In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen einer Kombinationstherapie
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Aus der Medizinischen Klinik I der Universität zu Lübeck Direktor: Prof. Dr. med. H. Lehnert In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen einer Kombinationstherapie mit Bortezomib, Mafosfamid und 4-OH-Trofosfamid an humanen Tumorzelllinien LX1, MX1 und S117 Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Universität zu Lübeck – Aus der Sektion Medizin – vorgelegt von Jan Mikael Gerl aus Hillerød Lübeck 2013 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. T. Wagner 2. Berichterstatter/-in: Priv.-Doz. Dr. rer. physiol. M. Tegtmeier Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2014 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 21.11.2014 Promotionskommission der Sektion Medizin i ii Meinen Eltern iii Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Geschichte der Chemotherapie . . . 1.2 Alkylanzien . . . . . . . . . . . . . 1.3 Neue Generation der Krebstherapie 1.4 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . 1.5 Kombinationstherapie . . . . . . . 1.6 Stand der Forschung . . . . . . . . 1.7 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Material und Methoden 2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Medien und Zusätze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.2 Puffer und Stammlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 Zytostatika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.1 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.2 Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.3 Cyclophosphamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3.4 Mafosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5.1 Herstellung der Lösungen und Medien für die Zellkultur . 2.6 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.1 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.2 Kultivieren und Passagieren . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6.3 Kryokonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Proteinchemische Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.1 Kristallviolett-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.2 Zytostatikaaufbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.3 Behandlungsschemata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 2 3 4 7 8 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 11 11 11 12 12 12 13 13 13 14 14 14 15 15 16 16 16 17 17 17 18 18 Inhaltsverzeichnis 2.8 . . . . . . . 20 20 20 21 21 21 22 3 Ergebnisse 3.1 In-vitro-Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib . . . . . . . . . . . . . 3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid und 4OHTrofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.1 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.2 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.3 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.4 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.5 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4.6 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Versuchsablauf in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib 3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 25 25 4 Diskussion 4.1 Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 54 55 2.9 Tierexperimentelle Versuche . 2.8.1 Tierhaltung . . . . . . 2.8.2 Narkose . . . . . . . . 2.8.3 Tumoranzüchtung . . . 2.8.4 Tumortransplantation 2.8.5 Behandlungsschemata Biometrie und Statistik . . . . iv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 27 27 30 34 35 37 39 41 44 47 49 49 50 52 Inhaltsverzeichnis 4.3 4.4 4.5 4.6 4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1 . Das Mammakarzinom MX1 . . . Das Weichteilsarkom S117 . . . . Zeitversetzte Versuche . . . . . . Schlussfolgerung . . . . . . . . . . v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 59 61 61 63 5 Zusammenfassung 64 Literaturverzeichnis 66 Abbildungsverzeichnis 77 Tabellenverzeichnis 79 A Abkürzungsverzeichnis 82 B Grafische Darstellungen 84 C Daten 90 D Danksagung 99 E Lebenslauf 100 F Erklärung 101 1 1 Einleitung 1.1 Geschichte der Chemotherapie Die Behandlung maligner Tumore hat sich im 20. Jahrhundert entwickelt. Lange Zeit stand als Therapie lediglich die Möglichkeit der lokalen Tumortherapie durch Chirurgie oder Bestrahlung zur Verfügung. 1942 wurde als erstes Chemotherapeutikum StickstoffLost eingesetzt und markierte damit den Beginn der systemischen Therapieansätze. Zu Beginn der 90er Jahre wurden die ersten Antikörper entwickelt, und 10 Jahre später standen die ersten zielgerichteten Therapien (englisch Targeted Therapies“) zur ” Verfügung [10]. Die Entwicklung der systemischen Chemotherapie brachte den entscheidenden Vorteil, Tumore auch in fortgeschrittenen Stadien behandeln zu können und damit die Lebenszeit der Patienten zu verlängern und die Lebensqualität zu verbessern. Da die zytotoxische Wirkung von Chemotherapien allerdings nicht ausschließlich auf Tumorzellen beschränkt ist, verursachen sie zahlreiche und zum Teil erhebliche Nebenwirkungen, die sich limitierend auf die Therapie auswirken können. Viele schnell proliferierende Gewebe, wie das Knochenmark, die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes und die Geschlechtszellen, leiden unter der zytotoxischen Wirkung der Medikamente. So entstehen Leukozytopenien, Mukositiden und Sterilität. Nach wie vor ist es Inhalt zahlreicher Forschungsvorhaben, die Behandlungsmöglichkeiten gezielter einzusetzen und damit Nebenwirkungen zu reduzieren [81]. Dank neuer Erkenntnisse der Biomedizin und Molekularbiologie können bestimmte Eigenschaften maligner Zellen für die Entwicklung neuer, spezifischer Arzneistoffe genutzt werden. Diese Medikamente umfassen u.a. monoklonale Antikörper gegen Oberflächenproteine von Krebszellen oder Inhibitoren der Blutgefäßneubildung [65]. 1 Einleitung 2 1.2 Alkylanzien Zu den ältesten Chemotherapeutika gehören die Alkylanzien. Sie sind eine Stoffgruppe, die zyklusunspezifisch DNA-Schäden induziert [42]. Die Alkylanzien lassen sich in die Untergruppen der platinhaltigen Chemotherapeutika, wie Cisplatin, und in die Senfgasderivate, wie beispielsweise Cyclophosphamid, Trofosfamid und Mafosfamid, aufteilen. Die Stoffe der zuletzt genannten Gruppe werden auch als Oxazaphosphorinderivate bezeichnet. Cyclophosphamid wurde als eines der ersten Zytostatika Anfang der fünfziger Jahre entdeckt und ist zur Behandlung vieler verschiedener Tumore zugelassen, wie beispielsweise dem Mammakarzinom, Lungenkarzinom und Weichteilsarkom [14, 56]. Das heutzutage am häufigsten angewandte Oxazaphosphorin ist das Cyclophosphamid. Es ist eine inaktive Vorstufe (Prodrug) und wird erst in der Leber mittels Cytochrom P450-abhängigen Oxidasen zu dem aktiven Metaboliten 4-Hydroxycyclophosphamid hydroxyliert. Im Falle des Cyclophosphamids handelt es sich um das Cytochrom 2B6 (Cyp2B6). In der aktivierten Form gelangt das Cyclophosphamid leicht durch die Zellmembran ins Zellinnere, wo es dann spontan zu Acrolein und dem alkylierenden Phosphoramid-Mustard zerfällt (Abb. 1.1). Letztgenanntes bewirkt in der Zelle eine Vernetzung der einzelnen DNA-Stränge, was zu Einzel- oder Doppelstrangbrüchen führt und letztendlich den Zelltod induziert. Für die toxischen Nebenwirkungen macht man unter anderem Acrolein und in geringerem Ausmaß Chloracetaldehyd verantwortlich. Um Nebenwirkungen vorzubeugen wird Cyclophosphamid mit Mesna kombiniert, welches an Acrolein bindet und es dadurch neutralisiert [14, 31, 52, 56, 74]. Da Cyclophosphamid erst durch Enzyme aktiviert werden muss, wird es in Zellversuchen durch Mafosfamid ersetzt. Dieses zerfällt in wässriger Lösung spontan äquimolar zu 4-OH-Cyclophosphamid und Mesna [15]. Trofosfamid schädigt die DNA von metabolisch aktiven Zellen auf gleiche Weise wie Cyclophosphamid und Mafosfamid. Aufgrund der stark lipophilen Eigenschaften wird Trofosfamid ausschließlich per os verabreicht. Im Organismus wird es teilweise zu Ifosfamid und zu einem geringen Teil zu Cyclophosphamid metabolisiert. Trofosfamid wird wie Cyclophosphamid über Enzyme der Cytochrom P450-Familie in der Leber aktiviert, in diesem Fall jedoch durch das Cytochrom 3A4 (Cyp3A4). Das so entstandene 4-OH-Trofosfamid zerfällt spontan zu Trofosfamid-Lost (Abb. 1.1). Im Gegensatz zu Cyclophosphamid ist die aktivierte Form von Trofosfamid in seiner kristallinen Form stabil und kann deshalb in Zellkulturversuchen verwendet werden. Die Nebenwirkungen von Trofosfamid werden zu einem größeren Teil vom Chloracetaldehyd verursacht, anders als bei Cyclophosphamid, was die stärker ausgeprägteren neurotoxischen Nebenwirkungen erklärt. Vergleichsweise hat Trofosfamid jedoch ein niedrigeres Neben- 1 Einleitung 3 wirkungsprofil und scheint eine vielversprechende palliative Behandlungsmöglichkeit für eine Reihe von Tumoren zu sein. Es wird, ebenfalls wie Cyclophosphamid, unter anderem beim Mammakarzinom, Weichteilsarkom und Lungenkarzinom eingesetzt [14, 31, 52, 56, 74]. Oxazaphosphorine Ifosfamid Trofosfamid Prodrug Inakv Mafosfamid Strukturisomere Mesna Cyclophosphamid Cyp 2B6 4-OH-Ifosfamid 4-OH-Cyclophospamid Acrolein Chloracetaldehyd Acrolein Chloracetaldehyd Akve Metabolite 4-OH-Trofosfamid Cyp 450 Spontaner Zerfall Leber Cyp 3A4 Im ER der Cyp 3A4 Abbildung 1.1: Dargestellt ist der Stoffwechsel der Oxazaphosphorin-Derivate Trofosfamid, Mafosfamid und Cyclophosphamid. Sie liegen als inaktive Vorstufe (Prodrug) vor. Die Pfeile in dieser Ebene indizieren spontanen Zerfall. Damit die Stoffe aktiviert werden können, müssen sie erst durch die Untertypen des Cytochrom P450 (Cyp 450) verstoffwechselt werden, welche auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER) der Leberzellen zu finden sind. Mafosfamid bedarf als einziges keiner enzymatischen Metabolisierung, da es spontan in seine aktive Form zerfallen kann. [56] 1.3 Neue Generation der Krebstherapie Die neue Generation der systemischen Chemotherapien umfasst, wie oben erwähnt, die sogenannten Targeted Therapies“. Man kann sie unter anderem in die Wirkklassen der ” niedermolekularen Arzneimittel“ (englisch small molecule drugs“), Monoklonalen An” ” ” tikörper“ und Apoptose induzierenden Arzneimittel“ unterteilen. ” Die small molecule drugs“ blockieren spezifische Enzyme und Rezeptoren für Wachs” tumsfaktoren, welche am Prozess des Tumorwachstums beteiligt sind. Ein Beispiel dafür ist Imatinib, das fehlgefaltete Enzyme oder Proteine in einer Zelle erkennt und weitere Zellteilungen dieser Zelle durch die kompetitive Hemmung der Tyrosinkinase verhindert. Monoklonale Antikörper blockieren Moleküle, wie Oberflächenrezeptoren oder Wachstumsfaktoren. Als Beispiel ist hier Bevacizumab zu nennen, welches die Angioneo- 1 Einleitung 4 genese hemmt. Das wichtigste angiogenetische Molekül ist der Vascular Endotheli” al Growth Factor“ (VEGF), welcher mitogen auf das Gefäßendothel wirkt und die Permeabilität der Gefäße beeinflusst. Bevacizumab bindet den VEGF, verhindert somit die Gefäßneubildung in Tumoren und verbessert die Membranpermeabilität der Gefäße. Letzteres kann die Wirkung zeitgleich gegebener Zytostatika begünstigen [72]. Apoptose induzierende Therapeutika lösen, wie der Name schon sagt, den programmierten Zelltod aus. Zu den Apoptose induzierenden Medikamenten gehört u.a. Bortezomib. Entdeckt wurde es, als man gezielt proteasomhemmende Proteine entwickelte, da man sich aufgrund theoretischer Kenntnisse eine proapoptotische Wirkung erhoffte. Bei den In-vitro-Screeningsversuchsreihen des National Cancer Institute“ (NCI) erwies ” sich PS-341, welches später in Bortezomib umbenannt wurde, als potentes zytotoxisches Agens gegenüber einer Reihe von humanen Krebszelllinien. Aufgrund der hohen Ansprechrate und der geringen Nebenwirkungen bei der Behandlung des Multiplen Myeloms wurde Bortezomib 2003 im Eilverfahren von der amerikanischen Food and ” Drug Administration“ (FDA) und ein Jahr später von der europäischen European ” Medicines Agency“ (EMA) für die Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen [61]. 1.4 Bortezomib Die Hemmung der Proteindegradierung über das Proteasom stellt eine neue Therapieoption für die Behandlung von malignen Erkrankungen dar, da insbesondere gezeigt werden konnte, dass maligne Zellen sensibler als normale Zellen auf die Proteasomhemmung reagieren. Dies wurde in vitro und in vivo am Beispiel von transformierten Fibroblasten, CLL-Zellen (chronisch lymphatische Leukämie) oder CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen von Patienten mit CML gezeigt [39, 43, 66]. Die Wirkungsweise des Bortezomib steht in engem Zusammenhang mit dem Wirkmechanismus der Proteasomen. Es gibt mehrere zelluläre Systeme, die Proteine abbauen, wobei man lysosomale und nicht lysosomale Systeme unterscheidet. Proteasome spalten Proteine nicht lysosomal und sind maßgeblich an der zellulären Homöostase beteiligt. Durch das Degradieren von Proteinen bilden sie einen Gegenspieler der Proteinbiosynthese. Das Proteasom ist ein Enzymkomplex, bestehend aus einer 20S-Kerneinheit und zwei regulativen 19SUntereinheiten. Die zur Degradation bestimmten Proteine werden vom Proteasom unter Energieverbrauch entfaltet und anschließend in der Kerneinheit proteolytisch gespalten. Zuvor müssen diese Proteine jedoch mit Ubiquitin markiert werden, welches ein hoch konservatives Protein ist. Die Bindung des Ubiquitins an ein Protein wird durch drei 1 Einleitung 5 Enzyme (E1, E2 und E3) katalysiert (Abb. 1.2). Der weitere Werdegang des markierten Proteins hängt dann von der Art sowie von der Anzahl angehängter Ubiquitin-Moleküle ab. Das Anbinden von einem oder mehreren einzelnen Ubiquitin-Molekülen beeinflusst die intrazelluläre Verteilung eines Proteins und ermöglicht die Interaktion mit anderen Proteinen. Eine Polyubiquitinierung, die Markierung eines Proteins mit mehr als fünf aneinander geketteten Ubiquitin-Molekülen, bewirkt den Abbau über das Proteasom [37, 71]. Es wird eine Vielzahl von Proteinen durch das Proteasom gespalten. Die Spaltung bewirkt je nach Protein eine Aktivierung, Stabilisierung oder Inaktivierung. Durch diese Vorgänge beeinflusst das Proteasom die intrazelluläre Konzentration von Regulatoren des Zellzyklus (p21, p27 [83]), der DNA-Reparatur [22, 26, 30], der Apoptose (Glykoprotein 130 [38, 64, 68]), der Tumorsuppression (p53 [84]), des Immunsystems (Iκ Bα Inhibitor des Transkriptionsfaktor NF-κ B [85]) und der zellulären Stressantwort (c-Jun N-terminale Kinase [89][92]). Außerdem beseitigt es auch fehlgefaltete sowie überflüssige Proteine. Die Wirkungsweise des Bortezomib entsteht durch die Hemmung der Proteasomen und den dadurch entstehenden Einfluss auf die oben genannten Systeme. Abbildung 1.2: Dargestellt ist der Proteasomstoffwechsel. Ein zu verstoffwechselndes Protein wird durch die Enzyme E1-E3 ubiquitiniert und unter Energieverbrauch durch das Proteasom gespalten. - ADP = Adenosin Diphosphat, ATP = Adenosin Triphosphat, E1 = Ubiquitin aktivierendes Enzym, E2 = Ubiquitin konjugierendes Enzym, E3 = Ubiquitin Protein Ligase. Abbildung von Rieken et al. 2010 [75]. Bortezomib besetzt reversibel, mit hoher Affinität und Selektivität die katalytische Untereinheit des Proteasoms und hemmt somit dessen Funktion. Eine Verhinderung der regelrechten Verstoffwechselung der oben genannten Proteine verursacht eine Störung des Gleichgewichts derselben in der Zelle. Das somit entstehende Überangebot oder der Mangel dieser Proteine führt zur Hemmung der Zelldifferenzierung, zur Initiierung von Entzündungsreaktionen und letztendlich zum Zellzyklusarrest und dem programmierten Zelltod (Apoptose). Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass Bortezomib eine zytostatische Wirkung auf 1 Einleitung 6 eine Vielzahl von Tumoren hat. Zu diesen Tumoren gehören unter anderem das Multiple Myelom [53], die T-Zell-Leukämie [78, 86, 87], das Prostata-Karzinom [1, 93], das KolonKarzinom [19], das Melanom [3] sowie das Lungenkarzinom [1], das Mammakarzinom [1] und das Sarkom [82]. Eine Reihe von Studien wurden zum nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) durchgeführt, im Gegensatz dazu finden sich nur wenige Studien zum kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC). Mortenson et al. konnten 2005 in einem Zellversuch zeigen, dass das SCLC empfindlich auf Bortezomib reagiert. Außerdem liegen Studien vor, die vermuten lassen, dass Bortezomib die Chemoresistenz von SCLC unterbinden kann (Siehe Kap. 1.6). Bis heute liegen für Bortezomib keine In-vivo-Daten vor, weder für das SCLC noch für die Kombinationsgabe. Eine 2006 veröffentlichte Phase-II-Studie von Lara et al. zur Behandlung von refraktären SCLC-Patienten mit Bortezomib als Einzelbehandlung konnte keine signifikante Überlebensverlängerung zeigen [49]. Im Gegensatz zu der Phase-II-Studie zum SCLC liegen Daten zu einem In-vivo-Versuch für Kombinationsversuche am NSCLC vor. Teicher et al. haben für das NSCLC im Tiermodell der Maus eine signifikante antineoplastische Wirkung von Bortezomib als Einzeltherapie und auch als Kombinationstherapie mit Cisplatin, Flourourazil, Taxol oder Adriamyzin zeigen können [87]. Beim Mammakarzinom konnten Teicher et al. einen zytotoxischen Effekt von Bortezomib sowohl bei In-vitro- als auch In-vivoVersuchen nachweisen [87]. In den In-vivo-Versuchen mit Mäusen wurde Bortezomib alleine und in Kombination mit Cyclophosphamid oder Cisplatin untersucht. Bei der Einzeltherapie mit Bortezomib konnte man im Vergleich zur peroralen bei der intraperitonealen Verabreichung eine signifikant niedrigere Zellüberlebensrate sehen. Die Kombination von Bortezomib und Cyclophosphamid in den Tierversuchen verstärkte die zytotoxische Wirkungen sowohl auf die Tumorzellen (bis zum 40-fachen) als auch auf die Knochenmarkszellen, dies jedoch zu einem geringeren Grad (bis zum 18-fachen). Dies bedeutet eine effektivere Krebsbehandlung, aber auch ein erhöhtes Risiko für Knochenmarksdepression in Form von Anämie, Trombozytopenie oder Leukopenie und ein damit verbundenes erhöhtes Risiko für schwere Infektionen. Bis heute befassen sich nur wenige Studien mit der Wirkung von Bortezomib auf das Sarkom. Eine 2010 veröffentlichte In-vitro-Studie von Bauer et al. zu den Gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zeigte, dass diese empfindlich auf Bortezomib reagieren [7]. In der Studie wurde die Zelllinie GIST882 mit verschiedenen BortezomibKonzentrationen im nM-Bereich behandelt und über 3 Tage inkubiert. Anschließend wurde die Zellüberlebensrate mit einem Apoptose-Assay gemessen. Die Konzentration, bei der 50% des Wachstums gehemmt wurde, lag ungefähr bei 20 nM. Im gleichen Jahr wurde eine Studie von Shapovalov et al. publiziert, in der gezeigt wurde, dass Mäuse mit einem Rhabdomyosarkom ebenfalls gut auf die Einzeltherapie mit Bortezomib 1 Einleitung 7 ansprechen. Maki et al. hatten bereits 2005 eine Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung von Patienten mit metastasierendem Sarkom mit Bortezomib durchgeführt. Man stellte fest, dass die Einzelbehandlung mit Bortezomib keinen signifikanten antineoplastischen Effekt hatte und man in zukünftigen Studien nur präklinisch getestete Kombinationsbehandlungen anwenden sollte. Bis heute gibt es allerdings keine Studien über die Kombinationsbehandlungen von Bortezomib und Oxazaphosphorinen. 1.5 Kombinationstherapie Wie im vorhergehenden Kapitel dargestellt, stößt die Einzeltherapie an ihre Grenzen, und der Einsatz von Kombinationstherapien in der Krebsbehandlung gewinnt immer mehr an Bedeutung. Ist ein Medikament zur Einzeltherapie zugelassen, ist es gesetzlich nicht zwingend notwendig, eventuelle Kombinationen präklinisch zu testen [24]. Das hat zur Folge, dass man Kombinationsbehandlungen an Patienten einsetzen kann, ohne die Wirkung in präklinischen Studien gezeigt zu haben. Dies birgt die Gefahr, dass man Wechselwirkungen wie z.B. Resistenzmechanismen erst zu einem späteren Zeitpunkt beim Patienten entdeckt. Fanucchi et al. haben 2006 in einer Phase-II-Studie die Kombination von Bortezomib und Docetaxel, einem antimikrotubulären Zytostatikum, an Lungenkarzinom-Patienten untersucht [27]. Man hat nur eine geringfügig verstärkte antineoplastische Wirkung für die Kombinationsbehandlung im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Bortezomib festgestellt. In der Arbeit wird auf den positiven Effekt der Kombinationstherapie von Bortezomib und Doxetacel, einem Taxan, verwiesen. Es fehlt jedoch ein Verweis auf Studien, welche dies in präklinischen Versuchen belegen. In den 1999 durchgeführten Studien von Teicher et al. wurde gezeigt, dass Paclitaxel, welches ebenfalls ein Taxan ist, in Kombination mit Bortezomib einen guten antineoplastischen Effekt auf eine Lungenkrebszelllinie hat [87]. Auch wenn Docetaxel und Paclitaxel zur Gruppe der Taxane gehören und eine gleiches Grundgerüst haben, können alleine aufgrund unterschiedlicher Seitenketten unerwartete Wechselwirkungen in der Kombination mit Bortezomib auftreten. Dies veranlasste 2007 Jung et al., eine In-vitro-Studie zur Kombination von Docetaxel und Bortezomib am NSCLC durchzuführen, in der sie sowohl antagonistische als auch synergistische Effekte beobachten konnten [41]. Der synergistische Effekt war dann zu beobachten, wenn die Zellen erst mit Docetaxel und zeitverzögert mit Bortezomib behandelt wurden. Auch wenn man nicht direkt vom präklinischen Effekt auf den klinischen Effekt einer Behandlung schließen kann, zeigen diese Daten, wie wichtig es ist, eine Kombinationstherapie erst in präklinischen Studien zu untersuchen, um im Patienten eine optimale Wirkung erzielen zu können. 1 Einleitung 8 1.6 Stand der Forschung Das Lungenkarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung des Mannes. Veröffentlichungen der deutsche Krebsgesellschaft [4] kann man entnehmen, dass das kleinzellige Lungenkarzinom, ein Subtyp des Lungenkarzinoms, charakteristischerweise zentral mit hoher Proliferationsrate wächst und früh hämatogen oder lymphogen metastasiert, vorzugsweise in das Gehirn, die Knochen, Leber oder Nebenniere. Klinisch wird das kleinzellige Lungenkarzinom in eine begrenzte (limited disease, LD) und eine ausgedehnte Krankheitsausdehnung (extensive disease, ED) eingeteilt. Da es meist erst im fortgeschrittenen Stadium symptomatisch wird, liegt die mediane Überlebensrate bei drei bis fünf Monaten und die 1 Jahresüberlebensrate bei ca. vier Prozent. Die deutsche Krebsgesellschaft erklärt, dass die Therapie der Wahl bei begrenzter wie bei dissiminierender Erkrankung die Polychemotherapie ist. Beim SCLC LD kann die Therapie mit Bestrahlung und in seltenen Fällen auch mit Chirurgie ergänzt werden. Außerdem führen sie aus, dass eine Polychemotherapie einen bedeutend besseren Effekt hat als eine Einzelstoffbehandlung. Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasiertem ” medizinischen Standard.“ [4]. Die Standardchemotherapien stellen sich aus einem Alkylanzium wie Cisplatin oder Cyclphosphamid, und einem zweiten und eventuell dritten Medikament zusammen. Klinische Studien zur Kombinationsbehandlung des SCLC mit Bortezomib sind bis jetzt noch nicht veröffentlicht worden. In präklinischen Studien haben Mortenson et al. zeigen können, dass es die Synthese der regulatorischen Proteine des B-cell lymphoma 2“ ” (Bcl-2) hemmt [63]. Außerdem wurde in präklinischen Studien von Zangemeister-Wittke et al. gezeigt, dass diese Bcl-2-Proteine Grund für die Chemoresistenz des SCLC sein können [96]. Durch die Blockade der Synthese von funktionsfähigen Bcl-2-Proteinen zeigten sie, dass diese Proteine, die von Proteasomen verstoffwechselt werden, antiapoptotisch wirken und einer der Hauptfaktoren der Chemoresistenz im SCLC sind. Diese Beobachtungen führen zu der Hypothese, dass Bortezomib einer Cheomoresistenz im SCLC entgegenwirken kann. Dowlati et al. konstatierten in ihrer Studie von 2007, dass im SCLC eine hohe angiogenetische Aktivität zu beobachten sei und dies sich als therapeutischer Angriffspunkt eigne [23]. Im Jahr zuvor haben Roccaro et al. mit verschiedenen Untersuchungen festgestellt, dass Bortezomib antiangiogenetisch wirkt [77]. Sie zeigten, dass die Proliferation von Endothelzellen von Myelom-Patienten durch Bortezomib gehemmt wird. Außerdem haben sie eine dosisabhängige Inhibition der Angiogenese anhand von verschiedenen Assays nachgewiesen. Die häufigste maligne Erkrankung der Frau ist das Mammakarzinom, wobei das invasive duktale Mammakarzinom der am häufigsten vorkommende Untertyp des Mammakarzinoms ist. Die Wahl der Therapie des Mammakarzinoms soll den individuellen 1 Einleitung 9 Gegebenheiten gerecht werden und hängt unter anderem von Tumortyp, Aus-breitung, Lokalisation und diversen Risikofaktoren ab. Die ausführlichen Leitlinien sind auf der Homepage der Deutschen Krebsgesellschaft einzusehen [46]. Vereinfacht wird primär operiert und speziell bei brusterhaltender Operation nachbestrahlt. Erst in den fortgeschrittenen Stadien kommt die neoadjuvante und adjuvante Polychemotherapie hinzu, die sich aus einer Kombination von u.a. Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Flourouracil zusammensetzt. Im fortgeschrittenen Stadium wird diese aggressive Kombinationstherapie gegebenenfalls von einer milderen palliativen Monotherapie abgelöst. Seit einigen Jahren wird der Effekt von Bortezomib auf das Mammakarzinom untersucht. Es gibt einige Forschungsgruppen, die in In-vitro-Versuchen zeigten, dass verschiedene Mammakarzinomzellen auf eine Therapie mit Bortezomib ansprechen [16, 18, 87]. Im Vergleich dazu konnten Ames et al. 2009 keine signifikante Steigerung der Apoptoserate bei der Monotherapie mit Bortezomib feststellen, hingegen jedoch erhöhte Aktivität der Apoptose induzierenden Pfade, weswegen man empfiehlt, eine Kombinationsbehandlung zu untersuchen [2]. Einzig die 2008 veröffentlichten Ergebnisse der Forschungsgruppe um Xu et al. [95] zeigten eine Resistenz des Mammakarzinoms gegenüber Bortezomib. Klinische Versuche zur Kombination mit einem zweiten Zytostatikum haben verschiedene Ergebnisse erbracht. Eine 2008 veröffentlichte Studie von Schmid et al. zur Kombination von Capecitabin mit Bortezomib an therapierefraktären Mammakarzinom-Patientinnen zeigte eine moderate Verlängerung des progressionsfreien Überlebens [80]. Die Kombination war für die Patientinnen gut verträglich und hatte wenige Nebenwirkungen. Die Kombination von Bortezomib und Doxorubicin in einer 2010 veröffentlichten Studie von Irvin et al. wurde gut toleriert, hatte aber keine signifikante Wirkungsverstärkung [40]. Zur Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib gibt es bis heute eine einzige Arbeit aus dem Jahr 1999 von Teicher et al. [87]. In ihren Vorversuchen mit Mäusen konnte gezeigt werden, dass die intraperitoneale Verabreichung von Bortezomib der oralen Verabreichung vorzuziehen ist, da Bortezomib eine um ein Vielfach verstärkte zytotoxische Wirkung bei einer nur gering erhöhten Knochenmarkstoxizität zeigte. Bei den In-vivo-Kombinationsversuchen mit Cyclophosphamid und Bortezomib zum Mammakarzinom konnte eine bis zu 40-fache Verstärkung der Zytotoxizität beobachtet werden. Die Knochenmarkstoxizität verstärkte sich im Vergleich dazu nur um das 17-fache. Anders als bei den Erwachsenen kommt Lungen- und Brustkrebs bei Kindern seltener vor. Das Weichteilsarkom stellt nach den Malignomen des zentralen Nervensystems (ZNS) die zweitgrößte Gruppe der soliden Tumoren in der Pädiatrie dar. Es ist mesenchymalen Ursprungs und kommt zu 60% an den Extremitäten vor. Die WHO hat 61 maligne Sarkomentitäten registriert. Die Vielzahl an Sarkomen erklärt die Uneinigkeit und die widersprüchlichen Ergebnisse bei Studien zum Ansprechen auf Chemothera- 1 Einleitung 10 pieprotokolle. Die niedrig malignen Sarkome und Chondrosarkome sprechen nicht bis kaum auf Chemotherapien an, weswegen sie chirurgisch angegangen werden sollten. Bei inoperablen Fällen wird u.a. mit Ifosfamid, Doxorubicin, Cyclophosphamid und Methotrexat in verschiedenen Kombinationen behandelt [67, 79, 94]. Bei Begleiterkrankungen oder reduziertem Allgemeinzustand sollte weniger aggressiv therapiert werden. In solchen Fällen wird u.a. Trofosfamid als Monotherapie empfohlen. Die Ansprechwahrscheinlichkeit bei der Trofosfamid-Monotherapie ist gering und kann alternativ mit einer neueren Substanz kombiniert werden [79]. Die bis jetzt vorliegenden Studien zeigen jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Mortalität beim Vergleich von Mono- und Polychemotherapie [60, 73]. In der 2009 durchgeführten klinischen Studie von Maurel et al. verglich man den Effekt von Doxorubicin mit dem der Kombination von Doxorubicin und Ifosfamid [60]. Bei der Kombinationstherapie wurden mehr Nebenwirkungen beobachtet, aber keine Verlängerung des progressionsfreien Überleben. Es gibt wenige Studien zu Sarkomen und der Behandlung mit Bortezomib. Diese zeigen, dass Ewingsarkome [57], Rhabdomyosarkome [9] und Osteosarkome [82] sensibel gegenüber Bortezomib sind. In einer Phase-II-Studie von Maki et al. aus dem Jahr 2005 zur Einzelbehandlung von Sarkomrezidiven mit Bortezomib wurde eine nur geringfügige antineoplastische Aktivität beobachtet, weswegen man auch hier eine Kombinationsbehandlung vorschlägt [58]. 1.7 Fragestellung Die meisten Neoplasien werden mit einer Kombination von Chemotherapeutika behandelt, da diese sich als effektiver als die jeweilige Einzelbehandlung erwiesen haben. In Kapitel 1.4 und 1.6 werden Studien erwähnt, die gezeigt haben, dass Bortezomib Eigenschaften hat, die eine Kombination mit einem zweiten Zytostatikum als vielversprechend erscheinen lassen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob es bei der Kombination von den Oxazaphosphorinen Trofosfamid und Mafosfamid mit Bortezomib in Zellversuchen zu einer Wirkungsverstärkung kommt und ob eine eventuelle Wirkungsverstärkung durch die zeitversetzte Gabe der Substanzen beeinflusst wird. Die Kombinationsbehandlungen wurden in Zellversuchen an den häufigsten Malignomen der Frau, des Mannes und des Kindes untersucht. In vorliegender Studie wurden das Mammakarzinom MX1, das Lungenkarzinom LX1 und das Weichteilssarkom S117 verwendet. Im Anschluss an die In-vitro-Untersuchungen wurde der Frage nachgegangen, ob sich die Ergebnisse der Zellversuche am Tiermodell der Maus zum LX1 reproduzieren lassen. 11 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Labormaterial Tabelle 2.1: Labormaterial Labormaterial 96 Well - Mikrotiterplatten Falcon Röhrchen (15 ml, 50 ml) sterile Pipetten Pipettenspitzen (200 µl, 1000 µl) Biocidal ZF Desinfektionsspray Zellkulturflaschen 75cm2 Einfrierröhrchen, Cryo Tube Tuberkulinspritze 1ml Kanüle 26G, 0,45mm Steriles Abdecktuch 45cm x 75cm Skalpell 11er Klinge Knopfsonde Cutasept Steri-Strip Bezugsquelle Nunc, Wiesbaden Nunc, Wiesbaden Eppendorf AG, Hamburg Greiner, Griesheim WAK Chemie Medical GmbH, Steinbach Nunc, Wiesbaden Nunc, Wiesbaden BD Plastipak, Heidelberg BD Pastipak, Heidelberg Hartmann AG, Heidenheim C. Bruno Bayha GmbH, Tuttlingen Aesculap AG, Tuttlingen Bode Chemie, Hamburg Noba Verbandmittel, Wetter 2.1.2 Geräte Tabelle 2.2: Geräte Geräte Bezugsquelle Brutschrank Typ BB 6220 CU Heraeus Instruments, Hanau Werkbank Gelaire, Sydney, Australien Spektralphotometer für Mikrotiterplatten Dynex Technologies, Berlin Mikroskop ID 03 Carl Zeiss, Göttingen Neubauer Zählkammer Karl Hecht KG, Sondenheim/Rhön Megafuge Heraeus Sepatech, Osterode 2 Material und Methoden 12 Tabelle 2.2: Fortsetzung Geräte Elektronische Waage Bezugsquelle Sartorius, Göttingen Wasserbad GFL, Burgwedel Ultraschallbad, Dandelin Sonorex, TK 52 Bandelin Electronic, Berlin ELISA-Waschstation Behring, Marburg Rüttler, MS2 Minishaker IKA-Werk GmbH, Staufen Pipetus-Akku Hirschmann, Eberstadt Stickstoffbehälter Cryson GmbH, Schöllkrippen Wasserstrahlpumpe KNF-Lab, Balterswil, Schweiz Glaspasteurpipetten Hecht- Assistent, Sondeheim Käfig Makrolon Typ III E. Becker und Co., Castrop-Rauxel 2.2 Reagenzien 2.2.1 Medien und Zusätze Tabelle 2.3: Medien und Zusätze Medien und Zusätze RPMI 1640 Zellmedium Einfriermedium Cryo-Safe I Fetal Bovine Serum Penicillin-Streptomycin (Penicillin 50.000 IU/ml Streptomycin 50 mg/ml) Trypsin-EDTA-Lösung Ampicillin Rompun 2% Pentobarbital-Na. 1,8 ml Amp. Bezugsquelle Cambrex Bio Science, Verviers, Belgien c.c.pro GmbH, Oberdorla Biochrom AG, Berlin Gibco/ Invitrogen, Karlsruhe Gibco/ Invitrogen, Karlsruhe Ratiopharm, Ulm BayerVital, Leverkusen Apotheke UK-SH, Lübeck 2.2.2 Puffer und Stammlösungen Tabelle 2.4: Puffer und Stammlösungen Puffer und Stammlösungen Bezugsquelle MES-Puffer, Morpholenoethansulfonic acid Gerbu, Gaiberg Essigsäure 10% J.T. Backer, Griesheim Kristallviolett 0,1% Sigma, Deisenhofen 2 Material und Methoden 13 Tabelle 2.4: Fortsetzung Puffer und Stammlösungen Glutaraldehyd Grade II 25% Lösung Bezugsquelle Sigma, Deisenhofen Natriumchloridlösung 0,9% Apotheke UK-SH, Lübeck Ethanol 70% hergestellt aus Ethanol 96% Apotheke UK-SH, Lübeck Natriumhydroxid 1N (NaOH) Apotheke UK-SH, Lübeck Aqua destillata Apotheke UK-SH, Lübeck 2.3 Zytostatika 2.3.1 Bortezomib Bezugsquelle: Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, USA Summenformel: C19 H25 BN4 O4 Bortezomib ist eine Dipeptidyl-Borsäure. Das bei den Versuchen verwendete Bortezomib war eine fertig hergestellte Injektionslösung, die aus den Beständen der stationären Therapie zur Verfügung gestellt wurde. Die Lösung wurde aliquotiert und bei -20°C gelagert. Bortezomib hat eine Molekulargewicht von 384,24. Die verschiedenen Konzentrationen für die einzelnen Versuche wurden durch Verdünnung mit Medium hergestellt (Kap. 2.7.2). 2.3.2 Trofosfamid Bezugsquelle: Baxter Oncology, Frankfurt Summenformel: C9 H18 Cl3 N2 O2 P Trofosfamid wurde in zwei Formen angewandt. Das aktivierte Trofosfamid, auch 4OHoder 4OOH-Trofosfamid genannt, wurde in den Zellversuchen angewandt. Die inaktive Grundsubstanz Trofosfamid wurde in den Tierversuchen verwendet. Das kristalline 4OHTrofosfamid hat ein Molekulargewicht von 355,6. Für die Versuche wurden Röhrchen mit 2 µg Zytostatikum eingewogen und bei -80°C gelagert, um sie bei Bedarf für die Behandlung der Zellen als Stocklösung nutzen zu können. Die gewünschten Konzentrationen wurden mittels einer Verdünnungsreihe hergestellt (Kap. 2.7.2). Das inaktive Trofosfamid mit einem Molekulargewicht von 323,59 wurde ebenfalls als kristalline Substanz geliefert. Es wurde bei -80°C gelagert, wobei für die Versuche Röhrchen mit jeweils 80 mg Trofosfamid abgewogen wurden. Vor Behandlung der Tiere wurde das Trofosfamid in 16 ml 0,9% Kochsalzlösung mittels des Ultraschallbades aufgelöst, wonach die gewünschte Menge intraperitoneal (i.p.) verabreicht wurde 2 Material und Methoden 14 [13, 54, 48, 44, 91]. Bei der peroralen (p.o.) Therapie wurde in Abhängigkeit von Anzahl und Gewicht der Tiere die gewünschte Menge Trofosfamid in dem jeweils nötigen Volumen Leitungswasser gelöst [8, 59]. 2.3.3 Cyclophosphamid Bezugsquelle: Pfizer, Karlsruhe Summenformel:C7 H15 Cl2 N2 O2 P Das kristalline Cyclophosphamid von der Firma Pfizer wurde aus den Beständen der stationären Therapie zur Verfügung gestellt. Das Pulver wurde bei Raumtemperatur trocken gelagert. Am Tag der Therapie wurde mit physiologischer Kochsalzlösung die gewünschte Dosis hergestellt, welche vom Körpergewicht des Versuchstier abhängt (Kap. 2.8.5). Das Molekulargewicht beträgt 279,1. 2.3.4 Mafosfamid Bezugsquelle: NIOMECH, Bielefeld Summenformel: C9 H18 C12 N2 O5 P S2 xC6 H14 N Mafosfamid wurde in seiner kristallinen Form als Mafosfamid L-Lysine mit einem Molekulargewicht von 500,5 g/mol von Niomech bezogen und bei -20°C trocken gelagert. Für die Versuche wurden Röhrchen mit 2 mg Zytostatikum vorbereitet, um sie bei Bedarf für die Behandlung der Zellen als Stocklösung zu verwenden. Die gewünschten Konzentrationen wurden anschließend anhand einer Verdünnungsreihe, wie in Kapitel 2.7.2 beschrieben, hergestellt [13, 54, 48, 44, 91] 2.4 Zelllinien Tabelle 2.5: Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung S117 polymorphkerniges Sarkom der Schilddrüse Cell Lines Service Heidelberg in vitro etabliert von H. Löhrke, 1985 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2 Material und Methoden 15 Tabelle 2.5: Fortsetzung Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung MX1 invasives duktales Mammakarzinom ohne Östrogenrezeptoren Cell Lines Service Heidelberg in vitro etabliert von H. Löhrke, 1985 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg LX1 kleinzelliges Bronchialkarzinom Cell Lines Service Heidelberg in vitro etabliert von H. Löhrke, 1985 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg 2.5 Zellbiologische Methoden 2.5.1 Herstellung der Lösungen und Medien für die Zellkultur Tabelle 2.6: Zusammenstellung der verwendeten Lösungen und Medien Medium, Lösung Komponenten Menge Kulturmedium RMPI 1640 (25 mM Hepes, L-Glutamin) fetales Kälberserum, Penicillin-Streptomycin (50.000IU/ml und 50 mg/ml) 450 ml 50 ml 1 ml Gefriermedium Cryo-safe gebrauchsfertig Glutaraldehyd 11% Glutaraldehyd 25% NaCl 0,9% 44 % 56 % Trypsin EDTA Trypsin EDTA gebrauchsfertig MES Puffer 200mM pH 6,0 MES Aqua dest. NaOH 1N 4,2652g 100 ml bis pH 6,0 Kristallviolett 0,1% Kristallviolett MES-Puffer pH 6,0 100 mg 100 ml Essigsäure 10% Essigsäure 100% Aqua dest. 5 ml 45 ml Pentobarbital-Na. -Rompun-Lsg. Pentobarbital-Na. NaCl-Lsg. 0,9% Rompun 2% NaCl-Lsg. 0,9% 1 9 1 9 ml ml ml ml 2 Material und Methoden 16 2.6 Zellkultur 2.6.1 Steriles Arbeiten Um die Kontamination der Zellkulturen mit Mikroorganismen zu vermeiden, wurde steril gearbeitet. Alle Arbeiten mit den Zellen wurden unter der sterilen Werkbank durchgeführt. Die Arbeitsfläche und die Arbeitsmaterialien wurden zu Beginn der Arbeit mit 70% Ethanol desinfiziert. Außerdem wurden steril verpackte Einmalartikel benutzt und zuvor autoklavierte Glasmaterialien. 2.6.2 Kultivieren und Passagieren Es wurden die humanen Zelllinien MX1, LX1 und S117 verwendet (Tab. 2.5). Die Tumorzellen wurden als Aliquots von 4x106 Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert. Um ausreichend Zellen für die Versuchsansätze zu erhalten, mussten sie nach dem Auftauen in Kulturflaschen (75 cm2 ) subkultiviert werden. Zur Vermehrung wurden die Zellen, die als adhärente Monolayer wachsen, ab einer Konfluenz von ca. 95 % passagiert, indem sie auf zwei oder mehr Flaschen verteilt wurden. Die in flüssigem Stickstoff kryokonservierten Tumorzellen wurden in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut und anschließend in Kulturmedium aufgenommen und in ein Falconröhrchen überführt. Um die Tumorzellen vom restlichen Gefriermedium zu befreien, wurden die Röhrchen mit der Zellsuspension drei Minuten bei 1000-1500 Umdrehungen per Minute (U/min) zentrifugiert, und das Medium wurde anschließend abgesaugt. Das übriggebliebene Zellpellet wurde in Kulturmedium resuspendiert und auf Zellkulturflaschen verteilt. Diese wurden im Brutschrank bei 37°C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert. Vor den Versuchen fand immer eine Subkultivierung statt, um eventuelle Schäden durch die Kryokonservierung auszuschließen. Während die MX1- und LX1-Zellen alle drei Tage subkultiviert wurden, reichten für die Vermehrung der S117–Zellen vier Tage aus. Für das Passagieren der Zellen wurde zunächst das Nährmedium abgesaugt, durch Zugabe von 10 ml 0,9% Kochsalzlösung wurden die Zellen gespült und anschließend mit einer 10%igen Trypsin-Lösung für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflasche lösten sich die Zellen vom Flaschenboden. Um die Trypsinwirkung zu neutralisieren, wurden fünf ml Kulturmedium zugegeben. Diese Suspension wurde in einem 50 ml-Falconröhrchen bei 1500 U/min für 3 Minuten zentrifugiert. Die S117-Zellen wurden bei 1000 U/min über die gleiche Zeit 2 Material und Methoden 17 zentrifugiert. Der Mediumüberstand wurde abgesaugt und das Pellet in Medium resuspendiert. Anschließend wurde die Zellzahl, mittels der Neubauerzählkammer bestimmt, und pro Kulturflasche wurden 4–6x106 Tumorzellen eingesät. 2.6.3 Kryokonservierung Für die Kryokonservierung von Zellen wurde das Pellet wie oben beschrieben gewonnen und in Cryo-Safe-Medium resuspendiert. Durch Cryo-Safe-Medium wird das Auskristallisieren von Wasser im Zellinneren verhindert. Dabei wurde die Zellzahl diesmal auf 4x106 Zellen/ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde in Nunc-Kryoröhrchen mit einem Volumen von je 1,8 ml überführt und anschließend einen Tag bei -80°C heruntergekühlt. Die Kryoröhrchen wurden am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff umgelagert. 2.7 Proteinchemische Methode 2.7.1 Kristallviolett-Assay Der Kristallviolett-Assay wurde erstmals von Joseph E. Grady 1960 beschrieben [33] und für die vorliegenden Versuche - wie von W. Kueng 1989 optimiert [47] - durchgeführt. Mit dieser Methode erhält man ein quantitatives Maß für vitale Zellen. Die Versuche wurden in 96-Well-Platten durchgeführt, die mit einer zuvor festgelegten Anzahl Zellen beimpft wurden. Die zu messenden Zellen wurden 15 Minuten mit einer 11%-igen Glutaraldehydlösung auf einem Plattenrüttler bei 500 U/min inkubiert (Tab. 2.6). Nach Entfernung des Überstands und einem Waschschritt mit destilliertem Wasser wurden die Versuchsplatten luftgetrocknet. Anschließend wurden die Zellen mit einer 1%-igen Kristallviolett-Lösung gefärbt und 20 Minuten auf einem Plattenrüttler inkubiert (Tab. 2.6). Da abgestorbene Zellen ihre Adhärenz verlieren, wurden diese samt dem freien Farbstoff durch den folgenden Waschschritt entfernt. Anschließend wurden die Platten luftgetrocknet und die verbleibenden angefärbten Zellen danach mit 1 ml 10% Essigsäure lysiert (Tab. 2.6). Auf diese Weise wurde der Farbstoff freigesetzt, dessen optische Dichte bei 590 nm im Photometer bestimmt wurde. Durch die Farbstoffkonzentration bzw. die optische Dichte kann man auf die Zellkonzentration rückschließen. 2 Material und Methoden 18 2.7.2 Zytostatikaaufbereitung Für die Herstellung von Verdünnungsreihen wurden Stocklösungen von Mafosfamid (1 mmol/l), 4OH-Trofosfamid (1 mmol/l) und Bortezomib (1 µmol/l) angesetzt (siehe hierzu auch Kapitel 2.3). Die Zytostatika wurden in Medium suspendiert. Anschließend wurden Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid für 3 Minuten im verschlossenen Reagenzglas in ein Ultraschallbad gestellt, um die vollständige Lösung der Stoffe im Medium zu sichern. Zur Bestimmung der geeigneten Mafosfamid- und 4OH-Trofosfamid-Konzentrationen wurden die Arbeiten von Klink et al., Letsch et al. und Braasch et al. herangezogen [54, 11, 44]. Die Arbeit von Teicher et al. diente als Orientierung bei der Bestimmung der Bortezomibkonzentrationen [87]. Die Bortezomibkonzentrationen werden in der vorliegenden Arbeit als Inhibiting Concentration“ IC25, IC50 oder IC75 angegeben, und ” entsprechen bei der jeweiligen Zelllinie einer Wachstumshemmung von 25, 50 oder 75% (durch Bortezomib). Die verschiedenen IC-Werte von Bortezomib sind im Ergebnisteil in Tabelle 3.1 dargestellt. Die Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine sind im Ergebnisteil in Tabelle 3.2 dargestellt. 2.7.3 Behandlungsschemata Da, abgesehen von den verwendeten Zytostatikakonzentrationen, der Versuchsaufbau bei allen Zelllinien identisch war, wird dieser im Folgenden exemplarisch an einer Zelllinie dargestellt. Die 96-Well-Platten wurden am Tag 1 des Versuchs mit Zellen beimpft. LX1- und S117-Platten wurden mit 3x103 Zellen pro Well beimpft, und MX1-Platten wurden mit 5x103 Zellen pro Well beimpft. Der zweite Schritt, die Behandlung, wurde am Tag 2 durchgeführt. Je nach Versuch wurden unterschiedliche Behandlungsschemata angewandt. Es wurden Kombinationsversuche durchgeführt, in denen die Zytostatika zeitgleich und zeitversetzt gegeben wurden. Bei den zeitgleichen Versuchen gab es eine unbehandelte Kontrollplatte und jeweils eine Kontrollplatte zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid und Bortezomib mit den zuvor festgelegten Konzentrationsreihen, die in den Tabellen 3.1 und 3.2 im Ergebnisteil dargestellt sind. Die Versuchsplatten wurden mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 bzw. 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC25 behandelt. Die gleichen Versuche wurden ebenfalls mit Bortezomib IC50 und IC75 durchgeführt (Tab. 2.7). Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurden die Zellen mit einer Stunde Zeitverzögerung behandelt. Dies ist ebenfalls in Tabelle 2.7 dargestellt. Es wurde zum Zeitpunkt null Stunden (0h) mit Bortezomib (IC25 oder IC50) behandelt, und eine 2 Material und Methoden 19 Stunde später (1h) mit Mafosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid und umgekehrt, in den gleichen Konzentrationen wie die zeitgleichen Kombinationen. Der Versuchsaufbau ähnelt dem Aufbau der simultan behandelten Zellen. Es wurden wie zuvor eine unbehandelte Kontrollplatte, sowie eine Kontrollplatte für Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid und Bortezomib verwendet. Diesmal wurde jedoch für Bortezomib eine Kontrollplatte für die Zeitpunkte 0h und 1h benötigt. In diesen Versuchen wurde Bortezomib IC75 ausgeschlossen, da der zytotoxische Effekt der Kombinationen mit Bortezomib IC75 in den zuvor durchgeführten simultanen Behandlungen zu hoch war. Mit dem Verdünnungseffekt, der entsteht, wenn man ein Zytostatikum zum Zeitpunkt 1h dazugibt, wurde folgendermaßen umgegangen: Die Versuchsplatte wurde mit 200 µl des ersten Zytostatikums in normaler Konzentration beimpft und nach einer Stunde mit 10 µl des zweiten Zytostatikums, welches eine 21-mal höhere Konzentration hatte. Dadurch fällt die Konzentration des ersten Zytostatikums mit ca. 5%, welches als akzeptabel angesehen wurde. Die genannten zeitversetzten Kombinationsversuche wurden ebenfalls mit zwei Stunden Verzögerung durchgeführt (Tab. 2.7). In diesem Fall wurde jedoch nur Bortezomib IC50 angewandt, da aufgrund der vorangegangenen Versuche dies am erfolgversprechendsten erschien. Im dritten Schritt wurde die Zellüberlebensrate gemessen. Dies geschah anhand des Kristallviolett-Assays, wie unter Kapitel 2.7.1 beschrieben. Die Versuchsreihen mit LX1 und S117 wurden 48 Stunden nach Behandlung gemessen. Die Versuchsreihen mit MX1-Zellen wurden wegen der geringen Teilungsrate, erst 72 Stunden nach Behandlung gemessen. Die Absorbtionswerte wurden mit den Computerprogrammen Microsoft Excel und GrafPad Prism ausgewertet und dargestellt. Tabelle 2.7: Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien Einzeltherapie MX1 LX1 S117 Bortezomib (B) Mafosfamid (M) Trofosfamid (T) x x x x x x x x x Zeitgleich Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 B+M B+T x x x x x x Um 1h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 und IC50 B 0h + M 1h M 0h + B 1h B 0h + T 1h T 0h + B 1h x x x x x x x x x x x x 2 Material und Methoden 20 Tabelle 2.7: Fortsetzung MX1 LX1 S117 Um 2h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC50 B 0h + M 2h M 0h + B 2h B 0h + T 2h T 0h + B 2h x x x x x x x x x x x x 2.8 Tierexperimentelle Versuche 2.8.1 Tierhaltung Die in den Versuchen verwendeten Nu/Nu-Nacktmäuse wurden aus der Züchtung von Taconic erworben. Durch Deletion eines Gens sind die Nacktmäuse athymisch, was eine fehlende T-Zellprägung zur Folge hat. Artfremde Zellen werden daher nur bedingt vom Immunsystem der Maus erkannt und abgestoßen, was diese Mäuse zum idealen Wirt von Xenografts macht. Die Tiere wurden in der spezifisiert pathogenfreien (SPF) Abteilung der Universitätsklinik Schleswig-Holstein, Campus Lübeck gehalten. Futter und Käfigstreu wurde bei der Firma Altromin erworben. Die Mäuse bekamen Leitungswasser ad libitum und hatten einen konstanten Tag-/Nacht-Rhythmus. Gemäß dem Tierschutzgesetz wurden alle Tierversuche dieser Dissertation unter der Tierversuchsantragsnummer V742-72241 122-4 (22-3/05) vom Ministerium für Umweltschutz, Natur und Forsten des Landes Schleswig-Holstein genehmigt. 2.8.2 Narkose Die Narkose wurde mittels einer Mischung aus Nembutal (Pentobarbital-Natrium) und Rompun durchgeführt (Tab. 2.6). Hierfür wurde Nembutal, wie auch Rompun 2% mit einer isotonischen Kochsalzlösung im Verhältnis 1:10 verdünnt. Beide Lösungen wurden zu gleichen Teilen gemischt (1:1). Die zu verabreichende Dosis war vom Gewicht des Versuchstier abhängig (8 ml/kg KG Nembutal sowie 8 ml/kg KG Rompun 2%). Zur Betäubung eines Tiers wurde nach Desinfektion der Haut die Nembutal-/RompunLösung i.p. injiziert. 2 Material und Methoden 21 2.8.3 Tumoranzüchtung In den Tierversuchen wurde die Tumoranzüchtung im Nacken der Maus wie folgt durchgeführt: Es wurde ausschließlich die Tumorzelllinie LX1 verwendet. In einem ersten Schritt wurden die Zellen in vitro kultiviert, wie unter Kapitel 2.6 beschrieben. Anschließend wurde das Zellpellet zweimal mit 20 ml Zellkulturmedium gewaschen. Das gereinigte Zellpellet wurde in Ringerlösung resuspendiert, und die Zellen wurden auf eine Konzentration von 2 - 4x106 Zellen pro 100 µl eingestellt. Diese wurden dann in einer 1 ml-Spritze aufgenommen und unverzüglich weiterverarbeitet, d.h. dem Anzuchtstier nach Desinfektion der Haut in den Nacken injiziert. Dazu wurde für jede Maus eine neue 12er Kanüle verwendet. Als Prophylaxe wurde für die drei darauffolgenden Tage Ampicillin (10 mg/kg KG) ins Trinkwasser gegeben. Um die Maus mit den Zellen zu beimpfen, wurde sie, wie zuvor beschrieben, mit der Nembutal-/Rompun-Lösung narkotisiert (Kap. 2.8.2). 2.8.4 Tumortransplantation Bei einem Tumorvolumen von mindestens 300 mm3 wurde der Tumor entweder auf ein neues Anzuchttier oder ein Versuchstier transplantiert. Dazu wurden die Tiere, wie unter Kapitel 2.8.2 narkotisiert. Unter aseptischen Bedingungen wurde der Tumor explantiert und auf einer Petrischale in ca. 1 mm3 große Tumorstückchen zerteilt. Zum Schutz vor Austrocknung lagerten die Tumorstückchen bis zur Implantation in einer Petrischale mit 0,9% Kochsalzlösung. Nach der Entnahme des Tumors wurde das narkotisierte Tier durch Genickbruch getötet. Bei den Anzuchttieren wurde der Tumor ins Genick transplantiert und bei den Versuchstieren in die Flanke. Von der Implantationsstelle abgesehen, war der Transplantationsvorgang identisch. In Narkose und unter sterilen Bedingungen wurde an der gewünschten Stelle ein ca. 0,5 cm langer Hautschnitt vorgenommen und mit Hilfe einer Kiefersonde eine subkutane Hauttasche präpariert. Nach der Implantation eines Tumorstückchens wurde der Schnitt mit einem Steri-Strip verschlossen. Zur Infekionsprophylaxse verabreichte man den Tieren Ampicillin über das Trinkwasser, wie in Kapitel 2.8.3 beschrieben. Transplantationsdatum, Tumortyp und Passage wurden entsprechend vermerkt. Jeden zweiten bis dritten Tag wurde das Tumorwachstum kontrolliert (Kap. 2.9). 2.8.5 Behandlungsschemata Die Therapie wurde bei einem Tumorvolumen von 100-150 mm3 begonnen. Die Berechnung des Tumorvolumens ist in Kapitel 2.9 beschrieben. Es wurde mit Trofosfamid, 2 Material und Methoden 22 Cyclophosphamid und Bortezomib behandelt. Die Wirkung einer Einzeltherapie mit je einem der drei Medikamente wurde untersucht sowie die Kombination von Bortezomib und Trofosfamid bzw. Cyclophosphamid. Bortezomib wurde zweimal wöchentlich verabreicht. Trofosfamid und Cyclophosphamid wurden i.p. einmal alle 14 Tage verabreicht. Bortezomib wurde i.p. injiziert in den Konzentrationen 0,3 mg/kg(KG), 0,6 mg/kg(KG) und 1,0 mg/kg(KG). Trofosfamid wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG) verabreicht. Cyclophosphamid (als Äquvalent zu Mafosfamid der In-vitro-Versuche) wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG) verabreicht. Außerdem wurde die metronomische Therapie mit der Stoßtherapie von Trofosfamid in Kombination mit Bortezomib i.p. untersucht. Hierbei wurde Trofosfamid (19 mg/kg(KG)) kontinuierlich über das Trinkwasser verabreicht und zwei-mal wöchentlich mit Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)) i.p. kombiniert. Während der Versuche wurde dreimal wöchentlich das Tumorvolumen bestimmt und vermerkt, ob Nekrosen auf dem Tumor zu sehen waren. 2.9 Biometrie und Statistik Bei den in den Graphiken angegebenen Werten handelt es sich um Mittelwerte (Mean) und Standardfehler (SEM). Die Berechnung und Darstellung der Werte erfolgte mit dem Computerprogramm ExcelTM. Die IC-Werte wurden an den Graphiken des Computerprogramms GraphPad Prism 4 berechnet. Die Zellüberlebensrate wurde anhand der optischen Dichte (OD) errechnet. Dabei wurde eine unbehandelte Kontrolle als 100% Zellüberleben gewertet. Folgende Formel wurde zur Berechnung der Zellüberlebensrate verwendet: ODP robe Zellüberlebensrate% = 100 ODKontrolle Zum Vergleich der Mittelwerte wurde der Mann-Withney-U-Test verwendet, da es sich um ein parameterfreies Prüfverfahren handelt, bei dem die Voraussetzung der Normalverteilung nicht erfüllt sein muß. Ein Signifikanzniveau (p) ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant gewertet. Es wurde untersucht, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrolle und der Kombinationstherapie gibt. Dazu wurden die jeweiligen Mittelwerte bei jeder verwendeten Konzentrationsstufe miteinander verglichen. Die Werte sind tabellarisch u.a. im Anhang C dargestellt. Die p-Werte wurden mit dem Programm PAST“ (Paleontological Statistics Software) berechnet (Universität Blindern ” in Oslo, Norwegen [34]). Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurde mehr als ein Vergleich pro Datensatz durchgeführt, was es nötig machte, das Signifikanzniveau anzupassen, um eine Kumulation des Alphafehlers zu vermeiden. Die AlphafehlerKumulierung besagt, dass mehr Vergleiche pro Datensatz das Risiko erhöhen, ein 2 Material und Methoden 23 falsch positives Ergebnis zu bekommen. Nach der Bonferroni-Methode für multiple Paarvergleiche adjustiert man das Signifikanzniveau, indem man das initial festgelegte Signifikanzniveau (in vorliegender Arbeit p≤0,05) durch die Anzahl der Vergleiche teilt. Bei den zeitversetzten Versuchen wurden bis zu zwei Vergleiche pro Datensatz durchgeführt, weswegen das Signifikanzniveau bei p≤0,025 lag. Außerdem wurde als Mittel der Effektmessung der Combination Index“ (CI) ange” wandt. Dieser beruht auf einer von Chou und Talalay entwickelten Methode, welche der quantitativen Beschreibung einer Kombinationstherapie dient [17]. Wenn die Gesamtwirkung zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen ist, spricht man von einem additiven Effekt (CI=1). Ein synergistischer Effekt liegt vor, wenn die Gesamtwirkung zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen übertrifft (CI<1). Wenn die Gesamtwirkung zweier Medikamente niedriger ist als die jeweiligen Einzelwirkungen, wird das als antagonistischer Effekt bezeichnet (CI>1). Der CI wurde mit der Software Cal” cuSyn“ von Firma Biosoft berechnet. Um den CI genauer zu beschreiben, empfiehlt der Hersteller eine Unterteilung des CI, wie in Tabelle 2.8 dargestellt. Tabelle 2.8: Unterteilung des CI Beschreibung CI stark synergistisch synergistisch moderat synergistisch leicht synergistisch additiv leicht antagonistisch moderat antagonistisch antagonistisch stark antagonistisch 0,10 - 0,30 0,30 - 0,70 0,70 - 0,85 0,85 - 0,90 0,90 - 1,10 1,10 - 1,20 1,20 - 1,45 1,45 - 3,30 3,30 - 10 Um die abschließende Diskussion zu erleichtern, soll der Begriff subadditiver Effekt“ ” ergänzend definiert werden, welcher infolge CalcuSyn schon in den antagonistischen Bereich gehört. Als subadditiv wird der Effekt definiert, bei dem die Gesamtwirkung zweier Medikamente geringer ist als die Summe der Einzelwirkungen, hingegen höher ist als die jeweiligen Einzelwirkungen. Diese Definitionen orientieren sich an dem Buch Anästhesiologische Pharmakotherapie“ von Holger Thiel und Norbert Roewer ” [88]. In den Tierversuchen wurde das Tumorvolumen mit Hilfe eines Messschiebers berechnet. Der Tumor wurde in Längs- und Querrichtung ausgemessen. Da die Tiefe eines Tumors 2 Material und Methoden 24 nicht mit einfachen Mitteln gemessen werden kann, wurde folgende viel verwendete Formel zu Hilfe genommen: Volumen (mm3 ) = Länge (mm) x Breite (mm2 )/ 2 [21, 29] Der Behandlungseffekt wurde anhand der Tumorwachstumsverzögerung gemessen. Dies ist die Zeit, die benötigt wird, um ein gewisses Tumorvolumen zu erreichen im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle. In diesem Fall wurden 800 mm3 als Zielwert festgelegt. 25 3 Ergebnisse 3.1 In-vitro-Versuche 3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib Um die IC25-, IC50- und IC75-Werte für Bortezomib für die Zelllinien MX1, LX1 und S117 (Kap. 2.4) zu ermitteln, wurden die Zellen mit einer steigenden Konzentrationsreihe von Bortezomib behandelt. Anschließend wurde die relative Zellüberlebensrate mit dem Kristallviolett-Assay (Kap. 2.7.1) ermittelt. Die benötigte Dosis, um 25% (IC25), 50% (IC50) bzw. 75% (IC75) des Zellwachstums zu hemmen, wurde berechnet. In der Tabelle 3.1 sind die ermittelten Werte für alle drei Zelllinien zusammengefasst. Der Abbildung 3.1 kann man entnehmen, dass die drei Zelllinien gegenüber einer Behandlung mit Bortezomib sensibel reagieren. Am empfindlichsten reagierten die LX1-Zellen auf eine Bortezomibbehandlung, wohingegen die MX1-Zellen am unempfindlichsten waren; sie benötigten bei einer IC50 eine um das 4,5-fache höhere Dosis als die MX1-Zellen. Die S117-Zellen lagen bei der IC25 und IC50 nur geringfügig höher als die LX1Zellen. Tabelle 3.1: Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien Zelllinie MX1 LX1 S117 Bortezomib IC25 6,98 nmol/l 2,92 nmol/l 3,93 nmol/l Bortezomib IC50 18,36 nmol/l 4,03 nmol/l 6,04 nmol/l Bortezomib IC75 53,12 nmol/l 5,25 nmol/l 18,90 nmol/l 26 Rel.Zellüberlebensrae im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1,25 2,5 5 7,5 10 15 20 30 40 50 60 Bortezomib [nmol/l] LX1 MX1 S117 Abbildung 3.1: Dargestellt sind die Zellüberlebensraten für Bortezomib bei den Zelllinien MX1 (n=10), LX1 (n=10) und S117 (n=10). Die y-Achse stellt die relative Überlebensrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, und die x-Achse die untersuchte Bortezomibkonzentration in nmol/l dar. 3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid Außerdem wurden in dieser Arbeit Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid zur Behandlung der drei Zelllinien untersucht. Das in den In-vitro-Versuchen verwendete 4OHTrofosfamid wird im folgenden Text als Trofosfamid bezeichnet. In der Tabelle 3.2 ist die jeweilige IC50 der beiden Oxazaphosphorine dargestellt. Trofosfamid zeigte für alle drei Zelllinien eine geringfügig höhere IC50 als Mafosfamid. In der gleichen Tabelle sind die in den Versuchen verwendeten Konzentrationsreihen für die einzelnen Zelllinien aufgeführt. Die in den Arbeiten von Klink et al. [44] und Letsch et al. [54] verwendeten Oxazaphosphorin-Konzentrationen wurden mit der vorliegenden Arbeit bestätigt. Tabelle 3.2: Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine Oxazaphosphorin IC50 Mafosfamid Konz.reihe IC50 Trofosfamid Konz.reihe MX1 5,91 µmol/l 1,25; 2,5; 5; 7,5; 10; 15 µmol/l 12,85 µmol/l 2,5; 5; 10; 15; 20; 30 µmol/l LX1 11,83 µmol/l 2,5; 5; 10; 20; 40 µmol/l 16,75 µmol/l 2,5; 5; 10; 20; 40 µmol/l S117 15,07 µmol/l 5; 10; 15; 20; 30 µmol/l 16,08 µmol/l 5; 10; 15; 20; 30 µmol/l 3 Ergebnisse 27 3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung Die Zelllinien wurden mit den in Tabelle 3.2 aufgeführten Konzentrationsreihen für Mafosfamid oder Trofosfamid behandelt und mit Bortezomib IC25, IC50 bzw. IC75 (Tab. 3.1) kombiniert. Als Kontrolle diente eine Behandlung mit Mafosfamid und Trofosfamid als Einzeltherapie. Um Unterschiede in den Kombinationsbehandlungen und den Einzelbehandlungen zu ermitteln, wurden die Zellüberlebensraten der Kombinationsbehandlungen mit denen der Einzelbehandlung verglichen. Im Folgenden wird über Signifikanzen geschrieben, die sich auf den Vergleich mit der jeweiligen Einzelbehandlung beziehen. Die berechneten p-Werte sind im Anhang für die Zelllinien MX1, LX1 und S117 zu sehen (Anhang C). Außerdem wird der Combination Index“ (CI) verwendet, ” um zu beurteilen, ob eine Kombinationsbehandlung einen wirkungsverstärkenden oder einen wirkungsabschwächenden Effekt hat. Dies wird in Kapitel 2.9 und Tabelle 2.8 beschrieben. 3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib In den Abbildungen 3.2-3.4 wird an den Zelllinen MX1, LX1 und S117 die Einzeltherapie mit der Mafosfamidkonzentrationsreihe im Vergleich zur Kombinationstherapie der Konzentrationsreihe mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 gezeigt. Abbildung 3.2 stellt die zeitgleiche Kombinationsgabe an der Zelllinie MX1 dar. Es konnten für alle Mafosfamidkonzentrationen bei der Kombinationsgabe mit Bortezoimb IC75 signifikante Unterschiede ermittelt werden (Tab. 3.3). Bei den Kombinationen mit Bortezomib IC50 waren alle Messpunkte signifikant bis auf den mit der höchsten Mafosfamidkonzentration. Im Gegensatz dazu konnten Signifikanzen bei der Kombination mit Bortezomib IC25 nur für die Mafosfamidkonzentrationen 1,25 µmol/l bis 5 µmol/l ermittelt werden. Die Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte knapp über und unter eins, was einem moderat antagonistischen bis moderat synergistischen Effekt entspricht (Tab. 3.4). In Abbildung 3.3 sind die Kombinationsversuche für das LX1 abgebildet. Die Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC25 war dem Kurvenverlauf der Kontrolle sehr ähnlich. Nur bei der Mafosfamidkonzentration von 5 µmol/l konnte eine Signifikanz nachgewiesen werden (Tab. 3.3). Die Kombinationen mit Bortezomib IC50 bzw. IC75 ähnelten sich in ihrem Verlauf und unterschieden sich signifikant von der der Kontrolle anhand der niedrigsten drei bzw. vier Mafosfamidkonzentrationen. Die Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte über eins entsprechend einem moderat antagonistischen bis antagonistischen Effekt (Tab. 3.4). 3 Ergebnisse 28 Die Ergebnisse der Versuche mit der Zelllinie S117 sind in Abbildung 3.4 dargestellt. Auch hier war der Kurvenverlauf der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle sehr ähnlich und wies keinen signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.3). Die Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 zeigte signifikante Unterschiede für die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen. Ähnlich war es bei der Kombination mit Bortezomib IC75, die mit Ausnahme der beiden höchsten Mafosfamidkonzentrationen Signifikanzen zeigte (Tab. 3.3). Die Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte, die knapp unter eins lagen, und belegen somit einen additiven bis moderat synergistischen Effekt (Tab. 3.4). Tabelle 3.3: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichen Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC25, IC50 bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤ 0,05. MX1 LX1 S117 Mafosfamid µmol/l M vs. M + B IC25 M vs. M + B IC50 M vs. M + B IC75 Mafosfamid µmol/l M vs. M + B IC25 M vs. M + B IC50 M vs. M + B IC75 Mafosfamid µmol/l M vs. M + B IC25 M vs. M + B IC50 M vs. M + B IC75 1,25 + + + 2,5 + + 5 + + 2,5 + + + 5 + + + 10 + + 5 + + + 10 + + 15 + + 7,5 + + 20 + 20 + 10 + + 40 30 - 15 + Tabelle 3.4: Der CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid (M) und Bortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Der CI ist in Kap. 2.9 erläutert. MX1 LX1 S117 M µmol/l CI M µmol/l CI M µmol/l CI 1,25 1.309 2,5 1.377 5 1.028 2,5 1.197 5 1.590 10 1.085 5 1.118 10 1.771 15 0.803 7,5 0.857 20 1.638 20 0.759 10 0.771 40 1.247 30 0.796 15 0.815 29 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1,25 2,5 5 7,5 10 15 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC25 Mafosfamid + Bortezomib IC75 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] Abbildung 3.2: Dargestellt ist die relative Überlebensrate des MX1 unter der Behandlung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=14), IC50 (n=14) und IC75 (n=14). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC25 Mafosfamid + Bortezomib IC75 Abbildung 3.3: Abgebildet ist die relative Überlebensrate des LX1 unter der Behandlung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12). 30 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC25 Mafosfamid + Bortezomib IC75 Abbildung 3.4: Die Grafik zeigt die relative Überlebensrate des S117 unter der Behandlung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75 (n=12). 3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib In den Abbildungen 3.5-3.7 wird die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, IC50 und IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117 dargestellt. In diesen Versuchen wurde die Kombination von Trofosfamid und Bortezomib mit der Einzelbehandlung mit Trofosfamid verglichen. Die Ergebnisse mit MX1 sind in Abbildung 3.5(a) dargestellt. Bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC25 gab es einen signifikanten Unterschied für die Trofosfamidkonzentration 5 µmol/l (Tab. 3.5). Vergleichsweise gab es Signifikanzen für die Kombinationen mit Bortezomib IC50 und IC75 bei den Trofosfamidkonzentrationen 5 µmol/l bis 10 µmol/l. In Abbildung 3.5(b) ist der CI der Kombination von Trofosfamid mit Bortezomib IC50 grafisch dargestellt. Die Ordinatenachse zeigt den CI an, wobei die gestrichelte Linie CI=1 markiert, welches der Umschlagpunkt zwischen Synergismus und Antagonismus ist. Alle gemessenen Werte hatten einen CI von über 1 und lagen somit im antagonistischen Bereich. Den Zahlenwerten des CI kann man entnehmen, dass der Effekt der Kombinationsbehandlung rein antagonistisch war (Tab. 3.6). An der Abbildung 3.6 zum LX1 wird deutlich, dass alle drei Kurven der Kombinationsversuche sich der Trofosfamidkontrolle schon bei geringen Trofosfamidkonzentrationen anpassen. Die Kurven deuten anfänglich eine Abnahme der Proliferationshemmung an, 3 Ergebnisse 31 im Sinne eines antagonistischen Effekts. Der CI zur Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 bestätigt dies (Tab. 3.6). Der einzige signifikante Unterschied war für die Trofosfamidkonzentration von 2,5 µmol/l bei der Kombination mit Bortezomib IC75 zu sehen (Tab. 3.5). Die Versuche zum S117 wurden in Abbildung 3.7 dargestellt. Auch hier war die Kurve der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle sehr ähnlich und wies keinen signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.6). Die Kombination mit Bortezomib IC50 wies lediglich eine Signifikanz für die niedrigste Trofosfamidkonzentration auf, wohingegen die Kombination mit Bortezomib IC75 für die Konzentrationen 5 µmol/l bis 15 µmol/l Signifikanzen aufwies. Der CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 lag zwischen 1,3 und 1,9, entsprechend einer Wirkungsabschwächung im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich (Tab. 3.6). Zusammenfassend für die zeitgleichen Kombinationstherapien kann man sagen, dass die Zelllinien allen Behandlungen gegenüber sensibel waren. Wie zu erwarten, zeigte sich, dass mit steigender Dosis von Mafosfamid die Proliferationsrate der Zellen fiel und ein vorhandener signifikanter Unterschied mit steigender Mafosfamidkonzentration immer kleiner wurde. Ähnliches war auch für die Kombination mit Trofosfamid zu beobachten, wobei die Proliferation anfänglich jedoch stabil war bzw. tendenziell zunahm, was den Eindruck erweckt, dass eine Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib einen besseren Effekt hat als die Kombination mit Trofosfamid. Ein additiver bis synergistischer Effekt wurde nur für die Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid für das MX1 und das S117 festgestellt, jedoch nicht für das LX1. Die Kombination mit Trofosfamid zeigte für alle drei Zelllinien einen unterschiedlich stark ausgeprägten Antagonismus. 32 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC25 Trofosfamid + Bortezomib IC75 (a) (b) Abbildung 3.5: (a)Dargestellt ist die relative Überlebensrate vom MX1 unter der Behandlung mit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=12), IC50 (n=12) und IC75 (n=12). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Überlebensrate als Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 wird mit der jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Messpunkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1 der niedrigsten und 6 der höchsten Trofosfamidkonzentration entspricht. 33 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC25 Trofosfamid + Bortezomib IC75 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] Abbildung 3.6: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate vom LX1 unter der Behandlung mit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC25 Trofosfamid + Bortezomib IC75 Abbildung 3.7: Die Grafik zeigt die rel. Überlebensrate vom S117 unter der Behandlung mit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75 (n=12). 3 Ergebnisse 34 Tabelle 3.5: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichen Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, IC50 bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤ 0,05. MX1 LX1 S117 Trofosfamid µmol/l T vs. T + B IC25 T vs. T + B IC50 T vs. T + B IC75 Trofosfamid µmol/l T vs. T + B IC25 T vs. T + B IC50 T vs. T + B IC75 Trofosfamid µmol/l T vs. T + B IC25 T vs. T + B IC50 T vs. T + B IC75 2,5 + + 2,5 + 5 + + 5 + + + 5 10 + 10 + + 10 15 + 15 20 20 - 20 40 30 - 30 - Tabelle 3.6: CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid (T) und Bortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Siehe auch Kap. 2.9 MX1 LX1 S117 T µmol/l CI T µmol/l CI T µmol/l CI 2,5 2.112 2,5 1.780 5 1.616 5 2.201 5 1.903 10 1.753 15 2.482 10 2.037 15 1.828 10 1.938 20 1.813 20 1.336 20 1.677 40 0.858 30 1.406 30 1.995 3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche Nach den unter Kapitel 3.1.3 beschriebenen zeitgleichen Kombinationsgaben wurde der Frage nachgegangen, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente Einfluss auf das Überleben der Tumorzellen hat. Diese Frage stellt sich, da eine zeitversetzte Gabe der Stoffe theoretisch von Vorteil sein könnte, wenn man bedenkt, dass die Oxazaphosphorine am besten auf schnell proliferierende Gewebe wirkt, wohingegen Bortezomib zyklusunspezifisch einen hemmenden Effekt auf den Zellzyklus ausübt. Das eine zeitversetzte Gabe von Medikamenten einer zeitgleichen Gabe überlegen seien kann, haben Gomi et al. bereits 1992 gezeigt. Mit ihren In-vitro-Versuchen an einer NSCLC-Zelllinie zeigten sie, dass die zeitversetzte Gabe von Navelbine und Cisplatin einen agonistischen Effekt hatte, wohingegen die zeitgleiche Gabe einen antagonistischen Effekt hatte [32]. Die In-vivo-Versuche zu einem NSCLC von Kodama et al. zeigten, dass die zeitversetzte Gabe von Cisplatin und Docetaxel der zeitgleichen Gabe überlegen war [45]. 3 Ergebnisse 35 In den vorliegenden zeitversetzten Versuchen wurde, wie in Kapitel 2.7.2 beschrieben, erst Mafosfamid bzw. Trofosfamid und dann zeitversetzt Bortezomib gegeben und umgekehrt. Aus Gründen der Lesbarkeit werden diese Kombinationen im folgenden Text an einigen Stellen als Abkürzungen dargestellt, wobei M“ für Mafosfamid, T“ für Trofosfa” ” mid und B IC25“ bzw. B IC50“ für Bortezomib IC25 bzw. IC50 steht. Die zeitversetzte ” ” Kombination, in der Bortezomib IC25 nach Mafosfamid gegeben wurde, ist als M>B ” IC25“ dargestellt. Die Kombination mit Bortezomib IC75 wurde nicht durchgeführt, da die hohe Apoptoserate einen nur geringen Spielraum für die Kombinationsbehandlung übrig ließ. Im Anschluss an die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen wurde untersucht, ob eine Verlängerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden die gefundenen Effekte verstärkt. In diesen Versuchen wurden nur Kombinationen mit Bortezomib IC50 untersucht, da man an diesen Kombinationen sowohl antagonistische als auch synergistische Effekte gut darstellen kann. Der genaue Versuchsaufbau wurde unter Kapitel 2.7.3 beschrieben. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden in den folgenden Kapiteln einige Grafiken lediglich im Anhang B aufgeführt, insbesondere wenn sie keine neuen Informationen bringen. Die Ergebnisse werden stattdessen tabellarisch zusammengefasst. Das adjustierte Signifikanzniveau lag bei den zeitversetzten Versuchen, wie in Kapitel 2.9 erklärt, bei p≤ 0,025. 3.1.4.1 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am MX1 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am MX1 Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 sind in Abbildung 3.8 dargestellt. Der Kurvenverlauf der zeitgleichen Kombinationen, wie sie in Abbildung 3.2 zu sehen sind, und der hier dargestellten zeitversetzten Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 ähneln einander. Die zeitversetzten Kombinationen mit Bortezomib IC50 zeigten Signifikanzen für die Mafosfamidkonzentrationen 1,25-5µmol/l (Tab. 3.7). Es gab keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zwischen den zeitversetzten Kombinationen, unabhängig davon, ob Mafosfamid an erster oder zweiter Stelle gegeben wurde. Der Tabelle 3.7 kann man entnehmen, dass der CI der zeitversetzten Kombination M>B IC50“ größtenteils ” im additiven Bereich lag, wohingegen die Kombination B IC50>M“ einen leichten ” Antagonismus aufwies. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitversetzten Kombinationen von Mafosfamid und Bortezomib IC25 unterschieden sich nicht signifikant von der Einzelbehandlung mit Mafosfamid. Grafik und p-Werte sind im Anhang B.1 und C.7 zu finden. 36 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1,25 2,5 5 7,5 10 15 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Abbildung 3.8: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate der um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche von Mafosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Mafosfamidkontrolle am MX1 (n=15). Tabelle 3.7: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 CI B IC50 >M 1,25 + + 1.149 1.557 2,5 + + 1.125 1.483 5 + + 0.922 1.183 7,5 0.916 1.138 10 0.844 0.977 15 1.099 2.242 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid am MX1 Als Erweiterung der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen wurde untersucht, ob eine Verlängerung des Intervalls zwischen der Medikamentengabe auf zwei Stunden vorhandene Effekte verstärkt. Die um zwei Stunden versetzte Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte einen ähnlichen Kurvenverlauf, wie die um eine Stunde versetzte Kombination (Anhang B.3 und C.11). Signifikante Unterschiede waren für die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen zu sehen, wie auch bei der um eine Stunde versetzten Kombination (Tab. 3.8). Die Gabe von Mafosfamid zwei Stunden vor oder nach Bortezomib IC50 zeigte keinen unterschiedlichen Effekt. Der CI 3 Ergebnisse 37 der um zwei Stunden versetzten Kombination streckte sich von moderat antagonistisch bis synergistisch für beide Kombinationsvarianten (Tab. 3.8). Tabelle 3.8: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kapitel 2.9. Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 CI B IC50 >M 1,25 + + 1.412 1.392 2,5 + + 1.263 1.207 5 + + 1.055 1.027 7,5 0.811 0.933 10 0.708 0.861 15 0.584 0.675 3.1.4.2 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am MX1 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am MX1 Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 zeigten einen ähnlichen Kurvenverlauf wie die zuvor in Abbildung 3.5(a) dargestellten zeitgleichen Kombinationsversuche. Die um eine Stunde versetzten Kombinationen von Trofosfamid und Bortezomib IC50 sind in Abbildung 3.9 dargestellt. Für beide Kombinationsvarianten waren Signifikanzen für die zwei niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen zu sehen (Tab. 3.9). Im Vergleich der Kombinationsvarianten untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede für die Konzentrationen 5 µmol/l und 15 µmol/l. Die zeitversetzte Kombination B IC50 >T“ lag hauptsächlich im ” antagonistischen Bereich, ähnlich der zeitgleichen Kombination (Tab. 3.9). Die zeitversetzte Kombination T >B IC50“, die an zwei Messpunkten einen signifikant höheren ” antineoplastischen Effekt aufwies als B IC50 >T“, hatte lediglich einen geringfügig ” niedrigeren CI im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Die um eine Stunde versetzten Kombinationen von Trofosfamid und Bortzeomib IC25 wiesen keine signifikanten Unterschiede auf, weder im Vergleich zur Kontrolle noch im Vergleich zueinander (Anhang B.2 und C.9). 38 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Abbildung 3.9: Dargestellt ist die rel. Überlebensrate des MX1 bei der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=15). Tabelle 3.9: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9 Trofosfamid µmol/l T vs. T >B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T >B IC50 vs. B IC50 >T T >B IC50 CI B IC50 >T 2,5 + + 1.432 1.987 5 + + + 1.562 2.438 10 1.379 2.088 15 + 1.359 2.088 20 0.946 1.158 30 0.983 1.212 Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am MX1 Die Verlängerung des Zeitintervalls zwischen der Arzneimittelgabe bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 hatte keinen bedeutenden wirkungsverstärkenden Effekt. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.4 und C.12 abgebildet. Der Vergleich der um eine und um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche von Trofosfamid und Bortezomib IC50 zeigte eine Veränderung in der Anzahl signifikanter Messpunkte für die Kombination T>B IC50“. Während bei der um eine Stunde ” versetzten Kombinationsbehandlung signifikante Unterschiede für die Trofosfamidkonzentrationen von 2,5 - 5 µmol/l gemessen wurden, zeigte die um zwei Stunden versetzte Kombination Signifikanzen für die Trofosfamidkonzentrationen von 2,5 - 15 µmol/l (Tab. 3 Ergebnisse 39 3.9 und 3.10). Die Verlängerung des Zeitintervalls für die Kombinationsbehandlung B ” IC50>T“ bewirkte dahingegen keine Veränderung. Im Vergleich der beiden um zwei Stunden versetzten Kombinationen untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede für die Trofosfamidkonzentrationen 5 - 10 µmol/l. Der CI der Kombination T>B ” IC50“ lag im moderat antagonistischen bis additiven Bereich, wohingegen der CI der Kombination B IC50>T“ im antagonistischen Bereich lag. Wie auch bei den um eine ” Stunde versetzten Kombinationen zu sehen war, hatte die Kombination T>B IC50“ ” einen geringfügig stärkeren antineoplastischen Effekt als die Kombination B IC50>T“. ” Die Kombination T>B IC50“ zeigt jedoch lediglich zwei signifikante Messpunkte und ” einen CI über eins. Tabelle 3.10: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9 Trofosfamid µmol/l T vs. T>B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T>B IC50 vs. B IC50>T T >B IC50 CI B IC50 >T 2,5 + + 1.167 1.923 5 + + + 1.252 2.270 10 + + 1.184 2.261 15 + 1.009 1.823 20 0.826 1.037 30 0.764 0.961 3.1.4.3 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am LX1 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am LX1 In Abbildung 3.10 ist die um eine Stunde versetzte Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1 abgebildet. Die Kombination B IC50>M“ zeigte si” gnifikante Unterschiede für die Mafosfamidkonzentrationen 2,5 und 5 µmol/l (Tab. 3.11). Vergleichsweise erbrachte die Kombination M>B IC50“ Signifikanzen für die ” Mafosfamidkonzentrationen 2,5 - 10 µmol/l. Signifikanzen für die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen waren auch bei den zeitgleichen Kombinationen zu sehen (Tab. 3.3). Der CI der zeitversetzten Kombination M>B IC50“ lag im moderat antagonistisch ” Bereich, wohingegen die Kombination B IC50>M“ hauptsächlich im antagonistischen ” Bereich lag (Tab. 3.11). Für die zeitgleiche Kombination wurden ähnliche CI-Werte 3 Ergebnisse 40 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] dokumentiert wie für die zeitversetzten Kombinationen. Der Vergleich der zwei zeitversetzten Kombinationen untereinander zeigte einen signifikanten Unterschied für die Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l. Die um eine Stunde versetzten Kombinationen von Mafosfamid und Bortezomib IC25 wiesen keine signifikanten Unterschiede auf, weder im Vergleich zur Mafosfamid-Kontrolle noch im Vergleich untereinander (Anhang B.5 und C.13). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Abbildung 3.10: Die Abbildung zeigt die rel. Überlebensrate des LX1 bei den um eine Stunde versetzten Kombinationstherapien mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Kontrolle mit Mafosfamid (n=11). Tabelle 3.11: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9 Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 IC B IC50 >M 2,5 + + + 1.286 1.548 5 + + 1.367 1.520 10 + 1.223 1.395 20 1.130 1.214 40 1.588 1.592 3 Ergebnisse 41 Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am LX1 Die um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1 ähnelt vom Kurvenverlauf den zuvor durchgeführten zeitgleichen und um ein Stunde versetzten Kombinationen (Anhang B.7). Ungleich der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen zeigten die um zwei Stunden versetzten Kombinationen Signifikanzen für die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen für beide Kombinationsvarianten (Tab. 3.12). Dafür war beim Vergleich der beiden Kombinationen untereinander keine Signifikanz festzustellen. Der CI zeigte für die Kombination M >B IC50“ einen moderat antagonistischen Effekt und für die Kombination B IC50 ” ” >M“ einen antagonistischen Effekt, wobei es jedoch keinen signifikanten Unterschied gab (Tab. 3.12). Tabelle 3.12: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9 Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 IC B IC50 >M 2,5 + + 1.230 1.331 5 + + 1.357 1.464 10 + + 1.494 1.690 20 1.350 1.548 40 1.187 1.404 3.1.4.4 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am LX1 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am LX1 Die zeitversetzten Kombinationen mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 unterschieden sich deutlich von der zeitgleich Kombination (Abb. 3.11). Es zeigten sich Signifikanzen für die drei bzw. vier niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen für die Kombination T>B IC50“ bzw. B IC50>T“ (Tab. 3.13). Im Gegensatz dazu unterschied sich die ” ” zeitgleiche Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 nicht signifikant von der Kontrolle (Tab. 3.5). Die Graphen der beiden zeitversetzten Kombinationen kreuzen sich an einem Punkt. Es ergaben sich signifikante Unterschiede beim Vergleich der 3 Ergebnisse 42 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] Kombinationsvarianten untereinander für die Konzentrationen 2,5 und 5 µmol/l sowie 20 µmol/l. Der CI beschreibt die Wirkung der beiden Kombinationsvarianten als antagonistisch bis leicht antagonistisch, für die Kombination B IC50>T“ sogar bis additiv ” (Tab. 3.13). Das Proliferationsverhalten der LX1 unter der Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, ähnelte dem der zeitgleichen Kombinationsbehandlung. Sie zeigten weder Signifikanzen im Vergleich zur Trofosfamid-Kontrolle noch im Vergleich der zeitversetzten Kombinationen untereinander. Die Grafik und die p-Werte sind im Anhang B.6 und C.15 zu finden. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Abbildung 3.11: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate des LX1 unter der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13). Tabelle 3.13: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Trofosfamid µmol/l T vs. T>B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T>B IC50 vs. B IC50>T T >B IC50 IC B IC50 >T 2,5 + + + 1.208 1.479 5 + + + 1.386 1.637 10 + + 1.675 1.425 20 + + 1.739 0.998 40 1.114 0.882 3 Ergebnisse 43 Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am LX1 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] Die Ergebnisse der Versuche, in denen Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Abstand von zwei Stunden gegeben wurden, sind in Abbildung 3.12 zu sehen. Die um zwei Stunden versetzte Kombination T>B IC50“ zeigte einen gleichen Kurvenverlauf, wie dieselbe ” Kombination mit einem Behandlungsintervall von einer Stunde. In beiden Fällen waren signifikante Unterschiede zu sehen im Vergleich zu den drei niedrigsten Konzentrationen der Kontrolle (Tab. 3.14). Die um zwei Stunden versetzte Kombination B IC50>T“ ” unterschied sich von der Kontrolle lediglich bei der Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l. Ähnlich der zeitgleichen Kombinationstherapie waren CI-Werte im antagonistischen Bereich zu sehen (Tab. 3.14). Die Kombination T >B IC50“ befand sich im moderat ” antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Der Unterschied zwischen den beiden Kombinationsvarianten war für die beiden niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen signifikant. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Abbildung 3.12: Abgebildet ist rel. Überlebensrate des LX1 bei der um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13). 3 Ergebnisse 44 Tabelle 3.14: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Trofosfamid µmol/l T vs. T>B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T>B IC50 vs. B IC50>T T >B IC50 IC B IC50 >T 2,5 + + + 1.235 1.567 5 + + 1.322 1.820 10 + 1.537 2.157 20 1.489 2.177 40 1.591 1.813 3.1.4.5 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am S117 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am S117 Die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 am S117 erbrachten Signifikanzen für die zwei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen in beiden Kombinationsvarianten (Tab. 3.15). Im Vergleich dazu zeigte die zeitgleiche Kombination keine Signifikanzen (Tab. 3.3). Im Vergleich untereinander zeigten die beiden Varianten der zeitversetzten Kombinationen keinen signifikanten Unterschied. Grafik und p-Werte sind im Anhang B.8 und C.19 abgebildet. Die zeitversetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigten für beide Kombinationen einen fast deckungsgleichen Kurvenverlauf (Abb. 3.13(a)). Die Ergebnisse der Kombinationen M>B IC50“ bzw. B IC50>M“ zeigten Signifikanzen ” ” für die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen (Tab. 3.15). Der Vergleich der Kombinationen untereinander erbrachte keinen signifikanten Unterschied. Der CI beider Kombinationen lag zwischen 0,82 und 1,14 und befand sich somit im überwiegend additiven Bereich. Dies ist grafisch am Beispiel der Kombination M>B ” IC50“ dargestellt (Abb. 3.13(b)). 45 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] 3 Ergebnisse 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h (a) (b) Abbildung 3.13: (a) Dargestellt ist die rel. Überlebensrate des S117 bei der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid (n=31). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Überlebensrate als Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung M>B IC50“ wird mit ” der jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Messpunkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1 der niedrigsten und 5 der höchsten Mafosfamidkonzentration entspricht. 3 Ergebnisse 46 Tabelle 3.15: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 CI B IC50 >M 5 + + 1.081 1.144 10 + + 1.158 1.173 15 + + 1.004 1.092 20 + 0.875 0.988 30 0.823 0.948 Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am S117 Bei den um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuchen von Mafosfamid und Bortezomib IC50 am S117 bewirkte die Verlängerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden keinen Unterschied. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.10 und C.24 dargestellt. Signifikante Unterschiede zeigten die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen für die Kombination M>B IC50“ bzw. B IC50 >M“ (Tab. 3.16). Beide ” ” Kombinationsvarianten der um zwei Stunden versetzten Behandlung zeigten CI-Werte im additiven bis leicht synergistischen Bereich (Abb. 3.14). Gleiches war für die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen zu sehen (Tab. 3.15). Der Unterschied zwischen den um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlungen war nicht signifikant (Tab. 3.16). Tabelle 3.16: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Mafosfamid µmol/l M vs. M>B IC50 p-Werte M vs. B IC50 >M M>B IC50 vs. B IC50>M M >B IC50 CI B IC50 >M 5 + + 0.876 0.942 10 + + 0.777 0.865 15 + + 0.751 0.879 20 + 0.956 1.093 30 1.063 1.528 3 Ergebnisse 47 Abbildung 3.14: Dargestellt ist der CI im Vergleich zur rel. Überlebensrate als Fraktion (eng. Fractional Effect). Der Effekt der um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlung M>B IC50“ wird mit der jeweiligen Einzel” behandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Messpunkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1 der niedrigsten und 5 der höchsten Mafosfamidkonzentration entspricht. 3.1.4.6 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am S117 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am S117 Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 zeigte, wie dieselbe zeitgleiche Kombination, keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle. Im Vergleich untereinander unterschieden sich die beiden zeitversetzten Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib IC25 ebenfalls nicht (Anhang B.9 und C.21). Die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 mit einem Zeitintervall von einer Stunde ist in Abbildung 3.15 dargestellt. Die Kombination B IC50>T“ erbrachte Signifikanzen für die Konzentrationen 5 µmol/l und 10 µmol/l, ” wohingegen die zeitgleiche Kombination lediglich für die niedrigste Konzentration einen signifikanten Unterschied aufwies (Tab. 3.17). Im Vergleich dazu zeigte die Kombination T>B IC50“ Signifikanzen für alle untersuchten Konzentrationen. Der Vergleich der ” beiden Kombinationsvarianten untereinander erbrachte signifikante Unterschiede für alle bis auf die höchste Trofosfamidkonzentration. Die Kombination T>B IC50“ lag ” im additiven bis leicht antagonistischen Bereich im Vergleich zur Kombination B ” 3 Ergebnisse 48 Rel. Zellüberlebensrate im Vgl. zur Kontrolle [%] IC50>T“, welche im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich lag (Tab. 3.17). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Abbildung 3.15: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate des S117 unter den um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=31). Tabelle 3.17: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Trofosfamid µmol/l T vs. T>B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T>B IC50 vs. B IC50>T T >B IC50 CI B IC50 >T 5 + + + 1.012 1.438 10 + + + 1.184 1.943 15 + + 1.141 1.984 20 + + 1.156 1.784 30 + 0.843 1.120 Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am S117 Die um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117 erreichten nicht den gleichen Effekt wie dieselbe Kombination mit einer Stunde zwischen den Behandlungen (Anhang B.11). Die um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlungen erbrachten lediglich Signifikanzen für die ersten drei bzw. 3 Ergebnisse 49 zwei Trofosfamidkonzentrationen für die Kombinationen T >B IC50“ bzw. B IC50 >T“ ” ” (Tab. 3.18). Der Vergleich zwischen den beiden Kombinationen zeigte einen signifikanten Unterschied für die niedrigste Trofosfamidkonzentration. Der CI zeigte einen leichten antagonistischen Effekt für die Kombination T >B IC50“, wohingegen die Kombination ” B IC50 >T“ einen antagonistischen Effekt hatte. ” Tabelle 3.18: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt der Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9. Trofosfamid µmol/l T vs. T>B IC50 p-Werte T vs. B IC50 >T T>B IC50 vs. B IC50>T T >B IC50 CI B IC50 >T 5 + + + 1.106 1.755 10 + + 1.282 1.338 15 + 1.220 1.390 20 + 0.933 0.794 30 0.714 0.831 3.2 Versuchsablauf in vivo Aufgrund der umfangreichen In-vitro-Versuche und der hinsichtlich der Tieranzahl restriktiven Tierversuchsgenehmigung wurde die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im Tiermodell exemplarisch anhand der LX1-Zelllinie untersucht. Diese Zelllinie zeigte bei den In-vitro-Experimenten die beste Ansprechrate auf die untersuchten Chemotherapeutika. Die Ergebnisse werden aufgrund der marginalen Unterschiede zwischen den Versuchen und der geringen Fallzahl nur deskriptiv dargestellt. Die Tiere wurden mit Bortezomib, Trofosfamid und Cyclophosphamid wie unter Kapitel 2.8.5 behandelt. Die Versuche wurden wie unter Kapitel 2.9 ausgewertet. 3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung In den ersten Tierversuchen wurde untersucht, wie das Tumorwachstum auf die Einzelbehandlung mit Bortezomib reagiert. In Abbildung 3.16 wurde die Behandlung mit Bortezomib in verschieden Konzentrationen dargestellt. Die y-Achse stellt das Tumorvolumen in mm3 und die x-Achse die Zeit in Tagen dar. Der Abbildung kann man entnehmen, dass die unbehandelte Kontrolle das Zielvolumen von 800 mm3 nach ca. 6,5 Tagen erreicht, wohingegen die Behandlung mit den drei verschiedenen Bortezomibkonzentrationen das Zielvolumen erst nach ca. 12 Tagen erreicht. Die einzelnen 3 Ergebnisse 50 Bortezomibkonzentrationen wiesen untereinander keine großen Unterschiede im Tumorwachstum auf. Die Wachstumsverlangsamung entsprach dementsprechend ca. 5,5 Tagen (ca. 45%). 1400 Tumorvolumen mm³ 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 8 10 12 15 Tage Kontrolle Bortezomib i.p. 0,3 mg/kg KG 2x/Woche Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche Abbildung 3.16: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Bortezomib. Dargestellt ist die Entwicklung des Tumorvolumens in mm3 (y-Achse) über Tage (x-Achse). Abgebildet ist eine unbehandelte Kontrolle (n=3) im Vergleich zu i.p. verabreichtem Bortezomib zweimal Wöchentlich, einmal als 0,3 mg/kg (n=2), einmal als 0,6 mg/kg (n=2) und einmal als 1,0 mg/kg (n=8). 3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib In Abbildung 3.17 ist die Kombinationstherapie mit Trofosfamid (i.p.) und Bortezomib 0,6 mg/kg am Tiermodell dargestellt. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Versuchstieren wurde auf die Kombination mit der niedrigsten Bortezomibkonzentration verzichtet. Die Behandlung mit Bortezomib (0,6 mg/kg(KG)) alleine und in Kombination mit Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen. Die Einzelbehandlung mit Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von 8,5 Tagen (ca. 57%), was drei Tage mehr waren als bei der Kombinationsbehandlung. In Abbildung 3.18 ist die gleiche Kombinationsbehandlung nur mit Bortezomib 1,0 mg/kg (KG) dargestellt. In diesem Fall hatte die Kombinationsbehandlung den gleichen wachstumsverlangsamenden Effekt wie Trofosfamid als Einzelbehandlung. 3 Ergebnisse 51 1400 Tumorvolumen mm³ 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 8 10 12 15 17 19 Tage Kontrolle Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15. Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 0,6 mg/kg KG i.p. Abbildung 3.17: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG)) im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. xAchse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3, Bortezomib n=2, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mit Bortezomib n=8. 1400 Tumorvolumen mm³ 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 8 10 12 15 17 19 Tage Kontrolle Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15. Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 1,0 mg/kg KG i.p. Abbildung 3.18: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bortezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG)) im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. xAchse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3, Bortezomib n=8, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mit Bortezomib n=8. 3 Ergebnisse 52 Außerdem wurde untersucht, ob die metronomische Gabe von Trofosfamid p.o. in der Kombinationsbehandlung einen Unterschied bewirken könnte (Siehe auch Kap. 2.8.5). Aus den oben genannten Gründen wurde der Kombinationsversuch lediglich mit Bortezomib 0,6 mg/kg (KG) i.p. und Trofosfamid p.o. bzw. i.p. durchgeführt. Wie in Abbildung 3.19 zu sehen, verlangsamte die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid (19 mg/kg (KG)) p.o. das Tumorwachstum um 10,5 Tage (ca. 62%) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Dahingegen verlangsamte die Kombinationsbehandlung, in der Trofosfamid i.p. alle 14 Tage verabreicht wurde, das Tumorwachstum nur mit 8,5 Tagen (ca. 57%) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die p.o.-Gabe von Trofosfamid verlangsamte das Tumorwachstum um fünf Tage im Vergleich zur i.p.-Gabe von Trofosfamid. 1400 Tumorvolumen mm³ 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 8 10 12 15 17 19 Tage Kontrolle Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 0,6 mg/kg KG i.p. Trofosfamid p.o. 19 mg/kg KG + Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG i.p. Abbildung 3.19: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationsweges von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG)) und Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)). Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid i.p. (n=8) im Vergleich mit Trofosfamid p.o. (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. 3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid und Bortezomib Parallel zu den Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib und Trofosfamid wurde die Kombination von Bortezomib (1,0 mg/kg (KG) i.p.) und Cyclophosphamid (176,4 mg/kg (KG) i.p.) untersucht (Abb. 3.20). Wie in Kapitel 2.8.5 beschrieben, wurde Bortezomib zwei-mal pro Woche und Cyclophosphamid einmal jede zweite Woche verabreicht. Die Einzelbehandlung mit Cyclophosphamid bzw. Bortezomib bewirkten 3 Ergebnisse 53 1400 Tumorvolumen mm³ 1200 1000 800 600 400 200 0 1 3 5 8 10 12 15 17 19 22 Tage Kontrolle Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 1,0 mg/kg KG i.p. 2x/Woche Abbildung 3.20: Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Cyclophosphamid (176,4 mg/kg (KG) i.p.) und Bortezomib (0,6 mg/kg (KG) i.p.) (n=2) im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Cyclophosphamid (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. jeweils eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen (ca. 45%), wohingegen die Kombination der beiden Arzneien eine Wachstumsverlangsamung von ca. 8,5 Tagen (ca. 57%) bewirkte. Die Kombination hatte dementsprechend einen wirkungsverstärkenden Effekt, wenn auch nur einen leichten. 54 4 Diskussion 4.1 Hintergrund Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasierten me” dizinischen Standard“, lautet es von der deutschen Krebsgesellschaft zu der Behandlung des kleinzelligen Lungenkarzinoms. In der Behandlung von vielen Krebsleiden konnte man zeigen, dass eine Kombinationstherapie im Hinblick auf das Nebenwirkungsprofil und die Überlebensrate einer Monotherapie überlegen ist. Aufgrund der komplexen Wirkungsmechanismen und Interaktionen verschiedener Stoffe ist es schwierig vorauszusagen, welche Kombinationen eine positive Wirkungsverstärkung entwickeln und welche dem Patienten letztendlich mehr Schaden zufügen. Deswegen ist es wichtig, jede Kombinationsbehandlung in präklinischen Studien zu testen, auch wenn es nicht in jedem Fall gesetzlich vorgeschrieben ist. Wie einleitend erwähnt, wurde die Wirksamkeit von Bortezomib als Monotherapeutikum diverser Tumoren in präklinischen Studien gezeigt. In klinischen Studien jedoch wurde gezeigt, dass sich Bortezomib als Einzelstoffbehandlung für dieselben Tumoren nicht bewährt, weshalb in diesen Fällen Kombinationsbehandlungen mit verschiedenen Chemotherapeutika diskutiert wurden [25, 55, 58]. Inzwischen liegt eine Reihe klinischer Studien vor, die Bortezomib mit einem zweiten Chemotherapeutikum kombinieren. Eine der wenigen Kombinationsbehandlungen, die einen verstärkenden Effekt zeigen, ist die Kombination von Bortezomib mit Transtuzumab (In-vitro-Studie) oder mit Docetaxel (Phase-II-Studie), wobei letztere Kombination mit einer Verstärkung der Nebenwirkungen einhergeht [6, 16]. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung und damit den eventuellen Nutzen einer Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin zu prüfen. Außerdem sollte die Reproduzierbarkeit von In-vitro-Versuchen in In-vivo-Versuchen exemplarisch untersucht werden. 4 Diskussion 55 4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom LX1 Mit den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass die SCLC-Zelllinie LX1 auf die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Abb. 3.1). Von den untersuchten Zelllinien zeigte LX1 das beste Ansprechen mit einer IC50 von ca. 4 nM. Dies bestätigt die 2005 veröffentlichten Ergebnisse von Mortenson et al. [63]. In ihren Zellversuchen am SCLC wurde eine Apoptoserate von 25-50% für 20 nM Bortezomib nachgewiesen. Weitere präklinische Versuche zur Einzelbehandlung von SCLC mit Bortezomib liegen bis heute nicht vor. Lara et al. konnten in einer Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung mit Bortezomib keinen Effekt am Patienten nachweisen und schlugen deshalb eine Kombinationsbehandlung vor [51]. In den vorliegenden In-vitro-Versuchen wurde die Kombination von Bortezomib mit den Oxazaphosphorinen Mafosfamid und Trofosfamid untersucht. Cyclophosphamid ist von einer enzymatischen Aktivierung abhängig und wurde deshalb in den Zellversuchen durch Mafosfamid ersetzt, da dieses spontan in den aktiven Metaboliten von Cyclophosphamid zerfällt. Sowohl Trofosfamid als auch Cyclophosphamid sind für die Behandlung des SCLC zugelassen. Studien zur Kombinationsbehandlung mit Bortezomib am SCLC wurden bisher nicht durchgeführt. Andere Lungenkarzinome werden daher zum Vergleich herangezogen. Die zeitgleiche Kombination der beiden Oxazaphosphorinen mit Bortezomib am LX1 zeigte einen unterschiedlich stark ausgeprägten Antagonismus. Speziell für die Kombination mit Trofosfamid ist eine negative Interaktion zu vermuten, da es zu einer Wirkungsabschwächung kommt (Abb. 3.6). Die Kombination von Bortzeomib mit Mafosfamid zeigte vergleichsweise einen zytotoxischen Effekt, der nur geringfügig stärker war als der der jeweiligen Einzelbehandlung. Die Wirkung von Mafosfamid war relativ unbeeinflusst von der Kombination mit Bortezomib. Das kann damit erklärt werden, dass die beiden Medikamente einen unterschiedlichen Ansatzpunkt haben. Dies wirft jedoch die Frage auf, warum es bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib zu einer Wirkungsabschwächung kommt. Die Studie von Mortenson et al. legt nahe, dass der negative Effekt der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib nicht am Wirkungsmechanismus der Gruppe der Alkylanzien liegt [62]. In ihrer Studie zeigten sie an einem NSCLC, dass die zeitgleiche Kombination von Bortezomib, Gemcitabin und Carboplatin, welches ebenfalls ein Alkylantium ist, einen wirkungsverstärkenden Effekt hatte. Abgesehen davon, dass im Versuch ein anderer Lungenkarzinomtyp verwendet wurde, war der Versuchsaufbau dem der vorliegenden Studie relativ ähnlich. Die Behandlungsdauer der Zellen betrug in beiden Fällen 24 Stunden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte anhand des MTT-Assays, das dem in vorliegender Arbeit verwendeten Kristallviolett-Assay sehr ähnlich ist. Ein kleiner 4 Diskussion 56 Unterschied besteht darin, dass in der Kombinationsbehandlung von Mortenson et al. eine Bortezomibkonzentration von 50 nM verwendet wurde, was über der IC50 des NSCLC liegt (IC50 = 30 nM). 2009 veröffentlichten Davies et al. eine Phase-II-Studie zur Kombination von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin, die eine Verlängerung der medianen Überlebenszeit auf 11 Monate erzielte [20]. Diese beiden Studien zeigen, dass Bortezomib und ein Alkylanzium sich in einer Kombination nicht gegenseitig ausschließen. Eine andere mögliche Erklärung für den negativen Effekt der Kombination der Oxazaphosphorine und Bortezomib am LX1 in vorliegender Studie ist auch in der eben genannten Studie von Mortenson et al. zu finden [62]. Sie haben die gleiche Kombination von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin auch zeitversetzt untersucht. Die Gabe von Bortezomib zwölf Stunden vor Carboplatin und Gemcitabin bewirkte eine Apoptoserate von 6,7%, wohingegen die Gabe von Bortezomib zwölf Stunden nach Carboplatin und Gemcitabin eine Apoptoserate von 33,6% ergab. Die zeitgleiche Gabe zeigte eine Apoptoserate von 21,5%. Die zeitversetzte Gabe der Oxazaphosphorine und Bortezomib in der vorliegenden Studie konnte einen ähnlichen Effekt nur tendenziell bestätigen. Generalisierend gesagt, zeigten die zeitgleichen Kombinationen und diejenigen, in denen Bortezomib an erster Stelle gegeben wurden, einen ähnlichen antagonistischen Effekt. Lediglich die Kombinationen, in denen die Oxazaphosphorine an erster Stelle gegeben wurden, zeigten einen tendenziell stärkeren antineoplastischen Effekt, der jedoch immer noch im antagonistischen Bereich lag. Zwischen den zeitversetzten Versuchen von Mortenson et al. und denen der vorliegenden Studie gab es einige Unterschiede, die die Ergebnisse beeinflusst haben können. Wie bei den zeitgleichen Versuchen von Mortenson et al. handelt es sich auch bei den zeitversetzten Versuchen um ein NSCLC. Außerdem fehlte in der vorliegenden Studie ein Gegenstück zu Gemcitabin, das in der Dreierkombination von Mortenson et al. mit aller Wahrscheinlichkeit seinen Teil zur Wirkungsverstärkung beigetragen hat. Die Behandlung dauerte unverändert 24 Stunden. In den ersten zwölf Stunden wurde mit dem ersten Medikament behandelt. Danach wurde das Medium getauscht, und die Zellen wurden für weitere zwölf Stunden dem zweiten Medikament ausgesetzt. In der vorliegenden Arbeit betrug das Zeitintervall zwischen den Behandlungen eine bzw. zwei Stunden, und die Medikamente wirkten danach gemeinsam auf die Zellen ein. Einerseits eignet sich der Versuchsaufbau von Mortenson et al. wahrscheinlich besser zur Darstellung des Effekts einer zeitversetzten Therapie, da der Zeitintervall bedeutend länger ist. Andererseits hat Bortezomib eine mittlere Eliminationshalbwertzeit von mindestens 40 Stunden laut EMA (European Medicines Agency). Das bedeutet, dass ein Kombinationspartner, der zwölf Stunden später dazugegeben wird, auch unter dem Beisein von Bortezomib wirken wird. Umgekehrt gilt Ähnliches für Carboplatin, welches eine terminale Halbwertszeit von 24 Stunden hat. Falls die Medikamente über und auf gleiche Zellstrukturen, wie z.B. Enzyme, wirken sollten, wird ein realistischeres Bild vermittelt, wenn, wie in vorliegender Studie, das 4 Diskussion 57 Medikament nach dem gewählten Zeitintervall hinzugegeben wird. Ob und wie die Reihenfolge der Medikamentengabe einen Einfluss auf die Zellüberlebensrate hat, wird in Kapitel 4.5 ausführlicher diskutiert. 4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1 Da das LX1 am empfindlichsten gegenüber der Einzelbehandlung mit Bortezomib war, wurde es in den weiterführenden In-vivo-Versuchen näher untersucht. Aus zuvor genannten Gründen werden die In-vivo-Versuche lediglich deskriptiv abgehandelt (Kap. 3.2). Die durchgeführten Versuche zeigten, dass Bortezomib als Einzelbehandlung im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle eine Verzögerung des Tumorwachstums um 41% - 45% bewirkt (Abb. 3.16). Der wachstumsverzögernde Effekt von Bortezomib wurde nur geringfügig durch die verwendeten Dosen (0,3 - 1,0 mg/kg) beeinflusst. Dies stützt die In-vivo-Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Teicher et al., die am NSCLC zeigten, dass eine Dosisänderung von Bortezomib (0,1 - 1,0 mg/kg) den wachstumshemmenden Effekt der Einzelbehandlung nicht signifikant beeinflusste [87]. Dies kann an den Eigenschaften von Bortezomib liegen. Wie in der Einleitung beschrieben, besetzt es reversibel mit hoher Affinität und Selektivität die katalytische Untereinheit des Proteasoms (Kap. 1.4). Wenn ein Großteil der Proteasome bei einer gewissen Bortezomibkonzentration gebunden ist, scheint eine Erhöhung der Bortezomibkonzentration einen nur geringen Mehreffekt zu bringen. Darüber hinaus nehmen die Bindungen an andere Proteine zu, was eventuell Nebenwirkungen verursachen kann [5]. Auch wenn der Effekt der Einzelbehandlung mit Bortezomib begrenzt ist, erhofft man sich einen positiven Effekt in einer Kombinationsbehandlung an Tieren. Einerseits konnte gezeigt werden, dass Bortezomib die Bcl-2-Proteinfamilie hemmt, welche für die Chemoresistenz des SCLC verantwortlich gemacht wird [96]. Andererseits soll Bortezomib einen antiangiogenetischen Effekt haben, was speziell bei der Behandlung des SCLC ein Vorteil wäre [23, 77]. In den vorliegenden In-vivo-Versuchen wurde u.a. die Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib am LX1 untersucht (Abb. 3.20). Die Kombination bewirkte eine Wachstumsverzögerung von ca. 20% im Vergleich zur jeweiligen Einzelbehandlung. Tendenziell hatte die Kombination einen subadditiven Effekt, was etwas besser war als die gleiche Kombination in den In-vitro-Versuchen (Abb. 3.3). Dieser Unterschied kann damit erklärt werden, dass bei Zellversuchen lediglich die Zellen direkt untersucht werden und die Interaktion mit dem Tumorstroma nicht repräsentiert wird. Die einzigen publizierten Ergebnisse zur Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib stammen von Teicher et al. [87]. In ihrer 1999 veröffentlichten Studie untersuchten sie u.a. diese Kombination in einem Xenograftmodell zum Mammakarzinom MCF-7. Sie beschreiben den Kombinationseffekt als synergistisch, was 4 Diskussion 58 einer ausgeprägteren Wirkungsverstärkung entspricht, als es die vorliegende Studie zeigen konnte. Im Vergleich zu den vorliegenden Tierversuchen handelt es sich um zwei verschiedene Tumortypen und einen unterschiedlichen Versuchsaufbau. Im Tiermodell von Teicher et al. wurde nach einem abgeschlossenen Behandlungszyklus von neun Tagen Tumorgewebe und Knochenmark von den Versuchstieren in Zellkultur überführt, um auf diese Weise eine Proliferationshemmung zu messen. In den In-vivo-Versuchen der vorliegenden Arbeit wurde mit der Tumorwachstumsverzögerung gearbeitet. Das lässt einerseits nur eine gröbere Beurteilung zu, andererseits wird der Behandlungsverlauf etwas realistischer widergespiegelt, da das Versuchstier mehrere Behandlungszyklen durchläuft. Auf diese Weise kann man genauer den lebensverlängernden Effekt der Behandlung beurteilen. Ein weiterer Unterschied war, dass Teicher et al. eine relativ niedrige Bortezomibkonzentration von 0,1 mg/kg KG gewählt hatten, die als Einzeltherapie einen geringen klinischen Effekt hatte. An den Anfang dieser Diskussion zur Einzelbehandlung mit Bortezomib zurückdenkend, könnte man die Vermutung aufstellen, dass Bortezomib am besten unterstützend zu einer zweiten Behandlung eingesetzt werden sollte. Man würde so auf die zytotoxische Eigenwirkung von Bortezomib verzichten und nur die potenzierende Wirkung auf das zweite Zytostatikum nutzen. Davon ausgehend, dass man Cyclophosphamid und Trofosfamid miteinander vergleichen kann, erscheint dies eher unwahrscheinlich. Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche zur Kombination von Trofosfamid mit verschiedenen Dosen Bortezomib (0,6 mg/kg KG und 1,0 mg/kg KG), wie sie in Kapitel 3.2.2 beschrieben sind, sprechen dagegen. Die Kombination mit der niedrigeren Dosis Bortezomib hatte den gleichen wachstumsverzögernden Effekt, wie die Einzelbehandlung mit derselben Dosis Bortezomib. Das war 13% weniger als die Einzelbehandlung mit Trofosfamid. Dies zeigt, dass die Kombination antagonistisch wirkte. Die gleiche Kombination mit der höheren Bortezomibdosis hatte den gleichen Effekt wie Trofosfamid als Einzelbehandlung. Somit kam es nicht zu einer Wirkungsverstärkung, jedoch auch nicht zu einem Effektverlust. Diese Ergebnisse für die Kombination mit Trofosfamid waren in Anbetracht der durchgeführten In-vitro-Versuche nicht unerwartet (Abb. 3.6). Rückblickend muss die Frage gestellt werden, ob man bei so unterschiedlichen Ergebnissen die beiden Alkylanzien Trofosfamid und Cyclophosphamid für die Kombination mit Bortezomib miteinander vergleichen kann. Unterschiede zwischen der Kombination mit Cyclophosphamid und der mit Trofosfamid können an der Verstoffwechselung liegen. Trofosfamid und Bortezomib werden beide durch das Leberenzym Cyp3A4 metabolisiert, wohingegen Cyclophosphamid von Cyp2B6 metabolisiert wird. Durch das Enzym Cyp3A4 wird Trofosfamid aktiviert und Bortezomib inaktiviert (Abb. 1.1). Außerdem hat Bortezomib eine leicht hemmende Wirkung auf einige Proteine der Cytochrom P450-Familie. Cyp2B6, welches Cyclophosphamid metabolisiert, gehört jedoch nicht zu den von Bortezomib gehemmten Cytochrom P450-Proteinen [36, 70]. In welchem Ausmaß dieses Einfluss auf den Behandlungseffekt hat, ist unklar. Der 4 Diskussion 59 Unterschied zwischen den beiden Alkylanzien war in den In-vitro-Versuchen zu LX1 nur leicht ausgeprägt. Dies kann jedoch nicht mit dem Metabolismus der Stoffe erklärt werden, da einerseits die Cytochrome in nicht-hepatischen Geweben wie der Lunge in nur geringen Konzentrationen vorkommen, und andererseits, weil in den Zellversuchen aktiviertes 4OH-Trofosfamid verwendet wurde [69]. Im klinischen Alltag wird Trofosfamid oral verabreicht. In unseren In-vivo-Versuchen hatten wir uns für eine intraperitoneale Verabreichung entschieden. Es wäre mit einigen Herausforderungen und Unsicherheiten verbunden, Tieren eine gewünschte Menge Trofosfamid p.o. zu verabreichen. Da die orale Bioverfügbarkeit von Trofosfamid gut ist, sollte es keinen großen Unterschied machen, ob die gewünschte Stoffmenge i.p. oder p.o. gegeben wird. Mit dem letzten In-vivo-Versuch sollte diese Annahme bestätigt werden. Dies wurde anhand einer Kombination von Bortezomib und Trofosfamid getestet, wobei Trofosfamid einmal wie bisher als Injektion verabreicht wurde und einmal über das Trinkwasser. Die Trofosfamiddosierung basierte auf vorher durchgeführten Untersuchungen zum Trinkwasserverbrauch der Versuchstiere. Die Kombination, in der Trofosfamid p.o. verabreicht wurde, verlangsamte das Tumorwachstum um weitere fünf Tage im Vergleich zur Kombination, in der das Trofosfamid i.p. verabreicht wurde. Diese beiden Applikationswege von Trofosfamid wurden auch in der Arbeit von Bela et al. untersucht [8]. Die Tumorwachstumskurven für die beiden Applikationswege zeigten in dieser Studie den gleichen Effekt. Im Vergleich zur vorliegenden Arbeit fallen zwei Unterschiede auf. Erstens wurde in vorliegender Arbeit eine Kombinationsbehandlung untersucht. Zweitens wurde die per-orale-Behandlung bei Bela et al. mit acht Tieren untersucht, im Vergleich zu zwei Tieren in der vorliegenden Studie, was bei den sich ergebenden Unsicherheiten einer metronomischen Therapie zu wenig war. Die Resultate der Tierversuche bestätigten mit geringfügigen Abweichungen die vorangegangenen Versuche zu den LX1-Zellen und die Aussagekraft von In-vitro-Experimenten zur Wirkung von Chemotherapeutika. Allerdings war dies aufgrund der geringen Fallzahl und hoher biologischer Varianz im Tumorwachstum nicht statistisch zu sichern. 4.3 Das Mammakarzinom MX1 Bei den Mammakarzinomen wurden anfänglich nur Östrogen-Rezeptor-positive Zelllinien mit Bortezomib untersucht. Erst Ende 2009 wurde die Empfindlichkeit von ÖstrogenRezeptor-negativen Mammakarzinom-Zelllinien auf Bortezomib getestet [35]. In den Versuchen war kein wesentlicher Unterschied in der Empfindlichkeit gegenüber Bortezomib zwischen Östrogen-Rezeptor-positiven oder Östrogen-Rezeptor-negativen Zelllinien zu 4 Diskussion 60 erkennen. Aufgrund dieser Ergebnisse wird in der vorliegenden Diskussion auf den Rezeptorstatus der Mammakarzinomzellen keine Rücksicht genommen. In der vorliegend Studie konnte gezeigt werden, dass das Mammakarzinom MX1 auf die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Kap. 3.1.1). Dies bestätigten die 1999 veröffentlichten In-vitro-Versuche zum Mammakarzinom MCF-7 von Teicher et al. [87]. Eine 2008 publizierte Studie von Xu et al. zeigte hingegen, dass verschiedene Mammakarzinom-Zelllinien, u.a. MCF-7-Zellen, resistent gegen Bortezomib waren [95]. Es ist schwierig, diese Diskrepanz aus dem Stand zu erklären, da ein ähnlicher Versuchsaufbau benutzt wurde wie von Teicher et al.. Der gleiche Versuchsaufbau wurde auch in der vorliegenden Arbeit angewandt. Die MX1-Zellen wurden 72 Stunden mit Bortezomib behandelt, wohingegen die MCF-7-Zellen einer Behandlungsdauer von lediglich 48 Stunden ausgesetzt waren. Bei 50 nM Bortezomib war bei den Versuchen von Xu et al. eine relative Zellüberlebensrate von über 90% zu sehen. Jedoch zeigten Teicher et al. bei der gleichen Konzentration eine Überlebensrate von ca. 1%, und die vorliegenden Ergebnisse zeigten für die MX1-Zellen eine Überlebensrate von ca. 25% (Abb. 3.1). Der Verweis von Xu et al. auf eine klinische Studie, die zeigte, dass Bortezomib als Einzelbehandlung keinen signifikanten Effekt hatte, spricht zwar für die Ergebnisse von Xu et al., erklärt jedoch nicht den Unterschied zwischen den Studien. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Empfindlichkeit der Zellen sich verändert hat. Es wurde beispielsweise während eines der Versuche der vorliegenden Arbeit bemerkt, dass sich die Empfindlichkeit bei einer Zellreihe mit einer hohen Passagenummer ( ältere“ ” Zellen), schlagartig markant und bleibend verringerte. Abgesehen von den zuvor diskutierten Versuchen von Teicher et al. liegen bis heute keine Studien zur Kombination von Bortezomib mit Oxazaphosphorinen vor. Bei der zeitgleichen Kombination von Bortezomib und Mafosfamid zeigte das MX1 einen Effekt im additiven Bereich, wie er auch für das S117 zu sehen war. Im Vergleich dazu zeigte der CI für das LX1 einen moderat antagonistischen Effekt für dieselbe Kombination. Dabei war das LX1 die empfindlichste Zelllinie bei der Einzelbehandlung mit Bortezomib. Da die gleiche Kombinationsbehandlung auf die eine Zelllinie einen moderat antagonistischen und auf die beiden anderen einen addiditiven Effekt hatte, ist es schwierig, die Ursache hierfür in der Interaktionen der beiden Stoffe zu suchen. Bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib ist dies eher möglich. Da diese Kombination in allen drei Zelllinien einen mehr oder weniger stark ausgeprägten Antagonismus ausübt, stellt sich die Frage, warum nicht ein ähnlicher Effekt gesehen wird wie bei der Kombination von Mafosfamid und Bortezomib, jedenfalls für das MX1 und das S117. Wie in Kapitel 4.2.1 diskutiert wird, könnte dies mit einem Unterschied zwischen den beiden Alkylanzien Mafosfamid und Trofosfamid erklärt werden, wie z.B. der Membrangängigkeit. Dabei hat Trofosfamid jedoch aufgrund seiner lipophilen 4 Diskussion 61 Eigenschaft eine bessere Membrangängigkeit als Mafosfamid [12]. Mafosfamid hingegen zerfällt zu 4OH-Cyclophosphamid mit ebenfalls guter Membrangängigkeit, da es im chemischen Gleichgewicht mit seinem Tautomer Aldolphosphamid steht. Bortezomib könnte einerseits die Membrangängigkeit von Trofosfamid beeinflussen durch Konkurrenz um einen Transportmechanismus, andererseits wäre eine chemische Interaktion der Stoffe auch denkbar. Trofosfamid hat z.B. eine schlechtere Wasserlöslichkeit als Mafosfamid. Eine Kombination von Midazolam und Ketamin als Infusion führt beispielsweise zur Herabsetzung der Löslichkeit und damit zur Ausfällung der Stoffe [76]. Die zeitversetzten Kombinationen zu MX1 werden in Kapitel 4.5 diskutiert. 4.4 Das Weichteilsarkom S117 In den vorliegenden Ergebnissen wird gezeigt, dass die Sarkomzellen S117 auf die Behandlung mit Bortezomib ansprechen (Abb. 3.1). Dies stützt die 2008 veröffentlichten Ergebnisse von Lu et al. und Bersani et al., die in Zellkulturversuchen zeigten, dass verschiedene Weichteilsarkome empfindlich auf Bortezomib als Einzeltherapie reagieren [9, 57]. Eine Studie zu der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin am Sarkom wurde bis heute nicht veröffentlicht. Es liegen jedoch Studien vor, die einen synergistischen Effekt bei der Kombination von Bortezomib mit Cisplatin, Doxorubicin oder 5-Flourouracil beschrieben haben [28, 90]. Wie Oxazaphosphorine entfalten diese Zytostatika ihre Wirkung auch über DNA-Schädigung. Speziell Cisplatin gehört wie die Oxazaphosphorine zur Familie der Alkylanzien. Es sollte dementsprechend nicht an der alkylierenden Wirkung von Trofosfamid liegen, dass die Kombination mit Bortezomib einen antagonistischen Effekt hatte. Einen neuen Betrachtungswinkel bringen die zeitversetzten Kombinationstherapien im folgendem Kapitel 4.5. 4.5 Zeitversetzte Versuche Beim Betrachten der zeitversetzten Ergebnisse fiel auf, dass die Kombinationen, in denen Bortezomib an erster Stelle gegeben wurde, einen tendenziell schlechteren Effekt hatten. Dies galt sowohl für die Kombination mit Mafosfamid als auch für die mit Trofosfamid. Der einzige Versuch, der signifikante Unterschiede zwischen den zeitversetzen Kombinationen zeigte, war der um eine Stunde versetzte Kombinationsversuch mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 (Abb. 3.15). Im Vergleich dazu haben die erwähnten Versuche von Mortenson et al. zum NSCLC signifikante Unterschiede bei den zeitversetzten Kombinationen von Carboplatin, Gemcitabin und Bortezomib gezeigt [62]. Wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben wurde, zeigte die Behandlung mit Gemcitabin und 4 Diskussion 62 Carboplatin, gefolgt von Bortezomib, die stärkste Wirkungsverstärkung. Die zeitgleiche Kombination zeigte einen etwas geringeren Effekt. Die Kombination, in der Bortezomib als erstes gegeben wurde, zeigte lediglich eine minimale Wirkungsverstärkung. Diese Ergebnisse konnten Mortenson et al. anhand von Tierversuchen zum gleichen NSCLC reproduzieren. Versuchsgruppen von je vier Tieren wurden entweder zeitgleich oder zeitversetzt mit Gemcitabin, Carboplatin und Bortezomib beimpft. Das Zeitintervall der zeitversetzten Versuche betrug acht Stunden, wobei wie in den Zellversuchen Bortezomib entweder vor oder nach den beiden anderen Zytostatika gegeben wurde. Diese Kombinationsbehandlungen wurden zweimal wöchentlich durchgeführt. In ihren Ergebnissen berichten Mortenson et al., dass Bortezomib, als es an erster Stelle gegeben wurde, den antineoplastischen Effekt der Behandlung fast gänzlich aufhob. Im Gegensatz dazu zeigten die zeitgleiche Kombination und die Kombination, in der Bortezomib um acht Stunden später gegeben wurde, eine signifikante Wachstumsverlangsamung. Die Zellversuche von Mortenson et al. zeigten einen geringen Effekt von Bortezomib auf die beiden anderen Zytostatika, jedoch nicht einen so ausgeprägten antagonistischen Effekt wie bei den Tierversuchen. Idealerweise kann man mit präklinischen Versuchen den Effekt einer Behandlung in klinischen Versuchen voraussagen, wie es Jung et al. 2007 zeigten [41]. Aufgrund ihrer präklinischen Versuche rieten sie von einer zeitgleichen Kombination von Bortezomib und Docetaxel ab und empfahlen stattdessen eine zeitversetzte Behandlung, in der Bortezomib an zweiter Stelle dazugegeben werden sollte. Im Januar 2011 veröffentlichten Lara et al. eine Phase-II-Studie, in der Patienten mit NSCLC zu erst mit Docetaxel und dann zeitversetzt mit Bortezomib behandelt wurden, und verglichen dies mit einer Gruppe, die beide Stoffe gleichzeitig erhielt. Die zeitversetzte Behandlung zeigte eine mediane Überlebenszeit von 13,3 Monaten im Vergleich zu 10,5 Monaten bei der zeitgleichen Behandlung, was die Ergebnisse von Jung et al. bestätigte. Bezüglich der Wirkung von Bortezomib in zeitversetzten Kombinationsbehandlungen könnte man diese wie folgt erklären: In vielen Studien wurde beschrieben, wie Bortezomib den Zellzyklus unter anderem durch seine Wirkung auf Protein 21, Protein 27 und Protein 53 (auch als Wächter des Genoms“ bekannt) zum Stillstand bringt und durch ” Herunterregulation der katalytischen Untereinheit der DNA-abhänigen Protein-Kinase (DNA-PKcs) die DNA-Reparatur hemmt [22, 26, 30, 83, 84]. Im Vergleich dazu bewirken Oxazaphosphorine bzw. Carboplatin DNA-Schäden, wobei sie bei schnell proliferierenden Zellen mit hohem Stoffwechsel den besten Effekt entwickeln. Der antagonistische Effekt von Bortezomib, wenn es an erster Stelle in einer Kombination gegeben wird, könnte also durch die Hemmung des Zellzyklus erklärt werden. Der Umkehrschluss, dass die Reparatur von Alkylanzien induzierter DNA-Schäden durch spätere Zugabe von Bortezomib verhindert werde, konnte durch diese Arbeit nicht unterstützt werden, sehr 4 Diskussion 63 wohl hingegen durch die Studie von Mortenson et. al.. 4.6 Schlussfolgerung Wie man in den zahlreichen präklinischen Untersuchungen zur Einzelbehandlung mit Bortezomib sieht, sind erfolgreiche Zell- und Tierversuchen keine Garantie für erfolgreiche klinische Studien. Sie dienen jedoch als Wegweiser, weswegen es auch wichtig ist, Versuche zu veröffentlichen, die kein positives Resultat aufweisen. Die molekularen Mechanismen und möglichen Interaktionen einer Kombinationstherapie mit Bortezomib sind noch nicht ausreichend geklärt und bedürfen weiterer Untersuchungen. Überdies sollten keine klinischen Kombinationsversuche durchgeführt werden, ohne dass diese vorher mit äquivalenten präklinischen Versuchen untermauert wurden. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse sollte vorläufig von klinischen Studien zur Kombination von Bortezomib und Oxazaphosphorinen bei soliden Tumoren abgeraten werden, da die Ergebnisse bestenfalls eine subadditive Wirkungsverstärkung erwarten lassen. Außerdem muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den Behandlungseffekt hat. In künftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmark gelegt werden. 64 5 Zusammenfassung Bortezomib ist ein neuartiges Targeted Drug“ aus der Klasse der Proteasomen” Inhibitoren, welches zur Behandlung des multiplen Myeloms eingesetzt wird. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Wirksamkeit von Bortezomib in Kombination mit Mafosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid in Zellversuchen, und die Kombination von Bortezomib mit Cyclophosphamid bzw. Trofosfamid in Tierversuchen. Mafosfamid ersetzte Cyclophosphamid in den Zellversuchen, da Mafosfamid spontan in den aktiven Metaboliten 4OH-Cyclophosphamid zerfällt, wohingegen Cyclophosphamid von einer enzymatischen Aktivierung abhängig ist. Ziel der Arbeit war es, die Wirkung und damit den eventuellen Nutzen der Kombinationstherapien zu prüfen, da es hierzu bis heute nur eine präklinische Studie gibt. Um die Wirkung der Kombinationstherapien bewerten zu können, wurde die Zellüberlebensrate photometrisch mit dem Kristallviolett-Assay bestimmt. Zu den in vitro untersuchten Zelllinien gehörten das Mammakarzinom MX1, das kleinzellige Lungenkarzinom LX1 und das Weichteilssarkom S117. Der Behandlungseffekt in den Tierversuchen wurde anhand des Tumorvolumens gemessen. In den Tierversuchen wurden die Kombinationstherapien wegen der begrenzten Anzahl der Versuchstiere und des hohen Zeitaufwands lediglich an der LX1-Zellline untersucht. Die vorliegenden Versuche bestätigen die Empfindlichkeit der drei Zelllinien gegenüber Bortezomib. Die zeitgleiche Therapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 erbrachte einen wirkungsverstärkenden Effekt im additiven Bereich für die Zelllinien MX1 und S117. Bei LX1 hatte diese Kombination einen moderat antagonistischen Effekt. Im zweiten Versuchsabschnitt wurde untersucht, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente Einfluss auf die Wirkung der Kombinationen hat. Dabei wurden die Medikamente einmal mit einem Zeitintervall von einer Stunde gegeben und einmal mit einem Zeitintervall von zwei Stunden. Für die zeitversetzte Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 wurde keine größere Veränderung des Behandlungseffekts für die drei Zelllinien beobachtet, unabhängig davon, ob die Medikamente um eine oder zwei Stunden versetzt gegeben wurden. Für die zeitversetzten Kombinationen, in denen Mafosfamid (M) vor Bortezomib IC50 (B IC50) gegeben wurde (M >B IC50), zeigte sich eine tendenziell niedrigere Zellüberlebensrate als für die Kombinationen, in denen Bortezomib an erster Stelle gegeben wurde. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitgleiche 5 Zusammenfassung 65 Kombinationsbehandlung mit 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC50 erzielte für alle drei Zelllinien einen hauptsächlich antagonistischen Effekt. Für die zeitversetzten Kombinationen, in denen Bortezomib IC50 vor 4OH-Trofosfamid (T) gegeben wurde (B IC50>T), war ein ähnlicher antagonistischer Effekt festzustellen. Die zeitversetzten Kombinationen T>B IC50“ zeigten eine tendenzielle Wirkungsverstärkung, da nur ” einzelne Messpunkte der Kombinationen signifikante Unterschiede aufwiesen. Nur das S117 zeigte einen klaren signifikanten Unterschied für die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung (Abb. 3.15). Die Kombination T>B IC50“ lag im additiven ” bis leicht antagonistischen Bereich, was sich signifikant von der Kombination B IC50>T“ ” unterschied. Die letztgenannte Kombination lag ebenso wie die zeitgleiche Kombination im antagonistischen Bereich. Dass eine zeitversetzte Behandlung einer zeitgleichen Behandlung überlegen sein kann, haben Jung et al. 2007 (In-vitro-Studie) und Lara et al. 2011 (Phase-II-Studie) für die Kombination von Bortezomib mit Docetaxel an einem NSCLC gezeigt [41, 50]. Einige der Kombinationsversuche der vorliegenden Studie wurden auch mit Bortezomib IC25 und IC75 durchgeführt, sollen hier aber nur erwähnt werden, weil sie keine neuen Informationen erbrachten. Die gleichen Behandlungen wurden auch am Xenograftmodell zum LX1-Tumor untersucht. Das LX1 wurde für die In-vivo-Versuche ausgewählt, weil es in den In-vitroVersuchen am empfindlichsten auf Bortezomib reagierte. Die Tierversuche bestätigten die Wirksamkeit von Bortezomib als Einzelbehandlung. Der Effekt war unabhängig von der verabreichten Dosis. Die Kombination von Bortezomib mit Trofosfamid zeigte einen antagonistischen Effekt, ähnlich dem der Zellversuche. Im Vergleich dazu zeigte die Kombination von Cyclophosphamid mit Bortezomib eine leichte Wirkungsverstärkung im Sinne einer subadditiven Wirkungsverstärkung, im Vergleich zur jeweiligen Einzelbehandlung. Abgesehen von der Studie von Teicher et al. zur Kombinationsversuchen von Cyclophosphamid und Bortezomib am Xenograftmodell zum Mammakarzinom liegen bis heute keine ähnlichen Arbeiten über die untersuchten Kombinationsbehandlungen vor. Die molekularen Mechanismen und möglichen Interaktionen einer Kombinationstherapie mit Bortezomib sind noch nicht ausreichend geklärt und bedürfen weiterer Untersuchungen. In Anbetracht der vorliegenden Ergebnisse sollte von einer klinischen Untersuchung der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin an soliden Tumoren abgeraten werden, solange keine Arbeiten vorliegen, die Gegenteiliges belegen. Außerdem muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den Behandlungseffekt hat. In künftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmerk gelegt werden. 66 Literaturverzeichnis [1] Adams, J ; Palombella, VJ ; Sausville, EA ; Johnson, J ; Destree, A ; Lazarus, DD ; Maas, J ; Pien, CS ; Prakash, S ; Elliott, PJ: Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents. In: Cancer Res 59 (1999), S. 2615–2622 [2] Ames, E ; Hallett, WHD ; Murphy, WJ: Sensitization of human breast cancer cells to natural killer cell-mediated cytotoxicity by proteasome inhibition. 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Proteasomstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5 3.1 3.2 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a) Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib am MX1 (b) CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Trofosfamid und Bortezomib am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a) Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am S117; (b) CI der um eine Stunde versetzten Kombination M>B IC50“ am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ” CI der um zwei Stunden versetzten Kombination M>B IC50“ . . . . . ” 26 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 29 29 30 32 33 33 36 38 40 42 43 45 47 Abbildungsverzeichnis 3.15 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.16 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Bortezomib 3.17 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 3.18 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bortezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 3.19 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationsweges von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.20 Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Cyclophosphamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.1 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.2 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.3 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.4 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.5 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.6 Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.7 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.8 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.9 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.10 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und Bortezomib am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B.11 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 48 50 51 51 52 53 84 85 85 86 86 87 87 88 88 89 89 79 Tabellenverzeichnis 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.7 2.8 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Medien und Zusätze . . . . . . . . . . . . . . . . Puffer und Stammlösungen . . . . . . . . . . . . . Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien . . . Zusammenstellung der verwendeten Lösungen und Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien . . Fortsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Unterteilung des CI . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 3.2 3.3 Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine . . . . . . . . . . . . . . . Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CI der zeitgleichen Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib . . . Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . CI der zeitgleichen Kombination mit Trofosfamid und Bortezomib . . . MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 11 12 12 14 15 19 20 23 25 26 28 28 34 34 36 37 38 39 40 41 42 Tabellenverzeichnis 3.14 LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 3.15 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 3.16 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 3.17 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 3.18 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . C.1 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.2 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.3 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.4 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.5 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.6 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.7 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.8 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.9 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.10 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.11 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.12 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.13 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.14 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 44 46 46 48 49 90 90 90 91 91 91 92 92 93 93 93 94 94 94 Tabellenverzeichnis C.15 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.16 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.17 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.18 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.19 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.20 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.21 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.22 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.23 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . C.24 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 95 95 95 96 96 96 97 97 97 98 82 Anhang A Abkürzungsverzeichnis Abb. ADP Amp. Aqua dest. ATP B Bcl-2 bzw. CI CLL CML Cyp DNA ED EMA ER evtl. FKS GIST IC25 IC50 IC75 i.p. Kap. KG Konz. LD M MES-Puffer Abbildung Adenosindiphosphat Ampulle Aqua destillata Adenosintriphosphat Bortezomib B-cell lymphoma 2 beziehungsweise Combination Index chronisch lymphatische Leukämie chronisch myeloische Leukämie Cytochrom P450 Desoxyribonukleinsäure extensive disease European Medicines Agency Endoplasmatisches Retikulum eventuell fetales Kälberserum gastrointestinale Stromatumoren Inhibiting Concentration 25% Inhibiting Concentration 50% Inhibiting Concentration 75% intraperitoneal Kapitel Körpergewicht Konzentration limited disease Mafosfamid 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure Anhang A Abkürzungsverzeichnis NaCl-Lsg. Natrium Chlorid Lösung NCI National Cancer Institute NSCLC nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom OD optische Dichte PAST Paleontological Statistiscs p.o. peroral rel. Überlebensrate relative Überlebensrate rpm rounds per minute - siehe auch U/min. SCLC kleinzelliges Lungenkarzinom SEM Standard Error of Mean T Trofosfamid Tab. Tabelle u.a. unter anderem U/min Umdrehungen pro Minute VEGF vascular endothelial growth factor Vgl. Vergleich vs. versus ZNS Zentrales Nervensystem 83 84 Anhang B Grafische Darstellungen Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1,25 2,5 5 7,5 10 15 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Abbildung B.1: Dargestellt ist die rel. Überlebensrate der MX1 Zellen unter der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC25 im Vergleich zur Mafosfamidkontrolle (n=11). Anhang B Grafische Darstellungen 85 Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Abbildung B.2: Dargestellt ist die rel. Überlebensrate des MX1 bei den um eine Stunde versetzten Kombinationsversuchen mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=11). Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 7,5 10 15 20 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Abbildung B.3: Dargestellt ist die um zwei Stunden versetzt Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am Mammakazinom MX1 (n=11). Anhang B Grafische Darstellungen 86 Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid 4OH-Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + 4OH-Trofosfamid 2h Abbildung B.4: Dargestellt ist die Zellüberlebensrate des MX1 unter der um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 (n=11). Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Abbildung B.5: Die Grafik zeigt am LX1 die um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie von Mafosfamid und Bortezomib IC25, sowie die Kontrolle mit Mafosfamid (n=10). Anhang B Grafische Darstellungen 87 Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Abbildung B.6: Die Abbildung zeigt die relative Überlebensrate der LX1 unter der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 (n=10). Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 2,5 5 10 20 40 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Abbildung B.7: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate des LX1 bei der um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 (n=13). Anhang B Grafische Darstellungen 88 Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Abbildung B.8: Abgebildet ist die rel. Überlebensrate des S117 bei der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib IC25, sowie die Kontrolle mit Mafosfamid (n=11). Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Abbildung B.9: Abgebildet ist rel. Überlebensrate des S117 unter der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC25 im Vergleich zur Trofosfamidkontrolle (n=11). Anhang B Grafische Darstellungen 89 Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Mafosfamid [µmol/l] Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Abbildung B.10: Dargestellt ist die rel. Überlebensrate des S117 unter der um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 (n=16). Rel. Proliferationshemmung im Vgl. zur Kontrolle [%] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 30 Trofosfamid [µmol/l] Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Abbildung B.11: Dargestellt ist rel. Überlebensrate des S117 bei der um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=12). 90 Anhang C Daten Zeitgleiche Kombinationsbehandlung Dargestellt sind die p-Werte der zeitgleichen Kombinationsversuche der Zelllinien MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p≤ 0,05 wurde für diese Versuche festgelegt. Tabelle C.1: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am MX1 Mafosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 1,25 >0,01 >0,01 >0,01 2,5 >0,01 >0,01 >0,01 5 >0,01 >0,01 >0,01 7,5 0,11 >0,01 >0,01 10 0,33 0,05 >0,01 15 0,71 0,49 0,043 Tabelle C.2: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1 Mafosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 2,5 0,31 >0,01 >0,01 5 0,04 >0,01 >0,01 10 0,25 >0,01 >0,01 20 0,68 0,17 0,03 40 0,70 0,55 0,45 Tabelle C.3: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117 Mafosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 5 0,35 >0,01 >0,01 10 0,17 >0,01 >0,01 15 0,36 0,023 >0,01 20 0,51 0,12 0,02 30 0,97 0,44 0,46 Anhang C Daten 91 Tabelle C.4: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am MX1 Trofosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 2,5 0,37 >0,01 >0,01 5 0,04 >0,01 >0,01 10 0,40 0,02 >0,01 15 0,24 0,76 0,16 20 0,30 0,32 0,72 30 0,11 0,29 0,37 Tabelle C.5: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1 Trofosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 2,5 0,48 0,10 0,02 5 0,90 0,61 0,13 10 0,67 0,33 0,74 20 0,16 0,95 0,11 40 0,78 0,99 0,43 Tabelle C.6: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117 Trofosfamid µmol/l Bort. IC25 p-Wert Bort. IC50 Bort. IC75 5 0,97 >0,01 >0,01 10 0,68 0,25 >0,01 15 0,74 0,36 >0,01 20 0,80 0,74 0,75 30 0,80 0,74 0,74 Anhang C Daten 92 Zeitversetzte Kombinationsbehandlungen Dargestellt sind die p-Werte der zeitverzögerten Kombinationsversuche der Zelllinien MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p>0,025 wurde für diese Versuche festgelegt. Tabelle C.7: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert 0,30 0,09 0,27 0,33 0,67 0,80 Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert 0,09 0,27 0,52 0,80 0,70 0,95 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert 0,70 0,56 0,75 0,70 0,47 1,00 Tabelle C.8: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,04 0,46 0,60 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,20 0,78 0,45 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert 0,15 0,09 0,23 0,25 0,68 0,78 Anhang C Daten 93 Tabelle C.9: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,70 0,24 0,36 0,80 0,33 0,22 Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,90 0,13 0,51 0,56 0,85 0,33 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,95 0,95 0,85 0,56 0,57 0,80 Tabelle C.10: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 0,07 0,13 0,33 0,37 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 0,90 0,54 1 0,67 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,07 0,02 0,06 0,02 0,44 0,50 Tabelle C.11: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,01 0,09 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,12 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15 p-Wert 0,75 0,80 0,80 0,75 0,70 0,57 Anhang C Daten 94 Tabelle C.12: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,24 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,02 0,12 0,06 0,65 0,19 0,52 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30 p-Wert 0,07 0,01 0,02 0,08 0,48 0,85 Tabelle C.13: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,40 0,60 0,60 0,90 0,78 Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,39 0,91 0,91 0,53 0,32 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,97 0,81 0,53 0,40 0,39 Tabelle C.14: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,73 0,19 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 0,17 0,81 0,42 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 0,13 0,27 0,53 0,44 Anhang C Daten 95 Tabelle C.15: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC25 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,34 0,64 0,59 0,93 0,54 Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,54 0,44 0,91 0,19 0,85 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,66 0,21 0,66 0,18 0,72 Tabelle C.16: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC50 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 0,01 0,13 0,53 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,10 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 0,02 0,27 >0,01 0,24 Tabelle C.17: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,30 0,69 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,88 0,72 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,54 0,76 0,41 0,24 0,41 Anhang C Daten 96 Tabelle C.18: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC50 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,32 0,76 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert >0,01 0,03 0,42 0,52 0,76 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40 p-Wert 0,05 >0,01 >0,01 0,12 0,27 Tabelle C.19: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,01 0,01 0,05 0,21 0,24 Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,03 >0,01 0,12 0,19 0,44 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,13 0,40 0,16 0,23 0,33 Tabelle C.20: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,04 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,21 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,12 0,41 0,16 0,23 0,32 Anhang C Daten 97 Tabelle C.21: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,52 0,85 0,66 0,65 0,95 Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,85 1 0,70 0,19 0,61 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,65 0,85 0,85 0,3 0,61 Tabelle C.22: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 0,06 0,07 0,21 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,45 Tabelle C.23: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,07 Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,16 Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert 0,27 0,27 0,09 0,15 0,03 Anhang C Daten 98 Tabelle C.24: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,09 Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 >0,01 0,16 >0,01 0,27 Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30 p-Wert >0,01 0,98 0,44 0,10 0,81 99 Anhang D Danksagung Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Thomas Wagner für die Überlassung des Themas dieser Dissertation und der Nutzungsmöglichkeit des Labors. Außerdem möchte ich mich bei ihm für die intensive und geduldigen Betreuung bedanken. Außerdem möchte ich mich bei Frau Dr. Stephanie Stölting bedanken für die motivierende Unterstützung, die wiederholte Korrektur der Arbeit, sowie die Hilfestellung bei der Statistik. Danken möchte ich auch Frau Monica Vollmert für die Einweisung in die Arbeitsmethoden, die Betreuung während der Versuche sowie für die Korrektur von Teilen der Arbeit. Für die großartige Hilfe bei den Tierversuchen möchte ich mich bei meiner Mitdoktorandin Friederike Auerswald bedanken. Bei Mark Schenk möchte ich mich für die Einführung in das Arbeitsprogramm LaTex bedanken sowie dafür, dass er jederzeit mit Rat und Tat bei der Lösung von Programmproblemen geholfen hat. Außerdem möchte ich mich bei Dr. Mathias Hoizcyk von der Onkologischen Klinik in Essen und Dr. Tobias Wöhrle von der Anästesiologischen Klinik der LudwigMaximilians-Universität München für die Korrekturlesung meiner Arbeit bedanken. Für die Rettung meiner Daten von meinem ausgebrannten Computer bin ich meinem Freund Kasper Worsøe Andersen sehr zu Dank verpflichtet. Auch dem Laborteam und den Mitdoktoranden möchte ich für die aufmunternde Zusammenarbeit danken. Zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern und meinem Bruder dafür, das sie mir mein Studium ermöglicht und mir während dieser Arbeit Vertrauen und Unterstützung geschenkt haben. 100 Anhang E Lebenslauf Persönliche Daten Name: Jan Mikael Gerl Geburtstag/-ort: 26. März 1981, Hillerød, Dänemark Hochschulausbildung 2000-2007 Studium der Humanmedizin 04/03 - 12/07 Klinischer Abschnitt, Universität zu Lübeck, Deutschland 09/00 - 08/02 Vorklinischer Abschnitt, Semmelweis Universität, Budapest, Ungarn 02/06 - 10/06 PJ, Chirurgie und HNO, Universität zu Lübeck, Deutschland 11/06 - 02/07 PJ, Innere Medizin, Haukeland Sykehus, Bergen, Norwegen Beruflicher Werdegang 09/12 06/12 06/11 04/11 04/10 09/08 04/08 - 08/12 05/12 05/12 03/11 03/10 08/09 Ass.-Arzt Ass.-Arzt Ass.-Arzt Ass.-Arzt Ass.-Arzt Ass.-Arzt Ass.-Arzt HNO, Ahus Sykehus, Lørenskog, Norwegen Innere Medizin, Dronning Ingrids Hospital, Nuuk, Grönland HNO, Slagelse Hospital, Dänemark Audiologie, Slagelse Hospital, Slagelse, Dänemark Onkologie, Rigshospitalet, Kopenhagen, Dänemark Innere Medizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Dänemark Gastromedizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Dänemark Extracurriculare Aktivitäten 09/11 04/09 05/05 06/04 - 05/12 04/10 05/06 12/07 Assistentensprecher des Krankenhauses in Slagelse Assistentensprecher der internistischen Abteilung in Herlev 1. Vorsitzender des ”deutschen Famulantenaustausches”(dfa) Experimenteller Teil der Dissertation 101 Anhang F Erklärung Ich versichere, die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Benutzung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt zu haben. Die Tierversuche wurden vom Ministerium für Umweltschutz, Natur und Forsten des Landes Schleswig-Holstein unter der Tierversuchsantragsnummer V742-72241 122-4 (22-3/05) genehmigt (siehe auch Kap. 2.8.1). Lübeck, den 30.01.2013
