Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der

Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
____________________________________________________
Aktivierung der erythrozytären
NO-Synthase durch Rosuvastatin
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Barbara Ludolph
aus Düsseldorf
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Priv.-Doz. Dr. M. Gernert
1. Gutachter:
Priv.-Doz. Dr. M. Gernert
2. Gutachter:
Prof. Dr. M. Ganter
Tag der mündlichen Prüfung:
21.05.07
„Das Lernen ist wie ein Meer ohne Ufer.“
Konfuzius
Für Philipp und meine Eltern
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
2
3
4
Einleitung..................................................................................... 1
Literaturübersicht......................................................................... 3
2.1
NO-Synthasen ...............................................................................................3
2.2
Regulation konstitutiver NO-Synthasen .........................................................5
2.3
Metabolismus von Stickstoffmonoxid ...........................................................10
2.4
Einfluss von NO auf die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit ......13
2.5
Die erythrozytäre NO-Synthase ...................................................................16
2.6
Rosuvastatin ................................................................................................18
Zielsetzung ................................................................................ 23
Material und Methoden.............................................................. 25
4.1
Material .......................................................................................................25
4.1.1
Vollblutproben von gesunden Probanden ....................................................25
4.1.2
Vollblutproben von gesunden Hündinnen ....................................................25
4.1.3
Übersicht über die verwendeten Proben ......................................................26
4.1.4
Verwendete Substanzen und Reagenzien für
die Vollblutinkubation ...................................................................................27
4.1.5
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitritmessung
mittels reduktiver Chemilumineszenz-detektion ...........................................27
4.1.6
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitratmessung
mittels Fluß-Injektions-Analyse ....................................................................28
4.1.7
Verwendete Substanzen und Reagenzien für
die modifizierte Filtrationsmethode ..............................................................29
4.1.8
Verwendete Substanzen und Reagenzien für den
immunhistochemischen Nachweis der phosphorylierten
Form der eNOS............................................................................................29
4.1.9
Verwendete Substanzen und Reagenzien zur Messung
des Blut-pH Wertes ......................................................................................30
4.2
Material und Geräte ...................................................................................31
4.2.1
Materialien zur Gewinnung von Vollblutproben............................................31
4.2.2
Materialien für die Vollblutinkubation ...........................................................31
4.2.3
Materialien und Geräte für die Nitritmessung
mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion ............................................32
4.2.4
Materialien und Geräte für die Nitratmessung mittels
Fluß-Injektions-Analyse ...............................................................................33
4.2.5
Materialien und Geräte für die
modifizierte Filtrationsmethode ....................................................................33
4.2.6
Materialien und Geräte für den immunhistochemischen
Nachweis der phosphorylierten Form der eNOS..........................................35
4.2.7
Materialien und Geräte für die photometrische Messung
der Hämoglobinkonzentration in Plasma......................................................35
4.2.8
Materialien und Geräte zur Messung des Blut-pH .......................................35
4.3
Methoden ....................................................................................................36
4.3.1
Blutabnahme bei Probanden........................................................................36
4.3.2
Blutabnahme bei Hunden.............................................................................36
4.3.3
Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität der
erythrozytären NOS in humanen Vollblutproben..........................................36
4.3.3.1
Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin ex vivo
in humanen Vollblutproben ..........................................................................36
4.3.3.2
Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation
mit dem
NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin
in humanen Vollblutproben ..........................................................................37
4.3.3.3
Quantitative Bestimmung der Phosphorylierung
der erythrozytären NOS an Serin 1177 nach Inkubation
von humanen Erythrozyten mit Rosuvastatin...............................................38
4.3.3.4
Gleichzeitige Messung der Plasmanitrit- und Nitratkonzentration,
sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit
nach Inkubation von humanen Vollblutproben mit Rosuvastatin..................39
4.3.4
Etablierung eines Inkubationsprotokolls zur Bestimmung
der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ...................................39
4.3.4.1
Basale Aktivität der erythrozytären NOS während 30minütiger
Inkubation mit und ohne Arginaseinhibition durch L-Valin...........................39
4.3.4.2
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit verschiedenen
L-Argininkonzentrationen mit und ohne Arginaseinhibition ..........................40
4.3.4.3
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit
verschiedenen NOS-Inhibitoren ...................................................................40
4.3.4.4
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit
verschiedenen eNOS-Stimulantien ..............................................................41
4.3.5
Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität
der erythrozytären NOS im Tierversuch.......................................................42
4.3.14
Bestimmung der Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver
Chemilumineszenzdetektion ........................................................................45
4.3.15
Bestimmung des Plasmanitratgehaltes mittels Nitrat-ReduktaseFlussinjektionsanalyse .................................................................................48
4.3.16
Messung der erythrozytären Verformbarkeit mit der modifizierten
Filtrationsmethode .......................................................................................49
4.3.17
Messung der erythrozytären Aggregation mit dem
Myrenne-Aggregometer ...............................................................................50
4.3.18
Hämolysekontrolle mittels photometrischer Bestimmung der
Plasmahämoglobinkonzentration .................................................................51
4.3.19
Kontrolle des pH-Werts in Vollblut ...............................................................52
4.3.20
Statistik ........................................................................................................52
5
Ergebnisse................................................................................. 53
5.1
Aktivierung einer erythrozytären NOS durch Rosuvastatin
in humanen Vollblutproben ..........................................................................53
5.1.1
Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin .....................................................53
5.1.2
Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation mit
dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin............................................54
5.1.3
Quantitative Bestimmung der eNOS-Phosphorylierung
nach Inkubation mit Rosuvastatin ................................................................55
5.1.4
Gleichzeitige Messung der plasmatischen Nitrit- und Nitratkonzentration,
sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit
nach Inkubation mit Rosuvastatin ................................................................56
5.2
Etablierung einer caninen Vollblutinkubation als Assay
für die Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ..............................59
5.2.1
Basale Aktivität der caninen erythrozytären NOS
während 30minütiger Inkubation mit und ohne
Arginaseinhibition durch L-Valin...................................................................59
5.2.3
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen L-Argininkonzentrationen
mit und ohne Arginaseinhibition durch L-Valin .............................................60
5.2.4
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen NOS-Inhibitoren .............................................................61
5.2.5
Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen eNOS-Stimulantien ........................................................62
5.3
Tierversuch: Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS
nach Verabreichung von Rosuvastatin ........................................................63
5.3.1
Gleichzeitige Messung der plasmatischen Nitrit- und Nitratkonzentration,
sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit
vor und nach Verabreichung von Rosuvastatin............................................63
5.3.2
Bestimmung der Plasmanitritkonzentration vor
und nach Verabreichung von Rosuvastatin
mittels Inkubationsprotokoll in caninen Vollblutproben.................................65
6
5.4
Hämoglobingehalt ........................................................................................66
5.5
pH-Wert........................................................................................................66
Diskussion ................................................................................. 67
6.1
Aktivierung der erythrozytären NOS durch Rosuvastatin .............................68
6.2
Erstellung und Anwendung eines Inkubationsassay zur Bestimmung der
Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch .........................................70
5
8
9
6.3
Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Verformbarkeit .................74
6.4
Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Aggregation......................76
Zusammenfassung .................................................................... 79
Summary ................................................................................... 81
Literatur ..................................................................................... 83
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
ADMA
Asymmetrisches Dimethylarginin
AE-1
Anionenaustauscher-1
AMP
Adenosinmonophosphat
AMPK
AMP-aktivierte Proteinkinasen
ATP
Adenosintriphosphat
BAT
Breitbandaminosäuretransporter
BH4
Tetrahydrobiopterin
CaM
Calmodulin
cAMP
zyklisches Adenosin-Monophosphat
CAT
Kationischer Aminosäuretransporter
cGMP
zyklisches Guanosinmonophosphat
cNOS
konstitutive NO-Synthase
DDAH
Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase
EC
Endothelzelle
EDRF
endothelial-derived relaxing factor
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
eNOS
endotheliale NO-Synthase
ETU
S-Ethyl-N-{4(Trifluoromethyl)Phenyl}Isothiourea
FAD
Flavin-Adenosin-Dinukleotid
FMN
Flavin-Mononukleotid
FPP
Farnesylpyrophosphat
GDP
Guanosindiphosphat
GGPP
Geranylgeranylpyrophosphat
G6P
Glukose-6-Phosphat
G6PDH
Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase
GTP
Guanosintriphosphat
HDL
high density Lipoprotein
HMG-CoA
ß-Hydroxy ß-Methyl Glutaryl Coenzym A
HPLC
Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Hsp90
Hitzeschock-Protein 90
iNOS
induzierbare NO-Synthase
KHK
Koronare Herzkrankheit
Ki
Inhibitionskonstante
LDL
low density Lipoprotein
L-NAME
Nω-Nitro-L-Arginin Methylester
L-NIO
N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin
L-NMMA
NG-Monomethyl-L-Arginin
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NADP
+
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NADPH
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (reduziert)
nNOS
neuronale NO-Synthase
NOS
NO-Synthase
NR
Nitratreduktase
PBS
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PeNOS
Phosphorylierte eNOS
PKC
Proteinkinase C
PRMTs
Protein Arginin N-Methyltransferasen
RNNO
Nitrosamine
RSNO
Nitrosothiole
ROS
Reaktive Sauerstoffradikale
SDMA
symmetrisches Dimethylarginin
s.o.
siehe oben
s.u.
siehe unten
TBS
Tris-Bor-Säure
TRIS-HCL
Tris-Salzsäure
u.a.
unter anderem
VLDL
very low density Lipoprotein
z.B.
zum Beispiel
1
1
Einleitung
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges inter- und intrazelluläres Signalmolekül, das sowohl
im kardiovaskulären als auch im Nerven- und Immun-System an der Vermittlung biologisch
relevanter Funktionen beteiligt ist. Im kardiovaskulären System beeinflusst das von
endothelialen NO-Synthasen (eNOS) gebildete NO unter anderem den Gefäßtonus, die
regionale myokardiale Funktion, das Gefäßwachstum, sowie die Leukozyten-, Thrombozyten
und Erythrozytenfunktion1;2. Erst in den letzten 20 Jahren konnte die parakrine Wirkung von
NO auf die Gefäßwand identifiziert werden: 1980 entdeckten Furchgott, Murad und Ignarro
gleichzeitig und unabhängig voneinander einen sekundären Botenstoff (Endothelium derived
relaxing factor, EDRF), der nach Stimulation der unversehrten Gefäßwand mit Acetylcholin
gebildet wurde und später als NO identifiziert werden konnte
3-5
. Das kontinuierlich
freigesetzte NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase der glatten Muskelzelle der Gefäßwand
und reguliert über die herbeigeführte Vasodilatation den Blutfluss6.
Die
bekannten
klassischen
kardiovaskulären
Risikofaktoren
des
Menschen,
wie
Hypercholesterinämie, arterielle Hypertonie, Nikotinkonsum und Diabetes mellitus, gehen mit
einem
Verlust
dieser
NO-vermittelten
Vasodilatation
einher.
Dieser
Verlust
der
endohelvermittelten Vasodilatation ist das Kennzeichen einer "endothelialen Dysfunktion", die
bereits in der Frühphase der Arteriosklerose nachweisbar und ursächlich mit dieser
Erkrankung verbunden ist1. Kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere ein Herzinfarkt oder
ein Hirninfarkt, entstehen häufig auf dem Boden arteriosklerotisch veränderter Gefäße. Sie
stellen in Deutschland nach wie vor die häufigste Todesursache des Menschen dar. Nach
Angaben des Statistischen Bundesamtes starben im Jahr 2003 396.622 Menschen an den
Folgen einer Herz-Kreislauf-Erkrankung. Darunter erlagen 92.673 Menschen einem akuten
Herzinfarkt und 39.286 Menschen einem Schlaganfall. Die koronare Herzkrankheit (KHK) war
2003 sowohl bei Männern als auch bei Frauen die häufigste Todesursache.
2
Statine oder HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren sind cholesterinsenkende Pharmaka, welche
heutzutage weltweit bei Patienten mit KHK zum Einsatz kommen. Die cholesterinsenkende
Wirkung der Statine wurde schon 1978 erkannt. Goldstein et al7 untersuchten die aus
Penicilium ssp. isolierte Substanz Compactin und fanden heraus, dass diese kompetitiv die
HMG-CoA-Reduktase der Cholesterinbiosynthese inhibiert. Durch Herstellung synthethischer
und semisynthetischer Statine wurde die Effektivität und Selektivität deutlich verbessert. So
kommt es selektiv zu einer Senkung der low density Lipoproteine (LDL) und zu einem Anstieg
der high density Lipoproteine (HDL). Neben ihrer Cholesterinsenkenden Wirkung besitzen
Statine noch diverse andere vasoprotektive Eigenschaften. Zu diesen gehört neben ihrer
antiinflammatorischen
und
antioxidativen
Wirkung
insbesondere
eine
Aktivierung
endothelialer NO-Synthasen (eNOS)8;9.
Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch Erythrozyten eine
NO-Synthase besitzen, welche in physiologisch relevanten Mengen NO synthetisiert und
exportiert. Diese NO-Synthase ist durch ihr Substrat L-Arginin beeinflussbar, welches bei
einer Bereitstellung eine gesteigerte Syntheserate und NO-vermittelte Veränderungen der
Rheologie bewirkt10. Bislang war nicht eindeutig geklärt, um welche NOS-Isoform es sich bei
der erythrozytären NOS handelt. Unterschiedliche Ergebnisse, die entweder eine eNOS oder
Kreuzreaktionen für verschiedene Isoformen beschreiben, liegen vor11;12. In Untersuchungen
der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der eNOS-Knock-Out Maus konnte die erythrozytäre
NOS eindeutig als endotheliale Isoform charakterisiert werden10. Ob Statine in der Lage sind,
diese erythrozytäre NO-Synthase zu aktivieren, ist bislang nicht bekannt.
3
2
Literaturübersicht
2.1
NO-Synthasen
Zu Beginn der achtziger Jahre wurde die Entdeckung gemacht, dass die gefäßrelaxierende
Wirkung bestimmter Stoffe, wie z.B. Acetylcholin und Histamin, von der Unversehrtheit des
Gefäßendothels abhängig ist. Es wurde die Existenz eines sekundär freigesetzten Faktors
postuliert,
der
in
Endothelzellen
gebildet
wird
und
anschließend
in
den
glatten
Gefäßmuskelzellen eine Relaxation herbeiführt. Man nannte diesen Faktor endotheliumderived relaxing factor (EDRF)3. Später konnte EDRF als NO identifiziert werden4;13, welches
die beobachtete Gefäßdilatation über die Stimulation der cytosolischen Guanylatzyklase und
der damit einhergehenden Erhöhung der intrazellulären zyklischen Guanosinmonophosphat
(cGMP)-Konzentration der glatten Gefäßmuskelzelle bewirkte14;15. Die Biosynthese von NO
konnte auch in anderen Geweben und Zelltypen nachgewiesen werden, z.B. im zentralen
Nervensystem16 und in bestimmten Zellen des Immunsystems17. Weitere Untersuchungen
ergaben, dass die Bildung des NO von einer Familie von Enzymen, den NO-Synthasen
(NOS), katalysiert wird. Bisher sind drei Isoformen dieser Enzymfamilie bekannt, die alle als
Homodimere vorliegen. Dabei handelt es sich um eine neuronale (nNOS, NOSI), eine
induzierbare (iNOS, NOSII) und eine endotheliale (eNOS, NOSIII) NOS-Isoform, die sich
hinsichtlich ihres genetischen Ursprunges, ihrer Lokalisation im Säugetierorganismus sowie
ihrer Regulation und katalytischen Eigenschaften unterscheiden18;19. Die konstitutiv
exprimierten Enzyme nNOS und eNOS, auch als konstitutive NOS (cNOS) bezeichnet, sind
für
die
kontinuierliche
Synthese
des
NO
als
Signalmolekül
im
neuronalen
und
kardiovaskularen System verantwortlich. Die iNOS wird im Rahmen der unspezifischen
Immunabwehr insbesondere von Makrophagen als Reaktion auf ein toxisches Agens
exprimiert, wodurch temporär wesentlich höhere, zytotoxische NO-Konzentrationen produziert
werden können. Die Aktivierung der konstitutiven NOS wird nach Rezeptorstimulation durch
extrazelluläre Signale, wie z.B. einem Anstieg der Schubspannung im Gefäß oder durch
Freisetzung rezeptorabhängiger physiologischer Stimulatoren (z.B. Acetylcholin, Histamin,
4
Serotonin, Bradykinin), über einen Anstieg der Ca2+-Konzentration mit nachfolgender
Calmodulin(CaM)-NOS Assoziation vermittelt19-21. CaM ist ein Ca2+-bindendes Protein,
welches in einer Vielzahl eukariotischer Zellen vorkommt
22;23
. Es kontrolliert den
Elektronenfluss zwischen der Reduktase- und der Oxygenase-Domäne der NOS, so dass der
Anstieg der Ca2+-Konzentration die NO-Bildung induziert24. Die NOS katalysiert die Reaktion
von L-Arginin, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) und Sauerstoff zu NO, LCitrullin und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP+). Hierfür benötigt sie die
Kofaktoren
Tetrahydrobiopterin
(BH4),
Flavin-Adenosin-Dinukleotid
(FAD),
Flavin-
Mononukleotid (FMN) und das Eisen-Protoporphyrin (Haem), mit denen sie eine enge
Bindung eingeht. NADPH assoziiert mit seiner Bindungsstelle auf der Reduktase-Domäne
und gibt ein Elektron ab, welches mittels der Redox-Carrier FAD und FMN in Richtung
Oxygenase-Domäne transportiert wird und nach Interaktion mit BH4 und Haem zur aktiven
Seite des Enzyms gelangt. An der aktiven Seite der Oxygenase-Domäne läuft dann die
Reaktion von L-Arginin und Sauerstoff zu L-Citrullin und NO ab (siehe Abb.1)19.
Calmodulin
NADPH
L-Arginin
O2
Ca2+
e-
FAD
NADP+
H+
e-
-
e
FMN
BH4
Fe
L-Citrullin
NO
Calmodulin
Reduktase-Domäne
Ca2+
Oxygenase-Domäne
Abb.2.1: Schematische Darstellung der von NO-Synthasen katalysierten Reaktion und des
Elektronenflusses zwischen Reduktase- und Oxygenase-Domäne
5
2.2
Regulation konstitutiver NO-Synthasen
Die klassische Aktivierung der NOS erfolgt über einen Anstieg der intrazellulären Ca2+
Konzentration20. Die eNOS ist in ihrer inaktiven Form in der Zelle über einen Myristoyl- und
einen Palmitoyl-Rest in der Plasmamembran verankert, wo sie in Caveolae genannten
lipidreichen Mikrodomänen lokalisiert ist25. Die ebenfalls in den Caveolae lokalisierten
Proteine der Caveolin-Familie inhibieren direkt die Aktivität der NOS. Die Assoziation von
Caveolin,
sowie
dessen
inhibitorische
Wirkung
werden
durch
die
Bindung
von
Ca2+/Calmodulin aufgehoben26. Durch die Bindung mit zwei Ca2+/Calmodulin Komplexen geht
das Enzym in seine aktive Form über19 und dissoziiert von der Plasmamembran ins
Zytosol27;28. Die Aktivierung wird von Signalwegen ausgelöst, die eine Erhöhung der
intrazellulären Ca2+-Konzentration herbeiführen. Die Erhöhung der Ca2+-Konzentration kann
einerseits durch einen Ca2+-Einstrom aus der Umgebung durch Ionenkanäle in der
Plasmamembran geschehen, die durch Liganden, Spannungsänderungen, mechanische
Reize oder intrazelluläre Faktoren aktiviert werden. Ebenso bedeutend ist die Rezeptorvermittelte Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Ca2+-Speichern. Die Bindung bestimmter
Hormone und Neurotransmitter an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs, für 'G-ProteinCoupled Receptors') kann zu einer solchen intrazellulären Ca2+-Freisetzung führen29.
Endogene Inhibitoren können als autokrine Mediatoren die NOS-Aktivität regulieren. Hierbei
handelt es sich um die methylierten L-Arginin Analoga Nω-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA)
und das asymmetrische Dimethylarginin (ADMA), welche die NOS kompetitiv in ihrem aktiven
Zentrum hemmen. Symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) zeigt keine inhibitorische Wirkung
auf die NOS30. Das Verhältnis des intrazellulär vorhandenen L-Arginin zu ADMA und LNMMA reguliert somit die NOS-Aktivität. Asymmetrisch methylierte L-Arginin Analoga
entstehen zum einen beim Abbau methylierter Proteine31 und zum anderen durch den
enzymatischen Umbau durch N-Methyltransferasen (PRMTs). Bislang sind fünf verschiedene
Isoformen von PRMTs identifiziert worden, welche zur Synthese von asymmetrisch
methylierten L-Argininanaloga befähigt sind32. PRMTs katalysieren die Methylierung der
6
Guanidino N-Gruppe des L-Arginin. Als Donor der Methylgruppe dient S-Adenosylmethionin,
welches als Zwischenprodukt bei der Umwandlung von Methionin zu Homocystein entsteht30.
Der Hauptanteil des
gebildeten ADMA und L-NMMA wird intrazellulär von der
Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) abgebaut. Ein Teil des gebildeten ADMA
und L-NMMA sowie das gesamte gebildete SDMA gelangt aus der Endothelzelle ins Plasma
und wird dann über die Niere ausgeschieden30. ADMA erreicht im Plasma zehnmal höhere
Konzentrationen als L-NMMA33. Ein Zusammenhang zwischen erhöhten Plasma-ADMAWerten
und
kardiovaskulären
Risikofaktoren,
wie
Bluthochdruck
34
,
Diabetes35,
zunehmendem Alter36 und Hypercholesterinämie30, konnte gezeigt werden. Bislang sind zwei
DDAH-Isoformen (DDAH I und DDAH II) beschrieben worden. Die Expression der DDAH I
kommt verstärkt in nNOS exprimierenden Zellen vor, während die Expression der DDAH II in
eNOS exprimierenden Zellen überwiegt32;37. Durch Untersuchungen der DDAH-Expression in
der Niere von Ratten wurde eine Kolokalisation von NOS und DDAH festgestellt38,was Anlass
zur Vermutung gibt, dass die NOS-Aktivität über einen intrazellulären ADMA/L-NMMA-Level
hauptsächlich über die DDAH-Aktivität reguliert wird, während von einer konstanten
Syntheseleistung der PRMTs ausgegangen wird32;37. Diese Hypothese wurde durch
Untersuchungen an Endothelzellen mit dem DDAH-Inhibitor 4124W (S-2-Amino-4(3methylguanidino)buttersäure) gestützt: durch den Einsatz von 4124W an kultivierten
Endothelzellen konnte eine erhöhte Anflutung von ADMA im Zellüberstand provoziert werden,
während die Konzentration an SDMA konstant blieb39.
7
L-Arginin:
NH
NH2
II
I
NH2—C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
L-NMMA:
NH
NH2
II
I
CH2—NH---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
ADMA:
CH2 NH
NH2
I II
I
CH2—N---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
SDMA:
NH2
NH CH2
I
I
CH2—NH---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
Abb. 2.2: Chemische Struktur von L-Arginin und den methylierten L-Argininanaloga
L-NMMA, ADMA und SDMA
Einen weiteren Einflussfaktor auf die NOS-Aktivität stellt die Bereitstellung ihres Substrates LArginin dar. Die semiessentielle kationische Aminosäure L-Arginin gelangt neben dem y+LSystem und B0,+-System, hauptsächlich durch das y+-System in die Endothelzelle40. Das y+System ist als einziges System selektiv für kationische Aminosäuren. Danach werden die
Transportsysteme auch in kationische Aminosäuretransporter (CAT) und Breitband-
8
Aminosäuretransporter (BAT) eingeteilt. Bislang sind drei Isoformen der CAT Familie
identifiziert worden: CAT-1, CAT-2A, CAT-2(B) und CAT-3. Der Begriff y+ beschreibt die
Aktivität und Expression der Gesamtheit der kationisch selektiven Transporter41. Über ein
negatives
Membranpotential
des
Transporters
kommt
es
zur
Akkumulation
und
Einschleusung der Aminosäuren40. Der Transporter ist sensitiv gegenüber Transstimulation.
Eine
Sättigung
liegt
unter
physiologischen
Bedingungen
bei
einer
L-Arginin
Plasmakonzentration von ~0,1-0,2mM vor41. In kultivierten Endothelzellen liegen LArgininkonzentrationen von 0,1 bis 0,8mM und in frisch entnommenen Endothelzellen sogar
Konzentrationen von 2-4 mM vor. Die Michaelis-Menten-Konstante der NOS beträgt ~310µM. Dennoch ist durch extrazellulär zugeführtes L-Arginin nach Stimulation der NOS
sowohl eine gesteigerte NO-Poduktion42;43, als auch ein erhöhter L-Arginin Einstrom in die
Zelle auslösbar43. Ein Recycling von L-Arginin findet durch die Argininosuccinatsynthase statt,
deren gemessene Bildungsrate in der Endothelzelle ~0,7-1,9 nmol L-Arginin *106 *Zellen1
*Stunde-1 beträgt40. Aufgrund dieser Gegebenheiten wird vermutet, dass die NOS über einen
eigenen lokalen L-Argininspeicher verfügt. Die Kolokalisation von eNOS, y+ (CAT-1) und
Argininosuccinatsynthase innerhalb der Caveolae spricht ebenfalls dafür, dass es sich bei
diesen Strukturen um eine funktionelle Einheit handelt, die auch regulativ Einfluss nimmt40;44.
Bislang sind einige Regulationsmechanismen der Aminosäuretransporter auf die NOS
beschrieben worden: die vasoaktiven Substanzen Bradykinin, Adenosintriphosphat (ATP)43
oder der A2-Purinoceptoragonist CGS-2186045 bewirken neben einer gesteigerten NOProduktion einen gesteigerten L-Arginin Einstrom in die Endothelzelle als Folge einer
Hyperpolarisation der Plasmamembran. Durch Versuche mittels NO-Donatoren konnte
gezeigt werden, dass die NO-Freisetzung selbst akut einen steigernden Effekt auf den LArginintransport via y+ bewirkt, jedoch ohne eine Hyperpolarisation auszulösen, während eine
längere Disposition eine inhibitorische Wirkung ausübt46;47. Diese inhibitorische Wirkung des
NO wurde durch eine Oxidation der Sulfhydrylgruppen des Transporters bewirkt47.
L-Arginin stellt nicht nur das Substrat der NOS, sondern auch das Substrat der Arginase dar.
Hierbei handelt es sich um ein Enzym des Harnstoffzyklus, welches mit einer Michaelis-
9
Menten-Konstante von 1-3mM erheblich zum Abbau des L-Arginin beiträgt. Bislang sind zwei
Isoformen der Arginase identifiziert worden: Arginase I und Arginase II. Bei Arginase I handelt
es sich um ein zytosolisches Enzym, welches hauptsächlich in der Leber exprimiert wird.
Arginase II ist in den Mitochondrien lokalisiert und kommt in diversen extrahepatischen
Geweben vor40. Sowohl in glatten Muskelzellen als auch in der Endothelzelle ist eine
konstitutive Aktivität der Arginase beschrieben worden48. Die Arginase interagiert mit der NOS
mittels Substratkonkurrenz, während das Zwischenprodukt der NO-Synthese Nω-hydroxy-LArginin einen potenten kompetitiven Inhibitor der Arginase darstellt (Ki 10-42µM)49.
Ein weiterer wichtiger Regulationsmechanismus für die NOS-Aktivität ist die Aktivierung durch
Phosphorylierung. So führt die Aktivierung der Proteinkinase Akt zu einer Phosphorylierung
der eNOS, was eine Ca2+-unabhängige Stimulation der NO-Produktion zur Folge hat
50;51
.
Durch Phosphorylierung verschiedener Epitope kann die NOS in ihrer Aktivität beeinflusst
werden: Serin 1177 (Ser1177), Threonin 495 (Thr495), Serin 116 (Ser116) und Serin 633
(Ser633)50-52. Die Regulation der eNOS über Ser1177-Phosphorylierung wird durch die
Proteinkinase A und Akt50;50;51;51, die Proteinkinase C (PKC), die AMP-aktivierte Proteinkinase
(AMPK)53 sowie über die zyklische AMP-abhängige Proteinkinase54 modifiziert. Die eNOS ist
unter basalen Bedingungen an Serin- und Threoninresten schwach phosphoryliert53.
Verschiedene Stimuli, wie z.B. Scherstress, bewirken eine verstärkte Phosphorylierung an
Ser1177 und damit eine Aktivierung der eNOS51-53. Die Phosphorylierung an Thr495 geht mit
einer Abnahme der Enzymaktivität einher, welche in der Lokalisation in der Bindungsdomäne
von CaM begründet ist53. Obwohl die Aktivierung der eNOS simultan mit Veränderungen der
Phosphorylierung
von
Ser1177
und
Thr495
einhergeht,
gibt
es
zusätzliche
Phosphorylierungswege des Enzyms: Ser116 ist in der Oxygenase-Domäne lokalisiert. Eine
Phosphorylierung geht, wie auch bei Thr495, mit einer Abnahme der Enzymaktivität einher54;55.
Ser633 ist an einem sogenannten Autoinhibitor-Loop, einem Peptid, welches in konstitutiv
exprimierten NOS-Isoformen vorkommt, lokalisiert. Ser633 kann in vitro durch die cAMPabhängige PKA und durch eine Proteinkinase G (PKG) phosphoryliert werden56. Bis jetzt
konnte noch keine physiologische Relevanz in intakten Zellsystemen nachgewiesen werden.
10
In vergleichenden Studien von Ser1177 mit Ser633 wurde festgestellt, dass Ser1177 eine zentrale
Rolle für die NO-Produktion spielt, wohingegen eine Phosphorylierung von Ser633 nicht
detektierbar war oder konsequenzlos blieb50;50;51;51.
2.3
Metabolismus von Stickstoffmonoxid
NO ist ein farbloses Gas, welches in wässrigen Phasen bis zu Konzentrationen von 2 mM
löslich ist57. Es kann durch die Reaktion mit Sauerstoff entweder zu Nitrosylanionen (NO-)
reduziert oder zu Nitrosoniumionen (NO+) oxidiert werden58. Das primäre Oxidationsprodukt
von NO in wässriger Lösung ist Nitrit (NO2-). Es wurde gezeigt, dass 70-90% des im Blut
zirkulierenden Nitrit aus dem L-Arginin-NO-Stoffwechsel stammen und dass Nitrit als
spezifischer und sensitiver Marker für akute Veränderungen der NOS-Aktivität verwendet
werden kann59;60. Die Kinetik der Autoxidation von NO hängt von der Ausgangskonzentration
ab61;62. Somit ist die Halbwertzeit von NO umgekehrt proportional zur NO-Konzentration und
kein konstanter Wert. Im biologischen System hängt der NO-Metabolismus von der
Diffusionsgeschwindigkeit
über
biologische
Membranen
sowie
von
der
jeweiligen
Konzentration an NO, Sauerstoff und anderen Reaktionspartnern ab. Die Diffusionskonstante
von NO in der Gefäßwand beträgt 3300 µm2/s63. Somit diffundiert NO in kurzer Zeit durch
mehrere benachbarte Zellen. Die Wirkung von NO selbst ist hiermit nicht nur auf den direkten
Ort der Bildung beschränkt, vielmehr kann der parakrine Mediator deutliche Entfernungen
vom Ort der Bildung bis zur Zielzelle zurücklegen. Einer der Reaktionspartner von NO
während der Diffusion ist molekularer Sauerstoff. Es kommt hierbei zur Bildung höherer
Stickoxide, z.B. Stickstoffdioxid und Distickstofftrioxid. Diese Stickoxide können entweder mit
anderen Molekülen wie z.B. Thiolen oder Aminen reagieren oder zu Nitrit und Nitrat (NO3-)
hydrolysieren. Ferner reagiert NO mit Hämproteinen und Sauerstoffradikalen. Das Ausmaß
jeder dieser Reaktionen ist abhängig von den Bedingungen unter denen NO freigesetzt wird
11
und von der Konzentration der jeweiligen Reaktionspartner64-66. Wichtige, am Abbau von NO
beteiligte Komponenten sind Superoxidanionen (O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2) und
Hydroxylradikale, die in unterschiedlichen Konzentrationen und in verschiedenen Zellen und
Organen vorkommen65;67;68. Hieraus resultieren verschiedene Reaktionskinetiken von NO in
vivo.
Bis vor kurzem wurde angenommen, dass endothelial gebildetes NO ausschließlich parakrin,
d.h. lokal in der Gefäßwand wirkt, weil das instabile NO-Molekül abhängig von verschiedenen
Faktoren nur eine Halbwertzeit von 0,05 bis 1 Sekunde aufweist. Mittlerweile gibt es jedoch
Hinweise, dass die NO-Wirkung durch Speicherformen69;70 auch systemisch, bildungsortfern,
also endokrin, vermittelt werden kann71-73. Im Plasma wurden NO-Intermediate gefunden, die
NO reversibel binden und die es vor dem direkten Abbau schützen können. Weiterhin wurden
Nitrosothiole, sogenannte RSNO72 nachgewiesen. RSNO entstehen durch die nitrosative
Reaktion mit plasmatischen Thiolgruppen von Albumin, Glutathion und Cystein. Die genaue
Reaktion, die zur RSNO-Bildung führt ist noch nicht geklärt. Man geht jedoch davon aus, dass
die Thiolgruppen in Anwesenheit von Elektronenakzeptoren über das Nitrosylkation zu
RSNO74;75 und nicht, wie lange angenommen, direkt mit NO reagieren73;76. Neben Thiolen im
Plasma kann NO auch mit Aminen reagieren. Neue Befunde haben gezeigt, dass
Nitrosamine (RNNO) einen physiologischen Bestandteil des humanen Plasmas darstellen
und nicht nur in entzündlichen Prozessen gebildet werden. Welche Funktion RNNO
übernehmen und ob auch sie NO freisetzen können, ist noch nicht geklärt.
Erythrozyten nehmen nicht alleine durch ihren großen Anteil am Blutvolumen von bis zu 50%
eine zentrale Rolle im vaskulären NO-Metabolismus ein77. Erythrozyten, primär als
Sauerstofftransporter bekannt, sind zellorganellfreie Blutzellen, die lediglich durch eine
Plasmamenbran vom Blutplasma abgegrenzt sind und vor allem das Protein Hämoglobin
enthalten, welches ¾ der erythrozytären Proteine ausmacht. Die Erythrozyten wurden im
Zusammenhang mit dem NO-Metabolismus bis vor kurzem lediglich als NO-abfangende
12
Zellen betrachtet, bei denen endothelial gebildetes NO durch die Reaktion mit oxygeniertem
Hämoglobin bzw. durch die Bindung an deoxygeniertes Hämoglobin inaktiviert wird78;79.
Erreicht endothelial gebildetes NO den Erythrozyten, so kann es mit dem Hämoglobin
prinzipiell drei verschiedene Reaktionen eingehen. Einerseits kann es wie bereits
beschrieben mit Oxyhämoglobin zu Methämoglobin und Nitrat reagieren. Bei der Reaktion
von NO mit dem Eisen des Deoxyhämoglobins entsteht Nitrosylhämoglobin. Die dritte
Reaktion ist die Bildung von S-nitroso-Hämoglobin, welches sich nach der Oxygenierung des
Hämoglobins in der Lunge durch eine Nitrosierungsreaktion von NO an das Cystein-93 (Cys)
der β-Kette des Hämoglobins bildet80;81. Die O2-Abgabe des Hämoglobins in der Peripherie ist
mit einer Strukturänderung zur T-Form verbunden. Dies resultiert ebenfalls in der Freisetzung
des an Cys-93 gebundenen NO. Sowohl S-nitroso-Methämoglobin als auch S-nitrosoHämoglobin führen infolge der durch die Strukturänderung des Hämoglobins induzierten
Instabilität und nachfolgender NO-Abspaltung zu einer Dilatation der Blutgefässe. NitrosylHämoglobin führt wie natives Hämoglobin durch Abfangen des endothelialen NO zu einer
Vasokonstriktion. Wie das im Erythrozyten an Hämoglobin gebundene NO in das
zellumgebende Plasma gelangt, konnte lange nicht geklärt werden. Inzwischen wird
angenommen,
dass
ein
in
der
Erythrozytenmembran
lokalisierter
AE1-Transporter
(Anionenaustauscher 1-Transporter) NO über verschiedene Bindungen ins extrazelluläre
Medium überführt82. Erythrozyten scheinen also nicht nur Abbauort von NO, sondern auch ein
regulatorischer Bestandteil der vaskulären NO-Bioverfügbarkeit zu sein. Das im Vollblut
befindliche Nitrit wurde wie oben beschrieben primär als intermediäres Zwischenprodukt im
Abbau von NO betrachtet. Neueste Untersuchungen bestätigen jedoch eine ältere
Hypothese, nach der auch im humanen Organismus, ähnlich der bakteriellen Nitrit-Reduktase
aus
Nitrit
NO
gebildet
83
Xanthinoxidoreduktase ,
Reduktion
84;85
werden
die
kann.
Drei
Mechanismen
nicht-enzymatische
sind
beschrieben:
Dysproportionierung
und die nicht-enzymatische NO-Bildung durch Deoxyhämoglobin
oder
78;86
Die
Säure-
.
Das im Plasma vorliegende Nitrit wird rasch durch Oxidation mit Oxyhämoglobin zu Nitrat
umgewandelt. Nitrat stellt ein stabiles Abbauprodukt von NO in vivo dar. Es bleibt im Blut bis
13
zu seiner Ausscheidung über die Nieren stabil und hat eine Halbwertzeit von 5-8 Stunden87;88.
Der größte Anteil des intravaskulär gebildeten NO wird ebenfalls durch die Reaktion mit
erythrozytärem Hämoglobin zu Nitrat umgewandelt. Die Konzentration des Nitrates im Blut
wird jedoch in großem Maße von NO-Stoffwechsel-unabhängigen Faktoren beeinflusst, wie
der Aufnahme durch die Nahrung, dem Metabolismus durch den Harnstoffzyklus89, der
Absorption durch den Verdauungstrakt90 und der Inhalation aus der Luft91. Die in der Literatur
beschriebenen basalen Konzentrationen von Nitrat differieren stark und wurden im Plasma
mit 0,8-95 µmol/l92-94angegeben. Als Grund hierfür wurden bisher externe Einflußfaktoren
benannt. Ein Teil des gebildeten NO entgeht der Umsetzung zu Nitrat und ist als Nitrit oder
als gebundenes NO (RNO) im Plasma zu finden. Zur besseren Beurteilung des NOMetabolismus wurde daher Nitrit als Marker für die akute eNOS-Aktivität gewählt. Es wurde
gezeigt, dass dieser oxidative Metabolit durch Stimulation bzw. Inhibition in der
Unterarmzirkulation des Menschen einen Marker für die akute eNOS-Aktivität darstellt95.
2.4
Einfluss von NO auf die erythrozytäre Aggregation und
Verformbarkeit
Die Hämorheologie beschäftigt sich mit den Fließeigenschaften des Blutes, welche sowohl
durch die zellulären Bestandteile als auch durch plasmatische Eigenschaften bestimmt
werden. Da die Erythrozyten andere Blutzellen zahlenmäßig weit übertreffen, ist auf sie das
Hauptaugenmerk gerichtet. Die Fließeigenschaften der Erythrozyten werden maßgeblich
durch deren Anzahl im Verhältnis zum Plasma (Hämatokrit) sowie deren Verformbarkeit und
Aggregierbarkeit bestimmt96;97. Als determinierende plasmatische Faktoren gelten die
Konzentrationen der großen Plasmaproteine, insbesondere des Fibrinogens, aber auch der
Immunglobuline,
des
2-Makroglobulins98;99
und
der
Lipoproteine100.
Während
die
erythrozytäre Verformbarkeit den ungestörten Blutfluss im Bereich der Mikrozirkulation
14
ermöglicht, gewährleistet die physiologische Aggregation die axiale Zellströmung in den
Arterien und Venen, welche für den Blutfluss elementar ist96.
Unter erythrozytärer Aggregation versteht man die Zusammenlagerung der Erythrozyten zu
sogenannten „Geldrollen“ (Rouleaux-Bildung), die sich mittels Interzellularbrücken der großen
Plasmaproteine formen99. Es konnte gezeigt werden, dass die Aggregationsneigung zur
„Geldrollen“-Bildung mit einer zunehmenden Plasma-Fibrinogen-Konzentration ansteigt101.
Aber auch andere hochmolekulare Proteine wie alpha2-Makroglobulin, der HaptoglobinHämoglobin-Komplex oder IgM96 und Lipide mit hohem Molekulargewicht wie LDL und VLDL
haben derartige vernetzende Eigenschaften100;102-104. Die erythrozytäre Aggregation existiert
bis zu einer Scherrate von 25 sec-1 oder im Extremfall sogar bis zu einer Scherrate von 100
sec-1, bei höheren Scherraten trennen sich die Erythrozyten wieder voneinander101. Eine
erhöhte erythrozytäre Aggregation wird als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen
diskutiert. So konnte gezeigt werden, dass an Diabetes Mellitus105, Bluthochdruck106 oder an
einer instabilen Angina pectoris107 erkrankte Personen eine erhöhte Aggregationsneigung
aufweisen. Diese Erkrankungen gehen unter anderem mit einer endothelialen Dysfunktion
einher1. Experimentell konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Aggregationsneigung
der Erythrozyten durch NO auslösbar ist108, während durch den NOS Inhibitor Nω-Nitro-LArginin Methylester (L-NAME) die erythrozytäre Aggregation gesteigert werden konnte109.
Unter erythrozytärer Verformbarkeit versteht man die Elongation der Erythrozyten, die eine
Passage durch die kleinsten Gefäße ermöglicht. Der Erythrozyt besitzt eine diskoide,
bikonkave Form mit einem Durchmesser von ~7-8 µm beim Menschen110. Der Durchmesser
der kleinsten Kapillaren mit 2-3 µm ist deutlich kleiner als der Durchmesser des Erythrozyten
selbst. Eine Durchblutung im Bereich der Mikrozirkulation ist somit nur durch die Verformung
des Erythrozyten möglich111.
15
Erythrozyt
Arteriole
Kapillare
Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Verformung eines Erythrozyten bei der Passage
durch eine Kapillare.
Die erythrozytäre Verformbarkeit ist sowohl von extrinsischen als auch intrinsischen Faktoren
abhängig. Zu den extrinsischen Faktoren gehören vor allem die Scherkräfte, die auf die
Oberfläche der Zellen wirken. Die Scherkraft selbst ist das Produkt aus Plasmaviskosität und
Scherrate111. Intrinsische Faktoren sind die Zellgeometrie, die zytoplasmatische Viskosität,
sowie die viskoelastischen Eigenschaften der Zellmembran97;111. Aus der Zellgeometrie der
Erythrozyten
mit
ihrer
diskoiden,
bikonkaven
Form
resultiert
ein
vorteilhaftes
Oberflächen/Volumen Verhältnis. Seine große Oberfläche ist nicht nur förderlich für den
Gasaustausch zwischen Gewebe und Erythrozyt, sondern ermöglicht ihm auch, relativ große
Verformungen durch einwirkende Scherkräfte zu tolerieren111;112. Die zytoplasmatische
Viskosität
wird
hauptsächlich
durch
die
intraerythrozytäre
Hämoglobinkonzentration
bestimmt111. Der dritte intrinsische Faktor, welcher die erythrozytäre Verformbarkeit im
höchsten Maße beeinflusst, ist die Viskoelastizität der Zellmembran. Die Viskoelastizität der
Zellmembran wird maßgeblich durch die Struktur ihres Zytoskeletts beeinflusst. Die
Zellmembran besteht aus zwei Komponenten. Zum einen aus der äußeren PhospholipidDoppelschicht. Und zum anderen aus einem Netzwerk von Strukturproteinen, welche sich an
der Innenseite der Lipid-Doppelschicht befinden und in dieser verankert sind. Der Hauptanteil
16
dieses Netzwerks ist das Spektrin, welches aus einer α- und einer ß-Untereinheit besteht.
Dieses dimere bis auf 200% seiner Ursprungslänge dehnbare Protein113 bildet ein 200nm
langes Tetramer, welches netzartig der Innenseite der Phospholipiddoppelschicht aufliegt. Im
Allgemeinen sind sechs Spektrinenden mit einem Aktin (Synonym: Band 5) verbunden,
welches über das Protein 4.1 und Adducin stabilisiert wird und mittels Ankyrin, Band 3 und
Glycophorin C in der Phospholipiddoppelschicht verankert ist111. Aufgaben dieser
Strukturproteine sind nicht nur der Erhalt der Membranstabilität, sondern vor allem die
Ermöglichung der Verformung114. In diversen Studien konnte gezeigt werden, dass NO die
erythrozytäre Verformbarkeit positiv beeinflusst108;115-117, während ein reverser Effekt unter
Verwendung des NOS-Inhibitor L-NAME provozierbar war108;117. Eine durch L-NAME
verschlechterte erythrozytäre Verformbarkeit war durch Zugabe von NO kompensierbar108.
2.5
Die erythrozytäre NO-Synthase
Erythrozyten wurden bislang ausschließlich als NO-abfangende Zellen betrachtet, welche
endothelial gebildetes NO durch die Reaktion mit oxygeniertem Hämoglobin oder durch die
Bindung an deoxygeniertes Hämoglobin inaktivieren (s.o.)78;79. Erst kürzlich konnte gezeigt
werden, dass neben der Endothelzelle auch Erythrozyten eine NO-Synthase besitzen10-12;118,
welche
in
physiologisch
relevanten
Mengen
NO
synthetisiert
und
exportiert10;118.
Deliconstantinos et al.118 beschrieben als erste eine im Erythrozyten lokalisierte NOS. Diese
NOS konnte durch oxidativen Stress und Kalzium zu einer gesteigerten NO-Produktion
angeregt werden, welche durch den NOS-Inhibitor L-NMMA hemmbar war. Sie beschrieben
die erythrozytäre NOS als konstitutiv exprimiert und zeigten eine Abhängigkeit von CaM,
NADPH und den Kofaktoren BH4 und FAD. Mittlerweile konnte in diversen anderen Studien
ebenfalls eine Kalziumabhängigkeit der erythrozytären NOS nachgewiesen werden10;11;119.
Um welche NOS-Isoform es sich bei der erythrozytären NOS handelt war bis vor kurzem nicht
17
eindeutig
geklärt.
Unterschiedliche
Ergebnisse,
die
entweder
eine
eNOS11
oder
Kreuzreaktionen für verschiedene Isoformen beschreiben, lagen vor12;120. In Untersuchungen
der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der eNOS-Knock-Out Maus konnte die erythrozytäre
NOS erstmals eindeutig als endotheliale Isoform charakterisiert werden10. Weiterhin ist die
erythrozytäre NOS durch das Hormon Insulin stimulierbar10;119;121. So konnte gezeigt werden,
dass die erythrozytäre NOS nach Inkubation mit Insulin sowohl eine erhöhte NO-Produktion
als auch eine gesteigerte Phosphorylierung an Serin1177 aufweist, welche mit einem
Phosphatidyl-Inositol-3.Kinase-Inhibitor hemmbar ist10. Am aufgereinigten NOS-Enzym aus
Erythrozytenmembranen wurde gezeigt, dass das Insulin direkt mit dem Enzym eine Bindung
eingeht, wodurch es vom Autor als insulin-activated-NOS (IANOS) bezeichnet wird. Die durch
Insulin gesteigerte NO-Produktion war durch einen Antikörper gegen den Insulinrezeptor
inhibierbar. Im Überstand der Präparation der Erythrozytenmembran zeigen Insulin und
Insulinrezeptor-Antikörper keine Wirkung. Nur eine membranständige NOS kann somit durch
Insulin aktiviert werden
119
. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe in mittels Gold-
Labeling untersuchten Gefrierschnitten von Erythrozyten konnte gezeigt werden, dass die
erythrozytäre NOS, sowohl zytosolisch als auch membranständig sein kann10. Die NOProduktion der insulinstimulierten NOS ist durch Zugabe von Kalzium bis zu einer
Konzentraion von 2mM steigerbar, eine höhere Konzentration hingegen hat eine
inhibitorische Wirkung auf die NOS. NO selbst hat in einer Konzentration von unter 0,8nM
eine steigernde Wirkung auf die insulinstimulierte NOS119. Weiterhin ist die erythrozytäre NOS
durch ihr Substrat L-Arginin beeinflussbar. So konnte durch ein Angebot an L-Arginin eine
gesteigerte erythrozytäre NO-Produktion nachgewiesen werden, welche durch Verwendung
eines NOS-Inhibitors hemmbar war10;11. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe
konnte gezeigt werden, dass die NO-Produktion durch Erythrozyten konzentrationsabhängig
mit steigenden L-Argininkonzentrationen zunimmt10.
Die NO-Produktion durch die erythrozytäre NOS besitzt eine inhibitorische Wirkung auf die
Thrombozytenaggregation10;11.
18
2.6
Rosuvastatin
Die Substanz Rosuvastatin, formell als ZD4522 bekannt, stellt ein Statin der 3. Generation
dar. Statine oder HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren sind cholesterinsenkende Pharmaka,
welche heutzutage nicht nur weltweit bei Patienten mit Hypercholesterinämie, sondern auch
bei Patienten mit KHK zum Einsatz kommen8. Die cholesterinsenkende Wirkung der Statine
wurde schon 1978 erkannt. Goldstein et al.7 untersuchten die aus Penicilium ssp. isolierte
Substanz Compactin122 und fanden heraus, dass diese kompetitiv die HMG-CoA-Reduktase
der Cholesterinbiosynthese inhibiert7. Wenig später konnte Lovastatin, eine dem Compactin
strukturell ähnelnde Substanz, aus Aspergillus spp. isoliert werden. Lovastatin wurde das
erste Statin, welches pharmazeutisch zum Einsatz kam123. Die HMG-CoA-Reduktase
katalysiert
die
Umsetzung
von
HMG-CoA
zu
Mevalonat
und
stellt
den
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Cholesterinbiosynthese dar. Statine binden mit
ihrer 3,5-Dihydroxyheptansäure-Seitenkette reversibel und kompetitiv an die aktive
Bindungsstelle der HMG-CoA-Reduktase124;125. Die Enzymaffinität zum Statin ist hierbei um
ein vielfaches höher als zum natürlichen Substrat HMG-CoA126. Die Inhibition der
Cholesterinbiosynthese der Leber hat eine gesteigerte Expression der hepatozytären LDLRezeptoren und somit eine Eliminierung des LDL aus dem Plasma zur Folge127. Nach einem
initialen Cholesterinabfall kommt es zu einem Gleichgewicht zwischen kompensatorischen
Mechanismen und HMG-CoA-Reduktase-Inhibition. Abhängig vom Statin werden reduzierte
Plasma-LDL-Werte
von
-19%
bis
-60%
erreicht.
Bei
Patienten,
die
an
einer
Hypertriglyzeridämie leiden, kommt es ebenfalls zu einem Abfall der Triglizeride um -22% bis
-45%, gleichzeitig wird das HDL-Cholesterin um ~5% bis 10% erhöht8. Bei den heutzutage
zum Einsatz kommenden Statinen handelt es sich entweder um rein synthetisch hergestellte
Statine, wie Rosuvastatin, oder um das natürliche Produkt Lovastatin, isoliert aus Aspergillus
terreus, und seine semisynthetischen Analoga. Die ersten angewandten Statine Lovastatin
und Simvastatin liegen als sogenannte „Prodrugs“ vor, ihre aktive Hydroxysäure-Form wird
erst in den Mukosazellen und der Leber gebildet. Alle anderen Statine liegen bereits bei
Arzneimittelapplikation in ihrer aktiven Form vor. Rosuvastatin und Pravastatin sind im
19
Gegensatz zu den anderen Statinen nicht lipophil. Rosuvastatin stellt somit eines der wenigen
Statine dar, dessen Absorption nicht von der gleichzeitigen Nahrungsaufnahme beeinflusst
wird. Rosuvastatin besitzt mit 90% eine sehr hohe hepatische Extraktion und eine
Bioverfügbarkeit von 75%, es besitzt eine Halbwertszeit von 11 bis 30h und eine hohe
Plasma-Protein-Bindung. Gerade für einen guten lipidsenkenden Effekt ist eine hohe
hepatische Extraktion von entscheidender Bedeutung. Die Metabolisierung fast aller Statine
erfolgt über das Cytochrom-P450-System8. Als hypophile Substanz wird Rosuvastatin
weitestgehend ohne Metabolismus über das Cytochrom-P450-System über die Faeces
ausgeschieden128.
Statine
sind
im
Allgemeinen
gut
verträgliche
Arzneimittel.
Als
ernstzunehmende Nebenwirkungen können Myalgien und sehr selten auch Rhabdomyolysen
auftreten8. Mevalonat stellt nicht nur den Grundbaustein des Cholesterins dar, sondern es
gewährleistet
auch
die
Bereitstellung
verschiedener
Intermediärprodukte
der
Cholesterinbiosynthese, welche z.B. für die Synthese der Isoprenoide benötigt werden129;130.
Diese Intermediärprodukte sind u.a. entscheidend für die Zellfunktion der quergestreiften
Muskulatur8. Als Folge einer Zerstörung des Sarkolemm können kurzzeitig nach
Therapiebeginn erhöhte Plasma-Kreatininkinase- und Myoglobinwerte auftreten. Verstärkte
Nebenwirkungen treten auch aufgrund von Arzneimittelinteraktionen auf. Arzneimittel, deren
Metabolisierung ebenfalls über das Cytochrom-P450-System abläuft, verursachen eine
vermehrte Anhäufung der lipophilen Statine im Organismus8;131. Für das hydrophile
Rosuvastatin besteht dieses Risiko nicht128;132
20
O
HO
O
O
HO
-
O-
H3C
OH
O
F
S-CoA
CH3
CH3
N
N
H3C
N
S
O
HMG-CoA
CH3
O
Rosuvastatin
Abb.2.6: Strukturformel des HMG-CoA und des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin.
Neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung besitzen Statine noch diverse andere
vasoprotektive Eigenschaften. Diese pleiotropen Effekte sind neben der HMG-CoAReduktase-Hemmung für den therapeutischen Nutzen der Statine von großer Bedeutung. So
konnte gezeigt werden, dass die Einnahme von Statinen das Herzinfarktrisiko unabhängig
von einer Abnahme des LDL-Cholesterins senkt133. Statine steigern eine durch Acetylcholin
provozierte Vasodilatation und verbessern somit die Endothelfunktion134. Sie üben einen
inhibitorischen
Effekt
auf
Metalloproteinasen
aus,
erhöhen
den
atherosklerotischen Plaques und beugen somit der Plaqueruptur vor
135
Kollagenanteil
in
. Dieser Effekt wird
weiterhin begünstigt durch eine Inhibition der Oxidation des LDL-Cholesterins136;137, eine
Inhibition
der
Cholesterinaufnahme
Adhäsionsneigung
der
Monozyen
der
an
Makrophagen137,
die
sowie
Gefäßwand
138
.
eine
Eine
verminderte
verminderte
21
Thromboxanbiosynthese
resultiert
in
einer
gesenkten
Aggregationsneigung
der
Thrombozyten139 und einer gesteigerten Biosynthese des Plasminogen Aktivators, zudem
führt eine verminderte Aktivität des Plasminogen Activator Inhibitor-1 zu einer verbesserten
Fibrolyse140-142. Weiterhin wirken Statine entzündungshemmend. So sinkt nach Statintherapie
der plasmatische Anteil des C-reaktiven Proteins (CRP). Hierbei handelt es sich um einen
Entzündungsmarker, welcher positiv mit dem KHK-Risiko korreliert143;144. Indirekt erhöhen
Statine die NO-Bioverfügbarkeit, indem sie die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (ROS)
unterdrücken und somit den Verlust an vasoaktivem NO durch die Reaktion mit ROS
verhindern145;146.
Viele dieser Effekte können ganz oder teilweise auf eine eNOS Aktivierung zurückgeführt
werden1. Statine stabilisieren die eNOS mRNA und steigern somit posttranskriptional die
eNOS Expression
147
. Es konnte gezeigt werden, dass Statine die hypoxie-induzierte
Herunterregulation der eNOS in kultivierten ECs verhindern148. Verursacht wird dies durch
einen
Mangel
bestimmter
Zwischenprodukte
der
Cholersterinbiosynthese.
Intermediärprodukte der Cholesterinbiosynthese wie Farnesylpyrophosphat (FPP) oder
Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) spielen eine wichtige Rolle in der posttranslationalen
Modifikation einer Vielzahl von Signalproteinen. Rho ist ein Guanosinotriphosphat (GTP)bindendes Protein, welches zwischen einem aktiven GTP-bindenden und einem inaktiven
Guanosinodiphosphat
(GDP)-bindenden
Zustand
pendelt,
während
es
von
der
Plasmamembran ins Zytoplasma transloziert. Die Geranylgeranylierung des Rho ist eine
Grundvoraussetzung für seine Translokation149. Statine verhindern die Geranylgeranylierung
und hemmen somit die Rho-GTPase, wodurch eine stabilisierende Wirkung auf die mRNA
der eNOS ausgeübt wird150. Caveolin-1 inhibiert direkt die Aktivität der NOS151. Es konnte
gezeigt werden, dass Atorvastatin die Expression von Caveolin-1 senkt und somit eine
deutliche Steigerung der NOS-Aktivität und NO-Produktion bewirkt152. Weiterhin konnte
gezeigt werden, dass Statine die eNOS auch direkt mittels Phosphorylierung durch die
Serin/Threoninkinase Akt (Synonym: Proteinkinase B) aktivieren153. Für eine Aktivierung
durch die Akt wird das Hitzeschockprotein 90 (hsp90) benötigt154. Die M-Domäne des hsp90
22
interagiert mit dem N-terminalen Ende der eNOS und der Akt155. Eine gesteigerte Interaktion
der Proteinkinase B und dem hsp90, mit der eNOS nach Verabreichung von Atorvastatin
konnte gezeigt werden152;154.
23
3
Zielsetzung
Es konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch rote Blutzellen eine NOSynthase besitzen118. Erst kürzlich konnte diese NO-Synthase eindeutig als endotheliale
Isoform charakterisiert werden10. Ob und wie eine pharmakologische Beeinflussung dieser
erythrozytären eNOS möglich ist, ist bislang ungeklärt. Statine sind cholesterinsenkende
Pharmaka, welche in der Lage sind, direkt endotheliale NO-Synthasen zu aktivieren153. Über
eine Aktivierung der erythrozytären NOS durch Statine ist bislang jedoch nichts bekannt. In
der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor
Rosuvastatin eine Wirkung auf die Aktivität der erythrozytären NOS ausübt. Als NOvermittelte rheologische Folgeerscheinungen soll die Wirkung des Rosuvastatin auf die
erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit untersucht werden. Dies soll sowohl ex vivo in
Vollblutproben von Probanden, als auch nach Verabreichung von Rosuvastatin beim Hund
untersucht werden.
Die plasmatische Nitritkonzentration stellt einen Marker der NO-Bildung durch endotheliale
NO-Synthasen dar95 und soll in dieser Arbeit als Parameter der Aktivität der erythrozytären
NOS ex vivo dienen. Die gleichzeitige Anwendung eines spezifischen NOS-Inhibitor und
Rosuvastatin soll zur Prüfung der Spezifität der NO-Bildung durch die erythrozytäre NOS
eingesetzt werden. Eine akute Aktivierung endothelialer NO-Synthasen durch Statine findet
mittels Phosphorylierung der Akt an Serin1177 statt153. Erst kürzlich konnte gezeigt werden,
dass eine Aktivierung der erythrozytären NOS durch Insulin mittels Phosphorylierung an
Serin1177 abläuft10. Ob eine mögliche Aktivierung der erythrozytären NOS durch Statine
ebenfalls mit einer Phosphorylierung an Serin1177 einhergeht, ist bislang nicht bekannt.
Da in vivo die NO-Bildung und somit auch die Nitritbildung nicht nur durch die erythrozytäre
NOS sondern vor allem auch durch die eNOS der Endothelzelle verursacht wird10;95, ist eine
Bestimmung
der
Aktivität
der
erythrozytären
NOS
mittels
der
plasmatischen
Nitritkonzentration im Tierversuch nicht möglich. Ein Inkubationsassay soll entwickelt werden
und somit eine gezielte Untersuchung der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch
ermöglichen.
24
Zusammenfassung der Ziele und Fragestellungen:
1. Bewirkt Rosuvastatin eine Aktivierung der erythrozytären NOS ex vivo in
humanen Vollblutproben?
a. Untersuchung der NO-Produktion
b. Untersuchung der NO-Produktion bei gleichzeitiger NOS-Inhibition
c. Untersuchung der eNOS-Phosphorylierung an Serin1177 in Erythrozyten
2. Verändert Rosuvastatin die Hämorheologie ex vivo in humanen
Vollblutproben?
a. Messung der erythrozytären Aggregation
b. Messung der erythrozytären Verformbarkeit
3. Etablierung eines Inkubationsassays zur Bestimmung der Aktivität der
erythrozytären NOS im Tierversuch beim Hund.
4. Bewirkt die Verabreichung von Rosuvastatin eine Aktivierung der erythrozytären
NOS beim Hund?
a. Messung mittels Inkubationsassay
5. Verändert die Verabreichung von Rosuvastatin die Hämorheologie beim Hund?
a. Messung der erythrozytären Aggregation
b. Messung der erythrozytären Verformbarkeit
25
4
Material und Methoden
4.1
Material
4.1.1
Vollblutproben von gesunden Probanden
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde Vollblut von weiblichen und männlichen
gesunden Personen mittleren Alters (20-40 Jahre) verwendet, welche sich freiwillig für die
Blutabnahme zur Verfügung stellten. Keiner der Probanden litt an Bluthochdruck, Diabetes
mellitus oder einer erblich bedingten Hypercholesterinämie. Keiner der Probanden hatte
innerhalb der letzten zwei Wochen ein Arzneimittel eingenommen (Ausnahme: Konzeptivum
bei weiblichen Probanden).
4.1.2
Vollblutproben von gesunden Hündinnen
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde Vollblut von vier gesunden
ausgewachsenen
Universitätsklinikum
Hündinnen
der
Heidelberg)
Rasse
Foxhound
sowie
von
zwei
(Herkunft:
Zentrales
ausgewachsenen
Tierlabor,
gesunden
Schäferhundmischlingshündinnen (Herkunft: Versuchstierzuchtanstalt Bonengel, Schweinfurt)
verwendet. Die Hunde waren im Zentralen Tierlabor des Universitätsklinikum Essen
untergebracht. Versuchsleiter war Prof. Dr. med. R. Schulz aus dem Institut für
Pathophysiologie, Zentrum für Innere Medizin. Jeder Hund war in einem 6,2m2 oder 7m2
großen Zwinger mit Liegemöglichkeit untergebracht und erhielt vormittags entweder einzeln
oder in Gesellschaft für ~4-6h Stunden Auslauf in einem 35,34m2 oder 70,68m2 großen
Indoorgehege mit verschiedenen Spiel- und Klettermöglichkeiten. In einem Raum befanden
sich mehrere Zwinger. Die Hunde waren durch großmaschige Metallgitter voneinander
getrennt, so dass Sozialkontakte untereinander möglich waren. Die Hunde erhielten täglich
26
zwischen 13:30 und 14:00 Uhr eine Standarddiät (ssniff® Hd-H, Exdrudat, ssniff Spezialitäten
GmbH, Soest). Wasser wurde über den Tag mittels Tränkschale ad libitum gereicht. Die
Zwinger und Ausläufe wurden täglich feucht gereinigt. Die klimatisierten Räume wiesen eine
konstante Temperatur von 21°C und eine Luftfeuchtigkeit von 55±5% auf. Mittels
Lichtprogramm wurden die Räume von 7:00 Uhr bis 19:00 Uhr erleuchtet. Intensiver
Tierpflegerkontakt war Grundvoraussetzung für das Wohlbefinden der Hunde, sowie ein
gutes Handling bei den Blutabnahmen. Bei Ankunft besaßen die Foxhounds ein
Körpergewicht von durchschnittlich 46,8kg und die Schäferhundmischlinge von 27,1kg. Zum
Zeitpunkt des Versuches war bei den Foxhounds ein Körpergewicht von 37,1kg und bei den
Schäferhundmischlingen von 32,0kg messbar. Sie besaßen ein Alter von 3-4 Jahren
(Schäferhundmischlinge) und 8-9 Jahren (Foxhounds). Das Geschlecht war aufgrund
besserer Erfahrungen im Handling mit weiblichen Tieren festgelegt worden. Der
Gesundheitszustand wurde sowohl adspektorisch als auch durch ein gleichzeitig erhobenes
rotes und weißes Blutbild vor jeder Messung überprüft. Alle Hunde hatten innerhalb der
letzten drei Wochen vor der Blutabnahme keine anderen Arzneimittel erhalten. Zwischen den
Blutabnahmen wurde ein Zeitraum von zwei Wochen zur Erholung der Tiere eingehalten.
Zum Zeitpunkt der Blutabnahme zeigten die Hunde keine Läufigkeitssymptome.
4.1.3
Übersicht über die verwendeten Proben
Spezies
Anzahl
Art der Proben
Mensch
50
Blutproben
Herkunft
Freiwillige Probanden
Institut für Pathophysiologie,
Hund
24
Blutproben
Zentrum für Innere Medizin,
Universitätsklinikum Essen
27
4.1.4
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die
Vollblutinkubation
Substanz
Bezugsquelle
L-Arginin
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
L-Valin
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin (L-NIO)
Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA)
Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
S-Ethyl-N-{4(Trifluoromethyl)
Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
Phenyl}Isothiourea (ETU)
NG, NG-Dimethyl-L-Arginin (ADMA)
Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
Insulin
Actrapid, Novonordisk Bagsvaerd, Dänemark
Calzium-Ionophore
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
EDTA
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Rosuvastatin
AstraZeneca, Macclesfield, Chestire, UK
PBS-Puffer pH 7,3
Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland
Refludan (Lepirudin)
Schering, Berlin, Deutschland
4.1.5
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die
Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion
Substanz
Bezugsquelle
Kaliumiodid
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Iodine
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
LiChrosolv
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Essigsäure
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
28
Natriumhydroxid
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Aceton
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Isopropanol
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Aqua B. Braun
B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
Natriumnitrit
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Helium
Linde, Unterschleißheim, Deutschland
4.1.6
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die
Nitratmessung mittels Fluß-Injektions-Analyse
Substanz
Bezugsquelle
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-
Sigma-Aldrich GmbH, München,
Phosphat (NADPH)
Deutschland
Glukose-6-Phosphat
Roche Life Sciences, Mannheim,
Deutschland
Glucose-6-Phophat-Dehydrogenase
Roche Life Sciences, Mannheim,
Deutschland
TRIS-HCl
BioRad, Kalifornien, USA
Aqua ad injectabilia
B.Braun, Melsungen AG, Deutschland
Nitratreduktase
Roche Life Sciences, Mannheim,
Deutschland
Aqua B. Braun
B.Braun, Melsungen AG, Deutschland
PBS-Puffer pH 7,3
Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland
Natriumnitrat
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
N-(1-Naphtyl)ethylendiamine
Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz
Dihydrochloride
Sulfanilamid
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Isopropanol
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
29
Salzsäure
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
LiChrosolv
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
4.1.7
Verwendete Substanzen und Reagenzien für die modifizierte
Filtrationsmethode
Substanz
Bezugsquelle
PBS-Puffer pH 7,3
Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland
Lepirudin
Schering, Berlin, Deutschland
4.1.8
Verwendete Substanzen und Reagenzien für den
immunhistochemischen Nachweis der phosphorylierten Form
der eNOS
Substanz
Bezugsquelle
PBS-Puffer pH 7,3
Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland
Methanol
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Paraformaldehyd
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Triton-X-100
neoLab, Heidelberg, Deutschland
Tris-Base
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Tween 20
BioRad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Dr.,
Hercules, CA 94 547
Trypsin
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Hydrogenperoxid
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Blotting Grade Blocker, Non-fat dry
BioRad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Dr.,
milk
Hercules, CA 94 547
PeNOS Antikörper (Ser1177)
Upstate, Lake Placid, NY
30
goat antirabbit antibody
Dako, Glostrup, Denmark
streptavidin–horseradish-peroxidase
Amersham, Little
conjugate
Chalfont, England
4.1.9
Verwendete Substanzen und Reagenzien zur Messung des
Blut-pH Wertes
Substanz
Bezugsquelle
Puffer pH 7,00
Riedel-de Haën, RdH Laborchemikalien, Seelze, Deutschland
Puffer pH 9,00
Riedel-de Haën, RdH Laborchemikalien, Seelze, Deutschland
Aqua B. Braun
B.Braun, Melsungen AG, Deutschland
31
4.2
Material und Geräte
4.2.1
Materialien zur Gewinnung von Vollblutproben
Material
Bezugsquelle
Punktionskanüle
Venofix, 0,8mm, B.Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
Sterile Einmalspritze 10ml
BD
Becton
Dickinson,
Heidelberg
,
Deutschland
Reaktionsgefäß
Greiner bio one, Frickenhausen Deutschland
Venenverweilkanüle
KLINIKA
MedicalGmbH,
Usingen,
Deutschland
Stauschlauch
Prämeta, Deutschland
Tupfer
Fuhrmann
Verbandstoffe
GmbH,
Deutschland
4.2.2
Materialien für die Vollblutinkubation
Material
Bezugsquelle
Warmwasserbad
GFL, Deutschland
Externes Thermometer
Brand, Deutschland
Reaktionsgefäße (50ml/15ml)
Greiner bio one, Frickenhausen,
Deutschland
Eppendorf-Reaktionsgefäße
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Eppi-Schwimmer
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Much,
32
4.2.3
Materialien und Geräte für die Nitritmessung mittels
reduktiver Chemilumineszenzdetektion
Material
Bezugsquelle
Zentrifuge
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Pipetten und Pipettenspitzen
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Reaktionsgefäße
Greiner
bio
one,
Frickenhausen,
Deutschland
NO-Detektor, CLD 88 NO e
Eco Physics, Schweiz
Reaktionskammer
Firma Verhees, Neus, Deutschland
Proteinfalle
Firma Verhees, Neus, Deutschland
Kaltwasserumwälzpumpe
Behr Labortechnik, Düsseldorf, Deutschland
Warmwasserumwälzpumpe
Firmengruppe Preiss-Daimler, Medingen,
Deutschland
Teflonschläuche
Sigma-Aldrich GmbH, München,
Deutschland
Gummischläuche
Norton Performance Plastic Corporation,
Akron, OH
Filter: SRP 25 0,20µm
Virascience AG, Hannover, Deutschland
Fritrestriktor
Eco Physics, Schweiz
Ultraschallwasserbad
Welabo, Düsseldorf, Deutschland
Hamiltonspritze (100, 200, 500 microl)
Hamilton, Bonaduz, Schweiz
Druckverminderer
FMI GmbH, Seeheim/Ober-Beerbach,
Deutschland
Barometer
IMT, Deutschland
Interfacebox
Knauer, Berlin, Deutschland
Handelsüblicher PC
Eurochrome
Knauer, Berlin, Deutschland
33
Eppendorf-Reaktionsgefäße
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Sterile Einmalspritzen 20ml
BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
Sterile Kanülen
BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
4.2.4
Materialien und Geräte für die Nitratmessung mittels
Fluß-Injektions-Analyse
Material
Bezugsquelle
Eppendorf Reaktionsgefäße
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Ultrafiltrationsröhrchen Centricon YM 10
Millipore Corporation, Eschborn,
Deutschland
HPLC-Pumpe, Sunflow 100
Sunchrom, Friedrichsdorf, Deutschland
Entgaser, 2-Kanal Degaser Populär
Sunchrom, Friedrichsdorf, Deutschland
Photometer
Shimadzu SPD-6AV
Autoinjektor
Triathlon, Spark, Holland
Interface-Box
Knauer, Berlin, Deutschland
Handelsüblicher PC
Chromatographie-Software:
Knauer, Berlin, Deutschland
Chromgate2.55
4.2.5
Materialien und Geräte für die modifizierte Filtrationsmethode
Material
Bezugsquelle
Zentrifuge
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
50ml Reaktionsgefäße
Greiner bio one, Frickenhausen,
Deutschland
34
Sterile Einmalspritzen 20ml
BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
Parafilm
Pechiney Plastic Packaging, Chicago, IL
Combi-Stopper
B.Braun, Melsungen AG, Melsungen,
Deutschland
Pipettboy
Hirschmann Laborgeräte, Deutschland
Stripetten
Costar, Corning, NY
Sterile Einmalspritzen 2ml
BD Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
Teflonkanülen
Welabo, Düsseldorf, Deutschland
3 Reaktionsgefäße für die Verformbarkeit Glasbläserei, Firma Verhees, Neus,
Deutschland
Gummischläuche
Norton Performance Plastic Corporation
justierbares Barometer
Van Der Heijden, Dörentrup, Deutschland
Erlenmeyerkolben (2l)
Schott, Deutschland
Glaskapillare
Schott, Deutschland
Wasserreservoir
Greiner bio one, Frickenhausen,
Deutschland
Absaugpumpe
Welabo, Düsseldorf, Deutschland
Vakuumpumpe: Liquiport Membran-
Welabo, Düsseldorf, Deutschland
Flüssigkeitspumpe
Stoppuhr
Membranfilter, Isopore
VWR, Darmstadt, Deutschland
®
Millipore Corporation, Eschborn,
Deutschland
Kunststofffilterhalter, Swinnex
®
Millipore Corporation, Eschborn,
Deutschland
Tuberkulinspritzen, BD-Plastipak
BD, Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland
35
4.2.6
Materialien und Geräte für den immunhistochemischen
Nachweis der phosphorylierten Form der eNOS
Material
Bezugsquelle
Deckgläser
VWR, Darmstadt, Deutschland
Objektträger
VWR, Darmstadt, Deutschland
Kompressen
Fuhrmann
Verbandstoffe
GmbH,
Much,
Deutschland
Eppendorf Reaktionsgefäße
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Petrischalen
VWR, Darmstadt, Deutschland
Leica RM2000 microscope
Leica, Wetzlar, , Deutschland
Sony DXC 1850 PCCD camera
Sony, Cologne, , Deutschland
Image G software
National Institutes of
Health, Bethesda, MD
4.2.7
Materialien und Geräte für die photometrische Messung der
Hämoglobinkonzentration in Plasma
Material
Bezugsquelle
Photometer
Beckmann, Deutschland
Halbmikroküvetten
VWR, Darmstadt, Deutschland
4.2.8
Materialien und Geräte zur Messung des Blut-pH
Material
Bezugsquelle
pH-Meter
WTW pH522, Wissenschaftlich-technische
Werkstätten, Weilheim, Deutschland
36
4.3
Methoden
4.3.1
Blutabnahme bei Probanden
Die Blutabnahme erfolgte unter Verwendung eines Stauschlauchs mittels venöser
Punktionskanüle (Butterfly) aus der Vena cubiti. Zur Vermeidung einer Hämolyse wurde auf
eine langsame gleichmäßige Blutabnahme und rasches Überführen mittels 10ml-Spritzen in
das mit Antikoagulans bestückte Röhrchen geachtet. Als Antikoagulans wurde ausschließlich
Refludan (Lepirudin 62,5µg/ml Vollblut) verwendet.
4.3.2
Blutabnahme bei Hunden
Die Blutabnahme am Hund erfolgte aus der mit der Hand gestauten V. cephalica antebrachii
oder der V. saphena lateralis unter Verwendung eines Venenverweilkatheters. Das Blut für
die Inkubationsversuche wurde direkt ins Sammelgefäß hineingetropft und anschließend zu
den Ansätzen pipettiert. Für die Messungen der basalen Nitritkonzentrationen wurde Blut in
eine 2ml-Spritze aufgezogen. Dies ermöglichte eine präzise und schnelle Überführung von
2ml
Vollblut
in
die
vorbereitete
auf
4°C
gekühlte
mit
Antikoagulans
versetzte
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS).
4.3.3
Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität
der erythrozytären NOS in humanen Vollblutproben
4.3.3.1
Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin ex vivo in humanen
Vollblutproben
Die Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre NOS-Aktivität wurde anhand einer
Vollblutinkubation mit der Reinsubstanz untersucht. Hierfür wurden Konzentrationen von
37
10ng/ml, 20ng/ml, 30ng/ml und 40ng/ml Rosuvastatin gewählt. Dies entspricht den
Konzentrationen, welche nach oraler Therapie beim Menschen im Plasma gemessen werden
können. Stocklösungen mit der zehnfachen Konzentration an Rosuvastatin versetzt mit LValin (300mM) und L-Arginin (3mM), sowie eine Stocklösung mit nur L-Valin und L-Arginin für
die Kontrollinkubation wurden vorbereitet. Frisch entnommenes antikoaguliertes Vollblut von
neun gesunden Probanden wurde mit den vorbereiteten Stocklösungen im Verhältnis 10:1
vermischt, und dann für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurde
allen Inkubationsansätzen ein 400µl großes Aliquot entnommen, welches direkt in ein
Eppendorfgefäß, gefüllt mit 1600µl eisgekühlten PBS (Verhältnis 1:5), überführt und sofort
mittels Eppendorfzentrifuge (1min, 5000g, 4°C) in seine zellulären und plasmatischen
Bestandteile zerlegt wurde. Der Plasmaüberstand wurde vorsichtig abpipettiert und in einem
separaten Röhrchen bis zur Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion
(siehe 4.3.14) im Dunkeln auf Eis gelagert. 1ml des Plasmaüberstandes wurde in
Ultrafiltrationsröhrchen (Centricon YM 10) mittels Zentrifuge (3h, 2000g, 4°C) ultrafiltriert und
das Ultrafiltrat anschließend bei -80°C für die spätere Messung der plasmatischen
Nitratkonzentration mittels Nitrat-Reduktase-Flussinjektionsanalyse (siehe 4.3.15) konserviert.
Die Nitritmessung erfolgte direkt im Anschluss an den Inkubationsversuch.
4.3.3.2
Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation
mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin in
humanen Vollblutproben
Stocklösungen mit Rosuvastatin 200ng/ml, Rosuvastatin 200ng/ml + L-NMMA 3mM und LNMMA 3mM wurden vorbereitet. Alle drei Stocklösungen enthielten zusätzlich L-Valin 300mM
und L-Arginin 3mM. Frisch entnommenes antikoaguliertes Vollblut von fünf gesunden
Probanden wurde mit den vorbereiteten Stocklösungen im Verhältnis 10:1 vermischt, und
dann für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurde die
Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion (siehe 4.3.14)
bestimmt. Die Plasmanitratkonzentration wurde in den folgenden Wochen mittels Nitrat-
38
Reduktase-Flussinjektionsanalyse (siehe 4.3.15)
gemessen (Probenaufarbeitung siehe
4.3.3.1).
4.3.3.3
Quantitative
Bestimmung
der
erythrozytären NOS an Serin
1177
Phosphorylierung
der
nach Inkubation von
humanen Erythrozyten mit Rosuvastatin
Eine Stocklösung mit 200ng/ml Rosuvastatin, 300mM L-Valin, 3mM L-Arginin sowie eine
Stocklösung mit 300mM L-Valin und 3mM L-Arginin für die Kontrollinkubation wurden
vorbereitet. Vollblut von vier gesunden Probanden wurde mit Lepirudin antikoaguliert. Durch
Zentrifugation (800g, 20min, 4°C) wurden Erythrozyten und Plasma in speziellen
Abtropfgefäßen voneinander getrennt und anschließend die reinen Erythrozyten im zellfreien
Plasma im Verhältnis 1:1 resuspendiert. Das Erythrozytengemisch der vier Probanden wurde
jeweils mit den vorbereiteten Stocklösungen im Verhältnis 10:1 vermischt, und dann für 30min
bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurden die Erythrozyten als
Ausstriche auf breiten Deckgläsern mit Methanol/Paraformaldehyd(37%)-Lösung (9:1, V:V)
fixiert, mit PBS gewaschen und mit PBS/Triton-X-100 (0,1%) permeabilisiert. Danach wurden
sie in einmolarer Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) nochmals gewaschen und für 20min
in eine Lösung, bestehend aus PBS, H2O2 (2%) und Methanol (80%) gegeben. Die Ausstriche
wurden mit Milchpulver (3%), gelöst in TBS, für 30min bei Raumtemperatur behandelt. Es
folgte eine Inkubation in TBS mit Milchpulver (0,3%), Tween 20 (0,03%) und dem primären
polyklonalen Kaninchen Antikörper gegen die phosphorylierte Form der eNOS an Ser1177
(1:500, Upstate, Lake Placid, NY). Nach Waschen der Proben mit TBS wurden die Ausstriche
mit dem Zweitantikörper (1:400, goat-anti-rabbit-antibody, Dako, Glostrup, Dänemark) für
30min inkubiert. Ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Verdünnung 1:150) wurde den
Ausstrichen für 30min hinzu gegeben. Die Reaktion wurde mit 3,3’-DiaminobenzidinTetrahydrochlorid gelöst in PBS durchgeführt. Die immunzytochemischen Untersuchungen
der Erythrozytenausstriche wurden von Prof. W. Bloch und seinen technischen Assistenten/innen an der Deutschen Sporthochschule Köln durchgeführt.
39
4.3.3.4
Gleichzeitige
Messung
der
Plasmanitrit-
und
Nitratkonzentration, sowie der erythrozytären Aggregation
und
Verformbarkeit
nach
Inkubation
von
humanen
Vollblutproben mit Rosuvastatin
Eine Stocklösung mit 200ng/ml Rosuvastatin, 300mM L-Valin, 3mM L-Arginin sowie eine
Stocklösung mit 300mM L-Valin und 3mM L-Arginin für die Kontrollinkubation wurden
vorbereitet. Vollblut von acht gesunden Probanden wurde mit Lepirudin antikoaguliert. Das
frisch entnommene Vollblut wurde mit den vorbereiteten Stocklösungen im Verhältnis 10:1
vermischt, und dann für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurde
die Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion (siehe 4.3.14,
Probenaufarbeitung siehe 4.3.3.1), die erythrozytäre Verformbarkeit mittels der modifizierten
Filtrationsmethode (siehe 4.3.16, Probenaufarbeitung siehe 4.3.5) und die erythrozytäre
Aggregation
mit
dem
Myrenne-Aggregometer
(siehe
4.3.17)
bestimmt.
Die
Plasmanitratkonzentration wurde in den folgenden Wochen mittels Nitrat-ReduktaseFlussinjektionsanalyse (siehe 4.3.15) gemessen (Probenaufarbeitung siehe 4.3.3.1).
4.3.4
Etablierung eines Inkubationsprotokolls zur Bestimmung der
Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch
4.3.4.1
Basale
Aktivität
der
erythrozytären
NOS
während
30minütiger Inkubation mit und ohne Arginaseinhibition durch
L-Valin
Die Abhängigkeit der erythrozytären NOS-Aktivität von der vorhandenen Plasma L-Arginin–
konzentration sollte quantifiziert werden. Weiterhin sollte der Einfluss der Arginase auf die
basale Aktivität der erythrozytären NOS untersucht werden. Eine 300mM Lösung von dem
Arginaseinhibitor L-Valin gelöst in PBS wurde angesetzt. Drei beliebigen Hunden des
40
Kollektivs wurden 25ml Blut abgenommen und mit Lepirudin antikoaguliert. 10ml des frisch
entnommenen Vollblutes wurden im Verhältnis 10:1 mit 300mM L-Valin gelöst in PBS für
30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Weitere 10ml wurden entnommen, mit
reinem PBS im Verhältnis 10:1 vermischt, und dann ebenfalls bei 37°C für 30min inkubiert.
Anschließend
wurde
die
Plasmanitritkonzentration
mittels
reduktiver
Chemilumineszenzdetektion (siehe 4.3.14) bestimmt. Die Plasmanitratkonzentration wurde in
den folgenden Wochen mittels Nitrat-Reduktase-Flussinjektionsanalyse (siehe 4.3.15)
bestimmt (Probenaufarbeitung siehe 4.3.3.1).
4.3.4.2
Bestimmung
verschiedenen
der
Nitritbildung
nach
L-Argininkonzentrationen
Inkubation
mit
und
mit
ohne
Arginaseinhibition
Stocklösungen der verschiedenen Reagenzien gelöst in PBS wurden vorbereitet, sowie alle
Materialien und Geräte, die für den Versuch notwendig waren aufgebaut. Das Vollblut wurde
im Inkubationsversuch mit den Stocklösungen im Verhältnis 10:1 vermischt. Für den Versuch
wurden folgende Stocklösungen verwendet: 30mM L-Arginin, 3mM L-Arginin, 3mM L-Arginin
+ 300mM L-Valin, 300µM L-Arginin und 300mM L-Valin. 10ml Vollblut von acht gesunden
Probanden wurde mit Lepirudin antikoaguliert und anschließend mit den jeweiligen
Reagenzien für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Nach Beendigung der
Inkubation wurde jedem Inkubationsansatz ein Aliquot entnommen, und im plasmatischen
Überstand die Nitrit- und Nitratkonzentration bestimmt (siehe 4.3.3.1).
4.3.4.3
Bestimmung
der
Nitritbildung
nach
Inkubation
mit
verschiedenen NOS-Inhibitoren
Die NOS-Inhibitoren N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin (L-NIO), NG, NG-Dimethyl-L-Arginin (ADMA),
S-Ethyl-N-{4-(Trifluoromethyl)Phenyl}Isothiourea (ETU), NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA)
41
wurden auf ihre inhibitorische Wirkung untersucht. Aufgrund einer größeren Verfügbarkeit von
Blut gesunder Probanden wurden die Inhibitoren zuerst an humanem Vollblut, und darauf
folgend an caninem Vollblut getestet. Zuerst wurden Stocklösungen der Inhibitoren gelöst in
PBS vorbereitet (L-NIO 1mM, ADMA 500 µM, ETU 1mM, L-NMMA 3mM). Alle Stocklösungen
enthielten zusätzlich 300mM L-Valin. Eine Stocklösung mit L-Valin (500mM) gelöst in PBS
diente der Kontrollinkubation. Vier gesunden Personen (weitere 3 für L-NIO) wurde 10ml
Vollblut abgenommen. Das frisch entnommene Vollblut wurde dann direkt in die mit dem
Agens gefüllten Reaktionsgefäße pipettiert und für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad
inkubiert. Das Vollblut wurde im Verhältnis 10:1 mit dem jeweiligen Agens vermischt, so dass
die angestrebten Endkonzentrationen von 100µM L-NIO, 50µM ADMA, 100µM ETU, 300µM
L-NMMA sowie 50mM L-Valin erreicht wurden. Nach Beendigung der Inkubation wurde jedem
Inkubationsansatz ein Aliquot entnommen, und im plasmatischen Überstand die Nitrit- und
Nitratkonzentration bestimmt (siehe 4.3.3.1). Der Versuch wurde mit Vollblutproben von drei
gesunden Hunden auf gleiche Art und Weise wiederholt.
4.3.4.4
Bestimmung
der
Nitritbildung
nach
Inkubation
mit
verschiedenen eNOS-Stimulantien
Neun gesunden Personen wurde jeweils 10ml Vollblut entnommen. Die antikoagulierte
Blutprobe wurde dann direkt in die vorbereiteten Reaktionsgefäße pipettiert und bei 37°C für
30min im Schüttelwasserbad inkubiert. Die Stocklösungen wurden mit Vollblut 1:10 verdünnt,
so dass die Endkonzentrationen von 300µM L-Arginin, 300µM L-Arginin + 27,5µU Insulin und
300µM L-Arginin + 5mM Kalzium erreicht wurden. Alle Stocklösungen enthielten zusätzlich LValin, so dass eine Endkonzentration an L-Valin von 30mM in jedem Inkubationsansatz
erreicht wurde. Nach Beendigung der Inkubation wurde jedem Inkubationsansatz ein Aliquot
entnommen, und im plasmatischen Überstand die Nitrit- und Nitratkonzentration bestimmt
(siehe 4.3.3.1).
Der Versuch wurde mit Vollblutproben von sechs gesunden Hunden auf gleiche Art und
Weise wiederholt.
42
4.3.5
Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität
der erythrozytären NOS im Tierversuch
Zur Differenzierung zwischen Effekten der erythrozytären NOS und der eNOS anderer Zellen,
wurde ein speziell entwickeltes Inkubationsprotokoll verwendet. Vollblut von sechs gesunden
Hunden wurde unter Kontrollbedingungen und 24h nach oraler Verabreichung von
Rosuvastatin in Tablettenform (3mg/kg Körpergewicht) untersucht. Bei jeder Untersuchung
wurde den Hunden insgesamt 58ml Vollblut abgenommen und mit Lepirudin (62,5µg/ml
Vollblut) antikoaguliert. 2ml der Vollblutprobe wurden direkt bei der Blutentnahme mittels 2mlSpritze in ein Reaktionsgefäß mit 8ml eisgekühltem PBS überführt und zur Gewinnung des
Plasma für die Nitrit- und Nitratbestimmung sofort zentrifugiert (4°C, 800g, 20min). Das
Plasma wurde abpipettiert und bis zur Messung des plasmatischen Nitritgehalt mittels
reduktiver Chemilumineszenzdetektion auf Eis gelagert. Für die Nitratmessung mittels
Nitratreduktase-Fluß-Injektions-Analyse wurde 1ml des Plasmas in der Zentrifuge mittels
Ultrafiltrationsröhrchen (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) ultrafiltriert. 10ml der
Vollblutprobe wurden ebenfalls in einem separaten Röhrchen zentrifugiert (4°C, 800g, 20min),
um daraus Erythrozytenkonzentrat für die Messung der erythrozytären Verformbarkeit
herzustellen. Das Erythrozytenkonzentrat wurde mittels PBS auf einen Hämatokrit von 35%
eingestellt und die erythrozytäre Verformbarkeit mit der modifizierten Filtrationsmethode als
Dreifachmessung bestimmt. Weitere 45ml der Vollblutprobe wurden in ein Reaktionsgefäß mit
5ml L-Valin (500mM) gelöst in PBS überführt und dann unverzüglich in die drei vorbereiteten
Reaktionsröhrchen für den Vollblutinkubationsassay überführt. Das Vollblut wurde im
Verhältnis 1:10 mit PBS, L-Arginin (3mM) gelöst in PBS und ADMA (500µM) gelöst in PBS
vermischt und dann bei 37°C für 30min im Schüttelwasserbad inkubiert. 1ml der Vollblutprobe
diente zur Erstellung eines roten und weißen Blutbildes zur zusätzlichen Kontrolle des
Gesundheitszustandes des Hundes. Aus einem weiteren Aliquot der Vollblutprobe von 100µl
wurde mit dem Myrenne-Aggregometer die erythrozytäre Aggregation gemessen. Nach
Abschluss der Inkubation wurde aus den drei Inkubationsansätzen ebenfalls der plasmatische
Nitrit- und Nitratgehalt sowie die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit bestimmt. Für
43
die Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion wurde den drei Ansätzen je
ein Aliquot von 800µl entnommen, welches dann im Verhältnis 1:5 mit eisgekühlten PBS
verdünnt und sofort zur Plasmagewinnung durch Zentrifugation in seine plasmatischen und
korpuskulären Bestandteile zerlegt wurde (4°C, 300g, 20min). Je 1ml des Plasmas von allen
drei Ansätzen wurde für die spätere Bestimmung des Nitratgehaltes mittels NitratreduktaseFluß-Injektionsanalyse ultrafiltriert (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) und das Ultrafiltrat
anschließend bis zur Messung bei -80°C gelagert. Ein 100µl Aliquot aus allen drei Ansätzen
diente der sofortigen Bestimmung der erythrozytären Aggregation mittels MyrenneAggregometer. Aus dem Rest der drei Inkubationsansätze wurde durch Zentrifugation (4°C,
800g, 20min) Erythrozytenkonzentrat hergestellt. Dieses wurde mit PBS auf einen Hämatokrit
von 35% eingestellt und direkt anschließend die erythrozytäre Verformbarkeit mit der
modifizierten Filtrationsmethode als Dreifachmessung bestimmt. Das plasmatische Nitrit
wurde direkt nach Abschluss der Messungen der erythrozytären Aggregation und
Verformbarkeit der Inkubationsproben bestimmt und das plasmatische Nitrat in den darauf
folgenden Wochen.
44
Vorbereitung und Messung des Nitritund Nitratgehalts sowie der
erythrozytären Verformbarkeit
Zeit:
Messung der erythrozytären
Aggregation
Inkubationsassay
Vorbereitung
b
a
s
a
l
e
M
e
s
s
u
n
g
Blutabnahme und Aliquotierung des Vollbluts:
A: 10ml in Erythrozyten-Abtropfgefäß (+Lepirudin 0,25µl/ml) und direkt zentrifugieren
B: 2ml direkt 1:5 in eisgekühltes PBS (+Lepirudin 0,25µl/ml) und direkt abzentrifugieren
D: 45ml (+Lepirudin 0,25µl/ml)+5ml L-Valin (500mM)
E: 100µl (+Lepirudin 0,25µl/ml) für Myrenne-Aggregometer isolieren
F: 1ml in EDTA-Röhrchen für rotes und weißes Blutbild (direkt bestimmen)
aus E:
Messung der basalen
erythrozytären Aggregation
mit dem
Myrenne-Aggregometer
800g, 4°C, 20min
aus D: Inkubationsproben pipettieren:
1. PBS
2. L-Arginin(300µM)
3. ADMA (50µM)
(VB 1:10 + Agens:
15ml VB + 1,666 ml Agens)
aus B: 2x 500µl verdünntes Plasma aliquotieren und für die CLD kühl
und dunkel lagern, 1ml ultrafiltrieren (s.u.)
aus A: Erythrozyten isolieren, mit PBS auf Hkt. 35% einstellen und mit
der modifizierten Filtrationsmethode die basale Verformbarkeit bestimmen
Inkubation bei 37°C
für 30min
im Schüttelwasserbad
Nach Beendigung der Inkubation werden die 3 Inkubationsproben wie folgt aliquotiert:
aus 1. 3x500µl VB aliquotieren und mit eisgekühltem PBS 1:5 verdünnen
aus 2. 3x100µl VB in 1,5ml Eppendorfgefäß aliquotieren
aus 3. 3x10ml VB in Erythrozyten-Abtropfgefäß überführen
1. und 3. zentrifugieren
(800g, 4°C, 20min)
aus 2.: Messung der
erythrozytären
Aggregation der
Inkubationsproben
mit dem
Myrenne-Aggregometer
Weitere Probenaufarbeitung aus 1. und 3.:
aus 1.: aus den 3 Ansätzen je 2x500µl verdünntes Plasma aliquotieren und für die Chemilumeneszenzdetektion
auf Eis dunkel lagern und 1ml im Ultrafiltrationsröhrchen nochmals zentrifugieren (Centricon YM 10; ca. 3h,
2000g, 4°C)
aus 3.: aus den 3 Ansätzen Erythrozyten isolieren, mit PBS auf Hkt. 35% einstellen und mit der Filtration nach
Reid die erythrozytäre Verformbarkeit der Inkubationsproben messen
Messung der Nitritkonzentration mittels Chemilumeneszenzdetektion und Lagerung des ultrafiltrierten Plasmas (je 2 Aliquots)
bei -80°C für die Messung der plasmatischen Nitratkonzentration mittels Nitratreduktase-Fluß-Injektionsanalyse
45
Abb. 4.1: Protokoll für die Messung der erythrozytären Verformbarkeit, Aggregation und des
Plasmanitritgehaltes, sowie für die Probenaufarbeitung der Nitratproben vor und nach
Verabreichung von Rosuvastatin
Bestimmung der Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver
4.3.14
Chemilumineszenzdetektion 156;157
Die Nitritkonzentration wurde mittels einer reduktiven jodhaltigen Reaktionslösung vollständig
stöchiometrisch zu Stickstoffmonoxid
umgewandelt
und
anschließend
mittels
einer
Chemilumineszenzreaktion quantifiziert. Die NO-Detektion beruhte auf der Messung von
Lichtquanten, die stöchiometrisch bei der Reaktion von NO mit Ozon (O3) abgegeben werden.
Als Detektor diente eine Anlage der Firma Ecophysics (Typ CLD 88 NO e). Zur Reduktion von
Nitrit zu NO wurde eine jodhaltige Reaktionslösung (1,62 g Kaliumjodid, 0,57 g Iod, 30 ml,
200ml konzentrierte Essigsäure) verwendet, welche sich in einer auf 60°C erhitzten
Reaktionskammer befand. Die reduktive Freisetzung von NO aus der Probe läuft dann nach
folgender Reaktion ab:
NO2 - + 2 H+ →
NO+ + H2O
NO+ + I-
→
ONI
2 ONI
→
2 NO. + I2
In die Reaktionskammer wurde direkt über eine Membran mittels einer gasdichten Spritze
(Hamiltonspritze) die Probe appliziert. Nach jeder Probenaufgabe wurde die Spritze einmal
mit Aceton, sowie sechsmal mit destilliertem Wasser gespült. Währendessen strömte über
eine Glasfritte das Inertgas Helium in die Reaktionskammer hinein und transportierte das
gasförmige
NO
in
Richtung
Detektor.
Zur
Befreiung
möglicher
mitgetragener
Verunreinigungen aus der Probe passierte das mit der Probe angereicherte Gas eine
Kühleinheit (4°C) sowie ein mit einmolarer Natronlauge gefülltes Gefäß, bevor es den
Detektor erreichte. Durch Kondensation und Proteinfällung wurde somit eine Aufreinigung des
46
Probengasgemisches erreicht. Zur Bestimmung der Plasmanitritgehalte wurde Vollblut in auf
4°C gekühlter Phosphatpufferlösung (PBS) 1:5 verdünnt und sofort zentrifugiert (20min, 800g,
4°C)
um
den
zellulären
vom
plasmatischen
Anteil
zu
trennen.
Diese
Art
der
Probenaufarbeitung ermöglichte eine hohe Wiederfindungsrate des plasmatischen Nitrits. Zur
Datenaufnahme und Verarbeitung wurde ein handelsüblicher PC mit der Software
Eurochrome verwendet, welcher über eine Interfacebox mit dem Detektor verbunden war. Die
Größe des Signals wurde als Fläche unter der Kurve bestimmt. Vor jeder Analyse wurde
durch Aufgabe fünf wässriger Nitritstandards mit aufsteigenden Nitritkonzentrationen eine
Kontrolle der Anlage durchgeführt. Hierbei diente sowohl die Signalstärke als auch die
Steigung
der
Korrelationsgeraden
der
Standards
als
Qualitätskontrolle.
Die
Endkonzentrationen wurden errechnet aus der Fläche unter der Kurve dividiert durch die
Steigung der Standards. Zur Messung von Plasmanitritproben, bei denen Endkonzentrationen
im nanomolaren Bereich zu erwarten sind, wurden zur Eichung Standards von 0, 50, 100, 150
und 200 nM aufgegeben. Pro Probe wurde immer eine Dreifachmessung durchgeführt, als
Endergebnis diente der Mittelwert. Für die Inkubationsversuche wurden ausschließlich
Reagenzien verwendet, welche am selben Tag unter saubersten Bedingungen hergestellt
wurden. Sämtliche verwendete Reagenzien wurden bei jedem Versuch auf eine mögliche
Nitritverunreinigung getestet.
47
Abb. 4.2: Schematische Darstellung der reduktiven Chemilumineszenzdetektion.
0nM
50nM
100nM 150nM
200nM
Abb.4.3: Beispielchromatogramm: Aufgabe wässriger Nitritstandards als Kontrolle der Anlage
für die reduktive Chemilumineszenzdetektion; je Standard wurde eine Dreifachmessung
durchgeführt.
48
Bestimmung
4.3.15
des
Plasmanitratgehaltes
mittels
Nitrat-
Reduktase-Flussinjektionsanalyse 157;158
Im ersten Schritt wurde Nitrat mittels Nitratreduktase (NR) zu Nitrit reduziert. Hierfür wurden
die zu untersuchenden Proben mit Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH),
gelöst in Aqua ad injectabilia, sowie einer weiteren Lösung bestehend aus NR, Glucose-6Phosphat (G6P) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) gelöst in Aqua ad
injectabilia und TRIS-HCl versetzt und bei 25°C für 1 Stunde inkubiert. Das in der Probe
vorhandene Nitrat wurde so durch die NR unter Verbrauch von NADPH zu Nitrit reduziert.
NADP+, welches durch den Verbrauch aus der Reaktion entstanden war, wurde durch die
G6PDH zu NADPH reduziert und so permanent dem Gleichgewicht der NR-Reaktion
entzogen. So wurde eine vollständige Umwandlung des Nitrates zu Nitrit gewährleistet. Im
zweiten Schritt wurde das so zu Nitrit überführte Nitrat basierend auf der Griess-Reaktion
photometrisch quantifiziert. Nitratmessungen fanden ausschließlich am Plasmaultrafiltrat statt.
Die Ultrafiltration des Plasmas wurde durch Zentrifugation in Ultrafiltrationsröhrchen
(Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) erreicht. Das ultrafiltrierte Plasma wurde bis zur
Durchführung der Messung bei -80°C gelagert.
Reaktion von Nitrat
durch die NR
NR
NO3-
NADPH
Griess-Reaktion
NO2-
Sulfanilamid
NADP+
+
N≡N ~ Sulfanilamid
G6PD
6-Phosphogluconolacton
Naphtylendiamin
G6P
Naphtylendiamin
Abb.4.4: Nitratreduktase- und Griess-Reaktion.
~ N=N ~ Sulfanilamid
λ=540
49
4.3.16
Messung der erythrozytären Verformbarkeit mit der
modifizierten Filtrationsmethode
Reid et al.159 entwickelten 1976 eine einfache Methode zur ex vivo Bestimmung der
erythrozytären Verformbarkeit: bei einem Unterdruck von 1,96kPa, erzeugt durch einen
Peleusball, wurden die Erythrozyten durch einen dem Kapillardurchmesser entsprechenden
Filter gesaugt und die Flußrate (ml/min) bestimmt. Die modifizierte Filtrationsmethode von
Kumara et al. 2005160 stellt eine Weiterentwicklung der von Reid et al. etablierten
Filtrationsmethode dar: bei einem Unterdruck von 0,98kPa (~10cm Wassersäule) wurden
reine Erythrozyten bei einem Hämatokrit von 35% in Puffer durch einen Filter mit der
Porengröße von 5µm gesaugt, die Flußrate bzw. Passagezeit (ml/min) diente als Maß der
erythrozytären Verformbarkeit. Der Unterdruck im Vakuumsystem wurde mit Hilfe einer
elektrischen Vakuumpumpe erreicht, während ein Vakuumreservoir Druckschwankungen
verminderte. Als Manometer diente eine sich in einer Glaskapillare befindliche Wassersäule,
die auf 10cm geeicht war. Drei an das Vakuumsystem angeschlossene Filtratreservoirgefäße
mit aufgestecktem Filterhalter und Membranfiltern von 5µm ermöglichten eine schnell
hintereinander ablaufende Dreifachmessung. Vorab wurden die Erythrozyten durch
Zentrifugation (20min, 800g, 4°C) in speziellen Erythozyten-Abtropfgefäßen von der restlichen
Zellfraktion getrennt und mit Phosphatpufferlösung auf einen Hämatokrit von 35% eingestellt.
Die Flußrate (ml/min) wurde mittels Zeitschaltuhr dreimal für je 1ml Erythrozytengemisch
bestimmt und als Endergebnis diente der Mittelwert.
50
Probenapplikation
Filter (5 µm
Porengroße)
Tap
Abfall-Tap
Zeitschaltuhr
Wassersäule
(10 cm)
Luftreservoir
Vakuum Pumpe
Abb.4.5: Schematische Darstellung der modifizierten Filtrationsmethode.
4.3.17
Messung der erythrozytären Aggregation mit dem MyrenneAggregometer
Die
erythrozytäre
Aggregation
wurde
vollautomatisch
mittels
eines
Erythrozyten-
Aggregometers der Firma Myrenne GmbH gemessen (Erythrozyten Aggregometer MA1). 30
µl
der
Probe
wurden
in
die
Messkammer
des
Gerätes
appliziert
und
mittels
Infrarotbestrahlung die Lichtdurchlässigkeit bestimmt. Die Meßkammer bestand aus einem
rotatorischen Platte-Kegel-System (Kegelwinkel: 2), dazwischen befand sich die Probe,
welche je nach Aggregationszustand eine unterschiedliche Durchlässigkeit für das
Infrarotlicht aufwies. Die Proben wurden sowohl im M-Mode nach einem Schergrad von 600/s
als auch im M1-Mode nach einem Schergrad von 3/s während 10s vermessen. Das Ergebnis
wurde im digitalen Display als mittleres Ausmaß der Aggregation durch die Rechnereinheit
des Gerätes bestimmt. Pro Probe fand eine Dreifachmessung statt, als Endergebnis galt der
Mittelwert.
51
4.3.18
Hämolysekontrolle mittels photometrischer Bestimmung der
Plasmahämoglobinkonzentration
Da Erythrozyten intrazellulär hohe Nitritkonzentrationen besitzen, ist es für die Detektion der
plasmatischen Nitritkonzentration besonders wichtig, eine Hämolyse der Erythrozyten und die
damit verbundene Nitritverunreinigung zu vermeiden. Als Maß der Hämolyse diente die
plasmatische Hämoglobinkonzentration. Mit einem Beckmann Photometer wurde bei einer
Wellenlänge von 415nm die Absorption des Hämoglobins in Plasma bestimmt und dann
mittels des Extinktionskoeffizienten (έ415=131000lmol-1cm-1) die Konzentration berechnet.
Y Axis
0,4
Absorbance (AU)
0,0
X=415 Area=0,196937561
-0,4
320
400
480
560
X Axis
Abb. 4.6: Beispiel einer photometrischen Messung der Hämoglobinkonzentration bei
λ=415nm
52
4.3.19
Kontrolle des pH-Werts in Vollblut
Der pH-Wert der Inkubationsansätze, bestehend aus Vollblut und dem jeweiligen Agens
wurde vor und nach der Inkubation mittels pH-Meter (WTW pH522) gemessen. Die
Validierung des Gerätes wurde vor jeder Probenbestimmung mit Eichlösungen der pH-Werte
7 und 9 (Puffer 7,00, Puffer 9,00 Riedel-de Haën) durchgeführt.
4.3.20
Statistik
Die statistische Auswertung erfolgte unter Anwendung des Programm SPSS® 12.0 für
Windows (Chicago Ill., USA). Mit dem Test nach Shapiro-Wilk wurden die Daten auf
Normalverteilung geprüft. Zur Überprüfung signifikanter Unterschiede zwischen zwei
verschiedenen Gruppen von normalverteilten Daten wurde der t-Test angewendet. Der
Wilcoxon-Test wurde zur Überprüfung signifikanter Unterschiede der Ergebnisse der
erythrozytären Verformbarkeit durchgeführt, hierbei handelte es sich um verbundene, nicht
normalverteilte Daten. Eine Einwege-ANOVA mit anschließendem Mittelwertvergleich nach
Bonferoni diente zur Überprüfung der statistischen Signifikanz bei Ergebnissen mit mehr als
zwei Gruppen. Als statistisch signifikant galt eine Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von kleiner
oder gleich 0,05. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte (MW) mit Standardfehler (SE),
Stückzahl (n) und Signifikanz (p) oder als Pearson-Korrelation dargestellt. Zur graphischen
Darstellung diente das Programm MicroCal Origin® (Version 7.0 MicroCal Software Inc.,
North Hampton, MA, USA).
53
5
Ergebnisse
5.1
Aktivierung einer erythrozytären NOS durch Rosuvastatin in
humanen Vollblutproben
Vor Durchführung des Tierversuches wurde in Vollblutproben von humanen Probanden die
Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre NOS-Aktivität ex vivo untersucht.
5.1.1
Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin
Frisch entnommenes Vollblut von neun gesunden Probanden wurde mit L-Valin und L-Arginin
versetzt und dann mit verschiedenen Konzentrationen von Rosuvastatin für 30min bei 37°C
inkubiert und anschließend die Plasmanitritkonzentration bestimmt. Nach Inkubation mit
20ng/ml Rosuvastatin war die höchste Plasmanitritkonzentration von im Mittel 68,8±8,0nM
(n=9) im Vegleich zur Kontrolle (51,7±6,3nM, n=9) messbar. Der Anstieg nach Inkubation mit
10ng/ml und 30ng/ml Rosuvastatin erreichte Werte von 61,0±11,4nM (10ng/ml, n=9) und
62,3±8,2nM (30ng/ml, n=9). Nach Inkubation mit 40ng/ml Rosuvastatin war im Mittel kein
Anstieg messbar (53,7±6,4nM, n=9) (Abb. 5.1 A). Die Unterschiede waren nicht signifikant
(Einwege-ANOVA). Von neun Vollblutproben von verschiedenen Probanden zeigten n=5 die
höchste Nitritkonzentration bei 20ng/ml Rosuvastatin, während n=2 einen höheren Wert bei
30ng/ml erreichten und jeweils ein Proband bei 10ng/ml und 40 ng/ml die höchste
plasmatische Nitritkonzentration erreichte (Abb. 5.1 B).
54
A
B
80
100
n=9
70
90
n=9
p<0,05
n=9
n=9
80
60
n=8
n=9
70
60
40
Nitrit (nM)
Nitrit (nM)
50
30
n=9
50
40
30
20
20
10
10
0
0
10ng/ml
Kontrolle
20ng/ml
30ng/ml
40ng/ml
Kontrolle
höchste Stimulation
10ng:
20ng:
30ng:
40ng:
Rosuvastatin
n=1
n=5
n=2
n=1
Abb. 5.1: Vollblutinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Rosuvastatin (A);
Darstellung
der
höchsten
NO-Produktion
bei
verschiedenen
Konzentrationen
von
Rosuvastatin im Vergleich zur Kontrolle (B).
5.1.2
Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation
mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin
Vollblut von fünf gesunden Probanden wurde unter Arginaseinhibition und Überschuss an LArginin für 30min bei 37°C mit Rosuvastatin (20ng/ml), mit Rosuvastatin und dem NOSInhibitor L-NMMA oder nur mit L-NMMA inkubiert. Nach gleichzeitiger Inkubation mit L-NMMA
und Rosuvastatin kam es zu einem signifikanten Abfall der Plasmanitritkonzentration auf
46,6±4,0nM (n=5, p<0,05), im Vergleich zur Inkubation mit Rosuvastatin allein, welche im
Mittel Werte von 64,3±4,5nM (n=5) erreichte. Nach Inkubation mit L-NMMA allein wurden
ebenfalls erniedrigte Werte von im Mittel 43,9±2,0nM erreicht (n=3, p<0,05, siehe Abb. 5.2).
55
90
p<0,05
80
p<0,05
70
n=5
Nitrit (nM)
60
50
n=5
n=3
40
30
20
10
0
Rosuvastatin
L-NMMA
L-NMMA
+Rosuvastatin
Abb. 5.2: Nitritkonzentrationen nach Inkubation von humanem Vollblut mit Rosuvastatin,
Rosuvastatin und L-NMMA und L-NMMA.
5.1.3
Quantitative Bestimmung der eNOS-Phosphorylierung nach
Inkubation mit Rosuvastatin
Im immunzytochemischen Nachweis wurde die Phosphorylierung der erythrozytären NOS an
Ser1177 nach Inkubation mit Rosuvastatin (20ng/ml) untersucht. Vollblut von vier gesunden
Probanden wurde direkt nach der Blutabnahme durch Zentrifugation in seine zellulären und
plasmatische Bestandteile zerlegt. Reine Erythrozyten resuspendiert in zellfreiem Plasma
wurden unter Arginaseinhibition und Substratüberschuss für 30min bei 37°C entweder mit
oder ohne Rosuvastatin (20ng/ml) inkubiert. Anschließend wurden die Erythrozyten als
Ausstriche
fixiert
und
immunzytochemisch
untersucht
(siehe
Abb.
5.3
B).
Nach
densitometrischer Auswertung wurde ein signifikanter Anstieg der Phospho-eNOS auf
24,9±3,0 a.u. (n=4, p<0,05) gemessen, während die Kontrolle nur bei 3,6±4,3 a.u. (n=4) lag
(siehe Abb. 5.3 A).
56
A
B
35
30
n=4
p<0,05
arbitrary units (a.u.)
25
20
15
10
5
Kontrolle
Rosuvastatin
n=4
0
Kontrolle
Abb.
5.3:
Anstieg
Rosuvastatin
der
Phospho-eNOS
nach
Inkubation
mit
Rosuvastatin
(A).
Immunzytochemische Detektion im Erythrozytenausstrich (B).
5.1.4
Gleichzeitige
Messung
der
plasmatischen
Nitrit-
und
Nitratkonzentration, sowie der erythrozytären Aggregation
und Verformbarkeit nach Inkubation mit Rosuvastatin
Vollblutproben von acht gesunden Probanden wurde mit Arginaseinhibitor L-Valin und NOSSubstrat L-Arginin versetzt und anschließend mit Rosuvastatin (20ng/ml) oder als Kontrolle
für 30min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Plasmanitrit und –nitratkonzentrationen,
sowie die erythrozytäre Verformbarkeit und Aggregation bestimmt. Nach Inkubation mit
Rosuvastatin kam es zu einem signifikanten Anstieg sowohl der Plasmanitritkonzentrationen
als auch der erythrozytären Verformbarkeit und Aggregation. Die Plasmanitritkonzentrationen
nach Inkubation mit Rosuvastatin (20ng/ml) erreichten im Mittel einen Wert von 98,2±12,4nM
(n=8, p<0,05), während die Kontrollen mit 55,8±7,9nM (n=8) signifikant niedriger lagen (Abb.
57
5.4 A). Die erythrozytäre Verformbarkeit nach Inkubation mit Rosuvastatin lag im Mittel
signifikant höher (2,63±0,31ml/min, n=8, p<0,05) als die der Kontrollen (1,96±0,34ml/min,
n=8, Abb. 5.4 B). Die Plasmanitritkonzentration nach Inkubation mit Rosuvastatin korrelierte
positiv mit der erythrozytären Verformbarkeit, aber nicht bei der Kontrollinkubation
(Rosuvastatininkubation:
R=0,76,
p<0,05;
Kontrollinkubation:
R=0,41),
beide
Korrelationsgeraden zeigen einen ähnlichen Verlauf (Rosuvastatininkubation: A=0,78 und
B=0,019; Kontrollinkubation: A=0,98 und B=0,018; Abb. 5.4 C). Die erythrozytäre Aggregation
zeigte nach Inkubation mit Rosuvastatin sowohl im M-Mode als auch im M1-Mode im Mittel
einen signifikant höheren Wert als nach Kontrollinkubation (Kontrollinkubation: M-Mode
4,89±0,98[Index], n=7; M1-Mode 8,76±0,79[Index], n=7; Rosuvastatininkubation: M-Mode
6,66±1,54[Index], n=7, p<0,05; M1-Mode 10,25±0,99 [Index], n=7, p<0,05; Abb. 5.4 D). Die
Nitritkonzentration
korrelierte
nicht
mit
der
erythrozytären
Aggregation.
Plasmanitratkonzentrationen waren im Mittel nicht bedeutend unterschiedlich.
Die
58
A
B
3,5
120
n=8
p<0,05
100
3,0
n=8
p<0,05
2,5
60
Flußrate (ml/min)
Nitrit(nM)
80
n=8
40
n=8
2,0
1,5
1,0
20
0,5
0
0,0
Kontrolle
Rosuvastatin
Kontrolle
C
Rosuvastatin
D
M1-Mode
n=7 p<0,05
4,0
12
M-Mode
n=7, p<0,05
3,5
10
Flußrate (ml/min)
2,5
2,0
1,5
Rosuvastatin(S): R =0,76
Kontrollen( ) R =0,41
1,0
erythrozytäre Aggregation (Index)
3,0
8
6
4
2
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
Nitrit(nM)
120
140
160
Kontrolle
Rosuvastatin
Abb. 5.4: Anstieg der Plasmanitritkonzentration (A) und der erythrozytären Verformbarkeit (B)
nach Inkubation mit Rosuvastatin. Korrelation der Plasmanitritkonzentration mit der
erythrozytären Verformbarkeit (C). Anstieg der erythrozytären Aggregation im M-Mode und im
M1-Mode(D).
59
5.2
Etablierung einer caninen Vollblutinkubation als Assay für die
Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch
5.2.1
Basale Aktivität der caninen erythrozytären NOS während
30minütiger Inkubation mit und ohne Arginaseinhibition durch
L-Valin
Zur Untersuchung der basalen Aktivität der erythrozytären NOS in Abhängigkeit von der
Arginaseaktivität wurde Blut von drei gesunden Hunden mit oder ohne Arginaseinhibitor LValin (30mM) über einen Zeitraum von 30min bei 37°C inkubiert und alle 5min ein Aliquot zur
Bestimmung der Nitritkonzentration entnommen. Die erreichten Nitritkonzentrationen nach
Arginaseinhibition waren nicht bedeutend unterschiedlich von den Kontrollansätzen. Sowohl
zum Zeitpunkt 0 als auch bei den weiteren Messungen lagen die Nitritkonzentrationen basal
durchschnittlich um 25,3±5,8nM und unter Arginaseinhibition durchschnittlich um 26,6±5,5nM
(siehe Abb. 5.5).
50
MW+SE, n=3
Inkubation mit PBS
MW+SE, n=3
Inkubation mit L-Valin
40
Nitrit(nM)
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Zeit(min)
Abb. 5.5: Inkubationsverlauf mit PBS (□) und Inkubationsverlauf unter Arginaseinhibition (■).
60
5.2.3
Bestimmung
der
verschiedenen
Nitritbildung
nach
Inkubation
L-Argininkonzentrationen
mit
und
mit
ohne
Arginaseinhibition durch L-Valin
Humanes Vollblut wurde mit verschiedenen Konzentrationen L-Arginin mit und ohne
Arginaseinhibition mittels L-Valin für 30 min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert und
anschließend die plasmatischen Nitritkonzentrationen bestimmt. Nach Inkubation von
humanem
Vollblut
mit
L-Arginin
bei
einer
Konzentration
von
3mM
waren
Nitritkonzentrationen von 44,4±6,7 nM (n=8) messbar. Die Nitritkonzentrationen nach
Inkubation mit 300µM lagen bei 62,7± 15,7 nM (n=5) und nach Inkubation mit 30µM bei
41,7±5,3 nM (n=3). Die Inkubation mit dem Arginaseinhibitor L-Valin (30mM) allein erreichte
einen Wert von 40,9 ±4,6 nM (n=6), während durch eine Inkubation mit L-Arginin in einer
Konzentration von 300µM unter gleichzeitiger Arginaseinhibition durch L-Valin eine
Nitritkonzentration von 67,2±9,8 nM (n=7) erreicht wurde (siehe Abb. 5.6).
80
p<0,05
70
n=7
n=5
60
50
Nitrit(nM)
n=8
n=3
40
n=6
30
20
10
0
L-Arginin
3mM
L-Arginin
300µM
L-Arginin
300µM
L-Valin
30mM
L-Arginin
30µM
L-Valin
30mM
Abb.5.6: Wirkung von verschiedenen Konzentrationen an L-Arginin mit und ohne
Arginaseinhibition auf die Nitritbildung durch die erythrozytäre NOS.
61
5.2.4
Bestimmung
der
Nitritbildung
nach
Inkubation
mit
verschiedenen NOS-Inhibitoren
Die NOS-Inhibitoren N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin (L-NIO), NG, NG-Dimethyl-L-Arginin (ADMA),
S-Ethyl-N-{4-(Trifluoromethyl)Phenyl}Isothiourea (ETU), NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA)
wurden auf ihre inhibitorische Wirkung untersucht. Nach 30minütiger Inkubation von
humanem Vollblut bei 37°C mit L-NIO (100µM) und L-NMMA (300µM) wurden erniedrigte
Plasmanitritkonzentrationen (L-NIO: 46,2±12,2nM, n=7; L-NMMA: 38,7±4,0nM, n=4), im
Vergleich zur Kontrollinkubation (60,2±4,3 nM, n=7) gemessen. Eine Inkubation mit ADMA
(50µM) bewirkte keine deutliche Senkung der Plasmanitritkonzentration (ADMA: 59,2±5,0 nM,
n=4). Eine Inkubation mit ETU bewirkte einen Anstieg der Nitritkonzentration (ETU: 77,7±14,4
nM, n=4, Abb. 5.7 A). Die Inkubation mit denselben NOS-Inhibitoren zeigte an caninem
Vollblut folgendes Ergebnis: der niedrigste Wert wurde nach Inkubation mit ADMA erreicht
(41,7±4,7 nM, n=3) während L-NMMA den höchsten Wert (87,4±17,3 nM, n=3) im Vergleich
zur Kontrolle (89,0±14,3, n=3) lieferte. Inkubationen mit L-NIO und ETU zeigten ebenfalls eine
Senkung der Nitritkonzentration (L-NIO: 61,1±4,2 nM, n=3; ETU: 70,2±25,8 nM, n=3, Abb. 5.7
B).
A
B
90
100
90
n=4
80
n=7
n=7
n=4
40
Nitrit(nM)
Nitrit (nM)
n=3
70
n=4
60
50
n=3
80
70
60
n=3
n=3
50
n=3
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Kontrolle L-NIO
100µM
ADMA
ETU
L-NMMA
50µM
100µM
300µM
Kontrolle L-NIO
100µM
ADMA
ETU
L-NMMA
50µM
100µM
300µM
62
Abb. 5.7: Vergleich der Wirkung verschiedener NOS-Inhibitoren auf die erythrozytäre NOSAktivität in humanem Vollblut (A) und caninem Vollblut (B).
5.2.5
Bestimmung
der
Nitritbildung
nach
Inkubation
mit
verschiedenen eNOS-Stimulantien
Vergleichend wurden die Nitritkonzentrationen nach Inkubation mit L-Arginin, L-Arginin +
Insulin und L-Arginin + Kalzium untersucht. Nach Inkubation von humanem Vollblut waren
Nitritkonzentrationen nach Zugabe von Insulin von 81,1±10,0nM (n=9) und nach Zugabe von
Kalzium von 78,7±12,6nM (n=9) messbar, während die durch L-Arginin provozierte
Nitritkonzentration bei 67,1±11,2nM (n=9, Abb. 5.8 A) lag. Nach Inkubation von caninem
Vollblut mit L-Arginin lagen die Nitritkonzentrationen bei 54,1±21,7nM (n=5), nach Inkubation
mit zusätzlich Insulin bei 53,6±11,5nM (n=6) und nach Inkubation mit zusätzlich Kalzium bei
59,4±19,6nM (n=6, Abb. 5.8 B).
A
B
90
70
n=9
80
n=9
n=6
60
70
n=9
n=5
n=6
L-Arginin
Insulin
50
40
50
Nitrit (nM)
Nitrit (nM)
60
40
30
30
20
20
10
10
0
0
L-Arginin
Insulin
Kalzium
Kalzium
Abb. 5.8: Vergleich der Wirkung verschiedener NOS-Stimulantien auf die erythrozytäre NOSAktivität von humanem Vollblut(A) und caninem Vollblut(B).
63
5.3
Tierversuch: Bestimmung der Aktivität der erythrozytären
NOS nach Verabreichung von Rosuvastatin
5.3.1
Gleichzeitige
Messung
der
plasmatischen
Nitrit-
und
Nitratkonzentration, sowie der erythrozytären Aggregation
und Verformbarkeit vor und nach Verabreichung von
Rosuvastatin
Sechs gesunden Hunden wurde Rosuvastatin per os in einer Dosierung von 3mg/kg
Körpergewicht verabreicht. Vor Arzneimittelapplikation und 24h danach wurden die
Plasmanitrit-
und
–nitratkonzentration
sowie
die
erythrozytäre
Aggregation
und
Verformbarkeit bestimmt. Nach Verabreichung von Rosuvastatin kam es zu erhöhten Werten
der Plasmanitritkonzentration, der erythrozytären Verformbarkeit und Aggregation. Die
Plasmanitritkonzentrationen nach Verabreichung von Rosuvastatin erreichten im Mittel einen
Wert von 58,3±6,5nM (n=6, p<0,05), während die Kontrollmessungen bei 37,0±3,5nM (n=6)
lagen (Abb. 5.9 A). Die erythrozytäre Verformbarkeit nach Verabreichung von Rosuvastatin
lag im Mittel bei 3,3±0,1ml/min (n=6), während die Kontrollmessungen bei 2,9±0,2ml/min
(n=6, Abb. 5.9 B) lagen. Die Plasmanitritkonzentration und die erythrozytäre Verformbarkeit
nach Verabreichung von Rosuvastatin zeigten keine Korrelation. Die erythrozytäre
Aggregation zeigte nach Verabreichung von Rosuvastatin sowohl im M-Mode als auch im M1Mode
einen
Anstieg
(Kontrollmessung:
M-Mode
3,5±0,9[Index],
n=6;
M1-Mode
12,5±0,4[Index], n=6; Rosuvastatin: M-Mode 4,9±0,9[Index], n=6, p=0,05; M1-Mode 14,1±0,7
[Index], n=6, Abb. 5.9 C). Die Nitritkonzentration nach Verabreichung von Rosuvastatin
korrelierte nicht mit der erythrozytären Aggregation. Die Plasmanitratkonzentration war im
Mittel nicht bedeutend unterschiedlich.
64
A
B
70
4,0
n=6
p<0,05
60
3,5
3,0
50
n=6
p=0,10
n=6
Nitrit (nM)
Flußrate (ml/min)
2,5
40
n=6
30
2,0
1,5
20
1,0
10
0,5
0
basal
C
24h nach Rosuvastatin
0,0
basal
24h nach Rosuvastatin
M1-Mode
n=6
16
M-Mode
n=6, p=0,05
14
Erythrozytäre Aggregation (Index)
12
10
8
6
4
2
0
basal
24h nach R osuvastatin
Abb. 5.9: Anstieg der Plasmanitritkonzentration (A) und der erythrozytären Verformbarkeit (B)
nach Verabreichung von Rosuvastatin. Anstieg der erythrozytären Aggregation im M-Mode
und im M1-Mode nach Verabreichung von Rosuvastatin (C).
65
5.3.2
Bestimmung der Plasmanitritkonzentration vor und nach
Verabreichung von Rosuvastatin mittels Inkubationsprotokoll
in caninen Vollblutproben
Canines Vollblut wurde mit dem NOS-Substrat L-Arginin, dem NOS-Inhibitor ADMA sowie in
einem Kontrollansatz mit PBS für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert und
anschließend die Plasmanitrit- und -nitratkonzentration, sowie die erythrozytäre Aggregation
und
Verformbarkeit
Arzneimittelapplikation
Verabreichung
von
bestimmt.
Die
und
danach
24h
Rosuvastatin
Vollblutinkubationen
wurden
durchgeführt.
Werte
von
Im
wurden
ebenfalls
vor
Inkubationsversuch
vor
25,1±1,9nM
(n=6)
in
der
Kontrollinkubation, 33,4±3,0nM (n=6) nach Inkubation mit L-Arginin und 24,3±3,2nM (n=6)
nach Inkubation mit ADMA erreicht. Nach Verabreichung von Rosuvastatin wurden Werte von
34,0±6,3 nM (n=6) in der Kontrollinkubation, 31,3±6,1nM (n=6) nach Inkubation mit L-Arginin
und
25,1±3,8nM
(n=6)
nach
Inkubation
mit
ADMA
erreicht
(Abb.
5.3.2).
Die
Plasmanitratkonzentration, sowie die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit der
Inkubationsproben waren im Mittel nicht signifikant unterschiedlich.
45
basal
40
24h nach Rosuvastatin
35
Nitrit(nM)
30
25
20
15
10
5
0
Kontrolle
L-Arginin
Inkubationswerte, n=6
ADMA
*
66
Abb. 5.3.2: Plasmanitritkonzentration vor und nach Verabreichung von Rosuvastatin nach
Vollblutinkubation mit L-Arginin, ADMA und PBS als Kontrolle.
5.4
Hämoglobingehalt
Ein erhöhter plasmatischer Hämoglobingehalt ist ein Anzeichen für eine Hämolyse. Um eine
Nitritverunreinigung aus dem erythrozytären Intrazellularraum zu vermeiden, wurden
sämtliche
zur
Nitrit-
und
Nitratmessung
bestimmten
Plasmaproben
auf
ihren
Hämoglobingehalt untersucht. Bei sämtlichen Untersuchungen führte weder die Blutabnahme
noch
die
Inkubation
zu
bedeutenden
Veränderungen
der
plasmatischen
Hämoglobinkonzentration. Die Messungen dienten ausschließlich der Qualitätssicherung der
Nitrit- und Nitratmessung und sind deshalb nicht aufgeführt.
5.5
pH-Wert
Um physiologische Stoffwechsevorgänge in Erythrozyten widerzuspiegeln, wurde in der
vorliegenden Arbeit versucht während der Inkubationsversuche so nah wie möglich an diese
heranzukommen. Neben einem direkt nach der Blutabnahme beginneneden Versuchsablauf,
sowie einer ständigen Temperaturkontrolle und Vermeidung von längerer Stase der
Inkubationsproben, wurde ebenfalls vermieden durch die zugeführten Agenzien den
physiologschen pH von 7,4 des Blutes zu ändern. Bei sämtlichen Untersuchungen führte
weder die Inkubation noch die Zugabe der verwendeten Agenzien zum Vollblut zu messbaren
Veränderungen des pH-Wertes. Die Untersuchungen dienten lediglich der Qualitätssicherung
des Inkubationsversuches und sind deshalb nicht aufgeführt.
67
6
Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre NOS
und auf die erythrozytäre Verformbarkeit und Aggregation als mögliche rheologische
Folgeerscheinungen
untersucht. Es wurden
sowohl ex-vivo-Inkubationsversuche mit
humanem Vollblut als auch ein in-vivo-Versuch an ausgewachsenen gesunden Hündinnen
durchgeführt. Für die Quantifizierung der Aktivität der erythrozytären NOS in vivo wurde ein
Inkubationsassay erstellt. Im Folgenden werden die wesentlichen Ergebnisse dieser Arbeit,
sowie die Erstellung und Anwendung des Inkubationsassays diskutiert. Die wesentlichen
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind:
Ex-vivo-Versuche an humanen Erythrozyten:
1. Rosuvastatin aktiviert die erythrozytäre NOS und führt zu einer gesteigerten NOProduktion und eNOS-Phosphorylierung an Serin1177. Unter Verwendung des NOSInhibitor L-NMMA ist durch Rosuvastatin kein Anstieg der NO-Produktion durch die
erythrozytäre NOS nachweisbar.
2. Rosuvastatin steigert die erythrozytäre Verformbarkeit. Die durch Rosuvastatin
provozierte NO-Produktion der erythrozytären NOS korreliert positiv mit den Werten
der erythrozytären Verformbarkeit.
3. Rosuvastatin steigert die erythrozytäre Aggregation.
Untersuchungen nach Verabreichung von Rosuvastatin beim Hund:
1. Rosuvastatin steigert das plasmatische Nitrit, einen ubiquitären Marker der Aktivität
endothelialer NO-Synthasen. Die Quantifizierung der Aktivität der erythrozytären NOS
mittels Inkubationsassay lieferte kein eindeutiges Ergebnis.
2. Rosuvastatin steigert die erythrozytäre Verformbarkeit.
3. Rosuvastatin steigert die erythrozytäre Aggregation.
68
6.1
Aktivierung der erythrozytären NOS durch Rosuvastatin
Das kontinuierlich aus endothelialen NO-Synthasen freigesetzte NO hat eine direkte Funktion
in der Aufrechterhaltung der vaskulären Homöostase. Es bewirkt eine Gefäßdilatation und
senkt somit den Blutdruck und Gefäßtonus161;162. NO moduliert im vaskulären System
verschiedene Funktionen in der luminalen und abluminalen Gefäßwand. Es senkt den
Gefäßtonus in den Leitungsarterien vom muskulären Typ und in den präkapillären
Widerstandsgefäßen und über diesen Mechanismus den Blutdruck. NO wirkt am
Gefäßsystem anti-arteriosklerotisch, indem es Mitogenese und Proliferation der vaskulären
glatten Muskelzellen und die Zelladhäsion von Monozyten, neutrophilen Granulozyten und
Thrombozyten an die Gefäßwand hemmt und die Lipidoxidation reduziert1;2. Erst kürzlich
konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch Erythrozyten eine NO-Synthase
besitzen11;12, welche in physiologisch relevanten Mengen NO produziert und somit einen nicht
unerheblichen Beitrag zur NO-Bioverfügbarkeit leistet10. In Untersuchungen der eigenen
Arbeitsgruppe am Modell der eNOS-Knock-Out-Maus konnte die erythrozytäre NOS als
endotheliale
Isoform
charakterisiert
werden10.
Statine,
wie
Rosuvastatin
sind
cholesterinsenkende Pharmaka, welche in der Lage sind, direkt endotheliale NO-Synthasen
zu aktivieren8;9. In der vorliegenden Arbeit wurde vergleichend die Wirkung verschiedener
Rosuvastatinkonzentrationen auf die erythrozytäre NOS untersucht. Die deutlichste Wirkung
auf die NO-Bildung war durch eine Rosuvastatinkonzentration von 20ng/ml auslösbar, die
Varianzanalyse war jedoch nicht signifikant. Einige Probanden zeigten vor allem auf höhere
und ein Proband sogar auf eine niedrigere Konzentration von Rosuvastatin noch eine
Steigerung der NO-Bildung. Die untersuchten Probanden wurden zufällig ausgesucht, es
wurde darauf geachtet, dass keine der Erkrankungen mit einem erhöhten kardiovaskulären
Risiko, wie Diabetes mellitus, Bluthochdruck oder eine erblich bedingte Hypercholesterinämie
vorlag und keine weiteren Medikamente eingenommen worden waren (Ausnahme:
Konzeptivum). Auf andere Einflußfaktoren wie eine vorherige Nahrungsaufnahme, sportliche
Betätigung, Tageszeit oder Hormonstatus von weiblichen Probanden wurde jedoch keine
Rücksicht genommen. Da Insulin, Scherstress sowie Östrogen163;164 die Aktivität der eNOS
69
beeinflussen,
könnte
dies
möglicherweise
die
Ursache
der
hohen
Varianz
der
Ansprechbarkeit der Probanden auf verschiedene Rosuvastatinkonzentrationen sein. In
weiteren Untersuchungen wurde ausschließlich eine Rosuvastatinkonzentration von 20ng/ml
verwendet. Nach Inkubation mit 20ng/ml Rosuvastatin konnte eine gesteigerte NO-Produktion
durch Erythrozyten nachgewiesen werden, welche nach Zugabe des NOS-Inhibitor L-NMMA
stagnierte. Bekannterweise stabilisieren Statine die eNOS mRNA und steigern somit als
Langzeiteffekt posttranskriptional die eNOS Expression147. Verursacht wird dies durch einen
Mangel an Zwischenprodukten der Cholersterinbiosynthese wie Farnesylpyrophosphat (FPP)
oder Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP). FPP und GGPP spielen eine wichtige Rolle in der
posttranslationalen Modifikation einer Vielzahl von Signalproteinen150. In der vorliegenden
Arbeit wurde ausschließlich die akute Wirkung des Statins auf die erythrozytäre NOS
untersucht, zudem sind im zellkernlosen Erythrozyten posttranskriptionale Veränderungen,
wenn überhaupt nur in den Retikulozyten möglich. Diese sind bei gesunden Probanden nur
zu einem vernachlässigbar minimalen Anteil vorhanden. Eine akute eNOS-Aktivierung der
Statine hingegen erfolgt in der Endothelzelle mittels Phosphorylierung durch die
Serine/Threonine Kinase Akt (Synonym: Proteinkinase B) an Serin1177
153
, ein solcher
Regulationsmechanismus wäre auch für die erythrozytäre NOS denkbar. Erst kürzlich konnte
gezeigt werden, dass die erythrozytäre NOS nach Inkubation mit Insulin sowohl eine erhöhte
NO-Produktion als auch eine gesteigerte Phosphorylierung an Serin1177 aufweist, welche mit
einem Phosphatidyl-Inositol-3.Kinase-Inhibitor hemmbar ist10. Im immunzytochemischen
Nachweis konnte in der vorliegenden Arbeit ebenfalls eine signifikante Steigerung der eNOSPhosphorylierung an Serin1177 der Erythrozyten nach Inkubation mit 20ng/ml Rosuvastatin
nachgewiesen werden.
70
6.2
Erstellung und Anwendung eines Inkubationsassay zur
Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS im
Tierversuch
Der größte Anteil des intravaskulär gebildeten NO wird durch die Reaktion mit erythrozytärem
Hämoglobin zu Nitrat umgewandelt64;66. Die Konzentration des Nitrates im Blut wird jedoch in
großem Maße von NO-Stoffwechsel-unabhängigen Faktoren beeinflusst, wie der Aufnahme
durch die Nahrung, dem Metabolismus durch den Harnstoffzyklus89, der Absorption durch den
Verdauungstrakt90 und der Inhalation aus der Luft91. Ein Teil des gebildeten NO entgeht
jedoch der Umsetzung zu Nitrat und ist als Nitrit im Plasma zu finden. Zur besseren
Beurteilung des NO-Metabolismus wurde daher Nitrit als Marker für die akute NOS-Aktivität
gewählt. Es wurde gezeigt, dass dieser oxidative Metabolit durch Stimulation bzw. Inhibition
in der Unterarmzirkulation des Menschen einen Marker für die eNOS-Aktivität darstellt,
während im Nitrat kein signifikanter Unterschied messbar ist95. In der vorliegenden Arbeit
waren deutliche Unterschiede ebenfalls ausschließlich im plasmatischen Nitrit messbar,
während im plasmatischen Nitrat im Mittel keine deutlichen Unterschiede nachweisbar waren.
Plasmatisches Nitrit dient als Marker der eNOS-Aktivität, aber es lässt keine Differenzierung
im Hinblick auf den zellspezifischen Ursprung des NO zu. Neben der Endothelzelle konnte
mittlerweile auch in diversen anderen Zellarten eine eNOS-Expression nachgewiesen
werden18. In Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurde vergleichend die NO-Produktion
und Substratumsetzung der erythrozytären NOS und der eNOS in kultivierten Endothelzellen
untersucht. Hierbei zeigte die eNOS der Endothelzelle eine mehr als doppelt so hohe
Syntheserate pro mg Protein im Vergleich zur NOS in Erythrozyten10. Die Quantifizierbarkeit
der Aktivität der erythrozytären NOS mittels des plasmatischen Nitrit in vivo stellt somit ein
Problem dar. Im Inkubationsversuch ex vivo mit humanem Vollblut konnte durch Zugabe von
L-Arginin eine gesteigerte NOS-Aktivität provoziert werden, welche durch Zugabe eines NOS
Inhibitors inhibierbar war10;11. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser Inkubationsversuch mit
anschließender Messung der NO-Produktion an humanem und caninem Vollblut untersucht.
71
Dies diente dem Ziel, einen Inkubationsassay zu entwickeln und als Methode anzuwenden,
der eine Aussage über die Aktivität der erythrozytären NOS in vivo ermöglicht. Änderungen
der Ansprechbarkeit auf das Substrat L-Arginin, einen Inhibitor oder eine Stimulans sollten als
Maß der Aktivität der erythrozytären NOS dienen. Im folgenden Abschnitt erfolgt eine kurze
Abhandlung über die Erstellung und Anwendung dieses Inkubationsassay.
Die plasmatische L-Argininkonzentration liegt unter physiologischen Bedingungen im
zirkulierenden Blut bei ~0,1-0,2 mM. Das L-Arginin dient zum größten Teil der Arginase als
Substrat. Hierbei handelt es sich um ein Enzym des Harnstoffzyklus welches mit einer
Michaelis-Menten-Konstante von 1-3mM erheblich zum Abbau des plasmatischen L-Arginin
beiträgt40;49. Die Arginase I kommt sowohl frei im Plasma165, als auch intrazellulär in
Erythrozyten vor166;167. Bei einer konstanten Grundaktivität der Arginase ist mit einer stetigen
Abnahme des plasmatischen und intrazellulären L-Arginin während der Vollblutinkubation zu
rechnen. Dies könnte einen Substratentzug der erythrozytären NOS mit einer stagnierenden
Aktivität zur Folge haben. In der vorliegenden Arbeit wurde die basale Aktivität der caninen
erythrozytären NOS während eines zeitlichen Verlaufes von 30min mit und ohne
Arginaseinhibition untersucht. Sowohl im Kontrollansatz, als auch unter Arginaseinhibition
konnte kein deutlicher Unterschied in der Nitritbildung durch die erythrozyäre NOS
nachgewiesen werden. Die erythrozytäre NOS des Hundes scheint somit eine konstante
basale Aktivität zu besitzen, die möglicherweise wenig von der Aktivität der Arginase
beeinflusst wird.
Durch extrazellulär zugeführtes L-Arginin ist eine gesteigerte NO-Poduktion der eNOS der
Endothelzelle provozierbar42;43. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnte gezeigt
werden, dass die NO-Produktion der Erythrozyten durch extrazelluläres L-Arginin zunimmt10.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine Stimulation der erythrozytären NOS durch
verschiedene Konzentrationen an L-Arginin untersucht. Gleichzeitig wurde überprüft, ob eine
Arginaseinhibition zusätzlich einen steigernden Effekt auf die Nitritbildung der erythrozytären
NOS unter L-Arginin stimulierten Bedingungen haben würde. Die Inkubation mit 0,3 mM LArginin bewirkte den höchsten Nitritanstieg im Vergleich zu Inkubationen mit höheren oder
72
niedrigeren Konzentrationen an L-Arginin. Der Anstieg zeigte nach gleichzeitiger Inhibition der
Arginase noch eine zusätzliche ansteigende Tendenz. Eine L-Argininkonzentration von
0,3mM liegt nahe der Maximalkonzentration von L-Arginin in Plasma, die unter
physiologischen Bedingungen bei 0,095-0,25mM liegt40;168. Zudem entsprechen 0,3mM der
Konzentration, welche über das y+ und y+L-System40 in den Erythroztyen innerhalb einer
Stunde maximal aufgenommen werden kann169;170.
Eine Aktivierung der erythrozytären NOS durch das Hormon Insulin10;119;121 oder durch einen
Kalziumanstieg konnte in diversen Studien nachgewiesen werden10;11;119. Bislang ist jedoch
noch nicht eindeutig geklärt, ob die erythrozytäre NOS ausschließlich über einen
kalziumabhängigen Weg19;20 aktiviert wird, oder ob wie bei der eNOS der Endothelzelle auch
eine kalziumunabhängige Aktivierung möglich ist. Sowohl eine kalziumabhängige Aktivierung
der erythrozytären NOS10;11;119 als auch eine Aktivierung durch Phosphorylierung ist
beschrieben worden10. In der vorliegenden Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die
Aktivierung der erythrozytären NOS durch Rosuvastatin mittels Phosphorylierung stattfindet.
Eine Aktivierung durch Phosphorylierung kann auch kalziumunabhängig verlaufen50.In der
vorliegenden Arbeit wurde im direkten Vergleich untersucht, ob die durch L-Arginin
ausgelöste vermehrte NO-Produktion durch Insulin und Ca2+-Ionophore noch steigerbar ist.
Die humane erythrozytäre NOS war sowohl durch Insulin, als auch durch Kalzium in der NOProduktion steigerbar. Bei Erythrozyten vom Hund war nur mit Kalzium noch ein minimaler
Anstieg der NO-Produktion provozierbar. Vermutlich entsprach die durch L-Arginin ausgelöste
NO-Produktion der maximalen Syntheseleistung und deshalb war durch Ca2+-Ionophore nur
noch eine minimale Steigerung provozierbar. Bei dem verwendeten Insulin handelte es sich
um
humanes
Insulin
ohne
Depoteffekt.
Möglicherweise
ist
aufgrund
von
Speziesunterschieden mit humanem Insulin beim Hund keine Stimulation der erythrozytären
NOS auslösbar. Weiterhin wurde für das Vollblutinkubationsprotokoll ein NOS-Inhibitor
benötigt, der möglichst effektiv und reproduzierbar eine Hemmung der NO-Synthese der
caninen erythrozytären NOS bewirkte. ADMA hatte sich in der vorliegenden Arbeit unter den
getesteten Inhibitoren als stärkster Inhibitor der caninen erythrozytären NOS bewiesen. Für
das Inkubationsprotokoll wurde somit ADMA als Inhibitor ausgesucht. Für die Stimulation
73
wurde L-Arginin verwendet. Zum Ausschluss eines möglichen Einflusses der Arginase wurde
allen Inkubationsansätzen der Arginaseinhibitor L-Valin hinzu gegeben.
Inkubationsprotokoll canin
L-Valin
Kontrolle
L-Valin
L-Valin
L-Arginin
ADMA
Stimulans
Inhibitor
37°C
30 min
Abb. 6.1: Schematische Darstellung des verwendeten Protokolls für die Vollblutinkubation zur
Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS im in-vivo-Versuch
Sechs Hunde wurden in der vorliegenden Arbeit mittels des Inkubationsassays vor und nach
Verabreichung von Rosuvastatin untersucht. Nur im Kontrollansatz zeigte sich ein Anstieg der
Nitritkonzentration nach Verabreichung von Rosuvastatin, die beiden anderen Werte blieben
unverändert.
Erstaunlicherweise
war
der
Kontrollwert
des
Inkubationsassays
nach
Verabreichung von Rosuvastatin sogar noch minimal höher, als die L-Arginin-Inkubation.
Während die L-Argininaufnahmekapazität der Erythrozyten über das y+ und y+L-System bis
zu einer bestimmten Konzentration (Vmax) limitiert ist
169;170
, ist über eine L-Arginin-
Neusynthese der Argininosuccinatsynthase in Erythrozyten nur wenig bekannt. In der
Endothelzelle findet ein Recycling von L-Arginin durch die Argininosuccinatsynthase mit einer
gemessenen Bildungsrate von ~0,7-1,9 nmol L-Arginin *106 *Zellen-1*Stunde-1 statt40. Ob in
Erythrozyten ein Recycling von L-Arginin über die Argininosuccinatsynthethase möglich ist, ist
74
nicht bekannt. Vielleicht ist die durch extrazelluläres L-Arginin maximal provozierbare Aktivität
der erythrozytären NOS nur bis zu einem gewissen Wert in Abhängigkeit des
Transportsystems steigerbar, während ihre Aktivität bei minimaler Bereitstellung an
plasmatischen L-Arginin vom L-Arginin-Recyclingweg abhängig sein könnte. Ob und wenn
wieviel L-Arginin über den Recyclingweg im Erythrozyten bereitgestellt werden kann, ist nicht
bekannt.
6.3
Wirkung
des
Rosuvastatin
auf
die
erythrozytäre
Verformbarkeit
Unter erythrozytärer Verformbarkeit versteht man die Fähigkeit der Erythrozyten zur
Verformung bei der Passage durch eine Kapillare, welche den ungestörten Blutfluss im
Bereich der Mikrozirkulation ermöglicht96;111. An Diabetes mellitus
erkrankte
Personen
zeigen
eine
herabgesetzte
171
erythrozytäre
und Bluthochdruck172
Verformbarkeit.
Die
erythrozytäre Verformbarkeit wird u.a. durch die Membraneigenschaften der Erythrozyten
bestimmt. Hierzu gehört neben den viskoelastischen Eigenschaften der Strukturproteine des
Zytoskelettes
auch
die
Membranfluidität
der
Phospholipiddoppelschicht111.
Unter
Membranfluidität versteht man den Grad der Beweglichkeit der Fettsäurenseitenketten der
Phospholipiddoppelschicht.
Diese
wird
maßgeblich
von
der
Lipidzusammensetzung,
insbesondere dem Gehalt an Cholesterin und der Lipidperoxidation beeinflusst173;174. Bei an
Diabetes mellitus erkrankten Personen konnte eine erniedrigte erythrozytäre Verformbarkeit,
vergesellschaftet mit Veränderungen der Lipidzusammensetzung und der Membranfluidität
nachgewiesen werden. Modifikationen in der Lipidzusammensetzung der Plasmamembran
der Erythrozyten finden sich insbesondere im Cholesterin/Phospholipid-Verhältnis
171
. Da die
Plasmalipide in einem dynamischen Gleichgewicht mit den Membranlipiden der Blutzellen
stehen,
könnten
Veränderungen
der
Plasmalipide
einen
Lipidzusammensetzung der Plasmamembran der Erythrozyten haben
Einfluss
175;176
auf
die
. Statine sind
cholesterinsenkende Pharmaka, deren Wirkung auf die erythrozytäre Verformbarkeit in
75
diversen Studien untersucht wurde. So konnte durch eine cholesterinsenkende Therapie bei
hypercholesterinämischen Patienten mittels Lovastatin eine signifikante Verbesserung der
erythrozytären
Verformbarkeit
erreicht
werden100;177,
die
mit
einer
Abnahme
des
Cholesteringehalts der Erythrozytenmembran verbunden war176. Auch für Simvastatin und
Pravastatin konnte eine positive Wirkung auf die erythrozytäre Verformbarkeit nachgewiesen
werden, welche von einer Abnahme des Plasma LDL begleitet wurde178-180. Weiterhin konnte
nach LDL-Apherese bei Patienten, die an einer familiären Hypercholesterinämie litten,
ebenfalls eine Verbesserung der erythrozytären Verformbarkeit bewirkt werden181. Im
Rahmen der vorliegenden Arbeit war durch den Einsatz von Rosuvastatin ebenfalls eine
Verbesserung der erythrozytären Verformbarkeit nachgewiesen worden. Im Gegensatz zu
den oben beschriebenen Studien, welche die Auswirkungen einer über mehrere Monate
andauernden Statintherapie auf die erythrozytäre Verformbarkeit untersuchten100;178;179,
wurde in der vorliegenden Arbeit die akute Wirkung des Statins auf die erythrozytäre
Verformbarkeit untersucht. In der vorliegenden Studie wurden keine Plasma-LDL-Spiegel
bestimmt, jedoch sind Veränderungen innerhalb der gleichen Vollblutprobe, versetzt mit
Rosuvastatin nach einer Inkubation von 30 min auszuschließen. Weiterhin ist nach einem
Zeitraum von 24h nach Statineinnahme noch nicht mit deutlichen Veränderungen der
Plasmalipiddoppelschicht der Erythrozyten zu rechnen. Eine mögliche Erklärung der akuten
Änderung der erythrozytären Verformbarkeit könnte eine erhöhte NO-Bioverfügbarkeit,
verursacht durch eine gesteigerte Aktivität der erythrozytären NOS, sein. In diversen Studien
konnte gezeigt werden, dass NO die erythrozytäre Verformbarkeit positiv beeinflusst 108;115-117,
der genaue Mechanismus ist jedoch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit korrelierten die
Nitritwerte positiv mit den Werten der erythrozytären Verformbarkeit im RosuvastatinInkubationsversuch. In vivo konnte eine gesteigerte NO-Produktion nach Verabreichung von
Rosuvastatin
mittels
der
plasmatischen
Nitritkonzentration
nachgewiesen
werden.
95
Plasmatisches Nitrit ist ein Marker der Aktivität der eNOS , das gebildete NO kann also
sowohl aus der Endothelzelle als auch aus dem Erythrozyten stammen. In der vorliegenden
Arbeit konnte in vivo ebenfalls eine gesteigerte erythrozytäre Verformbarkeit nach
Verabreichung von Rosuvastatin nachgewiesen werden. Die erythrozytäre Verformbarkeit
76
zeigte zwar die gleiche Tendenz wie der Nitritanstieg aber keine Korrelation. Möglicherweise
könnte die NO-Bildung der Erythrozyten selbst der wichtigere Regulationsfaktor der
erythrozytären Verformbarkeit sein.
6.4
Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Aggregation
Eine erhöhte erythrozytäre Aggregation wird als Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen
diskutiert. So konnte gezeigt werden, dass die erythrozytäre Aggregation bei Erkrankungen,
die mit einer endothelialen Dysfunktion einhergehen, wie Bluthochdruck106, Diabetes
mellitus105 oder einer instabilen Angina pectoris107, erhöht ist, während durch Hinzugabe von
NO eine verminderte erythrozytäre Aggregation auslösbar ist108. In der vorliegenden Arbeit
war durch Rosuvastatin eine gesteigerte NO-Produktion durch die erythrozytäre NOS
nachgewiesen worden. Folglich war anzunehmen, dass durch Rosuvastatin ein Abfall der
erythrozytären Aggregation auslösbar sei. Erstaunlicherweise war in der vorliegenden Arbeit
durch Rosuvastatin eine gesteigerte erythrozytäre Aggregation nachgewiesen worden.
Die
erythrozytäre
Aggregation
entsteht
durch
Interzellularbrücken
der
großen
Plasmaproteine99, welche bei Scherraten von unter 25 sec-1 eine Aneinanderlagerung der
Erythrozyten in der sogenannten „Rouleaux-Formation“ vermitteln99;101. Lipide mit hohem
Molekulargewicht wie LDL und VLDL haben ebenfalls derartige vernetzende Eigenschaften.
In diversen Studien konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz von Statinen ein Abfall
der erythrozytären Aggregation auslösbar ist. Als Grund wurde eine Abnahme der PlasmaLDL und -VLDL angegeben100;102;103. Trotz der senkenden Wirkung auf das Plasma-LDL und VLDL, konnte nicht für alle Statine ein positiver Effekt auf die erythrozytäre Aggregation
beschrieben werden. So konnte nach Verabreichung von Lovastatin und Simvastatin eine
Verminderung der Aggregationsneigung beschrieben werden100;177;178, während nach
Verabreichung von Fluvastatin ein deutlicher Anstieg zu vermerken war182. Die im Rahmen
dieser Studie ermittelten Werte der erythrozytären Aggregation zeigten sowohl nach
30minütiger Inkubation mit Rosuvastatin als Reinsubstanz als auch 24h nach einer
einmaligen oralen Verabreichung des Statins einen Anstieg. Dieses Ergebnis schließt jedoch
nicht aus, dass Rosuvastatin nach Langzeittherapie ebenfalls einen Abfall der Aggregation
77
aufgrund gesenkter Plasma-LDL-Werte bewirken kann. Im Fall von Fluvastatin war der
Anstieg der erythrozytären Aggregation mit einem deutlichen Anstieg der PlasmaFibrinogenspiegel vergesellschaftet182. Erhöhte Plasma-Fibrinogenspiegel korrelieren mit
einer erhöhten erythrozytären Aggregation101. In der vorliegenden Studie wurden keine
Plasma-Fibrinogenspiegel bestimmt, jedoch sind Veränderungen innerhalb der gleichen
Vollblutprobe, versetzt mit Rosuvastatin nach einer Inkubation von 30min auszuschließen.
Weiterhin ist nach einem Zeitraum von 24h nach Statineinnahme noch nicht mit
Veränderungen der Fibrinogenspiegel zu rechnen. Die klinische Relevanz der gezeigten
Steigerung der erythrozytären Aggregation nach Verabreichung von Fluvastatin182 bleibt
jedoch insgesamt fragwürdig, da im Gegensatz dazu in einer in-vivo-Studie mittels
Intravitalmikroskopie eine durch Fluvastatin verbesserte Mikrozirkulation nachgewiesen
werden konnte183. In einer Studie zu Atorvastatin konnten ebenfalls erniedrigte Werte der
erythrozytären Aggregation gemessen werden, während Fibrinogen interessanterweise eine
steigende Tendenz zeigte184. Die Ergebnisse zu Atorvastatin sind jedoch insgesamt sehr
widersprüchlich, so konnte sowohl eine Verminderung184, keine Veränderung185 und sogar ein
Anstieg der erythrozytären Aggregation nach Änderung des Wirkstoffes von Simvastatin
(40mg/Tag) auf Atorvastatin (40mg/Tag) nachgewiesen werden. Erklärt wurde dieses
Phänomen durch einen Abfall der Plasma-HDL-Werte nach Statintherapie mit Atorvastatin.
So führte der Wechsel zu einem Anstieg der erythrozytären Aggregation, welcher mit einem
unter Atorvastatin-Therapie geringeren HDL-Spiegel negativ korrelierte186. Eine negative
Korrelation zwischen der erythrozytären Aggregation und der HDL-Cholesterinkonzentration
war schon früher beschrieben worden103;187. HDL-Cholesterin besitzt antiatherosklerotische
Eigenschaften.
Es
konnte
gezeigt
werden,
dass
die
Aktivierung
der
eNOS
konzentrationsabhängig mit ansteigenden HDL-Konzentrationen zunimmt. Die Stimulation der
eNOS durch HDL erfolgt über den in den Caveolae lokalisierten Scavenger-Rezeptor BI (SR
BI)188. Bekannterweise vermindert NO die erythrozytäre Aggregation108;109, was die
Vermutung zulässt, dass es sich hier um einen NO-vermittelten Mechanismus handelt.
Widersprüchlich demgegenüber zeigt sich das Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit. So
konnte sowohl eine Aktivierung der erythrozytären NOS als auch eine gesteigerte
78
erythrozytäre Aggregation nach 30minütiger Inkubation und 24h nach oraler Applikation mit
Rosuvastatin nachgewiesen werden. Beide Parameter korrelierten sowohl nach Inkubation
als auch nach oraler Applikation nicht. Zwei miteinander konkurrierende Mechanismen
könnten hierfür eine Erklärung liefern. Neben der vorliegenden Arbeit war in diversen anderen
Studien eine eNOS-Aktivierung durch Rosuvastatin gezeigt worden189;190. Eine akute
Beinträchtigung der rheologischen Eigenschaften191 mit einer gesteigerten erythrozytären
Aggregation192 konnte ebenfalls nach Verabreichung von Aspirin nachgewiesen werden.
Diese
wurden
ursächlich
auf
eine
Acetylierung
bestimmter
Integralproteine
der
Erythrozytenmembran mit nachfolgender herabgesetzter Membranfluidität zurückgeführt193.
Für Rosuvastatin liegen in Bezug auf die erythrozytäre Aggregation keine weiteren
Publikationen vor. Ob ein solcher oder ähnlicher Mechanismus auch für das im Gegensatz zu
den anderen Statinen hydrophile Rosuvastatin8 in Frage kommt bleibt somit ungeklärt.
79
5 Zusammenfassung
Aktivierung der erythrozytären NO-Synthase durch Rosuvastatin
-Barbara Ludolph (2007)Das von endothelialen NO-Synthasen (eNOS) gebildete Stickstoffmonoxid (NO) ist ein
wichtiger Botenstoff im kardiovaskulären System. NO reguliert unter anderem Gefäßtonus,
Gefäßwachstum, Adhäsion von Blutzellen, die Blutgerinnung und wirkt anti-arteriosklerotisch.
Neue Untersuchungen konnten zusätzlich zum Endothel eine endotheliale NO-Synthase im
Erythrozyten
nachweisen.
HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren
(oder
Statine)
sind
cholesterinsenkende Pharmaka, welche endotheliale NO-Synthasen aktivieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors
Rosuvastatin auf die erythrozytäre NO-Synthase, sowie auf die erythrozytäre Aggregation
und Verformbarkeit als NO-vermittelte Folgeerscheinungen untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass Rosuvastatin als Kurzzeiteffekt sowohl eine gesteigerte NOProduktion, als auch eine gesteigerte eNOS-Phosphorylierung an Serin1177 in humanen
Erythrozyten bewirkt. Unter gleichzeitiger Verwendung des spezifischen NOS-Inhibitor NGMonomethyl-L-Arginin und Rosuvastatin blieb eine Steigerung der NO-Bildung aus.
Gleichzeitig bewirkt Rosuvastatin eine akute Steigerung der erythrozytären Verformbarkeit
humaner Erythrozyten. Die erythrozytäre Verformbarkeit korreliert positiv mit der durch
Rosuvastatin provozierten NO-Produktion. Erstaunlicherweise kommt es, anstelle einer
erwarteten NO-vermittelten Senkung der erythrozytären Aggregation, zu einem Anstieg.
80
24h nach oraler Aufnahme von gesunden ausgewachsenen Hündinnen bewirkt Rosuvastatin
ebenfalls sowohl eine gesteigerte erythrozytäre Aggregation als auch Verformbarkeit. Ein
entwickelter Inkubationsassay lieferte kein eindeutiges Ergebnis über die Aktivität der
erythrozytären NOS.
In dieser Arbeit konnte erstmals die pharmakologische Wirkung eines Statins auf die
erythrozytäre NO-Synthase nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass
Rosuvastatin die Erythrozytenfunktion akut beeinflusst.
81
8
Summary
Activation of the erythrocytes NO-synthase by rosuvastatin
-Barbara Ludolph (2007)-
Nitric oxide (NO) formed by endothelial NO-Synthases (eNOS) is an important signalling
molecule of the vascular system. NO modulates vascular tone, endothelial cellgrowth,
bloodcell adhesion, fibrolysis and counteracts atherosclerosis. Recently it was shown that
beside endothelial cells red blood cells (RBCs) possess eNOS as well. Atheroprotective
effects of HMG-CoA reductase inhibitors (or statins), independent of their lipid-lowering
properties, had been demonstrated. One of these effects refers to their ability to activate
eNOS.
This present study tested the capacity of the HMG-CoA reductase inhibitor rosuvastatin to
activate RBC NOS and subsequently to modulate RBC aggregability and deformability.
Rosuvastatin acutely increased NO-production and eNOS-phosphorylation at serine1177 in
human erythrocytes. The specific NOS inhibitor NG-Monomethyl-L-arginine reversed the
stimulatory effect of rosuvastatin on NO-formation.
Furthermore rosuvastatin increased erythrocytes deformability acutely. NO-formation
correlated to RBC deformability after rosuvastatin treatment. Interestingly erythrocytes
aggregation increased in opposition to the presumptive result of an NO-modulated decrease.
In healthy adult bitch erythrocytes aggregation and deformability increased 24h after oral
rosuvastatin treatment. The whole blood incubation-assay showed no significant difference of
RBC NOS activity.
82
For the first time this study demonstrated the effect of a statin on RBC NOS. Furthermore it
was shown that rosuvastatin influences RBC function acutely.
83
9
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108
Danksagung
Zuallererst möchte ich Frau Priv. Doz. Dr. rer. nat. Manuela Gernert für die Übernahme der
externen Betreuung dieser Arbeit danken. Nur durch sie wurde die Erstellung dieser Arbeit
überhaupt erst ermöglicht.
Herrn Prof. Dr. med. Rainer Schulz und Herrn Prof. Dr. med. Malte Kelm danke ich für die
Überlassung des Themas und die Möglichkeit, selbständiges wissenschaftliches Arbeiten zu
erlernen. Des Weiteren danke ich Herrn Prof. Dr. med. Wilhelm Bloch für die gute
Kooperation
Viele weitere Personen haben dazu beigetragen, dass diese Dissertation möglich wurde.
Zuerst will ich meine Eltern erwähnen, die mir das Hochschulstudium überhaupt ermöglicht
haben, sowie meine Oma Frieda Ludolph, die immer an mich geglaubt hat. Weiterhin
bedanke ich mich ganz herzlich bei den Mitarbeitern des Kardiologichen Labor für die
freundliche Unterstützung und ständige Diskussionsbereitschaft bei der Planung und
Durchführung dieser Arbeit: Frau Dr. rer. nat. Petra Kleinbongard, Herrn Dr. med. Intan Fatah
Kumara, Frau Ulrike Hendgen-Cotta, Herrn Paris Brouzos, Frau Dr. rer. nat. Svetlana
Kabanova, Frau Dr. med. Puthrika Gharini, Frau Katharina Lysaja und Frau Anita Kossak.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. Intan Fatah Kumara für seine unermüdliche
Bereitschaft, auf Fragen einzugehen sowie Hilfestellungen jeder Art zu leisten. Darüber
hinaus bedanke ich mich bei Herrn Dr. rer. nat. Giuliano Dodoni und Frau Anita Van de Sand
für die freundliche Unterstützung bei der Durchführung der Hundestudie sowie bei Herrn Gerd
Spohr für das Korrekturlesen dieser Arbeit.
Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Freund Philipp Spohr, der mich durch die letzten
Jahre begleitet hat und mir in schwierigen Zeiten immer zur Seite stand. Ich möchte mich an
dieser Stelle für seine Liebe, moralische Unterstützung und die wunderbare Zeit, die wir
miteinander verbringen durften, von ganzem Herzen bedanken.
109
Posterpräsentation:
B. Ludolph, P. Kleinbongard, I. Kumara, K. Lysaja, M. Kelm, R. Schulz:
Rosuvastatin activates an erythrocyte eNOS: Effects on NO-formation and
erythrocyte deformability. Vascular Biology and Medicine, 2005, P94 (B2)