Julia Henzgen - Katalog der Deutschen Nationalbibliothek

Aus dem medizinischen Zentrum für operative Medizin
Klinik für Neurochirurgie
Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. C. Nimsky
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,
Standort Marburg
Expressionsunterschiede von Wif1 und Rab34 bei
Gliomen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Julia Henzgen
aus Berlin
Köln, Dezember 2009
Angenommen vom Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg am: 10.12.2009
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.
Dekan: Prof. Dr. med. B. Maisch
Referent: Prof. Dr. H. Bertalanffy
1. Korreferent: Prof. Dr. J. Rüschoff
Für meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung ........................................................................................................ 1
2. Summary....................................................................................................................... 3
3. Einleitung ..................................................................................................................... 5
3.1 Einführung in die Thematik und Fragestellung...................................................... 5
3.2 Literaturübersicht.................................................................................................... 7
3.2.1 Tumoren .......................................................................................................... 7
3.2.2 Tumoren des Nervensystems........................................................................... 8
3.2.3 Astrozytäre Tumoren (Gliome) ..................................................................... 10
3.2.4 Niedriggradiges Astrozytom (WHO-Grad II) ............................................... 11
3.2.5 Anaplastisches Astrozytom (WHO-Grad III)................................................ 14
3.2.6 Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV)................................................... 16
3.3 Genetische Aspekte von Wif1 und Rab34............................................................ 21
3.3.1 Das Onkogen Wif1 ............................................................................................ 21
3.3.1.1 Der Wnt-Pathway ....................................................................................... 21
3.3.1.2 Extrazelluläre Antagonisten des Wnt-Pathways ........................................ 22
3.3.1.3 Struktur von Wif1....................................................................................... 23
3.3.1.4 Expressionsverhalten von Wif1.................................................................. 25
3.3.2 Das Onkogen Rab34.......................................................................................... 29
3.3.2.1 Übersicht..................................................................................................... 29
3.3.2.2 Rab-Proteine ............................................................................................... 30
3.3.2.3 Struktur von Rab34/Ras-related protein ..................................................... 31
3.3.2.4 Rab39.......................................................................................................... 32
3.3.2.5 Rab34 und seine Interaktion mit dem Golgi-Apparat ................................ 33
3.3.2.6 Rab34 und RILP (Rab-interacting lysosomal protein) ............................... 35
3.3.2.7 LDR (low dose radiation)-Abhängigkeit von Rab34 ................................. 35
4. Material....................................................................................................................... 37
4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien ............................................................. 37
4.2 Geräte.................................................................................................................... 37
4.3 Kits ....................................................................................................................... 38
4.4 Primer ................................................................................................................... 39
4.5 Medien und Puffer ................................................................................................ 40
5. Methoden .................................................................................................................... 41
5.1 Probenpräparation für die PCR ............................................................................ 41
5.1.1 Materialgewinnung........................................................................................ 41
5.1.2 Probenpräparation/RNA-Isolierung anhand der „single step“ Methode ....... 42
5.1.3 Homogenisierung .......................................................................................... 42
5.1.4 Phasentrennung.............................................................................................. 43
5.1.5 RNA-Aufreinigung........................................................................................ 43
5.1.6 Messung der Optischen Dichte (OD-Messung) ............................................ 44
5.2 Die Standard-PCR ................................................................................................ 44
5.2.1 Probenvorbereitung für die PCR ................................................................... 46
5.2.2 Transkription der RNA in cDNA .................................................................. 47
5.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................ 47
5.2.4 DNA-Agarosegel zur elektrophoretischen DNA-Auftrennung..................... 48
5.3 Das Prinzip der Real-Time PCR........................................................................... 49
5.3.1 Etablierung der Standardkurve ...................................................................... 52
5.3.2 Etablierung und Auswertung der Schmelzkurve ........................................... 53
5.3.3 Auswertung der Standardkurve ..................................................................... 54
5.3.4 Messung der Proben ...................................................................................... 56
5.3.5 Auswertung der Proben ................................................................................. 57
5.4. Auswertung mittels U-Test/Mann-Whitney-U-Test............................................ 57
6. Ergebnisse................................................................................................................... 60
6.1 Ergebnisse der PCR .............................................................................................. 60
6.2 Ergebnisse der Real-Time-PCR............................................................................ 61
6.2.1 Ergebnisse für Wif1....................................................................................... 61
6.2.2 Ergebnisse für Rab34 .................................................................................... 62
6.3. Auswertung mittels U-Test/Mann-Whithney-Test.............................................. 64
7. Diskussion .................................................................................................................. 65
7.1. Einleitung ............................................................................................................ 65
7.1.1. Allgemeine Probleme der histologischen Einteilung ................................... 65
7.1.2. Allgemeine Probleme des Versuchsaufbaus ................................................ 68
7.1.3. Allgemeine Probleme der statistischen Auswertung .................................... 68
7.2. Diskussion für Wif1 ............................................................................................ 69
7.3. Diskussion für Rab34 .......................................................................................... 73
8. Literatur ...................................................................................................................... 79
9. Abkürzungen, Kurzzeichen ........................................................................................ 87
10. Tabellenanhang......................................................................................................... 91
Tabelle 10 ................................................................................................................... 91
Tabelle 11 ................................................................................................................... 93
Tabelle 13 ................................................................................................................... 96
11. Lebenslauf .............................................................................................................. 101
12. Verzeichnis der akademischen Lehrer.................................................................... 103
13. Danksagung ............................................................................................................ 104
14. Ehrenwörtliche Erklärung....................................................................................... 105
1. Zusammenfassung
Onkologische Reaktionswege, bei denen unter anderem die Wnt-Protein-Familie
und die Ras-Gene eine bedeutende Rolle spielen, stehen im Interesse der derzeitigen
medizinischen Forschung. Sowohl das Gen Wif1 als auch Rab34 könnten
möglicherweise auch als wichtige Schaltpunkte innerhalb der Gliomgenese dienen.
Wif1 ist ein extrazellulär lokalisierter Antagonist des Wnt und wirkt über eine
direkte Bindung an Wnt-Liganden. Über eine intrazelluläre Herunterregulation von
β-Catenin kommt es zu einer verminderten Ausbildung von Onkogenen. Im
Gegensatz dazu geht eine Abnahme von Wif1 mit einem Expressionsanstieg von
Wnt einher, so dass es über die β-Catenin-Kaskade zu einer gesteigerten
Transkriptionsaktivität kommt.
Rab34 gehört zu der Gruppe der Ras-Gene und ist in verschiedenste Stufen der
Endo- und Exozytose involviert. Die Rab-Proteine regulieren Transportwege durch
die Membran, indem sie als molekulare Schalter zwischen der aktiven und der
inaktiven Form agieren. Im aktiven Status erfüllen Rab-Proteine ihre Funktion bei
der
Vesikelformation
und
bei
der
Bewegung
von
Organellen
sowie
Membranspaltung/-fusionen durch die Rekrutierung von Effektor-Proteinen.
Basierend auf vorausgegangenen Microarray-Analysen, in denen ein signifikanter
Unterschied in der Gen-Expression von Rab34 und Wif1 in Astrozytomen Grad III
und Glioblastomen nachgewiesen werden konnte, wurde in der vorliegenden Arbeit
mittels semiquantitativer Real-Time-PCR das unterschiedliche Expressionsmuster
von Rab34 und Wif1 in Astrozytomen Grad II, Grad III, in Glioblastomen und
Glioblastom-Rezidiven untersucht. Die Patienten mit Glioblastom-Rezidiven waren
mit gleicher Radio-Chemo-Therapie einmalig vorbehandelt worden. Die Gesamtzahl
von 51 Tumorproben wurde mittels eines ABI™ Sequence Detection Systems ABI
PRISM® 7700 and Qiagen™ QuantiTect® SYBR® Green PCR Kits experimentell
untersucht. Die statistische Überprüfung erfolgte mittels U-Test.
Für das Gen Wif1 konnten signifikante Expressionsunterschiede im Vergleich
zwischen Astrozytomen Grad III und der Gruppe der Rezidive sowie zwischen
Glioblastomen und den Rezidiven festgestellt werden.
1
Beim Vergleich der Expressionsstärke von Rab34 zwischen den GlioblastomGruppen zeigte sich eine Verdoppelung der Werte vom Glioblastom verglichen mit
seinen
Rezidiven.
Im
U-Test/Mann-Whitney-Test
war
dieser
Expressionsunterschied statistisch signifikant.
Eine veränderte Aktivierung des Wnt-Reaktionsweges bzw. ein Ungleichgewicht der
Über- und Unterexpression von Wif1 scheint eine zentrale Rolle bei der
Tumorgenese von Astrozytomen zu spielen. Es scheint aber keine Korrelation
zwischen dem Malignitätsgrad des Tumors und der Expression von Wif1 zu geben.
In einigen Tumoren wie Blasen- oder Prostata-Karzinom korreliert die Wif1Expression mit dem Tumorgrad. In der vorliegenden Arbeit bestätigt sich dieser
Zusammenhang für Astrozytome nicht. Ein Expressionsanstieg kann sowohl eine
anti-apoptotische Aktivität als auch eine potenzierte Malignität bedeuten.
Für das zweite untersuchte Gen Rab34 konnte mit den vorliegenden Versuchen die
Vermutung einer Assoziation zwischen der Gen-Expression und dem Tumor-Grad
bestätigt werden. Aus den signifikanten Expressionsunterschieden zwischen
Glioblastomen und den mit Radio- und Chemo-Therapie behandelten Rezidiven
geht ferner hervor, dass hier möglicherweise ein sehr sensibler Schritt innerhalb des
Rab34-Pathways (Reaktionsweges) zugrunde liegt. Hier sei auf die zentrale Rolle
von Rab34 innerhalb des Organellen-Transportes im Axoplasma, auf Mikrotubulusabhängige Effekte und die Regulation der Antigen-Präsentation verwiesen.
2
2. Summary
Major oncologic pathways, such as the Wnt protein family and the Ras genes belong
to oncogenes that play a significant role in tumor genesis pathways. Wif1 and Rab34
have been implicated to be involved in glioma genesis.
Wif1 is a secreted antagonist of Wnt signalling and functions by direct binding to
Wnt ligands in the extracellular space. There is evidence that intracellular downregulation of β-catenin correlates with reduced expression of oncogenes. On the
other hand down-regulation of Wif1 results in a higher expression level of Wnt,
which causes higher transcription activity through the β-catenin pathway.
Rab34 belongs to the group of Ras genes and is involved in various steps along the
exocytic and endocytic pathways. By changing between the active and inactive
form, Rab-proteins are considered key regulatory factors for membrane traffic. This
biological activity causes vesicular formation, movement of organelles and
membrane traffic by recruitment of effector proteins.
Previous microarray analysis showed a significant incidence of different gene
expressions of Rab34 and Wif1 in astrocytomas of WHO-grade III and
glioblastomas. The current study analysed the incidence of Wif1 and Rab34
expression in a larger number of tissue samples from astrocytomas of WHO-grades
II, III, glioblastomas and first-time recurrent glioblastomas. Last-mentioned were
treated by radiation and chemo-therapy.
To study possible differences in their expression, semiquantitative two-step RT
Real-Time PCR examinations on a total of 51 tissue samples of astrocytomas WHOgrade II, III, glioblastomas and first-time recurrent glioblastomas were performed.
Analysis were conducted using the ABI™ Sequence Detection System ABI
PRISM® 7700 and Qiagen™ QuantiTect® SYBR® Green PCR Kits. According to
the histological grading the arithmetic mean was calculated and compared by using
the U-test.
There is an immense uptake of Wif1 in astrocytomas from grade II to grade III.
Strong reduction of Wif1 expression was present in glioblastomas compared to
astrocytomas grade III. The expression level of astrocytomas grade II was nearly
equivalent to the group of glioblastomas. Another up-regulation of Wif1-expression
3
was seen in recurrent compared to primary glioblastomas. By using the U-test, there
was a significant difference in expression level between astrocytomas grade III and
recurrent glioblastomas as well as recurrent compared to primary glioblastomas.
Rab34 showed the highest expression in astrocytomas grade III and displayed a
strong reduction compared to the benign astrocytomas grade II. Moreover, Rab34expression showed a down-regulation of astrocytomas grade III compared to
primary glioblastomas. Expression level of Rab34 in glioblastomas showed a double
increase from primary to recurrent glioblastomas. By using the U-test there was a
significant difference in expression levels between recurrent when compared to
primary glioblastomas.
Both pathways may be operative in early glioma tumor genesis. Aberrant activation
of the Wnt pathway indicates that loss of Wif1 expression may be an early event in
tumor genesis as demonstrated by other groups for higher tumor stages like urinary
bladder or prostate cancer. The data indicates that there is no correlation between
tumorgrade and expression level of Wif1, but this probably demonstrates tissuespecific or tumor-specific expression. There is evidence for anti-apoptotic activity
and potentiated malignity.
Overexpression of Rab GTPases is detected in various kinds of cancer. The
increasing expression of Rab34 in all glioma grades supports the previously
suggested role of tumor genesis for astrocytomas. There is significant correlation
between tumor stage and tumor-grade. Because of the uptake in expression level
between recurrent when compared to primary glioblastomas, the Rab34 pathway
might play an important role. On the basis of this result, membrane traffic in the
axoplasma, microtubules- or actin-based motor complexes and regulation within the
antigenic presentation may yield additional understanding.
4
3. Einleitung
3.1 Einführung in die Thematik und Fragestellung
Die Zellen eines jeden Lebewesens sind durch ein exakt geregeltes homöostatisches
Gleichgewicht
von
Proliferation
(Wachstum),
Differenzierung
(zelluläre
Spezialisierung) und Apoptose bzw. Nekrose (Zelltod) gekennzeichnet. Das
Wachstumsverhalten von Zellen und der genaue genetische Ablauf des Zellzyklus
(Zellteilung) werden durch definierte genetische Instruktionen gesteuert. Derartige
genetische Programme werden wesentlich durch extrazelluläre Signale beeinflusst,
die die Aktivität der Gene einer Zelle bestimmen (Schmoll et al. 2005).
Bei der Genese maligner Tumorerkrankungen spielen Imbalancen im fein
eingestellten
Gleichgewicht
intrazellulärer
Signaltransduktionsketten,
der
Regulationsmechanismen des Zellzyklus’ sowie der Zelldifferenzierung und anderer
wesentlicher Punkte im Stoffwechsel der Zelle eine wichtige Rolle (Böcker et al.
2001). Aufgrund von Schädigungen des DNA-Erbmaterials kommt es innerhalb der
Zellen zu einer fehlregulierten Genaktivität.
Jeder Mechanismus, der das Überleben DNA-geschädigter Zellen erhöht, z.B. durch
Verhinderung des apoptotischen Todes solcher Zellen, trägt zum karzinogenen
Prozess bei (Hanahan u. Weinberg 2000, Schmoll et al. 2005). Als Ursache jeder
Tumorerkrankung sind somit Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen und
Virusinfektionen, im Erbmaterial der primären Tumorzelle zu sehen.
Der
größte
Teil
tumorinduzierender
Mutationen
entsteht
in
Somazellen
(Körperzellen, die sich nur in Zellen gleichartigen Typs differenzieren können), es
spielen jedoch auch vererbte genetische Defekte im Genom von Keimzellen eine
wesentliche Rolle für die Tumorgefährdung eines Individuums. Ein extremes
Beispiel einer derartigen genetischen Prädisposition liegt beim Li-FraumeniSyndrom vor, das auf der Existenz eines defekten Allels jenes Gens beruht, welches
für das Tumorsuppressorprotein p53 kodiert (Srivastava et al. 1990, Schmoll et al.
2005).
Aufgrund der außerordentlichen Komplexität der molekularen Mechanismen der
Genregulation ist ein zunehmendes Verständnis dieser Prozesse die Voraussetzung
für weitere Einblicke in die Ursachen der Tumorentstehung. Durch die molekulare
Identifizierung mutierter genetischer Loci (Orte) eröffnen sich im Zusammenhang
mit der Tumorprogression neue Möglichkeiten für die DNA-Diagnostik. Die
5
prognostische Abschätzung von individuellem Risiko und die damit verbundene
Prädisposition für familiär bedingte, keimbahnvererbte Mutationen rücken neben
potentiellen
Therapien
des
fehlregulierten
zellulären
Wachstums
in
den
Vordergrund. Des weiteren eröffnen sie die Möglichkeiten zu Vorhersagen über die
Gefahr einer malignen Progression nach Früherkennung prämaligner Vorstufen von
Tumoren und gestatten eine frühzeitige Erkennung von Mikrometastasen, da mit
Hilfe der PCR (polymerase chain reaction; Polymerase Ketten Reaktion) spezifische
tumorassoziierte
Genom-Polymorphismen
in
kleinsten
Zellpopulationen
nachweisbar geworden sind (Schmoll et al. 2005).
Der Schwerpunkt der hier vorliegenden, experimentellen Doktorarbeit liegt in der
Quantifizierung der Genexpression von Wif1 und Rab34.
Wif1 ist ein extrazellulärer Antagonist des Wnt-Pathways, während Rab34 als
Mitglied der Ras-Gene im Rahmen exo- und endozytotischer Pathways eine Rolle
spielt. Für andere Organe bzw. Gewebe sind in der Literatur zu diesen Genen bereits
Pathways, Expressionsmuster und molekulargenetische Erkenntnisse beschrieben
worden.
In vorangegangenen Microarray-Analysen mit Tumorproben von semimalignen
Astrozytomen Grad III und malignen Glioblastomen konnte bereits ein signifikantes
Auftreten verschiedener Genexpressionen von Wif1 und Rab34 nachgewiesen
werden (Köhler 2007, Bozinov et al. 2008). Der Schwerpunkt der hier vorliegenden
Arbeit liegt im Bereich der Genexpressionsanalyse von Wif1 und Rab34, welche
anhand von 51 Tumorproben untersucht werden sollte. Diese 51 Proben umfassten 5
Astrozytome Grad II, 12 Astrozytome Grad III, 23 Glioblastome und 11
Glioblastom-Rezidive.
Um mögliche Expressionunterschiede zu zeigen, wurde die Methode der Real-TimePCR gewählt. Diese Methode zeichnet sich durch hohe Spezifität, hohe
Empfindlichkeit, schnelle Ergebnisse und eine genaue Quantifizierung aus.
Mit den Ergebnissen dieser Arbeit soll letztendlich ein weiterer Beitrag im
Verständnis der Gliomgenese geleistet werden. Durch Einsichten in das
Expressionsverhalten dieser Gene sollen molekularbiologische Prozesse besser
verstanden und somit möglicherweise neue Behandlungsoptionen diskutiert werden.
6
3.2 Literaturübersicht
3.2.1 Tumoren
Als Tumor bezeichnet man eine Neubildung von Körpergewebe im Sinne einer
abnormen Gewebsmasse, die durch Fehlregulationen des Zellwachstums entsteht.
Diese Vermehrung von körpereigenen entarteten Zellen (transformierte Zellen,
Tumorzellen) ist vor allem das Ergebnis von Regulationsstörungen im Rahmen von
Zellteilung (Proliferation) und Zellverlust (Apoptose) transformierter Zellen (Böcker
et al. 2001).
Neoplasien können jegliche Art von Gewebe betreffen. Je nach Lokalisation und
Funktion des durch tumorartiges Wachstum geschädigten Gewebes kann es zu einer
Fehlfunktion von Organen mit Beeinträchtigung des Gesamtorganismus bis zum
Tod kommen. Klinisch unterscheidet man als wichtigstes Einteilungsprinzip einer
Tumorerkrankung gutartige (benigne) von bösartigen (malignen) Tumoren,
Sonderformen bilden die semibenignen und semimalignen Tumoren.
Ein gutartiges Neoplasma ist im Allgemeinen durch langsames Wachstum
gekennzeichnet, das sich vor allem expansiv, verdrängend verhält. Des Weiteren
findet man in der Regel keine Metastasierung, benigne Tumoren rezidivieren selten,
wenn sie komplett entfernt wurden.
Die durch das Zellwachstum entstehende zusammenhängende Tumormasse führt zur
Verdrängung, Kompression und Druckatrophie des angrenzenden normalen
Gewebes. Benigne Tumoren haben in der Regel geringe, meist nur mechanische
Rückwirkung auf den Allgemeinzustand des betroffenen Menschen, sie wachsen
häufig über Monate und Jahre. Gelegentlich verursachen sie aber schwerwiegende
lokale Komplikationen wie zum Beispiel bei benignen Tumoren des Gehirns oder
der Meningen. Hier kann es zu unmittelbarer Druckeinwirkung auf lebenswichtige
Zentren des Gehirns und damit durchaus zum Tod des Tumorträgers kommen
(Kleihues u. Cavenee 2000).
Im Gegensatz dazu ist bösartiges Neoplasma mit weitgehender Unreife (Atypie,
Anaplasie) der Zellen durch ein eventuell sehr rasches, autonom infiltrierendes
Wachstum gekennzeichnet, das sich invasiv (Invasion) und zerstörend (Destruktion)
verhält. Makroskopisch findet man dementsprechend eine tumoröse Durchsetzung
des normalen Gewebes und demzufolge meist eine unscharfe Begrenzung, die bei
7
inadäquater
chirurgischer
Entfernung,
ausgehend
von
den
verbleibenden
Tumorzellen, zu einem Weiterwachsen und Wiederauftreten des Tumors
(Tumorrezidiv) führt.
Maligne Tumoren zeichnen sich ferner durch die Fähigkeit zur Verschleppung und
Absiedlung von Zellen in andere Gewebe und/oder Organe (Metastasierung) aus,
dies geschieht über Zell-Einbrüche in Lymph- und Blutgefäße. Im fortgeschrittenen
Stadium ist eine erhebliche Rückwirkung auf den Allgemeinzustand des Patienten
möglich (Anämie, Kachexie). Bösartige Tumoren sind nach den Herz-KreislaufErkrankungen die zweithäufigste Todesursache in den industrialisierten Ländern
(Böcker et al. 2001).
3.2.2 Tumoren des Nervensystems
Obwohl Tumoren des Nervensystems nur etwa 2 % aller menschlichen Tumoren
ausmachen, spielen sie klinisch eine wichtige Rolle, nicht zuletzt, weil alle
Altersstufen, insbesondere auch Kinder betroffen sind (Böcker et al. 2001). Im
pädiatrischen Bereich stehen diese Neoplasien neben Leukämien und Lymphomen
an oberster Stelle (Nakamura et al. 2007), sie schließen Retinoblastome und
Neuroblastome des sympathischen Nervensystems ein.
Neoplasien können sich prinzipiell in allen Abschnitten des Nervensystems und mit
Ausnahme der Mikroglia aus jedem Zelltyp entwickeln. Am häufigsten sind jedoch
Gliome des zentralen Nervensystems (ZNS), insbesondere des Großhirns (Holland
2001).
Tumoren des Nervensystems werden nach histologischen Kriterien eingeteilt, d.h.
nach dem Zelltyp, aus dem sich der Tumortyp entwickelt hat. Die WHOKlassifikation der Tumoren des Nervensystems geht zurück auf grundlegende
histologische
Erkenntnisse
sowie
Beobachtungen
von
tumorspezifischen
Wachstumsmodalitäten durch Bailey und Cushing. Auf deren 1926 publizierter
Arbeit basiert die erste WHO-Klassifikation von Zülch und Wechsler 1986, welche
zuletzt 2007 von der Editorial and Consensus Conference Working Group der WHO
aktualisiert wurde (siehe Tabelle 1):
8
Tabelle 1 (englisch): Auszug aus Tumours of Neuroepithelial Tissue (nach WHO 2007, Fuller u.
Scheithauer 2007)
Pilocytic astrocytoma
Pilomyxoid astrocytoma
Subependymal giant cell astrocytoma
Pleomorphic xanthoastrocytoma
Diffuse astrocytoma
Fibrillary astrocytoma
Protoplasmic astrocytoma
Gemistocytic astrocytoma
Anaplastic astrocytoma
Glioblastoma
Giant cell glioblastoma
Gliosarcoma
Gliomatosis cerebri
Oligodendroglioma
Anaplastic oligodendroglioma
Oligoastrocytoma
Anaplastic oligoastrocytoma
Subependymoma
Myxopapillary ependymoma
Ependymoma
Cellular
Papillary
Clear cell
Tanycytic
Anaplastic ependymoma
Astrocytic tumours
Oligodendroglial tumours
Oligoastrocytic tumours
Ependymal tumours
Die Inzidenz intrakranieller Tumoren liegt in Europa bei 7-10 Neuerkrankungen pro
100 000 Einwohner und Jahr und ist weitgehend konstant, mit Ausnahme einer
deutlichen Zunahme der primären malignen ZNS-Lymphome während der
vergangenen 10-15 Jahre. Männer sind insgesamt etwas häufiger betroffen
(Männer:Frauen = 1,35:1). Eine Ausnahme stellen die Meningeome dar, die gehäuft
bei Frauen auftreten (Böcker et al. 2001).
Obwohl es in der Vergangenheit ausgedehnte epidemiologische Studien gab, ist es
bisher nicht gelungen, Umweltfaktoren zu identifizieren, die für die Entstehung von
Hirntumoren verantwortlich sind. Als gesichert gilt die gelegentliche Induktion von
Hirntumoren
durch
therapeutische
Dosen
ionisierender
Strahlen,
welche
insbesondere bei Kindern zu beobachten ist. Ungewöhnlich häufig treten hingegen
Tumoren des Nervensystems im Rahmen erblicher Tumorsyndrome auf (DeVita et
al. 2004).
Klinisch und prognostisch unterscheiden sich Tumoren des ZNS in einigen
Aspekten von denen anderer Organe. Da das Hirn in den knöchernen Schädel
eingeschlossen ist, führen alle, also auch gutartige (z.B. Meningeome),
raumfordernde
Prozesse
früher
oder
später
zu
Hirndrucksteigerung
mit
lebensbedrohlichen intrakraniellen Massenverschiebungen (DeVita et al. 2004).
9
Aufgrund dieser Korrelation gelten die klassischen Merkmale der Malignität
(infiltrativ-destruierendes Wachstum und Metastasierung) nur eingeschränkt.
In der Regel bleibt die Tumorinfiltration auf das Hirnparenchym beschränkt, nur
selten findet ein Übergreifen auf benachbarte Strukturen (Dura, Knochen) statt.
Auch eine hämatogene Streuung in andere Organe ist sehr selten und klinisch meist
ohne bestimmten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Einige Hirntumoren, wie z.B.
die Medulloblastome neigen allerdings zur Metastasierung über den Liquor
cerebrospinalis.
Charakterstisch für Tumoren des Nervensystems ist die häufig ausgeprägte
Bevorzugung bestimmter Lokalisationen und Altersgruppen. Oft lässt sich aus der
Kombination beider Angaben bereits eine Verdachtsdiagnose stellen (Kleihues u.
Cavenee 2000).
3.2.3 Astrozytäre Tumoren (Gliome)
Astrozytäre Tumoren sind in jedem Lebensalter und in allen anatomischen
Lokalisationen anzutreffen und machen ca. 25% aller intrakraniellen Gliome aus
(Berlit 1999). Sie wachsen entlang der Marklagerbahnen und infiltrieren weit vom
Tumorzentrum entfernt gelegene Hirnareale. Bevorzugte Lokalisationen sind
Frontal- und Temporallappen, aber auch im Okzipital- und Parietallappen, im
Thalamus, im Hypothalamus, im Mittelhirn, in dem Pons und im Nervus Optikus
treten Astrozytome auf.
Im Wesentlichen werden zwei Formen unterschieden, das pilozytische Astrozytom
des Kindes- und Jugendalters und die diffus infiltrierenden Astrozytome bei
Erwachsenen. Entsprechend ihres Malignitätsgrades und ihres bevorzugten
Auftretens verhalten sie sich unterschiedlich, so dass in der Therapie große
Unterschiede bestehen.
Anhand
der histologischen
Klassifikation
werden
die Hirntumoren
nach
Empfehlungen der WHO in vier Malignitätsgrade eingeteilt, die einen Schätzwert
für ihr biologisches Verhalten angeben (siehe Tabelle 2; Poeck u. Hacke 2001).
Tabelle 2: Histologische Kriterien der Hirntumoren (Poeck u. Hacke 2001)
WHO
Grad
Dignität
Histologische
Charakteristika
Beispiele
I
Benigne
Gut differenzierte Gewebe,
keine Metastasen
Pilozytisches
Astrozytom,
Meningeom,
Neurinom,
Überlebens
zeit (Ca.Angaben)
≥ 5 (-50)
Jahre
10
HypophysenAdenom
II
Semibenigne
Einzelne atypische Zellen,
Astrozytom II,
3-5 Jahre
noch gut differenziertes
Oligodendrogliom,
Gewebe, Kernatypien,
Ependymom,
keine/kaum Metastasen
Pineozytom
III
Semimaligne
Viele atypische Zellen,
Anaplastisches
2-3 Jahre
Mitosen, Ursprungsgewebe
Astrozytom,
noch erkennbar, jedoch
anaplastisches
bereits entdifferenziert
Oligodendrogliom,
Plexuskarzinom
IV
Maligne
Entdifferenziertes Gewebe,
Glioblastom,
6 Monate
viele Mitosen, Nekrosen,
Medulloblastom,
(bis 2 Jahre)
Endothelproliferation,
Meningosarkom,
Metastasen
Glioblastom,
malignes Lymphom
Folgende histologische Kriterien werden zur Beurteilung herangezogen: Kernatypien, Mitosen,
Endothelproliferation, Nekrosen.
Wenn keines der Kriterien erfüllt ist
Grad I
1 Kriterium erfüllt
Grad II
2 Kriterien vorhanden
Grad III
3 oder 4 Kriterien erfüllt
Grad IV
Der Malignitätsgrad dient der Verdeutlichung der Klassifizierung. Als benigne oder
niedriggradig („low grade“) werden die Gliome der Grade I und II bezeichnet, dies
trifft für die Grad-I-Tumoren klinisch-biologisch zu, die Grad-II-Tumoren können
jedoch wegen ihrer diffusen Infiltration praktisch nie komplett reseziert werden und
gehen meist in maligne Gliome über (Peiffer et al. 2002). Als maligne oder
höhergradige („high grade“) Gliome werden die Tumoren Grad III (anaplastische
Gliome) und die Glioblastome (Gliome Grad IV) zusammengefasst. Da in der hier
vorliegend durchgeführten Studie Astrozytome Grad II, III und Glioblastome
untersucht worden sind, werden lediglich diese Tumorformen detailliert dargestellt.
3.2.4 Niedriggradiges Astrozytom (WHO-Grad II)
Häufigkeit, Vorkommen und Klinik
Die diffus infiltrierenden, niedriggradigen Astrozytome wachsen langsam und
manifestieren sich bevorzugt bei jüngeren Erwachsenen. Der Erkrankungsgipfel
liegt in der 3. bis 4. Lebensdekade. Das Astrozytom Grad II manifestiert sich bei
70% der Patienten durch epileptische Anfälle (Berlit 1999) und tritt vor allem in den
Großhirnhemisphären auf, wobei es selten die großen Sulci überschreitet. In
absteigender Häufigkeit sind der Frontallappen (42%), der Temporallappen (41%),
der Parietallappen (15%) und der Okzipitallappen (8%) betroffen (Berlit 1999).
Obwohl die Wachstumstendenz gering ist, infiltrieren sie diffus in benachbarte
Strukturen, so dass eine vollständige chirurgische Resektion nicht gelingt. Im
11
Verlauf der typischerweise auftretenden Rezidive beobachtet man histologisch eine
zunehmende Zellteilungsaktivität und Anaplasie, d.h. eine Progression zum
anaplastischen Astrozytom oder Glioblastom (Kleihues u. Cavenee 2000).
Morphologie
Makroskopisch findet man einen unscharf begrenzten, infiltrativ wachsenden Tumor
mit
glasiger
Schnittfläche,
der
wegen
seines
infiltrativen,
jedoch
nicht
destruierenden Wachstums zu einer Auftreibung des betroffenen Hirnareals führt.
Häufig beobachtet man glattwandige Zysten mit wasserheller Flüssigkeit. Blutungen
kommen praktisch nicht vor und Verkalkungen sind wesentlich seltener als beim
Oligodendrogliom (Kleihues u. Cavenee 2000).
Mikroskopisch
gemistozytischen
unterscheiden
und
sich
gemischten
fibrilläre
von
Varianten.
protoplasmatischen,
Einen
wichtigen
immunhistochemischen Marker der astrozytären Histogenese, den alle Zellen
zeigen, stellt das gliafibrilläre saure Protein (GFAP) als ein Baustein der glialen
Intermediärfilamente dar (siehe Abbildung 1). Dieser Marker vereinfacht die
Klassifikation. Das Astrozytom Grad II unterscheidet sich vom anaplastischen
Astrozytom (Grad III) oft nur durch die niedrigere mitotische Aktivität und die
geringere Zellatypie (Kaji et al. 2006).
Abbildung 1: GFAP-Bild eines niedriggradigen Astrozytoms (Aus Agamanolis 2006)
Gemistozytisches Astrozytom
Zytoplasmatisches Filament
GFAP-Immun-Histochemie
Histologisch ähneln die Tumorzellen normalen oder reaktionsfähigen Astrozyten. Sie können
sternförmig sein, spindelförmig mit Faser-ähnlichen Prozessen, oder komplett aus einer großen
eosinophilen Masse bestehen (gemistozytisches Astrozytom). Sie enthalten intermediäre
zytoplasmatische Filamente, welche denen von nicht-neoplastischen Astrozyten ähneln. Das Protein
dieser Filamente, das sog. gliafibrilläre saure Protein (glial fibrillary acidic protein = GFAP), kann
mittels Immunhistochemie detektiert werden.
12
Bei etwa 50% der Astrozytome Grad II wird eine Chromosomenaberration mit
Verlust des kurzen Arms von Chromosom 17 beobachtet, die zum Verlust des
Tumorsuppressorgens p53 führt (Berlit 1999).
Diagnostik
Oft stellt sich das Astrozytom im CT und MRT als homogene Markveränderung dar.
Es ist im CT als Zone verminderter Dichte erkennbar, in der sich Tumor- und
Ödemanteil selbst nach Kontrastmittelgabe in der Regel nicht differenzieren lassen.
Im MRT erscheint das Tumorgewebe als überwiegend in der weißen Substanz
lokalisierte Läsion mit mäßigem raumforderndem Effekt. Es kommt im T1gewichteten Bild leicht hypointens und im T2-Bild deutlich hyperintens und in ihrer
Struktur homogen zur Darstellung (siehe Abbildung 2; Weller 2004).
Abbildung 2: Niedriggradiges Astrozytom
MRT-Bilder eines Patienten mit einem niedriggradigen Astrozytom. Links: Das MRT zeigt in T2Wichtung und in der axialen Ebene eine große, homogen hyperintense Läsion, die bis in die
Stammganglien reicht; Rechts: In T1-Wichtung stellt sich der Tumor glatt begrenzt, hypointens dar
(Frontalebene) (Aus dem Universitätsklinikum Marburg, Abteilung für Neurochirurgie).
Genetische Aspekte
Zu den häufigen molekulargenetischen Veränderungen gehören Mutationen im
TP53-Tumorsuppressorgen (35%) (Peiffer et al. 2002).
Therapie und Prognose
Eine komplette operative Tumorentfernung ist aufgrund des schlecht begrenzten
Wachstums dieser Tumoren meist unmöglich. Eine weitgehende Tumorresektion
erscheint jedoch sinnvoll. Bei primär inoperablen Tumoren kommt eine lokale
interstitielle
Bestrahlung
in
Frage
(Brachytherapie)
(Weller
2004).
Die
13
konventionelle Strahlentherapie reduziert in begrenztem Ausmaß das Risiko eines
Rückfalls. Sie wird oft erst bei einem weiteren Tumorwachstum nach der Operation
eingesetzt (Weller 2004). Wenn der Tumor nach Operation und Strahlentherapie
weiteres Wachstum zeigt, kann auch der Versuch einer Chemotherapie
unternommen werden. Die durchschnittliche Überlebensprognose nach WHO
beträgt nach der Diagnosestellung statistisch 5 bis 10 Jahre (Weller 2004).
3.2.5 Anaplastisches Astrozytom (WHO-Grad III)
Häufigkeit, Vorkommen und Klinik
Dieser
histologisch
maligne
Tumor
entwickelt
sich
häufig
aus
einem
niedriggradigen Astrozytom und wächst fast immer infiltrierend. Die malignen
Astrozytome machen die Mehrzahl der primären Hirntumoren aus (Anteil an allen
Astrozytomen 35%; Peiffer et al. 2002), sie treten multilokulär überall im ZNS auf,
vor allem jedoch in den Großhirnhemisphären. Die Mehrzahl der Patienten mit
einem anaplastischen Astrozytom sind zwischen 40 und 60 Jahre alt, männliche
Patienten sind häufiger betroffen als weibliche (2:1) (Berlit 1999).
Innerhalb von ca. 3-5 Monaten entwickeln sich klinische Symptome wie
epileptische Anfälle (38%), Kopfschmerzen (35%) und psychische Veränderungen
(16%). Zusätzlich kommen Übelkeit, Erbrechen und Papillenödem vor, die auf einen
erhöhten Hirndruck aufgrund des raumfordernden Effekts des Tumors und eine
konsekutive Liquorzirkulationsstörung zurückgeführt werden können (Berlit 1999).
Morphologie
Morphlogisch unterscheidet sich das anaplastische Astrozytom von einem
niedriggradigen Tumor im Wesentlichen durch eine größere Zellteilungsaktivität,
die sich klinisch durch ein rascheres Auftreten von Rezidiven manifestiert. Es zeigt
Malignitätszeichen, aber noch nicht das Vollbild des weiter entdifferenzierten
Glioblastoms.
Astrozytome Grad III wachsen sehr rasch, sind gefäßreich und sind von einem
erheblichen Begleitödem umgeben (Kleihues u. Cavenee 2000).
14
Diagnostik
Anaplastische
Astrozytome
sind
in
CT-
und
MRT-Bildern
durch
kontrastmittelanreichernde Tumoranteile, Zysten oder häufig auch ein umgebendes
Ödem gekennzeichnet. Das anaplastische Astrozytom ist sowohl histologisch als
auch im CT und MRT nur schwer vom Glioblastoma multiforme abzugrenzen (siehe
Abbildung 3, Weller 2004).
Von diagnostischer und prognostischer Bedeutung ist histologisch neben
gesteigerter Zelldichte und Kernpolymorphie vor allem die erhöhte Mitoserate. Ein
wichtiger Marker ist weiterhin der Ki-67/MIB1-Proliferationsindex, er liegt
typischerweise zwischen 5% und 10% (Peiffer et al. 2002, Nafe et al. 2005).
Abbildung 3: Anaplastisches Astrozytom
MRT-Bild eines Patienten mit einem anaplastischen Astrozytom. Zu sehen sind inhomogene
Strukturen in der Kontrastmittelaufnahme. Axial, coronar, sagittal und intracerebral befinden sich
Raumforderungen,
weiterhin
Zysten
und
Kontrastmittelanreicherungen
(Aus
dem
Universitätsklinikum Marburg, Abteilung für Neurochirurgie).
Genetische Aspekte
Auch genetisch ist das anaplastische Astrozytom zwischen Grad-II-Astrozytom und
Glioblastom anzusiedeln. Zu den TP53-Mutationen, die in etwa gleicher Häufigkeit
wie bei Grad-II-Astrozytomen vorliegen (35%), kommen Aberrationen von Genen
für
zellzyklusregulierende
Inaktivierung
des
Proteine
wie
CDKN2A/p16-Deletion
Retinoblastom-(RB-)Tumorsuppressorgens
(25%),
(30%),
p19ARF-
Deletion (15%) und CDK4-Amplifikation (10%). Inaktivierungen bisher nicht
identifizierter Tumorsuppressorgene auf den Chromosomen 19q und 22q, detektiert
durch einen Verlust der Heterozygotie (loss of heterozygosity, LOH), findet man in
15
40% bzw. 30% der Fälle. EGFR-Amplifikationen treten in weniger als 10% der
Fälle auf (Peiffer et al. 2002, Kleihues u. Ohgaki 2000).
Therapie und Prognose
Die Therapie der Wahl besteht in einer möglichst radikalen Resektion. Eine
komplette Resektion dieser Tumoren ist aufgrund ihres infiltrierenden Wachstums
aber ebenfalls oft nicht möglich. Nahezu immer treten Rezidive auf. Therapeutisch
wird nach bestmöglicher Tumorverkleinerung eine Strahlentherapie mit 60 Gy in
Dosen von 1,8-2,0 Gy angeschlossen. Das vasogene Ödem spricht gut auf die
Behandlung mit Steroiden an. Aufgrund der schlechten Prognose kann eine
adjuvante Chemotherapie versucht werden. Bei Patienten mit anaplastischen
Astrozytomen liegt die Einjahresüberlebensrate bei 60-70%, die 2- und 5-JahresÜberlebensraten betragen 38-60% bzw. 15-25% (Peiffer et al. 2002).
3.2.6 Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV)
Häufigkeit, Vorkommen und Klinik
Das Glioblastoma multiforme ist ein hochmaligner glialer Tumor astrozytären
Ursprungs, der sich bevorzugt im höheren Erwachsenenalter (50.-60. Lebensjahr)
manifestiert. Glioblastome umfassen etwa 40% der Gliome und machen mit 15-20%
den häufigsten aller Hirntumoren aus (Peiffer et al. 2002). Männer sind im
Verhältnis 3:2 häufiger als Frauen betroffen (Ohgaki u. Kleihues 2007). Das
Glioblastom kann sich aus einem niedriggradigen Astrozytom entwickeln oder, mit
sehr kurzer klinischer Anamnese, de novo entstehen. Man findet Glioblastome
vornehmlich in den Großhirnhemisphären, sie wachsen von der weißen Substanz aus
und verhalten sich infiltrierend (meist subkortikal). Sie können in allen Hirnlappen
lokalisiert sein. Im Kleinhirn kommen sie nicht vor (Ohgaki u. Kleihues 2007).
Klinisch sind das frühe Einsetzen von Kopfschmerzen und Hirndruckzeichen
charakteristisch. Anfälle sind eher selten, dafür sind wegen der großen Ausdehnung
des Tumors und dem begleitenden Hirnödem, welches oft zu einer Schwellung der
ganzen Hemisphäre führen kann, Lähmungen häufig (Weller 2004). Aufgrund des
raschen Wachstums des Tumors kommt es zu einer überstürzten Bildung von
pathologischen Gefäßen mit arteriovenösen Anastomosen (Weller 2004).
16
Morphologie
Makroskopisch weisen Glioblastome eine charakteristische „bunte“ Schnittfläche
auf, die bedingt ist durch das Nebeneinander von gelblichen Nekrosebereichen,
grünlich
verflüssigten
Nekrosen
(„Gallertzysten“),
rot
oder
schwärzlich
erscheinenden Blutungen und grau-weißem soliden Tumorgewebe (Kleihues u.
Cavenee 2000).
Histologisch handelt es sich um zellreiche, meist polymorphe Tumoren mit sehr
hoher Mitoserate (Wachstumsfraktion: 8-25%) (Böcker et al. 2001). Typisch, aber
nicht obligat, sind hyperchromatische, unregelmäßig geformte Kerne mit
mehrkernigen Riesenzellen (multiformes Glioblastom) (Weller 2004). Daneben gibt
es Tumoren, in denen spindelige oder kleine rundlich-polymorphe Zellen
überwiegen (fusiforme und globuliforme Glioblastome) (Weller 2004). Praktisch
immer nachweisbar sind Mitosen in variabler Zahl (siehe Abbildung 4; Kleihues u.
Cavenee 2000).
Abbildung 4: Glioblastoma multiforme
Links: Pathologischer Befund im Frontalschnitt: Buntes, polymorphes, zystisch-hämorrhagisches
Tumorgewebe in den Stammganglien und in der Inselregion; Massenverschiebung nach links.
Rechts: GFAP-Immun-Histochemie: Die fibrilläre Matrix ist hier besonders gut sichtbar; zudem
findet man Bereiche mit gemistozytären Tumorzellen (breites, plumpes, eosinophiles Zytoplasma mit
randständigem abgeflachten Zellkern); kennzeichnend ist auch der Mitosenreichtum (Aus dem
Universitätsklinikum Marburg, Abteilung für Neurochirurgie).
Für die Diagnose entscheidend ist neben flächenhaften und strichförmigen
Nekrosen, um die sich die Tumorzellkerne radiär anordnen (Palisadenstellung der
Kerne), das Vorkommen höhergradig-pathologischer Blutgefäße im Sinne einer
Hyperplasie und Hypertrophie der Endothelien (DeVita et al. 2004). Diese
Gefäßproliferationen werden durch ein von den Gliomzellen sezerniertes
angiogenetisches Protein (vascular endothelial growth factor, VEGF) induziert
17
(Omuro et al. 2007). Immunhistochemisch lässt sich trotz fortgeschrittener
Entdifferenzierung zumeist in einem Teil der Tumorzellen GFAP nachweisen.
Diagnostik
Im CT sind Glioblastome durch eine unterschiedliche Dichte, eine unscharfe
Tumorbegrenzung sowie ein großes, begleitendes Marklagerödem gekennzeichnet.
Vor allem in der Tumorrandzone kommt es nach Kontrastmittelgabe zu einer
inhomogenen Anreicherung. Typisch für T2-Bilder im MRT sind eine starke
Anreicherung von Kontrastmittel in soliden Tumoranteilen, Zysten, Blutungsreste
und ein ausgedehntes, fingerförmiges Ödem. Differentialdiagnostisch sollte immer
an eine große, nekrotische Hirnmetastase oder an einen Abszeß gedacht werden
(Weller 2004).
Die
Angiographie
lässt
in
60-70%
eine
Kontrastmittelanreicherung
mit
pathologischen Gefäßen erkennen. (Poeck u. Hacke 2001).
Genetische Aspekte
Mit Ausnahme des Li-Fraumeni-Syndroms ist die Ätiologie der Glioblastome
unbekannt. Dennoch gibt es eine Assoziation zu genetischen Daten, die sich, je
nachdem, ob das Glioblastom sekundär aus einem Grad-II- oder Grad-IIIAstrozytom entsteht oder ob es sich primär entwickelt, unterschiedlich äußern.
Primäre Glioblastome manifestieren sich eher bei älteren Patienten nach kurzer
Anamnese de novo und sind genetisch charakterisiert durch EGFR (epidermal
growth factor receptor, epidermaler Wachstums-Faktor-Rezeptor)-Amplifikation
(40%) und -Überexpression (60%), MDM2 (murine double minute, Murin doppelte
Minute [p53 bindendes Protein])-Amplifikation (<10%) und -Überexpression (50%),
CDKN2A/p16 (cyclin - dependent kinase inhibitor 2A/p16, Cyclin abhängiger
Kinase Inhibitor)-Deletion (30-40%) und PTEN (phosphatase and tensin homolog,
Phosphatase und Tensin Homologes)-Mutation (30%) (Ohgaki u. Kleihues 2007,
Kleihues u. Ohgaki 2000). Das sekundäre Glioblastom entwickelt sich durch
Tumorprogression aus einem niedriggradigen oder anaplastischen Astrozytom und
tritt bei jüngeren Patienten auf. Hier sind TP53-Mutationen (>65%) häufiger (siehe
Abbildung 5; Peiffer et al. 2002, Kleihues u. Ohgaki 2000, Böcker et al. 2001).
18
Abbildung 5: Representative klinische, pathologische und molekulargenetische Charakteristika
von Glioblastoma Multiforme (Aus Weil 2006)
Die Abbildungen in der oberen Reihe veranschaulichen MR-Bilder eines Patienten mit Glioblastoma
multiforme (GBM). Auf der linken Seite und in der Mitte sind Gadolinium-verstärkte T1-gewichtete
axiale MR-Bilder vom Tag vor und dem Tag nach der Resektion eines großen, links-frontalen
GBM´s zu sehen. Der Patient war postoperativ mit Chemotherapie und Radiatio behandelt worden.
11 Monate nach der ersten Operation stellte sich der Patient mit Stupor und verstärkten
Kontrastmittelaufnahmen im CT (Bild oben rechts) erneut vor. Hier zeigte sich ein massives
Wiederauftreten des GBM.
19
Die mittlere Abbildungsreihe zeigt histopathologische Beispiele vom Tumor dieses Patienten. Das
linke Bild ist durch Hyperzellularität, Pseudopallisaden um eine Nekrose (kleiner Pfeil) und
vaskuläre Proliferation mit Hämorrhagie (großer Pfeil) gekennzeichnet. Im mittleren Bild ist eine
Hyperzellularität mit intermittierenden mitotischen Formen (kleine Pfeile) zu sehen, während man in
der rechten Abbildung verschiedene Areale mit endothelialer Proliferation (kleine Pfeile) erkennen
kann.
Die untere Abbildung zeigt ein schematisches Modell der Astrozytom-Entwicklung und Progression.
Die wichtigsten genetischen Veränderungen sind bei jedem Pathway angezeichnet. Auch die
durchschnittliche Überlebenszeit ist für jeden Astrozytomtyp notiert. Neuronale Tumoren und
Oligodendrogliome (links oben bzw. unten) scheinen unabhängig zu entstehen. Obwohl
grundlegende Erkenntnisse über genetische Merkmale entwickelt worden sind, konnten diese nur
inkonsequent in GBM´s gefunden werden und erscheinen bis jetzt nicht effektiv vereinbar mit einer
gezielten Therapie. Es bleibt im großen und ganzen unklar, wie innerhalb des Tumor-Progresses
entweder ein GBM de novo oder eine sekundäre Form entsteht (unbekannte Schritte von potentiellen
Vorläufern oder pluripotenten Tumor-Zelle(n) sind durch kleine Pfeile angezeigt).
Therapie und Prognose
Die Therapie der Wahl besteht in einer möglichst radikalen Resektion, an die sich
eine Bestrahlung und antiödematöse Therapie anschließen. Mit einer subtotalen
Resektion, einer Bestrahlung, einer Zytostase und Kortikoiden kann man das Leben
der Kranken lediglich um einige Monate verlängern. Prognostische Faktoren wie
Resektionsumfang, Lebensalter und Ausmaß der klinischen Beeinträchtigung zu
Beginn der Therapie spielen dabei eine Rolle (Stummer et al 2006).
Obwohl innerhalb der Neurochirurgie und Strahlentherapie bedeutende Fortschritte
erzielt worden sind, besitzt der Tumor mit einer 5-12%igen 2-Jahres-Überlebensrate
noch immer eine äußerst schlechte Prognose (Peiffer et al. 2002). Eine
Radikaloperation des Tumors ist nicht möglich, schon früh treten Rezidive auf
(Poeck u. Hacke 2001). Die mediane Lebenserwartung unter der gegenwärtigen
Standardtherapie (Operation und anschließende Bestrahlung) beträgt 8-13 Monate
(Peiffer et al. 2002). Neueste Therapieformen zeigen hier eine mögliche
Verbesserung durch Temozolomid (Weller et al. 2005)
20
3.3 Genetische Aspekte von Wif1 und Rab34
3.3.1 Das Onkogen Wif1
Wif1 steht für Wnt inhibitory factor-1 (Wnt inhibierender Faktor-1) und ist ein
bekanntes Onkogen, das zu der Wnt-Proteinfamilie gehört. Die Wnt (Wingless-type,
flügelloser Typ)-Proteinfamilie besteht aus 19 Mitgliedern, die als sezernierende
Glycoproteine mit Signalfunktion beschrieben werden. Diese Signalmoleküle
scheinen sowohl in Entwicklungsprozesse als auch weitreichend in die Onkogenese
involviert zu sein. Anhand verschiedenster menschlicher Krebsarten konnte bereits
eine aberrante Aktivierung des Wnt-Signal-Pathways demonstriert werden. Hierzu
gehören kolorektale Tumoren, Kopf- und Nackenkarzinome, Melanome und
Leukämie (Reguart et al. 2004). Sowohl in NSCLC (non-small-cell lung cancer,
Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom), als auch in Mesotheliom-Zellen induziert die
Blockade der Wnt-1-Signalkaskade Apoptose und unterdrückt Wachstum (Reguart
et al. 2004).
3.3.1.1 Der Wnt-Pathway
Für Wnt konnten bisher drei Pathways mit verschiedenen Aktivierungsmechanismen
innerhalb der Wnt-Antagonisten identifiziert werden (siehe Abbildung 6; Reguart et
al. 2004):
Der
am
besten
verstandene
wird
als
Canonical-Pathway
(traditioneller
Reaktionsweg) bezeichnet (siehe Abbildung 6 oben). Er beinhaltet die direkte
Bindung
von
Wnt-Liganden
an
zwei
verschiedene
Familien
von
Zell-
Oberflächenrezeptoren: die Fz (Frizzled, gezischt)-Rezeptorfamilie und die LRP
(LDL-receptor-related
protein,
LDL-Rezeptor
assoziiertes
Protein)-Familie.
Intrazellulär aktivieren die Wnt-Signale Dvl-Proteine, welche wiederum GSK-3β
(glycogen synthase kinase-3beta, Glycogen Synthase Kinase 3beta) inhibieren. Das
Ausschalten von GSK-3β wird durch Kasein-Kinase1epsilon vermittelt, welche an
die Protein-Interaktionsdomäne PDZ bindet und Dvl phosphoryliert. Dadurch wird
die Phosphorylierung von β-Catenin verhindert. Dieses freie β-Catenin ist stabilisiert
und akkumuliert im Zytosol, was seine Translokation in den Zellkern erlaubt, von
wo aus es an Transkriptionsfaktoren wie LEF/TCF binden kann. Dieser β-CateninLEF/TCF-Komplex induziert die Transkription von wichtigen nachfolgenden
21
Zielgenen, von denen viele eine Rolle beim Tumorwachstum spielen (Mazieres et al.
2005).
Die anderen beiden Pathways, welche das Wnt-Signal beeinflussen können, wirken
entweder durch eine Aktivierung von Calmodulin Kinase II und Protein Kinase C
(der sog. Wnt/Ca2+ Pathway) oder durch eine Aktivierung von Jun N-terminaler
Kinase (der sog. planare Zell-Polaritäts-Pathway) (Mazieres et al. 2005).
Abbildung 6 (englisch): The Wnt pathways, (a) Wnt/beta signaling pathway, (b) Wnt/Ca2+ pathway,
(c) Wnt/polarity pathway (Internet: The Wnt-Pathways)
3.3.1.2 Extrazelluläre Antagonisten des Wnt-Pathways
Extrazelluläre Antagonisten Wnt signalisierender Pathways können in zwei große
Klassen unterteilt werden. Beide Molekülklassen verhindern eine Interaktion
zwischen Ligand und Rezeptor, allerdings durch unterschiedliche Mechanismen:
Mitglieder der ersten Klasse, welche die sFRP (secreted Frizzled-related protein,
abgesondertes Frizzled-assoziiertes Protein)-Familie, den Wif (Wnt inhibitory
factor, Wnt-hemmender Faktor)-1 und Cerberus umfassen, binden in erster Linie an
die Wnt-Proteine selbst (Kawano u. Kypta 2003).
22
Die zweite Gruppe besteht aus der Dkk (Dickkopf)-Familie, welche die Wnt-Signale
durch Bindung an die LRP5/LRP6-Komponenten des Wnt-Rezeptorkomplexes
unterbindet (Reguart et al. 2004).
3.3.1.3 Struktur von Wif1
Die Rolle des Wif1 innerhalb der Wnt-Signalkaskade wurde erstmals im
Zusammenhang mit der menschlichen Retina identifiziert, es wurden hoch
konservierte Orthologe im Krallenfrosch (Xenopus) und Zebrafisch (Danio rerio)
gefunden (Reguart et al. 2004).
Wif1 ist ein Antagonist des Wnt, es kann Wnt-Proteine im extrazellulären Raum
binden und seine Aktivität inhibieren (siehe Abbildung 7; Mazieres et al. 2004).
Abbildung 7 (englisch): Wif1 physical map; location 12q13.13 (Internet: Geneatlas - Database)
Entwicklungsgeschichtlich ist Wif1 ein konserviertes Protein, das auf dem
Chromosom 12q14 lokalisiert ist und am N-terminalen Ende eine einzigartige
Signalsequenz enthält, die als Wif-Domäne bezeichnet wird (Reguart et al. 2004).
Wif1 enthält zusätzlich 5-EGF (five-epidermal growth factor, fünf epidermaler
Wachstumsfaktor)-ähnliche Wiederholungen. Es zeigt keine Ähnlichkeiten mit der
cysteinreichen Domäne (CRD, cysteine-rich domain) von Fz oder sFRP.
Es konnte gezeigt werden, dass Wif1 an XWnt-8 und an Drosophila Wg (wingless,
Übersetzung)-Mutanten im extrazellulären Raum binden kann und sowohl eine
Unterbindung der Interaktion von XWnt-8 mit Dfz2, als auch eine ArmadilloStabilisierung von XWnt-8 behandelten Klon-8-Zellen von Drosophila verursacht
(Reguart et al. 2004).
23
Eine Funktionsanalyse der 5´Promotorregion (etwa 1,5 Kilobasen) des menschlichen
Wif1-Genes zeigt, dass diese Region ein ganzes Fragment mit hoher basaler
Promotor-Aktivität in verschiedenen Zelllinien aufweist, während die gekürzten
Formen
dies
nicht
tun
(Reguart
et
al.
2004).
Verschiedene
wichtige
Transkriptionselemente wurden auf der 5´flankierenden Region gefunden, hierzu
gehören das Homeobox Protein Engrailed (ausgezacktes Homeobox Protein; -826
bis -830 von ATG), E2F (-807 bis -811), GLI-Krueppel (-548 bis -552), MYCassoziiert (-419 bis -423) und NF-κB (-421 bis -425) (Reguart et al. 2004). Der G/CGehalt der menschlichen Wif1-Promotorregion ist hoch (ungefähr 63,5%) (Reguart
et al. 2004). Diese Integrität der Wif1-Promotorregion demonstriert möglicher
Weise seine zentrale Rolle bei der Wif1-Aktivität bzw. -Aktivierung.
Beim Klonen und der Charakterisierung des menschlichen Wif1-Promotors fand
man
unterschiedliche
Aktivitäten
dieses
Wif-Promotors
in
verschiedenen
menschlichen Krebs-Zelllinien. Es wird über eine innerhalb dieses Promotors
gelegene CpG-Insel (105 CpGs) berichtet und vermutet, dass dieser Promotor eine
mutmaßliche TATA-Box (-1368 bis -1378 über dem ATG) enthält (Reguart et al.
2004). Ein weiterer wichtiger Reaktionsmechanismus ist die aus menschlichem
Lungenkrebs beobachtete Methylierung von CpG-Inseln, welche innerhalb der
funktionellen Wif1-Promotorregion liegt (Reguart et al. 2004). Die Methylierung in
diesem Gebiet scheint ein wichtiger Regulationsmechanismus im Zusammenhang
mit aberranter Wnt-Signal-Aktivierung in Tumoren zu sein (Reguart et al. 2004).
Reguard et al. fanden des Weiteren eine Korrelation zwischen dem Expressionslevel
von β-Catenin in Tumorzelllinien und der Wif1-Promotoraktivität. Dies legt nahe,
dass der Wif-Promotor durch den Wnt/β-Catenin-Pathway reguliert wird und
möglicherweise eine Funktion im Sinne eines negativen Feedbacks übernimmt
(Reguart et al. 2004).
Zusammenfassend kann man aus diesen Untersuchungen schließen, dass die CpGInsel innerhalb eines funktionellen Wif1-Promotors liegt, folglich kann diese
methylierte
Region
als
wichtig
für
das
Wif1-Gen-Silencing
(Wif1-Gen-
Verstummen) und somit innerhalb des Wnt/β-Catenin-Pathways angesehen werden
(Reguart et al. 2004).
24
3.3.1.4 Expressionsverhalten von Wif1
Bekanntermaßen spielen die Wnt-Aktivierung und Wif1 eine Rolle in der
Tumorgenese. An dieser Stelle sei auf das unterschiedliche Expressionsverhalten
innerhalb verschiedenster Tumorarten der einzelnen Mitglieder des Wnt-Pathways
verwiesen, die in nachstehender Tabelle 3 aufgeführt sind.
Tabelle 3: Auszug aus Alterationen im Wnt-Pathway in verschiedenen Tumoren (Nach Ilyas
2005)
Diese Tabelle (in englisch) zeigt in Auszügen Mechanismen, durch die Wnt aktiviert werden kann.
Außerdem zeigt sie die unterschiedlichen Tumoren, über die im Zusammenhang mit einer aberranten
Wnt-Signalisierung berichtet worden ist.
Wnt pathway
Change
Cancer type
component
Wnts
Overexpression
NSCLC
CLL
Gastric cancer
HNSCC
Colorectal
Ovarian
BCC
Down-regulation
Breast
sFRPs
Overexpression
Prostate
Down-regulation
Breast
Bladder
Mesothelioma
Colorectal
WIF1
Down-regulation
NSCLC
Prostate
Breast
Lung
Bladder
LRP5
Overexpression
Osteosarcoma
Frizzled
Overexpression
Prostate
HNSCC
Colorectal
Ovarian
Oesophageal
Gastric
Dishevelled
Overexpression
Prostate
Breast
Mesothelioma
Cervix
Legende: NSCLC = non-small cell lung cancer; HNSCC = head and neck squamous cell carcinoma;
CLL = chronic lymphatic leukaemia; BCC = basal cell carcinoma; GOF = gain-of-function; LOF =
loss-of-function.
Wie
aus
der
Tabelle
Lungenkarzinogenese
Zusammenhang
ersichtlich,
beschrieben
zwischen
der
ist
ein
worden.
Aktivierung
Wnt-Pathway
Es
wird
ein
u.a.
bei
der
unterschiedlicher
Wnt-vermittelter
Signale
bei
Lungentumoren und beispielsweise bei kolorektalem Krebs gesehen.
Beim Lungenkrebs sind APC (Antigen presenting cell, Antigen-präsentierende
Zelle)-
oder
β-Catenin-Veränderungen
selten,
der
Wnt-Pathway
scheint
25
stromaufwärts des β-Catenins aktiviert zu werden (Mazieres et al. 2005). Drei
Mechanismen der Aktivierung wurden identifiziert: Eine Überexpression von WntEffektoren
wie
Dvl,
eine
Aktivierung
des
nicht-kanonischen
Pathways,
einschließlich der JNK (Jun N-terminale Kinase) und eine Verdrängung von WntAntagonisten wie Wif1 (Mazieres et al. 2005).
Die jeweilige Relevanz jener Ereignisse und ihre wahrscheinliche Beziehung bleiben
unklar. Dennoch könnte die Blockade des Wnt-Pathways in Zukunft zu neuen
Behandlungsstrategien bei Lungenkrebs führen (Mazieres et al. 2005).
Um den Mechanismus von Wif1 zu klären, der für das Silencing von
Lungentumoren sorgt, wurde der menschliche Wif1-Promotor identifiziert und der
Methylierungsstatus der CpG-Inseln untersucht. Anhand methylierungsspezifischer
PCR und Sequenzanalysen nach Bisulfidbehandlung demonstrierten Mazieres et al.
eine häufige CpG-Insel-Hypermethylierung im funktionellen Wif1-Promotor-Gebiet
(Mazieres et al. 2004). Diese Hypermethylierung korrelierte mit seinem
transkriptionellen Silencing (Schweigen) in menschlichen Lungenkrebs-Zelllinien.
Außerdem stellte die Behandlung mit 5-aza-2'-Deoxycytidin die Wif1-Expression
wieder her. Weiterhin konnte in 15 (83%) von 18 frisch resezierten Lungentumoren
eine Herunterregulierung der Wif1-Expression gezeigt werden. Dieses Silencing
korrelierte mit der Wif1-Promotor-Methylierung (Mazieres et al. 2004).
In intestinalen Adenomen wurde eine, verglichen zu normalen epithelialen Zellen
von APC (Min.n / +) Mutant-Mäusen, erhöhte Expression von Opg-, Ctse-, Krt2-4-,
Fut-2-, 24p3- und Wif1-Genen gefunden. Eine Wif1-Expression konnte auch in
mehreren
Tumor-Zelllinien
epithelialer
Abstammung
einschließlich
zweier
menschlicher Kolon Adenokarzinom-Zelllinien nachgewiesen werden (Cebrat et al.
2004).
In einer Untersuchung an Mäuse-Großhirnen zur Charakterisierung von WntAntagonisten der Dkk-Familie waren nur dkk1 und dkk4, zusammen mit den zwei
anderen Antagonisten Axin2 und Wif1, an einem Feedback-Mechanismus beteiligt
(Diep et al. 2004). Dieser Feedback-Mechanismus verhindert in transgenen Mäusen,
die eine bedingte Vermehrung von β-Catenin in ihrem Großhirn aufweisen, die WntSignale (Diep et al. 2004).
26
Der Zusammenhang zwischen der Wnt-Signalkaskade und dem Akt (Protein Kinase
B)-Pathway in Prostatatumoren ist bisher noch unklar. Wif1 reguliert den AktPathway herunter (Ohigashi et al. 2005). Hierdurch konnte die Chemosensitivität in
PTEN-Null-Zellen (Zellen ohne PTEN-Suppressorgen) erhöht werden, man
erreichte dies durch einen Transfer von Wif1 in PC-3 (von Knochenmetastasen
stammende)- und DU145 (von Gehirnmetastasen stammende)-Pca-Zellen, die
Charakteristika des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms zeigen. Als Resultat fand
man eine Akt-Phosphorylierung in PTEN-Null-PC-3-Zellen und eine zu geringe
Phosphorylierung in PTEN-exprimierten DU145-Zellen (Ohigashi et al. 2005). Der
Phosphorylierungsgrad von Akt in Wif1-überexprimierten PC-3-Zellen war
niedriger als der in nativen Zellgruppen oder Kontrollgruppen mit Vektorübertragenen PC-3-Zellen. Wif1 zeigte dabei eine zusätzliche Hemmung bei bereits
reduzierter Akt-Aktivität in DU145-Zellen (Ohigashi et al. 2005). Eine
Überexpression von Wif1 resultierte in einer Sensibilisierung von PC-3-Zellen für
Paclitaxel und veranlasste so eine Apoptose. DU145-Zellen waren empfindlicher für
Paclitaxel, allerdings wurden sie nicht durch Wif1 beeinflusst. Der PI3K-Inhibitor
LY294002 schien die Chemosensitivität nativer PC-3-Zellen wiederherzustellen,
genauso wie Wif1 es tat (Ohigashi et al. 2005). Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Wnt-Nachrichtenübermittlung in die Akt-Aktivierung der Pca-Zellen involviert ist.
Des Weiteren zeigen diese Daten die Möglichkeit auf, Wnt und seinen Pathway für
therapeutische Ziele bei PTEN-veränderten Pca-Zellen zu verwenden (Ohigashi et
al. 2005).
Wissmann et al. führten eine Chip Hybridisierung durch, bei der sie das
Expressionslevel
von
40
Genen
des
Wnt-Pathways
bei
54
primären
Prostatakarzinomen analysierten (Wissmann et al. 2003). Elf Gene zeigten in
mindestens 10% der Prostatatumoren eine mehr als doppelt so hohe Expression.
Während sFRP4, FZD4, FZD6, Dvl1, TCF4 und MYC hoch reguliert waren, waren
Wif1, Wnt2, PPP2CB, CCND2 und CD44 bei bestimmten Prostata-Krebs-Patienten
runterreguliert. Die signifikantesten Veränderungen in der Expressionsabweichung
der RNA-Niveaus zeigten Wif1 und sFRP4. In 64% der primären Prostatatumoren
zeigte sich eine Herabregulierung des Wif1, während sFRP4 bei 81% der Patienten
hochreguliert war. Immunohistochemische Analysen, die einen polyklonalen
Antikörper verwendeten, deckten eine starke zytoplasmatische perinukleäre Wif127
Expression in normalen epithelialen Zellen der Prostata, der Brust, der Lunge und
der Harnblase auf. Eine starke Verminderung der Wif1-Protein-Expression wurde in
23% der Prostatakarzinome, in 60% der Brusttumoren, in 75% der NSCLC und in
26% der analysierten Blasentumoren gefunden. Keine bedeutende Assoziation
zwischen der Wif1-Herunterregulation und dem Tumor-Stadium oder -Grad wurde
für die Prostata, die Brust oder NSCLC beobachtet. In Blasentumoren korrelierte die
Wif1-Runterregulation mit höheren Tumor-Stadien (pTa gegen pT1-pT4; p = 0.038)
(Wissmann et al. 2003).
28
3.3.2 Das Onkogen Rab34
3.3.2.1 Übersicht
Eines der Kennzeichen von eukaryontischen Zellen ist der interzelluläre vesikuläre
Transport. Die Vesikel tragen verschiedene Moleküle und Signalmoleküle wie
Lipide und Proteine durch die Zelle. Rab34 gehört der Gruppe der Ras-Gene an.
Rab-GTPasen
sind
Ras-ähnliche
GTP-bindende
Proteine
mit
kleiner
Molekularmasse, die in verschiedene Stufen entlang exozytischer und endozytischer
Pathways involviert sind (Chen et al. 2003). Ursprünglich wurde die partielle cDNA
für Rab34 als Rah (ras-related homolog) identifiziert (Wang u. Hong 2002).
Ras-Gene sind Onkogene, sie umfassen eine Gruppe von Protoonkogenen (H-Ras,
K-Ras, K-RasB, N-Ras), die für G-Proteine kodieren. Die heute bekannten mehr als
50 Protoonkogene können aufgrund der Funktion der Produkte, für die sie kodieren,
eingeteilt werden in:
1) Wachstumsfaktoren
2) Wachstumsfaktor-Rezeptoren
3) G-Proteine
4) Nichtrezeptor-Proteinkinasen (Tyrosinkinasen, Serin-/Theoninkinasen)
5) nukleäre Proteine, Transkriptionsfaktoren
6) tumorspezifische Chomosomenrearrangements
7) virale Onkogene (Roche Lexikon 2003).
Eine Reihe von onkogenen Mutationen von Effektoren des Zytoplasmas (und der
anderen Effektoren) ist bekannt. Diese Mutationen bewirken wie bei den onkogenen
Rezeptoren häufig eine Aktivierung der entsprechenden Proteine, welche zu deren
Intensivierung gegenüber regulatorischen oder inhibitorischen Faktoren führen oder
in deren subzellulärer Umverteilung resultieren. Durch diese Veränderungen kommt
es zu einer konstitutiven Aktivierung von Molekülen, welche weiter unterhalb in der
Signalübertragungskaskade gelegen sind, und führen zu einer zumindest teilweisen
Entkoppelung der entsprechenden Signalwege von regulatorischen Einflüssen, die
über Rezeptoren in die entsprechende Zelle weitergeleitet werden. Mutationen von
Ras sind die am häufigsten vorkommenden Mutationen eines einzelnen Onkogens
(Schmoll et al. 2005).
29
3.3.2.2 Rab-Proteine
Rab-Proteine gehören zu den am frühesten identifizierten Proteingruppen, die die
Membrananhaftung und -fusion kontrollieren. Rab-Proteine sind kleine GuaninNukleotid-bindende Proteine. Sie repräsentieren mit mehr als 60 Proteinen die
größte der sog. Ras-ähnlichen kleinen GTPase-Familie vor allem in Säugetierzellen
und sind bislang in allen eukaryontischen Organismen gefunden worden. Von den
isolierten und charakterisierten Rab-Proteinen (inklusive Isoformen) scheinen elf
Rab-Proteine eine Rolle im endozytotischen Pathway zu spielen (Chen et al. 2003).
Die Rab-Proteine regulieren die Transportwege durch die Membran, indem sie als
molekulare Schalter zwischen der aktiven (GTP-gebundenen) und der inaktiven
(GDP-gebundenen) Form agieren, welche durch zusätzliche Faktoren wie GAPs
(GTPase activating proteins), GEFs (Guanosine exchange factors) und GDIs (GDP
dissociation inhibitors) reguliert werden. Im aktiven Status erfüllen Rab-Proteine
ihre Funktion bei der Vesikelformation, Bewegung von Organellen sowie
Membranspaltung und -fusionen durch die Rekrutierung von Effektor-Proteinen
(Chen et al. 2003).
In Rab-Proteinen sind verschiedene Moleküle spezifisch lokalisiert und regulieren
über unterschiedliche Pathways die Endo- und Exocytose. Sie regeln viele
biologische Mechanismen, von der Freisetzung von Neurotransmittern über die
Entwicklung von Intelligenz bis hin zu Befruchtung und Knochenwachstum (Chen
et al. 2003). Rab-Proteine bestimmen als Signal das Zustandekommen, das
Andocken und die Verbindung von intrazellulären Räumen. Die Proteine selbst
unterliegen verschiedenen Kontrollmechanismen, inklusive den Vorgängen bei der
Expression, Lokalisation und Aktivierung.
Bekannte Krankheits-Beispiele für Mutationen in Rab-GTPasen oder den mit ihnen
interagierenden Proteinen sind immunologische- und Pigmentstörungen wie das
Griscelli-Syndrom, mentale Retardierung, Neuropathie (Charcot-Marie-Tooth),
Nierenkrankheiten
und
Blindheit.
In
vielen
vaskulären,
Lungen-
und
Schilddrüsenerkrankungen sowie in einigen Krebsarten wurde die Überexpression
von Rab-GTPasen gemessen und korrelierte mit der Stärke des Krankheitsverlaufes.
30
3.3.2.3 Struktur von Rab34/Ras-related protein
RAB34 (Ras-related protein Rab34; Ras-verwandtes Protein Rab34) trägt als
Synonyme die Bezeichnungen RAH, RAB39, Rab-39 und Ras-related protein (siehe
Abbildung 8). In den folgenden Texten werden die Bezeichnungen je nach zitierter
Quelle verwendet.
Abbildung 8 (englisch): Rab34 physical map; location 17q11.1 (Internet: Geneatlas - Database)
Man findet Rab34 sowohl beim Menschen (Homo sapiens), als auch bei der Maus
(Mus musculus) und beim Zebrafisch (Danio rerio).
Rab34 ist auf Chromosom 17q11.1 lokalisiert und umfasst die Abschnitte 54 bis
213, während Rab39 auf Chromosom 11q22-q23 lokalisiert ist und die Abschnitte 8
bis 178 umfasst. Obwohl beide Gene auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert
sind, scheint Rab39 eine kurze splice-Variante von Rab34 zu sein. Zu dieser
Annahme kamen Chen at al. (2003), indem durch Druckwellenanalyse von Rab39cDNA und Proteinsequenz mit Homologen Rab39 als eine mögliche Variante von
Rab34 detektiert wurde. Auch innerhalb der Literatur wird Rab39 synonym zum
Begriff Rab34 verwendet, da beide Gene eine hohe Homogenität aufweisen. Die
höchste Homogenität zeigt Rab39 mit dem Rah/Rab34-Protein der Maus und dem
menschlichen Rab34 an der N-terminalen Aminosäure 192 (>95% Identität), welche
in den Membranausstülpungen lokalisiert und in die Mikropinosomen-Formation
involviert ist (Chen et al. 2003).
31
3.3.2.4 Rab39
In voller Länge umfasst die cDNA von Rab39 1251 Basenpaare mit einem
kompletten ORF (open reading frame) von 636 Basenpaaren Länge, welcher
potentiell ein 211 aa (amonoacid; Aminosäure, AS)-Rest-Protein mit einem
berechneten Molekulargewicht von 23,7 kDa verschlüsselt (Chen et al. 2003).
Rab39 besitzt genaufwärts des ORF ein innerhalb des Leserahmens liegendes
Stopcodon und ATTAAA-übereinstimmende Sequenzen, sowie einen PolyadenosinSchwanz an seinem 3´-Ende. Somit scheint die cDNA in ihrer vollen Länge isoliert
worden zu sein (Chen et al. 2003).
Beim Vergleich von Homologen zeigte das Rab39-Protein drei Phosphat/Mg2+bindende Motive (59-67, 85-87 und 107-113 AS) und zwei Guanosin-bindende
Motive (122-124 und 165-170 AS). Weiterhin konnten drei Proteinkinase-CPhosphorylisierungs-Abschnitte (167-169,
199-201
und
208-210
AS),
ein
Caseinkinase II Phosphorylisierungs-Abschnitt (167-170 AS), ein Tyrosin
Phosphorylisierungs-Abschnitt (75-80 AS), ein Myristoyl-Abschnitt (99-104 AS),
ein ATP/GTP- bindendes Motiv (60-67 AS) und ein C-terminales Microbody
(Mikrokörper) Zielsignal (209-211 AS) aufgezeigt werden (Chen et al. 2003).
Rab39 enthält konservierte Motive, welche bei der Phosphat/Guanosin-Bindung und
einem Microbody-C-Terminal als Signal eine Rolle spielen (Chen et al. 2003). Aus
diesem Grund scheint Rab39 als neues Rab-Protein in den Proteintransport unter
Regulierung von Kinasen involviert zu sein (Chen et al. 2003).
Vorkommen von Rab39
Ein Rab39-Vorkommen konnte sowohl in der DC (Dünnschichtchromatographie)
als auch in verschiedenen hämatologischen Leukämie-Zelllinien detektiert werden.
Auch in den meisten epithelialen Tumorzellen fand man eine Rab39-Expression
(Chen et al. 2003). Ein verstärktes Vorkommen von Rab39 fand man in der Leber,
während es in der Milz, dem Kolon, dem Herzen, der Plazenta, der Lunge, dem
Skelettmuskel und in den Nieren nur moderat ausgebildet war. Eine niedrige
Expression wurde in der Prostata, den Testes, den Ovarien, im Dünndarm, in den
peripheren Blut-Leukozyten (PBL) und im Pankreas gefunden. Rab39 konnte in
HeLa-S3-Zellen, in Lungenkarzinom-Zellen A549, in Melanom-G361-Zellen und
NIH3T3-Zellen (permanente Fibroblastenzelllinie aus Mausembryonen) detektiert
32
werden (Chen et al. 2003). Man findet Rab39 hauptsächlich in epithelialen Zellen
(Chen et al. 2003).
Subzelluläre Lokalisation von Rab39
Rab39-GFP (C-terminal) ist vorzugsweise im Zytosol lokalisiert, in manchen Fällen
auch im Nukleus, während GFP-Rab39 (N-terminal) komplett im Zytosol zu finden
ist. GFP- Rab39 wurde vor allem in perinukleären Strukturen und kolokalisiert mit
Golgi-assoziierten
Organellen
gefunden,
wie
anhand
gelber
Overlays
in
Fluoreszenzbildern in HeLa-Zellen und NIH3T3-Zellen demonstriert werden
konnte. Zellen, auf welche nur pGFP (phosphorylated GFP) übertragen wurde,
zeigten sowohl im Zytolasma als auch im Nukleus eine Fluoreszenz, welche keine
Übereinstimmung mit den BFA (Brefeldin A)-positiven Golgi-verwandten
Organellen zeigte. Auch bei der Überprüfung des Rab39 mittels konfokaler
Mikroskopie lässt die subzelluläre Lokalisation darauf schließen, dass Rab39 mit
Golgi-verbundenen Organellen assoziiert ist (Chen et al. 2003). Eines der
Charakteristika der Rab-Proteine ist ihre Bindung an GTP und die Hydrolisierung zu
GDP, welche zu einer Regulierung der Vesikel-Knospung und des Fusionsprozesses
führt.
3.3.2.5 Rab34 und seine Interaktion mit dem Golgi-Apparat
Der Golgi-Apparat übernimmt neu hergestellte Proteine aus dem Endoplasmatischen
Retikulum (ER), modifiziert ihre Oligosaccharide, sortiert die Proteine und
versendet sie aus dem trans-Golgi-Netz zur Plasmamembran, den Lysosomen oder
sekretorischen
Vesikeln.
In
allen
eukaryontischen
Zellen
schnüren
sich
Transportvesikel ständig vom trans-Golgi-Netz ab und verschmelzen mit der
Plasmamembran (konsekutive Exozytose); der Golgi-Apparat bringt Plasmalipide
und -proteine zur Zelloberfläche und entlässt im Prozess der Sekretion Moleküle aus
der Zelle. Spezialisierte sekretorische Zellen verfügen zusätzlich über einen
geregelten exozytotischen Ausscheidungsweg, in dessen Verlauf Moleküle, die in
sekretorischen Vesikeln gespeichert werden, von der Zelle nur nach Empfang eines
Sekretionssignals durch Exozytose freigesetzt werden. Durch Endozytose nehmen
Zellen
Flüssigkeit,
Moleküle
und
kleinere
Partikel
auf;
Bereiche
der
Plasmamembran stülpen sich ein und schnüren sich unter Bildung von
endozytotischen Vesikeln ab. Der größte Teil des endozytierten Materials wird erst
33
den Endosomen und dann den Lysosomen übergeben, wo es von hydrolytischen
Enzymen
verdaut
wird.
Die
meisten
Bestandteile
der
endozytotischen
Vesikelmembran werden jedoch zur Wiederverwendung in Transportvesikeln zur
Plasmamembran zurückgebracht (Alberts et al. 1999).
Wang et al. wiesen in ihren Studien die Assoziation von Rab34 mit dem GolgiApparat nach. Expression des Wild-Typs oder GTP-gebundenen aber nicht GDPgebundenen Versionen von Rab34 verursachen Raumneuverteilungen von
Lysosomen von der Peripherie bis in das peri-Golgi-Gebiet (Wang u. Hong 2002).
Vermittelt durch Prenylation (Isoprenrest) und seine direkte Wechselwirkung mit
dem RILP (Rab-interacting lysosomal protein) hängt die Regulierung lysosomaler
Positionierung durch Rab34 von seiner Assoziation mit der Membran ab. Diese
biologische Aktivität, vermittelt durch die Rab34-RILP Wechselwirkung, ist
abhängig vom Lysin an der Position 82 in der switch (Schalt)-I Region (Wang u.
Hong 2002).
Diese Ergebnisse beweisen die Existenz von regulatorischen Pathways innerhalb des
Golgi-Apparates, die zur Modulierung der räumlichen Positionierung von sonst
entfernt gelegenen Lysosomen führen. Dennoch ist der genaue Mechanismus bis
heute nicht bekannt.
Die Makropinozytose ist ein effizienter Mechanismus in der Nährstoffaufnahme und
bei der Lösung von Makromolekülen. Makropinosomen werden aus Ausstülpungen
der Zelloberfäche gebildet und wandern, (v. a. in Fiboblasten) von Aktin umgeben,
zum Zellzentrum ab (Sun et al. 2003). In Untersuchungen zur Makropinozytose
wurde die komplette codierende Sequenz von Rah/Rab34 geklont. Dabei konnte
eine merkliche GTPase Tätigkeit in vivo gezeigt werden, obwohl der Wild-Typ Rah
in vitro eine äußerst niedrige GTPase-Aktivität aufwies (Sun et al. 2003). Es konnte
eine teilweise Koexistenz von Rah und Rab5 gezeigt werden, vor allem Rah konnte
bei der Bildung der Makropinosomen gefunden werden, wohingegen Rab5 in
späteren Stadien der Endosomen anwesend war (Sun et al. 2003).
Des Weiteren konnte die Bildung von Makropinosomen durch die Behandlung des
von Thrombozyten hergeleiteten Wachstumsfaktors PDGF (plateled-derived growth
factor) oder Phorbolester (karzinogen wirksame Diterpene in pflanzl. Öl, z.B.
Crotonöl) durch Rah erleichtert werden, wurde aber durch einen dominant-negativen
34
Rah unterdrückt (Sun et al. 2003). In den Untersuchungen von Sun et al. zeigte sich
auch durch die dominant-negativen Mutanten von Rac1 und WAVE2 eine
Verzögerung bzw. Hemmung der Rah-geförderten Makropinosombildung, die für
das Membranenzerzausen wesentlich ist (Sun et al. 2003). Diese Ergebnisse deuten
an, dass Rah/Rab34 für die effiziente Bildung von Makropinosomen aus der
Membranoberfläche erforderlich ist.
3.3.2.6 Rab34 und RILP (Rab-interacting lysosomal protein)
Innerhalb des Vesikel- und Membrantransportes scheint das Rab-interacting
lysosomal protein (RILP) eine wichtige Rolle als interaktiver Dimerisationspunkt zu
spielen und steht somit im Zusammenhang mit effektiven Wechselwirkungen bei der
Entstehung und Verteilung der Lysosomen.
Während der Regulation der lysosomalen Morphologie findet man die kleinen
GTPasen Rab7 und Rab34 und über einen gemeinsamen Effektor ihre Interaktion
mit RILP (Wang et al. 2004, Colluci et al. 2005). RILP ist ein bekannter Effektor
von Rab7 und Rab34. Rab GTPasen und ihre Effektoren sind Schlüsselfaktoren in
der Regulation des Membranverkehrs. Tatsächlich organisieren Rab-Proteine
verschiedene
Proteinkomplexe
innerhalb
einzelner
Vesikel/Organellen
und
regulieren alle Stadien des Vesikeltransportes. Verschiedene Rab-Proteine scheinen
in die Bewegung von Vesikeln/Organellen verwickelt zu sein. Sie sind oftmals
assoziiert mit spezifischen Mikrotubuli- oder Aktin-Motorkomplexen (Colluci et al.
2005).
3.3.2.7 LDR (low dose radiation)-Abhängigkeit von Rab34
Es wurden weiterhin Studien über LDR (low dose radiation; niedrige Strahlendosis)abhängige Expressionsmuster onkogener Signalvermittlung im Muskel, in der Leber
und in der Milz von Mäusen durchgeführt, welche anfällig für akute und chronische
LDR-Exposition sind (Besplug et al. 2005). Analysen der Genexpression von
Wachstumsfaktoren
und
Wachstumsfaktor-Rezeptoren,
zytoplasmatischen
Serin/Threonin Protein Kinasen, G-Proteinen und DNA-bindenden Kernproteinen,
sowie anderen wichtigen Bestandteilen der onkogenen Signalvermittlung wurden
erstellt (Besplug et al. 2005).
Als Ergebnis zeigten sich sexual- und gewebespezifische Änderungen in der
Expression von Mitgliedern der Ras Superfamilie (N-Ras, Rab2, Rab34, Vav2),
35
Protein Kinase C (PKC) Isoformen (PKCβ, PKCmu), AP 1 Faktor-Komponenten
(Jun, JunB und FosB), Wnt signalisierenden Pathway-Mitgliedern sowie in vielen
anderen zellulären Protoonkogenen und Onkogenen. Wesentlich unterschiedliche
Protein-Niveaus wurden in allen drei Geweben (Muskel, Milz und Leber) akut und
chronisch bestrahlter weiblicher und männlicher Tiere beobachtet (Besplug et al.
2005).
36
4. Material
4.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
123bp-Marker
Invitrogen, Karlsruhe
Agarose (electrophoresis grade; Unit 500)
Invitrogen, Karlsruhe
Chloroform 70 %
Merck, Darmstadt
DEPC-Wasser (Aqua ad injectabilia Braun),
B. Braun Melsungen AG
Wasser mit Diethyl Pyrocarbonat behandelt
Einmalkanülen, BD Microlance 3
BD Becton Dickinson, Heidelberg
Einmalspritzen Inject, Solo,
B. Braun Melsungen AG
5 ml, Innendurchmesser: 8 mm
Eppendorf Reaktionsgefäße:
Eppendorf, Hamburg
- 0,5 ml, Safe lock
- 1,0 ml, 1,5 ml Standard Micro Test Tubes 3810
Erlenmeyerkolben (Duran Jenaer Glas)
Schott, Mainz
Ethanol, absolut
Riedel-de Haen, Seelze
Ethidiumbromid (EtBr) 1 %
Carl Roth, Karlsruhe
Filter tip Pipettenspitzen,
Greiner Bio-One, Frickenhausen
RNAse-frei, 10 E, 100, 1000 (g)
H2O2 (30 %)
Acros Organics, Geel, Belgien
H2O dest.
Milli-Q Anlage, Millipore,
Schwalbach
Optical caps, Qty: 300 strips
AB Applied Biosystems,
Part No: 4323032
Darmstadt
Optical reaction plate, 96 well; code 128,
AB Applied Biosystems,
Qty: 20; Part No: 4306737
Darmstadt
QIAzol Lysis Reagent
Qiagen, Hilden
Kat. Nr. 74804 and 75842
4.2 Geräte
ABI PRISM 7700 Sequence Detector
Applied Biosystems, Darmstadt
+ Power Macintosh G3
Biofuge (max. 13000 UpM)
Heraeus Instruments, Hanau
Camera Transilluminator
Stratagene, La Jolla, USA
37
Eppendorf Reference Pipette:
Eppendorf, Hamburg
- 0,5-10 µl
- 10-100 µl
- 50-250 µl
- 1000 µl
Gene Quant II RNA/DNA Calculator
Pharmacia Biotech, Freiburg
+ DPU-411 Thermal Printer
Gradient Cycler, PTC-200 Peltier T C
MJ Research, Waltham, USA
Horizontal Gel Elektrophoresis System
Biometra, Göttingen
(HORIZON 11.14) mit Gelschlitten + Kamm
Kühlschrank
Liebherr, Ochsenhausen
Kühlzentrifuge, Biofuge fresco
Heraeus Instruments, Hanau
Mikromörser und Stößel G3 (H = 50mm)
Carl Roth, Karlsruhe
Mikrowelle Micromat-Duo
AEG, Nürnberg
Savant Speed Vac Concentrator
Thermo Fisher Scientific,
Langenselbold
Tiefkühltruhe HERA freeze (-80 °C)
Heraeus Instruments, Hanau
Tischmischer VF2 Vortex
Janke & Kunkel IKA
Labortechnik, Staufen
Waage CS 200
Ohaus Corporation USA
4.3 Kits
Omniscript RT Kit (50)
Qiagen, Hilden
Kat. Nr. 205111
200 Units
Omniscript Reverse Transcriptase
150 µl
Buffer RT, 10x
100 µl
dNTP Mix, 5 MM each
1,1 ml
RNase-Free Water
QuantiTect SYBR Green PCR Kit (1000) Qiagen, Hilden
Kat. Nr. 204143
25 ml
2 x QuantiTect SYBR Green PCR Master-Mix
20 ml
RNase-Free Water
38
RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (50)
50
Qiagen , Hilden
Kat. Nr. 74804
RNeasy Mini Spin Colums,
jede in einem 2 ml Collection Tube
50
1,5 ml Collection Tubes
50
2 ml Collection Tubes
50 ml
QIAzol Lysis Reagent
45 ml
Buffer RW1
11 ml
Buffer RPE
10 ml
RNase-Free Water
Taq PCR Core Kit (250 U)
Qiagen , Hilden
18,8 µl
Distilled water
1,2 ml
Qiagen PCR Buffer, 10x
1,2 ml
MgCl2, 25 MM
200 µl
dNTP Mix, 10 MM each
250 Units
Taq DNA Polymerase
Kat. Nr. 201223
4.4 Primer
Alle genspezifischen Primer wurden von der Firma Sigma-Genosys, Steinheim
bezogen. Über die Datenbank des National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine, Bethesda, MD USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
wurden die Sequenzen der Zielgene abgerufen.
Bezeichnung
Sequenz
GAPDH forward
5´CTC CTC CAC CTT TGA CGC TG 3´
GAPDH reward
5´ACC ACC CTG TTG CTG TAG CC 3´
β-Actin forward
5´CAT TGC CGA CAG GAT GCA 3´
β-Actin reward
5´CCG ATC CAC ACG GAG TAC 3´
Wif1 forward
5´CGA TGC TCA CCA GGC AAG A 3´
Wif1 reward
5´GCT GGC ATT CTC TGT TGC G 3´
39
Rab34 forward
5´AGG AAG GAG GCC GCT TTG CA 3´
Rab34 reward
5´CAA GTC TTC CCC ACC GAC AC 3´
Oligo (dT18)-Primer für den Master-Mix
Operon, Köln
4.5 Medien und Puffer
Tris-Eisessig-EDTA Puffer, 0,5 M EDTA, pH 8,0
Sigma, Seelze
Ladepuffer für PCR, Kat. Nr. 36097401090
Applied Biosystems, Foster
City, USA
40
5. Methoden
5.1 Probenpräparation für die PCR
5.1.1 Materialgewinnung
Alle verwendeten Tumorproben stammen aus intraoperativ entnommenen Proben
von Patienten, die in den Jahren 2002 bis 2005 in der Neurochirurgie des
Universitätsklinikums Marburg operativ behandelt wurden. Insgesamt wurden 51
Tumorproben untersucht, hierunter waren 36 Proben von männlichen und 15 von
weiblichen Patienten. Das mediane Alter der Patienten lag bei 54 Jahren
(Altersspanne: 6 bis 79 Jahre).
Sofort nach ihrer Entnahme wurden die Tumorproben in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bis zu ihrer Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
Weiterhin erfolgte durch das Institut für Neuropathologie des Universitätsklinikums
Marburg eine histologische Bestimmung der Proben nach der WHO-Klassifizierung
in Astrozytome der Grade II, III und IV, den Glioblastomen. Des Weiteren wurde
eine Gruppe mit rezidivierenden Glioblastomen gebildet, das heißt denjenigen
Tumoren, die mit Chemotherapie und Radiatio vorbehandelt waren (siehe Tabelle
4). Die Chemotherapie mit ACNU/VM26 (Nitrosoharnstoff in Kombination mit
einem halbsynthetischen Epipodophyllotoxinderivat) wurde möglichst parallel zur
Bestrahlung mit 60 Gy (fraktioniert) und zunächst für ein halbes Jahr mit
regelmäßigen Nachuntersuchungen alle sechs Wochen durchgeführt.
Als Referenz diente ein pilozytisches Astrozytom WHO-Grad I.
Tabelle 4: Verwendete Tumorproben und ihre histologische Einordnung
Histologische Einordnung
nach WHO
Astrozytom Grad II
Astrozytom Grad III
Glioblastom
Glioblastom-Rezidiv
Verwendete Proben
67/02, 08/04, 58/04, 11/05, 18/05
63/02, 21/03, 37/03, 65/03, 75/03, 96/03,
121/03, 137/03, 87/04, 78/05, 89/05, 45/06
37/02, 64/02, 124/02, 01/03, 17/03, 27/03,
29/03, 35/03, 68/03, 76/03, 103/03, 03/04,
60/04, 10/05, 44/05, 74/05, 79/05, 80/05,
83/05, 103/05, 119/05, 33/06, 51/06
28/03, 36/03, 51/03, 54/03, 74/03, 152/03,
153/03, 47/04, 76/04, 04/05, 29/06
Referenz-Probe: 08/03
Die Gruppe der Astrozytome Grad II umfasst 5 Proben, die Gruppe der Astrozytome Grad III 12
Proben, die Gruppe der Glioblastome 23 Proben und die Gruppe der Rezidive 11 Proben;
Gesamtmenge: 51 Tumorproben.
41
5.1.2 Probenpräparation/RNA-Isolierung anhand der „single step“ Methode
Mittels der single-step-Methode ist es möglich, die Gesamt-RNA zu isolieren.
Hierfür sind ein kompletter Aufschluss von Zellwänden sowie Zell- und
Organellmembranen und eine Homogenisation notwenig. Bei der RNA-Isolierung
werden die Zellen zuerst lysiert, die RNasen inaktiviert und die RNA anschließend
isoliert. Auf diese Weise erhält man Gesamt-RNA, das heißt ein Gemisch aus
ribosomaler RNA (rRNA), Transfer-RNA (tRNA), messenger RNA (mRNA) und
anderen RNA-Formen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das RNeasy
Lipid Tissue Mini Kit der Firma Qiagen zur RNA-Isolierung verwendet. Bei der
Aufbereitung wurde nach dem von Quiagen empfohlenen Protokoll vorgegangen.
Chemikalien je Ansatz:
100 mg
Tumorgewebe
1000 µl
Qiazol
200 µl
Chloroform
600 µl
Ethanol (70%)
700 µl
RW-Puffer
2 x 500 µl
RPE-Puffer
2 x 30 µl
H2O DEPC
190 µl
H2O DEPC
50 µl
Ethanol (100%)
200 µl
H2O dest.
5.1.3 Homogenisierung
Das Homogenisieren der Probe führt zu einem Scheren der genomischen DNA und
zu
einer
Reduktion
der
Viskosität
des
Lysats.
Die
dafür
verwendete
Guanidinisothiocyanat-Lösung (GTC-Lösung) ist ein chaotropes Salz, durch das
RNasen inaktiviert werden, so dass die Isolierung einer intakten RNA gewährleistet
wird.
Als biologisches Ausgangsmaterial werden je 100 mg des tiefgefrorenen Gewebes
von Astrozytomen Grad II, III und Glioblastomen, hierunter primäre Astrozytome
sowie Glioblastom-Rezidive verwendet. Dieses Material wird zunächst in 1 ml einer
GTC-Lösung in Form des Puffers Quiazol aus dem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit
lysiert. Für die Aufbereitung wird ein Stößel verwendet. Hochmolekulare DNA kann
durch 5- bis 10-maliges Aufziehen des Lysats in einer sterilen Einmal-Spritze mit
Kanüle geschert werden bzw. so lange, bis ein homogenes Lysat vorliegt (Qiagen
2003).
42
5.1.4 Phasentrennung
Nach einer Sedimentationszeit von 2-3 min. werden 200 µl Chloroform zu der
homogenisierten Probe hinzugegeben. Dieser Ansatz wird nach Überführung in ein
1,5 ml Eppendorfgefäß 15 sec. lang geschüttelt und für weitere 2-3 min. bei
Raumtemperatur inkubiert.
Während der anschließenden 20-minütigen Zentrifugation bei +4 °C und einer
Rotationseinstellung von 12 000 UpM entsteht eine endgültige Trennung in drei
Phasen:
Entsprechend ihrer Dichte verteilen sich die suspendierten Partikel in eine oberste,
wässrige Phase, die die benötigte RNA enthält. Die größeren DNA-Fragmente
sammeln sich nach der Zentrifugation in der Interphase, welche als mittlerer, weißer
Bereich sichtbar wird, während die unterste, rote Phase aus organischen Substanzen
wie Proteinen besteht.
5.1.5 RNA-Aufreinigung
Nach der Zentrifugation wird die wässrige Phase abpipettiert und in ein neues
Eppendorfgefäß überführt. Ihr Volumen beträgt durchschnittlich 600 µl. 70%iges
Ethanol wird im Verhältnis 1:1 zugegeben. Die Interphase und die organische Phase
werden verworfen.
Unter Zuhilfenahme des RNeasy Lipid Tissue Mini Kit der Firma Qiagen wird nach
dem Auftragen der mit Ethanol versetzten Probe auf die RNeasy Mini-Säule mit
Silicagelmembran diese bei 10 000 UpM für 15 sec. zentrifugiert. Zur möglichst
hohen RNA-Aufreinigung wird des Weiteren 700 µl RW-Puffer auf die Säule
gegeben und bei 10 000 UpM für 15 sec. zentrifugiert. Zum Auswaschen von
Kontaminationen werden 500 µl RPE-Puffer auf die Säule gegeben, für 15 sec. bei
10 000 UpM zentrifugiert und danach weitere 500 µl RPE-Puffer aufgetragen und
für 2 min. bei 10 000 UpM zentrifugiert. Die Gesamt-RNA bindet hierbei an die
Membran, während die übrigen Substanzen ausgewaschen und somit abgetrennt
werden. Nach einer weiteren ein-minütigen Zentifugation bei 14 000 UpM, wird die
gereinigte RNA dann zwei Mal mit 30 µl RNase-freiem Wasser eluiert, indem sie
jeweils bei 10 000 UpM für 1 min. zentrifugiert wird.
Parallel wird in einem Eppendorfgefäß die Probe für die OD-Messung vorbereitet.
Sie besteht aus 10 µl der mit RNase-freiem Wasser eluierten Probe und 190 µl H2O
DEPC (Diethyl Pyrocarbonat).
43
Danach wird die restliche Probe (50 µl) im Verhältnis 1:1 mit 100%igem Ethanol
gefällt, um sie zu konservieren. Nach der Fällung wird die Probe bei -80 °C
eingefroren.
5.1.6 Messung der Optischen Dichte (OD-Messung)
Die OD-Messung dient der Quantitätsüberprüfung der RNA. Hierbei wird die
Absorption der RNA über ein Spektrophotometer (Gene Quant II RNA/DNA
Calculator) bei 260 nm erfasst. Eine Einheit bei 260 nm entspricht einem RNAGehalt von 40 µl/ml.
Für die OD-Messung werden 10 µl der zuvor mit RNase-freiem Wasser eluierten
Probe mit 190 µl H2O verdünnt. Als Referenzprobe dient destilliertes H2O. Mittels
einer Quarzglasküvette mit einem Durchmesser von 10 mm wird zwei Mal die
Absorption bei 260 nm gemessen, um den gewonnenen Mittelwert als Grundlage für
die Berechnung der isolierten RNA-Menge zu verwenden.
OD-Berechnung:
Berechnung des Mittelwertes der beiden gemessenen RNA-Konzentrationen
=> µg/ml totale RNA
µg/ml totale RNA: 1000 = µg/µl totale RNA
µg/µl totale RNA x Eluatmenge = µg totale RNA in der Probe
5.2 Die Standard-PCR
Die Polymerase-Kettenreaktion oder kurz PCR (Polymerase Chain Reaction) ist eine
Methode zur selektiven Vervielfältigung (Amplifikation) bestimmter DNASequenzen, in vorliegendem Fall bestimmter RNA-Sequenzen. Wie bei der
Replikation werden anhand einer Matritzen-RNA durch zwei Oligonukleotide, Hinund Rückprimer, die jeweils dem Strang in 3´→ 5´-Richtung und in 5´→ 3´Richtung komplementär sind, neue RNA-Stränge enzymatisch synthetisiert (siehe
Abbildung 9).
44
Abbildung 9: Amplifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz durch die PolymeraseKettenreaktion (Mülhardt 2002)
Das typische PCR-Programm besteht aus einem Denaturierungsschritt, bei dem
dsDNA getrennt wird, einem Anlagerungsschritt der Oligonukleotide (Annealing)
und einem Verlängerungsschritt (Elongation), bei dem die Polymerase eine
Extension zu neuen Doppelsträngen durchführt. Durch die etwa 35-malige
Wiederholung eines Zyklus kommt es zur exponentiellen Vervielfältigung des
zwischen den Oligonukleotiden gelegenen DNA- bzw. RNA-Abschnittes.
Ursprünglich wurde das PCR-Verfahren für die Amplifizierung von DNAFragmenten beschrieben. Es eignet sich für DNA-Stücke von einigen 100 bis
mehreren
1000
Bp
Länge.
Inzwischen
hat
es
ein
breites
Feld
von
Anwendungsmöglichkeiten, so ist es beispielsweise mit Hilfe der Reverse
Transkription-PCR (RT-PCR) möglich, auch RNA als Ausgangsmaterial zu
verwenden. Hierbei wird isolierte mRNA zunächst mit Hilfe des Enzyms reverse
Transkriptase in cDNA umgeschrieben, welche dann als Ausgangsmatritze für die
Amplifikation dient (siehe Abbildung 10).
45
Abbildung 10: Herstellung spezifischer DNA-Sequenzen ( nach Löffler u. Petrides 2003)
mRN
AAAAA
Hybridisieren mit Oligo-dT;
Herstellen eines DNA-RNAHybrids
mit reverser Transcriptase
AAAAA 3
TTTTT
5
Hydrolyse der RNA durch
Nucleaseaktivität;
Ausbildung
einer Haarnadelstruktur
TTTTT 5
Herstellen eines DNA-Doppelstrangs durch reverse
Transcriptase;
Hydrolyse der Haarnadelstruktur
mit Nuclease S1
3
cDN
5
TTTTT 5
AAAAA
3
5.2.1 Probenvorbereitung für die PCR
Die zuvor bei -80 °C gefrorene RNA-Probe wird bei +4 °C für 30 min. bei
14 000 UpM zentrifugiert. Nach Abnehmen des Überstandes wird die Probe zur
anschließenden Aufreinigung mit 500 µl 70%igem Ethanol aufgefüllt und zur
Entfällung ein weiteres Mal bei +4 °C für 15 min. bei 14 000 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wird erneut abpipettiert, anschließend erfolgt die Eintrocknung und
Niederschlagbildung (Pellet) der RNA in der Vakuumzentrifuge (Speed Vac), um
Ethanolreste zu entfernen.
In einem weiteren Schritt wird der RNA-Niederschlag im Verhältnis 1:5 mit DEPCWasser gelöst. 20 µl davon werden in ein neues Eppendorfgefäß überführt, so dass
eine Konzentration von 4 µg RNA in 20 µl H2O vorliegt. Für die Transkription der
RNA in cDNA werden je 4 µg RNA eingesetzt.
Die Restprobe wird im Verhältnis 1:1 mit 100%igem Ethanol gefällt und
anschließend bei -80 °C tiefgefroren.
46
5.2.2 Transkription der RNA in cDNA
Zunächst wird nach dem Protokoll des Herstellers ein Master-Mix aus dem
Omniscript RT Kit der Firma Quiagen mit dem entsprechenden unspezifischen
Primer angesetzt (pro Probe zwei Ansätze).
Standard-Reaktionsansatz Master-Mix je Probe (einfacher Ansatz):
3 µl
RNase freies H2O
2 µl
Puffer RT, 10 x
2 µl
dNTP-Mix, jeweils 5 MM
2 µl
Oligo (dT18) – Primer, 10 µM
1 µl
Omniscript Reverse Transcriptase
Daraufhin wird jede Probe (20 µl) mit je 20 µl Master-Mix gemischt und kurz
zentrifugiert. Danach werden die Proben für 60 min. bei +37 °C im Thermocycler
inkubiert. Die Proben werden bis zu ihrer weiteren Anwendung bei -20 °C
eingefroren.
5.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Im Anschluss an die oben beschriebene Inkubation wird der PCR-Mix angesetzt.
Die Durchführung erfolgt unter Zuhilfenahme des Taq PCR Core Kit der Firma
Qiagen nach dem Protokoll des Herstellers.
Standard-Reaktionsansatz PCR-Mix je Probe:
18,8 µl
H2O
2,5 µl
Reaktionspuffer, 10 x
0,5 µl
dNTP-Mix, jeweils 10 MM
0,2 µl
Taq DNA Polymerase (zum Schluss hinzufügen)
Die hitzestabile Taq DNA Polymerase ist ein rekombinantes Enzym, das mit einer
3´→ 5´-Exonuclease-Aktivität ausgestattet ist. Durch das im PCR-Puffer enthaltene
MgCl2 wird die Amplifikation spezifischer PCR-Produkte begünstigt.
Auf 1 µl der zuvor synthetisierten cDNA-Probe werden nun 1 µl Vorwärtsprimer
(Primer forward) und 1 µl Rückwärtsprimer (Primer reward) gegeben und
anschließend 22 µl des PCR-Mixes hinzugefügt.
47
Nach der Fertigstellung der PCR-Ansätze werden die Restproben für die
längerfristige Lagerung bei –20 °C eingefroren. Die in ein 0,5 ml Eppendorfgefäß
pipettierten Proben werden für 90 min. in der Programm-Einstellung des β-ActinZyklus im PTC – 200 Gradient Cycler inkubiert (siehe Tabelle 5).
Tabelle 5: Zyklusparameter des Thermocycler-Programmes nach Taq PCR Core Kit (Qiagen
1999)
Versuchsschritte
Zeit (Min.)
Temp. (°C)
Initiale
Denaturierung
3
+94
3-Schritt-Zyklus
Zusatzinformationen
25-35 Zyklen
Denaturierung
0,5-1
+94
Annealing
0,5-1
+50 bis +68
Circa 5 °C unter dem
Tm der Primer
Extension
1
+72
Für PCR-Produkte,
die länger als 1 kb
sind, erhöhen sie die
Extensionszeit um ca.
1 min. pro kb DNA.
Abschließende
10
+72
Extension
Holding
Tm = Schmelztemperatur
+20
5.2.4 DNA-Agarosegel zur elektrophoretischen DNA-Auftrennung
Im Anschluss an die PCR wird eine Agarosegel-Elektrophorese mit dem
Housekeepinggen β-Actin durchgeführt.
Hierfür werden in einem Erlenmeyerkolben 3 g Agarose in 100 ml 1%igem TAEPuffer (Tris-Acetate-EDTA-Buffer) gelöst und in einem Mikrowellengerät unter
mehrmaligem Zwischenstopp mit Schwenken aufgekocht, bis die Agarose gelöst ist
und keine Blasen bzw. Klümpchen mehr sichtbar sind.
Parallel wird ein Gelschlitten zur Anfärbung der DNA mit 10 µl 1%igem
Ethidiumbromid (EtBr) versehen, welches anschließend mit einem Kamm
gleichmäßig verteilt wird. Durch Bindung von EtBr an Nukleinsäuren nimmt die
Intensität der Fluoreszenz-Emission um den Faktor 50 bis 100 zu. Nach Einsetzen
des Kammes auf der Kathodenseite des Gels kann die gelöste Agarose möglichst
blasenfrei in den Gelschlitten gegossen werden, so dass sich nach ca. 45 min. ein
erstarrtes Gel mit Taschen bildet.
48
Sobald die Agarose erstarrt ist, wird der Kamm entfernt und das Gel mit dem
Gelschlitten in eine Elekrophoresekammer gestellt. Dort werden die Geltaschen mit
dem Elektrophoresepuffer TAE aufgefüllt, bis das Gel knapp bedeckt ist, so dass
man später die DNA-Lösungen in die Taschen pipettieren kann.
Zur Dichteerhöhung und Anfärbung der Proben werden nach der abgeschlossenen
PCR jeweils 15 µl der Probe mit 3 µl des Laufpuffers (loading buffer) in einem
Eppendorfgefäß gemischt. Anschließend werden pro Reihe in die erste und die letzte
Kammer des Gels ein 123-bp-Marker (123-Basenpaare-Marker) pipettiert und in die
dazwischen verbleibenden Kammern entsprechend die DNA-Proben. Nun wird für
45 min. eine Spannung von 100 Volt angelegt, so dass sich die DNA entsprechend
ihrer Größe auftrennen kann. Nach ausreichender Auftrennung der DNA wird die
Spannung abgestellt, der Gelschlitten aus der Elektrophoresekammer genommen
und das Gel ohne Gelschlitten unter UV-Licht betrachtet.
Nach dem digitalen Fotografieren und Speichern dieser Ergebnisse wird das Gel
verworfen.
5.3 Das Prinzip der Real-Time PCR
Bei der Real-Time (Echtzeit-) PCR misst man die Entstehung von PCR-Produkten
während der Amplifikation. Hierfür verwendet man den Fluoreszenzfarbstoff
SYBR-Green I, der unspezifisch mit der Doppelstrang-DNA interkaliert und
ungebunden nur eine geringe Eigenfluoreszenz zeigt. Die Anregungswellenlänge
dieses Fluorphosphors liegt bei 470 nm, die Fluoreszenzwellenlänge bei 585 nm.
Sobald der Farbstoff an der doppelsträngigen DNA bindet, fluoresziert er stark. Es
binden sich mehrere Farbstoffmoleküle an einem PCR-Amplikon, so dass der dabei
entstehende Fluoreszenzanstieg gegen die Hintergrundfluoreszenz gemessen werden
kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das ABI Sequence Detection
System 7700 verwendet. Hiermit ist es möglich, zeitgleich 96 Reaktionen zu
untersuchen.
Das Real-time PCR-Gerät ist mit einer UV-Lampe (Ultra Violett Lampe) und einer
CCD-Kamera (Charge-Coupled Device Kamera, Digitalkamera) ausgestattet und
ermöglicht während der laufenden Zyklen einen Überblick über das Geschehen in
den PCR-Reaktionsgefäßen. Durch Hinzufügen des Fluoreszenzfarbstoffes SYBR®
49
Green I (Molecular Probes) zu der PCR-Reaktion kommt es zu einer Interkalierung
des Fluorophors in doppelsträngige DNA, wodurch die Fluoreszenz messbar erhöht
wird (Higuchi et al. 1992, Mülhardt 2002).
Aus der Kombination von PCR-Gerät mit Fluoreszenz-Detektor (spektroskopischer
Detektor), spezifischem Oligonucleotid und FRET entwickelten sich drei mehr oder
weniger ähnliche Nachweismethoden, der sog. TaqMan®, die Molecular Beacons
und die Hybidization Probes (siehe Abbildung 11).
Abbildung 11: Die verschiedenen Nachweismethoden der Real-time quantitative PCR (Mülhardt
2002)
Farbstoffe wie SYBR green I werden unspezifisch in doppelsträngige DNA eingebaut. TaqManSonden und molecular beacons fluoreszieren, wenn das Oligonukleotid von der Polymerase abgebaut
wurde, hybridization probes dagegen, solange beide Oligonukleotide an das Template binden.
Am ältesten und bekanntesten ist das TaqMan-Prinzip (Livak et al. 1995, Mülhardt
2002), welches auch in vorliegenden Versuchen Anwendung fand. Bei dieser
Methode
befinden
sich
Reporter
(Reporter-Fluoreszenz)
und
Quencher
(Fluoreszenz-Löscher) auf demselben Oligonucleotid, vorzugsweise am 5´-und 3´Ende. Die Lichtstärke bei E1 ist gering, solange das Oligonucleotid intakt ist. Durch
die herannahende Polymerase wird dann der Reporter freigesetzt, dadurch steigt die
50
Lichtproduktion bei dieser Wellenlänge an. Proportional zur DNA-Synthese werden
also Reporter-Moleküle freigesetzt und entsprechend steigt die Signalstärke.
Als Prinzip der Quantifizierung wird nicht die absolute Menge an PCR-Produkt
gemessen, sondern man nutzt die Kinetik der PCR-Reaktion aus, da anfangs eine
weitgehend exponentielle Vermehrung der DNA stattfindet, auch wenn diese noch
nicht sichtbar ist. Bei der Akkumulation des Produktes steigen auch störende
Einflüsse, zum einen werden Primer und Nucleotide knapper, zum anderen gehen
Polymerase oder Nucleotide aufgrund der anhaltend hohen Temperaturen kaputt.
Außerdem wird die Reaktion durch die Anhäufung von Produkten wie Pyrophosphat
gehemmt.
All diese Parameter führen zu einer Verlangsamung des Prozesses zu einem linearen
Wachstum, bis es zu einem Stillstand kommt (siehe Abbildung 12).
Abbildung 12: Charakteristika einer Real-Time PCR-Kurve, Fluoreszenz-Signal gegen ZyklenAnzahl aufgetragen (Bustin u. Mueller 2005)
Gezeigt werden die Kurven von drei Proben, welche in doppelter Ausführung den Real-time PCRZyklus durchlaufen. Die Pfeile markieren die Ct-Werte und repräsentieren die Zyklusfraktionen, bei
denen das Gerät zuerst zuverlässig eine Fluoreszenz detektieren kann (hergeleitet aus der
Amplifikations-Reaktion). Während der initialen Zyklen der PCR liegt das Fluoreszenzsignal
unterhalb des Schwellenwertes des Gerätes und definiert die Grundlinie für den Amplifikations-Plot
(Anschlag). Ein Anstieg der Fluoreszenz oberhalb dieses Schwellenwertes zeigt die Ermittlung eines
akkumulierten PCR-Produktes an. Der Ct-Parameter ist definiert als die minimale Zyklen-Anzahl der
Proben, bei welcher die Fluoreszenz einen fixierten Schwellenwert durchläuft. Ein Anschlag der
Aufzeichnung der anfänglichen Zielkopie-Zahl für eine Reihe von Standards gegen Ct bildet eine
Gerade. Durch die Messung des Ct und die Verwendung der Standardkurve wird der Betrag des Ziels
in einer unbekannten Probe gemessen, um so die Startkopie-Zahl zu bestimmen.
51
Aus diesem Grund nimmt man als Richtwert die Zykluszahl, bei der sich das
Fluoreszenzsignal gerade deutlich vom Hintergrund abhebt (Ct-Wert), weil zu
diesem Zeitpunkt die Vermehrung noch exponentiell ist.
Parallel amplifiziert man bekannte Templatemengen und vergleicht die Ct-Werte der
entsprechenden Templatemengen. Aus diesen Werten lässt sich eine Standardkurve
erstellen, aus der sich aus einem Ct-Wert auf die Templatemenge schließen lässt.
5.3.1 Etablierung der Standardkurve
Um ein geeignetes Protokoll für die Real-Time PCR zu etablieren, ist es notwendig,
zunächst eine Standardkurve zu erstellen, die die Bedingungen zur Durchführung
der Delta Delta Ct-Methode erfüllt. Hierfür verwendet man die genspezifischen
Primer, sowie die Housekeepinggene GAPDH und β-Actin.
Voraussetzung für die Etablierung der Standardkurve ist eine Primertestung.
Außerdem muss die richtige Annealing-Temperatur (Anlagerungs-Temperatur)
entsprechend der Schmelztemperatur (Tm) ermittelt werden. Hierzu führt man eine
Gradienten-PCR durch, bei der die individuelle Temperatur gewählt werden kann.
Zusätzliche Voraussetzung ist eine Probe, die aufgrund ihrer ausreichenden cDNAMenge und der Vergleichbarkeit mit den anderen zu messenden Proben als
Kalibrator verwendet werden kann. Als Referenz wird ein Pilozytisches Astrozytom
mitgeführt, dessen cDNA wie folgt in sieben Schritten verdünnt wird:
1
9 µl cDNA
1:5
4 µl cDNA + 16 µl H2O
1:10
10 µl cDNA (1:5) + 10 µl H2O
1:50
5 µl cDNA (1:10) + 20 µl H2O
1:100
13 µl cDNA (1:50) + 13 µl H2O
1:200
14 µl cDNA (1:100) + 14 µl H2O
1:400
14 µl cDNA (1:200) + 14 µl H2O
1:500
16 µl cDNA (1:5) + 4 µl H2O
Für den Ansatz einer 96 Mikrotiter-Platte wird anschließend ein Master-Mix aus
dem QuantiTect SYBR Green PCR Kit (200) erstellt.
52
Standard-Reaktionsansatz pro Vertiefung (Well):
12,5 µl
SYBR Green I
10,0 µl
RNase-Free Water (RNase-freies Wasser)
0,75 µl
Primer 1 (Primer forward)
0,75 µl
Primer 2 (Primer reward)
24 µl des entsprechenden Master-Mixes werden pro Vertiefung vorgelegt, erst dann
wird 1 µl cDNA hinzupipettiert.
Insgesamt wird jeweils ein Master-Mix für die Housekeepinggene GAPDH und βActin, sowie für den genspezifischen Primer angesetzt. Entsprechend der sieben
cDNA-Verdünnungen wird für jede Verdünnung jeweils ein Master-Mix verwendet,
so dass die Platte anhand des ABI PRISM 770 Sequence Detectors entsprechend der
Schmelztemperatur des jeweiligen spezifischen Primers bemessen werden kann.
Die Auswertung der Standardkurve erfolgt durch die Berechnungen des ComputerProgrammes cdf (Cyberspace Description Format), Applied Biosystems.
5.3.2 Etablierung und Auswertung der Schmelzkurve
Um den Erfolg der Real-Time PCR zu bestätigen, erfolgt die Messung der
Schmelzkurve. Hierbei werden die PCR-Produkte bei kontinuierlicher Aufheizung
der einzelnen Vertiefungen bei +95 °C gemessen, das heißt bis sie, ihrem
Schmelzpunkt entsprechend, nur noch als Einzelstrang vorliegen. Die damit
verbundene Fluoreszenzabnahme wird aufgezeichnet, kleinere Fragmente weisen
einen niedrigeren Schmelzpunkt als die spezifischen PCR-Produkte auf.
In der Regel wird die Schmelzkurve nach Beenden des Laufes der Standardkurve
erstellt, um zu kontrollieren, ob die PCR-Produkte bei dem angegebenen
spezifischen Wert, also der Schmelztemperatur des jeweiligen Primers einen DNADoppelstrang gebildet haben, oder ob sich eventuell vor allem bei niedrigen
Temperaturen Primer-Dimere gebildet haben.
Für diese Schmelzkurve muss die Einstellung am Taqman verändert werden, die
Platte selbst muss nicht gewechselt werden. Über das Auswertungsprogramm cdf
erfolgt daraufhin eine Darstellung der Schmelzkurven (siehe Abbildung 13).
53
Abbildung 13: Bild einer Schmelzkurve
1.6E1.2E8.0E4.0E0.0E+
7
8
9
69
Dieser Beispiel-Lauf verdeutlicht, dass in jeder Probe das richtige Produkt hergestellt wurde.
Ausnahme stellen nur die beiden braunen Kurven dar, diese haben ein kleineres Produkt als das
eigentliche Produkt, d.h. es handelt sich hier um Primer-Dimere. Alle restlichen Proben können
ausgewertet werden.
5.3.3 Auswertung der Standardkurve
Zur Auswertung der Standardkurve wird als erstes eine Tabelle mit den Ct-Werten
der
einzelnen
Verdünnungen
des
Referenzgenes
erstellt.
Aus
diesen
Dreifachbestimmungen kann nun der Mittelwert für das jeweilige Housekeepinggen
und das zu untersuchende Zielgen errechnet werden.
Der Mittelwert entspricht dem mittleren Ct-Wert, der logarithmisch zur jeweiligen
RNA-Konzentration in eine Grafik eingetragen wird. Nun wird durch Subtraktion
der Ct-Werte des Referenzgenes von den Ct-Werten des Zielgenes der einzelnen
Verdünnungen der sogenannte Delta Ct-Wert bestimmt, welcher wiederum
logarithmisch gegen die RNA-Konzentrationen in den einzelnen Verdünnungen
aufgetragen wird.
Da die vorliegende Arbeit auf vorausgangenen Microarray-Analysen basiert und
hierüber die Housekeepinggene evaluiert wurden, wurde als Beispiel das Zielgen
EZH2 (Enhancer of zeste homolog 2) aufgeführt (Köhler 2007; siehe Tabelle 6).
Berechnung des Ct-Wertes:
Delta Ct (Probe) = Ct Zielgen – Ct Referenzgen
Delta Ct (Kalibrator) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen
Delta Delta Ct = Delta Ct Zielgen - Delta Ct Referenzgen
54
Tabelle 6: Beispiel der Auswertung einer Standardkurve von dem Referenzgen β-Actin und dem
Zielgen EZH2
RNA-Konz.
Ct β-Aktin
Ct EZH2
∆Ct EZH2
0,00
15,25
22,14
6,89
-0,70
17,13
25,06
7,92
-1,00
18,61
27,27
8,66
-1,70
20,41
29,36
8,95
-2,00
21,77
29,73
7,96
-2,70
24,20
32,29
8,09
-3,00
25,76
32,76
7,00
-3,70
27,92
33,72
5,80
Bei EZH2 handelt es sich um ein Gen, das als transkriptioneller Hemmer im Sinne einer Kontrolle des
Zellgedächtnisses und der Aufeinanderfolge der Zellgenerationen fungiert. Es ist möglicherweise
wichtig innerhalb der Hämatopoese und für das Zentrale Nervensystem (Kleer at al. 2003).
Um die Effizienz des Referenzgenes und des Zielgenes zu kontrollieren, wird der
Ct-Wert logarithmisch gegen die RNA-Konzentrationen in den einzelnen
Verdünnungen aufgetragen (siehe Abbildung 14). Um von einer Effizienz von
beinahe 100% ausgehen zu können, muss die Steigung der Geraden zwischen 3,2
und 3,8 liegen, das heißt es liegen vergleichbare Bedingungen vor. Weiterhin
werden die beiden Effizienzen der Referenz und des Zielgenes gegeneinander
aufgetragen. Wenn der Wert der Steigung der Geraden unter 0,1 liegt, sind die
Effizienzen der Referenz und des Zielgenes fast identisch, so dass hierdurch die
Voraussetzungen für die Anwendung der Delta Delta Ct-Methode erfüllt werden.
Abbildung 14: Vergleichs-Diagramm zur Kontrolle der Effizienzen des Referenz- und des
Zielgens am Beispiel von β-Actin und EZH2
CT
35,00
30,00
25,00
Ct β-Aktin
Ct EZH2
20,00
∆Ct EZH2
15,00
Linear (Ct EZH2)
10,00
Linear (Ct β-Aktin)
Linear (∆Ct EZH2)
5,00
-4,0
-3,0
-2,0
-1,0
0,00
0,0
55
5.3.4 Messung der Proben
Nach der Erstellung der oben beschriebenen Kurven können die Proben gemessen
werden. Hierfür wird wiederum ein Master-Mix-Ansatz für eine 96 Mikrotiter-Platte
aus dem QuantiTect SYBR Green PCR Kit (200) erstellt. Sowohl für das die
Bedingungen erfüllende Housekeepinggen GAPDH oder β-Actin, als auch für den
genspezifischen Primer wird ein Master-Mix nach der Anleitung des Herstellers
angesetzt.
Standard-Reaktionsansatz pro Vertiefung:
12,5 µl
SYBR Green I
10,0 µl
RNase-freies Wasser
0,75 µl
Primer 1 (Primer forward)
0,75 µl
Primer 2 (Primer reward)
24 µl des entsprechenden Master-Mixes werden pro Vertiefung vorgelegt, erst dann
wird 1 µl cDNA hinzu pipettiert. Entsprechend der jeweils drei Ansätze werden also
das Houskeepinggen, die zu untersuchende cDNA der Probe und eine Probe ohne
DNA als Negativkontrolle (Non Template Control, NTC) auf die Platte aufgetragen
und untersucht (siehe Tabelle 7).
Tabelle 7: Beispiel eines Pipettierschemas mit dem Gen Rab34 und dem Housekeeping-Gen
GAPDH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
37/02
37/02
37/02
63/02
63/02
63/02
64/02
64/02
64/02
124/02
124/02
124/02
GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH
01/O3
01/O3
01/O3
21/O3
21/O3
21/O3
29/O3
29/O3
29/O3
35/03
35/03
35/03
GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH
37/03
37/03
37/03
65/03
65/03
65/03
96/03
96/03
96/03
137/03
137/03
137/03
GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH
10/O5
10/O5
10/O5
18/O5
18/O5
18/O5
74/05
74/05
74/05
NTC
NTC
NTC
GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH GAPDH
37/02
37/02
37/02
63/02
63/02
63/02
64/02
64/02
64/02
124/02
124/02
124/02
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
01/O3
01/O3
01/O3
21/O3
21/O3
21/O3
29/O3
29/O3
29/O3
35/03
35/03
35/03
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
37/03
37/03
37/03
65/03
65/03
65/03
96/03
96/03
96/03
137/03
137/03
137/03
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
10/O5
10/O5
10/O5
18/O5
18/O5
18/O5
74/05
74/05
74/05
NTC
NTC
NTC
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
Rab34
ANNEALING 65 °C
2 x 50 Ansätze
12,5 µl SYBR Gree n MM
→ 625 µl
(Überschuss)
0,75 µl Primer1
→ 37,5 µl
0,75 µl Primer2
→ 37,5 µl
10,00 µl
1,00 µl cDNA
H2O
→ 500 µl
auf jeden Ansatz 24,00 µl
56
Diese Platte wird nun im ABI PRISM 770 Sequence Detector entsprechend der
Einstellungen für die Probenmessung programmiert. Die Messung erfolgt bei der
genspezifischen Schmelztemperatur des Primers, also sowohl für Wif1 als auch für
Rab34 bei 65 °C.
Um den Erfolg der Real-Time PCR zu bestätigen, erfolgt die oben beschriebene
Messung der Schmelzkurve, das heißt die Messung bei kontinuierlicher Aufheizung
der einzelnen Vertiefungen auf +95 °C. Sie ist notwendig, um eine Differenzierung
zwischen spezifischem Produkt und Primer-Dimeren oder Nebenprodukten zu
machen und kann erst nach Abschluss der PCR-Reaktion erfolgen.
5.3.5 Auswertung der Proben
Zur Auswertung der Probenmessung wird eine weitere Tabelle mit den Ct-Werten
und den Ct-Mittelwerten aus den Dreifachbestimmungen für das jeweilige
Housekeepinggen und das zu untersuchende Zielgen erstellt. Voran die Werte der
Referenzprobe, die hier dem Wert 1 gleichgesetzt werden, da sie eine gleichmäßige
Expression aller zu vergleichenden Gene aufweist.
Durch Subtraktion der Ct-Werte des Referenzgenes von den Ct-Werten des
Zielgenes der einzelnen Verdünnungen wird der Delta Ct-Wert bestimmt. Dieser
Wert dient als Grundlage für die Berechnung des Delta Delta Ct-Wertes, der sich
aus Delta Ct Zielgen und Delta Ct Referenzgen errechnet.
Alle Delta Delta Ct-Werte werden in Relation zu dem Wert 1 der Referenzprobe
gesetzt.
Berechnungen:
Delta Ct (Probe) = Ct Zielgen – Ct Referenzgen
Delta Ct (Kalibrator) = Ct Zielgen - Ct Referenzgen
Delta Delta Ct = Delta Ct Zielgen - Delta Ct Referenzgen
Zur Darstellung der relativen Delta Delta Ct-Werte wird ein Diagramm erstellt
(siehe Kapitel 6, Ergebnisse).
5.4. Auswertung mittels U-Test/Mann-Whitney-U-Test
Um eine Aussage über die statistische Signifikanz der Versuchsergebnisse zu
machen, wird der U-Test zur statistischen Datenanalyse herangezogen. Dieser sog.
57
Mann-Whitney-U-Test oder (äquivalent dazu) der Wilcoxon-W-Test stellt das
nichtparametrische Pendant zum T-Test für zwei unabhängige Stichproben dar.
Anhand des U-Testes ist es möglich, aus den Beobachtungen einer Stichprobe
Rückschlüsse auf bestimmte Eigenschaften der Grundgesamtheit zu ziehen. Der
Zweigruppen-Vergleich mittels U-Test und der Mehrgruppenvergleich mit dem
Kruskal-Wallis-Test wird bei ordinalskalierten Variablen berechnet oder wenn die
Verteilungsvoraussetzungen für die parametrischen Verfahren nicht als gegeben
angenommen werden können.
Mittels des Programmes SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) können
die Ergebnisse ausgewertet werden. Voraussetzungen für den U-Test sind eine
Ordinalskalierung der abhängigen Variablen (= Histologie der Tumoren) und die
„Ähnlichkeit“ der Verteilungen der Testvariablen (= Expression der Gene) in beiden
Gruppen.
Beim U-Test werden die Daten der Test-Variablen durch das SPSS-Programm
zunächst in eine Rangreihe umgewandelt, das heißt der kleinste aller Werte wird zu
1, der nächstkleinste zu 2, bis hin zum größten Wert, der zu N (Anzahl der Fälle in
der Datei) wird. Anschließend werden die jeweiligen Mittelwerte dieser Rangdaten
in den beiden Gruppen errechnet.
Der Unterschied der beiden mittleren Rangplätze wird dann über die U-Statistik auf
Signifikanz geprüft (siehe Beispiel, Tabelle 8).
Tabelle 8: U-Test-Auswertung anhand des Genes Wif1 beim Vergleich der Astrozytom-Gruppe
Grad II gegen die Gruppe der IIIer
Ränge
Expression
Histo
N
Mittlerer Rang
Rangsumme
Astro II
5
9,40
47,00
Astro III
12
8,83
106,00
Gesamt
17
58
Bei großen Stichproben lässt sich diese Signifikanzprüfung nicht immer exakt
durchführen (Rechenzeit und/oder Genauigkeitsprobleme). In diesem Falle lässt sich
die U-Statistik approximativ in eine z-verteilte Prüfstatistik überführen, die in jedem
Falle auf Signifikanz geprüft werden kann. Diesen approximativen Test führt SPSS
immer aus, auch dann, wenn die exakte Signifikanz der U-Statistik ermittelt werden
kann (siehe Tabelle 9).
Tabelle 9: U-Test-Auswertung anhand des Genes Wif1 beim Vergleich der Astrozytom-Gruppe
Grad II gegen die Gruppe der IIIer
Statistik für Test (b)
Expression
Mann-Whitney-U
28,000
Wilcoxon-W
106,000
Z
-,211
Asymptotische
Signifikanz (2-seitig)
Exakte Signifikanz
[2*(1-seitig Sig.)]
,833
,879 (a)
a = Nicht für Bindungen korrigiert
b = Gruppenvariable: Histologie
Auch für den U-Test gilt als Grenze für die (zwei seitige) Signifikanz ein Wert von
0,05. Werte > 0,05 bezeichnen keinen signifikanten Unterschied, während Werte <
0,05 eine Signifikanz anzeigen.
59
6. Ergebnisse
6.1 Ergebnisse der PCR
Mittels der OD-Messung (siehe Kapitel 5, Methoden) wurden alle Tumorproben auf
ihren Gehalt totaler RNA in µg berechnet. Diese Tumorproben wurden nun gegen
eine gemeinsame Referenz, den Marker bp123, in der PCR überprüft.
Tabelle 10 zeigt Auszüge der verwendeten Proben und ihrer Histologien, des
Weiteren gibt sie eine Übersicht über die in der Probenpräparation erhaltenen RNAMengen und die durchgeführte PCR (siehe Kapitel 10, Tabellenanhang).
Tabelle 10: Auszug aus der Auflistung aller Proben und ihrer Probenpräparation, sortiert nach
histologischer Nummer
Total Rest
Histo- RNA RNA
logie in µg in µg
GBM 58,01 48,2
Astro
III
2
63/02
25.10.2005
5,72
*
3
64/02
26.10.2005 GBM 46,39 37,7
Astro
4
67/02
14.09.2005
II
16,09 10,48
Fortführung der Tabelle: siehe Kapitel 10, Tabellenanhang
ProbenAnzahl
Nr.
1
37/02
Präparationsdatum
25.10.2005
PCR
Datum
16.03.2006
PCR
Nr.
7+
Gel
Position
Nr.
2
16.03.2006
16.03.2006
7+
7+
3
4
16.09.2005
5+
2
Unter UV-Licht betrachtet zeigte sich eine unterschiedliche Bandenbildung auf dem
verwendeten Elektrophoresegel. Nach dem Abfotografieren mit der Kamera und
dem Speichern dieser Ergebnisse auf dem Computer konnten die Bilder wie im
Folgenden ausgewertet werden (siehe Abbildung 15).
Abbildung 15: PCR Bild vom 16.09.2005
PCR-Bild vom 16.09.2005
Marker
67/02
08/04
58/04
11/05
44/05
79/05
83/05
89/05
Marker
Alle Proben zeigen
in dieser
Versuchsreihe aufgrund der
beweisenden
Bandenfärbung
eindeutige
Ergebnisse. Die
Färbung und
Wanderung des
Markers bestätigt
den Erfolg des
durchgeführten
Versuches.
60
6.2 Ergebnisse der Real-Time-PCR
6.2.1 Ergebnisse für Wif1
Siehe Tabelle 11 im Tabellenanhang (Kapitel 10)
Aus den tabellarischen Berechnungen (siehe Tabelle 11 im Tabellenanhang, Kapitel
10) wurde zunächst eine Tabelle mit den Mittelwerten für die einzelnen
Tumorgruppen erstellt (siehe Tabelle 12). Desweiteren wurde ein Balkendiagramm
erstellt, das die Mittelwerte der Wif1-Expression in den nach Farben sortierten
Tumorgruppen zeigt. In orange sind die Astrozytome Grad II, in gelb die
Astrozytome Grad III, in hellblau die primären Glioblastome und in lila die
Glioblastom Rezidive dargestellt (siehe Abbildung 16).
Tabelle 12: Mittelwerte für die einzelnen Tumorgruppen für Wif1
Probe
rel. WIF1
Probe
rel. WIF1
Probe
rel. WIF1
Reference
1,0000
Reference
1,0000
Reference
1,0000
67/02
0,0078
37/02
0,0000
28/03
0,6256
08/04
0,0886
64/02
0,0001
36/03
0,2088
58/04
0,2852
124/02
0,0000
51/03
0,0380
11/05
0,0079
01/03
0,0000
54/03
0,0528
18/05
0,0021
17/03
0,0002
74/03
0,0557
27/03
0,0486
152/03
0,9482
63/02
0,0012
29/03
0,0001
153/03
0,0380
21/03
0,0001
35/03
0,0007
47/04
0,0844
37/03
0,0002
68/03
0,0786
76/04
0,0379
65/03
0,0008
76/03
0,2449
04/05
0,0974
75/03
2,4737
103/03
0,0009
29/06
0,5574
96/03
0,0227
03/04
0,0153
121/03
0,0088
60/04
0,0125
137/03
0,4343
10/05
0,0016
87/04
0,4118
44/05
0,0988
78/05
0,0157
74/05
0,0640
89/05
0,0064
79/05
0,0167
45/06
0,0321
80/05
0,2898
83/05
0,0438
103/05
0,4353
119/05
0,0403
33/06
0,3150
51/06
0,0009
Histo
Astro II
Astro III
GBM
Astro Rez.
Mittelwert
0,0783
0,2840
0,0743
0,2495
61
Abbildung 16: grafische Darstellung der Mittelwerte der Wif1-Expression, sortiert nach
Tumorgruppen
Mittelwerte WIF1
0,3000
0,2500
0,2000
0,1500
0,1000
0,0500
0,0000
Astro II
Astro III
Astro IV
Astro Rez.
Im Vergleich zum Astrozytom Grad II wies das Gen Wif1 in der Real-Time-PCRAnalyse einen signifikanten Expressionsanstieg beim Astrozytom Grad III auf. Eine
deutliche Reduktion dieser Wif1-Expression zeigte sich im Vergleich vom
Astrozytom Grad III mit der Gruppe der Glioblastome.
Das Expressionsmuster in der Gruppe der Astrozytome Grad II zeigte sich nahezu
äquivalent zu der Gruppe der Glioblastome.
Eine weitere Zunahme der Expressionsstärke verdeutlichte der Vergleich der
Glioblastome mit der Gruppe der Glioblastom-Rezidive, hier zeigte sich eine rund
dreifache Zunahme.
Eine statistische Auswertung folgt in Kapitel 6.3., Tabelle 15.
6.2.2 Ergebnisse für Rab34
Siehe Tabelle 13 im Tabellenanhang (Kapitel 10)
Aus den tabellarischen Berechnungen (siehe Tabelle 13 im Tabellenanhang, Kapitel
10) wurde zunächst eine Tabelle mit den Mittelwerten für die einzelnen
Tumorgruppen erstellt (siehe Tabelle 14). Desweiteren wurde ein Balkendiagramm
erstellt, das die Mittelwerte der Rab34-Expression in den nach Farben sortierten
Tumorgruppen zeigt. In orange sind die Astrozytome Grad II, in gelb die
62
Astrozytome Grad III, in hellblau die primären Glioblastome und in lila die
Glioblastom Rezidive dargestellt (siehe Abbildung 17).
Tabelle 14: Mittelwerte für die einzelnen Tumorgruppen für Rab34
Probe
rel. RAB34
Probe
rel. RAB34
Probe
rel. RAB34
Reference
1,0000
Reference
1,0000
Reference
67/02
9,4044
37/02
0,6752
28/03
35,6707
08/04
44,3235
64/02
1,1920
36/03
15,3128
58/04
20,2054
124/02
1,0210
51/03
5,1575
11/05
5,7358
01/03
0,1792
54/03
14,4868
18/05
1,0140
17/03
7,8354
74/03
16,2609
27/03
7,2267
152/03
40,3175
63/02
0,6213
29/03
0,2649
153/03
14,6890
21/03
0,3703
35/03
3,9086
47/04
19,9272
37/03
0,0827
68/03
4,8568
76/04
19,7895
65/03
1,9141
76/03
37,2715
04/05
1,7171
75/03
319,5726
103/03
3,2266
29/06
3,7581
96/03
0,4363
03/04
8,9797
121/03
45,4644
60/04
3,4263
137/03
0,4166
10/05
0,8746
87/04
19,0273
44/05
77,1717
78/05
0,4061
74/05
0,7137
89/05
27,4741
79/05
8,1492
45/06
8,5347
80/05
1,9543
83/05
32,5970
103/05
2,9349
119/05
0,2717
33/06
2,1238
51/06
1,1460
Histo
Astro II
Astro III
GBM
Astro Rez.
1,0000
Mittelwert
16,1366
35,3600
9,0435
17,0079
Abbildung 17: grafische Darstellung der Mittelwerte der Rab34-Expression, sortiert nach
Tumorgruppen
Mittelwerte RAB34
40,0000
35,0000
30,0000
25,0000
20,0000
15,0000
10,0000
5,0000
0,0000
Astro II
Astro III
Astro IV
Astro Rez.
63
Im Vergleich zum Astrozytom Grad II wies das Gen Rab34 in der Real-Time-PCRAnalyse seine höchste Expression bei der Gruppe der Astrozytome Grad III auf.
Eine deutliche Reduktion dieser Rab34-Expression zeigte sich im Vergleich vom
Astrozytom Grad III mit der Gruppe der Glioblastome. Beim Vergleich der
Expressionsstärke von Rab34 zwischen den Glioblastom-Gruppen zeigte sich eine
Verdoppelung der Werte vom primären verglichen zum Glioblastom-Rezidiv.
Eine statistische Auswertung folgt in Kapitel 6.3., Tabelle 15.
6.3. Auswertung mittels U-Test/Mann-Whithney-Test
Anhand des SPSS-Programmes wurden die Ergebnisse mit dem U-Test ausgewertet.
Hierfür wurden alle Tumorgrade miteinander verglichen und auf ihre Signifikanz
geprüft (siehe Tabelle 15).
Tabelle 15: Ergebnisvergleich Wif1 und Rab34 im U-Test/Mann-Whitney-Test
Auswertung
für Wif1
Asymptotische
Signifikanz
(2-seitig)
Signifikant
Nicht
signifikant
Auswertung
für Rab34
Asymptotische
Signifikanz
(2-seitig)
Signifikant
Nicht
signifikant
Astro IIer
gegen
IIIer
Astro IIer
gegen
GBM
Astro IIer
gegen
Rezidive
Astro
IIIer
gegen
GBM
Astro IIIer
gegen
Rezidive
GBM
gegen
Rezidive
0,833
0,528
0,126
0,664
0,016
0,012
X
X
0,140
0,005
X
X
X
X
0,292
0,112
0,865
0,728
X
X
X
X
X
X
Für das Gen Wif1 zeigte der U-Test/Mann-Whitney-Test sowohl beim Auftragen
der Astrozytome Grad III gegen die Gruppe der Rezidive als auch beim Vergleich
zwischen den Glioblastomen und den Rezidiven eine statistische Signifikanz.
Für das Gen Rab34 zeigte der U-Test/Mann-Whitney-Test beim Auftragen der
Glioblastome gegen die Gruppe der Rezidive eine statistisch auswertbare
Signifikanz.
64
7. Diskussion
7.1. Einleitung
7.1.1. Allgemeine Probleme der histologischen Einteilung
Die zentrale Rolle der Gehirntumoren und die funktionellen Konsequenzen von
neuronalen Verlusten erklären die Wichtigkeit der Forschung innerhalb der
Tumorgenese von Gehirntumoren. Neuronale Tumoren variieren in ihrer Malignität,
allerdings sind für gewöhnlich auch benigne Formen aufgrund ihres infiltrativen
Wachstums und der Tendenz zum Übergang in maligne Formen oft letztlich letal
(Peiffer et al. 2002).
Trotz der Häufigkeit ihres Vorkommens und der drastischen Auswirkung auf den
Patienten, ist die Darstellbarkeit dieser Tumoren oft nicht eindeutig und die
Diagnose muss durch eine histologische Probe mittels Biopsie oder chirurgischer
Resektion gestellt werden (Böcker et al. 2001). Hier stellt sich jedoch das Problem
der formalen Einordnung der Tumoren in bestimmte Gruppen. Innerhalb der durch
die
WHO
beschriebenen
Gruppen
lassen
sich
histologisch
oft
weitere
Unterteilungen machen, die in der Literatur zu Diskussionen führen.
Die WHO-Klassifikation für Oligodendrogliome und gemischte Oligoastrozytome
beschreibt beispielsweise zwei Grade: Die niedriggradige (Grad II) und die
anaplastische (Grad III) Form. Es bleibt als Fragestellung, ob nicht eine dritte
Gruppe hinzugefügt werden sollte, die Glioblastome mit oligodendroglialer
Komponente erfasst (Claes et al. 2008).
Die Inzidenz dieser drei Subtypen ist kontrovers zu betrachten. Verschiedene
Gruppen beschreiben für die Inzidenz eine ansteigende Tendenz, die mit Werten
zwischen 5% bis hin zu 25-33% bei allen glialen Tumoren angegeben wird.
Weiterhin beschreiben sie ein Absinken der Astrozytom-Inzidenz (Behin et al.
2003).
Dieser Wechsel führt zu der Annahme, dass einige Tumoren, die ursprünglich als
Astrozytome eingestuft wurden, nun als Oligodendrogliome oder gemischte
Oligoastrozytome klassifiziert wurden.
65
Aus diesem Grunde irritiert die morphologische Einordnung in manchen Fällen;
selbst geschulte Pathologen sind nicht in der Lage, eine eindeutige Zuordnung zu
treffen.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden alle Astrozytome als reine Astrozytome ohne
Mischgruppen logisch definiert, so dass oligodendrogliale Anteile ausgeschlossen
werden konnten. Dennoch gelten auch für die in der vorliegenden Studie gemachten
Einteilungen diese formalen Einschränkungen.
In unklaren Fällen ist demnach eine interdisziplinäre Abklärung anzustreben. Nach
Möglichkeit sollten klinische, radiologische und pathologische Aspekte mit in die
Einordnung fließen.
Ein weiterer wichtiger Aspekt beim Staging (Stadien-Einteilung) der neuronalen
Tumoren ist die Tatsache, dass viele niedriggradige Gliome über die Zeit hinweg
eine maligne Transformation durchlaufen. Aus diesem Grunde ist die gegebene
morphologische Klassifikation nicht als endgültig zu betrachten (Daumas-Duport et
al. 1997).
Ferner ist oft nicht nachvollziehbar, in welchem Stadium der Tumorgenese sich das
Gewebe derzeit befindet (Progression versus de novo-Bildung). Aus diesen
genannten Gründen sind analysierte Gewebeproben nicht repräsentativ (Behin et al.
2003).
Auch regionale Tumorproben weisen eine Heterogenität auf, so dass es vor allem
nach stereotaktischen Biopsien zu Fehlklassifikationen kommt (Coons et al. 1997).
Für die Differenzierung zwischen astrozytischen und oligodendroglialen Tumoren
bzw. die Identifikation von anaplastischen Astrozytomen ist die Reproduzierbarkeit
innerhalb und zwischen Beobachtern häufig mangelhaft (Behin et al. 2003). Diese
könnte deutlich verbessert werden, wenn klare geradlinige Abstammungs-Marker
identifizierbar wären.
Ein weiterer Punkt ist, dass Tumorproben zwar das gleiche morphologische
Erscheinungsbild zeigen können, aber dennoch genetische Unterschiede und auch
abweichende Verläufe aufweisen, trotz ähnlicher prognostischer Faktoren.
66
Aus diesem Grunde spielen molekular-genetische Analysen in zunehmendem Maße
eine wichtige Rolle innerhalb der Klassifikation, der Therapieansätze und der
Heilungschancen von Gliomen (Behin et al. 2003).
Wie für andere Tumorarten auch, ist für alle Gliome die Zugehörigkeit in die durch
abnorme Genexpression verursachte Genese nachgewiesen. Gliome zeigen in allen
Formen genetische Aberrationen (Claes et al. 2008).
Wenn eine vorausgehende Radiatio-Therapie nicht in Betracht gezogen wird, bleibt
die Ursache von genetischen Ereignissen gelegentlich unbestimmbar.
Die in die Gliomgenese involvierten Veränderungen von Onkogenen und TumorSuppressor-Genen sind nicht spezifisch, aber ihre Kombination und Akkumulation
ist charakteristisch (Wager et al. 2008).
Die Gliomgenese und die Tumorprogression zeigen eine starke Assoziation mit dem
Verlust der Zell-Zyklus-Kontrolle, welche vor allem durch eine Dysregulation des
TP53 und des Retinoblastom-Pathways zustande kommt (Zhu u. Parada 2002).
Weiterhin spielt der Anstieg der Tyrosin-Kinase-Signalisierung eine wichtige Rolle,
hierzu zählen die Amplifikation des EGF-Rezeptors und die Überexpression von
PDGF oder des PDGF-Rezeptors (Maher et al. 2001). Im späten Stadium der
Tumorprogression sind diese Reaktionswege in alle malignen Gliome involviert und
miteinander verbunden.
In der Hoffnung, eine neue molekulargenetische Klassifikation der Tumoren
schaffen zu können, haben sich Techniken eröffnet, welche eine detaillierte
Charakterisierung des Tumor-Genomes, der Transkriptome und der Proteome
ermöglichen. Am meisten gebraucht wird das cDNA Microarray (Mikro
Datenreihe), da es auf einem Objektträger (Slide) die Selektion (Screening)
tausender von Genen ermöglicht (Mülhardt 2002). Dieser Array zur Darstellung der
Expression hat sich als Methode für ein objektives Grading der Gliome und die
Definition molekularer Pathways der Tumorprogression angeboten. Diese Technik
sollte dabei helfen, neue prognostische Marker zu identifizieren, so basiert auch die
vorliegende Doktorarbeit auf Ergebnissen dieser Methode (Köhler 2007, Bozinov et
al. 2008).
67
7.1.2. Allgemeine Probleme des Versuchsaufbaus
Die
Real-Time
quantitative
PCR
ist
eine
Vervielfältigungsmethode
für
Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht, und zusätzlich
die Möglichkeit der Quantifizierung bietet (Higuchi et al. 1992).
Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, bietet aber folgende Vorteile:
Die Real-Time PCR zeichnet sich durch eine hohe Spezifität des Assays aus. Durch
Messung der Fluoreszenz kann man jederzeit die Menge des entstehenden Produkts
berechnen und unspezifische PCR-Produkte, die das Ergebnis verfälschen könnten,
werden nicht nachgewiesen (Mülhardt 2002).
Die Verwendung der heutigen Farbstoffe, die ein besseres Signal-HintergrundVerhältnis liefern, bietet eine universale Verwendbarkeit, weil damit jede beliebige
PCR-Reaktion verfolgt werden kann. Außerdem ist die Signalstärke hoch, weil jedes
DNA-Molekül mehrere Farbstoffmoleküle bindet. Aus diesem Vorteil resultiert
allerdings auch ein großer Nachteil, weil man nicht zwischen korrektem Produkt und
Artefakten
unterscheiden
kann
(Mülhardt
2002).
Obwohl
Artefakte
wie
Substitutionen, Insertionen und Deletionen allgegenwärtig sind und den Nutzen der
Klone für funktionelle Analysen einschränken, können diese durch sorgfältiges
Arbeiten eingeschränkt werden. Hierzu zählen die Durchführung möglichst weniger
Amplifikationszyklen,
einer
möglichst
langen
Elongationsphase
und
die
Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase (Higuchi et al. 1992).
7.1.3. Allgemeine Probleme der statistischen Auswertung
Voraussetzungen für die Durchführung und Interpretation eines statistischen Tests
sind vor dem Studienbeginn bis ins Detail festgelegte Rahmenbedingungen (Schäfer
1997). Hierzu zählt die Festlegung der Zielgröße oder Messgröße, auf die der Test
angewendet werden soll. Auch die Irrtumswahrscheinlichkeit (Signifikanzniveau α)
und die Art des durchzuführenden Tests müssen festgelegt werden. Weiterhin ist die
Anzahl der Patienten anzugeben.
Alle in die Studie aufgenommenen Patienten müssen in den statistischen Test
einbezogen werden. Kein Patient darf von der Auswertung ausgeschlossen werden.
Dabei ist das sog. Intention-to-treat-Prinzip anzuwenden. Dieses Prinzip besagt, dass
jeder Patient in derjenigen Gruppe ausgewertet wird, der er bei Studienbeginn
zugeteilt wurde (Schäfer 1997).
68
Im Rahmen der hier vorliegenden Doktorarbeit ergibt sich an der Stelle allerdings
ein wesentliches Problem:
Trotz Untersuchung aller seit 2002 im Institut gesammelten Proben ist die
Probenanzahl insgesamt gering, so dass vorliegende Auswertungen als Tendenzen
angesehen werden müssen. Weil es generell nicht viele Tumorproben gibt, wurden
den Auswertungen alle während der Versuchszeit neu entnommenen Proben
beigefügt.
7.2. Diskussion für Wif1
Der Wnt-Reaktionsweg spielt innerhalb verschiedenster Entwicklungsprozesse eine
entscheidende Rolle und ist aus diesem Grund an unterschiedlichen dynamischen
Regulationsmechanismen beteiligt, die durch eine Anzahl morphogenetischer
Faktoren begründet ist. Aberrante Reaktionsabläufe haben darum Konsequenzen,
welche von unbeabsichtigter Apoptose bis hin zur Tumorgenese oder abnormalem
embryogenetischen Wachstum führen können (Diep et al. 2004).
In der dieser Dissertation vorausgehenden Studie von Köhler (2007) wurde das
Transkriptions-Verhalten von 4608 Genen in 15 unterschiedlichen Tumorproben
mittels Mikroarray-Analyse untersucht. Die Proben setzten sich aus einer Gruppe
von sechs anaplastischen Astrozytomen und neun Glioblastomen zusammen. Für das
Gen Wif1 konnte mittels Mikroarray kein signifikanter Expressionsunterschied
zwischen beiden malignen Astrozytomen nachgewiesen werden. Einzig in einer
gesonderten Einzellfalluntersuchung fand Köhler einen Expressionsunterschied vom
anaplastischen Astrozytom zum folgenden sekundären Glioblastom (WHO Grad
IV), also einem therapierten malignen Rezidiv-Gliom. Hier zeigte sich sowohl im
Microarray als auch in der Real-Time PCR richtungsgleich eine Verminderung der
Expression zwischen anaplastischem Astrozytom vs. sekundärem Glioblastom.
In der vorliegenden Dissertation wurde daraufhin mittels Real-Time PCR-Analyse
eine größere Anzahl verschiedener Tumorstadien der Astrozytome gegeneinander
verglichen.
Wie
bei
Köhler
bereits
im
Array-Verfahren
und
in
der
gesonderten
Einzelfalluntersuchung aufgezeigt, bestätigte sich in vorliegenden Versuchen der
signifikante Expressionsverlust von Wif1 im Vergleich zwischen den Astrozytomen
69
Grad III und der Gruppe der Rezidive. Weiterhin konnte für das Gen Wif1 ein
signifikanter Expressionsunterschied zwischen den Glioblastomen und den
Rezidiven gezeigt werden. In allen anderen Vergleichsgruppen konnten keine
statistisch relevanten Unterschiede festgestellt werden. Dennoch zeigte sich im
Vergleich vom Astrozytom Grad II zum Astrozytom Grad III der Hinweis eines
Expressionsanstieges, der aber statistisch aufgrund des kleinen Probenumfangs
keine Signifikanz zeigte. Eine Reduktion dieser Wif1-Expression zeigte sich auch
im Vergleich vom Astrozytom Grad III mit der Gruppe der Glioblastome, ließ sich
aber ebenfalls statistisch nicht belegen. Das Expressionsmuster in der Gruppe der
Astrozytome Grad II zeigte sich nahezu äquivalent zu der Gruppe der Glioblastome.
Eine statistisch signifikante Zunahme der Expressionsstärke verdeutlichte der
Vergleich der Glioblastome mit der Gruppe der Glioblastom-Rezidive.
Da sich in den durchgeführten Untersuchungen lediglich in der Vergleichsgruppe
der beiden malignen Astrozytom-Formen Grad III und Glioblastom im Vergleich zu
den Rezidiven eine statistisch auswertbare Signifikanz zeigte, muss davon
ausgegangen werden, dass ein klarer Zusammenhang zwischen der Radio-ChemoTherapie und der Expression des Gens besteht. Man kann daraus schließen, dass ein
Expressionsunterschied von Wif1 möglicherweise zu einer Strahlenresistenz führt
oder umgekehrt.
Neben dem Wnt/planar cell polarity (Wnt/PCP) pathway und dem Wnt/calcium
(Wnt/Ca2+) pathway spielt der sog. Canonical Wnt signalling pathway die wichtigste
Rolle. Hierbei kommt es zu einer Stabilisierung und zu einem Anstieg der
Transkriptionsaktvität von β-Catenin. Letzteres wird vom Zytoplasma in den
Nukleus transloziert, wo es als Transkriptionsfaktor fungiert und zu einer
Aktivierung der eigentlichen Effektoren führt. Es kommt zu einem Tumorwachstum.
Dieses Tumorwachstum geht entweder mit einer ungeeigneten Inaktivierung für OffSchalter oder einer ungeeigneten Aktivierung von On-Schaltern einher (Mazieres et
al. 2004).
Es ist bisher gut bekannt, dass Mutationen im APC-Gen, Axin oder β-Catenin,
welche zu einer Akkumulation von β-Catenin im Zellkern führen, oft in
menschlichen Tumoren nachzuweisen sind (Reguart et al. 2004). Zudem bindet βCatenin selbst nicht an die DNA, sondern es benötigt für seine Bindung an LEF/TCF
Transkriptionsfaktoren für die Transaktion in den Zellkern, welches wiederum an
70
bestimmte Gene bzw. Genexpressionen gebunden ist. Allen Tumor-Typen gleich ist
die Assoziation mit verschiedenen Stadien der β-Catenin-Form innerhalb des
Reaktionsweges (Diep et al. 2004).
Obwohl der intrazytoplasmatische Teil des Wnt-Pathway weitestgehend verstanden
wurde, ist dennoch nur wenig über den Zusammenhang zwischen Antagonisten von
Wnt-Liganden und ihrer Rolle innerhalb der Karzinogenese bekannt (Reguart et al.
2004).
Aus den oben genannten, in der Literatur beschriebenen Reaktionsmechanismen des
Wif1 (Diep et al. 2004, Reguart et al. 2004) könnte man erwarten, dass eine
Expressionszunahme von Wif1 mit einem Anstieg von Apoptose und einer
Wachstumsverminderung einhergeht. Mit zunehmendem Tumor-Grad wäre also mit
einem Expressionsverlust zu rechnen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch
keine Korrelation zwischen der Tumor-Schwere und der Expression von Wif1. Es
scheint für Astrozytome also keinen Zusammenhang in dieser Hinsicht zu geben. Zu
berücksichtigen
ist
bei
diesen
Ergebnissen
jedoch
immer,
dass
die
Gesamtuntersuchungszahl wie bereits erwähnt zwangsläufig gering und somit die
statistische Signifikanz nur eingeschränkt möglich ist.
Interessanterweise ist in der Literatur aber auch eine Störung der normalen
Entwicklung von Zellverbänden durch eine Überexpression von Wif1 beschrieben
(Mazieres et al. 2004). Da Wnt-Proteine sowohl in der Embryogenese als auch beim
Gewebewachstum eine Schlüsselrolle spielen (Vaes et al. 2005) und zur Kontrolle
der Zellproliferation und Determination der Stammzellen-Entwicklung beitragen,
kann eine aberrante Aktivierung des Wnt-Signal-Pathways - egal in welche
Richtung - zu verschiedensten menschlichen Krebsarten beitragen. Hierzu könnte es
sowohl durch Unter- als auch durch Überexpression kommen (Mazieres et al. 2004,
Cebrat et al. 2004).
Des Weiteren bleibt zu überlegen, inwiefern die Radio-Chemo-Therapie bei der
Rezidiv-Tumorgruppe eine wichtige Rolle spielt. Sowohl Bestrahlung als auch
Chemotherapie kann entweder eine palliative oder potentiell kurative Behandlung
bedeuten. Die therapeutischen Effekte lassen sich im Groben in die vier
Wirkmechanismen Nekrose, Apoptose, beschleunigter Alterungsprozess und
71
terminale Differenzierung unterteilen (Böcker et al. 2001). Eine Zelle, die durch
Radio-Chemo-Therapie beschädigt worden ist und ihre reproduktive Integrität
verloren hat, kann sich ein oder mehrere Male teilen, bevor die Nachkommenschaft
eine sterile Reproduktivität hergestellt hat (DeVita et al. 2004). Jede Zelle unterläuft
nach Beschädigung durch diese Art von Therapie eine kritische Periode, in welcher
sich entscheidet, ob die Zelle untergeht, den Schaden behebt oder trotz dem Schaden
weitere Zellteilungen durchläuft. Auf molekularer Ebene initiiert ein ChemoRadiatio-induzierter Schaden komplexe Signalkaskaden in den Zellen, welche in
einer Vielzahl von Reaktionen resultieren. Hierzu zählen Zellzyklus Arrest,
Induktion von sog. Stress-Reaktions-Genen, DNA-Reparation und Apoptose
(Böcker et al. 2001). Das Protein p53 spielt zum Beispiel eine Schlüsselrolle in der
Aktivierung von Apoptose und Zell-Zyklus-Arrest nach DNA-Schaden (DeVita et
al. 2004). Auch andere Signal-Kaskaden werden durch die Wirkung der RadioChemo-Therapie aktiviert. In vielen dieser Pathways spielen Mitogene (Proteine
innerhalb
der
Mitose)
eine
wichtige
Rolle,
so
fördern
beispielsweise
Wachstumsfaktoren das Überleben der Zelle (Schmoll et al. 2005). Viele dieser
Effekte sind von einem bestimmten Zelltyp abhängig. Verschiedene Membrangebundene Rezeptoren sind in solche Signalisierungen verwickelt und agieren via
nachfolgender Aktivierung multipler Pathways. Zu diesen Rezeptoren zählen zum
Beispiel die mitogen-aktivierte Protein Kinase, Phosphatidyl 3 Kinase, K-/H-Ras,
JAK/STAT und c-Jun NH2-terminale Kinase (Schmoll et al. 2005, DeVita et al.
2004). Ein Beispiel ist weiterhin die durch Bestrahlung induzierte EGFR-SignalKaskade, die mit überlebens-fördernden Effekten einhergeht. Auch andere ZellOberflächen-Rezeptoren zeigen solche Effekte nach Bestrahlung, hierzu zählen
HER2, VEGF und der basische Fibroblasten Wachtstumsfaktor (Preiß et al. 2008,
DeVita
et
al.
2004).
Nicht
nur
Oberflächenrezeptoren,
sondern
auch
Wachstumsfaktoren und Zytokin-Rezeptor-Pathways sind in die BestrahlungsReaktion involviert. Bestrahlung führt zu einer schnellen Aktivierung des Tumor
Nekrose Faktor-α-Rezeptor (TNF-α-Rezeptor) und induziert auf diese Weise die
Expression des TNF-α-Proteins. Auch Zytokine scheinen bei antiapoptotischen
Signalen eine Rolle zu spielen, hierzu zählen Interleukin-6, TGF-ß und der
Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (Preiß et al. 2008, DeVita et al. 2004).
72
Bei den Ergebnissen der vorliegenden Disseration kann mit einem engen
Zusammenhang zwischen der Radio-Chemo-Therapie und der Beeinflussung der
Wif1-Expression gerechnet werden. An welcher Stelle der drei bekannten WntReaktionswege eine therapeutische Beeinflussung durch Radio-Chemo-Therapie
vonstatten geht, ist und bleibt unklar (Ohigashi et al. 2005). Dennoch zeigen die in
vorliegender Arbeit signifikanten Expressionsunterschiede, dass die Radio-ChemoTherapie mit 60 Gy und ACNU/VM26 eine Auswirkung auf das Gen Wif1 hat.
Dieses Ergebnis repräsentiert mögliche Ansätze für potentielle therapeutische
Maßnahmen.
7.3. Diskussion für Rab34
In den dieser Doktorarbeit vorausgegangenen Untersuchungen mittels MikroarrayAnalyse zeigte sich ein signifikanter Expressionsunterschied von Rab34 in
Astrozytomen Grad III und Glioblastomen. Es konnte eine deutliche HerunterRegulierung von Rab34 in Glioblastomen verglichen zu Astrozytomen Grad III
beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigte die anschliessende Real-Time PCR
für dieselben Tumorproben einen Expressionsanstieg (Köhler 2007, Bozinov et al.
2008). Trotz der in den unterschiedlichen Versuchen entgegengesetzten Ergebnisse
konnten mit den hier vorliegenden Daten die Ergebnisse für die Real-Time PCR
bekräftigt werden: In den vorliegend präsentierten Versuchen, die mit einer größeren
Anzahl von Astrozytom-Tumor-Proben durchgeführt wurden, konnte entsprechend
der Tumor-Grade eine ansteigende Expression von Rab34 nachgewiesen werden, es
gab also auch keinen Tumorgrad, in dem es zu gar keiner Expression kam.
Beim Vergleich der Mittelwerte (MW) der einzelnen Gruppen gegeneinander konnte
in der Real-Time-PCR-Analyse jeweils eine Expressionszunahme von Grad II zu
Grad III und wiederum von Glioblastomen zu den Rezidiven gezeigt werden. Die
insgesamt höchste Expression zeigte das Astrozytom Grad III (MW = 35,36).
Beim Vergleich der Expressionsstärke von Rab34 innerhalb der GlioblastomGruppen zeigte sich eine statistisch signifikante Verdoppelung der Werte vom
primären verglichen zum Glioblastom-Rezidiv (primäres Glioblastom: MW = 9,04;
Glioblastom Rezidiv: MW = 17,01). Diese statistisch auswertbare Signifikanz der
Messungen
konnte
im
U-Test/Mann-Whitney-Test
beim
Auftragen
der
Glioblastome gegen die Gruppe der Rezidive bestätigt werden. Dieses Ergebnis
73
könnte ein wichtiger Hinweis dafür sein, dass Rab34 eine Rolle bei der Einleitung
von einem Glioblastom zu einem Glioblastom-Rezidiv spielt. Weiterhin
demonstrieren die vorliegenden Daten eine signifikante Assoziation zwischen der
Gen-Expression und einer Radio-Chemo-Therapie.
Im Zuge der oben genannten Zellspezifität und ihrer Abhängigkeit zum Tumor-Grad
stellt sich bei den vorliegenden Versuchsergebnissen nun die Frage, inwieweit
zelluläre Mechanismen durch Radiatio und Chemotherapie zu einer Veränderung
führen, die wiederum eine Expressionsverdoppelung von Rab34 veranlassen. –
Führt die bisher angewandte Therapie zu einer verstärkten Expression von Rab34?
Gibt es in dem vorliegenden Beispiel einen direkten Zusammenhang zwischen
Therapie und Expression von Rab34?
Wie beim Gen Wif1 vorhergehend schon beschrieben, findet man in vielen der
Pathways, die durch Radio-Chemo-Therapie behandelt worden sind, Mitogene
(DeVita et al. 2004). Diese Proteine spielen innerhalb der Mitose eine wichtige
Rolle, für die Mitose sind wiederum das Mikrotubulus-Netzwerk und die Formation
von Membranen von Bedeutung. Genau an dieser Stelle wirken die Rab-Proteine im
Zusammenhang mit RILP:
Für verschiedene Rab-Proteine/-Gene und Rab-Effektoren konnte gezeigt werden,
dass eine Dimerisation zu einer grundlegenden Veränderung dieser Proteine führt
(Goldenberg et al. 2007). Die Oligomerisation ist eine der fundamentalen
Zustandsformen ihrer physiologischen Funktion. Die Dimerisation dieser RabProteine hängt von ihrer nukleotid-gebundenen Konformation ab, sie ist unabhängig
von einer Lipid-Modifikation und könnte dazu führen, dass diese Proteine den
GDP/GTP-Zyklus durchlaufen, ohne im Zytosol recycelt zu werden (Wang u. Hong
2002). Rab34 reguliert die lysosomale Formation durch einen Mikrotubulusabhängigen Weg, obwohl es selbst durch eine Interaktion mit RILP gesteuert wird.
Eine Unterbrechung der Selbst-Interaktion führt in diesem Falle zu einem
Funktionsverlust (Colucci et al. 2005).
- Ist es also möglich, dass Rab34 in seiner Interaktion mit RILP durch die RadioChemo-Therapie noch stabilisiert wird? Wird durch eine Radio-Chemo-Therapie
lediglich die Expression von Rab34 gesteigert, so dass mehr Rab34-Proteine
vorliegen oder hat die Chemotherapie mit ACNU/VM26 möglicherweise auf
chemischer Ebene eine direkte Stabilisierung der Verbindung zur Folge?
74
Ein entscheidender Unterschied zwischen Rab34 und RILP ist die Tatsache, dass
Rab34 über einen langen Reaktionsweg wirkt, der primär über den Golgi-Apparat
gesteuert ist. RILP hingegen agiert in der cis-Formation direkt an den Lysosomen.
Aus diesem Grunde ist anzunehmen, dass der Mikrotubulus-abhängige Effekt von
Rab34 mit der Möglichkeit einhergeht, dass das effektive und produktive
„Signaling“ von Rab34 auf RILP abhängig von einem intakten Mikrotubulus ist
(Wang et al. 2004). Ansätze für neue Therapieoptionen wären in diesem Falle also
das Mikrotubulus-Netzwerk, welches durchaus durch Medikamente beeinflussbar
ist.
Ein weiterer Unterschied zwischen Rab34 und RILP besteht darin, dass RILP eine
größere Potenz bei der Induktion der Formation von kleineren und größeren
Lysosomen zeigt. (Wang et al. 2004). Aufgrund ihrer Größe bilden größere
Lysosomen
natürlicherweise ein
Cluster (Anhäufung) innerhalb
der viel
geräumigeren Zentralregion. Dieser Vorgang ist unabhängig von der Intaktheit des
mikrotubulären Netzwerkes (Wang et al. 2004). Innerhalb kultivierter Zellen stellt
die weniger geräumige Peripherie keine bevorzugte Lokalisation für diese
vergrößerten Lysosomen dar. Aufgrund der kleineren Größe der Lysosomen in
Rab34-expremierenden Zellen scheint der Mikrotubulus-Apparat eine Rolle
innerhalb der aktiven Cluster-Bildung in der perinuklearen Region zu spielen (Wang
et al. 2004). Man weiß, dass eine Zerstörung des Mikrotubulus durch beispielsweise
Nocodazol in einer freien Diffusion dieser Lysosomen in die periphere Region
resultiert (Wang u. Hong 2002, Wang et al. 2004). - Warum sollten eine Bestrahlung
und/oder Chemotherapie hier nicht eine ähnliche Wirkung zeigen? Die Kombination
dieser beiden Möglichkeiten, gemeinsam mit anderen Faktoren, könnte eine Basis
für die unterschiedliche Mikrotubulus-Nutzung von Rab34 und RILP innerhalb der
lysosomalen Formation sein.
Ein weiterer interessanter Punkt ist der Zusammenhang mit phosphorylierten PKCMotiven innerhalb von Rab39. Für verschiedene Rab-Proteine, wie zum Beispiel
Rab5 und Rab8, konnte eine Regulation durch Proteinkinasen wie PKC, PKB, cdc2,
ERK1 und andere gezeigt werden. Auch für p38 konnte eine Inhibition des durch
Rab5 gesteuerten endozytotischen Reaktionsweges nachgewiesen werden (Chen et
al. 2003).
75
Seit Rab39 sowohl aus dendritischen als auch anderen Lympozyten-Zell-Linien
isoliert und exprimiert wird (Nachweis mittels RT-PCR), sind zudem zwei Dinge
bekannt: Rab39 könnte an der Internalisation und bei dem Transport von exogenen
Protein-Antigenen oder sogar an der Regulation des Antigen-präsentierenden
Prozesses beteiligt sein. Dieses wurde bisher schon für Rab5 und Rab4 angenommen
(Chen et al. 2003).
Weil Rab39 in engem Zusammenhang mit Proteinkinasen steht und die potentielle
Rolle des Rab39 in der Regulation der Antigen-Präsentation gesehen wird (Chen et
al.2003), ist es von großem Interesse, zukünftige Investitionen in die Erforschung
dieser Zusammenhänge zu machen.
Daß Bestrahlung die Expression einer Menge Gene induziert und dass die
Mitglieder dieser immer weiterwachsenden Liste der Bestrahlungs-induzierten Gene
zu einem weiten Spektrum an nachgeschalteten Effekten führen, ist in der Literatur
bereits mehrfach beschrieben (DeVita et al. 2004). Zum Beispiel hilft die induzierte
Expression von Egr-1 (early growth response 1, frühe Wachstums Antwort 1) und cJun Zellen beim Überleben nach Beschädigung durch Strahlung. Diese
Bestrahlungsanregung hängt von Modifikationen von Transkriptionsfaktoren durch
den Protein Kinase C-Pathway ab. Gezielte Inhibition von Egr-1 und c-JunProteinen verhindert den Beginn der S-Phase und reduziert das Überleben von
menschlichen Zellen nach Bestrahlungs-Schäden (DeVita et al. 2004). Auch andere
bestrahlungsinduzierte Gene sind beschrieben worden, hierzu zählen GADD45
(growth arrest and DNA damage-inducible protein 45, Wachstumshemmung und
DNA Schaden erzeugendes Protein), ß-Aktin, Interleukin-1, Protein-Kinase-C, der
basische
Fibroblasten
Wachstumsfaktor,
Interleukin-1ß
und
der
Gewebe-
Plasminogen-Aktivator (DeVita et al. 2004). Die Identifikation der genauen
Reaktionsabläufe, die Gene wie Egr-1 und auch Rab34 steuern, wird zur
Entwicklung der Gentechnologie mittels bestrahlungsinduzierter Gene beitragen.
Vielleicht kann man an dieser Stelle noch einen Schritt weiter gehen: welche
Faktoren werden durch die Radio-Chemo-Therapie genau beeinflusst? Sind es
einzelne chemische Strukturen wie die o.g. Mikrotubulus-Formation oder
bestrahlungsinduzierte Gene, die eine Modifikation erfahren? Oder ist es vielleicht
die Tatsache, dass eben bestimmte Strukturen nicht beeinflusst werden, während der
76
Rest eine Wandlung durchläuft? Gibt es neben der chemischen und radiologischen
vielleicht eine infektiöse Genese dieser Expressionsunterschiede? - Das interessante
Ergebnis dieser Dissertation ist, dass sich ausgerechnet zwischen den behandelten
und den unbehandelten Glioblastomen eine Signifikanz nachweisen ließ.
Während die Wirkung der Bestrahlung auf der Energieübertragung auf das
durchstrahlte Gewebe in Streuprozessen beruht, wobei im Wesentlichen die
Ionisierung von Wassermolekülen und die dadurch entstehenden freien Radikale
hochtoxisch sind, verwendet die Chemotherapie Stoffe, die ihre schädigende
Wirkung möglichst gezielt auf bestimmte krankheitsverursachende Zellen
beziehungsweise Mikroorganismen ausüben und diese abtöten oder in ihrem
Wachstum hemmen (Schmoll et al. 2005).
Coyne et al (2007) beispielsweise zeigten in diesem Zusammenhang, dass das
Coxsackievirus B (CVB) keine bedeutende Reorganisation der Tight junctions
induziert, es aber die spezifische Internalisation von Okkludin A (einem
Hauptprotein der Tight junctions) innerhalb der Makropinosomen stimuliert.
Obwohl Okkludin A nicht direkt mit dem Virus interagiert, führt eine Verminderung
von Okkludin A zu einer Prävention vom Eintritt von CBV in das Zytoplasma und
verhindert eine Infektion. Sowohl die Okkludin Internalisation als auch CVB
werden durch Inhibitoren der Makropinozytose blockiert und benötigen hierfür die
Aktivität von Rab34, Ras und Rab5 (Coyne et al. 2007).
Mit diesem Beispiel wird veranschaulicht, dass der Eintritt eines Virus (in diesem
Falle CVB) abhängig von Okkludin A ist, welcher wiederum bei einem Prozess
stattfindet, bei dem Aspekte der kaveolären Endozytose mit charakteristischen
Eigenschaften der Maktopinozytose kombiniert werden. Übertragen auf die in der
vorliegenden Arbeit gefundenen Ergebnisse könnte es möglich sein, dass nicht nur
die strukturellen Prozesse durch Rab34 beeinflusst werden, sondern dass in der
Folge Infektionserreger einen Weg in die Zelle oder wie o.g. eben nicht in die Zelle
finden und möglicherweise so zu einer Progression der Tumorgeschehens führen.
77
Zusammenfassend kann man sagen, dass die vorliegenden Ergebnisse durchaus mit
den in der Literatur angegebenen Thesen über die Bedeutung des Rab34
übereinstimmen. Durch Voruntersuchungen in der vorausgegangenen Doktorarbeit
(Köhler 2007) konnte bereits ein aussagekräftiger Nachweis über Rab34 in malignen
Astrozytomen gemacht werden.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde mittels Real-Time-PCR lediglich die relative
mRNA-Expression der beiden Zielgene Rab34 und Wif1 in den verschiedenen
Tumorproben untersucht. Weiterführende Untersuchungen sollten eine gezielte
Mengenbestimmung einer größeren Anzahl von Proben anstreben, um genauere
Aussagen über das wirkliche Vorliegen und Wirken der Proteine machen zu können.
Aus den signifikanten Expressionsunterschieden zwischen den Glioblastomen und
den trotz Radio- und Chemo-Therapie behandelten Rezidiven geht dennoch hervor,
dass hier möglicherweise ein sehr sensibler Schritt innerhalb des Rab34/39Pathways zugrunde liegt.
Die zentrale Rolle innerhalb des Organellen-Transportes im Axoplasma,
Mikrotubulus-abhängige Effekte und die Regulation der Antigen-Präsentation
scheinen sowohl durch Radio-, als auch Chemo-Therapie beeinflussbar zu sein, auch
eine infektiöse Genese ist nicht auszuschließen. Die genaue Funktion bleibt jedoch
unklar.
78
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86
9. Abkürzungen, Kurzzeichen
% = Prozent
< = kleiner
> = größer
° = Grad
°C = Grad Celsius
13q14 = Chromosom Nummer 13,
langer Arm, Position 14
24p3 = Chromosom Nummer 24, kurzer
Arm, Position 3
5-AZA-CdR = 5-aza-2 '-Deoxycytidin
A = Anregungsspektrum
a = nicht für Bindungen korrigiert (UTest)
A549 = Lungenkarzinom-Zellen
aa = aminoacid, Aminosäure, AS
ADP = Adenosindiphosphat
Akt = alpha serine/threonine-protein
kinase
AmpliTaq = Amplifikation mittels
thermostabiler Taq-Polymerase
AP 1 = activator protein 1
APC = adenomatosis polyposis coli
APC = antigen presenting cell
ARF = cyclin-dependent kinase inhibitor
2A
Arg = Arginin
AS = Aminosäure
Astro = Astrozytom
ATG = Adenosin, Thymin, Guanosin
ATP = Adenosintriphosphat
Axin2 = axis inhibition protein 2
b = Gruppenvariable (in vorliegendem
Fall: Histologie)
BCC = basal cell carcinoma
BFA = Brefeldin A
BMP2A = bone morphogenetic protein 2
bp = Basenpaare
bzw. = beziehungsweise
C = Celsius
C = Cytosin
Ca2+ = Calzium, Oxidationszahl +2
–C-A-A-X- = C: Cystein, A: aliphatische
Aminosäure, X: Leucin, Methionin,
Serin oder Glutamin
cag-Insertion = Cytosin, Adenin,
Guanin-Insertion
cAMP = Zyklisches
Adenosinmonophosphat
-C-C- = Phosphoglycolat, C2Verbindung, aktivierte Essigsäure =
Acetyl-CoA
CCD-Kamera = Charge-Coupled Device
Kamera, Digitalkamera
CCND2 = cyclin D2
CCNU = Cecenu®
CD44 = CD44 molecule (Indian blood
group)
cdc2 = cell division cycle 2
cdf = Cyberspace Description Format
CDK = cyclin-dependent kinase
CDKN2A/p16 = cyclin-dependent
kinase inhibitor 2A (melanoma, p16,
inhibits CDK4)
cDNA = complementary DNA
cis-Formation = räumliche Anordnung
aller Atome in eine gemeinsame
Richtung
CLL = chronic lymphatic leukaemia
c-myc = v-myc myelocytomatosis viral
oncogene homolog (avian)
CpG-Insel = Cytosin-PhosphatidylGuanosin-Insel
CRD = cysteine-rich domain
CSPG2 = chondroitin sulfate
proteoglycan 2 (versican)
CT = Computertomographie
C-terminal = Carboxyl-Terminus (CTerminus), bezeichnet das Ende eines
Proteins oder Polypeptides
CTNNBI = catenin, beta interacting
protein 1
Ctse = cathepsin E
Ct-Wert = Threshold Cycle =
"Schwellenwert-Zyklus"
-C-X-C- = C: Cystein, X: Leucin,
Methionin, Serin oder Glutamin
d.h. = das heisst
DC = Dünnschichtchromatographie
de novo = neu entstanden
Delta Ct = Subtraktionswert zweier CtWerte
DEPC-Wasser = Diethyl PyrocarbonatWasser
dest. = destilliert
87
Dfz2 = Drosophila frizzled 2
Dkk = Dickkopf
Dkk1 = dickkopf homolog 1 (Xenopus
laevis)
Dkk1-3 = dickkopf homolog 1-3
(Xenopus laevis)
Dkk2 = dickkopf homolog 2 (Xenopus
laevis)
DNA = Deoxyribonucleic acid
dNTP = Desoxynukleosidtriphosphat
dsDNA = double-stranded DNA
DU145-Zellen = von Gehirnmetastasen
stammende Pca-Zellen
Dvl = Dishevelled
E = Emissionsspektrum
E2F = E2F transcription factor 1
EGF = epidermal growth factor
EGFR = epidermal growth factor
receptor
ER = Endoplasmatischen Retikulum
ERK1 = mitogen-activated protein
kinase 3
et al. = et alii bzw. et aliae oder et alia
EtBr = Ethidiumbromid
EZH2 = enhancer of zeste homolog 2
(Drosophila)
F = Fluorochrom
FosB = FBJ murine osteosarcoma viral
oncogene homolog B
Frat I = Frataxin, mitochondrial
precursor
FRET = fluorescence resonance energy
transfer
FrzB = frizzled-related protein
FST = follistatin, activin-binding protein
Fut-2 = fucosyltransferase 2 (secretor
status included)
Fz = Frizzled
FZD = frizzled homolog (Drosophila)
g = Gramm
G = Guanosin
G1-Phase = gap-phase
G361-Zellen = Melanom-Zellen
GAP = GTPase activating proteins
GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
GBM = Glioblastoma multiforme
GDI = GDP dissociation inhibitor
GDP = Guanosindiphosphat
GDPasen = Proteine, die als molekulare
Schalter fungieren
GEF = Guanosine exchange factor
GFAP = glial fibrillary acidic protein
GFP = grün fluoreszierendes Protein
GLI-Krueppel = glioma-associated
oncogene homolog 1 (zinc finger
protein)
GOF = gain of function
G-Proteine = Guaninnukleotidbindendes Protein
GSK-3β = glycogen synthase kinase3beta
GTC-Lösung = GuanidinisothiocyanatLösung
GTP = Guanosintriphosphat
GTPasen = Proteine, die als molekulare
Schalter fungieren
Gy = Gray
H = Höhe
H2O = Wasser
H2O DEPC = Diethyl Pyrocarbonat
Wasser
H2O dest. = destilliertes Wasser
H2O2 = Wasserstoffperoxid
HeLa-S3-Zellen = in Suspension
adaptierte Zelllinie, leitet sich von einem
menschlichen Cervixkarzinom ab
HNSCC = head and neck squamous cell
carcinoma
HNSCC = head and neck squamous cell
carcinoma
H-Ras = v-Ha-ras harvey rat sarcoma
viral oncogene homolog
in situ = am Ort, in natürlicher Lage
in vitro = im Reagenzglas, d.h. außerhalb
des Organismus
in vivo = im lebenden Organismus
JNK = Jun N-terminale Kinase
Jun = v-jun sarcoma virus 17 oncogene
homolog (avian)
JunB = jun B proto-oncogene
K+ = Kalium
Kat. Nr. = Katalog Nummer
kb = Kilobasen
kDa = Kilo Dalton
Ki-67/MIB1 = Proliferationsmarker auf
der Chromosomenoberfläche
Konz. = Konzentration
K-Ras = proto-oncogene K-Ras2A
K-RasB = v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma
viral oncogene homolog
Krt2-4 = keratin complex 2, basic, gene
4
LBX1 = ladybird homeobox homolog 1
88
(Drosophila)
LDL = low density lipoprotein
LDR = low dose radiation
LEF/TCF = Pangolin
LOF = loss-of-function
LOH = Loss of Heterozygosity
LRP = LDL-receptor-related protein
LY294002 = PI3K-Inhibitor
MAPK = mitogen-activated protein
kinase 1
max. = maximal, maximus
MDM2 = murine double minute 2
mg = Milligramm
Mg2+ = Magnesium, Oxidationszahl +2
MgCl2 = Magnesiumchlorid
min. = Minute
ml = Milli Liter
mm = Milli Meter
MM = Milli Mol
MOX2 = Mox2 protein
MR-Bilder = Magnetresonanz-Bilder
mRNA = messenger RNA
MRT = Magnetresonanztomographie
MYC = v-myc myelocytomatosis viral
oncogene homolog (avian)
N = Anzahl der Fälle in einer Datei
NF-κB = transcription factor NRF
NIH3T3-Zellen = permanente
Fibroblastenzelllinie aus MausEmbryonen
nm = Nanometer
Nr. = Nummer
N-Ras = neuroblastoma RAS viral (vras) oncogene homolog
NSCLC = non-small cell lung cancer
nt = nucleotides; Transkript-Länge
NTC = non template control
N-terminal = Amino-Terminus (NTerminus) bezeichnet den Anfang eines
Proteins oder eines Polypeptides
OD-Messung = Optische DichteMessung
Oligo (dT18)-Primer = Primer von
Operon, Köln
Opg = Osteoprotegerin
ORF = open reading frame
p = kurzer Arm eines Chromosoms
p108Rb = Retinoblastom-Gen, Kurzer
Arm, Position 108
p19ARF = cyclin-dependent kinase
inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits
CDK4)
p38 = mitogen-activated protein kinase 1
p53 = tumor protein p53 (Li-Fraumeni
syndrome)
Part No = Partikel Nummer
PBL = periphere Blut-Leukozyten
PC-3 = von Knochenmetastasen
stammende Pca-Zellen
Pca-Zellen = Prostatakarzinom-Zellen
PCP-pathway= planar cell polaritypathway
PCR = Polymerase Chain Reaction
PCV-Schema = Procarbazin, CCNU,
Vincristin-Schema
PDGF = plateled-derived growth factor
PDZ = Protein-Interaktionsdomäne
pGFP = phosphorylated GFP
pH = pondus Hydrogenii, potentia
Hydrogenii
PI3K = phosphoinositide-3-kinase,
catalytic, gamma polypeptide
PKB = PTK2B protein tyrosine kinase 2
beta
PKC = protein kinase C
PKCmu = protein kinase D1
PKCβ = protein kinase C beta 1
PPP2CB = protein phosphatase 2
(formerly 2A)
pRB = Retinoblastomprotein
pTa = phosphate acetyltransferase
PTEN-Null-Zellen = Zellen ohne PTENSuppressorgen
PTQ-PCR = Real-Time-quantitativePCR
q = langer Arm eines Chromosoms
Qty = quantity
Rab = Ras-related protein Rah
Rab2 = Ras-related protein Rab-2A
Rab34 = Ras-related protein Rab34,
Synonyme: RAH, RAB39, Rab-39, Rasrelated protein
Rab39 = RAB39, member RAS
oncogene family
Rab4 = Ras-related protein Rab-4A
Rab5 = Ras-related protein Rab-5A
Rac1 = ras-related C3 botulinum toxin
substrate 1
Raf = v-raf-1 murine leukemia viral
oncogene homolog 1
Rah = ras-related homolog
Ras-Gene = Gruppe von kleinen GTPbindenden Proteinen
RB = Retinoblastom
89
real-time quantitative PCR = real-time
quantitative polymerase-chain-reaction,
Synonyme: PTQ-PCR, RTD-PCR (realtime detection PCR, Echtzeit DetektionsPCR)
real-time-PCR = real-time-polymerasechain-reaction
rel. = relative/r
Rez. = Rezidiv
RILP = Rab-interacting lysosomal
protein
RNA = Ribonuclein acid
RNasen = Ribonukleasen
RPE-Puffer = Puffer aus dem RNeasy
Lipid Tissue Mini Kit (50)
rRNA = ribosomale RNA
RT = Revese Transkriptase
RTD-PCR = real-time detection PCR
RTK = Rezeptortyrosinkinase
RT-PCR = Reverse Transkription-PCR
RW-Puffer = Puffer aus dem RNeasy
Lipid Tissue Mini Kit (50)
sec. = Sekunde
Ser = Serin
sFRP = secreted Frizzled-related protein
Sig. = Signifikanz
SIM2 = single-minded homolog 2
(Drosophila)
sog. = sogenannt/e/es
S-Phase = Synthese-Phase
SPSS = Statistical Package for the Social
Sciences; Softwarefirma, die Statistikund Analyse-Software entwickelt und
vertreibt
S-R-A-Sequenz = C: Cystein, S: Serin
STAT-Faktoren = Signal Transducers
and Activators of Transcription
sWAs = soluble Wnt antagonists
SYBR-Green = 2-{2-[(3Dimethylamino-propyl)- propylamino]1-phenyl- 1H-chinolin-4-ylidenmethyl}3-methyl-benzothiazol-3-ium-Kation
T = Temperatur
T = Thymin
T1,T2-gewichtetes Bild =
Signalintensitäten im MRT
TAE-Puffer = Tris-Acetat-EDTA-Puffer
Taq = Thermus aquaticus
TATA-Box = Thymin-Adenin-ThyminAdenin-Box
TCF4 = transcription factor 4
TGFB2 = transforming growth factor,
beta 2
TGF-β = transforming growth factor,
beta
Thr = Threonin
Tm = Schmelztemperatur
TP53 = tumor protein p53 (Li-Fraumeni
syndrome)
tRNA = transfer RNA
T-Test = beliebigen Hypothesentest mit
t-verteilter Testprüfgröße
Tyr = Tyrosin
U = Units
u.a. = unter anderem
UpM = Umdrehungen pro Minute
USA = United States of America
U-Test = Mann-Whitney-Test,
Homogenitätstest
UV = Ultra Violett
v.a. = vor allem
Vav2 = vav 2 oncogene
VCR = Vincristin
VEGF = vascular endothelial growth
factor
W = Watt
WAVE2 = Wiskott-Aldrich syndrome
protein family member 2
Wg = wingless, bezieht sich auf
Drosophila
WHO = World Health Organisation
Wif1 = Wnt inhibitory factor-1
Wilcoxon-W-Test = U-Test, MannWhitney-Test
Wnt = Wingless-type
Wnt2 = wingless-type MMTV
integration site family member 2
WT = Wilms Tumor
WT-1 = Wilms Tumor 1
XWnt-8 = Wnt-1/int-1-related
YO-PRO-1 = Fluorsezenzfarbstoff
z = Verteiltung innerhalb einer
Prüfstatistik (U-Test)
z.B. = zum Beispiel
ZNS = Zentrales Nerven System
α = alpha
α = Irrtumswahrscheinlichkeit,
Signifikanzniveau
β = beta
µg = Mikro Gramm
µl = Mikro Gramm
µM = Mikro Mol
90
10. Tabellenanhang
Tabelle 10
Auflistung aller Proben und ihrer Probenpräparation, sortiert nach histologischer
Nummer
Anzahl
ProbenNr.
Präparationsdatum
Histologie
Total
RNA
in µg
Rest
RNA
in µg
1
37/02
25.10.2005
2
63/02
25.10.2005
GBM
58,01
48,2
16.03.2006
7+
2
Astro III
5,72
*
16.03.2006
7+
3
3
64/02
26.10.2005
GBM
4
67/02
14.09.2005
Astro II
46,39
37,7
16.03.2006
7+
4
16,09
10,48
16.09.2005
5+
*
122/02
26.10.2005
2
GBM Rez.
230,95
203,0
16.03.2006
7-
5
5
124/02
6
01/03
27.10.2005
GBM
45,77
37,1
16.03.2006
7+
6
10.10.2005
GBM
21,36
15,1
16.03.2006
7+
7
7
04/03
03.09.2005
29,65
22,60
08.09.2005
3+
2
Referenz
08/03
03.09.2005
GBM
Pilozytisches
Astro
15,24
*
*
8
17/03
21/03
(1)
21/03
(2)
28.04.2006
GBM
64,66
54,10
29.04.2006
9+
2
02.09.2005
Astro III
3,43
*
*
9
9
PCR
Datum
Gel
PCR
Position
Nr.
Nummer
09.09.2005
Astro III
4,12
*
08.04.2006
8+
3
27/03
28/03
(1)
28/03
(2)
28.04.2006
GBM
19,77
13,70
29.04.2006
9+
3
30.08.2005
GBM Rez.
4,40
*
*
01.09.2005
GBM Rez.
53,92
44,50
08.09.2005
3+
3
10.10.2005
GBM
6,735
*
16.03.2006
7+
8
10.10.2005
GBM
3,29
*
*
13
29/03
35/03
(1)
35/03
(2)
27.10.2005
GBM
12,97
7,6
16.03.2006
7+
9
14
36/03
08.04.2006
GBM Rez.
41,81
33,60
29.04.2006
9+
4
15
24.10.2005
Astro III
25,36
18,7
16.03.2006
7+
10
20.08.2005
GBM
6,20
*
*
16
37/03
51/03
(1)
51/03
(2)
03.09.2005
GBM Rez.
11,20
6,08
07.09.2005
2+
3
17
54/03
24.05.2005
GBM Rez.
9,50
4,50
28.08.2005
1+
2
18
65/03
15.09.2005
Astro III
4,93
*
08.04.2006
8+
4
19
68/03
08.04.2006
GBM
11,04
5,92
29.04.2006
9+
5
20
09.09.2005
Astro II
9,10
4,10
12.09.2005
4+
2
03.09.2005
GBM Rez.
6,75
*
*
10.09.2005
GBM Rez.
15,1
9,50
12.09.2005
4+
3
09.09.2005
Astro III
7,25
*
*
10.09.2005
Astro III
4,5
6,50
12.09.2005
4+
4
21.08.2005
GBM
?
*
*
03.09.2005
GBM
3,36
*
*
23
69/03
74/03
(1)
74/03
(2)
75/03
(1)
75/03
(2)
76/03
(1)
76/03
(2)
76/03
(3)
10.09.2005
GBM
10,64
5,50
12.09.2005
4+
5
24
96/03
10.10.2005
Astro III
4,69
---
16.03.2006
7+
11
25
103/03
28.04.2006
GBM
8,47
*
29.04.2006
9+
6
10
11
11
12
13
16
21
21
22
22
23
23
91
Anzahl
ProbenNr.
Präparationsdatum
26
121/03
27
28
137/03
152/03
(1)
152/03
(2)
29
30
Gel
Position
PCR
Nummer
Nr.
Histologie
Total
RNA
in µg
Rest
RNA
in µg
PCR
Datum
03.09.2005
Astro III
12,70
7,40
08.09.2005
3-
4
24.10.2005
Astro III
24,35
17,8
16.03.2006
7+
12
03.09.2005
GBM 1. Rez.
5,67
*
*
10.09.2005
GBM Rez.
21,98
15,70
12.09.2005
4+
7
153/03
03.09.2005
GBM 2. Rez.
69,90
58,90
08.09.2005
3+
5
03/04
08.04.2006
GBM
7,50
*
29.04.2006
9+
7
31
08/04
10.09.2005
Astro II
8,36
*
16.09.2005
5+
3
32
47/04
01.09.2005
GBM Rez.
21,00
14,90
07.09.2005
2-
2
*
53/04
08.04.2006
GBM
0,97
*
*
33
58/04
14.09.2005
Astro II
24,13
17,71
16.09.2005
5+
4
34
60/04
08.04.2006
GBM
40,34
32,30
29.04.2006
9+
8
35
26.08.2005
GBM Rez.
20,12
14,00
28.08.2005
1+
3
06.09.2005
Astro III
4,10
*
*
36
76/04
87/04
(1)
87/04
(2)
09.09.2005
Astro III
23,29
16,90
12.09.2005
4+
8
37
04/05
05.09.2005
GBM Rez.
15,09
9,60
08.09.2005
3+
7
38
10/05
03.04.2006
GBM
91,20
78,00
08.04.2006
8+
5
39
11/05
14.09.2005
Astro II
8,66
*
16.09.2005
5+
5
40
18/05
30/05
(1)
30/05
(2)
44/05
(1)
44/05
(2)
05.04.2006
Astro II
7,53
*
08.04.2006
8+
6
09.09.2005
Astro II - III
5,09
*
*
10.09.2005
Astro II - III
25,6
19,00
12.09.2005
4+
9
15.09.2005
GBM
119,12
103,20
16.09.2005
5+
6
03.03.2006
GBM
11,0
---
06.03.2006
6+
2
28
36
41
41
42
42
*
68/05
15.09.2005
Astro II
1,57
*
*
43
74/05
03.04.2006
GBM
9,47
4,52
08.04.2006
8+
7
44
78/05
04.04.2005
Astro III
12,88
7,60
08.04.2006
8+
8
45
79/05
15.09.2005
GBM
31,04
23,94
16.09.2005
5+
7
46
80/05
05.04.2006
GBM
35,74
28,10
08.04.2006
8+
9
47
83/05
15.09.2005
GBM
25,29
18,76
16.09.2005
5+
8
48
89/05
15.09.2005
Astro III
48,04
39,23
16.09.2005
5+
9
49
103/05
03.04.2006
GBM
70,90
59,80
08.04.2006
8+
10
50
119/05
25.03.2006
GBM
15,34
9,80
08.04.2006
8+
11
*
124/05
04.04.2006
GBM Rez.
1,97
*
*
51
29/06
05.04.2006
GBM Rez.
36,22
28,60
08.04.2006
8+
12
52
33/06
05.04.2006
GBM
55,41
45,80
08.04.2006
8+
13
53
45/06
10.04.2006
Astro II-III
9,92
*
29.04.2006
9+
9
54
51/06
28.04.2006
GBM
3,89
*
29.04.2006
9+
10
92
Tabelle 11
Ergebnisse für Wif1
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
delta
Probe
GAPDH
GAPDH
WIF1
WIF1
delta Ct
delta Ct
rel. WIF1
Reference
14,15
14,7167
21,61
21,6200
6,9033
0,0000
1,0000
30,2333
13,9033
7,0000
0,0078
28,9000
10,4000
3,4967
0,0886
25,2700
8,7133
1,8100
0,2852
30,9433
13,8933
6,9900
0,0079
35,9200
15,8100
8,9067
0,0021
39,4300
17,1267
10,2233
0,0008
25,6267
10,1733
3,2700
0,1037
25,4233
8,1833
1,2800
0,4118
29,9900
13,1267
6,2233
0,0134
29,3467
11,8633
4,9600
0,0321
35,1033
16,5567
9,6533
0,0012
41,0367
19,8300
12,9267
0,0001
39,9433
19,2667
12,3633
0,0002
25,6600
5,5967
-1,3067
2,4737
67/02
08/04
14,82
21,15
15,18
22,10
16,34
16,3300
16,25
30,90
16,40
30,27
17,90
18,5000
18,90
16,49
28,80
16,5567
16,59
18/05
65/03
16,69
25,50
17,0500
30,70
17,17
30,51
20,10
20,1100
31,98
20,50
41,32
22,60
22,3033
15,90
38,30
15,4533
45/06
25,43
17,2400
25,34
17,80
24,71
16,79
16,8633
37/03
29,21
16,94
29,25
17,80
17,4833
18,33
28,94
29,40
29,70
18,5467
36,01
18,80
34,31
18,51
34,99
21,10
21,2067
41,53
21,30
40,13
21,22
41,45
20,74
20,6767
20,56
20,70
19,67
37,25
45,00
20,73
75/03
31,51
16,86
17,48
21/03
26,22
17,10
17,17
63/02
26,26
25,19
15,23
16,82
40,32
39,67
15,23
30/05
34,46
19,73
22,90
87/04
31,62
17,29
21,41
69/03
25,40
24,91
16,59
11/05
28,48
29,42
18,70
58/04
29,53
37,58
20,0633
26,24
26,40
93
Probe
Ct
Ct MW
GAPDH
GAPDH
19,82
96/03
121/03
21,72
89/05
21,2867
16,20
16,1767
21,39
29/03
15,5567
13,7300
6,8267
0,0088
29,8000
8,1067
1,2033
0,4343
28,4500
12,8933
5,9900
0,0157
31,5467
14,1867
7,2833
0,0064
44,3367
24,9933
18,0900
0,0000
39,7867
20,6433
13,7400
0,0001
40,8933
22,3467
15,4433
0,0000
45,0000
24,5333
17,6300
0,0000
34,9267
19,4033
12,5000
0,0002
27,6300
11,2667
4,3633
0,0486
39,5233
19,9367
13,0333
0,0001
37,4100
17,4500
10,5467
0,0007
27,0767
10,5733
3,6700
0,0786
29,1300
8,9333
2,0300
0,2449
33,4467
17,0767
10,1733
0,0009
30,47
29,21
28,49
15,44
27,65
17,45
17,3600
19,37
18,75
31,81
33,64
29,19
19,3433
44,53
45,00
43,48
19,1433
40,19
18,78
39,05
19,90
40,12
18,43
18,5467
41,33
18,43
40,68
18,78
40,67
20,60
20,4667
15,47
45,00
45,00
45,00
15,5233
34,08
15,38
33,12
15,72
37,58
16,80
16,3633
28,23
16,10
27,49
16,19
27,17
19,57
19,5867
19,58
16,26
38,35
41,24
38,98
19,9600
32,87
40,32
20,50
103/03
29,9067
30,14
15,72
19,80
76/03
0,0227
29,63
19,89
68/03
5,4633
29,30
19,30
35/03
12,3667
22,50
20,28
27/03
33,6533
35,71
30,93
21,6933
20,52
17/03
rel. WIF1
21,19
15,51
39,04
16,5033
26,56
16,49
27,23
16,76
27,44
19,69
20,1967
28,99
20,70
29,65
20,20
28,75
16,39
delta
28,65
19,36
01/03
delta Ct
34,13
19,30
124/02
delta Ct
21,54
17,35
64/02
WIF1
31,12
17,28
37/02
WIF1
20,60
16,22
78/05
Ct MW
24,34
16,11
137/03
Ct
16,3700
34,66
94
Probe
Ct
Ct MW
GAPDH
GAPDH
16,47
15,47
10/05
44/05
80/05
20,22
19,8567
17,78
17,8533
13,2200
6,3167
0,0125
36,0200
16,1633
9,2600
0,0016
28,0967
10,2433
3,3400
0,0988
30,9267
10,8700
3,9667
0,0640
27,2567
12,8067
5,9033
0,0167
24,9067
8,6900
1,7867
0,2898
28,3933
11,4167
4,5133
0,0438
24,1833
8,1033
1,2000
0,4353
26,1733
11,5367
4,6333
0,0403
23,6133
8,5700
1,6667
0,3150
31,7600
17,0200
10,1167
0,0009
26,9500
7,5800
0,6767
0,6256
25,9933
9,1633
2,2600
0,2088
30,1300
11,6200
4,7167
0,0380
37,54
20,11
28,32
27,77
28,20
20,0567
29,20
20,10
27,20
19,96
36,38
14,40
14,4500
27,75
14,43
26,65
14,52
27,37
15,77
16,2167
16,86
15,95
25,29
24,92
24,51
16,9767
28,23
28,50
28,45
16,0800
24,23
16,30
24,12
15,99
24,20
14,58
14,6367
25,57
14,68
26,48
14,65
26,47
14,67
15,0433
14,76
19,21
23,73
23,51
23,60
14,7400
32,31
31,21
19,3700
27,12
19,12
27,11
19,78
26,62
16,60
16,8300
16,75
18,47
26,33
25,99
17,14
51/03
28,2767
28,86
34,94
14,72
36/03
0,0153
19,53
15,60
28/03
6,0300
35,58
14,86
51/06
12,9333
19,82
17,16
33/06
28,5500
29,28
27,58
16,91
119/05
rel. WIF1
28,39
15,98
103/05
delta Ct
15,50
16,90
83/05
delta Ct
14,80
17,94
79/05
WIF1
27,77
15,0567
17,84
74/05
WIF1
28,60
15,60
14,87
delta
32,77
15,6167
15,78
60/04
Ct MW
32,91
16,25
03/04
Ct
25,66
18,5100
28,97
18,49
32,54
18,57
28,88
95
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
delta
Probe
GAPDH
GAPDH
WIF1
WIF1
delta Ct
delta Ct
rel. WIF1
54/03
18,35
18,3133
28,95
29,4600
11,1467
4,2433
0,0528
27,5500
11,0700
4,1667
0,0557
25,9633
6,9800
0,0767
0,9482
28,7033
11,6200
4,7167
0,0380
28,1733
10,4700
3,5667
0,0844
28,8833
11,6233
4,7200
0,0379
26,6267
10,2633
3,3600
0,0974
23,8833
7,7467
0,8433
0,5574
delta
rel.
74/03
152/03
18,35
30,76
18,24
28,67
16,47
16,4800
16,50
27,50
16,47
26,94
19,60
18,9833
18,77
16,56
24,53
17,0833
16,79
76/04
04/05
17,53
28,22
17,7033
27,74
17,63
28,23
17,95
28,55
17,20
17,2600
28,49
17,31
29,47
17,27
28,69
16,33
16,3633
16,36
16,20
26,92
26,54
16,40
29/06
29,19
28,70
17,90
47/04
24,98
28,38
18,58
153/03
28,21
26,42
16,1367
24,30
16,23
23,23
15,98
24,12
Tabelle 13
Ergebnisse für Rab34
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
Probe
GAPDH
GAPDH
RAB34
RAB34
delta Ct
delta Ct
RAB34
Reference
15,70
15,8767
25,97
25,5333
9,6567
0,0000
1,0000
22,7533
6,4233
-3,2333
9,4044
22,6867
4,1867
-5,4700
44,3235
21,8767
5,3200
-4,3367
20,2054
24,1867
7,1367
-2,5200
5,7358
26,8600
9,6367
-0,0200
1,0140
16,00
24,88
15,93
67/02
08/04
58/04
16,34
25,75
16,3300
16,25
22,36
16,40
23,60
17,90
18,5000
22,30
18,70
22,98
16,49
16,5567
16,69
21,70
21,58
16,59
18/05
22,78
18,90
16,59
11/05
22,30
22,35
17,0500
24,51
17,29
23,85
17,17
24,20
17,50
17,2233
28,10
96
Probe
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
GAPDH
GAPDH
RAB34
RAB34
16,87
18,34
87/04
30/05
20,40
20,42
17,2400
21/03
22,38
17,80
22,25
16,8633
17,53
24,80
24,26
15,8333
23,77
15,89
26,86
16,8133
17,27
20,70
89/05
17,6700
28,40
17,38
28,37
17,86
28,80
16,1767
20,26
28,26
29,11
18,19
29,78
15,5567
27,13
15,72
26,13
15,44
26,28
17,3600
22,6467
5,4067
-4,2500
19,0273
22,2700
5,4067
-4,2500
19,0273
24,3033
6,5633
-3,0933
8,5347
26,1767
10,3433
0,6867
0,6213
27,9033
11,0900
1,4333
0,3703
30,5367
13,2533
3,5967
0,0827
21,4000
1,3367
-8,3200
319,5726
28,5233
10,8533
1,1967
0,4363
20,3267
4,1500
-5,5067
45,4644
29,0500
10,9200
1,2633
0,4166
26,5133
10,9567
1,3000
0,4061
22,37
22,2367
4,8767
-4,7800
27,4741
26,7067
10,2233
0,5667
0,6752
21,84
17,35
16,44
24,7610
20,57
18,1300
17,90
17,45
-4,6300
20,15
17,28
37/02
21,72
21,21
15,51
5,0267
30,10
20,0633
21,27
18,30
20,4800
29,71
16,22
78/05
31,80
19,82
16,20
1,9141
27,81
17,2833
16,11
137/03
28,19
19,67
17,77
-0,9367
27,71
17,22
121/03
27,90
15,95
17,36
96/03
23,85
18,10
17,55
8,7200
21,89
17,7400
17,39
75/03
22,59
17,59
15,66
27,2133
22,33
15,50
37/03
23,31
17,10
16,94
63/02
20,62
15,23
16,79
RAB34
28,83
15,4533
16,86
45/06
24,24
15,23
16,82
delta Ct
28,57
18,80
15,90
delta Ct
25,74
18,4933
18,34
69/03
rel.
26,74
17,30
65/03
delta
22,50
16,4833
26,82
16,46
27,34
16,55
25,96
97
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
delta
rel.
Probe
GAPDH
GAPDH
RAB34
RAB34
delta Ct
delta Ct
RAB34
64/02
15,67
15,8067
26,46
25,2100
9,4033
-0,2533
1,1920
25,2000
9,6267
-0,0300
1,0210
29,3733
12,1367
2,4800
0,1792
22,6000
6,6867
-2,9700
7,8354
23,1733
6,8033
-2,8533
7,2267
27,9600
11,5733
1,9167
0,2649
24,5533
7,6900
-1,9667
3,9086
23,7867
7,3767
-2,2800
4,8568
24,6333
4,4367
-5,2200
37,2715
24,8000
7,9667
-1,6900
3,2266
22,4733
6,4900
-3,1667
8,9797
22,9200
7,8800
-1,7767
3,4263
26,5267
9,8500
0,1933
0,8746
21,2400
3,3867
-6,2700
77,1717
27,3333
10,1433
0,4867
0,7137
21,0800
6,6300
-3,0267
8,1492
124/02
01/03
15,79
24,59
15,96
24,58
15,41
15,5733
15,50
24,71
15,81
25,45
17,18
17,2367
17,31
15,91
29,80
15,9133
15,90
29/03
35/03
16,29
22,68
16,3700
22,50
16,40
23,28
16,27
16,3867
103/03
28,21
16,54
26,32
16,80
16,8633
16,40
25,32
16,4100
23,38
16,12
23,48
19,69
20,1967
24,61
20,20
24,62
16,91
16,8333
15,75
15,40
24,53
15,9833
21,95
15,0400
23,30
14,62
22,80
15,10
22,66
16,55
16,6767
26,45
16,79
26,30
16,69
26,83
17,78
17,8533
16,85
21,30
21,27
17,94
79/05
22,86
22,61
17,84
74/05
24,60
25,27
16,30
44/05
24,67
20,70
15,90
10/05
24,50
16,71
16,61
60/04
24,71
23,63
16,98
03/04
29,35
16,35
17,10
76/03
23,74
16,42
16,69
68/03
22,95
22,17
15,93
27/03
29,42
28,90
17,22
17/03
25,44
21,15
17,1900
27,69
17,32
27,39
17,40
26,92
14,40
14,43
14,4500
20,99
21,13
98
Probe
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
GAPDH
GAPDH
RAB34
RAB34
14,52
80/05
83/05
15,77
16,2167
15,98
24,51
16,9767
33/06
15,95
24,12
24,20
14,6367
26,48
14,65
26,47
15,0433
15,13
51/03
19,21
19,3700
152/03
24,50
17,1933
22,93
17,33
22,91
18,5100
24,15
23,97
16,4800
22,27
16,50
21,89
16,47
22,18
18,9833
16,56
17,53
22,93
22,92
-5,0267
32,5970
24,1833
8,1033
-1,5533
2,9349
26,1733
11,5367
1,8800
0,2717
23,6133
8,5700
-1,0867
2,1238
24,5850
9,4600
-0,1967
1,1460
23,8700
4,5000
-5,1567
35,6707
22,9133
5,7200
-3,9367
15,3128
25,8000
7,2900
-2,3667
5,1575
24,1133
5,8000
-3,8567
14,4868
22,1133
5,6333
-4,0233
16,2609
23,3067
4,3233
-5,3333
40,3175
22,8633
5,7800
-3,8767
14,6890
23,0433
5,3400
-4,3167
19,9272
22,6100
5,3500
-4,3067
19,7895
25,2400
8,8767
-0,7800
1,7171
22,90
22,77
17,7033
22,60
23,70
17,95
22,83
17,2600
22,82
17,31
22,20
17,27
22,81
16,33
4,6300
23,68
17,0833
17,63
17,20
21,6067
23,31
17,90
04/05
24,22
18,24
19,60
1,9543
25,81
18,3133
16,79
76/04
25,61
18,35
16,47
-0,9667
25,98
18,58
47/04
22,90
17,14
18,77
153/03
23,51
23,60
18,35
8,6900
24,72
18,57
74/03
24,45
19,78
18,47
24,9067
23,60
15,1250
18,49
54/03
23,73
19,12
17,11
RAB34
23,51
15,12
36/03
25,57
14,68
15,60
28/03
24,23
15,99
14,67
delta Ct
21,64
16,0800
14,86
51/06
21,49
16,30
14,58
delta Ct
21,69
17,16
119/05
25,29
24,92
16,91
103/05
rel.
21,12
16,90
16,86
delta
16,3633
25,17
99
Probe
Ct
Ct MW
Ct
Ct MW
GAPDH
GAPDH
RAB34
RAB34
23,8833
16,36
16,20
rel.
delta Ct
delta Ct
RAB34
7,7467
-1,9100
3,7581
25,28
16,40
29/06
delta
25,27
16,1367
24,30
16,23
23,23
15,98
24,12
100
11. Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name, Vorname:
Henzgen, Julia
Anschrift:
Vondelstraße 39
50677 Köln
Telefon:
0 221 – 30 09 68 31
Geburtsdatum/-ort:
06.07.1981, Berlin-Wilmersdorf
Schulbildung und Universität
1987 - 1993
Besuch der Grundschule auf dem Tempelhofer Feld,
Berlin
1993 - 2000
Besuch der Eckener-Oberschule (Gymnasium), Berlin,
Abschluss Abitur
10/2001 – 04/2008
Studium der Medizin an der Philipps-Universität,
Marburg; Abschluss Examen
03/2002
Pflegepraktikum im Krankenhaus Neukölln, Berlin
08/2002
Pflegepraktikum in der Reha Chrischona Basel, Schweiz
09/2003
Physikum an der Philipps-Universität Marburg
03/2004
Famulatur in einer Gemeinschaftspraxis, Marburg
08/2004
Famulatur am Universitätsklinikum Bonn (Zentrum für
Geburtshilfe und Frauenheilkunde)
04/2005
Famulatur im Krankenhaus Matema, Tanzania
Seit 07/2005
Experimentelle Doktorarbeit in der Neurochirurgie,
Marburg
02/2006
Famulatur im Krankenhaus Adakpame/Lome, Togo
08/2006
1. Tertial Praktisches Jahr (Chirurgie) im St.
Marienkrankenhaus, Siegen
12/2006
2. Tertial Praktisches Jahr (Gynäkologie) im
St. Marienkrankenhaus, Siegen
04/2007
3. Tertial Praktisches Jahr (Innere Medizin) an der
Philipps-Universität, Marburg
04/2008
Examen (zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung)
101
Beruf
Seit 06/2008
Assistenzärztin für Gynäkologie und Geburtshilfe im
Krankenhaus der Augustinerinnen gGmbH, Köln
Wissenschaftliche Veröffentlichungen/Vorträge
11/2005
Vortrag mit dem Titel "Genetic progression of
malignant glioma" an der Philipps-Universität Marburg
05/2006
Poster mit dem Titel "Wif-1 and Rab34 as markers for
early events in malignant astrocytoma genesis" auf der
57. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Neurochirurgie, Essen
10/2006
Poster mit dem Titel "Wif-1 and Rab34 as markers for
early events in malignant astrocytoma genesis" auf dem
Congress of Neurological Surgeons Chicago, Illinois
Auslandsaufenthalt
Freiwilliges soziales Jahr in Südafrika in der Zeit von
September 2000 bis September 2001; Arbeit in einem
Kindergarten und einer Holzwerkstatt auf der
Missionsstation Makapanspoort
Nebentätigkeit
11/2004 – 06/2006
Mitarbeit in einer Gemeinschaftspraxis, Marburg
Köln, Dezember 2009
102
12. Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer in Marburg waren Damen/Herren
Adamkiewicz
Arnold
Aumüller
Hofmann
Hoyer
Jungclas
Basler
Baum
Becker
Bertalanffy
Bien
Boudriot
Cetin
Christiansen
Czubayko
Daut
Eilers
Kalder
Kill
Klenk
Klose
Koch
Köhler
Koolman
Krause
Krieg
Kroll
Kuhlmann
Feuser
Folz
Fuchs
Lang
Lenz
Lill
Löffler
Lohoff
Gerdes
Göke
Görg
Gotzen
Griss
Grundmann
Grzeschik
Gudermann
Maier
Maisch
Mandrek
Moll
Moosdorf
Mueller
Müller
Mutters
Hamer
Hasilik
Hertl
Herrmann-Lingen
Neubauer
Radsak
Remschmidt
Renz
Richter
Riera
Röhm
Röper
Rosenow
Rothmund
Schäfer
Schmidt
Schnabel
Schneider
Schrader
Seitz
Sommer
Steiniger
Strauch
Sure
Vogelmeier
Wagner
Weihe
Weiler
Werner
Westermann
Wollenberg
Wulf
Oertel
103
13. Danksagung
Mein herzlicher Dank geht an meine Betreuer Prof. Dr. med. H. Bertalanffy und Dr.
med. O. Bozinov aus der Klinik für Neurochirurgie der Philipps-Universität
Marburg und des Universitätsklinikums Gießen und Marburg, Standort Marburg für
die hervorragende Betreuung und sorgfältige Überarbeitung dieser Doktorarbeit.
Besonderer Dank gilt dem ehemaligen Klinikleiter Prof. Dr. med. H. Bertalanffy für
die Bereitstellung des molekularen neurochirurgischen Labors und die Nutzung der
Geräte. Weiterhin möchte ich Herrn Prof. Dr. med. U. Sure in Zusammenarbeit mit
Dr. med. O. Bozinov für die Bereitstellung dieses Themas danken.
Ein besonderer Dank gilt Silvia Köhler für die Hilfe und Unterstützung im Labor,
weiterhin für alle Informationen, durch die diese Arbeit erst zustande kommen
konnte; Jens-Martin Kalk für die Zusammenarbeit und die schönen Tage und Nächte
im Labor, für geduldige Erklärungen und zuverlässiges zur Seite stehen.
Des Weiteren gilt mein Dank Herrn Dr. M. Ritter, Herrn Prof. A. Neubauer und D.
Schwell aus der Klinik für Hämatologie und Onkologie der Philipps-Universität
Marburg und des Universitätsklinikums Gießen und Marburg, Standort Marburg für
die selbstverständliche Überlassung von Geräten zur Durchführung der PCR und
Real-Time PCR; Herrn Prof. Dr. K. Strauch aus dem Institut für Med. Biometrie und
Epidemiologie der Philipps-Universität Marburg und des Universitätsklinikums
Gießen und Marburg, Standort Marburg für die Unterstützung bei der statistischen
Auswertung; Herrn P. Rexin von der Philipps-Universität Marburg und des
Universitätsklinikums Gießen und Marburg, Standort Marburg für die freundliche
Bereitstellung der histologischen Bilder.
Auch geht mein herzlicher Dank an Katharina Dolata und Denis Richter für tägliche
und nächtliche wissenschaftliche, aber auch seelische Betreuung, vor allem auch für
die Verbreitung von Ruhe, wenn es eigentlich mal wieder um eine „Hau-RuckAktion“ ging; Ute Hangleiter für Korrekturlesen, Probedrucke, Apfelkuchen und
sonstige Wohltaten; Ina Kluge für all die tollen Partys und Ablenk-Manöver; Rolf
Landskron für die Lebendorganspende und den Traum von Australien.
Weiterhin möchte ich meiner Familie und vor allem meinen Eltern danken, denen
diese Doktorarbeit gewidmet ist. Mein herzlicher Dank gilt auch meiner Patentante
und all meinen guten Freunden, die mir in manch´ verzweifelter Minute zur Seite
standen.
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14. Ehrenwörtliche Erklärung
über die selbstständige Anfertigung der Dissertation
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur
Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel
„Expressiosunterschiede von Wif1 und Rab34 bei Gliomen“
in der Klinik für Neurochirurgie unter Leitung von Prof. Dr. med. C. Nimsky mit
Unterstützung durch Dr. med. Oliver Bozinov ohne sonstige Hilfe selbst
durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der
Dissertation aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem inoder ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur
Promotion eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation
vorgelegt.
Vorliegende Arbeit wurde in folgenden Publikationsorganen veröffentlicht:
11/2005
Vortrag mit dem Titel "Genetic progression of
malignant glioma" an der Philipps-Universität Marburg
05/2006
Poster mit dem Titel "Wif-1 and Rab34 as markers for
early events in malignant astrocytoma genesis" auf der
57. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Neurochirurgie, Essen
10/2006
Poster mit dem Titel "Wif-1 and Rab34 as markers for
early events in malignant astrocytoma genesis" auf dem
Congress of Neurological Surgeons Chicago, Illinois
Ort, Datum
Julia Henzgen
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