C. Die Methylierung mit TMS-diazomethan nach Presser und Häfner [95] in einem Toluol/Methanolgemisch sowie die Methylierung mit N,N-Dimethylformamid-dimethylacetal in DMF [96] (Abbildung 39). 42 3. Spezieller Teil O H3 C N H3 C OCH3 -OCH3 OCH3 H H3 C N H3 C OCH3 H R O H3 C N H3 C OCH3 H O R O H H3C N H3C O OCH3 O R O Abbildung 39 CH3 N CH3 R OCH3 H O Methylierung einer Carbonsäure mit N-N-Dimethylformamid-dimethylacetal [96]. führten beide zum Aromaten Methyl 3-(3-methoxy-3-oxoprop-1-en-2-yloxy)benzoat (15), wobei N,N-Dimethylformamid-dimethylacetal im Gegensatz zur Methylierung mit TMSDiazomethan zu einem reinen Produkt führte (Abbildung 40). 15 wurde von Ife et al. [97] durch Methylierung von 1 mit Methyliodid und Silberoxid in DMF erhalten. OCH3 OCH3 H N,N-Dimethylformamid-dimethylacetal H3C N H3C CO2- O OH CO2- CO2CH3 DMF RT, 2 h 1 Abbildung 40 O CO2CH3 15 Methylierung von Chorismat (1) und Folgereaktion. Versuche zur Bromierung der elektronenreicheren Doppelbindung in Position 5,6 von 1 mit N-Bromacetamid in Ethylacetat, sowie zur Methylierung der Carbonsäurefnktionen mit 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimidhydrochlorid in Methanol führten zu einem nicht charakterisierbaren Produktgemisch aus vorwiegend aromatischen Verbindungen. SHCHC (5) Methylierungsversuche von 5 nach der Methode von Presser und Häfner [95] mit TMSDiazomethan ergaben die methylierte Form des Folgemetaboliten OSB (6). Dies wurde zur Synthese von 6 als Referenzsubstanz für die Identifizierung von Abbauprodukten genutzt. Das erhaltene Methyl 2-(4-methoxy-4-oxobutanoyl)benzoat (Dimethyl-OSB, 16) wurde durch Verseifung im Alkalischen zu kristallinem 6 umgesetzt (Abbildung 41). 3. Spezieller Teil O 43 CO2CH3 O LiOH H3CO2C CO2- - O2 C MeOH/H2O RT, 2h, 42% 16 Abbildung 41 6 Verseifung von Dimethyl-OSB (16) zu OSB (6). Versuche 5 mit TBS-Gruppen unter Erhaltung des Diensystems zu schützen, schlugen fehl und ein nicht charakterisierbares Gemisch aus Aromaten wurde erhalten. 44 3. Spezieller Teil 3.4. MenD als Biokatalysator Für den Einsatz von MenD als Biokatalysator wurde, soweit nicht anders angegeben, nur gereinigtes MenD mit C-terminalem 6x His-tag eingesetzt. Negativkontrollen wurden mit Lysat der Leervektorexpression sowie aufgereingtem Leervektorlysat durchgeführt (3.4.4). 3.4.1. 1,2-Addition von α-Ketoglutarat an Aldehyde Das gereinigte Enzym MenD wurde mit α-Ketoglutarat (3) als Donor und verschiedenen aliphatischen, aromatischen und α,ß-ungesättigten Aldehyden als potentiellen Akzeptoren inkubiert. Durch Kondensation der decarboxylierten α-Ketosäure an einen Akzeptoraldehyd entstehen chirale α-Hydroxyketone (Abbildung 42). Zuerst wurde für eine Vielzahl von Aldehyden im analytischen Maßstab von 1.5 mL Volumen (50 mM Donorsubstrat, 20 mM Akzeptorsubstrat) gearbeitet. Aus den Reaktionen mit guten bis sehr guten Umsatzraten wurde im Folgenden pro Gruppe von Aldehyden je eine Reaktion herausgegriffen und im präparativen Maßstab von 7-50 mL Lösungsmittelvolumen (50 mM Donorsubstrat, 20 mM Akzeptorsubstrat) durchgeführt. Damit wurde gewährleistet, dass ausreichend Produkt zur Bestimmung von Umsatz und isolierbarer Ausbeute, sowie für weiterführende Analytik und Derivatisierungsreaktionen zur Verfügung stand. O H OH R R O α-Ketosäure Abbildung 42 O MenD O - CO2 R * OH R α−Hydroxyketon "1,2-Additionsprodukt" Aldehyd Allgemeines Reaktionschema für die Bildung der α-Hydroxyketone. GC-MS-Analytik Zur Bestimmung der Umsatzrate von Edukt zu Produkt wird bei den flüchtigen Produkten GC-MS-Analytik verwendet. Dem Produkt entsprechen, bei allen detektierten Kondensationreaktionen mit α-Ketoglutarat (3) als Donor, 2 Peaks im Gaschromatogramm. Die Fragmente des 1. Produktpeaks lassen auf Decarboxylierung und Oxidation des sekundären Alkohols schliessen (m/z = M -46). Die markanten Fragmente des zweiten Produktpeaks weisen auf Wasserabspaltung (m/z = M -18) und Lactonbildung der 4Oxopentanoyleinheit hin (m/z = 85). Derartige Produkte waren NMR-spektroskopisch nicht nachweisbar. Dies zeigt eindeutig, dass es sich bei den gefundenen Verbindungen um 3. Spezieller Teil 45 Fragmentierungsprodukte handelt, die aufgrund der extremen Bedingungen in der Ionisierungsquelle entstehen. Am Beispiel der Kondensationsreaktion von Thiophenal (17) mit 3 ist ein Chromatogramm der Umsetzung nach 44 h gezeigt (Abbildung 43). Von Produktpeak 1 und 2 ist ausserdem jeweils das Massenspektrum gezeigt (Abbildung 44, Abbildung 45). Zu den dabei auftretenden Fragmenten, die stellvertretend für alle mit MenD synthetisierten α-Hydroxyketone stehen, sind die postulierten Strukturen gezeigt (Abbildung 46). (16) (18) (15) (17) Abbildung 43 (16) (18) GC-Chromatogramm der Umsetzung von Thiophenal (17) mit α-Ketoglutarat (3) zu 5-Hydroxy-4-oxo-5-(thiophen-2-yl)-pentansäure (18). Aufspaltung erfolgt in 2 Produktpeaks (1 und 2) durch GC-MS mit 87% Gesamtumsatz. Abbildung 44 MS-Spektrum von Produktpeak 1. Abbildung 45 MS-Spektrum von Produktpeak 2. 46 3. Spezieller Teil Fragmente aus Produktpeak 2 Fragmente aus Produktpeak 1 OH S O * CO2H O O S S S O * 18 m/z: 214 Abbildung 46 -2H, -CO2 m/z: 168 O O O O -H2O m/z: 196 m/z: 111 O m/z: 85 Produkt und postulierte Fragmente von Produktpeak 1 und 2. Die Umsatzraten wurden aus dem Chromatogramm durch Integration bestimmt. Vergleiche der durch GC-MS ermittelten Umsatzraten konnten mit 1H-NMR bestätigt werden, so dass die P P Bestimmung von flüchtigen Produkten mittels GC-MS-Analytik als Standardmethode verwendet wurde. HPLC-MS-MS- und NMR-Analytik T T Für nicht-flüchtige Produkte wurde HPLC-MS-MS-Analytik verwendet, um einen qualitativen Hinweis auf Produktbildung zu erlangen. Quantitative Ausagen konnten hierbei nicht gemacht werden. Im Falle des Umsatzes von Hydroxybenzaldehyd-Derivaten (19l-19n) konnte die HPLC-MS-MS eindeutige qualitative Produktbildung nachweisen. Gleichzeitig wurde die Bildung von Nebenprodukten, wie zum Beispiel Oxidationsprodukten, erfasst. cps 16.2 min Enzymansatz: O OH H HO OH COO- 1 mM ThDP 200 µg MenD 50 mM Ketoglutarat (3) O HO 20 mM 19n OH 20n HPLC-MS/MS Parameter: LC: Fließmittel Methanol/H2O 1:1 Fluss: 450 µl/min RP8-Phase MS: -Q1 Scan 20.3 min 24.9 min min Abbildung 47 MS/MS-Chromatogramm der Umsetzung von 3,4-Dihydroxybenzaldehyd (19n) mit α-Ketoglutarat (3) zu 5-(3,4-Dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-4-oxopentanoat (20n). 3. Spezieller Teil 47 Massenspektrum bei t = 16.2 min OH CO2O HO OH 20n Produkt [M – H+]Produkt - H2O - CO2 Produkt - H2O Produkt mit HCOOH m/z [amu] Abbildung 48 Massenspektrum bei t = 16.2 min. Produkt (20n) und Fragmente sind identifizierbar. Massenspektrum bei t = 24.9 min O CO2O HO OH 5-(3,4-Dihydroxyphenyl)-4,5dioxopentanoat oxidiertes Produkt [M – H+]- oxidiertes Produkt - CO2 m/z [amu] Abbildung 49 Massenspektrum zum Zeitpunkt t = 24.9 min. Produktpeak (oxidiert) und decarboxyliertes, oxidiertes Produkt sind identifizierbar. 48 3. Spezieller Teil Der Umsatz wurde in diesen Fällen über 1H-NMR-Analytik durch das Integralverhältnis der P P Protonen von Edukt zu Produkt bestimmt. Durch die Zugabe von 20% Deuteriumoxid konnten hierfür in situ Messungen direkt aus dem enzymatischen Ansatz durchgeführt werden. Verfälschungen der Integralverhältnisse durch unterschiedliche ExtraktionsEigenschaften von Produkt und Edukt konnten so von vornherein ausgeschlossen werden. 3. Spezieller Teil 49 Umsatzraten für aromatische Aldehyde Die Umsatzraten für aromatische Benzaldehydderivate in der Rolle des Akzeptors sind in Tabelle 4 gezeigt. O H R3 CO2- HO R1 - CO2 O R2 10, 19a-19n OH MenD O CO2R3 R1 O R2 3 Umsatzrate [%] 13, 20a-20n isolierte Ausbeute GC-MS [%] H >99 64 94 H H 90 n.b. n.b. Cl H H 80 n.b. n.b. 20c Br H H 65 n.b. n.b. 20d CH3 H H 12 n.b. n.b. 20e F H H >99 87 95 20f H F H 88 n.b. n.b. 20g H OCH3 H 50 n.b. n.b. 20h H I H 95 79 98 x 20i H H F >99 n.b. n.b. 20k H H Cl >99 n.b. n.b. 20l H H OH 60 (NMR) n.b. n.b. 20m OH OH H 45 (NMR) n.b. n.b. 20n H OH OH 53 (NMR) n.b. n.b. Produkt R1 13 H H 20a I 20b x) P P P P R2 P P R3 P P ee [%] (R) P P Bestimmung nach Methylierung. Tabelle 4 Umsatzraten, isolierte Ausbeuten und Enantiomerenüberschuss von aromatischen α-Hydroxyketonen (13, 20a-20n) katalysiert von MenD. Für Ansätze im präparativen Maßstab konnten isolierbare Ausbeuten von 64%-87% erreicht werden (Tabelle 4). Der Umsatz von substituierten Benzaldehyden (19a-19n) hängt dabei stark von der Art der Substituenten ab. Aldehyde mit elektronenziehenden Gruppen wie Halogene (19a-19c, 19e, 19f, 19h-19k) erhöhen die Elektrophilie der Aldehydgruppe und zeigen somit höhere Umsätze als Aldehyde mit elektronenspendenden Substituenten am 50 3. Spezieller Teil Aromaten wie Methoxy- (19g) oder Hydroxygruppen (19l-19n). Halogen-substituierte Benzaldehyde wurden von MenD sehr gut umgesetzt, ungeachtet der Position der Substitution. Methoxy- (19g) oder Methylsubstituierte (19d) Derivate zeigten im Vergleich deutlich geringere Umsatzraten. Der heteroaromatische Aldehyd Thiophenal (17) überzeugte zwar durch eine hohe Umsatzrate von 87% nach 44 Stunden unter selektiver Bildung des Regioisomers 5-Hydroxy-4-oxo-(thiophen-2-yl)-pentanoat (18). Im 1H-NMR konnte eine P P rasche Isomerisierung zu 4-Hydroxy-5-oxo-(thiophen-2-yl)-pentanoat beobachtet werden. Diese rasche Isomerisierungstendenz konnte sowohl bei Einsatz des elektronenreicheren Heteroaromaten 17 als auch für den Einsatz von Zimtaldehyd als Akzeptor beobachtet werden. Aufgrund des nicht auswertbaren Produktgemisches fehlen analytische Daten. Keine Reaktion erfolgte bei der Inkubation von stickstoffhaltigen Aldehyden wie 4-Aminobenzaldehyd und 2-Nitrobenzaldehyd mit MenD. Betrachtet man die Umsatzraten für aliphatische und olefinische Aldehyde, zeigen sich insgesamt geringere Umsatzraten. Die isolierbare Ausbeute der Produkte (R)-5-Hydroxy-4-oxodecanoat (22b) und (R)-5Cyclohexenyl-5-hydroxy-4-oxopentanoat (24) bei Einsatz des aliphatischen Aldehyds Hexanal (21b) und des ungesättigten Aldehyds 23 ist deutlich geringer (Abbildung 50). O OH Ketoglutarat H3 C H MenD -CO2 21a H3C H O 22a OH O H 21b CO2- Ketoglutarat MenD -CO2 55 % isolierte Ausbeute ee = 25% O 22b OH O H 21c 93% Rohausbeute CO2- Ketoglutarat CO2- 60% Conversion (NMR) CO2- 21% isolierte Ausbeute O MenD -CO2 22c O O HO H Ketoglutarat MenD -CO2 23 Abbildung 50 24 Produkte aus aliphatischen und olefinischen Aldehyden als Edukte. 3. Spezieller Teil 51 Einschränkungen bei der Substratakzeptanz, die auf sterische Eigenschaften zurückzuführen sind, sind für die verschiedenen Aldehyde nicht zu beobachten. Der C2-Aldehyd Acetaldehyd (21a) wird als Akzeptor ebenso akzeptiert wie der C11-Aldehyd Undec-10-enal (21c). Nur geringfügige Aktivitätseinbußen konnten zum Beispiel im Vergleich des Einsatzes des C11Aldehydes 21c zum C5-Aldehyd 21b beobachtet werden. Stereoselektivität von MenD Neben hohen Umsatzraten wurden für die entstandenen α-Hydroxyketone aus aromatischen Benzaldehyden hohe Enantiomerenüberschüsse bestimmt. Aufgrund des enthaltenen Chromophors der Benzaldehydderivate eignet sich zur ee-Bestimmung HPLC an Normalphase mit chiraler stationärer Phase. An den chiralen Phasen konnte eine Trennung der Enantiomere der freien Säuren erreicht werden (Abbildung 51). Für (R)-5-Hydroxy-5-(3iodphenyl)-4-oxopentansäure (20h) wurde eine Trennung der Enantiomere erst nach vorheriger Methylierung mit TMS-Diazomethan zu (R)-Methyl 5-hydroxy-5-(3-iodphenyl)-4oxopentanoat (25a) erzielt. 25.0 min Fläche: 46361 OH CO 2H F OH O 18e 20e CO 2H F O Fläche: 1366 Abbildung 51 23.1 min HPLC-Chromatogramm von (S)-5-(2-Fluorphenyl)-5-hydroxy-4-oxopentansäure (23.4 min) und dem Enantiomer (R)-5-(2-Fluorphenyl)-5-hydroxy-4-oxopentansäure (20e) (25.0 min). Der Enantiomerenüberschuss berechnet aus den Flächenintegralen beträgt 95%. Enthielt die Substanz kein Chromophor, wurde nach Trennung an chiraler Phase als Detektionsmethode MS-MS gewählt. Für das aliphatische α-Hydroxyketon (R)-Methyl 5hydroxy-4-oxodecanoat (25b) wurde dabei eine deutlich schlechtere Enantioselektivität beobachtet als für die beschriebenen aromatischen α-Hydroxyketone (Abbildung 52). 52 3. Spezieller Teil Intensität [cps] 16.1 min OH 2200 CO2CH3 2000 23b 25b O Fläche: 1.6 x 105 1800 19.1 min 1600 OH 1400 CO2CH3 1200 O 1000 Fläche: 9.4 x 104 800 600 400 200 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Zeit [min] Abbildung 52 HPLC-MS-MS-Chromatogramm von (R)-Methyl 5-hydroxy-4-oxodecanoat (25b). Der Enantiomerenüberschuss berechnet aus der Fläche beträgt 25%. Die bestimmten ee-Werte für durch MenD-Katalyse erhaltene Produkte sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Produkt Methode Enantiomerenüberschuss (ee) OH CO2H HPLC Chiralcel OM-Säule n-Hexan/2-Propanol = 90:10; 94% CO2H HPLC Chiralcel OM-Säule n-Hexan/2-Propanol = 90:10; 95% CO2CH3 HPLC Chiralcel OD-Säule n-Hexan/2-Propanol = 90:10; 98% HPLC-MS/MS Chiralcel OB-Säule n-Hexan/2-Propanol = 97:3; 25% O 13 OH F O 20e OH O I 25a OH CO2CH3 O Tabelle 5 25b Enantiomerenüberschüsse ausgewählter Produkte. 3. Spezieller Teil 53 Bestimmung der absoluten Konfiguration Die Bestimmung der absoluten Konfiguration erfolgte über Circulardichroismus (CD). Dabei wurden die Spektren mit der Standardsubstanz R-Phenylacetylcarbinol (PAC, 11) [98] verglichen. Die in Abbildung 53 gezeigten, MenD-katalysiert generierten 2-Hydroxyketone, zeigen alle einen negativen Cotton-Effekt im Wellenlängenbereich von 270-280 nm und einen positiven sehr viel schwächeren bei 315 nm. Diese Maxima stimmen gut mit denen von 11 überein. Deswegen wird R-Konfiguration für alle durch MenD-Katalyse produzierten Substanzen postuliert. Diese Hypothese wird unterstützt durch die gemessenen Drehwerte in Methanol. Für die gezeigten 2-Hydroxyketone werden negative Werte gemessen, ebenfalls konsistent mit 11. Die Produkte zeigen demnach die entgegengesetzte Konfiguration zu dem von Wetzel et al. aus einem Pilz isolierten PAC-Derivat 5-Hydroxy-4-oxo-5- phenylpentansäure (13) [65], das eine positive optische Aktivität aufwies. 17 OH OH H CO2- O O Standar t rd (R)-PAC 10 OH Mol. Mol. CD CD 13 OH CO2- Minimum bei 270-280 270nm F O O 20e 20h I O 0 CO2- HO OH CO2- CO2- 24 O OH 22b CO2- --9 200 22c O 250 300 325 Wellenlänge [nm] Abbildung 53 CD-Spektren der rechts abgebildeten Hydroxyketone. Durch Vergleich mit (R)-PAC wird die R-Konfiguration für diese, durch MenD-Katalyse entstandenen, Hydroxyketone postuliert. 54 3. Spezieller Teil 3.4.2. 1,2-Addition von unphysiologischen α-Ketosäuren an Aldehyde Nach der erfolgreichen Variation des Akzeptorsubstrats wurde auch auf der Donorenseite, den α-Ketosäuren, variiert. Benzaldehyd (10) und 2-Fluorbenzaldeyd (19e) wurden als Akzeptoren gewählt. Der physiologische Donor α-Ketoglutarat (3) wurde ersetzt durch verschiedene α-Ketosäuren (Abbildung 54). Nur Oxalacetat und Pyruvat konnten hierbei als Substrate für MenD identifiziert werden, für alle anderen eingesetzten Donoren konnte innerhalb des Detektionslimits der GC-MS keine Umsetzung beobachtet werden O HO COO O Oxalacetat O HO O O O - HO HO HO O O O Pyruvat Phenylglyoxylat Phenylpyruvat COOO HO HO O Ketobutyrat Abbildung 54 O O O 3 Br O 3-Brompyruvat HO O O 2-(Furan-2-yl)-2-oxoacetat Austausch von α-Ketoglutarat (3) durch verschiedene α-Ketosäuren. Oxalacetat ist um eine CH2-Einheit kürzer als 3, weist aber ebenfalls eine zweite B B Carbonsäurefunktion auf. Pyruvat ist ein häufig auftretendes Donorsubstrat für viele ThDPabhängige Enzyme. α-Ketobutyrat ist das natürliche Substrat der Acetolactat-Synthase, das zu MenD der Sequenzhomologie nach, am ähnlichsten ist. Sowohl Pyruvat als auch Oxalacetat reagierten mit den Akzeptoraldehyden zu (R)-PAC (11) beziehungsweise (R)-2-Flour-PAC (26). Die Umsatzraten sind jedoch im Vergleich zum natürlichen Donor 3 mit 1% und 2% für Benzaldehyd (10) sowie 5% und 24% für 2-Fluorbenzaldehyd (19e) deutlich geringer (Abbildung 55). Die Zwischenprodukte 4-Hydroxy-3oxo-4-phenylbutansäure (27) und 4-(2-Fluorphenyl)-4-hydroxy-3-oxobutansäure (28) konnten weder mit GC-MS– noch mit LC-MS/MS-Analytik nachgewiesen werden. Das heißt, dass entweder Oxalacetat zu Pyruvat decarboxyliert wird oder das mit Oxalacetat gebildete Kondensationsprodukt im Nachhinein decarboxyliert. Die deutlich höheren Umsatzraten mit Oxalacetat gegenüber Pyruvat lassen jedoch den Schluss zu, dass Oxalacetat den besseren Donor darstellt, da dem natürlichen Donor ähnlicher, und die Decarboxylierung in Folge der Instabilität der 3-Oxocarbonsäure nach der Produktbildung stattfindet. R-Konfiguration wurde für beide Produkte mittels chiraler HPLC bestimmt. Aufgrund der jeweils geringen Produktmenge und vieler Nebenprodukte war die Bestimmung eines aussagekräftigen eeWertes nicht möglich. 3. Spezieller Teil 55 O OH O H MenD HO O 10 O -CO2 Pyruvat O 1% 11 OH O H MenD HO O F -CO2 Pyruvat 19e 5% 26 O O H CO2O Oxalacetat 10 MenD CO2O -CO2 H F 19e Abbildung 55 2% 11 OH OH CO2- HO O CO2- MenD -CO2 Oxalacetat O -CO2 27 O O OH OH HO O F F 28 O -CO2 F O 24% 26 Donorsubstitution von α-Ketoglutarat (3) durch Pyruvat und Oxalacetat führt zu (R)-PAC (11) und (R)-2-Fluor-PAC (26) Bildung. Für alle anderen eingesetzten Donoren konnte innerhalb des Detektionslimits der GC-MS keine Umsetzung beobachtet werden. 56 3. Spezieller Teil 3.4.3. Carboligation von α-Ketosäuren Die Abhängigkeit der Regioselektivität von den dem Enzym angebotenen Substraten wurde bei anderen ThDP-abhängigen Enzymen bereits beobachtet [99]. Nach ersten Hinweisen auf Induktion einer Donor/Akzeptorselektivität bei MenD durch bestimmte Substrate bei Carboligationsexperimenten mit α-Ketosäuren wurden verschiedene α-Ketosäuren systematisch auf Regioselektivität untersucht (Abbildung 56). O O H3C MenD -CO2 O Pyruvat O - O- O2 C O 3 O O- H3C O Pyruvat O H3 C 21a O OO Glyoxylat Abbildung 56 * H3C CH3 OH 29 3 MenD - 2 x CO2 keine Reaktion O 3 MenD - 2 x CO2 MenD -CO2 3 MenD - 2 x CO2 H H3C CO2- * OH 30 OH 3 H H O Pyruvat - * H3C H CO2O 22a OH H H CO2O 31 Kondensationsreaktionen von α-Ketosäuren. Bei der Inkubation von Pyruvat mit α-Ketoglutarat (3) wird eine Umkehrung der Regioselektivität beobachtet. Der 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Aktivitätstest [100] wurde hierbei verwendet um die Bildung der α-Hydroxyketonstruktur nachzuweisen. Bei Untersuchungen zur Carboligation mit Pyruvat wurde das Selbstkondensationsprodukt Acetoin (29) in Spuren gebildet, welches nachgewiesen wurde über 1H-NMR. Chirale GC zeigt eine racemische P P Bildung von 29. 3 bildet im Gegensatz dazu kein Selbstkondensationsprodukt. Wurde Pyruvat mit 3 inkubiert trat deutliche Rotfärbung im TTC-Aktivitätstest auf. Der 3. Spezieller Teil 57 Ansatz wurde im Maßstab von 7 mL Reaktionsvolumen wiederholt und über 1H-NMR P P verfolgt. Es konnte nicht das die erwartete Regioselektivität beinhaltende 5-Hydroxy-4oxoderivat 22a beobachtet werden sondern das Isomer 4-Hydroxy-5-oxohexanoat (30). α-Ketoglutarat (3) reagiert in diesem Fall als Akzeptor für das nach Decarboxylierung von Pyruvat intermediär vorliegende, umgepolte Acetaldehyd. Wird jedoch Acetaldehyd mit 3 eingesetzt, fungiert letzteres wieder als Donor und Acetaldehyd als Akzepor, so dass 5-Hydroxy-4-oxohexanoat (22a) als Produkt isoliert wurde. Zur Aufreinigung wurden die Regioisomere mit TMS-Diazomethan methyliert. 1H-NMR P P nach Methylierung der Produkte 30 zu Methyl 4-hydroxy-5-oxohexanoat (32) und 22a zu Methyl 5-hydroxy-4-oxohexanoat (33) bestätigte dabei eine außerordentlich hohe Regioselektivität, die eine Bildung der Regioisomere durch Tautomerisierung unwahrscheinlich macht (Abbildung 57). 32 33 Abbildung 57 1 H-NMR (CDCl3) der Regiosiomere Methyl 4-hydroxy-5-oxohexanoat (32) aus der Umsetzung von Pyruvat mit α-Ketoglutarat (3) und Methyl 5-hydroxy-4-oxohexanoat (33) aus der Umsetzung von Acetaldehyd mit 3. P P B B Auch die α-Ketosäure Glyoxylat, die um eine CH3-Einheit kürzer ist als Pyruvat, führt wieder B B zur gewöhnlichen Regioselektivität mit 3 als Donor, so dass die Bildung von 5-Hydroxy-4oxopentansäure (31) durch 1H-NMR nachgewiesen wurde. Die Umkehr der Regioselektivität P P durch den Einsatz von Pyruvat ist mechanistisch nicht aufgeklärt. Eventuell verursacht die 58 3. Spezieller Teil Bindung von Pyruvat an einer allosterischen Bindungsstelle eine Konformationsänderung des Enzyms. Dies könnte zu einer Veränderung der Umgebung in der Bindungstasche des aktiven Zentrums führen, was schließlich die Decarboxylierung von Pyruvat ermöglicht und αKetoglutarat (3) in die Akzeptorrolle drängt. Es wurden Konkurrenzexperimente durchgeführt, in denen Pyruvat, 3 und Benzaldehyd (10) gleichzeitig inkubiert wurden. Mittels GC-MS wurde jedoch nur das Kondensationsprodukt aus 10 und 3 detektiert. Neben der Regioselektivität ist auch die Stereoselektivität dieser Produktbildung von Interesse. Zur Bestimmung der Enantiomerenüberschüsse wurden verschiedene Methoden verwendet. Drehwertbestimmung und Circulardichroismus (CD) wurden sowohl mit den Carbonsäuren 22a und 30 als auch mit den Methylestern 32 und 33 durchgeführt, um reaktionsbedingte Racemisierung durch Methylierung ausschließen zu können. Eine chromatographische Trennung der Methylester erfolgte daraufhin mittels chiraler GC (Tabelle 6). Produkt O H Methode Konfiguration CO2CH3 GC FS-Lipodex D-Säule; racemisch CO2CH3 GC FS-Lipodex D-Säule; racemisch OH 32 OH H O 33 Tabelle 6 Chromatographische Trennung der Methylester 32 und 33 mittels chiraler GC. Alle Messungen zeigten, dass beide Kondensationsprodukte, 32 und 33, racemisch vorlagen. Da die jeweiligen Regioisomere jedoch mit einer hohen Selektivität gebildet wurden, ist eine nachträgliche Tautomerisierung von 5-Hydroxy-4-oxohexanoat zu 4-Hydroxy-5-oxohexanoat oder umgekehrt unwahrsacheinlich enzymkatalysierte Bildung angenommen. und es wird deswegen eine regioselektive, 3. Spezieller Teil 59 3.4.4. Nachweis der spezifischen Leervektorexpression Aktivität von MenD durch Um auszuschließen, dass die gefundenen Produkte durch katalytische Aktivität von anderen Enzymen gebildet werden, wird für ausgewählte Reaktionen ein Vergleich der Expressionen der Konstrukte mit dem Insert MenD zu der Expression des Leervektor des verwendeten pETExpressionssystems vorgenommen. Besonders für Umsetzungen, bei denen der Donor αKetoglutarat (3) durch Pyruvat und Oxalacetat ersetzt wurde, sollte der Verdacht ausgeräumt werden, dass die relativ geringen Aktivitäten von Enzymen wie der Pyruvatdecarboxylase oder der Acetolactat-Synthase, die konstitutiv in E. coli vorkommen, ausgelöst wurden. Denn trotz Aufreinigung von MenD könnten diese Enzyme noch in Spuren enthalten sein. Es wurden folgende Untersuchungen durchgeführt, um auszuschließen, dass die gefundenen Aktivitäten durch ein anderes Enzym als MenD verursacht wurden. Sowohl BL21DE3-Zellen mit dem Leervektor pET22b(+), als auch BL21DE3 Zellen mit dem Konstrukt menD_C-term wurden unter Standardbedingungen zur Proteinexpression eingesetzt. Die SDS-PAGE der Lysate zeigt eine deutliche Überexpression von menD in den Stämmen, die das Gen menD enthalten, wohingegen bei Stämmen mit dem Leervektor in diesem Bereich keine derartige Bande zu erkennen ist. Da MenD in E. coli konstitutiv produziert wird, ist aber anzunehmen, dass MenD auch in den Leervektorzellen in Spuren produziert wird (Abbildung 58). 10 µl Lysat Marker Abbildung 58 10 µl Lysat 20 µl Lysat 20 µl Lysat pET22b(+) pET22b(+) pET22b(+) pET22b(+) mit menD mit menD (menD_C-term) (menD_C-term) SDS-PAGE der Lysate aus pET22b(+) mit dem Insert menD (menD_C-term) und der Leervektorexpression mit pET22b(+). Der Gesamtproteingehalt lag jeweils bei 11 mg/mL. 60 3. Spezieller Teil Das Lysat wurde nach Zellaufschluss ungereinigt in den Carboligationsexperimenten eingesetzt. Die Gesamtproteinmenge pro Milliliter betrug jeweils circa 11 mg nach Bradford. Für die 1,2-Addition von verschiedenen Donoren an 2-Fluorbenzaldehyd (19e) wurde der Umsatz im Lysat, das überexprimiertes MenD enthält (a), jeweils gegen den Umsatz mit dem Lysat aus der Leervektorexpression (b) verglichen (Tabelle 7, Spalte 4). Ein Teil des Lysats wurde mittels IMAC aufgereinigt. Dabei wurde das Lysat der Leervektorexpression genauso behandelt wie das MenD enthaltende und die gleichen Fraktionen entsalzt. In den aufgereingten Fraktionen des Lysats aus dem Leervektor konnte mittels Bradford kein Proteingehalt detektiert werden, in denen mit MenD betrug die Konzentration 1.7 mg/mL (Abbildung 59). Marker Abbildung 59 1 2 Gereinigtes Protein. (1) MenD, (2) Leervektorexpression. Anschließend wurden mit den aufgereinigten Fraktionen jeweils die gleichen Umsetzungen durchgeführt (Tabelle 7, Spalte 5). Im gereinigten Lysat des Leervektors konnten keine Umsätze mittels GC-MS-Analyse beobachtet werden, wohingegen das gereinigte MenD deutliche Umsatzraten zeigte (Tabelle 7, Spalte 5). Durch diese Umsetzungen konnte nachgewiesen werde, dass MenD die beobachteten Carboligationen katalysiert. 3. Spezieller Teil Akzeptor 61 Donor Umsatz mit Lysat (GC-MS) Umsatz mit gereinigtem MenD (GC-MS) mit IMAC O a: 8.7% b: 14% a: 0% b: 8.7% O a: 20.4% b: 14.0% a: 0% b: 8.4% a: 3.0% b: 100% a: 0% b: 100% Hauptprodukt OH * 2-Fluorbenzaldehyd (19e) Pyruvat F 26 OH * 2-Fluorbenzaldehyd (19e) Oxalacetat F 26 OH * 2-Fluorbenzaldehyd (19e) Tabelle 7 α-Ketoglutarat (3) CO2O F 20e Umsatzkontrollen im Vergleich von Leervektorexpression (a) und Expression von MenD (b) mit dem Akzeptor 2-Fluorbenzaldehyd (19e) und verschiedenen α-Ketosäuren als Donoren. zu den Hxdroxyketonen 26 und 20e Alle Umsetzungen wurden sowohl für das ungereinigte Lysat, als auch für gereinigtes Enzym durchgeführt. O O OH HO O CO2 - O O O O O Leervektor H HO 30 Ethylacetat CO2O ThDP MenD 3 Pyruvat CO2- OH 3 Pyruvat OH ThDP O H CO2- OH 30 Ethylacetat Abbildung 60 1 H-NMR (DMSO-d6) der Kondensation der α-Ketosäuren Pyruvat und α-Ketoglutarat (3) im Vergleich mit Lysat aus der Expression des Konstrukts menD_C-term und des Lysats der Leervektorexpression. Nur bei Anwesenheit von dem Enzym MenD kommt es zur Bildung des Hydroxyketons 30. P P B B 62 3. Spezieller Teil Die Kondensation der α-Ketosäuren Pyruvat und α-Ketoglutarat (3), in der 3 seine Donorrolle aufgibt und als Akzeptor fungiert, wurde im Lysat mit überproduzierten MenD und im Lysat der Leervektorexpression nach Extraktion des Ansatzes mit Ethylacetat und 1% Ameisensäure mittels 1H-NMR bestimmt. Ein Umsatz zu 4-Hydroxy-5-oxohexanoat (30) P P wurde nur im Lysat mit überexprimierten MenD nachgewiesen (Abbildung 60) 3. Spezieller Teil 63 3.4.5. In vitro-Darstellung von SHCHC Die postulierte Reaktion von MenD in der Biosynthese, der Umsetzung von Isochorimat (2) zu SEPHCHC (4), wurde in vitro mit gereingtem Enzym angesetzt. Da das Substrat von MenD, 2, sehr instabil ist, wurde es in situ generiert durch Umsetzung von Chorismat (1) mit dem Enzym EntC. Beide Enzyme wurden gleichzeitg zugegeben. Als Puffer wurde der Reaktionspuffer für MenD gewählt. Nach 26 h zeigt das HPLC-Spectrum bei 290 nm deutlich die Bildung von SHCHC (5). Des Weiteren waren sowohl Spuren des Eduktes 1, als auch Spuren von 2 zu erkennen (Abbildung 61). Aufgrund der unterschiedlichen Absorption der einzelnen Substanzen bei der Wellenlänge 290 nm ist es nicht möglich, aus den Integralen die tatsächlichen Mengenverhältnissen der Produkte zu bestimmen. Da das Absorptionsmaximum von 5 bei 290 nm liegt, wird dessen Peak überproportional verstärkt. 1 und 2 absorbieren hingegen schwach bei 290 nm. 5 mAU 175 14.5 min 150 125 100 75 2 50 17.9 min 25 1 20.3 min 0 0 Abbildung 61 5 10 15 20 25 30 35 min HPLC-Chromatogramm bei 290 nm. Aus Chorismat (1) wurde mittels der Enzymen EntC und MenD SHCHC (5) gebildet. Der Enzymansatz wurde lyophilisiert und durch semipräparative HPLC an einer 10 mm RP8 Säule aufgereingt. Der Nachweis von 5 gelang durch 1H-NMR und wurde durch 2D-NMRP P Experimente bestätigt. Das von Guo [18] identifizierte Zwischenprodukt 4 konnte dabei nicht beobachtet werden. 64 3. Spezieller Teil 3.4.6. Untersuchungen zur Selektivität der physiologischen 1,4-Addition Es war Ziel dieser Arbeit, den natürlichen Mechanismus der 1,4-Addition von α-Ketoglutarat (3) an Isochorismat (2) auf andere Substrate zu übertragen. Durch die Übertragung des decarboxylierten 3, formal eines Succinylsemialdehyds, an α,β-ungesättigte Carbonsäuren oder Carbonyle sind durch Katalyse mit MenD theoretisch chirale Verbindungen mit bis zu zwei neuen Stereozentren zugänglich (Abbildung 62). O OH MenD ThDP O R OH R R O O R Abbildung 62 * OH * R R - CO2 α,β−ungesättigte Carbonsäure α-Ketosäure O 1,4-Addukte Allgemeines Reaktionschema für die Bildung vchiralen 1,4-Addukten. Getestete α,β-ungesättigte Carbonsäuren als Substrate Um die Substratbreite bezüglich α,β-ungesättigter Carbonsäuren zu testen, wurden die in Abbildung 63 gezeigten Substanzen 34-38 und 7-9 als mögliche Akzeptoren untersucht. CO2- 34 Abbildung 63 CO2- CO2- 35 36 CO2- 37 38 CO2- CO2- CO2- CO2OH OH NH2 OH OH OH 7 OH OH 9 8 α,β-Ungesättigte Carbonsäuren als potentielle Akzeptorsubstrate für MenD. Die Substanzen 34-36 waren im Handel erhältlich, 7-9 waren durch Fermentation mit E. coliStämmen in vorangegangenen Arbeiten produziert worden [23, 24]. 1,3- Cyclohexadiencarbonsäure (37) wurde in einer 2-stufigen Synthese (siehe unten) [101] und die Carbonsäure 38 durch Hydrierung von 7 an Palladium/Kohle synthetisiert (5.6.3). Es stellte sich heraus, dass MenD hinsichtlich seiner Akzeptanz von nicht-physiologischen α,β-ungesättigte Carbonsäuren äußerst limitiert ist. Die Substanzen 34-38, 8 und 9 wurden nicht umgesetzt (1H-NMR). Umgesetzt wurde ausschließlich die durch Fermentation P P zugängliche Substanz 2,3-CHD (7). Sie unterscheidet sich von dem natürlichen Substrat nur durch das Fehlen des Pyruvylrestes, der als Ether mit der Hydroxygruppe in Position 3 vorliegt. Dass MenD das nicht-physiologische Substrat 7 akzeptierte und umsetzte, 3. Spezieller Teil 65 unterstreicht die Ergebnisse von Guo et al. [18]. Hiernach wird die Elliminierung von Pyruvat nicht von MenD katalysiert, sondern dazu wird ein zweites Enzym, MenH, benötigt [19]. Der Umsatz von 7 zeigt darüber hinaus, dass die Pyruvylgruppe nicht notwendig ist, damit MenD seine katalytische Aktivität ausüben kann. Die Reaktion wurde als Standardkontrolle für die Testung der anderen ungesättigten Carbonsäuren auf 1,4-Addition herangezogen (5.5.1). Notwendige Voraussetzung für die Aktivität scheinen die zwei konjugierten Doppelbindungen darzustellen, die eine Konjugation zwischen der Säurefunktion und der Hydroxylgruppe in Position 3 herstellen. Eine Unterbrechung dieser Konjugation durch Hydrierung der Doppelbindung in Position 4 bei 38 oder das Fehlen der Hydroxylgruppe in Position 2 und 3 bei der Carbonsäure 37 führten zu einem kompletten Aktivitätsverlust. Darüber hinaus ging der Ersatz der Hydroxylgruppe in Position 2 durch eine Aminogruppe bei dem Cyclohexadien 8 mit einem kompletten Aktivitätsverlust von MenD einher. Auch keine Umsetzung durch MenD erfuhren erwartungsgemäß Substanzen mit Veränderungen im Konjugationsmuster der Doppelbindungen wie bei 9. Um zu klären, ob die Anwesentheit der Hydroxylgruppe in Position 2 zur Aktivierung von MenD notwendig ist, wäre die Substanz 5-Hydroxycyclohexa1,3-diencarboxylat (39, Abbildung 64) von Interesse gewesen. CO2* OH 39 Abbildung 64 5-Hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (39). Durch Umsetzung des durch Synthese zugänglichen Racemats wäre außerdem eine Aussage über die vom Enzym akzeptierte Konfiguration der Hydroxylgruppe möglich gewesen. Leider führten verschiedene Syntheseversuche nicht zum Erhalt des Produktes (siehe nächster Abschnitt) und die Frage bleibt deshalb offen. Nicht-physiologische, enzymatische Synthese von 2-Succinyl-5,6- dihydroxycyclohex-2-encarboxylat (41) Die Reaktionsbedingungen für die 1,4-Addition von α-Ketoglutarat (3) an 2,3-CHD (7) wurden eingehend hinsichtlich pH-Optimum und geeignete Pufferkonzentration untersucht. MenD zeigt in einem breiten pH-Bereich von pH 7 bis pH 11 hohe Umsatzraten, mit einem Maximum der Aktivität bei pH 8.5. Der Zusatz von Natriumchlorid (50-200 mM) zeigte keinen Effekt auf den Umsatz. Auch die Pufferkonzentrationen konnten im Bereich von 66 3. Spezieller Teil 25-500 mM Kaliumphosphat variiert werden, ohne dass Aktivitätseinbußen zu erkennen waren. Bei der Durchführung der Experimente wurde zusätzlich der Einfluss von C- und N-terminalem His-tag auf den Umsatz von MenD getestet. Es konnte kein Unterschied in der Aktivität beobachtet werden. Verfolgte man die Umsetzung in situ 1H-NMR-spektroskopisch entstand zunächst die P P Substanz 2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-3-encarbonsäure (40), welche durch Addition des von MenD erzeugten Succinylsemialdehyds gebildet wurde. Nach 3 Tagen ist die Isomerisierung zum thermodynamisch stabileren Product 2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2encarbonsäure (SDHCHC, 41) abgeschlossen (Abbildung 65) gewesen. Die Produkte wurden in sehr reiner Form gebildet (1H-NMR), ein Auftreten von Nebenprodukten konnte nicht P P beobachtet werden, so dass eine weitere Reinigung zur Strukturaufklärung nicht erforderlich war. Die absolute Konfiguration von 41 wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht bestimmt. Da die Bildung der Substanz nach dem gleichen Mechanismus wie SHCHC (5) abzulaufen scheint, liegt die Annahme nahe, dass die neue Substanz die gleiche absolute Konfiguration, 1R, 5S und 6S, aufweist. 7 40 41 Abbildung 65 In situ 1H-NMR-Monitoring der SDHCHC-(41)-Bildung unter Nachweis der tautomeren Zwischenverbindung 40 in D2O. P P B B 3. Spezieller Teil 67 41 ist sehr gut löslich in Wasser, zeigt jedoch innerhalb des Detektionslimits von 1H-NMR P P keine Löslichkeit in DMSO oder Methanol. Um die Substanz als Baustein für die chirale Synthese einsatzfähig zu machen, sollte eine geeignete Methode zur Derivatisierung entwickelt werden. Acetylierungsversuche in Eisessig oder Methylierung mit TMSDiazomethan in Toluol/Methanol schlugen bislang fehl. Synthese von 1,3-Cyclohexadiencarbonsäure (37) In einer Diels-Alder-Reaktion reagieren Acrylsäure mit 1-Acetoxy-1,3-butadien zu 2-Acetoxycyclohex-3-encarbonsäure (42). Nach Pierre-Yves [101] sollte die Acylgruppe bereits unter den Diels-Alder-Bedingungen zu 37 elliminieren. 42 erwies sich jedoch als stabil und isolierbar. Erst unter 30%-iger Schwefelsäure konnte Essigsäure elliminiert werden und 37 erhalten werden. Die Reaktion wurde deshalb als zweistufige Reaktion durchgeführt (Abbildung 66). O O CO2H CO2H 20 h Toluol Reflux 1-Acetoxy-1,3-butadien 25 % Ausbeute O O 42 Acrylsäure CO2H CO2H 30 % H2SO4 O O 20 % Ausbeute 2 h, 40 °C 42 Abbildung 66 37 Zweistufige Synthese von 1,3-Cyclohexadiencarbonsäure (37) über das Zwischenprodukt 2Acetoxycyclohex-3-encarbonsäure (42). Syntheseversuche von 5-Hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (39) Um die Funktion der Hydroxylgruppe in Position 2 des 2,3-CHDs (7) zu bestimmen, ist die Substanz 5-Hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (39) von besonderem Interesse. Zunächst wurde die Vorstufe Methyl 5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (44) in einer zweistufigen Synthese generiert (Abbildung 67). 68 3. Spezieller Teil O O ZnI2 OCH3 Furan COOCH3 O O OCH3 2 Tage 40 °C 43 Methylacrylat LiHMDS THF -70 °C - 0° C innerhalb 1.5 h 50% Ausbeute Abbildung 67 OH 44 48% Ausbeute Zweistufige Synthese von Methyl 5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (44) [102, 103]. In einer Diels-Alder-Reaktion reagierte das Dien Furan mit dem Dienophil Methylacrylat unter Lewissäurekatalyse (ZnI2) zu Methyl 7-oxa-bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-carboxylat (43). B B Das Verhältnis von endo- zu exo-Produkt betrug 1:2 [102]. Die Reaktion wurde von Deshong und Lowmaster auch ohne Katalysator unter hohem Druck durchgeführt [104]. Der Bicyclus 43 wird anschließend durch die nicht nukleophile Base Lithiumhexamethyldisilylazid (LiHMDS) zu 44 gespalten [103]. Die Synthese von 39 wurde auf unterschiedlichen Wegen versucht (Abbildung 68). CO2CH3 (CO)3Fe CO2CH3 OH HCl /THF CO2CH3 PLE CO2CH3 44 CO2CH3 OH 44 OH CO2CH3 CO2CH3 NaOH/MeOH (CO)3Fe (CO)3Fe OH 45 HCl /THF 45 OH LiOH/MeOH 45 Methylbenzoat CO2H CO2CH3 Methylbenzoat Methylbenzoat Benzoesäure CO2H OH 39 Abbildung 68 Versuche zur Synthese von 5-Hydroxycyclohexa-1,3-diencarbonsäure (39) durch Demethylierung von Methyl 5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (44 und 45). Das bereits beschriebene Verfahren nach Floss et al. [105] in THF und HCl lieferte nicht die beschriebenen 64% Ausbeute der freien Carbonsäure, sonderen resultierte in Methylbenzoat. 3. Spezieller Teil 69 Die Methode wurde hinsichtlich des Säuregehaltes variiert, indem die Stoffmenge an Salzsäure bis auf ein Zehntel der angegebenen Menge gesenkt wurde, jedoch ohne Erfolg. Als schonendere Methode bei neutralem pH-Wert wurde versucht mittels Schweineleberesterase zu demethylieren, jedoch stellte 44 für MenD kein Substrat dar. Außer leichter Aromatisierung trat innerhalb von 72 Stunden keine Veränderung des Ausgangssubstrates ein. Um das Diensystem zu stabilisieren, wurde die Substanz schließlich mit Eisencarbonyl komplexiert (45). Mit diesem stabilisierten Edukt wurde die sauere Hydrolyse nach Floss et al. wiederholt, doch auch hier wurde kein Umsatz beobachtet. Alkalische Hydrolyse mit Natriumhydroxid und Methanol führte zu einem Produktgemisch aus Edukt und nach Abspaltung des Eisen(III)-carbonylkomplexes unter Aromatisierung zu Methylbenzoat. Ersetzte man das Natriumhydroxid durch Lithiumhydroxid, gelang die Abspaltung des Komplexes vollständig und es wurde Methylbenzoat und Benzoesäure erhalten. Weitere auf Carboligation getestete α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen Neben αβ-ungesättigten Carbonsäurederivaten wurden auch α,β-ungesättigte Ketone, ungesättigte Carbonsäureester und Ketone getestet. Es konnte für keine der Substanzen ein Umsatz detektiert werden (Tabelle 8). Ungesättigte Ketone Ungesättigte Ester H3CO Ketone O O O (E)-Non-3-en-2-on O (E)-4-Phenylbut-3-en-2-on O Methyl cyclohex1-encarboxylat H3CO O O CH3 CH3 OH 1-Cyclohexenylethanon Tabelle 8 Cyclohexanon Methyl 5-hydroxycyclohexa1,3-diencarboxylat Von MenD nicht akzeptierte ungesättigte Carbonylverbindungen. Acetophenon 70 3. Spezieller Teil 3.5. Arbeiten zur Strukturaufklärung von MenD Um die vorgestellten, interessanten nicht-physiologischen Reaktionen von MenD mechanistisch zu verstehen und vor diesem Hintergrund effizient weiter auszubauen, wurde angestrebt, die Proteinstruktur durch Kristallisation und anschließende Röntgenstrukturanalyse aufzuklären, um Informationen über die außergewöhnlichen Mechanismen im aktiven Zentrum und der Bindungstasche zu erhalten. Eine bekannte Kristallstruktur wäre auch Ausgangsbasis zum Durchführen von Mutationen, um die Produktbildung gezielt beeinflussen zu können. Die Gruppe Sieminska et al. publizierte 2005 Kristalldaten, jedoch ohne abschließend eine Struktur zu erhalten [16]. 3.5.1. Versuche zur Proteinmodellierung mit SWISS MODEL Versuche, die Struktur von MenD mittels dem Programm SWISS MODEL [106] anhand ähnlicher, bekannter Proteinstrukturen zu modellieren gelangen zwar, aber die erhaltene Struktur konnte aufgrund hoher Variabilitäten nicht als zuverlässig gewertet werden. Als Vergleichsstruktur diente das Enzym Benzaldehydlyase (BAL), deren Strukturdaten unter dem Datenbankeintrag 2ag0B.pdb einsehbar sind. 3.5.2. Kristallisation von MenD Die Kristallisation von MenD wurde in Kooperation mit Prof. Gunter Schneider am Karolinska Institut in Stockholm durchgeführt. Stabilität Als Voraussetzung für folgende Kristallisationsexperimente wurde ein Puffer gesucht, in dem MenD eine sehr gute Stabilität aufweist. Das Enzym wurde unterschiedlichen pH-Werten und verschiedenen Puffersalzen in einem Pufferscreen, dem so genannten "Thermofluorbufferscreen" [107] ausgesetzt (Stabilität von MenD in Lösung siehe 5.7.1). Insgesamt zeigt MenD eine sehr gute Stabilität in unterschiedlichen Puffern und noch dazu über einen großen pH-Bereich von pH 6-10. Gewählt wurde schließlich ein Imidazolpuffer (25 mM) mit pH 8, der für alle Konstrukte von MenD eine hohe Stabilität garantierte. Seleno-Methionin-Enzyme und "Multiwavelength Anomalous Diffraction" (MAD) Für Enzyme wie MenD, zu denen kein Enzym mit bekannter Struktur in ausreichender Sequenzhomologie (> 50%) zur Verfügung steht, kommt die Möglichkeit die Struktur mit Hilfe des „Molecular Replacement“, zu lösen nicht in Frage. Bei dieser Methode würden die Daten der bekannten Struktur des homologen Enzymes in die Berechnung der neuen Struktur 3. Spezieller Teil 71 mit einbezogen. Als Alternative wird das Enzym unter Ersatz der natürlichen Aminosäure Methionin durch die künstliche Aminosäure Seleno-Methionin produziert. An den Stellen, an denen das Selenomethionin inkorporiert wurde, werden andere Diffraktionsmuster, so genannte "Multiwavelength Anomalous Diffraction" (MAD) gemessen und in Beziehung zu dem Wildtyp-Enzym gesetzt. C-terminal und N-terminal His-tag tragendes MenD wurde deswegen als Seleno-Methionin-MenD exprimiert (5.7.2). Die Inkorporation des Selenomethionins wurde durch Massenspektrometrie bestätigt. Kristallisationstechniken Voraussetzung zur Röntgenstrukturbestimmung von Proteinen ist der Erhalt von Proteinkristallen. Bei der Kristallisation von MenD kamen zwei der gängigsten Techniken zum Einsatz, die so genannte "Hanging-Drop"- und die "Sitting-Drop"–Methode [108] (Abbildung 69). Deckplättchen Proteinlösung Silikonfett Silikonfett Proteinlösung Reservoir Reservoir “Sitting-Drop”-Methode Abbildung 69 “Hanging-Drop”-Methode Links: "Sitting-Drop"-Methode. Rechts: "Hanging-Drop"-Methode [109]. Beiden Verfahren liegt das Prinzip der Dampfdiffusion zugrunde. Ein Reservoir mit der Kristallisationslösung und ein Tropfen aus Kristallisationslösung und Proteinlösung stehen sich in einem geschlossenen System gegenüber. Die durch Proteinlösung "verdünnte" Kristallisationslösung im Tropfen verdampft kontinuierlich, die Proteinlösung konzentriert sich dabei auf, bis sich zwischen Tropfen und Reservoir ein Gleichgewicht eingestellt hat. Die durch diesen Wasserentzug erhöhte Konzentration an Protein führt im Idealfall zur Bildung eines Fällungskeims aus Protein und es kommt zur Kristallbildung. Die Kristallisation eines Proteins ist, abgesehen von der Methode, von einer Vielzahl von Faktoren abhängig. Ionenstärke, pH-Wert, Fällungsreagenz, Temperatur und Proteinkonzentration sind dabei die wichtigsten Variablen. Die zur Verfügung stehenden Konstrukte von MenD wurden deswegen zuerst in "High-Throughput-Screenings" auf eine Vielzahl von Kristallisationsbedingungen getestet. Hierzu kamen kommerziell erhältliche 72 3. Spezieller Teil "Sparse Matrix Screens" in 96 well Platten zum Einsatz [110]. Das Screening wurde im Sitting-Drop-Verfahren mit folgenden "Sparse Matrix Screens" durchgeführt: Nextal JCSG (Abbildung 70), Nextal Classic suite, Nextal pH clear suite, Nextal PEG suite, Molecular Dimensions PACT suite. Alle enthalten 96 verschiedene Kristallisations-Lösungen, die sich aus Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten und Präzipitationsmitteln wie verschiedene Salze, molekulare Substanzen (z.B. Polyethylenglykole mit unterschiedlichem Polymerisierungsgrad) oder organischen Lösungsmitteln (z.B. 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD), Ethylenglykol und Propanol) zusammensetzen. 96 well Platte A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 Abbildung 70 Salz 0,2M Lithium sulphate 0,2M di-Ammonium hydrogen citrate 0,02M Calcium chloride 0,2M Magnesium formate 0,2M Lithium sulphate Puffer pH 0,1M Sodium acetate 0,1M Citrate 4,5 5,5 4,6 4,2 9,5 8,5 4 9 7,5 6,5 4,2 4,6 7 5 6,5 6,5 4,2 4 7 7,5 4,2 4,5 8,5 6,2 9 4,6 7,5 6,2 4,5 7,5 8,5 8,5 8 6,5 4,6 - 0,1M Sodium acetate 0,1M phosphate/citrate 0,1M CHES 0,2M Ammonium formate 0,2M Ammonium chloride 0,2M Potassium formate 0,2M Ammonium dihydrogen phosphate 0,1M Tris 0,2M Potassium nitrate 0,1M Citrate 0,2M Sodium thiocyanate 0,1M Bicine 0,1M Hepes 0,1M Sodium cacodylate 0,1M Phosphate/citrate 0,1M Sodium acetate 0,2M Magnesium chloride 0,1M Tris 0,1M Citrate 0,2M Magnesium chloride 0,1M Sodium cacodylate 0,2M tri-potassium citrate 0,2M Sodium chloride 1,0M Lithium chloride 0,2M Ammonium nitrate 0,2M Zinc acetate 0,2M Magnesium chloride 0,2M Sodium chloride 0,2M Lithium sulphate 0,2M Magnesium chloride 0,2M Lithium sulphate 0,1M Phosphate/citrate 0,1M Citrate 0,1M Hepes 0,1M Sodium Hepes 0,1M Phosphate/citrate 0,1M Sodium acetate 0,1M Tris 0,1M Na/K phosphate 0,1M Bicine 0,1M Sodium acetate 0,1M Sodium Hepes 0,1M Na/K phosphate 0,1M Sodium acetate 0,1M Hepes 0,1M Tris 0,1M Tris 0,1M Tris 0,17M Ammonium sulphate 0,2M Calcium acetate 0,1M Sodium cacodylate 0,14M Calcium chloride 0,07M Sodium acetate 0,04M Potassium dihydrogen phosphate Präzipitant 50% v/v PEG 400 20% w/v PEG 3000 20% w/v PEG 3350 30% v/v MPD 20% w/v PEG 3350 20% w/v PEG 1000 20% w/v PEG 8000 20% w/v PEG 3350 20% w/v PEG 3350 20% w/v PEG 3350 50% v/v MPD 20% w/v PEG 3350 0,8M Ammonium sulphate 20% w/v PEG 3350 20% w/v PEG 6000 10% w/v PEG 8000 8% v/v Ethylene glycol 40% v/v MPD 5% w/v PEG 8000 40% v/v Ethanol 5% w/v PEG 1000 8% w/v PEG 4000 10% w/v PEG 8000 20% w/v PEG 6000 50% v/v PEG 200 1,6M tri-sodium citrate pH 6,5 20% w/v PEG 3350 20% w/v PEG 8000 20% w/v PEG 6000 20% w/v PEG 3350 10% w/v PEG 6000 0,8M Sodium dihydrogen phosphate 25% v/v PEG 300 10% w/v PEG 3000 20% v/v Ethanol 25% v/v 1,2-propanediol 10% v/v Glycerol 10% w/v PEG 20,000 2% v/v Dioxane 2,0M Ammonium sulphate 10% w/v PEG 1000 10% w/v PEG 8000 24% w/v PEG 1500 20% v/v Glycerol 30% v/v PEG 400 50% v/v PEG 200 30% w/v PEG 8000 70% v/v MPD 20% w/v PEG 8000 40% v/v PEG 400 40% v/v MPD 25,5% w/v PEG 4000 15% v/v Glycerol 40% v/v PEG 300 14% v/v 2-propanol 30% v/v Glycerol 16% w/v PEG 8000 20% v/v Glycerol Nextal JCSG "Sparse Matrix Screen"[111]. Die Proteinlösung wurde mit Hilfe des Mikrodispensers Phoenix (ART ROBBINS INSTRUMENT) vollautomatisch in 3 verschiedenen Konzentrationsverhältnissen von Proteinlösung zu Kristallisationslösung (1:1, 1:2, 2:1) in spezielle Kristallisationsplatten (GREINER), die neben dem Reservoir Platz für drei Tropfen bereitstellten, pipettiert (Abbildung 71). 3. Spezieller Teil Abbildung 71 73 4 1 3 2 Kristallisationsplatte (GREINER) mit Reservoir (1), Tropfen mit Proteinlösung zu Kristallisationslösung 1:1 (2), 2:1 (3), 1:2 (4). Das Screening ergab für C-terminal His-tag tragendes wt-MenD und Seleno-Methionin-MenD folgende Kristallisationsbedingung, unter der sich Kristalle (Abbildung 72) bildeten: 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.2, 25% (v/v) PEG 300. Abbildung 72 Nextal JCSG. Kristallbildung unter Bedingung C6: 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.2, 25% v/v PEG 300. Die Kristalle wurden manuell mit der "Hanging-Drop"-Methode optimiert. Die durch die "Sparse Matrix Screens" ermittelten Bedingungen lassen sich in der Regel nicht exakt auf die größeren Tropfen und Reservoirvolumina übertragen und wurden deshalb nach Erfahrungswerten der Arbeitsgruppe von Prof. Schneider ausgewählt. Der Präzipitant PEG 300 wurde durch PEG 400 ersetzt. Da die Konzentrationen der makromolekularen Lösungen für die Kristallbildung meistens deutlich unter den im "High-Throughput-Screening" ermittelten liegen, wurde ein Bereich von 16% bis 26% stufenweise abgedeckt. Eine erste manuelle Optimierung mit dem pH-Wert 4.2 zeigte vollständige Präzipitation, so dass für die nächste Platte mildere pH-Werte im Bereich von 4.6 bis 5.2 gewählt wurden (Abbildung 73). Die 24 well Platten wurden schließlich mit der jeweiligen Reservoirlösung versehen und die 74 3. Spezieller Teil Ränder mit Silikon eingerieben. Die Tropfen wurden aus 2 µL Proteinlösung ( c(MenD) = 10 mg/mL)) und 2 µL Reservoirlösung auf ein Glasplättchen zusammenpipettiert, welches dann umgedreht auf die Vertiefung gelegt und angedrückt wird. Ebenfalls in regelmässigen Abständen wurden die Tropfen mikroskopisch auf Kristallbildung untersucht. Vielversprechende Kristalle wurden unter der Bedingung 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 20% (v/v) PEG 400 beobachtet (Abbildung 74). % PEG 400 Platte 89 0.1 M Citrat/Phosphat 16 18 20 22 24 26 kleine Kristalle pH 4.6 0.1 M Citrat/Phosphat pH 4.8 Kristalle kleine Kristalle 0.1 M Citrat/Phosphat pH 5.0 0.1 M Citrat/Phosphat pH 5.2 Abbildung 73 Platteneinteilung für manuelle Optimierung. Bedingung 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 20% (v/v) PEG 400 ergab die aussichtsreichsten Kristalle (Abbildung 74). Abbildung 74 Manuell optimierte Kristalle unter 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 20% (v/v) PEG 400. Die Bedingungen 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 22% (v/v) PEG 400, 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.6, 20% (v/v) PEG 400 wiesen ebenfalls Kristallwachstum auf, allerdings waren sie für Messungen aufgrund ihrer kleinen Größe und ihrer unregelmäßigen, äußeren Struktur nicht 3. Spezieller Teil 75 geeignet. Sanders et al. [16] erhielt MenD mit 6-fachen N-terminalen His-tag unter gänzlich anderen Bedingungen: das wt-Holoenzym bildete Kristalle unter Zusatz von 20% (v/v) Ethylenglykol unter Verwendung der "Sitting-Drop" Methode bei einer Tropfengröße von 4 µL (2 µL Proteinlösung und 2 µL Pufferlösung), das Se-Met-Holoenzym bei 30% (v/v) Ethylenglykol als Reservoirlösung und unter Verwendung der "Hanging-Drop" Methode [16]. Röntgenstrukturanalyse Die erhaltenen Kristalle von wt-MenD wurden am Synchrotron in Lund vermessen. Erste X-ray Daten von den oben beschriebenen Kristallen aus wt-MenD mit C-terminalem His-tag (0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 20% (v/v) PEG 400) brachten folgende Ergebnisse: Die Raumgruppen P6122 und P6522 der erhaltenen Kristalle von wt-MenD mit C-terminalem B B B B His-tag sind hexagonal, mit durchschnittlichen Achsenlängen von c = 466 Å und a = 93 Å sowie Winkeln von 90 °, 90 ° und 120 °. In einer Elementarzelle sind 12 Dimere von MenD angeordnet. Project MenD MenD MenD MenD Abbildung 75 Space group P6122/ P6522 P6122/ P6522 P6122/ P6522 P6122/ P6522 Res. Cell 2.8 2.8 2.8 2.7 93.25 93.25 465.68 90 90 120 93.46 93.46 466.26 90 90 120 92.99 92.99 466.95 90 90 120 93.22 93.22 465.30 90 90 120 Vier Datensätze aus der Röntgenstrukturanalyse von wt-MenD mit C-terminalen His-tag am Synchrotron in Lund. 76 3. Spezieller Teil Streuungsmuster Elementarzelle hexagonal c = 466 Å a = 93 Å Abbildung 76 Streuungsmuster von wt-MenD mit C-terminalen His-tag und Abbildung der daraus abgeleiteten Elementarzelle. Die Struktur konnte trotz guter Streuung bis 2.8 Angström aufgrund der großen Elementarzelle nicht gelöst werden. Die Arbeiten wurden von Jolanta Kopec aus dem Arbeitskreis Prof. Schneider (Karolinska Institut, Stockholm) weitergeführt. Durch Änderung der Kristallisationsbedingungen als auch durch Änderung des Expressionssystems sollten kleinere Elementarzellen generiert werden. Sieminska et al. konnten die Kristalle von wt-MenD und Se-Met-MenD ebenfalls nicht klären, obwohl auf den ersten Blick das erhaltene, orthorhombische Kristallsystem P212121 B B B B B geeigneter zur Strukturaufklärung ist, da die Einheitszelle mit nur vier Molekülen in einer B asymmetrischen Einheit und mit Achsenlängen von a = 106.86, b = 143.06, c = 156.85 Å und Winkeln von α = β = γ = 90 °C, deutlich kleiner ist [16]. 3.5.3. Strukturaufklärung von MenD Die Gruppe Hunter, Universität Dundee, UK, veröffentlichte schließlich im Oktober 2008 mit den gleichen Kristalldaten wie im Rahmen dieser Arbeit erhalten, die Kristallstruktur von MenD [79]. Die Kristallisationsbedingungen für das wt-MenD waren ähnlich denen am Karolinska Institut gefundenen: das wt-MenD mit 6-fachen, N-terminalen His-tag kristallisierte Dawson et al. unter 0.1 M Citrat pH 5.6, 14% (v/v) PEG 6000 und 8% 2Pronanol, die Se-Met-Variante unter 0.1 M Tris-HCl pH 8.5, 22% PEG 8000 und 15% Glycerol. Die erhaltene Raumgruppe P6522 mit den Achsenlängen a = b = 93 Å und c = 465 B B Å entspricht dabei den Daten der in Stockholm erhaltenen Kristalle. Unter dem Datenbankeintrag 2jla.pdb ist das Seleno-Methionin-MenD veröffentlicht, unter 2jlc.pdb die 3. Spezieller Teil 77 Struktur des wt-MenD. Modelling der Substratbindung [79] Die Proteinstruktur zusammen mit bisher aufgeklärten Details zur ThDP-Katalyse unterstützt den postulierten zweistufigen Mechanismus von MenD. Nach Decarboxylierung von α-Ketoglutarat (3) und Bildung des ThDP-Adukts kommt es im zweiten Schritt zum nukleophilen Angriff des aktivierten Carbonyl an das C2 Atom des Isochorismats (2). An der Bildung des aktiven Zentrums von MenD sind zwei Untereinheiten, die Einheit A und die Einheit B, beteiligt. Sie bilden zusammen einen Hohlraum mit einem Durchmesser von etwa 8 Å und einer Länge von 15 Å. Basische Aminosäuren (Arg33B, Arg107B, Arg395A, Arg293A, Arg413A und Lys292A) dominieren das aktive Zentrum. Der basische Bereich wird unterbrochen von einem hydrophoben Bereich aus Ile474A, Phe475A und Leu478A, wobei Ile474A und Phe475A an der Cofaktorbindung beteiligt sind. Die genannten Aminosäuren gelten als hoch konserviert in MenD-Sequenzen, nur Arg293A und Lys292A sind austauschbar. Dies ist konsistent mit der Tatsache, dass diese Aminosäuren am weitesten vom aktiven Zentrum entfernt sind. Die stark polaren, basischen Arginine im aktiven Zentrum sprechen für die gute Akzeptanz von saueren, polaren Substraten wie dem Donor 3 und dem Akzeptor 2. Die Substratbindung erfolgt über die sauren Carbonsäurefunktionen von 2, sowie über eine Wasserstoffbrückenbindung der Hydroxylfunktion von 2 zu den basischen Guanidinfunktionen der Arginine. 78 Abbildung 77 Diskussion 3. Spezieller Teil Kristallstruktur 2jlc.pdb des Wildtyp-Proteins von MenD. Einblick in das aktive Zentrum mit den einmodellierten Substraten Isochorismat (2) (gelb) und demThDP-Adukt [79]. der Erweiterung des Substratsspektrums durch gerichtete Mutationen Die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren (Abbildung 77) stellen potentielle Targets für Mutationen dar. Der Austausch der basischen Arginine könnte die Akzeptanz weniger polarer Substrate ermöglichen. Interessant wäre die Ausdehnung des Substratspektrums von dem guten Akzeptor 2,3 CHD (7) auf das Substrat 2,3-CHA (8) (Abbildung 78). Die Bindung der Aminogruppe des Substrats könnte durch den Austausch von einem basischen Arginin gegen eine saure Aminosäure, wie zum Beispiel Aspartat oder Glutamat, ermöglicht werden. Das ebenfalls von wt-MenD nicht akzeptierte Substrat Cyclohexadiencarbonsäure (37), welches keine Hydroxylfunktion trägt, könnte vielleicht durch die Mutation eines Arginins gegen Lysin erleichtert werden. Zusätzlich sollte der hydrophobe Teil durch eine unpolare Aminosäure wie Leucin stabilisiert werden (Abbildung 78). 3. Spezieller Teil Arg O H H N H H N Austausch gegen Asp oder Glu R NH O O 79 R O- O H OH H O+ N H H OH O 8 7 Abbildung 78 Austausch gegen Lys und eventuell Leu R H3N O O H3C H3C R 37 Hypothetische Wechselwirkung von Substraten 2,3 CHD (7) mit wt-MenD, sowie 2,3-CHA (8) und Cyclohexadiencarbonsäure (37) mit ausgetauschten Aminosäuren im aktiven Zentrum. 8 und 37 werden von wt-MenD nicht akzeptiert. Betrachtet man das Modell der Substratbindung von Dawson et al. [79] wären Arg 395A oder Arg107B in der Nähe der Hydroxylgruppe des Isochorismats (2) angeordnet und deswegen potentielle Kandidaten für diese Mutationsexperimente. Um den unpolareren, ungesättigten Ketonen für die Addition von Succinylsemialdehyd zu aktivieren und als Substrate zugänglich zu machen, könnte ein zentrales Arginin gegen ein Cystein ausgetauscht werden, um die Carbonylfunktion über eine H-Brücke zu aktivieren (Abbildung 79). R O Austausch gegen Cys H S R ungesättigte Ketone Abbildung 79 Hypothetische Wechselwirkung von ungesättigten Ketonen mit Aminosäuren im aktiven Zentrum. Für die Bindung der Aldehyde ist wahrscheinlich eher der hydrophobe Teil des aktiven Zentrums verantwortlich. Die breite Akeptanz einer Vielzahl von Aldehyden spricht für ein flexibles aktives Zentrum in diesem Bereich. Um all diese Spekulationen zu testen, soll MenD in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Gunter Schneider strukturell weiter untersucht werden. Durch „Soaking“ können Inhibitoren und Substrate in MenD inkooperiert werden. Daraus könnten genauere Rückschlüsse auf bei der Umsetzung beteiligte Aminosäuren gezogen werden und daraus gezielter Mutanten erzeugt werden, deren Abweichungen vom Ursprungszustand der Struktur wiederum durch Kristallisation und Aufklärung der Proteinstruktur geklärt werden sollen. 80 3. Spezieller Teil 3.6. Alignments 3.6.1. MenD-Proteine aus verschiedenen Organismen MenD-Proteine aus E. coli, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis und Mycobacter tuberculosis wurden mit dem Programm T-Coffee [112] miteinander verglichen (7.3). Wichtige Übereinstimmungen wurden gefunden in der sogenannten "DER"-Stelle zwischen Position 57-59. Mutation des Glutamatrestes E führte zu Inaktivität [13]. Ebenfalls konserviert ist das Glutamin in Position 121, Q118 in der Proteinsequenz. Es wird postuliert, dass an diese Aminosäure der Akzeptor Isochorismat bindet [13]. Mutationen in diesem Bereich könnten Aufschluss über die Bindung der ungesättigten Carbonsäure geben. Ebenfalls konserviert unter den unterschiedlichen MenD-Proteinen ist die Thiaminbindungsstelle mit ihrer Anfangssequenz GDX und den beiden Asparaginen nach weiteren, etwa 25 Aminosäuren [13]. Weitere hochkonservierte Bereiche zeigen sich im Bereich 81-85 und Positionen 449-457. Mutageneseexperimente Diese sein, Regionen um die könnten Funktion der interessante Positionen für einzelnen Aminosäuren im Katalysemechanismus von MenD zu verstehen. 3.6.2. MenD und homologe Proteine MenD-PigD Das Enzym PigD katalysiert die Stetterreaktion, MenD eine Stetter-ähnliche Reaktion. Deswegen wurden die Sequenzen beider Enzyme miteinander verglichen (Alignments7.3). Jedoch lassen sich keine signifikanten Ähnlichkeiten der Sequenzdaten erkennen, die Identität der Enzyme beträgt lediglich 13.4%. Die für MenD charakteristische "DER"-Stelle ist bei PigD verändert - die polare und acide Asparaginsäure ist durch ein unpolares Alanin ersetzt. Die für die Bindung von Isochorismatt postulierte Aminosäure Glutamin wurde durch Alignment in diesem Bereich nicht nachgewiesen. Die Aminosäuresequenz am Beginn der Thiaminbindestelle ist konsistent mit Glycin und Asparaginsäure, es fehlen aber die am Ende der Bindungsstellensequenz, nach etwa 25 Aminosäuren, üblichen mindestens zwei Asparagine. 4. Diskussion und Ausblick 4. 81 Diskussion und Ausblick Die Naturstoffe Chorismat (1) und SHCHC (5) stehen in hoher Reinheit und im Grammmaßstab zur Verfügung. Ideale Bedingungen zur Entwicklung von Folgechemie unter Ausnutzung ihres hohen Funktionalisierungsgrades sind damit gegeben. Die hohe Aromatisierungs- und Dehydratationstendenz beider Subtanzen ist dabei zu beachten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass mit dem ThDP-abhängigen Enzym MenD ein interessanter Biokatalysator für die stereoselektive Synthese zur Verfügung steht. Die natürliche 1,4-Addition konnte auf ein neues Substrat ausgedehnt werden. Das dabei erhaltene Produkt SDHCHC (41) stellt als chirale Substanz mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen einen interessanten Ausgangsstoff für unterschiedlichste Derivatisierungen dar. Aufgrund der extrem hohen Polarität der Substanz sollte dabei die Schützung der Hydroxyl- und Carbonsäurefunktionen im Vordergrund stehen. Ein wichtiger Schritt wäre außerdem die Übertragung der neuen 1,4-Addition von α-Ketoglutarat (3) an 2,3-CHD (7) von in vitro Umsetzungen auf in vivo Ganzzellfermentation. Dazu würde ein 2,3-CHD Produzent [24] mit einer plasmidalen, induzierbaren Expression von MenD gekoppelt werden. Das neue Produkt SDHCHC (41) würde sich im Idealfall, wie die anderen fermentativ gewinnbaren Cyclohexadiene, im Überstand anreichern und im Grammmaßstab isolieren lassen. Die durch 1,2-Addition stereoselektiv erhaltenen α-Hydroxyketone mit einer Carboxypropanoyl-Seitenkette stellen bislang nicht zugängliche, chirale Strukturen dar. MenD ist bislang das einzige Enzym das α-Ketoglutarat (3) decarboxyliert und stereoselektiv an Aldehyde addiert. Die Produkte stellen ideale Ausgangssubstanzen für interessante Folgechemie dar, wie zum Beispiel für die Synthese von chiralen Diolen durch Reduktion oder stereoselektive Einführung einer Aminogruppe durch reduktive Aminierung. Bislang waren nur Produkte in (R)-Konfiguration zugänglich. Ein möglicher Schritt, diese αHydroxyketone auch in (S)-Konfiguration zu erhalten, wäre ein MenD-Analoga aus Tubercularia-Spezies Z1497, aus der das (S)-PAC-Derivat 5-Hydroxy-4-oxo-5- phenylpentansäure (13) isoliert wurde [65], zu identifizieren, zu klonieren und auf seine C-C-Bindungsknüpfungseigenschaften zu untersuchen. Die aufgeklärte Struktur von MenD kann in verschiedener Weise zur Erweiterung der enzymatischen Stetterreaktion und zum Ausbau der Biokatalyse mit MenD genutzt werden. Strukturvergleich mit anderen bekannten Kristallstrukturen kann zur Identifizierung von Enzymen genutzt werden, die aufgrund ihrer Struktur ebenfalls Potential zu einer Stetter- 82 4. Diskussion und Ausblick ähnlichen Reaktion haben. Des Weiteren kann das Substratspektrum von MenD selbst durch gezielte Mutationen erweitert werden. Um die für die Reaktion entscheidenden Aminosäuren zu erkennenm, sollten interessante Substrate wie 2,3-CHD (7) und Inhibitoren mit MenD co-kristallisiert werden. Bindungsstellen und Umgebung der Substrate könnten so erkannt werden. Durch gezielte Mutation des wt-MenD könnte ein stereoselektiver Zugang zu bislang schwer oder gar nicht zugänglichen, neuen 1,4-Diketonen erlangt werden. 5. Experimenteller Teil 5. 83 Experimenteller Teil 5.1. Chemikalien Chemikalien wurden, soweit nicht anders angegeben, von den Firmen Aldrich, Fluka und Acros bezogen und, soweit nicht anders angegeben, ohne weitere Reinigung verwendet. Die verwendeten α-Ketosäuren wurden in Form ihrer Natriumsalze eingesetzt. 5.2. Analytik NMR NMR-Spektren wurden mit dem Spektrometer "Bruker DRX 400" der Fa. Bruker (1H: 400 MHz, P P P 13 C: 100.6 MHz) bei 24 °C, soweit nicht anders angegeben, aufgenommen. P Angegeben werden die chemischen Verschiebungen δ in ppm, Kopplungskonstanten J in Hz sowie Multiplizitäten: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), q (Quartett), qui (Quintett), m (Multiplett). Fallen Kopplungen zu scheinbar höheren Multiplizitäten zusammen, wird die beobachtete Multiplizität in Anführungszeichen angegeben. Die Spektren wurden auf das jeweilige Lösungsmittelsignal kalibriert (1H-NMR: Chloroform 7.28, Wasser 4.81, Methanol P P 3.31, Dimethylsulfoxid 2.50, Benzol 7.15; 13C-NMR: Chloroform-d1 77.0, Methanol-d4 49.2, P P B B B B Dimethylsulfoxid-d6 39.5, Benzol-d6 128.4). Für quantitative Messungen wird 4 mM 3-(TriB B B methylsilyl)-propionsäure-2,2,3,3-d4 B B Natriumsalz B (TSP) als interner Standard in Deuteriumoxid zugesetzt. Zur Unterstützung der Signalzuordnung wurden zusätzlich (H,H)COSY-, DEPT-, HMBC-, HSQC-, NOESY-, ROESY- und TOCSY-Experimente durchgeführt. GC-MS GC-MS-Analysen wurden mit dem "HP 6890 N Series" GC-System sowie dem "HP 5973 Network Mass Selective Detector" der Fa. AGILENT (HP) mit Elektronensprayquelle EI-MS (70 eV, EI) durchgeführt. Es wurde die Säule FS-Supreme-5 der Firma CSCHROMATOGRAPHIE-SERVICE (L = 30 m, innerer Durchmesser = 0.25 mm, Filmdicke = 0.25 µm) eingesetzt. Das Injektionsvolumen betrug 1 µL Daten der eingesetzten Methoden: Helium als Trägergas (1.0 mL/min, konstant), Injektor im Splitmodus (41.7:1, 250 °C), TGC B B (Injektor) = 250 °C, TMS (Ionenquelle) = 200 °C, B B detektierter Massenbereich für M1-300/ M1-DMSO: 50-300 amu. Temperaturprogramm (Ofen) für M1-300/ M1-DMSO: T0 min = 60 °C, T3 min = 60 °C, T14 min = 280 °C (Aufheizrate: B B B B B B 84 5. Experimenteller Teil 20 °C/min), T19 min = 280 °C. Ein Solvent Delay von 3.75 min für M1-300 und von 4.5 min B B für M1-DMSO. GC an chiraler Phase GC-FID-Chromatogramme wurden mit dem Gerät "GC-2010" mit dem Injektor "AOC-20i" der Fa. SHIMADZU aufgenommen, das mit einem Flammenionisationsdetektor (FID, Makeup Gas: N2/ Luft, Makeup Flow: 30.0 mL/min, H2-Flow: 40.0 mL/min, Sampling Rate: 40 ms) B B B B ausgestattet war. Als chirale stationäre Phase wurde die FS-Lipodex D-Säule (Heptakis-(2,6di-O-pentyl-3-O-acetyl)-β-cyclodextrin, L = 50.0 m, innerer Durchmesser = 0.25 mm, Filmdicke = 1.00 µm, maximale Säulentemperatur: 280 °C) eingesetzt. Weitere Daten der eingesetzten Methoden waren: Helium als Trägergas (6.0 mL/min, konstant), Injektor im Splitmodus. Das jeweils verwendete Temperaturprogramm (Ofen) ist bei den einzelnen Verbindungen aufgeführt. HPLC-DAD HPLC-DAD-Analysen wurden mit dem "HP 1100" Chromatographiesystem der Fa. AGILENT (HP) sowohl an "Normal Phase" als auch an "Reversed Phase" (RP, Umkehrphase) durchgeführt. Für Chromatographie an "Normal Phase" wurden als stationäre Phasen die chiralen Chromatographiesäulen Chiralcel OD-H (DAICEL INC., 250 · 4 mm), Chiral OM (CS- CHROMATOGRAPHIE-SERVICE, 250 · 4 mm), Chiralcel OB (DAICEL Chiralpak AD (DAICEL INC., INC., 250 · 4 mm) und 250 · 4 mm) verwendet. Die Chiral OM Säule war mit einer entsprechenden Vorsäulenkartusche (CS-CHROMATOGRAPHIE-SERVICE, 50 · 4 mm), die Chiralcel OB Säule mit einer entsprechenden Vorsäule (DAICEL INC., 50 · 4 mm) ausgerüstet. Die mobile Phase bestand aus Gemischen von 2-Propanol und n-Hexan im Verhältinis von 3:97 bis 10:90 je nach Trennergebnis bei einer Flussrate von 0.75 mL/min. Die genauen Parameter werden bei den getrennten Verbindungen genannt. Die Identifizierung und Charakterisierung der Produkte, sowie die Ermittlung der Enantiomerenüberschüsse (eeWerte) erfolgte anhand der UV-Absorptionen bei den Wellenlängen λ = 210, 230, 254 und 280 nm. Bei Verwendung der Umkehrphase erfolgte die Trennung über eine LiChrospher® 100 RP 8 EC 5µ Chromatographiesäule (250 mm × 3 mm, 5 µm Partikelgröße) der Fa. CSCHROMATOGRAPHIE-SERVICE bei einer Säulentemperatur von 23 °C. Als Vorsäule wurde eine LiChrospher® 100 RP 8 EC 5µ Chromatographiesäule (20 mm × 3 mm, 5 µm Partikelgröße) der Fa. CS-CHROMATOGRAPHIE-SERVICE verwendet. Als mobile Phase wurden soweit nicht 5. Experimenteller Teil 85 anders angegeben ein Gradient aus A: Milliporewasser mit 0.1% Trifluoressigsäure (V/V) und B: Methanol gefahren. Begonnen wird mit 100% A. 5 min nach der Injektion wird ein linearer Gradient bis zu einem Anteil von 64% B innerhalb von 30 min gefahren. Nach insgesamt 35 min wird innerhalb 1 min auf die Ausgangskonzentration 100% A zurückgesetzt und weitere 4 min fortgesetzt. Die Flussrate betrug konstant 0.45 mL/min (Methode [anja3.m]). P P Abweichungen von dieser Methode sind bei den Verbindungen angegeben. Für die B B Identifizierung und Charakterisierung der Produkte wurde jeweils das UV-Spektrum (190400 nm) herangezogen. HPLC-MS-MS HPLC-MS-MS-Analysen wurden ebenfalls sowohl an chiraler "Normal Phase" als auch an "Reversed Phase" (Umkehrphase) mit dem "HP 1100" Chromatographiesystem der Fa. AGILENT (HP) durchgeführt, das mit einem Massenspektrometer API2000 verbunden war. Wahlweise wurde mit einer PhotosprayTM Quelle der Fa. APPLIED BIOSYSTEMS und der P P P P "Gradient Pump 2249" der Fa. PHARMACIA zur "Dopant" (Toluol) Infusion für "Normal Phase" oder einer TurbolonSprayTM Quelle der Fa. APPLIED BIOSYSTEMS für Umkehrphase P P gearbeitet. Stationäre und mobile Phasen entsprechen denen unter der HPLC-DAD erwähnten. MS/MS–Parameter unterscheiden sich für chirale "Normal Phase" (Tabelle 9) und Umkehrphase (Tabelle 10). Nebulizer gas (Gas 1) (psi) 30 Temperature (°C) 350 Auxiliary gas (Gas 2) (psi) 30 Declustering potential (DP) (V) 21 Lamp gas 1.0 Focusing potential (FP) (V) 300 Curtain gas (psi) 10 Entance potential (EP) (V) 9.5 Transfer voltage (V) +/-1200 Dopant (toluene) (% of total flow) 10 im MRM Modus: Collision gas (CAD) (psi) 4 Collision cell exit potential (CXP) 2.0 Tabelle 9 Betriebseinstellungen des API 2000 mit PhotosprayTM. P P 86 5. Experimenteller Teil Nebulizer gas (Gas 1) (psi) 30 Temperature (°C) 400 Auxiliary gas (Gas 2) (psi) 30 Declustering potential (DP) (V) 20 Curtain gas (psi) 10 Focusing potential (FP) (V) 300 Transfer voltage (V) -4500 Entance potential (EP) (V) 9.5 +5500 im MRM Modus: Collision gas (CAD) (psi) 4 Collision cell exit potential (CXP) 2.0 Betriebseinstellungen des API 2000 mit TurbolonSprayTM. Tabelle 10 P P Für die Identifizierung und Charakterisierung der Produkte und Ermittlung der Enantiomerenüberschüsse (ee) wurden sowohl der "Q1 Scan" (Q1), der "Product Scan" (MS2) als auch der "MRM Scan" (MRM) herangezogen. Ob die Substanz im negativen Modus unter Abspaltung eines Protons oder im positiven Modus unter Aufnahme eines Protons besser ionisiert wird, wurde für jede Substanz vor Durchführung der Experimente im "Q1 Scan" getestet. Die jeweiligen Parameter sind bei den Verbindungen aufgeführt. Circular Dichroismus (CD) CD-Spektren wurden mit dem Spektralpolarimeter "J-810" der Fa. JASCO INTERNATIONAL mit folgenden Parametern gemessen: Raumtemperatur, Länge der Zelle = 1.0 cm, Empfindlichkeit = Standard, Messgeschwindigkeit = 100 nm/min, Daten Abstand = 1 nm, Bandbreite 1 nm, Resonanz = 2 s, Akkumulation = 3. Als Lösungsmittel wurde Acetonitril verwendet. Aufgeführt sind die Extrema (Cotton-Effekte) der molaren CD-Spektren mit den dazugehörigen Intensitäten ∆ε in cm2 · mmol-1 und Wellenlängen λ in nm in einem P P P P Wellenlängenbereich von 200 bis 350 nm. UV/VIS Kinetik-Messungen (Decarboxylaseaktivität), Bradford-Analytik (Proteinkonzentration) und die optische Dichte (OD) von Bakterienkulturen erfolgten mit dem Spektrophotometer "UV mini – 1240" und dem temperierbaren Spektrophotometer "UV1650 PC" der Fa. SHIMADZU. Polarimetrie Die optische Drehung wurde mit dem Polarimeter "Modell 341" der Firma PERKIN ELMER bestimmt. Angegeben wird die Messung der spezifische Drehung [α]DT mit der Natrium DB PB P Linie bei λ = 589 nm. Zur Bestimmung der optischen Rotationsdispersion wurde zusätzlich die Drehung bei λ = 578 nm, 546 nm, 435 nm und 365 nm bestimmt. 5. Experimenteller Teil 87 IR ATR-IR-Spektren wurden mit dem Infrarot-Spektrometer "Perkin-Elmer 1605 FT" (P1065) der Fa. PERKIN ELMER von einem Film der Reinsubstanz aufgenommen. Angegeben werden die Wellenzahlen ν in cm-1. P P Dünnschichtchromatographie Die analytische Dünnschichtchromatographie erfolgte auf DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 der B B Fa. MERCK. Die Detektion erfolgte über Fluoreszenzlöschung (λ = 254 nm) sowie durch Eintauchen in eine Anisaldehyd-Lösung (1.5 mL Anisaldehyd, 3 mL H2SO4, 300 mL Eisessig) B B B B oder Cer-Molybdat-Färbelösung (0.8 g Ce(SO4)2 · 4 H2O, 20 g (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O, B B B B B B B B B B B B B B B B 20 g H2SO4, 400 mL H2O) und anschließendem Entwickeln der DC-Platte durch Erhitzen mit B B B B B B einer Heißluftpistole. Säulenchromatographie Präparative Trennungen erfolgten durch Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel 60 der Fa. MERCK mit der Korngröße von 40-63 µm. 88 5. Experimenteller Teil 5.3. Molekularbiologische und biochemische Arbeiten 5.3.1. Verwendete E. coli-Stämme, Vektoren und Plasmide Stamm Genotyp Referenz supE44 ∆lacU169 (φ80lacZ∆M15) hsdR17 DH5α STRATAGENE recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 supE thi-1 ∆(lac-proAB) ∆(mcrB-hsdSM)5 (rKB TG1 PB mK-) [F´ traD36 proAB lacIqZ∆M15] P B P PB P recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 XL1 blue STRATAGENE P q relA1 lac [F’ proAB lacI Z∆M15 Tn10 (TetR)] STRATAGENE P P BL21(DE3)pLysS P F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) P P B B P B PB P B PB pLysS(cmR) P BL21(DE3) P F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3)[lacI P P STRATAGENE P B B B PB P B PB P lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) STRATAGENE ∆(srlR-recA)306::TnlO, ∆(pheA-tyrA-aroF), KA12 thi-1, endA-1, hsdRl7, ∆(argF-lac) U169, P. Kast [88] supE44 W3110 F1 F- λ- IN(rrnD-rrnE) prototrophe Bachmann [113] W3110, wild type with in-frame-deletion of G. Sprenger, N. menC Trachtmann [90] P P P P F96 lac::(Ptac- aroFBL+)∆ (pheA tyrA aroF) B F97 B ∆ (entCEBA)::cat (CmR) F96 P G. Sprenger, N. P KmR > transformation with pC120 AmpRwith P P P P Trachtmann [90] in-frame-deletion of menC Tabelle 11 Verwendete E.coli-Stämme. Vektor genetische Marken pET22b(+) Ampr, oripBr322, PT7lac, C-terminal 6x His NOVAGEN pET19b Ampr, oripBr322, PT7lac, N-terminal 10x His NOVAGEN Tabelle 12 P P P P B B B Verwendete Vektoren. B B Referenz B B B 5. Experimenteller Teil 89 Plasmid Genotyp pJF119EH1 AmpR, lacIq, Ptac, ori colE1 P P P P P Referenz entC (1209 bps) aus E.coli kloniert in pDF2 pJF119EH1 (BamHI/PstI) pC120 pJF119EH1-entC-menD; pET22b(+) mit entC (1176) aus pDF2 kloniert entC_C-term über NdeI/ XhoI, C-terminal 6x His pET22b(+) mit menD aus pC120 kloniert über menD_C-term NdeI/ XhoI, C-terminal 6x His menD_N-term_1 J. P. Fürste [83] P pET19b mit menD, aus pC120 kloniert über NdeI/ XhoI, N-terminal 10x His D. Franke [82] S. Kozak [114] diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit pET19b mit menD_stop, aus pC120 menD_N-term_2 kloniert über NdeI/ XhoI mit Insertion eines diese Arbeit Stopcodons am C-terminus, N-terminal 10x His Tabelle 13 Verwendete rekombinante Plasmide. 5.3.2. Stammhaltung Es wurde das LB-Medium (Lennox) und zur Herstellung von Kultivierungsplatten das LBAgar-Medium der Fa. ROTH verwendet. Die Einwaagen zur Herstellung der Lösungen erfolgten nach den Angaben der Hersteller. Die Anzucht der E. coli Stämme erfolgte aerob bei 37 °C auf Agarplatten und in Flüssigkulturen unter Schütteln bei 120 UpM. Zur kurzfristigen Lagerung wurden Flüssigkulturen bei 4 °C bis zu einer Woche, auf Agarplatten bis zu 8 Wochen gehalten. Die langfristige Stammhaltung erfolgte in Form von Glycerin-Dauerkulturen. Hierzu wurden Übernachtkulturen mit 20% (V/V) sterilem Glycerin versetzt und bei -20 °C und -80 °C gelagert. 5.3.3. Allgemeine molekularbiologische Arbeitstechniken Verwendete Enzyme Restriktionsenzyme für die Klonierungsarbeiten (XhoI, NdeI), T4 DNA Ligase, Phusion™ Polymerase und High-Fidelity (HF) DNA Polymerase wurden von der Fa. NEW ENGLAND BIOLABS (NEB), Pfu DNA Polymerase von PROMEGA und PfuTurbo DNA Polymerase von 90 5. Experimenteller Teil STRATAGENE bezogen. Für die Isolierung des produzierten MenD und EntC wurde Lysozym der Fa. FLUKA und für enzymatische Tests Pferdeleber ADH (HLADH) der Fa. SIGMAALDRICH verwendet. Amplifikation und Reinigung von Plasmid-DNA Die erhaltenen Plasmide mit den Genen entC und menD wurden jeweils in DH5α–Zellen amplifiziert und mit "Wizard SV DNA Purification System" der Fa. PROMEGA nach Herstellerangaben gereinigt. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Herstellung der rekombinanten Plasmide entC_C-term, menD_C-term, menD_Nterm1 und menD_N-term2 Der das Gen entC tragende DNA-Abschnitt auf dem Plasmid pDF2 und der das Gen menD tragende Abschnitt auf dem Plasmid pC120 wurden durch PCR amplifiziert. Die dafür konstruierten Primer tragen jeweils die Erkennungssequenzen für die Schnittstellen von NdeI und XhoI (Tabelle 14, Tabelle 15). Sequenz (5’-3’ Richtung) Name Tm [C°] B B Schnittstelle entC _forward GGCATTCAT[ATGGATACGTCAC TGGCT] 62.0 NdeI entC _reverse GGCATTCTCGAG[ATGCAATCC AAAAACGTT] 67.7 XhoI Tabelle 14 Verwendete Oligonukleotide für entC. Die Restriktionsschnittstellen sind fett geschrieben. Sequenz (5’-3’ Richtung) Name Tm [C°] B B Schnittstelle menD _forward GGCATTCAT[ATGTCAGTAAGCG CATTT AAC] 61.9 NdeI menD _reverse GGCATTCTCGAG[TAAATGGCTT ACCTG CGCCAG] 72.5 XhoI menD _reverseSTOP GGCATTCTCGAG[TCATAAATG GCTTACCTG CGC] 71.3 XhoI menD_N_qc_f [CTGGCGCAGGTAAGCCATTTAT AA]CTCGAGGATCCGGCTGCT 79.0 NdeI menD_N_qc_rev AGCAGCCGGATCCTCGAG[TTA TAAATGGCTTACCTGCGCCAG] 79.0 XhoI Tabelle 15 Verwendete Oligonukleotide für menD. Die Restriktionsschnittstellen sind fett geschrieben. 5. Experimenteller Teil 91 Alle Oligonukleotide wurden von THERMO ELECTRON CORPORATION synthetisiert. Durch Einführung der XhoI und NdeI Schnittstellen gelang damit die Einführung eines Cterminalen His-tag unter Rekombination mit dem pET22b(+) Vektor und eines N-terminalen His-tag unter Verwendung des pET19b Vektors. Als PCR-Amplifikationssysteme wurde das "Gene Amp PCR System 2400" der Fa. PERKIN ELMER oder der "Gradient PCR cycler" der Fa. EPPENDORF eingesetzt, wobei die Temperaturprofile sowie die Dauer und Anzahl der Zyklen angepasst wurden. Die gewählte "Annealingtemperatur" richtete sich nach den Schmelztemperaturen (Tm) der Oligonukleotide B B und wurde über einen Temperaturgradienten ermittelt. Die PCR-Ansätze mit dem Gesamtvolumen von 50 µL wurden in dem entsprechenden Puffer des Herstellers wie folgt angesetzt: entC_C-term: 2 µL Matrizen-DNA (pDF2, Konzentration n.b.) 50 pmol von jedem Primer (entC_forward, entC_reverse) 1.5 mM dNTPs 5 µL Puffer 10x 40 µL nukleasefreies H2O B B 0.5 U Pfu DNA Polymerase. Temperaturschema: T (°C)/t: 95 °C/2 min│[95 °C/45 s│55 °C/30 s│72 °C/4 min]20│72 °C/10 min│4 °C/∞. B B menD_C-term: 4 µL Matrizen-DNA (pC120, Konzentration n.b.) 50 pmol von jedem Primer (menD_forward, menD_reverse), 1.5 mM dNTPs 5 µL Puffer 10x 38 µL nukleasefreies H2O B B 0.5 U HF DNA Polymerase. Temperaturschema: T (°C)/t: 94 °C/5 min│[94 °C/30 s│55 °C/30 s│72 °C/4 min]25│72 °C/5 min│4 °C/∞. B menD_N-term1 2 µL Matrizen-DNA (pC120, c ~ 100 ng/µL) 100 pmol von jedem Primer (menD_forward, menD_reverse) 1.2 mM dNTPs 5 µL Puffer 10x 40 µL nukleasefreies H2O B B B 92 5. Experimenteller Teil 1.5 U Pfu DNA Polymerase. Temperaturschema: T (°C)/t: 94 °C/4 min│[94 °C/30 s│65 °C/30 s│72 °C/4min]25│72 °C/10 min│4 °C/∞. B B menD_N-term2 Ziel war es ein Stop-Codon am C-terminus einzufügen um das Anfügen zusätzlicher Aminosäuren bedingt durch den Vektor zu vermeiden. Dazu wurden zwei Strategien verwendet: 1) Durch Verwendung der Primers menD_reverseSTOP wird mit der Amplifikation ein StopCodon am C-terminus eingefügt. 4 µL Matrizen-DNA (pC120, c ~ 30 ng/µL) 50 pmol von jedem Primer (menD_forward, menD_reverseSTOP) 1.5 mM dNTPs 5 µLPuffer 10x 38 µL nukleasefreies H2O B B 0.5 U Phusion DNA Polymerase. Temperaturschema: T (°C)/t: 94 °C/2 min│[94 °C/30 s│55 °C/30 s│72 °C/2 min]25│72 °C/10 min│4 °C/∞. B B 2) Durch Quickchange PCR wurde nachträglich an dem Konstrukt menD_N-term1 ein Stopcodon eingefügt. 3 µL Matrizen-DNA (menD_N-term1, c = 100 ng/µL) 100 pmol von jedem Primer (menD_N_qc_f, menD_N_qc_rev) 2.0 mM dNTPs 2 mM DMSO 2 mM MgCl2 B 5 µL Puffer 10x 34 µL nukleasefreies H2O B B 0.5 U PfuTurbo DNA Polymerase Die Annealingtemperatur bei der Quickchange PCR liegt tiefer als üblich und die Zeiten der einzelnen Phasen sind länger, da bei dieser Methode das gesamte Plasmid reproduziert wird: T (°C)/t: 98 °C/5 min│[95 °C/1 min│52 °C/1 min│72 °C/7 min]20│72 °C/6 min│8 °C/∞. B Die erhaltenen PCR-Amplifikate wurden Bestandteilen des PCR-Ansatzes getrennt. mittels B Agarose-Gelelektrophorese von 5. Experimenteller Teil 93 DNA-Gelelektrophorese Die Agarose-Gelelektrophorese wurde einerseits zur Analyse von linearisierter DNA, andererseits zur gezielten Isolierung von DNA-Fragmenten durchgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte mit dem Gel-System der Fa. PEQLAB bei 100 V nach Sambrook et al. in 1%igen (m/V) Agarosegelen. Als Elektrophoresepuffer wurde Tris-AcetatEDTA-Puffer (TAE-Puffer: Tris-Acetat (40 mM), EDTA (1 mM), pH 8) verwendet und Ethidiumbromid diente als Färbungsmittel (2 µL 10%ige Ethiudiumbromidlösung auf 50 mL geschmolzene Agarose in H2O). Die Proben wurden mit "Loading Dye Solution" der Fa. B B FERMENTAS versetzt. Als Größenstandard wurden je nach Größe des Fragments verschiedene DNA-Leiter der Fa. PEQLAB und der Fa. FERMENTAS verwendet. In vitro Rekombination von DNA Die Restriktion erfolgte durch sequenzspezifisches Schneiden der Plasmid-DNA mit den Enzymen NdeI und XhoI. Die Ligation der DNA-Fragmente wurde mit T4 DNA-Ligase nach den Angaben des Herstellers (Fa. NEW ENGLAND BIOLABS) durchgeführt. Dabei wurde das Verhältnis Vektor zu DNA nach Konzentrationsbestimmung und unter Einbeziehung der Größenverhältnisse von Vektor und Insert von 1: 20 bis 1:1 variiert, bei der Ligation von menD_N-term2 von 1:60-1:80. Restriktionsanalyse Zur Restriktionsanalyse erfolgt das sequenzspezifische Schneiden der Plasmid DNA mit den Enzymen NdeI und XhoI. Die Restriktionsansätze umfassten mindestens ein Volumen von 10 µL. Die Menge an eingesetztem Enzym betrug 2-5 UNEB. 1 UNEB ist definiert als die P P P P Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 µg λ-Phagen-DNA unter Standardbedingungen des Herstellers zu verdauen. Der Ansatz wurde 2 Stunden bei 37 °C und 300 Upm inkubiert und anschließend 15 Minuten bei 65 °C inaktiviert. Nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese wurde die korrekte Insertion anhand des charakteristischen Fragmentierungsmusters verifiziert. Reinigung von PCR- und Restriktionsansätzen Plasmid-DNA aus E. coli-Zellen und Agarosegelen wurde unter Verwendung des "Wizard SV DNA Purification System" der Fa. PROMEGA nach Herstellerangaben gereinigt. 94 5. Experimenteller Teil Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA Die Herstellung kompetenter Zellen der E. coli-Stämme erfolgte nach der Calciumchloridmethode. Bis zur Verwendung wurden die kompetenten Zellen bei -80 °C gelagert. Für die Transformation wurden 5 µL des Klonierungsprodukts beziehungsweise der Plasmid-Lösung (Konzentration: ca 100 ng/µL) zu 200 µL kompetenten Zellen gegeben. Die Transformation der kompetenten Zellen erfolgte durch Hitzeschock für 30 s bei 42 °C und sofortiger Kühlung für 1 min auf Eis. Es wurden 800 µL LB-Medium zugegeben und für 1 h bei 37 °C und 300 UpM inkubiert. Nach dem Ausstreichen der transformierten Bakterienkultur auf Antibiotika-haltigen (Ampicillin 100 µg/mL) LB-Agar-Platten erfolgte die Inkubation über Nacht bei 37 °C. Die nach der Transformation in die E. coli-Stämme DH5α, XL1 blue, TG1, BL21(DE3)pLysS undBL21(DE3) erhaltenen Bakterienkolonien wurden nach Kultivierung und DNA-Extraktion mittels Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des Plasmids geprüft. Zur Proteinexpression wurde das entsprechende Plasmid in E. coli XL1 blue, BL21(DE3)pLysS und BL21(DE3) Zellen transformiert. DNA-Sequenzierung Die kompletten DNA-Sequenzierungen der entC- und menD-Konstrukte wurden von der Fa. 4BASELAB durchgeführt. Analyse der DNA Sequenzdaten erfolgte mittels Bioedit® und Clone P P Manager®. P P Zentrifugation Bis zu einem Volumen von 50 mL pro Falcon wurde die Zentrifuge "5804 R" mit dem Rotor "F-34-6-38" der Fa. EPPENDORF genutzt, für grössere Volumina bis 400 mL kam die Zentrifuge "5810 R" mit dem Rotor "A-4-81" der Fa. EPPENDORF zum Einsatz. Gefriertrocknung Zur Lyophilisation wurde die Gefriertrocknungsanlage "Alpha 2-4 LD" der Fa. CHRIST GMBH verwendet. 5.3.4. Proteinbiochemische Methoden Expression Flüssigkulturen zur Produktion von EntC und MenD in den erzeugten rekombinanten E. coliStämmen wurden in LB-Medium in Schikanenkolben auf dem "Multitron" Inkubationsschüttler der Fa. INFORS bei 37 °C und 120 UpM inkubiert. Hauptkulturen wurden jeweils aus einer Übernachtkultur mit 1/100 Volumen angeimpft. 5. Experimenteller Teil 95 Zur Expression der Gene wurde die T7-RNA-Polymerase bei dem Erreichen einer OD600 = 0.6 durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG der Fa. ROTH) B B mit einer Endkonzentration von 0.4-1 mM induziert, die anfängliche Inkubationstemperatur von 37 °C auf 20 °C heruntergesetzt und anschließend 12 h inkubiert. Die Stämme mit Plasmid-kodierten Resistenzmarkern wurden stets unter Selektionsdruck durch Zugabe von Ampicillin (100 µg/mL) kultiviert. Nach Abbruch der Expression wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 UpM pelletiert. Zellaufschluss Zum Zellaufschluss wurde das erhaltene Zellpellet in 5% des ursprünglichen Kulturvolumes unter Verwendung von "Equilibrierungspuffer" resuspendiert. Die Zusammensetzung des Puffers ist für EntC in Tabelle 16, für MenD in Tabelle 17 aufgelistet. Nach Zugabe von 1 mg/mL Lysozym (aus Hühnereiweiss, 85400 U/ mg) wurden die Zellen mit dem Ultraschall-Desintegrator BRANSON Sonifier II "Modell W-250" der Fa. HEINEMANN unter Eiswasserkühlung aufgeschlossen (Duty Cycle = 70%, Output Control = 5; 5 x 5 s mit je 30 s Pause). Der Zellaufschluss wurde 1 Stunde unter Eiswasserkühlung inkubiert, die unlöslichen Komponenten durch Zentrifugation (20 min, 6000 UpM, 4 °C) abgetrennt und das dabei erhaltene Lysat aufgereinigt. Proteinreinigung Die Reinigung der Proteine als C-terminale beziehungsweise N-terminale Poly-HistidinFusionsproteine erfolgte über IMAC (Immobilisierte-Metall-Affinitäts-Chromatographie) nach Porath et al [87]. Sie basiert auf der Chelat-Komplex Bildung von sechs oder zehn aufeinander folgenden Histidin-Resten mit immobilisierten, zweiwertigen Ionen. Die Elution der Fusionsproteine erfolgt durch Verdrängen mittels hoher Imidazol-Konzentrationen. Die Detektion der verschiedenen Proteine während der Chromatographie gelingt mit Hilfe eines UV-Detektors (λ = 254 nm) oder durch simultanes Tüpfeln von Aliquots (5 µL) der Fraktionen mit Bradfordreagenz (100 µL) in 96 Well Platten. Die Reinigung von EntC und MenD erfolgt nach dem gleichen Vorgehen, nur die verwendeten Puffer unterscheiden sich. Für EntC sind die entsprechenden Puffer in Tabelle 16 zusammengefasst, für MenD inTabelle 17. Semipräparativer Maßstab: Bei Volumina < 20 mL Lysat erfolgt die Reinigung mittels "Poly-prep Chromatographiesäulen" (20 mL Kapazität) der Fa. BIORAD über "Gravity flow". Hierzu wurden 2 mL Ni-NTA (Superflow der Fa. QIAGEN) in eine kleine Säule gefüllt und mit "Equilibrierungspuffer" (Tabelle 16, Tabelle 17) gespült. Das Lysat wird mit Ni-NTA für eine 96 5. Experimenteller Teil Stunde inkubiert. Anschließend wurde mit "Waschpuffer" gewaschen und das Protein mit "Elutionspuffer" eluiert. Die einzelnen Fraktionen (1 mL) werden über Tüpfeln mit Bradfordreagenz auf Proteingehalt gescreent. Proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt und über Gelpermeationschromatographie entsalzt. Präparativer Maßstab: Die Proteinreinigung erfolgte ab Volumina von 20 mL Lysat mit Hilfe der "ÄKTAprimeTMplus" der Fa. AMERSHAM BIOSCIENCES. Zur Steuerung des Gerätes sowie P P zur Aufzeichnung und Auswertung der Daten wurde die Software „ÄKTA prime“ verwendet. Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von λ = 254 nm. Es wurde eine mit 20 mL Ni-NTA gepackte "XK 26/20" Chromatographie-Säule der Fa. AMERSHAM BIOSCIENCES verwendet. Die Säule wurde mit mindestens 200 mL "Equilibrierungspuffer" equilibriert. Das Auftragen des Lysats und alle weiteren Schritte wurden mit einer Flussrate von 2 mL/min durchgeführt. Bis zur Konstanz der Extinktion bei 254 nm wurden mit ca 100 -150 mL "Waschpuffer" alle unspezifisch gebundenen Proteine entfernt. Die Elution erfolgt mit "Elutionspuffer". Das gewünschte Protein wird über UV-Absorption bei λ = 254 nm erkannt. Das Eluat wurde anschließend über Gelpermeationschromatographie oder Dialyse entsalzt. Phosphatpuffer NaCl MgCl2 Imidazol pH "Equilibrierungspuffer" 50 mM 300 mM 5 mM --------- 7.5 "Waschpuffer" 50 mM 500 mM 5 mM 10 mM 7.0 "Elutionspuffer" 50 mM 300 mM 5 mM 250 mM 7.0 "Entsalzungspuffer 1" 50 mM -------- 5 mM -------- 6.5 Tabelle 16 B B Verwendete Puffer für die Proteinreinigung von EntC. Phosphatpuffer NaCl ThDP MgCl2 Imidazol pH "Equilibrierungspuffer" 50 mM 150 mM 1 mM 1 mM 20 mM 8.0 "Waschpuffer" 50 mM 150 mM ------ 1 mM 50 mM 8.0 "Elutionspuffer" 50 mM 150 mM ------ 1 mM 300 mM 8.0 "Entsalzungspuffer 1" 50 mM -------- 1 mM 2 mM -------- 8.0 "Entsalzungspuffer 2" 25 mM 150 mM 1 mM 2 mM -------- 8.0 Tabelle 17 B B Verwendete Puffer für die Proteinreinigung von MenD. Gelpermeationschromatographie Hierzu erfolgte eine Trennung über eine Sephadex-Matrix von Molekülen nach ihrer Größe. Makromolekulare Proteine eluieren früher, da für sie nur ein Teil der Poren zugänglich ist, als 5. Experimenteller Teil 97 niedermolekulare Verbindungen, die tiefer in die Matrixporen eindringen können und deswegen ein größeres Volumen durchlaufen müssen. Dadurch können Proteine von Salzen getrennt werden. Analytischer Maßstab: Zur Salzentfernung wurde die Proteinlösung über "PD-10 Columns" gefüllt mit SephadexTM G-25 M der Fa. GE Healthcare Amersham Biosciences nach den Angaben des Herstellers mit "Entsalzungspuffer 1" (Tabelle 16, Tabelle 17) entsalzt und mittels Gelelektrophorese analysiert. Präparativer Maßstab: Zur Entsalzung der im präparativen Maßstab gereinigten Enzyme wurde die "HiPrep 26/10 Entsalzungssäule" gefüllt mit Sephadex™ G−25 Fine , 53 mL Bettvolumen, von AMERSHAM BIOSCIENCES in Verbindung mit der "ÄKTAprimeTMplus" P P verwendet. Equilibriert wurde mit 2.5fachem Säulenvolumen von "Entsalzungspuffer 2". Nach Auftragen von 15 mL Eluat wurde bei einer Flußrate von 10 mL/min "Entsalzungspuffer 2" (Tabelle 17) eluiert und die Proteinelutionsfraktion unter UV-Detektion aufgefangen und mittels Gelelektrophorese analysiert. Dialyse Für grössere Mengen Eluat eignete sich auch die Entsalzung per Dialyse. Verwendet wurde zur Entsalzung von EntC hierzu der Dialyseschlauch "Visking" mit einer Ausschlussgrösse von 14 kDa der Fa. ROTH. Es wurde bei 4 °C 24 Stunden gegen 5 L "Entsalzungspuffer 1" (Tabelle 16) dialysiert. Ultrafiltration Zur Entsalzung im analytischen Maßstab und zur Konzentrierung von Proteinen wurden die Zentrifugenfilter "Amicon Ultra-15, Ultracel 50K" der Fa. MILLIPORE verwendet. Die Ultrafiltration wurde bei einer Temperatur von 4 °C nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur Größentrennung von Proteinen wird die Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Lämmli [115] angewandt. Es wurde das Gelsystem der Fa. PEQlab verwendet. Folgende Lösungen kamen zum Einsatz: Elektrophorese-Puffer 0.1% SDS (10x konzentriert): 30.3 g Tris, 144.0 g Glycin, 10.0 g Natriumlaurylsulfat (SDS), ad 1000 mL H2Obidest. B B B B Probenpuffer, reduzierend, 2% SDS: T T 3.2 mL H2Obidest, 1.0 mL Tris/HCl-Lösung 0.5 M, pH 6.8, 1.6 mL Glycerol, 1.6 mL B B B B Natriumlaurylsulfat-Lösung (SDS) 10% (m/m), 0.4 mL ß-Mercaptoethanol, 0.2 mL Bromphenolblau 0.1% (m/V). 98 5. Experimenteller Teil Acrylamid-Stammlösung 30%: 58 g Acrylamid, 2 g N’N’-Methylenbisacrylamid, ad 200 mL H2Obidest. B B B B Gelsystem-Zusammensetzung Trenngel Sammelgel Acrylamid-Stammlösung 30% 4.00 mL 0.65 mL Tris/HCl-Lösung 1.5 M, pH 8.8 2.50 mL - Tris/HCl-Lösung 0.5 M, pH 6.8 - 1.25 mL H2Obidest. 3.35 mL 3.05 mL Natriumlaurylsulfat-Lösung (SDS) 10% (m/m) 100 µL 50 µL 5 µL 5 µL 100 µL 50 µL B B B B N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Ammoniumperoxodisulfat-Lösung 10% (m/V) Tabelle 18 SDS-Gel. Färbelösung: 1.25 g Coomassie Brilliant Blue G 250, 225 mL Ethanol, 50 mL Eisessig, 225 mL H2Obidest. B B B B B Entfärbelösung: 100 mL Methanol, 37.5 mL Eisessig, ad 200 mL H2Obidest. B B B B B Vor der elektrophoretischen Trennung wurden die Proteinproben in Probenpuffer (reduzierend, 2% (V/V) SDS) aufgenommen und 10 min bei 65 °C denaturiert. Als Molekulargewichtsstandard wurden Proteinmarker der Fa. PEQLAB BIOTECHNOLOGIE GMBH (peqGOLD Prestained Protein-Marker®) und FERMENTAS (PageRuler™ Prestained Protein P P Ladder) verwendet. Als diskontinuierliches Trennmedium wird ein 4%iges Sammelgel und ein 12%iges Trenngel verwendet (Tabelle 18). Die Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von 200 V während einer Dauer von 45-60 min. Bestimmung der Proteinkonzentration Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford [116], spektralphotometrisch mit dem Spektrophotometer "UV mini – 1240" der Fa. SHIMADZU bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm bestimmt. Das Bradford-Reagenz wurde selbst hergestellt. Dazu wurden 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 mL 95%igem Ethanol gelöst, 100 mL 85%ige H3PO4 B B B B hinzugegeben und die Lösung 1 Stunde gerührt. Nach dem Auffüllen mit bidestilliertem Wasser auf 1 L wurde das Farbreagenz erneut mindestens 1 Stunde gerührt, anschließend 5. Experimenteller Teil 99 erhitzt, filtriert und in eine lichtgeschützte Flasche gefüllt. Da sich ungelöste Teilchen absetzten, wurde die Flasche vor der ersten Nutzung einen Tag ruhen gelassen. Die Kalibriergerade mit Rinderserumalbumin (BSA) wurde im linearen Bereich von 10-100 µg/mL erstellt. 900 µL Bradford-Reagenz wurden mit 100 µL Probe versetzt und gemischt. Nach 10 min Inkubation wurde die Absorption bei λ = 595 nm bestimmt. Als Nullwert dienten 900 µL Bradford-Reagenz inkubiert mit 100 µL des jeweiligen Puffers beziehungsweise Wasser. Aus 2 g Zellen einer Schüttelkolben-Expression von 500 mL wurden durchschnittlich 2-5 mg reines EntC und 20-35 mg reines MenD-Protein erhalten. Lagerung des Proteins Das Eluat wurde anschließend entweder sofort verwendet, bei 4 °C gelagert oder lyophilisiert und bei -20 °C gelagert. Die Lagerung von MenD kann bei -20 °C über mehrere Monate, bei 4 °C in Lösung mehrere Wochen ohne Aktivitätsverlust des Enzyms erfolgen. EntC wurde nur lyophylisiert eingesetzt und zeigte hier ebenfalls eine hohe Stabilität bei -20 °C. 5.4. Untersuchungen zur mikrobiellen Produktgewinnung 5.4.1. Kultivierung im Schüttelkolben Chorismat (1) Die Produktion von 1 im präparativen Stil wurde durchgeführt mit dem Chorismat-Mutase defizientem Stamm KA12 [88] von Dr. Peter Kast, ETH Zürich. Medium A: T T 2 g Casamino Acid (Bacto PeptonTM von Fa. BD), 2 g Hefeextrakt, 41 mg L-Tryptophan, P P 40 mL Vogel-Bonner-Salz (25 x), 10 mg Tetracyclin, ad 1000 mL mit H2Obidest. B B B 25 x Vogel-Bonner-Mineralsalz [117] 0.5% (w/v) MgSO4 x 7 H2O B B B B 5% (w/v) Citronensäure x H2O B B 12.5% (w/v) K2HPO4 4.4% (w/v) NaNH4HPO4 x 4 H2O B B Die Komponenten werden zunächst einzeln in etwas Wasser gelöst, die Lösungen zusammengegeben und auf das Endvolumen gebracht. Die fertige Lösung wird autoklaviert. Medium B: 12.8 g Na2HPO4, 1.36 g KH2PO4, 18 g Glucose, 2.7 g NH4Cl, 20.3 mg MgCl2·6H2O, 2 mg B B B B B B B B B L-Tryptophan, 10 mg Tetracyclin, ad 1000 mL mit H2Obidest. B B B B B B B B B 100 5. Experimenteller Teil Eine Vorkultur der Zellen werden in 500 mL autoklaviertes Medium A gegeben und 12 h bei 30 °C und 120 UpM geschüttelt. Bei einer OD600 = 2 werden die Zellen bei 2000 UpM B B abzentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in 500 mL Medium B resuspendiert und 20 h bei 30 °C und 120 UpM kultiviert. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und der Überstand auf 1 mit HPLC bei 275 nm untersucht. Die Konzentration an 1 erreichte einen Wert von etwa 400 mg/L bestimmt über NMR mit TSP-Natrium als Standard. Außerdem wurde in geringer Konzentration die Bildung von 4-Hydroxybenzoesäure und 3,4-CHD (9) beobachtet. SHCHC (5) 5 wurde mit den von Prof. G. Sprenger, Universität Stuttgart, bereitgestellten Stämmen F1 und F97 in vivo produziert. Beide Stämme weisen eine Deletion des Gens menC auf. Bei F1 liegen die Gene entC und menD chromosomal, bei F97 auf einem induzierbaren Plasmid vor. Kultivierung in LB-Medium In LB-Medium konnte nur für den Stamm F97 Produktion von 5 nachgewiesen werden: Zur Fermentation wurde bei dem Erreichen einer OD600 = 0.6, IPTG in einer Konzentration B B von 0.5 mM zur Induktion zugegeben. Des Weiteren wurden 0.3 mM α-Ketoglutarat (3), 0.2% Glucose final, 0.1 mM ThDP, 1 mM MgCl2 und Ampicillin (100 µg/mL) zugesetzt. B B B B IPTG-Zugabe und Glucose-Zugabe wurden alle 24 h wiederholt. Kultivierung in Minimalmedium (MM) Die Fermentationen wurden in folgenden Minimalmedien durchgeführt, als Standard diente die Kultivierung in LB-Medium. M9-Medium 6 g (42 mmol) Na2HPO4, 3 g (22 mmol) KH2PO4, 0.5 g (8.6 mmol) NaCl, 1 g (19 mmol) B B B B B B B B NH4Cl, ad 1000 mL H2Obidest. B B B B B B MM nach Pan 1 T T 13.0 g (96 mmol) KH2PO4, 10.0 g (57 mmol) K2HPO4, 6.0 g (43 mmol) NaH2PO4·2H2O, 2.0 g B B B B B B B B B B B B B B (15 mmol) (NH4)2SO4, 0.2 g (3.7 mmol) NH4Cl, ad 1000 mL H2Obidest. B B B B B B B B B B B B MM nach Pan 2 13.0 g (96 mmol) KH2PO4, 10.0 g (57 mmol) K2HPO4, 6.0 g (43 mmol) NaH2PO4·2H2O, B B B B B B B B B B B B B B 2.0 g (15 mmol) (NH4)2SO4, 5.0 g (93 mmol) NH4Cl, ad 1000 mL H2Obidest. B B B B B B B B B B B B MM nach Tanaka 4.1 g (34 mmol) NaH2PO4, 11.4 g (65 mmol) K2HPO4, 2.6 g (20 mmol) (NH4)2SO4, ad B B B B B B B B B B B B B B 5. Experimenteller Teil 101 1000 mL H2Obidest. B B B B MM nach Leistner 1.36 g (10 mmol) KH2PO4, 16.1 g (90 mmol) Na2HPO4·2H2O, 2.7 g (50 mmol) NH4Cl, ad B B B B B B B B B B B B 1000 mL H2Obidest. B B B B Zusatzlösungen Spurenelemente, Aminosäuren, Kohlenstoffquelle, Vitamine, Induktoren und Antibiotika werden autoklaviert, beziehungsweise bei Hitzeinstabilität sterilfiltriert und nachträglich als Stocklösungen zu den Basislösungen zugegeben. Die Zugabe der Zusatzlösungen wurde auf folgende Endkonzentrationen optimiert: 1 mM MgSO4, 0.6 mM Spurenelementlösung nach Pan (Tabelle 19), Ampicillin (100 µg/mL), B B L-Phenylalanin (40 µg/mL), L-Tyrosin (40 µg/mL), 0.15 mM Thiaminhydrochlorid, Glucose (3.5 mg/mL). Spurenelement-Stammlösung nach Pan (1000×) P P FeSO4·7H2O 40 g (140 mmol) CaCl2·H2O 40 g (270 mmol) B B B B B B B B MnSO4·2H2O 10 g (59 mmol) AlCl3·6H2O 10 g (41 mmol) CoCl2·6H2O 4 g (31 mmol) ZnSO4·7H2O 2 g (7.0 mmol) B B B B B B B B B B B B B B B B Na2MoO4·2H2O 2 g (8.3 mmol) CuCl2·2H2O 1 g (5.9 mmol) H3BO3 0.5 g (8.1 mmol) B B B B B B B B B B B B B B ad 1000 mL 5 N HCl Tabelle 19 Zusammensetzung Spurenelementstammlösung nach Pan. Die Hauptkultur wurde bis Vorliegen einer OD600 von 0.1 mit Vorkultur in LB-Medium B B angeimpft. Bei OD600 = 0.6 erfolgte die Induktion mit 1 mM IPTG und die Temperatur wurde B B auf 30 °C reduziert. Glucosezugabe (3.5 mg/mL) erfolgte nach 22 h, 42 h und 72 h. Die Bildung von 5 wurde mit HPLC bei 290 nm über 110 h verfolgt. Nach Abbruch der Kultivierung werden die Zellen bei 2000 UpM zentrifugiert und die Konzentration von 5 im Überstand bestimmt. Berechnet über 1H-NMR mit TSP-Natrium als P P 102 5. Experimenteller Teil Standard ergibt sich nach 110 h eine Konzentration von 5 im Bereich von ungefähr 350450 mg/L. 5.4.2. Fermentation Die Produktgewinnung im Fermenter von Chorismat (1) mit einem E. coli-Stamm (J. Bongaerts et al.,,unveröffentlicht) und von SHCHC (5) unter Einsatz des Stammes F97 mit dem Vektor pC120 wurde von Prof. G. Sprenger, Universität Stuttgart durchgeführt. Bei 1 wurden dabei Konzentrationen von 7-9 g/L erreicht, bei 5 lag die Konzentration bei 7 g/L. 5.4.3. Isolierung und Aufreinigung der Metabolite Chorismat (1) CO2H O CO2H OH Die Isolierung von 1 sowohl aus den Schüttelkolbenexperimenten, als auch aus dem zellfreien Überstand der Fermentation wird unter Anwendung von Ionenaustauschchromatographie in Anlehnung an die Methode von Hilvert et. al. [89] durchgeführt. Dazu werden 200 mL DOWEX®-Harz 1x8 (Cl¯, 200 mesh) in eine Säule (Innendurchmesser 4.3 cm, Höhe 30 cm, Füllhöhe 15 cm) gefüllt. Vor Gebrauch wird das Harz nacheinander mit 350 mL HCl-Lösung (1 M), 350 mL H2Obidest, 350 mL NaOH-Lösung (1 M) und erneut mit 350 mL H2Obidest B B B B B B B B gewaschen. 350 mL des chorismathaltigen Überstandes werden mit H2Obidest 1:5 verdünnt und B B B B mit NaOH auf pH 8.5 eingestellt. Die Lösung wird mit einer Flussgeschwindigkeit von 5 mL/min auf das Säulenbett aufgetragen und mit 350 mL H2Obidest gewaschen. Eluiert wurde B B B B mit einer 2 M NH4Cl-Lösung (pH 8.5). Das Eluat wird fraktioniert gesammelt, die einzelnen B B Fraktionen per HPLC-DAD-Analyse auf ihren Chorismat-Gehalt untersucht und die produkthaltigen Fraktionen vereinigt. Die wässrige Lösung wird mit HClkonz auf pH 1.5 B B gebracht, dreimal mit den gleichen Volumina Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen bei 30 °C im Vakuum auf ein Volumen von ca. 50 mL eingeengt. Anschließend wird solange Cyclohexan zugegeben bis sich ein dauerhafter weißer Niederschlag bildet. Bei Lagerung der Lösung von 1 bei −20 °C erfolgt weitere Ausfällung. Das Lösungsmittel wird von dem sich bildenden Niederschlag abdekantiert und das Produkt im Vakuum getrocknet. 1 wird in Form weißer Kristalle mit einer Reinheit von >95% und einer Gesamtausbeute von 5. Experimenteller Teil 103 10-20% gewonnen. Rf-Wert = 0.5 (Cyclohexan/Ethylacetat = 4:1 mit 1% TFA) DC (SiO2) B B B (RP8, 23 °C, 0.75 mL/min, Methode [anja9.m]): Rt (Chorismat) = 21.5 min. RP-HPLC T B T B (-MS2, Turbolonspray , 225 amu): m/z 225 [M -H+]-, 207 [M -H2O, H+]-, 181 [M - CO2, H+]-, 163 [M - CO2, -H2O, H+]-, 137 [M -2x CO2, H+]-, 119 [M -H2O, 2x CO2, H+]-. MS-MS T P P P B B B B P B B B B B B P B B B B B B P P P B B P B B B B P P P P P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B P P P P B B (MeOH-d4): δ = 69.1 (CHOHCHolef), 80.3 (CHOHCHOCq), 95.7 (CqCH2), 121.1 (CHolefCHolefCq), 129.4 (CqCO2H), 131.9 (CHolefCHOCq), 133.1 (CHolefCqCO2H), 149.6 (CqColefH2), 165.0 (CH2olefCqCO2H), 166.1 ppm (CqCO2H). C-NMR P B P P B B B B 13 B B P B B C10H10O6 B P P B B P B T (MeOH-d4): δ = 4.72 (dt, J = 11.6, 2.6, 0.7 Hz, 1H, CqOCH), 4.86 (d, J = 2.8 Hz, 1H, CqColefHxHy), 4.98 (dd, J = 11.6, 2.6 Hz, 1H, CHOH), 5.53 (d, J = 2.8 Hz, 1H, CqColefHxHy), 6.02 (dd, J = 10.1, 2.7 Hz, 1H, ColefH), 6.37 (dt, J = 10.1, 2.0, 1H, ColefH), 6.90 ppm (s, 1H, CqColefH). H-NMR P P P P 1 B TM B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 226.18 B SHCHC (5) O CO2H OH HO2C Analog zur Isolierung von Chorismat (1) (siehe oben) erfolgte auch die Reinigung von 5 unter Anwendung von Ionenaustauschchromatographie. Vorbereitung und Probenauftrag entspricht der Arbeitsweise für 1. Zur Elution von 5 wurde ein Stufengradient aus NH4Cl/NH3-Puffer (pH 8.5) in steigenden B B B B Konzentrationen verwendet: 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 1 M. Von jeder Stufe wurde ein halbes Säulenfüllvolumen (175 mL) fraktioniert und mit HPLC bei 290 nm auf SHCHC-Gehalt analysiert. Elution von 5 erfolgte ab 0.3 M NH4Cl/NH3-Puffer B B B B (pH 8.5). Die 5 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Extraktion von 5 aus dem Lyophilisat mit Methanol befreite von einem Großteil der Salze. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde 5 mit einem Gehalt von 27% erhalten, wobei die Verunreinigungen hauptsächlich aus Salzen bestanden. Durch nachfolgendes Entsalzen mit Sephadex LH20 der Fa. PHARMACIA in MeOH konnte die Reinheit auf bis zu 56% gesteigert werden. Die Gesamtausbeute an 5 nach Reinigung beträgt 15-20%. DC (SiO2) 5 ist schlecht detektierbar bei 254 nm. MS (-Q1, TurbolonsprayTM, EI): m/z 239 [M -H+]-, 177 [M -CO2, -H2O, H+]-, 133 [M -2x CO2, H2O, H+]-. B B T P 1 H-NMR P P P B B B B P P P T P P P P B B B B P P P P P (MeOH-d4): δ = 2.43-2.48 (m, 2H, CH2CO2H), 2.97-3.14 (m, 2H, CH2CO), 3.71 (d, J = 1.9 Hz, 1H, CHCO2H), 4.52 (dd, J = 5.4, 1.9 Hz, 1H, CHOH), 6.29 (dd, J = 9.4, 5.7 Hz, 1H, CHOHColefH), 6.36 (dd, J = 9.4, 5.4 Hz, 1H, B B B B B B B B B B B B 104 5. Experimenteller Teil CqColefHColefH), 7.27 ppm (d, J = 5.7 Hz, 1H, ColefHCq). B 13 B B B B B P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 240.06 C11H12O6 B B (MeOH-d4): δ = 30.1 (CO2HCH2), 32.8 (CH2CO), 48.9 (CO2HCH), 65.1 (CHOH), 125.8 (CqColefHColefH), 131.9 (ColefHCHOH), 133.6 (CqColefH), 134.4 (Cq), 177.1 (CH2CO2H), 180.1 (CHCO2H), 202.7 ppm (CO). C-NMR P B B B 5.5. Enzymatische Reaktionen und Synthesen 5.5.1. Nachweis und Bestimmung von Aktivität Reaktionspuffer Zur Bestimung von Aktivität sowie für enzymatische Synthesen wurden folgende Reaktionspuffer verwendet. Reaktionen unter Zusatz von EntC wurden in einem Puffer aus 50 mM Kpi oder 20 mM Tris sowie jeweils 5 mM MgCl2·6H2O bei pH 7 durchgeführt. B B B B Reaktionen unter MenD-Katalyse fanden in einem Puffer aus 50 mM Kpi, 2 mM MgCl2·6H2O, 0.1 mM ThDP bei pH 8 statt. Für in situ 1H-NMR Experimente wurde der B B B B P P gleiche Puffer mit einem Gehalt von 20% Deuteriumoxid hergestellt. Je nach Substratlöslichkeit wurden dem Ansatz 20% DMSO oder 5% MTBE zugegeben. Auf abweichende Pufferkonzentrationen und Zusätze wird hingewiesen. Einstellung der Proteinkonzentration EntC und MenD wurden in dem jeweiligen Entsalzungspuffer gelagert. Die erforderliche Proteinkonzentration wird durch Verdünnung mit dem jeweiligen Reaktionspuffer eingestellt. Natürliche Reaktionen EntC – Bildung von Isochorismat (2) in vitro CO2H OH O CO2H Lyophilisiertes, aufgereinigtes EntC (60 µg Gesamtprotein) wurde in Reaktionspuffer (20 mM Tris) mit 2 mg Chorismat (1) (6 mM) bei 37 °C und 300 UpM inkubiert. Nach einer Stunde wurde die Reaktion mit "Reversed Phase"-HPLC analysiert. Der Umsatz nach Integral unter Berücksichtigung des Absorptionkoeffizienten von 8830/M • cm bei 278 nm für Isochorismat (2) und von 2630/M • cm bei 275 nm für Chorismat (1) beträgt ungefähr 20% [118]. Weitere Inkubation erbrachte keine weitere Verschiebung des Verhältnisses zugunsten 5. Experimenteller Teil 105 von 2. RP-HPLC (RP8, 23 °C, 0.75 mL/min, Methode [anja9.m]): Rt (Isochorismat) = 19.0 min. C10H10O6 226.03 T T B B B B B B B B MenD – Bildung von SHCHC (5) in vitro O CO2H OH HO2C Lyophilisiertes, aufgereinigtes EntC (850 µg Gesamtprotein) und lyophilisiertes, aufgereinigtes MenD (480 µg Gesamtprotein) werden in 45 mL Tris-Puffer (50 mM, pH 8.0, 2 mM MgCl2·6H2O, 1 mM MnCl2·4H2O, 0.1 mM ThDP), mit 80 mg Chorismat (1) (8 mM) B B B B B B B B und 60 mg α-Ketoglutarat (3) (8 mM) bei 32 °C und 300 UpM inkubiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte nach 3 h, 21 h, 24 h und 30 h über RP-HPLC. Nach 30 h wurde der Ansatz semipräperativ über eine Säule RP18 (10mm) der Fa. CS CHROMATOGRAPHIE getrennt und 5 isoliert und mittels 1H-NMR (Daten 5.4.3) bestätigt. P (RP18, 23 °C, 2 mL/min, Methode [anja10.m]): Rt (SHCHC) = 17.1 min. RP-HPLC C11H10O6 B B B B B B 2PB P B 238.05 P Aktivität von MenD 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) -Assay Zum Nachweis von Aktivität in Form der Bildung von α-Hydroxyketonen wurde folgender Assay verwendet. Der Enzymansatz (1.5 mL Reaktionspuffer, 20 mM Akzeptorsubstrat, 50 mM einer α-Ketosäure, 300 µL DMSO und 200 µg MenD) wurde 12 h bei Raumtemperatur inkubiert. In eine Mikrotiterplatte (0.5 mL, Fa. GREINER BIO-ONE) werden 100 µL des Ansatzes vorgelegt. Die Farbreaktion wird durch Zugabe von 10 µL 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (0.4% in EtOH) und 30 µL 1 M NaOH gestartet. Als Blindversuch dienen Pufferlösungen ohne MenD mit 0.5 mM und 1 mM Acetoin. Innerhalb von 2 Stunden tritt bei Enzymansatz und bei den Blindproben eine deutliche Rotfärbung als Nachweis des Vorhandenseins von α-Hydroxyketonen ein. 1,2-Carboligase-Aktivitätstest mit GC-MS Zur Bestimmung der 1,2-Carboligase-Aktivität wurde die Umsetzung von 20 mM Benzaldehyd (10) mit 50 mM α-Ketoglutarat (3) zu (R)-5-Hydroxy-4-oxo-5- phenylpentansäure (13) ausgenutzt. Diese 1,2-Additionsreaktion wurde in 1.5 mL Reaktionspuffer bei 30 °C und 300 UpM mit 200 µg MenD über 20 Stunden durchgeführt. Nach Extraktion mit Ethylacetat (1% Ameisensäure) erfolgte die Bestimmung des Umsatzes 106 5. Experimenteller Teil aus dem Verhältnis 10 zu 13 mittels GC-MS Analyse. Als 1 UMenD1,2Lig wurde die B B Enzymmenge definiert, die 1 µmol 10 bei 30 °C in 1 Minute umsetzt. Die spezifische LigaseAktivität lag bei 200-250 mUMenD1,2Lig /mg Protein. B B 1,4-Carboligase-Aktivitätstest mit NMR Zur Bestimmung der 1,4-Carboligase-Aktivität wurde die Umsetzung von 20 mM 2,3-CHD (7) mit 50 mM α-Ketoglutarat (3) zu (5S,6S)-2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2encarbonsäure (41) ausgenutzt. Diese 1,4-Additionsreaktion wurde in 1.5 mL Reaktionspuffer mit einem Anteil von 20% D2O bei 30 °C und 300 UpM mit 400 µg MenD über 12 Stunden B B verfolgt. Alle 20 Minuten wurde ein 1H-NMR Spektrum aufgenommen und direkt über das P P Integralverhältnis von 7 zu dem Produkt 41 der Umsatz bestimmt. Als 1 UMenD1,4Lig wurde die B B Enzymmenge definiert, die 1 µmol 7 bei 30 °C in 1 Minute umsetzt. Die spezifische LigaseAktivität lag bei 66-83 mUMenD1,4Lig /mg Protein. B B 5.5.2. Substratspektrum von MenD-1,2-Additionen Benzaldehydderivate als 1,2-Akzeptoren Analytische Ansätze Ansätze im analytischen Maßstab von 1.5 mL wurden nach folgendem Schema durchgeführt: MenD (100-200 µg) wurde in Reaktionspuffer (5.5.1) mit 20% DMSO oder 5% MTBE in der Anwesenheit von 20 mM Aldehyd und 50 mM α-Ketoglutarat (3) bei 30 °C und 300 UpM (Thermomixer, EPPENDORF) inkubiert. Nach 16, 24 und 44 Stunden wurden je 100 µL Ansatz mit je 200 µL Ethylacetat und 2 µL Ameisensäure zur Analyse extrahiert. Für NMR Analyse wurde der komplette Ansatz nach 44 Stunden mit 15 µL (1%) Ameisensäure und CDCl3 B B extrahiert. Nach 24 Stunden konnte in den meisten Fällen bereits keine Umsatzsteigerung mehr festgestellt werden. 5-Hydroxy-4-oxo-5-(thiophen-2-yl)-pentansäure (18) OH S CO2H O GC-MS [M1-300] Rt = 8.3 min, m/z (%) 168 (7) [M -CO2, 2H]+, 111 (100) [C5H3OS]+, 83 (6) [C4H3S]+, 57 (8) [C3H5O]+; B B B B P B B P P B B B B P B B P P B B B B P P P P Rt (Lacton) = 11.3 min, m/z (%) 196 (10) [M –H2O]+, 111 (100) [C5H3OS]+, 85 (17) [C4H4O2]+, 83 (3) [C4H3S]+, 57 (3) [C3H5O]+; B B B B B B B B B P P B B B B P P B B B B B P P P P B B B B P P 5. Experimenteller Teil 107 Umsatz 87%; 214.03 C9H10O4S B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(2-iodphenyl)-4-oxopentansäure (20a) OH CO2H O I [M1-DMSO] GC-MS Rt = 8.64 min, m/z (%) 288 (1) [M -CO2, 2H]+, 231 (100) [C7H4IO]+, 203 (17) [C6H4I]+, 76 (36) [C6H4]+, 51 (19) [C4H3]+; B B B B B B B P P B B B B P P B B B B B P P P B B B B P P P Rt (Lacton) = 11.0 min, m/z (%) 231 (1) [C7H4IO]+, 176 (38), 104 (100) [C7H4O]+, 85 (12) [C4H6O2]+, 77 (28) [C6H5]+, 51 (12) [C4H3]+; B B B B B B B B B P P B B B B B B B P P P P B B B B B B B B P P P P Umsatz 89%; 333.97 C11H11IO4 B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(2-chlorphenyl)-4-oxopentansäure (20b) OH CO2H Cl O [M1-DMSO] GC-MS Rt = 9.1 min, m/z (%) 196 (1) [M -CO2, 2H]+, 141 (33) [C7H4ClO]+, 139 (100) [C7H4ClO]+, 113 (6) [C6H4Cl]+, 111 (25) [C6H4Cl]+, 75 (15) [C3H7O2]+, 57 (10) [C3H5O]+, 50 (4) [C4H2]+; B B P B B B B B B B B P P B P P B B B B B B B P B P P P P B B B B B B B B B P P P P B B B B B B P P P P Rt (Lacton) = 11.9 min, m/z (%) 224 (1) [M]+, 141 (34) [C7H4ClO]+, 139 (100) [C7H4ClO]+, 113 (5) [C7H4ClO]+, 111 (20) [C6H4Cl]+, 85 (23) [C4H6O2]+, 75 (12) [C3H7O2]+, 50 (2) [C4H2]+; B B B B B B P P B B P P B B B B B P B P B B B B P P B B P B B B B B P B B B P P P B B B B B B P P P Umsatz 80%; C11H11ClO4 242.03 (100.0%), 244.03 (32.0%) B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(2-bromphenyl)-4-oxopentansäure (20c) OH CO2H Br GC-MS O [M1-DMSO] Rt = 9.7 min, m/z (%) 240 (1) [M -CO2, 2H]+, 185 (100) [C7H4BrO]+, 183 (100) [C7H4BrO]+, 157 (27) [C6H4Br]+, 155 (25) [C6H4Br]+, 76 (20) [C6H4]+, 57 (18) B B P B B B B P P B B B B P P P B B P P B B B B B P P B B B P P B B B B P P 108 5. Experimenteller Teil [C3H5O]+, 50 (9) [C4H2]+; B B B P B P B B B P B P Rt (Lacton) = 11.9 min, m/z (%) 185 (100) [C7H4BrO]+, 183 (80) [C7H4BrO]+, 157 (12) [C6H4Br]+, 155 (16) [C6H4Br]+, 85 (52) [C4H6O2]+, 77 (36) [C6H5]+, 56 (12) [C4H8]+; B B B B B B B B B B B P P P B B B B B B B P P P B B P B B B B B B B B P P P P B B B B P P P Umsatz 65%; C11H11BrO4 285.98 (100.0%), 287.98 (97.3%) B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(2-methylphenyl)-4-oxopentansäure (20d) OH CO2H O CH3 [M1-DMSO] GC-MS Rt = 8.7 min, m/z (%) 176 (1) [M -CO2, 2H]+, 119 (100) [C8H7O]+, 91 (45) [C7H7]+, 65 (11) [C5H5]+, 57 (2) [C3H5O]+; B B P B B B B P P B B B B P P B B P B B B B P P B B B B P P P P Rt (Lacton) = 11.6 min, m/z (%) 119 (100) [C8H7O]+, 91 (36) [C7H7]+, 85 (7) [C4H6O2]+, 65 (9) [C5H5]+; B B B B B B B B B P P B B B B P B B B P P B B B B P P P Umsatz 12%; 222.09 C12H14O4 B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(3-fluorphenyl)-4-oxopentansäure (20f) OH CO2H O F [M1-DMSO] GC-MS Rt = 7.8 min, m/z (%) 180 (4) [M -CO2, 2H]+, 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (42) [C6H4F]+, 75 (13) [C3H7O]+, 57 (16) [C3H5O]+; B B B B B B P B P B B B P B P B B P B P B B B B B B P P P P + Rt (Lacton) = 11.0 min, m/z (%) 208 (3) [M] , 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (31) [C6H4F]+, 85 (38) [C4H4O2]+, 75 (9) [C3H7O]+, 57 (3) [C3H5O]+; B B B B B B P P Umsatz 88%; C11H11FO4 B B B B B B 226.06 P P B B B B B B P P B B B B P P B B B B B B P B P B P P 5. Experimenteller Teil 109 (R)-5-Hydroxy-5-(3-methoxyphenyl)-4-oxopentansäure (20g) OH CO2H O OCH3 [M1-DMSO] GC-MS Rt = 9.7 min, m/z (%):m/z (%) 192 (7) [M -CO2, 2H]+, 135 (100) [C8H7O2]+, 107 (25) [C7H7O]+, 92 (14) [C6H4O]+, 77 (18) [C6H5]+, 57 (2) [C3H5O]+; B B B B B B B P P B B B B P P B B P P B B B B P P B B B B B P + B B B B P P P + Rt (Lacton) = 12.4 min, m/z (%) 220 (7) [M] , 135 (100) [C8H7O2] , 107 (16) [C7H7O]+, 92 (6) [C6H4O]+, 85 (5) [C4H4O2]+, 77 (9) [C6H5]+, 57 (1) [C3H5O]+; B B B B B P B P P P B B B B P P B B B B B B B P P B B B B B B B B B P P P P B B B B P P Umsatz 50%; 238.08 C12H14O5 TB T B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(4-fluorphenyl)-4-oxopentansäure (20i) OH CO2H O F [M1-300] GC-MS Rt = 8.0 min, m/z (%) 180 (5) [M -CO2, 2H]+, 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (38) [C6H4F]+, 75 (16) [C3H7O]+, 57 (16) [C3H5O]+; B B B B B B P B P B B B P B P B B P P B B B B B B B P P P P Rt (Lacton) = 11.0 min, m/z (%) 208 (1) [M]+, 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (13) [C6H4F]+, 85 (20) [C4H4O2]+, 75 (5) [C3H7O]+, 57 (2) [C3H5O]+; B B B B B B P P P P B B B B B B P P B B B B B P P B B B B B B B P P P P Umsatz >99%; C11H11FO4 B B B B B B 226.06 (R)-5-Hydroxy-5-(4-chlorphenyl)-4-oxopentansäure (20k) OH CO2H Cl GC-MS O [M1-300] Rt = 9.2 min, m/z (%) 196 (2) [M -CO2, 2H]+, 141 (32) [C7H4ClO]+, 139 (100) [C7H4ClO]+, 113 (10) [C6H4Cl]+, 111 (30) [C6H4Cl]+, 75 (15) [C3H7O2]+, 57 (10) [C3H5O]+,50 (3) [C4H2]+; B B P B B B P B P B B B B B P P B B B B B B P B P P B B P P B P B B B B P B B B P P P B B B B B B P P P Rt (Lacton) = 12.5 min, m/z (%) 224 (1) [M]+, 141 (30) [C7H4ClO]+, 139 (100) [C7H4ClO]+, 113 (8) [C6H4Cl]+, 111 (30) [C6H4Cl]+, 85 (32) [C4H4O2]+, 75 (15) [C3H7O2]+, 57 (2) [C3H5O]+, 50 (7) [C4H2]+; B B B B B B B B B B B B P P P P P P B B B B B B B P B P P P B B B B B P P B B B B P P B B B P B B B B P B B P P 110 5. Experimenteller Teil Umsatz >99%; 1 (CDCl3): δ = 2.56-2.62 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 2.71-2.75 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 4.21 (br s, 1H, CHOH), 5.16 (s, 1H, CHOH), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 2H, CHm-Ar), 7.39 ppm (d, J = 8.5 Hz, 2H, CHo-Ar); H-NMR P P B B B B B B B B B B B B B 13 B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 27.4 (CO2HCH2), 32.3 (COCH2), 79.0 (CHOH), 128.7 (2 x CAr), 129.2 (2 x CAr), 134.8 (CCl), 136.2 (Cq), 176.7 (CO2H), 207.2 ppm (CO); C-NMR P B B P B B B B B B B B B B B B B B B B C11H11ClO4 242.03 (100.0%), 244.03 (32.0%). B B B B B B (R)-5-Hydroxy-5-(4-hydroxyphenyl)-4-oxopentansäure (20l) OH CO2H O HO (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z (%) 223 (32) [M -H+]-, 205 (24) [M -H2O, H+]-, 161 (100) [M -CO2, H2O, H+]-, 133 (53) [M -CO2, H2O, C2H2, H+]-, 121 (18), 93 (62) [C6H5O]-, 65 (10); MS B P 1 P P P P P B P P P P P B P B B B B P B B B P P P P B B P P P B B B B B B P (MeOH-d4): δ = 1.88-1.98 (m, 1H, CHxHyCO2H), 2.08-2.26 (m, 1H, CHxHyCO2H), 2.08-2.26 (m, 1H, CHxHyCO), 2.73-2.82 (m, 1H, CHxHyCO), 4.82 (s, 1H, CHCOH), 6.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H, CHm-Ar), 7.15 ppm (d, J = 8.4 Hz, 2H, CHo-Ar); H-NMR P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Umsatz nach Integralverhältnis Edukt/Produkt: 66%; 224.07 C11H12O5 B B B B B B (R)-5-(2,3-Dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-4-oxopentansäure (20m) OH CO2H O OH OH (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z 239 [M -H+]-, 221 [M -H2O, H+]-, 177 [M -CO2, -H2O, H+]-, 137 [C7H5O3]-, 91 [C7H7]-; MS C11H12O6 B B P P B B B B B B B B P P P P P P B B B B B B P P B B B B P P P B B P P P P P 240.06 (R)-5-(3,4-Dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-4-oxopentansäure (20n) OH CO2H O HO OH MS (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z 239 [M -H+]-, 221 [M -H2O, H+]-, P P P P P P B B P P P P 5. Experimenteller Teil 111 177 [M -CO2, -H2O, H+]-, 137 [C7H5O3]-, 91 [C7H7]-; B 1 P B B B P P P P B B B B B B P P B B B B P P (DMSO-d6): δ = 2.31 (dt, J = 6.7, 2.1 Hz, 2H, CH2CO2H), 2.66 (t, J = 6.7 Hz, 2H, CH2CO), 4.88 (d, J = 4.3 Hz, 1H, CHOH), 5.71 (d, J = 4.3 Hz, 1H, CHOH), 6.62 (dd, J = 8.0, 1.8 Hz, 1H, CHAr), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H, CHAr), 6.73 ppm (d, J = 1.2 Hz, 1H, CHAr); H-NMR P B B B B B B B B B B B B B B Umsatz nach Integralverhältnis Edukt/Produkt: 53%; C11H12O6 B B B B B 240.06 B Preparative Ansätze (R)-5-Hydroxy-4-oxo-5-phenylpentansäure (13) OH CO2H O 0.7 mmol Benzaldehyd (10) (13 mM) und 2 mmol α-Ketoglutarat (3) (40 mM) wurden in 2.5 mL MTBE (5%) gelöst und und zu 45 mL Reaktionspuffer gegeben. 2.5 mL desselben Puffers mit 3 mg MenD (final: 60 µg/mL) wurden in den Ansatz pipettiert und die Mischung langsam unter N2-Atmosphäre bei 30 °C gerührt. Die Reaktion wurde GC-MS kontrolliert B B durchgeführt. Nach 42 h wird mit 250 µL Ameisensäure (0.5%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 50 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck und Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/ Ethylacetat, 2:1, 1% Ameisensäure) ergaben 90.4 mg (65%) 13 als gelbes B B Öl. DC (SiO2) Rf-Wert = 0.2 (Cyclohexan/Ethylacetat = 2:1 mit 1% Ameisensäure); GC-MS [M1-300] B B B B Rt = 8.1 min, m/z (%) 162 (2) [M -CO2, 2H]+, 105 (100) [C7H5O]+, 77 (48) [C6H5]+, 51 (12) [C4H3]+; B B P P B B B B P P B B B B P B B P P B B B B P P P Rt (Lacton) = 11.3 min, m/z (%) 190 (1) [M]+, 105 (100) [C7H5O]+, 85 (12) [C4H6O2]+, 77 (28) [C6H5]+, 51 (7) [C4H3]+; B B B B B B B B P P P B B B B P P B B B B P P B B B B P P P Umsatz >99%; MS (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z (%) 207 [M -H+]-, 189 [M -H2O, H+]-, 161 [C10H9O2]-, 145 [C10H10O]-; P P P P P P B B B B B B P P B B P B B P P P P B B P HPLC-DAD (Chiralcel OM, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 90:10), Rt = 29.8 min (S-Enantiomer), Rt = 33.3 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt); ee = 94%; B B IR B ν̃̃ = 3436 (O-H), 3153 (COO-H), 2905 (C-H), 1710 (C=O), 1345, 1216 (C-O), 1163, 1015 cm-1; P P B 112 1 5. Experimenteller Teil (DMSO-d6): δ = 2.36 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2CO2H), 2.74 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH2CO), 5.08 (s, 1H, CHOH), 7.27-7.39 ppm (m, 5H, CHAr); H-NMR P P B B 1 P B B B B B B 13 C-NMR P B B (CDCl3): δ = 2.47-2.58 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H)), 2.65-2.78 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 5.17 (s, 1H, CHOH), 7.32-7.42 ppm (m, 5H, CHAr); H-NMR P B B P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 27.7 (CH2CO2H), 32.4 (CH2CO), 79.7 (CHOH), 127.4 (2 x Cm-Ar), 128.8 (CAr), 129.0 (2 x Co-Ar), 137.6 (Cq), 177.8 (CO2H), 207.8 ppm (CO); B B B B B B B B B B B B B B B B B B Drehwert [α]D22 = -112 (c = 0.86 g/ 100 mL in Methanol); CD λ (nm) (∆ε) = 216 (48.2), 279 (-22.3), 315 (1.3); c = 5.0 x 10-5 mol/L in CH3CN. T B B B B B P P B B P PB T C11H12O4 B B 208.07 B (R)-5-Hydroxy-5-(2-fluorphenyl)-4-oxopentansäure (20e) OH CO2H F O 0.36 mmol 2-Fluorbenzaldehyd (19e) (24 mM) und 0.87 mmol α-Ketoglutarat (3) (58 mM) wurden in 5 mL Reaktionspuffer gelöst. 10 mL desselben Puffers mit 3 mg MenD (final: 200 µg/mL) werden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C langsam unter N2B B Atmosphäre bei 30 °C gerührt. Die Reaktion wurde GC-MS kontrolliert durchgeführt. Nach 42 h wird mit 150 µL Ameisensäure (1%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 20 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck ergaben ohne weitere Aufreinigung 70.5 mg (87%) 20e als gelbes Öl. GC-MS [M1-300] Rt = 8.0 min, m/z (%)180 (7) [M -CO2, 2H]+, 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (50) [C6H4F]+, 75 (22) [C3H7O]+, 57 (23) [C3H5O]+; B B B B B B P B P B B B P B P B B P P B B B B B B B P P P P Rt (Lacton) = 11.1 min, m/z (%) 208 (1) [M]+, 123 (100) [C7H4FO]+, 95 (18) [C6H4F]+, 85 (27) [C4H4O2]+, 75 (8); B B B B B B P P P P B B B B B B B B B B P P P P Umsatz >99%; HPLC-DAD (Chiralcel OM, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 90:10) Rt = 23.4 min (S-Enantiomer), Rt = 24.9 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt), ee = 95%; B B P 1 H-NMR P (CDCl3): δ = 2.48-2.63 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 2.65-2.80 (m, 2H, CHxHyCO CHxHyCO2H), 5.45 (s, 1H, CHOH), 7.07-7.17 (m, 2H, CHAr), 7.277.37 ppm (m, 2H, CHAr); B B B B B B B B B B B B P C-NMR P B B B B B B B B B B B B 13 B B B B (CDCl3): δ = 27.6 (CH2CO2H), 32.1 (d, JC-F = 2.6 Hz, CH2CO), 73.4 (d, JC-F = 3.6 Hz, CHOH), 115.9 (d, 2JC-F = 21 Hz, Cm-Ar), 124.8 (d, 4JC-F = 3.8 Hz, Cm-Ar), 125.0 (d, 2JC-F = 13.5 Hz, Cq), 129.0 (3JC-F = 3.2 Hz, Cp-Ar), 130.5 (3JC-F = 8.3 Hz, Co-Ar), 160.4 (1JC-F = 249 Hz, CF), 177.9 (CO2H), 206.9 ppm (CO); B B B B B P P B B P B B B B P P B B P B B B B B P B P B B B P B B B B B P B B B B P B P B B B B 5. Experimenteller Teil 113 Drehwert [α]22D = -98.2 (c = 0.85 g/100 mL in Methanol); CD λ (nm) (∆ε) = 208 (15.9), 214 (19.7), 278 (-21.9); c = 5.0 x 10-5 mol/L in CH3CN. PB P B B C11H11FO4 B B B B B B B P B P B 226.06 (R)-5-Hydroxy-5-(3-iodphenyl)-4-oxopentansäure (20h) OH CO2H O I 0.3 mmol 3-Iodbenzaldehyd (19h) (20 mM) und 0.65 mmol α-Ketoglutarat (3) (45 mM) wurden in 750 µL MTBE (5%) gelöst und zu 4.25 mL Reaktionspuffer gegeben. 10 mL desselben Puffers mit 3 mg MenD (final: 200 µg/mL) werden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Die Reaktion wurde GC-MS kontrolliert durchgeführt. Nach 42 h wird mit 150 µL Ameisensäure (1%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 20 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck und Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/ Ethylacetat, 3:2, 1% Ameisensäure) ergaben 79.2 mg (79%) 20h als B B gelbes Öl. DC (SiO2) Rf-Wert = 0.1 (Cyclohexan/Ethylacetat = 3:2 mit 1% Ameisensäure; GC-MS [M1-300] B T B T B B Rt = 10.6 min, m/z (%) 288 (9) [M -CO2, 2H]+, 231 (100) [C7H4IO]+, 203 (20) [C6H4I]+, 76 (21) [C6H4]+, 50 (6) [C4H2] +; B B B B B B P B P B B B B P P B B B B B P P B B B B P P P P Rt (Lacton) = 13.4 min, m/z (%) 288 (1) [M-CO]+, 231 (100) [C7H4IO]+, 203 (26) [C6H4I]+, 85 (26) [C4H6O2]+, 76 (17) [C6H4]+, 50 (6) [C4H2]+; B B B B B B P P P B B B B B B P P B B B B P P B P B B B B P B B B P P P Umsatz 95%; IR ν̃̃ = 3392 (O-H), 3054 (COO-H), 2921 (C-H), 1707 (C=O), 1566, 1188 (C-O), 1063 cm-1; P P 1 P H-NMR P (CDCl3): δ = 2.48-2.62 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 2.66-2.76 (m, 2H, CHxHyCO, CHxHyCO2H), 5.11 (s, 1H, CHOH), 7.13 (t, J = 7.8 Hz, 1H, CHm-Ar), 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H, CHo-Ar), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H, CHp-Ar), 7.71 ppm (s, 1H, CHo-Ar); B B B B B B B B B B B B B B P C-NMR P B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 27.7 (CH2CO2H), 32.4 (CH2CO), 78.8 (CHOH), 94.8 (CI), 126.7 (CAr), 130.8 (CAr), 136.4 (CAr), 138.0 (CAr), 139.9 (Cq), 177.7 (CO2H), 207.2 ppm (CO); B B Drehwert B B B 13 B B B B B B B B B B B B B B B B [α]22D = -76.7 (c = 0.72 g/100 mL in Methanol); P PB B B B B B 114 5. Experimenteller Teil λ (nm) (∆ε) = 212 (52.3), 277 (-31.35), 314 (2.3); c = 3.0 x 10-5 mol/L in CH3CN. CD P B C11H11IO4 B B B B B P B 333.96 B Aliphatische Aldehyde als Akzeptoren rac-5-Hydroxy-4-oxohexansäure (22a) OH CO2H O 0.45 mmol Acetaldehyd (21a) (30 mM) und 0.46 mmol α-Ketoglutarat (3) (30 mM) wurden in 750 µL MTBE gelöst. 14.25 mL Reaktionspuffer mit 4 mg MenD (final: 270 µg/mL) wurden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Nach 42 h wurde mit 500 µL Ameisensäure (3%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 15 mL) mal extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck ergaben nach Roh-NMR 61 mg (93%) Rohprodukt der freien Säure als schwachgelbes Öl. 1 (MeOH-d4): δ = 1.35 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 2.59 (t, 2H, J = 6.4 Hz, CH2CO2H), 2.87 (t, 2H, J = 6.4 Hz, COCH2), 4.25 ppm (q, J = 7.0 Hz, 1H, CHOH); H-NMR P P B B 1 P B B B B B B B B B B Drehwert CD λ(nm) (∆ε) (CH3CN) -> kein CD-Effekt; B P PB B B B B B 0 (c = 0.74 g/100 mL in Methanol); B B B B [α]22D = B B (DMSO-d6): δ = 1.18 (d, 3H, J = 7 Hz), 2.38-2.44 (m, 2H, CH2CO2H), 2.752.81 (m, 2H, CH2CO), 4.05 ppm (q, 1H, J = 7 Hz); H-NMR P C6H10O4 B B 146.06 B (R)-5-Hydroxy-4-oxodecansäure (22b) OH CO2H O 0.3 mmol Hexanal (21b) (20 mM) und 0.66 mmol α-Ketoglutarat (3) (45 mM) wurden in 750 µL MTBE (5%) gelöst und zu 4.25 mL Reaktionspuffer gegeben. 10 mL desselben Puffers mit 3 mg MenD (final: 200 µg/mL) wurden zu den gelösten Substraten gegeben und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Die Reaktion wurde GC-MS kontrolliert durchgeführt. 5. Experimenteller Teil 115 Nach 42 h wird mit 150 µL Ameisensäure (1%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 20 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck ergaben ohne weitere Aufreinigung 50.4 mg (83%) (R)-5Hydroxy-4-oxodecansäure als gelbes Öl. 1 (MeOH-d4): δ = 0.94 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.34-1.38 (m, 6H, CH3CH2CH2CH2), 1.58-1.65 (m, 1H, CHxHyCHOH), 1.72-1.81 (m, 1H, CHxHyCHOH), 2.56-2.60 (m, 2H, CH2CO2H), 2.84-2.88 (m, 2H, CH2CO), 4.12 ppm (dd, J = 4.3, 8.2 Hz, 1H, CHOH); H-NMR P P B 13 C-NMR P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (MeOH-d4): δ = 12.9 (CH3), 22.1 (CH3CH2), 24.4 (CH2CH2CHOH), 26.9 (CH2CO2H), 31.4 (CH3CH2CH2), 32.4 (CH2CO), 33.1(CH2CHOH), 76.6 (CH2CHOH), 174.9 (CO2H), 212.3 ppm (CO); B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B λ (nm) (∆ε) = 274 (-2.95); c = 8 x 10-5 mol/L in CH3CN. B B B B B B P P B B B CD PB B B [α]22D = -21 (c = 0.50 g/100 mL in Methanol); P B B Drehwert C10H18O4 B B B 202.12 B (R)-5-Hydroxy-4-oxopentadec-14-ensäure (22c) OH CO2H O MenD (200 µg) wurde in 1.42 mL Reaktionspuffer und 75 µL MTBE (5%) mit Undec-10enal (21c) (20 mM) und 12.6 mg α-Ketoglutatrat (3) (50 mM) bei 30 °C und 300 UpM (Thermomixer, EPPENDORF) inkubiert. Nach 16, 24 und 44 Stunden wurden je 100 µL Ansatz mit je 200 µL Ethylacetat und 2 µL Ameisensäure zur Analyse extrahiert. Für NMR Analyse wurde der komplette Ansatz nach 44 Stunden mit 15 µL Ameisensäure und CDCl3 extrahiert. B B 67% Rohausbeute in bereits hoher Reinheit, wurden als gelbes Öl erhalten. GC-MS [M1-300] Rt = 10.0 min, m/z (%) 167 (16) [C11H19O]+, 149 (71) [C11H17]+, 121 (5) [C9H13]+, 107 (22) [C8H11]+, 93 (18) [C7H9]+, 83 (49) [C6H11]+, 55 (100) [C4H7]+; B B B B B B B B B P B P B B B B P B B P B B P P B B B B P P B B B B B B B P P P P P B P Rt (Lacton) = 12.6 min, m/z (%) 167 (18) [C11H19O]+, 149 (67) [C11H17]+, 107 (16) [C8H11]+, 93 (13) [C7H9]+, 85 (100) [C4H4O2]+, 55 (71) [C4H7]+; B B B P 1 H-NMR P B B B B P P B B B B P P B B B B B B B B B P P P B P B B B B B B B P P P P (CDCl3): δ = 1.19-1.50 (m, 8H, CH2), 1.58-1.65 (m, 1H, CHxHyCHOH), 1.801.91 (m, 1H, CHxHyCHOH), 2.01-2.09 (q, 2H J = 6.9 Hz, CH2CH2CHolef), 2.70-2.86 (m, 4H, CH2CH2CO2H), 4.26 (dd, 1H, J = 3.8 Hz, CHOH), 4.97-5.00 (m, 1H, CHxHyCHolef), 5.02-5.04 (m, 1H, CHxHyCHolef), 5.77-5.88 ppm (m, 1H, CH2CHolef); B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Umsatz nach Integralverhältnis Edukt/Produkt: 60%; PP P 13 C-NMR P (CDCl3): δ = 24.7, 27.6, 28.8, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 32.3, 33.5, 33.7 (CH2), B B B B 116 5. Experimenteller Teil 76.5 (CHOH), 114.1 (CH2 (CO); B olef), 139.1 (CH2 B olef), B 177.7 (CO2H), 203.2 ppm B B B Drehwert [α]22D = -50 (c = 0.63 g/100 mL in Methanol); CD λ (nm) (∆ε) = 273 (-21.8), 309 (2.0); c = 3.2 x 10-5 mol/L in CH3CN. B B B B B B P P B B 270.18 C15H26O4 B PB P B B Ungesättigte Aldehyde als Akzeptoren (R)-5-Cyclohexenyl-5-hydroxy-4-oxopentansäure (24) O HO CO2H 0.3 mmol Cyclohexencarbaldehyd (23) (20 mM) und 0.66 mmol α-Ketoglutatrat (3) (45 mM) wurden in 750 µL MTBE (5%) gelöst und zu 4.25 mL Reaktionspuffer gegeben. 10 mL desselben Puffers mit 2 mg MenD (final: 133 µg/mL) werden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Die Reaktion wurde GC-MS kontrolliert durchgeführt. Nach 44 h wird mit 150 µL Ameisensäure (1%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 20 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des B B B B Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/ Ethylacetat, 3:2, 1% Ameisensäure) ergaben B B 13.6 mg (21%) 24 als gelbes Öl. DC (SiO2) Rf-Wert = 0.15 (Cyclohexan/Ethylacetat = 3:2 mit 1% Ameisensäure); GC-MS [M1-300] B B B B Rt = 7.6 min, m/z (%) 168 (2) [M -CO2]+, 111 (24) [C7H11O]+, 83 (100) [C6H11]+, 55 (44) [C3H3O]+; B B B B B B B P P B B B B P B P P B B B B P P P Rt (Lacton) = 11.5 min, m/z (%) 109 (100) [C7H9O]+, 81 (45) [C6H9]+, 53 (7) [C4H5]+; B B B B B B B B B B P P B B B B P P P P Umsatz 22%; MS (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z (%) 211 [M -H+]-, 167 [M -CO2, H+]-; P B P 1 H-NMR P B P P P C-NMR P P P P B B T B B B B B B B B B B B B B B B T P P (CDCl3): δ = 1.51-1.67 (m, 5H, 2x CH2, 1x CHxHyCq), 2.07-2.15 (m, 3H, CHolefCH2, CHxHyCq ), 2.69-2.82 (m, 4H, COCH2CH2CO2H), 4.57 (s, 1H. CHOH), 5.96-5.97 ppm (m, 1H, CHolef); B 13 P P B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 22.1, 22.2 (CH2), 22.8 (CH2ColefH), 25.3 (CqCH2), 27.7 (CH2CO2H), 32.1 (CH2CO), 82.3 (CHOH), 129.9 (CHolef), 135.2 (Cq), 177.7 B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 5. Experimenteller Teil 117 (CO2H), 207.2 ppm (CO); B B Drehwert [α]22D = -111 (c = 0.15 g/100 mL in Methanol); CD λ (nm) (∆ε) = 213 (5.3), 281 (-8.3), 319 (0.1); c = 5.4 x 10-5 mol/L in CH3CN. B P P B B B B B 212.1 C11H16O4 B PB P B B Acetoin und α-Hydroxyketone durch Kondensation von α-Ketosäuren rac-Acetoin wurde in Spuren mit 1-3% Umsatz erhalten, rac-4-Hydroxy-5-oxohexansäure und rac-5-Hydroxy-4-oxopentansäure mit Rohausbeuten von 64% bzw 53% in ausreichender Reinheit. rac-Acetoin (3-Hydroxybutan-2-on) (29) O H OH 0.1 mmol Pyruvat (66 mM) werden in 1.5 mL Reaktionspuffer mit 500 µg MenD gelöst und bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Nach 42 h wurde mit CDCl3 extrahiert. B B Chirale GC (Lipodex D, isokratisch, 70 °C) Rt = 13.7 min (R), 18.3 min (S); B 1 H-NMR P P C4H8O2 B B B B B B (CDCl3): δ = 1.42 (d, J = 7 Hz, 3H, HCOHCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 4.14 (q, J = 7. Hz, 1H, CHOH); B B B B B B 88.05 B rac-4-Hydroxy-5-oxohexansäure (30) O H CO2H OH 0.45 mmol Pyruvat (30 mM) und 0.46 mmol α-Ketoglutarat (3) (30 mM) wurden in 2 mL Reaktionspuffer gelöst. 12.5 mL Reaktionspuffer mit 4.3 mg MenD (final: 290 µg/mL) werden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Nach 42 h wird mit 750 µL Ameisensäure (5%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 15 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels B B B B unter vermindertem Druck ergaben 42 mg (64%) Rohprodukt der freien Säure als gelbes Öl. P 1 H-NMR P (DMSO-d6): δ = 2.12 (s, 3H, CH3), 2.25-2.30 (m, 2H, CH2), 2.47-2.52 (m, 2H, CH2), 3.50 (br s, CHOH), 3.89 (q, J = 4.5 Hz, 1H, CHOH), 12.12 ppm (br s, 1H, CO2H); B B B B B B B B B B 118 5. Experimenteller Teil Drehwert [α]22D = 0 (c = 0.79 g/100 mL in Methanol); CD λ (nm) (∆ε) in CH3CN -> kein CD-Effekt; B B C6H10O4 B PB P B B B B B 146.06 B 5-Hydroxy-4-oxopentansäure (31) OH CO2H H H O 0.18 mmol Glyoxylat (30 mM) und 0.18 mmol α-Ketoglutarat (3) (30 mM) wurden in 2 mL Reaktionspuffer gelöst. 4 mL Puffer mit 4 mg MenD (final: 660 µg/mL) wurden in den Ansatz pipettiert und die Mischung bei 30 °C und 300 UpM geschüttelt. Nach 42 h wird mit 60 µL Ameisensäure (1%) acidifiziert und mit Ethylacetat (3 x 15 mL) extrahiert. Die Ethylacetat-Phase wird über Na2SO4 getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels unter B B B B vermindertem Druck ergaben 12 mg (53%) Rohprodukt der freien Säure als farbloses Öl. 1 P H-NMR P (DMSO-d6): δ = 2.43 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH2CO2H), 2.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H, COCH2), 4.06 (s, 2H, CH2OH, 5.15 ppm (br s, 1H, CH2OH); B B 13 C-NMR P P B B B B B B B B B B B B B (DMSO-d6): δ = 27.7 (CH2CO2H), 33.1 (CH2CO), 67.8 (CH2OH), 174.1 (CO2H), 210.4 ppm (CO); B B C5H8O4 B B B B B B B B B B B B 132.04 B Ketocarbonsäuren als Donoren MenD (800 µg) wurde in Reaktionspuffer in der Anwesenheit von 20 mM Akzepor (Benzaldehyd (10) beziehungsweise 2-Fluorbenzaldehyd (19e) und 50 mM Donor (Pyruvat beziehungsweise Oxalacetat) bei 30 °C und 300 UpM inkubiert. Nach 24 Stunden wurden je 100 µL Ansatz mit je 200 µL Ethylacetat und 2 µL Ameisensäure zur Analyse extrahiert. Sowohl für Pyruvat als auch für Oxalacetat als Donor konnte die Bildung von (R)Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC, 11) und (R)-2-Fluorphenylacetylcarbinol ((R)-2-Fluor-PAC, 26) nachgewiesen werden. Mit Pyruvat wurden Umsatzraten von 1-5% nach GC-MS, für Oxalacetat Umsatzraten von 2-24% nach GC-MS erreicht. 5. Experimenteller Teil 119 (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC, 11) OH O [M1-300] GC-MS Rt = 7.7 min, m/z (%) 150 (2) [M]+, 122 (100) [M -CO]+, 107 (41) [C7H7O]+, 77 (96) [C6H5]+; B B P P B B B B P P P B B B B P P P HPLC-DAD (Chiralcel OM, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 90:10) Rt = 11.2 min (S-Enantiomer), Rt = 13.3 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt), ee n.b.; B B C9H10O2 B B B B B B B 150.07 B (R)-2-Fluorphenylacetylcarbinol ((R)-2-Fluor-PAC, 26) OH F O [M1-300] GC-MS Rt = 7.6 min, m/z (%) 168 (2) [M]+, 140 (38) [M -CO]+, 125 (100) [C7H6FO]+, 97 (53) [C6H6F]+, 77 (31) [C6H5]+, 51 (11) [C4H3]+; B B P P B B B B P P B B B B P P P B B B B P P P B B B B P P HPLC-DAD (Chiralcel OM, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 90:10) Rt = 10.4 min (S-Enantiomer), Rt = 12.6 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt), ee n.b.; B B 168.06 C9H9O2F B B B B B B B B 5.5.3. 2,3-CHD als unnatürlicher Akzeptor der 1,4-Addition 0.14 mmol 2,3-CHD (20 mM) und 0.35 mmol α-Ketoglutatrat (3) (50 mM) wurden in 7 mL Reaktionspuffer mit 0.2 mg/mL MenD gelöst und bei 30 °C und 300 UpM inkubiert. Die Reaktion wurde 1H-NMR kontrolliert durchgeführt. Nach 10 h wurde vollständiger Umsatz P P von 2,3-CHD zu 40 NMR-spektroskopisch nachgewiesen. (1R,5S,6S)-2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-3-encarbonsäure (40) O CO2H OH HO2C OH P 1 H-NMR P (D2O): δ = 2.28-2.85 (m, 4H, CH2CH2), 2.52 (t, 1H, J = 11.1 Hz CHCO2H), 3.60 (m, 2H, CHOH, CHCO), 4.04 (d, 1H, J = 8.4 Hz CHOH), 5.61 (s, 2H, CHolef); B B B B B B B B B B 120 5. Experimenteller Teil 258.07 C11H14O7 B B B B B B Nach drei Tage bei Raumtemperatur wurde das Produkt 40 vollständig zu 41 umgelagert. (1R,5S,6S)-2-Succinyl-5,6-dihydroxycyclohex-2-encarbonsäure (41) O CO2H OH HO2C OH 1 (D2O): δ = 2.36-2.48 (m, 3H, CH2CO2H, CHolefCHxHy), 2.70-2.83 (m, 1H, CHolefCHxHy), 2.88 (dt, J = 6.4, 17.9 Hz, COCHxHy), 3.14 (dt, J = 7.1, 17.9 Hz, COCHxHy), 3.18-3.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H, CHCO2H), 3.77-3.80 (m, 2H, CHOH), 7.09 ppm (t, J = 2.6 Hz, 1H, CHolef); H-NMR P P B B B B B B B B B B B B B B B B B C-NMR P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 258.07 C11H14O7 B B B B B B B (D2O): δ = 34.2 (CH2CO2H), 35.2(CH2CHolef), 36.2 (CH2CO), 55.3 (CHCO2H), 71.5 (CH2CHOH), 76.6 (CHCHOH), 139.5 (Cq), 142.7 (CHolef), 183.5 (CHCO2H), 184.5 (CH2CO2H), 205.7 ppm (CO); B B B B B 13 B B B B 5.6. Chemische Synthesen 5.6.1. Derivatisierungsversuche von Chorismat und SHCHC Methyl 3-(3-methoxy-3-oxoprop-1-en-2-yloxy)benzoat (15) CO2CH3 O CO2CH3 0.4 mmol (90 mg) Chorismat wurden in 2.6 mmol (200 µL) DMF und 4 mmol (530 µL) N,NDimethylformamid-dimethylacetal gelöst. Nach 2 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Chorismat wurde vollständig umgesetzt und es wurden 72 mg Rohprodukt erhalten. Hauptprodukt ist nach NMR Methyl 3-(3-methoxy-3-oxoprop-1en-2-yloxy)benzoat (gelbes Öl). DC (SiO2) Rf = 0.4 (Cyclohexan/Ethylacetate 7:1) 1 (MeOH-d4): δ = 3.82 (s, 3H, OCH3), 3.93 (s, 3H, OCH3),5.19 (d, J = 2.1 Hz, 1H, CHxHyolef), 5.89 (d, J = 2.1 Hz, 1H, CHxHyolef), 7.27-7.32 (m, 1H, CHp-Ar), 7.48-7.53 (m, 1H, CHm-Ar),7.62-7.64 (m, 1H, CHo-Ar), 7.79-7.83 ppm (m, 1H, CHo-Ar); P B B H-NMR P B B B B B B B B P 13 C-NMR P B B B B B B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 51.4 (CArCO2CH3), 51.6 (ColefCO2CH3), 106.1 (CH2olef), 118.3 (CHo-Ar), 122.6 (CHp-Ar), 124.4 (CHo-Ar), 129.7 (CHm-Ar), 131.7 (Cq, CArCO2CH3), 149.5 (Cq, ColefCO2CH3), 156.2 (Cq, Cm-ArH), 163.4 (ColefCO2CH3), 166.2 ppm (CArCO2CH3); B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 5. Experimenteller Teil C12H12O5 B B B B B 121 236.07 B Methyl 2-(4-methoxy-4-oxobutanoyl)benzoat (16) O CO2CH3 H3CO2C Ausgangssubstanz hierfür ist SHCHC (5.6.3) 5.6.2. Methylester der 5-Hydroxy-4-oxopentansäurederivate Die Carbonsäurefunktion der enzymatisch synthetisierten Hydroxyketone wurde mit Trimethylsilyl(TMS)-Diazomethan verestert [95]. Durch die Methylierung der Säure konnte die Polarität der Verbindungen erniedrigt und damit die Aufreiniung und Analyse erleichtert werden. Die Hydroxyketone (0.1 mmol) wurden hierzu bei Raumtemperatur in 2 mL Toluol/Methanol (3:2) gelöst. Tropfenweise wurde eine 2 M Lösung von TMS-Diazomethan in Ether zugegeben bis eine leichte Gelbfärbung erhalten blieb. Nach 1 h under stetigem Rühren wurde der Überschuss an TMS-Diazomethan mit 10 µL Essigsäure zerstört. Nach Lösungsmittelentfernung unter vermindertem Druck konnten hohe Ausbeuten der Methylester erhalten werden. Je nach Reinheitsgrad wurden die Produkte mit Säulenchromatographie aufgereinigt. Dabei wurden unterschiedliche Mischungsverhältnisse von Ethylacetat mit Cyclohexan angewendet. Durch diese Aufreinigungmethode konnte keine signifikante Razemisierung beobachtet werden. (R)-Methyl 5-hydroxy-5-(3-iodphenyl)-4-oxopentanoat (25a) OH CO2CH3 O I Die aufgereinigte, freie Säure 5-Hydroxy-5-(3-iodphenyl)-4-oxopentansäure (20h) wurde mit TMS-Diazomethan methyliert. Ohne weitere Aufreinigung wurde 25a mit einer Rohausbeute von 50% als gelbes Öl erhalten. HPLC-DAD (Chiralcel OD, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 90:10) Rt = 28.9 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt), Rt = 31.9 min (S-Enantiomer), ee = 98%; B B P 1 H-NMR P B B (CDCl3): δ = 2.52-2.59 (m, 2H, CH2) , 2.66-2.78 (m, 2H, CH2), 3.68 (s, 3H, OCH3), 5.12 (s, 1H, CHOH), 7.15 (t, J = 7.9 Hz, 1H, Hm-Ar), 7.34 (d, J = 7.9 B B B B B B B B B B 122 5. Experimenteller Teil Hz, 1H, Ho-Ar), 7.71 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Hp-Ar), 7.73 ppm (s, 1H, Ho-Ar); B 13 P B B B B B B B B B B B C12H13IO4 B B B B (CDCl3): δ = 27.7, 32.6 (CH2), 52.0 (OCH3), 79.0 (CHOH), 94.8 (CI), 126.6 (CHAr), 130.6 (CHAr), 136.3 (CHAr), 137.9 (CHAr), 140.0 (Cq), 172.5 (CO2CH3), 207.3 ppm (CO). C-NMR P B B B B B B B B B B B B B B B 347.99 B (R)-Methyl 5-hydroxy-4-oxodecanoat (25b) OH CO2CH3 O Nach Extraktion aus dem enzymatischen Ansatz wurde das Produkt 22b direkt mit TMSDiazomethan methyliert. Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, B B Cyclohexan/ Ethylacetat, 4:3) ergaben 25b mit einer isolierten Ausbeute von 81% als farbloses Öl. +MS2 (Produktscan, PhotosprayTM, EI): m/z (%) 217 (100) [M +H+]+, 199 (4) [M -H2O, +H+]+, 115 (17) [C5H7O3]+, 91 (57) [C7H7]+,83 [C6H11]+; MS-MS P P B B P P P P B B B B B B P P P B B B B P P B B B B P PB P P P B LC-MS-MS (HPLC: Chiralcel OB, 25 °C, 0.75 mL/min, n-Hexan / 2-Propanol = 97:3; MS/MS: +MRM scan (mass 217/91), TurbolonSprayTM source, EI): Rt = 16.1 min (R-Enantiomer, Hauptprodukt), Rt = 18.9 min (S-Enantiomer); ee = 25%; P B 1 P B B B B B 13 C-NMR P C11H20O4 B B B B B B B (CDCl3): δ = 0.90 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.31-1.55 (m, 6H, CH2), 1.58-1.65 (m, 1H, CHxHyCHOH), 1.72-1.81 (m, 1H, CHxHyCHOH), 2.56-2.82 (m, 4H, CH2CH2CO2H), 3.34 (br s, 1H, CHOH), 3.69 (s, 3H, OCH3), 4.24 ppm (dd, J = 3.9, 7.5 Hz, 1H, CHOH); H-NMR P P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 13.9 (CH3), 22.4, 24.4, 27.6 (CH2), 31.6 (CH2CO), 32.5 (CH2CO2CH3), 33.6 (CH2CHOH), 51.9 (OCH3), 76.5 (CHOH), 172.8 (CO2CH3), 210.7 ppm (CO); B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 216.14 (R)-Methyl 5-cyclohexenyl-5-hydroxy-4-oxopentanoat (25c) O HO CO2CH3 Nach Extraktion aus dem enzymatischen Ansatz wurde das Produkt 24 direkt mit TMSDiazomethan methyliert. Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, B B Cyclohexan/ Ethylacetat, 7:3) ergaben 25c mit einer isolierten Ausbeute von 21% als farbloses Öl. 5. Experimenteller Teil 123 [M1-300] GC-MS Rt = 11.07 min, m/z (%) 226 (1) [M]+, 166 (28) [M -CO2, -2H]+, 111 (100) [C7H11O]+, 81 (38) [C6H9]+, 67 (86) [C5H7]+, 55 (50) [C4H7]+; B B 1 B B B P B B B B B B B B B B P P B B B B B C12H18O4 P P B B B B P P B B B B B P P P P (CDCl3): δ = 1.50-1.66 (m, 5H, CH2), 2.08-2.15 (m, 3H, CH2), 2.62-2.81 (m, 4H, CH2), 3.70 (s, 3H, OCH3), 4.55 (s, 1H, CHOH), 5.96-5.97 ppm (m, 1H, CHolef); H-NMR P P P B B B B B B B B 226.12 B rac-Methyl 4-hydroxy-5-oxohexanoat (32) O H CO2CH3 OH Nach Extraktion aus dem enzymatischen Ansatz wurde das Produkt 30 direkt mit TMSDiazomethan methyliert. Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, B B Cyclohexan/ Ethylacetat, 4:3) ergaben 32 mit einer isolierten Ausbeute von 17% als gelbes Öl. DC (SiO2) Rf = 0.35 (Cyclohexan/Ethyl acetat = 4:3 mit 0.1% Ameisensäure); 1 (C6D6): δ = 1.45-1.54 (m, 1H, CHxHyCO2CH3), 1.64 (s, 3H, CH3), 1.90-1.99 (m, 1H, CHxHyCO2CH3), 2.30-2.47 (m, 2H, CH2CO), 3.40 (s, 3H, OCH3), 3.86 ppm (dd, J = 3.8, 8.5 Hz, 1H, CHOH); B B H-NMR P P B B B B B B B B 1 P H-NMR P P B B B C-NMR P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 25.2 (CH3), 28.4 (CH2CHOH), 29.2 (CH2CO2CH3), 51.7(OCH3), 75.7 (CH2CHOHCO), 173.6 (CO2CH3), 209.3 ppm (CO); B B B B B B B P PB B B B B B B B B B B B B B 0 (c = 0.66 g/100 mL in Methanol); B B B B λ(nm) (∆ε) in CH3CN -> kein CD-Effekt; B B B CD B B B Drehwert B B B B B B B [α]22D = C7H17O4 B B B B P B B (CDCl3): δ = 1.75-1.85 (m, 1H, CHxHyCO2CH3), 2.21-2.31 (m, 1H, CHxHyCO2CH3), 2.26 (s, 3H, CH3CO), 2.43-2.63 (m, 2H, CH2CHOH), 3.07 (s, 3H, COOCH3), 4.24 ppm (dd, J = 8.8, 8.3 Hz); P B 13 B B B 160.07 rac-Methyl 5-hydroxy-4-oxohexanoat (33) OH CO2CH3 H O Nach Extraktion aus dem enzymatischen Ansatz wurde das Produkt 22a direkt mit TMSDiazomethan methyliert. Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, B B Cyclohexan/ Ethylacetat, 4:3) ergaben 33 mit einer isolierten Ausbeute von 25% als gelbes Öl. 124 1 5. Experimenteller Teil H-NMR P P (CDCl3): δ = 1.42 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 2.63-2.88 (m, 4H, CH2CH2), 3.69 (s, 3H, OCH3), 4.31 ppm (q, J = 7.0 Hz, 1H, CHOH); B B B B 13 C-NMR P P B B B B B B B B B B CD λ(nm) (∆ε) in CH3CN -> kein CD-Effekt; PB P B B B B B B B B B B 160.07 C7H12O4 B B 0 (c = 0.62 g/100 mL in Methanol); B B B B Drehwert B B (CDCl3): δ = 19.7 (CH3), 27.5 (CH2CO2CH3), 32.1 (CH2CO), 51.9 (OCH3), 72.7 (CHOH), 172.8 (CO2CH3), 210.9 ppm (CO); [α]22D = B B B B B 5.6.3. Vergleichsubstanzen und Enzymsubstrate Methyl 2-(4-methoxy-4-oxobutanoyl)benzoat (16) O CO2CH3 H3CO2C 73.2 mg (0.3 mmol) SHCHC (5) wurden in 2 mL Toluol/Methanol (3:2) gelöst. Zu der Lösung wird bei Raumtemperatur TMS-Diazomethan (2 M in Diethylether) tropfenweise zugegeben bis eine Gelbfärbung erhalten bleibt. Nach 30 min unter kontinuerlichem Rüheren wird dieser Überschuss TMS-Diazomethan mit 2 µL Essigsäure zerstört. Die Lösungsmittel wurden unter verminderten Druck entfernt, das Rohprodukt in 5 mL gesättigter NaCl-Lösung aufgenommen und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, B B Cyclohexan/ Ethylacetat, 7:3) ergaben 56 mg (66%) 16 als farbloses Öl. DC(SiO2) Rf = 0.4 (Ethylacetat/ Cyclohexan 3:7) ; 1 (CDCl3): δ = 2.83 (t, J = 6.9, 6.7 Hz, 2H, CH2CO2CH3), 3.61 (t, J = 6.9, 6.7 Hz, 2H, COCH2), 3.73 (s, 3H, CH2CO2CH3), 3.91 (s, 3H, CArCO2CH3), 7.45 (dd, J = 7.7, 1.2 Hz, 1H, CHAr), 7.53 (dt, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H, CHAr), 7.61 (dt, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H, CHAr), 7.93 ppm (dd, J = 7.7, 1.2 Hz, CHAr) ; B P B H-NMR P B B B B B B B B B B 13 P C-NMR P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 28.2 (CH2CO2CH3), 37.5 (COCH2), 51.8 (CH2CO2CH3), 52.5 (CArCO2CH3), 126.2 (CArH), 128.2 (CqCO2CH3), 129.8 (CArH), 129.9 (CArH), 132.3 (CArH), 143.0 (COCq), 167.0 (CArCO2CH3), 173.3 (CH2CO2CH3), 203.8 ppm (CO) ; B C13H14O5 B 250.08 B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 5. Experimenteller Teil 125 2-(Succinyl)benzoesäure (6) O CO2H HO2C 25 mg (0.1 mmol) Methyl 2-(4-methoxy-4-oxobutanoyl)benzoat (16) wurden in 2 mL einer Mischung aus Wasser/Methanol 1:1 gelöst. 12 mg (5 eq, 0.5 mmol) LiOH wurden zugegeben und die Lösung 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Zur Extraktion wurden 10 mL 1 M HCl zugegeben und mit Ethylacetat (2 x 10 mL) extrahiert. Nach Trocknung und Lösungsmittelentfernung wurde 6 aus Chloroform kristallisiert und in einer Ausbeute von 42% als weisse Kristalle erhalten. HPLC (RP8, anja3.m): Rt = 23.1 min, UVmax = 233 nm; 1 (D2O): δ = 2.37 (t, J = 7.1 Hz, 2H, CH2CO2H), 2.65 (t, J = 7.1 Hz, 2H, COCH2), 7.59 (d, J = 7.9 Hz, 1H, CHAr), 7.61 (t, J = 7.9 Hz, 1H, CHAr), 7.73 (t, J = 7.5 Hz, 1H, CHAr), 7.79 ppm (d, J = 7.5 Hz, 1H, CHAr); B H-NMR P P B B B B B B B B B 13 C-NMR P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B 222.05 C11H10O5 B B B B B B B B (D2O): δ = 28.4 (CH2CO2H), 34.0 (COCH2), 123.8 (CArH), 126.3 (CArH), 126.9 (CqCO2H), 131.2 (CArH), 134.6 (CArH), 145.3 (CqCO), 171.2 (CArCO2H), 177.1 ppm (CH2CO2H); B B B B B 2-Acetoxycyclohexa-3-encarbonsäure (42) CO2H O O 7.6 mL Acrylsäure (8.0 g, 140 mmol) und 10.4 mL 1-Acetoxy-1,3-butadien (10.0 g, 90 mmol) wurden in 55 mL Toluol gelöst. 0.31 g 1,4-Dihydrochinon (2.7 mmol) wurde hinzugegeben und der Ansatz 19 h unter Reflux gekocht. Nach Zugabe von 55 mL Ethylacetat wurde die organische Phase mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. B B Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/ Ethylacetat, 4:1, 1% Ameisensäure) B B ergaben 4.38 g (23 mmol, 25%) 42 als braunen Feststoff. P 1 H-NMR P (CDCl3): δ = 1.77-1.98 (m, 1H, CH2), 2.03 (s, 3H, CH3), 2.04-2.08 (m, 1H, CH2), 2.08-2.21 (m, 1H, CH2), 2.22-2.33 (m, 1H, CH2), 2.69 (dt, J = 3.5, 12.8 Hz, 1H, CHCO2H), 5.56 (t, J = 4.3 Hz, 1H, CHOCO), 5.93 (m, 1H, CH), 6.03 (m, 1H, CH), 10.16 ppm (s, 1H, CO2H). B B B B B B B B B B B B B 184.07 B B B B B C9H12O4 B B B B 126 5. Experimenteller Teil 1,3-Cyclohexadiencarbonsäure (37) CO2H 2-Acetoxycyclohex-3-encarbonsäure (42) (223 mg, 1.8 mmol) wurden in 1 mL H2O gelöst. B B Tropfenweise wurde 500 µL H2SO4 zugegeben. Nach 1.5 h bei 40 °C wurde der Ansatz mit B B B B Ethylacetat (3 x 5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 B B B B getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Reinigung des Rohproduktes durch Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/Ethylacetat, 7:3, 1% B B Ameisensäure) ergaben 43.5 mg, 0.35 mmol (20%) 37 als farbloses Öl. 1 H-NMR P P (D2O): δ = 2.28-2.35 (m, 2H, CH2CHolef), 2.44-2.51 (m, 2H, CH2Cq), 6.08-6.14 (m, 1H, CH2CHolef), 6.20-6.25 (m, 1H, CH2CHolefCHolef), 7.15 ppm (d, J = 5.0 Hz, 1H, CHolefCq); B B B B B B B 13 C-NMR P P B B B B B B B B B B B B B B B B B B B (D2O): δ = 20.2 (CqCH2), 22.8 (ColefCH2), 123.9 (ColefCH2), 126.4 (Cq), 134.7 (CH2CHolefCHolef), 135.4 (CHolefCq), 172.8 ppm (CO2H); B B T B C7H8O2 B B B B B T B B B B B B T T B B B B B B B B B B B B B B B B B 124.05 TB (5S,6S)-5,6-Dihydroxycyclohex-1-encarbonsäure (38) CO2H OH OH 2,3-CHD (7) (97.5 mg, 0.6 mmol) und 6 mg Pd/C (10%) wurden in 25 mL Methanol suspendiert. Nach 30 min in H2-Atmosphäre unter 0.5 bar bei 20 °C wurde das Lösungsmittel B B unter verminderten Druck entfernt und das Produkt mit 90%iger Reinheit nach NMR in einer Ausbeute 92 mg Rohprodukt (85 % bezogen auf die Reinsubstanz) als gelbes Öl erhalten. MS (-Q1 scan, TurbolonSprayTM Quelle, EI): m/z (%) 157 (100) [M -H+]-, 139 (15) [M -H2O, H+]-, 95 (43) [M -CO2, H2O, H+]-, 69 (17) [M -CO2, H2O, C2H2, H+]-; B 1 H-NMR P P B P P P P B H-NMR P B B C-NMR B B P B P B B B B P P B B B B P P P P B B B B B B B B B (MeOH-d4): δ = 1.71-1.78 (m, 1H, CHOHCHxHy), 1.87-1.94 (m, 1H, CHOHCHxHy), 2.21-2.29 (m, 1H, CHCHxHy), 2.25-2.34 (m, 1H, CHCHxHy), 3.92-3.94 (m, 1H, CH2CHOH, 4.35 (d, J = 3.7 Hz, 1H, CqCHOH), 7.14 ppm (t, J = 3.9 Hz, 1H, CHolef); B B B B B B B B P B B B P B P B B 13 P P P B B P P (D2O): δ = 1.68-1.76 (m, 1H, CHOHCHxHy), 1.81-1.88 (m, 1H, CHOHCHxHy), 2.24-2.28 (m, 2H, CH2CH), 3.89-3.93 (m, 1H, CH2CHOH, 4.35 (d, J = 4.5 Hz, 1H, CqCHOH), 6.74 ppm (t, J = 3.6 Hz, 1H, CHolef); B 1 P P P B B B B B B B B B B B B B B (MeOH-d4): δ = 21.4 (CHCH2), 23.1 (CH2COH), 66.3 (CqCOH), 69.2 (CH2COH), 129.9 (Cq), 142.6 (CHolef), 168.8 ppm (CO2H); B B B B B B B B B B B B B B B B 5. Experimenteller Teil C7H10O4 B B B B B 127 158.06 B Methyl 7-oxa-bicylo[2.2.1]hept-5-en-2-carboxylat (43) O CO2CH3 14.1 mmol Furan (958 mg, 1030 µL), 10.0 mmol Methylacrylat (860 mg, 900 µL) und 3.0 mmol ZnI2 (957 mg) wurden 48 h in einem geschlossenen System bei 40 °C gerührt [102]. B B Das Reaktionsgemisch wurde mit 100 mL Ethylacetat verdünnt und mit 0.1 M Natriumthiosulfatlösung gewaschen. Nach Trocknug über MgSO4 und Entfernen des B B Lösungsmittels unter Vakuum wurde 5 mmol Methyl 7-oxa-bicylo[2.2.1]hept-5-en-2carboxylat (771 mg) in einer Ausbeute von 50% erhalten. Exo-Produkt: 1 H-NMR P P (CDCl3): δ = 1.56 (dd, 1H, J = 8.6, 11.8 Hz, CHCHxHyCH), 2.17 (dt, J = 4.3, 11.8 Hz, CHCHxHyCH), 2.43 (dd, 1H, J = 3.8, 8.6 Hz, CHCO2CH3), 3.73 (s, 3H, COOCH3), 5.08 (br d, 1H, J = 4.5 Hz, CH2CHO), 5.20 (br d, 1H, J = 1.8 Hz, CHCHO), 6.35 (dd, 1H, J = 1.7, 6.0 Hz,CHolef), 6.39 ppm (dd, 1H, J = 1.7, 6.0 Hz,CHolef). B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Endo-Produkt: 1 P H-NMR P (CDCl3): δ = 1.57 (dd, 1H, J = 3.7, 11.5 Hz, CHCHxHyCH), 2.10 (dt, J = 4.7, 9.4, 14.1 Hz, CHCHxHyCH), 3.12 (ddd, 1H, J = 3.8, 4.8, 8.6 Hz, CHCO2CH3), 3.64 (s, 3H, COOCH3), 5.02 (br d, 1H, J = 4.7 Hz, CH2CHO), 5.10 (br d, 1H, J = 4.7 Hz, CHCHO), 6.22 (dd, 1H, J = 1.7, 6.0 Hz,CHolef), 6.42 ppm (dd, 1H, J = 1.7, 6.0 Hz,CHolef). B B B B B B B B B B B B C8H10O3 B B B B B B B B B B B B B 154.06 B Methyl 5-hydroxycyclohexa-1,3-diencarboxylat (44) CO2CH3 OH 6 mmol Lithiumhexamethyldisilylazid (LiHMDS) wurden in 10 mL trockenem THF bei 0 °C gelöst [102, 103]. Die Lösung wurde auf -68 °C abgekühlt und 5.0 mmol Methyl 7-oxabicylo[2.2.1]hept-5-en-2-carboxylat, gelöst in 2.5 mL trockenem THF, langsam zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei -68 °C gerührt und danach innerhalb 30 min auf 0 °C erwärmt. Die Reaktion wurde mit 10 mL gesättigter NH4Cl-Lösung gequencht und für 1 h B B stehengelassen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (2 x 12.5 mL) extrahiert und über MgSO4 B B getrocknet. Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigen des Rohproduktes durch 128 5. Experimenteller Teil Säulenchromatographie (SiO2, Cyclohexan/ Ethylacetat, 1:1) ergaben 2.4 mmol 44 (368 mg) B B in einer Ausbeute von 48%. P 1 (CDCl3): δ = 1.68 (m, 1H, OH), 2.66 (ddd, 1H, J = 2.5, 7.8, 19 Hz CHCHxHyCHOH), 2.95 (ddd, 1H, J = 1.0, 5.3, 19 Hz, CHCHxHyCHOH), 3.8 (3 H, s, OCH3), 4.40 (1 H, m, CHOH), 6.26 (2 H, m, CHolefCHolefCHOH), 7.10 ppm (1H, m, CHCCO2CH3). H-NMR P B B B B B B B B B B B 13 P B B C8H10O3 B B B B B B B B B B B (CDCl3): δ = 31.4 (CH2), 51.8 (OCH3), 63.0 (CHOH), 124.8 (Cq), 126.9 (CHolef), 131.4 (CHolefCHOH), 133.2 (CHolefCq), 167.4) ppm (CO2CH3). C-NMR P B B B B B B B B B B B 154.06 B 5.7. Kristallisation 5.7.1. Stabilität von MenD in Lösung Um die Stabilität von MenD in Abhängigkeit von der Pufferzusammensetzung zu testen und zu optimieren, wurden mit Hilfe des Thermofluor-Testsystems [107] sowohl verschiedene Puffer als auch der Effekt von verschiedenen Zusätzen getestet. Gemessen wird bei diesem Verfahren die Temperatur ab der das Protein in einem bestimmten Puffer ausfällt. Als Detektionsmethode der Präzipitation dient die UV-Absorption der Probe bei 280 nm. Insgesamt wurden 24 verschiedene Puffer, mit und ohne Zusatz von 100 mM Natriumchlorid, getestet. Die Proteinlösungen von wt-MenD und die Se-Met-Variante (beide mit N-terminalen- und C-terminalen His-tag) wurden in folgendem Puffer in einer Konzentration von 1 mg/mL gelagert: 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 5 mM ThDP. Ein Test B B einer Protein-Puffermischung setzte sich aus denen in Tabelle 20 beschriebenen Lösungen zusammen. Bestandteile Volumen Mikrotiterplattenfeld Enzym [µL] 5 Farbstoff SyproOrange 1 TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin) 0.012 Testpuffer (100 mM) 18.988 Gesamtvolumen 25 Tabelle 20 Zusammensetzung einer Bedingung für das Thermofluor-Testsystem Die Auswertung der Testergebnisse ergab eine hohe Stabilität in unterschiedlichen Puffern und über einen breiten pH-Bereich hinweg. 5. Experimenteller Teil 129 Für wt-MenD wurden demnach folgende Puffer für den Additivscreen ausgewählt. Natriumcitrat pH 5.5, MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonsäure) pH 6.2, Tris pH 7.5 und Imidazol pH 8. Für Se-Met-MenD war die Stabilität generell etwas geringer, es wurde nur Imidazol pH 8 weiter getestet. Durch die Zugabe von Additiven wie ADP, FAD, NADP, ATP, DTT, CoCl2, LiCl, CaAc2, B B B B FeCl3, MnCl2, Benzaldehyd und Glycerol (0-25%) wurde keine Erhöhung der Stabilität B B B B erzielt. Als Ausgangspuffer für Kristallisationsexperimente wurde sowohl für wt-MenD als auch für die Se-Met-Variante mit N-terminalen- und C-terminalen His-tag folgender Puffer gewählt: 25 mM Imidazol, 1 mM MgSO4, 1 mM TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin), B B 5 mM ThDP, mit NaOH auf pH 8 eingestellt. 5.7.2. Se-Met-MenD Selen als Schweratom wird in der Röntgenstrukturanalyse zur Phasenbestimmung mit Hilfe der "Multiwavelength Anomalous Diffraction" (MAD) verwendet. Hierfür wird Selen als Seleno-Methionin durch Ersetzen der natürlichen Aminosäure Methionin in das Protein eingebracht ohne die Proteineigenschaften zu verändern. Um die Inkorporation zu erzwingen wurde Minimalmedium verwendet [119] (Tabelle 21): Volumen Lösungen 200 mL M9-Medium 20 mL Aminosäurestammlösung 50x 20 mL Glucose 20% 2 mL MgSO4 1M 100 µL CaCl2 1M 1 mL Amp-Stammlösung (100 mg/mL) 100 µL 0.5 % Thiaminlösung 757 mL H2O (Millipore) Tabelle 21 B B B B B B Zusammensetzung des Nährmediums für die Expression des Se-Met-MenD. Die Aminosäurestammlösung (50x) enthält alle Aminosäuren außer Glycin, Alanin, Prolin, Asparagin, Cystein und Methionin in einer Konzentration von 2 mg/mL. 60 mL einer in LB-Medium angezogenen Vorkultur wurden 2 x mit 40 mL des angesetzten Minimalmediums gewaschen und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 1 L des Minimalmediums resuspendiert und bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0.5 unter B B 130 5. Experimenteller Teil Schütteln bei 120 UpM inkubiert. Die folgenden Aminosäuren wurden als Feststoffe zugegeben: 100 mg Threonin, Phenylalanin und Lysin, 50 mg Leucin und Isoleucin, sowie 60 mg Seleno-Methionin. Nach weiteren 15 min bei 37 °C wurde mit 1 mL einer 1M IPTG Lösung induziert und das Enzym über Nacht bei 20 °C exprimiert. Die Übernachtkultur wurde bei 4 °C und 4000 UpM abzentrifugiert und als Zellpellet eingefroren. Der Zellaufschluss und die Aufreinigung erfolgte bis auf den Zusatz von 1 mM TCEP während allen Arbeitsschritten nach der beschriebenen Standardmethode für MenD (5.3.4). Für alle Konstrukte konnte eine hohe Überexpression, und nach Massenspektrum eine sehr hohe Einbaurate von Seleno-Methionin für N-terminales MenD und hohe Einbauraten für das C-terminale MenD festgestellt werden. 5.7.3. Kristallisationsbedingungen Für das erste High-Through-put Screening wurde die "Sitting-Drop-Vapour-diffusion"Methode verwendet. 96 well Platten wurden dazu mit Hilfe des Mikrodispensers Phoenix (ART ROBBINS INSTRUMENT) beladen. Für jede der 96 Puffer wurden 3 Tropfen mit unterschiedlichen Puffer-Protein Verhältnissen pipettiert: Tropfen 1: 100 nL + 100 nL, Tropfen 2: 200 nL + 100 nL, Tropfen 3: 100 nL + 200 nL. Direkt nach Fertigstellung des Screens und in regelmässigen Abständen wurden die Tropfen mikroskopisch auf Kristallbildung hin untersucht. wt-MenD mit N-terminalem His-tag ergab die aussichtsreichsten Kristalle unter folgenden Bedingungen: 0.15 M Äpfelsäure pH 7, 20% w/v PEG 3350 sowie 0.1 M Natriumcacodylat pH 6.5, 40% v/v 2-Methyl-2,4-pentandiol (MPD), 5% w/v PEG 8000. Die Se-Met-Variante kristallisiert nach dem Screening unter 0.1 M HEPES pH 7.5, 10% w/v PEG 8000, 8%v/v Ethylenglykol. Für wt-MenD mit C-terminalem His-tag als auch für die Se-Met-Variante gilt folgende Zusammensetzung als beste Kristallisationsbedingung: 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.2, 25% v/v PEG 300. Diese erfolgversprechenden Kristalle wurden manuell mit der "Hanging-Drop Vapour-Diffusion"-Methode hinsichtlich Größe und Form optimiert. Dazu wurden Tropfen von 2 µL Protein und 2 µL Pufferlösung pipettiert und als hängender Tropfen über dem Puffereservoir inkubiert. 0.1 M Phosphat/Citrat pH 4.8, 20% v/v PEG 400 waren schließlich die manuell optimierte Bedingung für wt-MenD mit C-terminalem His-tag als auch für die Se-Met-Variante, unter der reproduzierbar vielversprechende Kristalle wuchsen. 6. Abkürzungsverzeichnis 6. Abkürzungsverzeichnis ADH Amp AHAS Ar BAL BSA CD CoA COSY B B DAD DC DMF DMSO DMS DNA EDTA ee EI ent et al. FAD FID GC GC-MS His HPP HMBC HPLC HPLC- MS-MS HRMS HSQC IMAC IPTG IR n J kat. kb kDa KPi LB M MenD MeOH P 131 P B B Alkoholdehydrogenase Ampicillin Acetolactat-Synthase Aromat Benzaldehyd-Lyase; Wildtyp-Enzym Rinderserumalbumin Zirkular Dichroismus (Circular Dichroism) Coenzym A Correlation Spectroscopy (NMR-Messtechnik, HH-Korrelation mit Gradienten) Photodiodenarraydetektor (Dioden-Array-Detektor) Dünnschichtchromatographie Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Dimethylsulfid Desoxyribonukleinsäure Ethylendiamintetraessigsäure Enantiomerenüberschuss [%] (enantiomeric excess); Definition: ee [%] = 100 · [x(R) - x(S)] / [x(R) + x(S)] mit x(R), x(S) = Stoffmengenanteil des (R)- bzw. des (S)-Enantiomers Elektronenstoß (Electron Impact) das entgegen gesetzte zum hauptsächlich gebildeten Enantiomer und andere Flavinadenindinukleotid Flammenionisationsdetektor Gaschromatographie Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Kopplung Histidin 2-Hydroxy-1-phenyl-propanon Heteronuclear Multiple Bond Correlation (NMR-Messtechnik) Hochleistungschromatograhie (High Performance Liquid Chromatography) HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung Hochauflösende Massenspektrometrie (High Resolution Mass Spectrometry) Heteronuclear Single Quantum Coherence (NMR-Messtechnik) Immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid Infrarotspektroskopie Kopplungskonstante [Hz] über n Atombindungen katalytisch Kilobasenpaare Kilodalton Kaliumphosphat-Gemisch (K2HPO4/ KH2PO4) Luria Bertani Molar (Konzentration in mol/L) Enzym aus dem Shikimisäureweg Methanol B B B B B B B B 132 6. Abkürzungsverzeichnis MES min mM MS MTBE MRM m/z NADP NADPH n.b. NMR NOESY NTA OD p.A. PAC PAGE PCR PDC PigD ppm Q1 Q3 R Rf RT SDS Smp. TAE TCEP TEMED ThDP THF TMS TOCSY Tris TTC U UpM UV VIS vgl. [α]TD B B P δ ε PB B 2-(N-Morpholino)ethanesulfonsäure Minuten Millimolar (Konzentration in mmol/L) Massenspektrometrie Methyl-tert-butylether Multiple Reaction Monitoring Masse/Ladungs-Verhältnis Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (oxidierte Form) Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (reduzierte Form) nicht bestimmt Kernmagnetische Resonanz (Nuclear Magnetic Resonance) Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy (NMR-Messtechnik, Kern-Overhauser-Messung mit "Spoil"-Gradienten in der Mischzeit) Nitrilo-tri-Essigsäure Optische Dichte Analysenrein (pro analysi), Reinheitsgrad von Chemikalien Phenyl-acetyl-carbinol Polyacrylamid-Gelelektrophorese Polymerasekettenreaktion Pyruvat-decarboxylase Enzym aus Serratia marcescens parts per million Quadrupol 1 (erster Massenfilter) Quadrupol 3 (zweiter Massenfilter) Rest Retentionskoeffizient Raumtemperatur Sodiumdodecylsulfat Schmelzpunkt Tris-Acetat-Ethylendiamintetraessigsäure Tris(2-carboxyethyl)phosphin N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin Thiamindiphosphat Tetrahydrofuran Trimethylsilyl Total Correlated Spectroscopy Signal Improved Tris(hydroxymethyl)aminomethan 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid Unit Umdrehungen pro Minute Ultraviolett Visuell wahrnehmbares Licht, optisches Fenster vergleiche Spezifische Drehung gemessen bei der Temperatur T [°C] und der Natrium-D-Linie Chemische Verschiebung [ppm] Molarer Extinktionskoeffizient [cm2 /µmol] P P 7. Anhang 7. 133 Anhang 7.1. Sequenz EntC atggatacgtcactggctgaggaagtacagcagaccatggcaacacttgcgcccaatcgctttttctttatgtcgccgtaccgcagtttta cgacgtcaggatgtttcgcccgcttcgatgaaccggctgtgaacggggattcgcccgacagtcccttccagcaaaaactcgccgcgct gtttgccgatgccaaagcgcagggcatcaaaaatccggtgatggtcggggcgattcccttcgatccacgtcagccttcgtcgctgtatat tcctgaatcctggcagtcgttctcccgtcaggaaaaacaagcttccgcacgccgtttcacccgcagccagtcgctgaatgtggtggaac gccaggcaattccggagcaaaccacgtttgaacagatggttgcccgcgccgccgcacttaccgccacgccgcaggtcgacaaagtg gtgttgtcacggttgattgatatcaccactgacgccgccattgatagtggcgtattgctggaacggttgattgcgcaaaacccggttagtt acaacttccatgttccgctggctgatggtggcgtcctgctgggggccagcccggaactgctgctacgtaaagacggcgagcgttttag ctccattccgttagccggttccgcgcgtcgtcagccggatgaagtgctcgatcgcgaagcaggtaatcgtctgctggcgtcagaaaaa gatcgccatgaacatgaactggtgactcaggcgatgaaagaggtactgcgcgaacgcagtagtgagttacacgttccttcttctccaca gctgatcaccacgccgacgctgtggcatctcgcaactccctttgaaggtaaagcgaattcgcaagaaaacgcactgactctggcctgtc tgctgcatccgacccccgcgctgagcggtttcccgcatcaggccgcgacccaggttattgctgaactggaaccgttcgaccgcgaact gtttggcggcattgtgggttggtgtgacagcgaaggtaacggcgaatgggtggtgaccatccgctgcgcgaagctgcgggaaaatca ggtgcgtctgtttgccggagcggggattgtgcctgcgtcgtcaccgttgggtgagtggcgcgaaacaggcgtcaaactttctaccatgtt gaacgtttttggattgcattaa 7.2. Sequenz MenD gtgaacccctcgacgacacaggcgcgcgtcgtcgtcgacgaactgatccgcggcggcgttcgcgacgtggtgctgtgtccgggctc gcgcaatgcgccgctggccttcgcgctgcaggacgccgaccggtccggccggatccggttgcacgttcgcatcgatgaacgcaccg ccggctacctggccatcgggctggcaatcggggcgggcgcgccggtgtgtgtcgcgatgacatccggcaccgccgtggccaacct cggtccggcggtggtggaggcaaactacgctcgggtgccgctgatcgtgctgtcagccaatcggccctacgagctgctgggcaccg gcgccaaccagaccatggaacagctgggctatttcggcacccaggtgcgcgccagcatcagcctggggctggccgaggacgcacc cgagcggacctcggcgctcaacgcgacctggcgatcggctacgtgccgagtgttggcggccgccacgggtgctcgcaccgccaac gcgggccccgtgcacttcgacatcccgctgcgcgaaccgctggtgcccgatcccgagcccctcggcgcggtcaccccgccgggcc ggcctgctggcaagccgtggacctacacgccgccggtcaccttcgaccagccactggacatcgacctgtcggtcgacaccgtggtca tctccgggcatggcgctggcgtgcaccccaacctcgcggcgttgccgaccgtcgcagaaccgacggcgccgcggtccggggacaa cccgttgcacccgctggcgctgccgctgctgcgccctcaacaggtgatcatgctgggccggccgacactgcatcgtccggtatcggt gctgctggccgacgcagaagtgccggtattcgcattgacaaccggtccacgctggccggatgtctcgggtaactcgcaggccaccgg cacgcgggcggtcaccaccggcgcgccgcggcccgcgtggctggaccggtgtgcggcgatgaaccggcacgcgatcgcggcgg ttcgggaacagctcgcggcgcacccgttgaccaccgggctgcatgtcgcggcggcggtgtcgcatgcgctgcggcccggtgacca gctggtgctcggggcatccaatccggtgcgggatgtggcgttggccggtttggacacccgcggcatccgggtacggtccaaccgtgg ggtcgccggcatcgacggcaccgtgtccaccgcgatcggggcggccctagcttatgagggggctcacgagcgcaccggcagccc ggactccccgccccgcaccatcgcactgatcggcgacctgacgttcgtgcacgacagctccgggctgttgatcgggccgaccgaac cgataccgcggtcattgaccatcgtggtgtctaatgacaacggcggcggcatcttcgaattgctcgagcagggtgatcccaggttctcc gacgtgtcatcgcgaatcttcggcaccccacacgacgtcgatgtgggcgcattgtgccgcgcctaccacgtggaatctcgccagatcg aggtcgacgaactcggaccgaccctcgatcaacccggtgccggcatgcgcgtgctcgaggtcaaggccgaccggtcgtcgttgcga caattgcacgccgccatcaaggcggctctgtga 7.3. Alignments Die verschiedenen Alignments auf Proteinebene wurden mit Clustal/W durchgeführt. "*" steht für Identität, ":" für Ähnlichkeit (Similarity). Grau hinterlegte Bereiche stehen für Aminosäuren, für deren Funtkion bereits Postulate aufgestellt sind [13, 81], gelbe Bereiche 134 7. Anhang stehen für im Rahmen dieser Arbeit disskutierten Bereiche. MenD Alignments MenD-Proteinen aus E. coli, Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis und Mycobacter tuberculosis. E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 5 MSVSAFNRRW MSVSVFNRCW MTVNPIT-HY ---MNPSTAQ . 15 AAVILEALTR SKVILETLVR IGSFIDEFAL ARVVVDELVR .:: :. 25 HGVRHICIAP QGVSHLCIAP SGITDAVVCP GGVHDVVLCP *: . :.* 35 GSRSTPLTLA GSRSTPLTLE GSRSTPLAVL GSRNAPLAFA ***.:**:. 45 AAENS---AF AVRLQNAGAV CAAHP---DI LADADRAGRL . . 55 IHHTHFDERG TCHTHFDERG SVHVQIDERS RLHVRIDERT *.::*** E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 65 LGHLALGLAK LGFFALGIAK AGFFALGLAK AGFLAIGLAV *.:*:*:* 75 VSKQPVAVIV ATQSPVAIIV AKQRPVLLIC ADRAPVCVAM . : ** : 85 TSGTAVANLY TSGTATANLY TSGTAAANFY TSGTAVANLG *****.**: 95 PALIEAGLTG PAIIEARQTG PAVVEAHYSR PAVVEANYAR **::** : 105 EKLILLTADR VNLFVLTADR VPIIVLTADR VPLIVLSANR :::*:*:* 115 PPELIDCGAN PPELWECGAN PHELREVGAP PYELLGTGAN * ** ** E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 125 QAIRQPGMFA QAILQQNMFG QAINQHFLFG QTFEQLGYFG *:: * *. 135 SHPTHSISLP QYPVANVNLP NFVKFFTDSA NQVRANISLG . . 145 RP-------KP-------LP-------LAPELSSGSP . 155 --TQDIPARW --NADYSAQW --EESPQMLR GDMTSLNAQW . 165 LVSTIDHALG LISLLEQAVF YIRTLASRAA RSATCRVVVA 175 ---TLHAGG---QQKQQGG GE-AQKRPMG ATGSRSANAG E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 185 -VHINCPFAE VVHINVPFAE PVHVNVPLRE PVQFDIPLRE *:.: *: * 195 PLYGEMDDTG PLYDATDEEV PLMPDLSDEP PLVPTFDDDG ** .: 205 --LSWQQRLG NSHSWLQPLQ FGRMRTGRHV SCPPGRPDGK 215 DWWQDDKPWL RWLIQNKSWI SVKTGTQSVD PWTHTPP--- 225 R-EAPRLESE NVEAQQNEVL R------ESL --------VT 235 KQRDWFFWRQ MHENWDHWRT SDVAEMLAEA FDQPLDIDLT . E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 245 KRGVVVAGRM KRGVVVVGQL EKGMIVCGEL PDTVVIAGHG ::: *. 255 SAEEGK-KVA PAEQAM-GIN HSDADKENII AGVHPNLADL . 265 LWAQTLGWPL SWASAMGWVL ALSKALQYPI PTVAEPTAPP 275 IGDVLS---LTDIQS---LADPLSNLRN AANPLH---: 285 ---QTGQPLP ---GVVPTTP GVHDKSTVID ---------- 295 CADLWLGNAK YEDIWLANQT AYDSFLKDDE ---------P 305 E.coliK12 ATSELQQAQI Haemophilus VREKLLQADI Bacillus_sub.LKRKLR-PDV MycobacteriumMALRLLRPKQ Clustal Co .* .. 315 VVQLGSSLTG VIQFGARFIS VIRFGPMPVS VIMLGRPTLH *: :* 325 KRLLQWQASC KRINQFLQAF KPVFLWLKDD RPVSALLADP : : 335 EPEEYWIVDD KG-EFWLVEQ PTIQQIVIDE SVPVYALTTG : 345 IEGRLDPAHH SGKALDPYHH DGGWRDPTQA PRWPDVSGNS . : 355 RGRRLIANIA SLTRFNAKVH SAHMIHCNAS QATGTRAVTS . 365 DWLELHPA-HWLRAHPP-VFAEEIMAGL G--------- 375 ---EKRQPWC ---LRQKPWL TAATRSSEWL ---TPDPAWL * 385 VEIPRLA-EQ LEPLALS-KF EKWQFVNGRF RRCKEVNDHA . : . 395 AMQAVIARRCATFIEQQVG REHLQTISSE VAAVREQLAA 405 DAFGEAQ-LA GNLTEAS-LA DVSFEGN-LY HPLTTGLHVA . : 415 HRICDYLPEQ LRLPTLLPYN RILQHLVPEN AAVADAVRPG : : 425 GQLFVGNSLV GVLFLGNSLL SSLFVGNSMP DQLVLGASNP 435 VRLIDALSQL VRLVDALTQL IRDVDTFFEK VRDAALVGFT 445 PAG-YPVYSN PES-YPVYTN QDRPFRIYSN PHG-VQVRSN 455 RGASGIDGLL RGASGIDGLL RGANGIDGVV RGVAGIDGTV 465 STAAGVQRAS ATAAGIGIGS SSAMGVCEGT STAIGAALAH 475 GKP---TLAI NKP---VVAV KAP---VTLV DRTGGRTIAL E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter 7. Anhang 135 Clustal Co . *.:* * :* . : :* **. **** : ::* * . . E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 485 VGDLSALYDL IGDTSTLYDL IGDLSFYHDL MGDLTFVHDS :** : :* 495 NALALLRQVS NSFALFKNVT NGLLAAKKLG SGLLIGPTEP ..: 505 AP--LVLIVV QP--TLIFVI IP--LTVILV TPRNLTIVVS * :.: 515 NNNGGQIFSL NNNGGAIFDM NNDGGGIFSF NDNGGGIFEL *::** **.: 525 LPTP----QS LPVD----EQ LPQASE--KT LEQGDPRFSD * . 535 ERERFYLMPQ VKDQFYRLPH HFEDLFGTPT VSSRVFGTPH . .: * E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter Clustal Co 545 NVHFEHAAAM NGDFSQIAAM GLDFKHAAAL DVDVGALCRA . .. . 555 FELKYHRPQN FDLKYAHPYT YGGTYSCPAS YHVDNR---Q : 565 WQELETAFAD WADLNSVVKQ WDEFKTAYAP IEVGQLADAL : . 575 AWRTPTTTVI AYSRRKATLI QADKPGLHLI DEPHEGMRVL :: 585 EMVVNDTDGA EIKTNPSDGS EIKTDRQSRV EVKADRSSLR *: .: . 595 QTLQQLLAQV SLYKRLIEQI QLHRDMLNEA ALHASIKAAL : E.coliK12| Haemophilu Bacillus_s Mycobacter 605 SHL------SHAVIGA--VREVKKQWEL ---------- Clustal Co MenD-PigD Alignment Identität: 13.4% MenD PigD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 MSVSAFN--- RR-----WAA VILEALTRHG VRHICIAPGS RSTPLT-LAA MRAATAACRD RRGLCRAEFA RLAEAVTPFW LHKELI---- -MTTLTGQAR * .:: ** * : **:* . ::: * *.** * MenD PigD Clustal Co 60 70 80 90 100 AENSAFIHHT HFDERGLGHL ALGLAKVSKQ PVAVIVTSGT AVANLYPALI LTNSAAYEQV WQAERQA--- ----CRTDAD P--DTLTVGV VVVTRNPAFF *** .:. ** .:.. : * :* *. .*.. **:: MenD PigD Clustal Co 110 120 130 140 150 EAGLTGEKL- -------ILL TADRPPELID CGA------- ---------QTGLSVLNDI RDYVFNRVHI QSEMPLKLLD LAADSLYLAA REKALHFLKG ::**: : : : :: * :*:* .* MenD PigD Clustal Co MenD PigD Clustal Co 160 170 180 190 200 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------QNKAINVRII QCASLAEATG KIIYTHALEQ RPEFHLGMLF YDQTTPAGVD 210 220 230 240 250 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------DSIEQIDRDL DAFYSALQRS GIPAFYTTFS TVAFIRQLRS PFRYLPQQYR MenD PigD Clustal Co 260 270 280 290 300 ---------- ---------- --------NQ AIRQPGMFAS HPTHSISLPR EIVRSEDPAI FQTELLCLWM DFFEMNYTNR RVKPIGALAL HNTLGEQLIQ *: :: * :* * * . .* : MenD PigD Clustal Co 310 320 330 340 350 PTQD-IPARW LVSTIDHALG TLHAGGV--H INCPFAEPLY GEMDDTG--FFERTAAERW LVSYYTGSII SNLIGYLDRH AEARGALILR GPNEH----: . ** *** :: : * : * :. * * * :. . : 136 7. Anhang MenD PigD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 ---------- ---------L SWQQRLGDWW QDDKPWLREA PR--LESEKQ ---------- ---------A IACGAMANWQ LYRMPFLGVV TSGMMDEFKG :.:* *:* . . ::. * MenD PigD Clustal Co 410 420 430 440 450 RDWFFWRQK- RGVVVAGRMS A--------- ---------- ---------TLANLKETAA QGIIVAAENR GNQWYSFQG- ---------- ---------: . :*::**.. . MenD PigD Clustal Co 460 470 480 490 500 -------EEG KKVALWAQTL GWPLIGDV-- ---------- ------------TLTPTED MREVLIARRI PFVYIDDVEM IGAGLTEAFR LYHQGQGPVV *. : .* *: : : *.** MenD PigD Clustal Co 510 520 530 540 550 ---------- --------LS QTGQPLPCAD LWLGNAKATS ELQQAQIVVQ ILATQNVLES TLSLEGAVCD PSPIPVLSAD DPLP---MSE SLAQAIALIN . : *: .** * :. .* ** ::: MenD PigD Clustal Co 560 570 580 590 600 LGSSLTGKRL LQWQA-SCEP EEYWIVDDIE GR-------- -----LDPAH R-----GPER LVWQLGPVSD DEYALIHDIA DAAGIALVDS LAHPGSAPKY * . * ** . . :** ::.** . * : MenD PigD Clustal Co 610 620 630 640 650 HRGRRLIANI --------AD --WLELHPAE K--------- ---RQPWCVE YQGRRNPHYL GTLAIYGYSP RVYNFLHTND K-------LN AMSEQSLFMI ::*** : : : **. : * .*. : MenD PigD Clustal Co 660 670 680 690 700 IPRLAEQAMQ AVIARRD--- ---------- ---------- ---------KSRVAQITTP FSDGRLERKV HLVQLTHDDR HLSPYADLHL HMN------.*:*: : .* : MenD PigD Clustal Co 710 720 730 740 750 -------AFG EAQLAHRICD -YLPEQGQLF VGNSLVVRLI DALSQLPAGY -----CLAFL RTVKAHLDVD PALRERRRAL IAAY-LDSPS DVVSQLPS-L ** .: ** * * *: : : :. : *.:****: MenD PigD Clustal Co 760 770 780 790 800 PVY------- ---------- ---------- ---------- -----SNRGA PMSANYFFCQ LNRVIEELIE TEGFDFTGVY DVGRCGISAA RNVAKTRRGF *: :.** MenD PigD Clustal Co 810 820 830 840 850 SGI------- DGLLSTAAGV QRASGKPTLA IVGD------ --LSALYDLN SGWYGRALMG DALLATGY-L AYTSPSHVMA FIGDGAKGIV PDILPAFIDN ** *.**:*. : :* . .:* ::** : . : * MenD PigD Clustal Co 860 870 880 890 900 ALALLRQVSA PLVLIVVNNN GGQIFS---- ---------- --LL----PT ILTHPQLLNK SITVFYLCNG GLSVINTYQE RILFNRTSRQ MRLVNVEQPD *: : :. .:.:: : *. * .::. *: * MenD PigD Clustal Co 910 920 930 940 950 PQSERERFYL MPQN-VHFE- ---------- HAAAMFELKY HR-------VEQTVNNFHI QSKTLTHFDE DVIRQALTTP HRLNLFSVVL GH-------:. :.*:: .:. .**: * :*.: : 7. Anhang 137 MenD PigD Clustal Co 960 970 980 990 1000 ---------- PQNWQELETA FADAWRTPTT TVIEMVVNDT DGAQT-------------- NNEGDGISLA TAKGWQRDPS DHDALQERKA WAAQQPESTS :: : :. * *..*: .: : ..: .** MenD PigD Clustal Co 1010 1020 ---------- ---LQQLLAQ VSHL ---------- -TAFDQDPTQ EATS ::* :* : MenD-AHAS Alignment Identität: 17% AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 MEMLS----G SEMIIQSLID QGIKYIFGYP GGAVLDIYDS LKSTKKIKHI MSVSAFNRRW AAVILEALTR HGVRHICIAP GSRSTPLTLA AAENSAFIHH *.: : : :*:::* :*:::* * *. : : ... : * AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 LVRHEQGATH MADGYARATG KIGVVLVTSG PGATNSITGI ATAYMDSIPI THFDERGLGH LALGLAKVSK QPVAVIVTSG TAVANLYPAL IEAGLTGEKL .*:* * :* * *:.: : .*:**** ...:* ..: * : . : AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 VVISGQVSSS LIGYDAFQEC DMIGISRPIV KHSF-LVKKT EDIPITFKKA ILLTADRPPE LIDCGANQAI RQPGMFASHP THSISLPRPT QDIPA----::::.: ... **. .* * *: . .**: * : * :*** AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 FWLASSG--- ----RPGPIV IDLPK--DIL NSYNKKPYIW PIEVN--IRS RWLVSTIDHA LGTLHAGGVH INCPFAEPLY GEMDDTGLSW QQRLGDWWQD **.*: :.* : *: * : .. :.. * .:. :. AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 YNPITKGHS- RQIKKAIDIL -KLSKQPVIY AGGGVISANC HNELKELAEK DKPWLREAPR LESEKQRDWF FWRQKRGVVV A--GRMSAEE GKKVALWAQT :* : . : :* * : .*: *: * * :**: ::: *:. AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 LNIPVTTSLM ALGAFPGNHP QNLQMLGMHG TYEANMAMHY ADVILAIGVR LGWPLIGDVL SQTGQPL--- -PCADLW-LG NAKATSELQQ AQIVVQLGSS *. *: .:: : . * * * . :*. :: *:::: :* AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 FDDRTTNNVK KYCP-NATII HIDI------ ---------- --------DP LTGKRLLQWQ ASCEPEEYWI VDDIEG---- ---------- ---------: .: : : * : * ** 138 7. Anhang AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 TSISKTITAH IPIVGNAKNV LQQILVFINS NMFVKEFYCL KKWWIKIQSW ---------- --RLDPAHHR GRRLIANIAD WLELHPAEKR QPWCVEIPRL :. *:: ::::. * . : :: : * ::* AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 K-NKNSLNFD TN-------- ---------- ---------- -------SDN --AEQAMQAV IA-------- ---------- ---------- ------RRDA ::::: * AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 460 470 480 490 500 IKPQSVIKTI --WKLTKGKA FITSDVGQHQ MFAALYYSFQ KPRRWINSGG FGEAQLAHRI CDYLPEQGQL FVGNSLVV-R LIDALSQLPA GYPVYSNRGA : .: : * : :*: *: ..: : :: ** : * *. AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 LGTMGFGLPA ALGVKLAFPN ETVICVTGDG SIQMNIQELS TAMQYELPIL SGIDGL-LST AAGVQRASGK PT-LAIVGDL SALYDLNALA LLRQVSAPLV * *: *.: * **: * : * :.:.** * ::: *: * . *:: AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 560 570 580 590 600 ILNLNNKSLG MVKQWQDIIY SGRHSHSYMK SLPNFIKLAE SYGHSGISIN LIVVNNNG-G QIFSLLPTPQ SERERFYL-- -MPQNVHFEH AAAMFELKYH :: :**:. * : . * *. . :*: ::: . : . :. : AHAS MenD Clustal Co ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 TPKELEKKLQ LALEKLQNGH LVFVDIKIDA SEHVYPMQIR D--GGM-NNM RPQN------ -----WQELE TAFADAWRTP TTTVIEMVVN DTDGAQTLQQ *:: *: . .*.* . : * * :. * *. : ....|... AHAS MenD Clustal Co LLRKNGQK LLAQVSHL ** : .: 8. Literaturverzeichnis 8. 139 Literaturverzeichnis [1] F. Dosselaere, J. Vanderleyden, Crit. Rev. Microbiology 2001, 27, 75. [2] G. B. Cox, F. Gibson, Biochim. Biophys. Acta 1964, 93, 204. [3] C. T. 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