Kein Folientitel

Vorlesung Toxikologie für Chemiker
Teil 3
In vitro Systeme
für toxikologische
Untersuchungen
Jan G. Hengstler
Einsatzgebiete von in vitro Systemen
- Metabolisierende Systeme bei Mutagenitäts- und
Toxizitätstests
- Identifizierung der Metabolite neuer Substanzen
- Prüfung neuer Pharmaka auf metabolische Stabilität
- Prüfung auf Enzyminduktion
Fremdstoffmetabolismus
Cytochrom P450
Konjugation
• CYP1A2
• CYP2B6
• CYP2E1
• CYP2C9
• UDP-Glucuronosyltransferasen
• Glutathiontransferasen
• Sulfotransferasen
• N-Acetyltransferasen
• CYP2C19
• CYP2D6
• CYP3A4
• CYP3A5
Phase I
Phase II
• Nahrungsbestandteile
• Umweltgifte
• Arzneistoffe
Oxygenierte
Intermediate
DNA-Bindung
Oxidativer Stress
Mutationen
Krebs
Konjugierte
Produkte
Ausscheidung
Die häufigsten in vitro Systeme
S-9 Mix
Einsatz: besonders als metabolisierendes System bei Mutagenitätstests
Besonderheiten: - Vorbehandlung von Ratten mit Enzyminduktoren
(Arochlor 1254 oder β-Naphthoflavon
+ 3-Methylcholanthren)
- Zusatz von NADPH bzw. eines NADPH-generierenden
Systems (unbedingt erforderlich)
Vorteil: - einfach und billig; kann tiefgefroren aufbewahrt werden
- Mensch S-9 ist kommerziell erhältlich
Nachteil: - kein oder nur rudimentärer Phase II-Metabolismus
(Grund: Verdünnung der Kofaktoren)
- Aufhebung von Kompartimentierungseffekten
Präparation von S9, Mikrosomen und Cytosol
Leber
Homogenisieren
(z.B. in 0,25 M
Sacharose)
• • •
•
•••
•
Zentrifugation
bei 9.000 x g für 10 min
S9
Zentrifugation
des Überstands (S9)
bei 100.000 x g für 1 Stunde
• • •
•
•
•
•
• ••
•
Cytosol
Mikrosomen
• • •
•
•••
•
Homogenat
Einsatz: meist zur Quantifizierung von Enzymaktivitäten nach
vorausgegangener Behandlung (Enzyminduktionsstudien)
Vorteil: besonders einfach herzustellen; kann ohne wesentlichen Verlust
der Enzymaktivitäten schockgefroren werden
Nachteile: wie S-9
Microsomen und Cytosol
Einsatz: - Quantifizierung von Enzymaktivitäten
- metabolisierendes System zur Lokalisation einer bestimmten
Enzymaktivität
Besonderheit: je mg Protein haben Lebermikrosomen etwa 5-fach höhere
Cytochrom P450-Aktivitäten als Leberhomogenat
Nachteile: wie S-9
Zellen mit heterologer Expression einzelner Enzyme
Einsatz:
Untersuchung von Effekten, die dem Metabolismus durch ein
bestimmtes Enzym zuzuordnen sind
Vorteil:
- die Aktivität definierter Einzelenzyme kann erfaßt werden
- einfache Handhabbarkeit
- gute Reproduzierbarkeit
Nachteile: - die artifizielle Expression erlaubt nicht die Untersuchung
des physiologischen Zusammenspiels mehrerer Enzyme
- Expression von „Enzymbatterien“ zur Simulation der in vivo
Situation noch nicht möglich; aber: Polycistronische
Vektoren erlauben bereits die äquimolare Expression
von zwei Enzymen
Künstliche Mikrosomen (Baculosomen)
- Enthalten:
(a) menschliche CYP-Isoformen
(b) NADPH-P450 Reduktase (aus Kaninchen)
- Isoliert aus Insektenzellen nach Infektion mit rekombinanten Bakterien
Rekombinante, aufgereinigte CYP-Isoenzyme
- NADPH-P450 Reduktase und NADPH müssen zugesetzt werden
Einsatz:
Beurteilung des Metabolismus durch bestimmte individuelle
Enzymaktivitäten
Primäre Hepatozyten
Einsatz: I. In Suspension (Inkubation max. 4 h):
- Identifikation der Metabolite neuer Substanzen
- Bestimmung der metabolischen Stabilität
- Hepatotoxizität
- Metabolisches System bei Mutagenitätstests
II. In Kultur (7 Tage oder auch länger): Enzyminduktion
Vorteile: - In Suspension: sehr gute Korrelation des komplexen
Metabolisus mit der in vivo Situation (>90% der in vivo
Metabolite können erfaßt werden).
- In Kultur: Bis jetzt sind alle Substanzen, die im Menschen
in vivo eine Enzyminduktion verursachen auch in vitro positiv
Nachteile: - Eingeschränkte Verfügbarkeit bei menschlichen Hepatozyten
- nicht geeignet für die Identifikation der Aktivität einzelner
Enzyme, da meist die konzertierte Aktion vieler Enzyme erfaßt wird
Leberdünnschnitte (ca. 200 µm)
Einsatz:
ähnlich einsetzbar wie Hepatozyten
Vorteile:
relativ einfach zu gewinnen (vorteilhaft bei der
Gewinnung von Material aus der menschlichen Leber)
Nachteile: - Kryokonservierung problematisch
- Inkubation für maximal 24 h
Anwendungsbeispiel Nr. 1
Heterocyclische Amine am Beispiel von MeIQx
(2-Amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline)
• Vorkommen in gekochtem oder gebratenem
Fleisch
• Entstehung: Reaktion von Muskelkreatinin mit
Aminosäuren
• Kanzerogen in Ratten und Mäusen
(Kolon-spezifisches Kanzerogen)
• Nicht kanzerogen im Cynomolgus Affen
TA 98 Revertanten pro Platte
Ames Test mit S-9 Mix
MeIQx (0.5 mg/Platte)
1200
800
400
0
-------------------------------------------------------------Mensch
Ratte
(männlich)
Ratte
Cynomolgus
(weiblich)
Affe
NH2
N
H3C
N
N
CH3
MeIQx (2-Amino-3,8dimethylimidazo[4,5-f]
quinoxalin)
N
Cytochrom P450 1A2
NHOH
N
H3C
N
N
Hydroxylamin
CH3
N
N-Acetyltransferase 2
NHO
N
H3C
N
C
CH3
O
N
CH3
Reaktiver N-Acetoxyester
N
Spontaner Verlust von Acetat NH +
N
H3C
N
Nitreniumion
N
CH3
N
Kovalente Binding an DNA
Aktivierung heterocyclischer Amine am Beispiel
von MeIQx
Anwendungsbeispiel Nr. 2
Aflatoxin B1 (AFB1)
• Hepatokarzinogen; extreme Interspezies-Unterschiede
• Dosis zur Induktion von Tumoren in 50 % der Tiere
(2-Jahresstudien):
Männliche Fischer Ratten:
1,3 µg AFB1/kg/Tag
Männliche Wistar Ratten:
5,8 µgAFB1/kg/Tag
Männliche Mäuse (z.B. C58BL): >2000 µg AFB1/kg/Tag
Phase I Metabolismus von Aflatoxin B1
O
O
O
OH
O
OMe
O
O
2
O
O
H
3
O
AFM1
O
H
9
9a
8
O
OMe
OH
H
O
6a
O
H
OMe
AFB1
O
O
H
AFQ1
O
O
O
O
O
O
O
H
O
H
OMe
OMe
O
O
H
AFB1-endo-8,9-oxide
O
O
H
AFB1-exo-8,9-oxide
Schwesterchromatidaustausche durch AFB1 in
Lymphozyten
SCE / Zelle
25
Aflatoxin B1 (10 µM)
20
15
Mensch
10
Ohne
Mit
NADPH NADPH
SCE / Zelle
25
Aflatoxin B1 (1 µM)
20
15
Maus
10
Mit
Ohne
NADPH NADPH
Aflatoxin B1 (10 µM)
30
SCE / Zelle
25
20
15
Ratte
10
5
0
Ohne
Mit
NADPH NADPH
25
Aflatoxin B1 (10 µM)
SCE / Zelle
20
Mensch
15
10
M it
N A DP H
M it
u n d C y to s o l
NA D P H un d GS H
Mikrosomen
Ohne
NA DP H
M it N A D P H
und g ekoc hte m C y to s o l
und G SH
25
SCE / Zelle
Aflatoxin B1 (1 µM)
20
15
Maus
10
M it
Mikrosomen
NA DP H
Ohn e
M it
u n d C y to s o l
N A D P H N A D P H u n d G SH
30
M it N A D P H
u nd ge koc ht e m C y to s o l
u nd G SH
Aflatoxin B1 (10 µM)
SCE / Zelle
25
20
15
Ratte
10
5
0
M it
Mikrosomen
N A D PH
Ohn e
M it
u n d C y to s o l
N A D PH N A D PH u nd G SH
M i t N AD P H
un d gek oc hte m C y to s o l
un d GS H
(pmol/min/mg cytosolisches Protein)
Aflatoxin B1-Konjugation mit Glutathion
8000
6000
4000
2000
*
0
Maus
Hamster
Ratte
Mensch
Konjugation von mikrosomal generiertem Aflatoxin B1-8,9-epoxid
mit Glutathion durch Lebercytosol; Review: Hengstler, Steinberg,
Burg und Oesch, Drug Metabolism Reviews 31, 917-970, 1999;
*unter der Nachweisgrenze
Aflatoxin B1-DNA Addukte
(pmol/mg)
DNA-Addukte durch AFB1 in primären Hepatozyten
(Inkubation mit 200 nM AFB1 für 24 h)
200
50
*
0
No. 1
No. 2 No. 3
Mensch
Männlich Weiblich
Ratte
Maus
Review: Hengstler, Steinberg, Burg and Oesch, Drug
Metabolism Reviews 31, 917-970, 1999
*unter der Nachweisgrenze
Anwendungsbeispiel Nr. 3
Tamoxifen
• Nichtsteroidales Antiöstrogen zur Behandlung
von Brustkrebs
• Applikation von Tamoxifen an Ratten verursachte
hepatozelluläre Karzinome und Metaplasien (Präkanzerose) der
Uterusschleimhaut bei einer Dosis von 2 mg/kg täglich für 3
Monate
• Tamoxifen wurde dennoch bei Frauen mit Brustkrebs eingesetzt
mit einer Dosis von: 0,3 mg/kg/Tag für 5 Jahre
Ergebnis der Studien mit Tamoxifen (20 mg/Tag für
5 Jahre):
• Signifikante Reduktion der Inzidenz von Krebs an der
kontralateralen Brust; Reduktion von Brustkrebs um 49 % bei
Risikopatienten
• leichte Erhöhung des Risikos der selteneren
Endometriumkarzinome
• Kein Anstieg weiterer Tumorentitäten
• Insgesamt verbesserte Tamoxifen das Langzeitüberleben der
Patientinnen.
DNA-Addukte durch Tamoxifen
Tamoxifen
α-Hydroxytamoxifen
Generierung einer
Abgangsgruppe
nach Sulfatierung
DNAAddukte
Interspeziesunterschiede des Phase I-Metabolismus von Tamoxifen
Metabolit
Rangfolge der Bildung
α-Hydroxytamoxifen
4-Hydroxytamoxifen
Tamoxifen-N-oxid
N-Desmethyl-Tamoxifen
Maus = Ratte >>>> Mensch
Maus > Ratte >
Mensch
Maus >>> Ratte = Mensch
Maus > Ratte =
Mensch
DNA-Addukte / 108 Nukleotide
100
80
60
40
20
*
0
Maus
Ratte
Mensch
Induktion von DNA-Addukten in primären Hepatozyten
nach Inkubation mit 10 µM Tamoxifen; *unter der Nachweisgrenze von 4 Addukte/1010 Nukleotide
Review: Hengstler, Steinberg, Burg und Oesch, Drug
Metabolism Reviews 31, 917-970, 1999
Problem: scheinbarer Widerspruch zwischen der in vitro und in vivo Situation:
DNA-Addukte in Rattenhepatozyten nach Inkubation
mit Tamoxifen (10 µM) bzw. α-Hydroxytamoxifen
(1 µM) für 18 h
Sulfotransferase-Aktivität (Substrat:
Dehydroepiandrosteron) in Hepatozyten
von männlichen und weiblichen Ratten
0,4
300
Männlich
Weiblich
Sulfotransferase (nmol/min/mg)
DNA-Addukte / 108 Nukleotide
350
250
200
150
100
50
Männlich
Weiblich
0,3
0,2
0,1
0,0
0
Tamoxifen
α−Hydroxytamoxifen
2-Jahres Karzinogenitätsstudie mit Tamoxifen
in Wistar-Ratten (50 Tiere je Gruppe)
Hepatozelluläre Karzinome
mg Tamoxifen / kg / Tag (p.o.)
0
5
20
35
Männchen
1
8
34
34
Weibchen
0
6
37
37
0,4
Männchen
Weibchen
0,3
0,2
0,1
0,0
1
4
7
14
Tage unter Applikation von Tamoxifen
(0,12 mmol/kg/Tag)
Anstieg der DNA-Addukte unter
Tamoxifen-Behandlung
DNA-Addukte / 108 Nukleotide
Sulfotransferase (nmol/min/mg Protein)
Induktion der Sulfotransferase-Aktivität unter
Tamoxifen-Behandlung
500
Männchen
Weibchen
400
300
200
100
0
1
4
7
14
Tage unter Applikation von Tamoxifen
(0,12 mmol/kg/Tag)
Nach: Davis et al., Cancer Res. 60, 2887, 2000
Menschliche Hepatozyten in Kokultur mit einer epithelialen Zellinie
aus der Leber
Rattenhepatozyten in Kokultur mit einer epithelialen Zellinie
aus der Leber
In Alginat mikroverkapselte Hepatozyten