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Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Substratspezifität der Rho-aktivierenden bakteriellen Toxine CNF1 und DNT sowie der eukaryoten Gewebstransglutaminase für Isoformen der Rho-Familie INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2006 von Ulrike Pack geboren in Berlin Dekan: Prof. Dr. C. Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. med. rer. nat. K. Aktories 2. Gutachter: Prof. Dr. H.-D. Hofmann Jahr der Promotion: 2006 Danksagung An dieser Stelle möchte ich Prof. Dr. Dr. Aktories für die Überlassung des Themas, die hervorragenden Arbeitsbedingungen und seine engagierte Betreuung danken. Bei Prof. Dr. Hofmann bedanke ich mich für die Übernahme der Zweitkorrektur. Ich danke Christian Wilde und Udo Göhring für ihre Betreuung zu Beginn der Arbeit. Für ihre geduldige und tatkräftige Hilfe im Laboralltag gilt mein Dank allen Mitarbeitern der Abteilung Ι des Instituts für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität Freiburg. Ganz besonders möchte ich Gudula Schmidt danken, die mich zur Fertigstellung der Arbeit motivierte und mich dabei sehr engagiert unterstützte. Auch Jürgen Dumbach, Iris Misicka, Claudia Hoffmann, Florian Füller, Martin Vogelsgesang, Thomas Jank und Myriam Motyl danke ich besonders herzlich für ihre Unterstützung und für die gute Atmosphäre im Labor, ohne die die Arbeit nur halb so viel Spaß gemacht hätte. Außerdem danke ich meiner Familie und meinen Freunden, die mich die ganze Zeit über begleitet haben und mir mit Rat und Tat zur Seite standen. INHALTSVERZEICHNIS____________________________________________________I A Einleitung 1 I Rho-GTPasen I.1 niedermolekulare GTP-bindende Proteine I.2 Gliederung der Rho-Familie I.3 GTP/GDP-Zyklus und Regulation I.4 Struktur der Rho-Proteine I.5 Posttranslationale Modifikation I.6 Rho-Proteine und Zytoskelett I.7 Wirkungsmechanismus von Rho am Zytoskelett I.8 Wirkungsmechanismus von Cdc42 am Zytoskelett I.9 Wirkungsmechanismus von Rac am Zytoskelett I.10 Nicht-Zytoskelett-assoziierte Funktionen I.11 Funktionen und Interaktionen der Rho-Isoformen I.12 Struktur und Regulation der Rho-Isoformen 1 1 2 2 4 4 5 5 7 8 9 9 10 II Bakterielle Toxine II.1 Einteilung II.2 Aufnahmemechanismen und Aufbau II.3 Eukaryote Substrate bakterieller Toxine II.4 Rho-aktivierende Toxine II.5 Transglutaminasen II.6 Bakterielle Toxine als Werkzeuge der Zellbiologie und Erforschung der Rho-GTPasen 11 11 11 12 15 17 18 B Zielsetzung der Arbeit 20 C Material und Methoden 21 I 21 21 24 24 24 24 25 25 25 26 26 26 27 Material I.1 Puffer, Nährmedien und Antibiotika I.2 Bakterienstämme I.3 Vektoren I.4 Glycerin-Kulturen I.5 Radionuklide I.6 Enzyme I.7 Antikörper I.8 Verbrauchsmaterialien I.9 Firmen I.10 Reagenzienkits I.11 Geräte I.12 Primer INHALTSVERZEICHNIS___________________________________________________II II Methoden II.1 II.2 II.3 Arbeiten mit Proteinen 1.1 Expression und Aufreinigung von GST-FusionsProteinen 1.1.1 Expression in E. coli 1.1.2 Lyse der Bakterienzellen 1.1.3 Affinitätschromatographie 1.1.4 Glutathion-Freisetzung 1.1.5 Thrombinspaltung 1.1.6 Konzentration der Proteinlösung 1.2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen nach Bradford 1.3 Optische Bestimmung der Proteinkonzentrationen 1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 1.5 Herstellung der Polyacrylamidgele 1.6 Proteinnachweis durch Immunoblot-Analyse (Westernblot) Tests der Substratspezifität 2.1 Auswahl der Konzentrationen für die Toxin/Substrat-Interaktion 2.2 Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin 2.3 Messung der Ammoniakfreisetzung 2.4 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel 2.5 Messung der GTP-Bindung 2.6 Messung der GTPase-Aktivität Arbeiten mit DNA 3.1 Zielgerichtete Mutagenese und Polymerasekettenreaktion 3.2 Primer-Design 3.3 Plasmid-Präparation 3.4 DNA-Konzentrationsbestimmung und Abschätzung der Qualität 3.5 Mutagenese-PCR 3.6 Dpn1-Verdau 3.7 Agarosegelelektrophorese 3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen 3.9 Transformation 3.10 Kontrolle der Basensequenz 3.11 Konservierung transformierter E. coli Bakterien 29 29 29 29 30 30 30 31 31 31 32 32 33 34 36 36 36 38 39 40 41 42 42 43 43 43 44 44 45 45 46 46 48 INHALTSVERZEICHNIS__________________________________________________III D Ergebnisse 49 I Nachweis der korrekten Faltung der getesteten Rho-Proteine 50 II DNT und CNF1 II.1 Substratspezifität von DNT II.2 Substratspezifität von CNF1 II.3 Aminosäuresequenzvergleich der Switch-II-Regionen der getesteten Rho-GTPasen II.4 Mutanten zur Untersuchung der Substratspezifität von DNT und CNF1 II.5 Untersuchung der Mutanten 51 51 53 57 58 III RhoD D76E III.1 Deamidierung von RhoD D76E III.2 GTPase-Aktivität von RhoD D76E 60 60 62 IV Gewebstransglutaminase IV.1 Substratspezifität der Gewebstransglutaminase IV.2 Aminosäuresequenzvergleich von Cdc42 und RhoA IV.3 Mutanten zur Untersuchung der Substratspezifität der Gewebstransglutaminase IV.4 Untersuchung der Mutanten 63 63 65 Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse 67 V E 56 66 66 Diskussion 68 I II III 69 73 75 DNT und CNF1 Gewebstransglutaminase Ausblick F Zusammenfassung 77 G Literaturverzeichnis 78 H Anhang 84 I II III IV V 84 85 86 87 88 Abbildungen Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Ein-und Dreibuchstaben-Code der Aminosäuren Abkürzungen Lebenslauf 1 A Einleitung I Rho-GTPasen I.1 Niedermolekulare GTP-bindende Proteine Rho-GTPasen sind niedermolekulare GTP-bindende Proteine, die zur Ras-Superfamilie gehören. An die 100 niedermolekulare GTP-bindende Proteine wurden bisher identifiziert. Ihre Einteilung erfolgt in fünf große Familien (Abb. A1). Dies sind die Ras-, die Rab-, die Sar1/Arf-, die Ran- und die Rho-Familie (Takai, 2001). Die Ras-Gene wurden in den achtziger Jahren als erste entdeckt. Da sie in Sarkoma-Viren aus Rattenzellen gefunden wurden, wurde das Genprodukt Ras („rat sarcoma“) genannt (Ellis, 1981). 1985 wurde ein mit Ras homologes Protein identifiziert, Rho. Der Name Rho steht für „Ras homologue“ (Madaule, 1985). Rho-Proteine besitzen gegenüber den Ras-Proteinen eine Identität der Sequenzen von ungefähr 30%, während die Sequenzidentität innerhalb der RhoFamilie mindestens 40% beträgt. Besonders konserviert sind die Regionen für die GTPBindung (Takai, 2001; Hall, 2000). Die Funktion der Ras-Familie ist vor allem die Regulation der Genexpression. Die RanFamilie reguliert den nukleoplasmatischen Transport und die Organisation von Mikrotubuli während des Zellzyklus. Für die Regulation des intrazellulären Vesikeltransportes sind vornehmlich die Mitglieder der Rab und Sar1/Arf-Familie verantwortlich. Die Reorganisation des Zytoskeletts und die Regulation der Transkription gehören zu den wichtigsten Funktionen der Rho-Familie (Takai, 2001). Abb. A1: Stammbaum niedermolekularer GTP-bindender Proteine (Wennerberg, 2004) Die niedermolekularen GTP- bindende Proteine werden in fünf große Innerhalb besteht Familien der eine eingeteilt. Rho-Familie Identität der Sequenzen von mindestens 40%, während sie zwischen der RhoFamilie und der Ras-Familie ungefähr 30% beträgt. 2 I.2 Gliederung der Rho-Familie Zur Rho-Familie gehören 22 Mitglieder, die in acht Subgruppen unterteilt werden können (Abb. A2) (Aspenström, 2004). Die am besten beschriebenen Rho-GTPasen sind RhoA, Cdc42 und Rac1. RhoA, Cdc42 und Rac1 haben mehrere Isoformen. In die Rho-Gruppe gehören RhoA, RhoB und RhoC. In die Cdc42-Gruppe gehören neben Cdc42 auch TC10, TCL, Chp und Wrch1. Zur Rac-Gruppe gehören Rac1, Rac2, Rac3 und RhoG. Eine weitere wichtige Gruppe sind die Rnd-Proteine, deren Merkmal vor allem der Antagonismus zu RhoA, Cdc42 und Rac ist. RhoD und RhoH bilden jeweils eine eigene Gruppe. Die Mitglieder dieser sechs Gruppen besitzen die klassische Struktur der Rho-GTPasen aus einer GTPaseDomäne und einem isoprenylierten C-terminalen Ende. In letzter Zeit wurden bei der Suche nach weiteren Rho-GTPasen atypische Rho-GTPasen gefunden. Sie unterscheiden sich von den typischen GTPasen durch zusätzliche Domänen. Die RhoBTB-Proteine besitzen eine GTPase-Domäne und zwei BTB-Domänen am C-Terminus (Rivero, 2001). Die Miro-Proteine setzen sich aus zwei GTPase-Domänen zusammen, zwischen denen sich zwei EF-HandMotive befinden (Fransson, 2003). GG Klassische Rho-GTPasen Rho-GTPase Rho Gruppe [K/R] Cdc42 Gruppe Cdc42, TC10, TCL, Chp und Wrch1 Rac Gruppe Rac1, Rac2, Rac3, RhoG Rnd Gruppe Rnd1, Rnd2, Rnd3/RhoE RhoD Gruppe RhoD, Rif RhoH RhoH/TTF OMe Rac1 OMe P F Rnd3 C RhoA, RhoB, RhoC F Rho-GTPase [K/R] Rho-GTPase [K/R] C P Rho-GTPase C F C C C TC10 OMe GG RhoB OMe Atypische Rho-GTPasen Gruppe Isoformen RhoBTB Gruppe RhoBTB1, RhoBTB2 Miro Gruppe Miro1, Miro2 Rho-GTPase Rho-GTPase BTB EFH EFH BTB RhoBTB Rho-GTPase Miro Abb. A2: Einteilung der Rho-Familie (Wennerberg, 2004) Die Mitglieder der Rho-Familie werden in acht Gruppen unterteilt. Die meisten Rho-Proteine besitzen die klassische GTPase-Struktur. RhoBTB und Miro sind atypische Rho-GTPasen, die zusätzliche Domänen aufweisen. Dargestellt ist auch die unterschiedliche C-terminale Isoprenylierung der Rho-GTPasen (s. u.); GG = Geranylgeranylrest; F = Farnesylrest; P = Palmitoylrest; [K/R] = polybasische Region; I.3 GTP/GDP-Zyklus und Regulation Wie alle Proteine der Ras-Superfamilie befinden sich die Rho-GTPasen in einem Kreislauf zwischen der GTP-gebundenen Form, in der sie aktiv sind, und der GDP-gebundenen Form, in der sie inaktiv sind (Hall, 1990; Takai, 2001) (Abb. A3). An der Regulation dieses Zyklus sind drei unterschiedliche Proteinfamilien beteiligt, GDIs, GEFs und GAPs. 3 In der GDP-gebundenen Form liegen die GTPasen an GDIs („guanine nucleotide dissociation inhibitors“) gebunden im Zytoplasma vor (Ueda, 1990). Diese Regulatorproteine verhindern die Dissoziation von GDP und in der Folge die Aktivierung der Rho-GTPasen. Erreichen extrazelluläre Stimuli zur Aktivierung der Rho-GTPasen die Zelle, löst sich GDI von der GTPase, und die GTPase transloziert zur Plasmamembran. Zur Aktivierung der GTPase kommt es durch die Wirkung eines GEF-Proteins („guanine nucleotide exchange factor“), das die Dissoziation von GDP beschleunigt und die Bindung von GTP an die Rho-GTPase ermöglicht (Takai, 2001; Hall, 2000). Extrazelluläre Signale führen häufig zur Aktivierung der GEFs. Die Inaktivierung der Rho-GTPasen erfolgt durch die Hydrolyse von GTP zu GDP. Rho-GTPasen besitzen eine intrinsische GTPase-Aktivität, die bei verschiedenen RhoGTPasen unterschiedlich ausgeprägt sein kann. An diesem Punkt setzt die dritte Gruppe von Regulatoren an, die GAPs („GTPase-activating proteins“). Sie steigern die intrinsische GTPase-Aktivität der Rho-Proteine, indem sie einen „Argininfinger“ in die GTPBindungsregion einbringen und so den Übergangszustand der Hydrolyse stabilisieren (Rittinger, 1997a/b). Die GTP-Hydrolyse wird gesteigert, und die Rho-GTPasen werden in den GDP-gebundenen Zustand überführt. Durch ein GDI können die GTPasen nach der Inaktivierung aus der Membran gelöst und wieder ins Zytosol überführt werden (Hall, 2000). Die Gruppe der GEFs umfasst bisher mehr als 70, die der GAPs ungefähr 80 Mitglieder, die sich in ihrer Substratspezifität zum Teil spezifisch unterscheiden und zum Teil überlappen. Im Gegensatz dazu sind nur drei GDIs bekannt (Wennerberg, 2004). GTP NukleotidAustausch GDP Abb. A3: GTP/GDP-Zyklus der RhoGTPasen In der GTP-gebundenen Form sind Rho- GEF GTPasen aktiv, in der GDP-gebundenen Form inaktiv. GDIs halten die Rho- GDP Rho inaktiv aktiv Rho GTP GTPasen im inaktiven Zytosol. GEFs Zustand beschleunigen im die Dissoziation von GDP und ermöglichen GDI GAP die Bindung von GTP. GAPs inaktivieren die Rho-GTPasen durch Stimulation der Pi Hydrolyse H2O intrinsischen GTPase-Aktivität. 4 I.4 Struktur der Rho-Proteine Die Rho-GTPasen sind monomere Proteine mit einer molaren Masse von 20-30 kDa (Abb. A4). Ihre Struktur weist zwei flexible Schleifen auf, die Switch-I- und die Switch-II-Region. Die Switch-Regionen vollziehen beim Austausch von GDP gegen GTP eine deutliche Konformationsänderung, die die Bindung der Rho-GTPasen an Effektorproteine ermöglicht. In Rho-GTPasen dienen, im Gegensatz zu Ras, neben der Switch-I-Region (As 32-41) auch andere Regionen der Effektorbindung, wie z. B. die Switch-II-Region, die Insert-Region und Teile des C- und N-Terminus (Li, 1999). Die Insert-Region ist eine Aminosäureabfolge von 13 Aminosäuren (As 125-137), die in Ras-Proteinen nicht vorkommt und eine α-Helix bildet (Hall, 2000). Die Switch-II-Region (As 62-78) ist an der GTP-Bindung und an der Hydrolysereaktion der Rho-GTPasen beteiligt (Pai, 1989). Für die Hydrolysereaktion sind zwei Aminosäuren erforderlich, Glycin 14 und Glutamin 63 (Foster, 1996). Das in der Switch-II-Region gelegene Glutamin 63 interagiert dabei mit dem hydrolysierenden Wassermolekül und bewegt sich während der Reaktion in Richtung γ-Phosphat des GTPMoleküls. Dort stabilisiert es einen Übergangszustand, der für den Ablauf der Hydrolyse notwendig ist (Garavini, 2002). Eine Rho-GTPase, die kein Glutamin an Position 63 besitzt, hat keine GTPase-Aktivität. Abb. A4: 3D-Struktur von RhoA Insert-Region Rho-GTPasen besitzen zwei flexible Schleifen, die Switch-I-Region ihre Konformation ändern, wenn GDP gegen GTP Glutamin 63 ausgetauscht wird. Die Switch-I-Region dient der Threonin 37 Switch-II-Region Effektorbindung, die Switch-II-Region der GTP-BindungAspartat und Hydrolyse. Für die intrinsische GTPase-Aktivität der RhoGTPasen ist Glutamin 63 essentiell. N-Terminus C-Terminus I.5 Posttranslationale Modifikation Am C-terminalen Ende besitzen Rho-Proteine eine Erkennungssequenz, die CAAX-Box, die der posttranslationalen Modifikation dient. CAAX steht für die Abfolge von einem Cystein, zwei aliphatischen und einer weiteren, nicht festgelegten Aminosäure. Posttranslational wird ein Isoprenrest am Cysteinrest angeheftet. Die drei verbleibenden Aminosäuren werden abgespalten, und die so entstandene freie Carboxylgruppe des Cysteins wird 5 carboxymethyliert (Abb. A5). Der Isoprenrest ist eine wichtige Vorraussetzung für viele Funktionen der Rho-GTPasen, da er für die Verankerung in der Membran und für die Interaktion mit GDI notwendig ist. Die meisten Rho-GTPasen werden geranylgeranyliert (20 C-Atome), die Rnd-Proteine hingegen werden farnesyliert (15 C-Atome). TC10 und RhoB können palmitoyliert werden (Abb. A2). Rho C A A X Abb. A5: Posttranslationale Modifikation SH Die posttranslationale Modifikation der RhoProteine erfolgt an der CAAX-Box. An den GG-PP Rho durch die Geranyl- C-Atomen (Geranylgeranyl = GG) angehängt. Dieser verankert das Rho-Protein in der Membran. C (-) S GG C Anschließend werden Aminosäuren durch die restlichen proteolytische drei Spaltung (CAAX-Protease) entfernt und die so entstandene Mikrosomale Membran freie Carboxylgruppe durch die Methyltransferase (MT) carboxymethyliert. MT AdenoHcy Rho GG CAAX Prot -AAX AdenoMet wird geranyltransferase (GGT) ein Isoprenrest von 20 S C A A X H2O Rho Cysteinrest GGT 2 Pi S GG Me I.6 Rho-Proteine und Zytoskelett Die Hauptfunktion der Rho-GTPasen liegt in der Regulation des Zytoskeletts. Vom Zytoskelett abhängige Prozesse, die im Zusammenhang mit den Rho-GTPasen stehen, sind Zellmigration, Phagozytose, Pinozytose, Exozytose, Zellpolarität, Vesikeltransport, Zytokinese, Morphogenese, Axonwachstum u. a (Hall, 2000; Ridley, 2001a/b). Bei der Zellmigration bewirkt z. B. Rac das Vorschieben von Zellfortsätzen, während RhoA für die Kontraktion und das Nachziehen des Zellkörpers verantwortlich ist. Cdc42 dient bei der Zellmigration vornehmlich der Wahrnehmung der Zellumgebung (Ridley, 2001a). I.7 Wirkungsmechanismus von Rho am Zytoskelett Die Rho-GTPasen beeinflussen das Zytoskelett, das aus Mikrotubuli, Intermediärfilamenten und Aktinfilamenten besteht, über verschiedene Wirkungsmechanismen. Dabei sind die Aktinfilamente das Ziel der Rho-GTPasen. Wird RhoA aktiviert, kommt es in Kulturzellen 6 zur vermehrten Bildung von Aktin-Kabeln, die das gesamte Zytoplasma durchziehen. RhoProteine fördern nicht nur die Bildung, sondern auch die Kontraktilität der Aktin-MyosinFasern. Aktin-Kabel bestehen aus Aktin- und Myosinfilamenten und sind mit verschiedenen aktinbindenden Proteinen assoziiert. Sie kommen physiologisch in Zellen vor, die an Oberflächen lokalisiert und Scherkräften ausgesetzt sind. Darüber hinaus kommt es durch Aktivierung von RhoA zu Aktinpolymerisierung und zur Bildung von fokalen Adhäsionen, die für Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte wichtig sind (Hall, 2000; Ridley, 1992). Die Effekte auf das Zytoskelett werden über eine Reihe von Effektorproteinen vermittelt. Dies können Proteinkinasen, Lipidkinasen, Phospholipasen und Adapterproteine sein. Abb. A6: Wirkmechanismus von Rho am Zytoskelett Der Rho Rho-Effektor phosphoryliert die („myosin mDia PIP-5K PI4,5P2 MLC Profilin Kontraktilität die bindet Profilin, ein aktinbindendes Protein. Die Kinase capping uncapping MLCK Aktin-Kabel und durch RhoA aktivierte PIP-5- MLCP P chain Myosinleichtketten. Der Effektor mDia MLC MLCP light phosphatase“) ROK ROK (Phosphatidylinositol- phosphat-5-Kinase) vermehrter Produktion Phosphoinositiden Aktin-Kabel Aktinpolymerisierung führt und zu von zum „uncapping“ der Aktinfilamente. Alle drei Mechanismen haben die Bildung von Aktin-Kabeln zur Folge. Ein gut erforschtes Beispiel ist der Rho-Effektor ROK (Rho-assoziierte Kinase) (Abb. A6). Über die Aktivierung von ROK bewirkt RhoA die Phosphorylierung der Myosinleichtketten (MLC = myosin light chain) auf zwei Arten. Erstens phosphoryliert und inaktiviert ROK die MLCP („myosin light chain phosphatase“). Die durch MLCK phosphorylierte Form des Myosins akkumuliert (Matsui, 1996, Leung, 1995). Zweitens phosphoryliert ROK selbst die Myosinleichtketten (Amano, 1996). Die phosphorylierte Myosinleichtketten binden verstärkt Aktinfilamente, und es kommt zur Aktin-Kabel-Bildung. Der Rho-Effektor mDia, ein forminähnliches Protein, ist ebenfalls für die Bildung von AktinKabeln notwendig. Mit einer prolinreichen Domäne bindet es an das aktinbindende Protein 7 Profilin und trägt auf diesem Weg zur Aktin-Kabel-Bildung bei (Alberts, 2001). Ein anderer Weg, über den RhoA die Bildung von Aktin-Kabeln vermitteln kann, ist die Bildung von Phosphoinositiden durch die Aktivierung der PIP-5-Kinase (Phosphatidylinositolphosphat-5Kinase) (Chong, 1994). Sie besitzen die Fähigkeit aktinbindende Proteine, die das Plusende („barbed ends“) der Aktinfilamente wie eine Art Kappe bedecken, zu verdrängen („uncapping“). Die Polymerisierung von Aktin wird dadurch ermöglicht. I.8 Wirkungsmechanismus von Cdc42 am Zytoskelett Aktiviertes Cdc42 stimuliert in Fibroblasten die Bildung langer, fingerartiger Zellfortsätze, in denen Aktinfilamente parallel verlaufen (Allen, 1997). Sie werden Filopodien genannt und kommen auch an den Wachstumskegeln neuronaler Zellen vor (Kozma, 1997). Am führenden Rand migrierender Zellen übernehmen Filopodien wahrscheinlich die Funktion von Sensoren, die Signale der Zellumgebung wahrnehmen und die korrekte Ausrichtung der Zelle gewährleisten (Nobes, 1999). Ein gut erforschter Weg, über den Cdc42 seine Effekte auf das Zytoskelett ausübt, ist die Bindung von N-WASP („Wiskott-Aldrich syndrome product“) (Abb. A7). Die Bindung hat eine Konformationsänderung von N-WASP zur Folge, durch die eine Arp2/3-Bindungsdomäne freigelegt wird. Der Arp2/3-Komplex bindet an das Gerüst aus Cdc42 und N-WASP und dient dann als „Kernbildungsort“ für die Aktinpolymerisierung, an den sich Aktinmonomere (G-Aktin) und Profilin anlagern (Rohatgi, 1999). Abb. A7: Wirkungsmechanismus von Cdc42 am Zytoskelett N-WASP Cdc42 führt zur Bildung von GTP Filopodien indem es N-WASP Cdc42 Arp2/3 N-WASP N-WASP an Cdc42 ändert sich GDP ru n g F-Aktin Profilin die Konformation von N-WASP und Arp2/3 Ak tiv ie Cdc42 bindet. Durch die Bindung von eine Arp2/3-Bindungs- domäne wird freigelegt. An den Profilin N-WASP Komplex aus Cdc42, N-WASP Aktinfilamente Kernbildung G-Aktin und Arp2/3 lagern sich Aktinmonomere und Profilin an, so dass werden. Aktin-Kabel gebildet 8 I.9 Wirkungsmechanismus von Rac am Zytoskelett Aktiviertes Rac bewirkt in Kulturzellen die Bildung von Lamellipodien, breiten Zellausstülpungen, die von einem Aktinnetzwerk durchzogen sind (Allen, 1997). Sie kommen z. B. am führenden Rand migrierender Zellen vor. Auch Zellausstülpungen an der apikalen Zellmembran, die „membrane ruffles“, werden durch Rac hervorgerufen. Die Effekte von Rac auf das Zytoskelett sind besonders wichtig für die Zellmigration. Zu den Effektoren von Rac (und Cdc42) gehören die Ser/Thr-Kinasen der PAK Protein-Familie („p21 activated kinase“), die die Fähigkeit besitzen, Lamellipodien und Filopodien hervorzurufen (Sells, 1997). Es gibt zwei Ansatzpunkte von PAKs am Zytoskelett (Abb. A8). Zum einen hemmen die PAKs die MLCK durch Phosphorylierung und führen dadurch zur Verminderung der Aktin-Kabel (Sanders, 1999). Zum anderen phosphorylieren PAKs eine weitere Kinase, die LIM Kinase (LIMK) (Edwards, 1999). LIMK phosphoryliert und inhibiert Cofilin, das dafür bekannt ist, die Depolymerisierung von Aktinfilamenten zu vermitteln. Durch die Hemmung der Depolymerisierung stabilisiert Rac über PAK und LIMK die Aktinfilamente. Rac bindet außerdem WAVE, ein WASP-ähnliches Protein, das sich in „membrane ruffles“ befindet und wie WASP/N-WASP mit Arp2/3 interagiert (Miki, 1998). Abb. A8: Wirkungsmechanismus Rac von Rac am Zytoskelett PAK phosphoryliert und aktiviert LIMK, und LIMK phosphoryliert PAK und hemmt Cofilin. Da aktives Cofilin die Depolymerisierung LIMK P Cofilin Cofilin aktiv inaktiv Aktinfilamenten bewirkt, wird durch diesen Mechanismus P P Depolymerisierung der Aktinfilamente von MLCK die Depolymerisierung von Aktin P gehemmt und die Aktinfilamente MLC Stabilisierung der Aktinfilamente MLC stabilisiert. außerdem Destabilisierung der Aktinfilamente PAK die hemmt MLCK Phosphorylierung, was durch zur Verminderung der Aktin-Kabel führt. 9 I.10 Nicht-Zytoskelett-assoziierte Funktionen Außer an der Regulation des Zytoskeletts sind die Rho-GTPasen an der Regulation der Transkription und an der Aktivierung der NADPH-Oxidase beteiligt. Rho, Rac und Cdc42 aktivieren die SRF-abhängige Transkription (SRF = Serum response factor), worunter z. B. die Transkription von Aktin und Myosin fällt (Hill, 1995). Rac und Cdc42 aktivieren darüber hinaus die „Stress aktivierten Proteinkinasen“ (SAPK) JNK („c-jun N-teminale Kinase“) und p38 (Bagrodia, 1995; Frost, 1996). Diese Kinasen translozieren nach ihrer Aktivierung in den Zellkern. Dort phosphorylieren und aktivieren sie die Transkriptionsfaktoren c-Jun und c-Fos, die Gene für Zelldifferenzierung und Zellproliferation regulieren. Über die Stimulation der vom Transkriptionsfaktor E2F abhängigen Transkription können Rac und Cdc42 die Expression von Cyclin D1 erhöhen und die Transformation der Zelle begünstigen (Gjoerup, 1998). Eine besondere Funktion von Rac ist seine Beteiligung an der Aktivierung der phagozytären NADPH-Oxidase. Rac löst die Bildung des NADPH-Oxidase Komplexes aus p47phox, p67phox und Rac aus (Ridley, 1995; Diekmann, 1994). Durch diesen Komplex wird Cytochrom b558 aktiviert, das in der Membran von Phagolysosomen lokalisiert und für den Elektronentransfer verantwortlich ist, der zur Bildung des Superoxidanions O2- führt. I.11 Funktionen und Interaktionen der Rho-Isoformen Am besten erforscht sind die Rho-GTPasen RhoA, Rac1 und Cdc42. In der letzten Zeit wurden jedoch auch vermehrt die anderen Mitglieder der Rho-Familie untersucht. Viele der Rho-Isoformen haben ähnliche Effekte auf das Zytoskelett wie RhoA, Rac und Cdc42, d. h. die Bildung von Aktin-Kabeln, Lamellipodien und Filopodien (Aspenström, 2004). Sie üben aber, trotz der hohen Sequenzidentität, auch spezifische Funktionen aus, wie z. B. die Insulin vermittelte Glucoseaufnahme (TC10) (Khan, 2002), die Hemmung der Endosomenbeweglichkeit (RhoD) (Gasman, 2003) oder die Förderung der Metastasierung von Krebszellen (RhoC) (Ikoma, 2004). Den Funktionen entsprechend haben die RhoIsoformen sowohl spezifische als auch gemeinsame Effektorproteine. Rho-GTPasen interagieren miteinander, sowohl in synergistischer als auch in antagonistischer Weise. RhoE und RhoD beispielsweise können RhoA-Effekte auf das Zytoskelett antagonisieren (Tsubakimoto, 1999; Riento, 2003), und RhoH unterdrückt die Aktivierung der MAPK p38 und des Transkriptionsfaktors NFκB durch Rho, Rac und Cdc42 (Li, 2002). In neuronalen Zellen wirken RhoD und Rnd1 als Gegenspieler (Zanata, 2002). 10 Außerdem können die Rho-Isoformen sequentiell oder kompensatorisch (Simpson, 2004) zusammen wirken. Zur kaskadenartigen Aktivierung der GTPasen Cdc42, Rac und Rho kommt es bei der Bildung fokaler Komplexe (Nobes, 1995) und bei der Aktivierung von Rac1 durch RhoG über das Dock180-bindende Protein Elmo (Katoh 2003). I.12 Struktur und Regulation der Rho-Isoformen Wichtige strukturelle Unterschiede zwischen den Rho-Isoformen bestehen vor allem an den N- und C- Termini. So unterscheidet sich z. B. die posttranslationale Modifikation von RhoB, TC10 und den Rnd-Proteinen von der posttranslationalen Modifikation der anderen RhoGTPasen (Abb. A2). RhoB wird palmitoyliert und entweder farnesyliert oder geranylgeranyliert, während Rnd-Proteine nur farnesyliert und die anderen Rho-GTPasen nur geranylgeraynyliert werden. TC10 wird farnesyliert und palmitoyliert. TC10 besitzt außerdem am N-Terminus eine für seine Funktion bei der Insulin vermittelten Glucoseaufnahme essentielle Domäne (Chunqiu, 2003). Zudem finden sich beim Vergleich der Rho-Isoformen Abweichungen in den Switch-I- und Switch-II-Regionen. In der Switch-II-Region unterscheiden sich vor allem RhoH und die Rnd-Proteine. Anstelle von Glutamin 63 steht in Rnd und RhoH ein Serin/Asparagin 63. Daher sind sie nicht in der Lage, GTP zu hydrolysieren und sind dementsprechend konstitutiv aktiv. RhoD unterscheidet sich auch in der für die Effektorbindung wichtigen Switch-IRegion durch mehrere Aminosäuren von den anderen Rho-GTPasen (Tsubakimoto, 1999). Die Unterschiede zwischen den Rho-Isoformen haben wahrscheinlich Auswirkungen auf ihre Regulation. Die Rho-Proteine, denen die Fähigkeit zur Hydrolyse von GTP fehlt, werden hauptsächlich auf der Ebene der Transkription reguliert. Die Regulation durch GDIs kann z. B. von C-terminalen Unterschieden abhängen. So verhindert die Palmitoylierung von RhoB die Erkennung durch GDI-1 (Michaelson, 2001). Sowohl die GDIs als auch die posttranslationale Modifikation beeinflussen die Lokalisation der Rho-Isoformen, ein wichtiger Faktor für die unterschiedlichen Funktionen ähnlicher GTPasen. 11 II Bakterielle Toxine II.1 Einteilung Die Einteilung bakterieller Toxine erfolgt in Endotoxine und Exotoxine. Endotoxine werden beim Zerfall von Bakterien frei, da sie Bestandteile der Zellwand sind. Es sind Lipopolysaccharide, die im Körper Immunzellen zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren anregen. Entzündungsmediatoren wie Interleukine, Leukotriene, TNFα u. a. können in großen Mengen zu Organschäden und zur Entwicklung eines septischen Schocks führen. Exotoxine werden von den Bakterien aktiv sezerniert und greifen häufig wichtige intrazelluläre Regulatorproteine an, die an der Weiterleitung extrazellulärer Signale beteiligt sind. Sie zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und Wirksamkeit aus (z. B. Neurotoxine). Es gibt zum einen zellmembranschädigende Exotoxine, die durch Porenbildung (S. aureus αToxin, S. pyogenes Streptolysin O) oder enzymatische Aktivität (C. perfringens α-Toxin) die Zellmembran zerstören. Zum anderen gibt es die intrazellulär wirksamen Exotoxine, die meist durch direkte Modifikation von intrazellulären Regulatorproteinen in die Signaltransduktion eingreifen (Forth, 2005). II.2 Aufnahmemechanismen und Aufbau Die Aufnahme intrazellulär wirksamer Exotoxine, u. a. die Aufnahme von CNF1 und DNT, erfolgt nach Sekretion in den Extrazellularraum über drei Schritte, der Bindung an einen Zellmembranrezeptor mit der Bindungsdomäne, der rezeptorvermittelten Endozytose, nach der das Toxin in einem sauren Endosomkompartiment vorliegt, und der Translokation ins Zytosol, die durch die Freilegung der Translokationsdomäne im sauren Milieu ermöglicht wird (Abb. A9). Abb. Aufnahme von AB-Toxinen A9: Aufnahmemecha- nismus bakterieller Toxine Bindung Rezeptor vermittelte Endozytose Translokation ins Zytosol Die Aufnahme von AB-Toxinen in die Zellen des Wirtsorganismus erfolgt in drei pH 5 A B Schritten: 1. Bindung an die Wirtszelle, 2. rezeptorvermittelte Endozytose, 3. Translokation vom Endosom ins Zytoplasma. 12 Dementsprechend sind diese Toxine grundsätzlich aus zwei Komponenten aufgebaut, einer Aund einer B-Komponente (Abb. A10). Die B-Komponente enthält Bindungs- und Translokationsdomäne, während die A-Komponente die Enzymdomäne darstellt, die für die spezifische Wirkung des Toxins in der Zielzelle verantwortlich ist. Solche Exotoxine werden auch AB-Toxine genannt. Abb. A10: Strukturen einiger bakterieller Toxine C3-Exoenzyme H2N Die COOH LCCs, besitzen I große clostridiale Toxine (LCCs) H2N COOH III I II DNT eine und CNF Bindungs-, Translokations- und domäne. C3-Exoenzyme Die Enzym- bestehen ausschließlich aus einer enzymatischen Domäne. ExoS, SptP, SopE und YopE haben N- Deamidierende/transglutaminierende Toxine H2N terminal COOH III II eine domäne für ihre Sekretion in die I Wirtszelle multifunktionale COOH III I durch Typ III Sekretion. ExoS und SptP sind ExoS + SptP H2N Translokations- Enzymatische Domäne (I) I haben zwei Proteine und Enzymdomänen, während SopE und YopE nur Bindungsdomäne (II) YopE + SopE H2N Translokationsdomäne (III) COOH III eine Enzymdomäne besitzen. I II.3 Eukaryote Substrate bakterieller Toxine Die Exotoxine, die wichtige intrazelluläre Regulatorproteine modifizieren, werden von Bakterien sezerniert, damit diese im Wirtsorganismus überleben können. Das Aktinzytoskelett, dessen Funktionsfähigkeit Vorraussetzung für Abwehrmechanismen wie Phagozytose oder Bildung einer zellulären Barriere ist, wird offenbar bevorzugt von bakteriellen Exotoxinen angegriffen. Die Zerstörung des Aktinzytoskeletts schützt die Bakterien vor Phagozytose und begünstigt ihr Eindringen ins Gewebe. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Regulation des Zytoskeletts sind die Rho-GTPasen ein gutes Angriffsziel für bakterielle Toxine. 13 Eine Reihe von Exotoxinen hat sich auf die Modifikation der Rho-GTPasen spezialisiert. Diese Toxine lassen sich unterteilen in solche, die die Rho-GTPasen inaktivieren und so zum Verlust des Aktinzytoskeletts und zur Zellabrundung führen (z. B. LCCs, C3-Exoenzyme), und solche, die Rho-GTPasen aktivieren und die Bildung von Aktin-Kabeln bewirken (Tab. A1). Zu letzteren gehören CNF und DNT. Die Rho-Proteine können kovalent modifiziert werden oder durch nicht kovalente Modifizierung in ihrer Funktion beeinflusst werden. Kovalente Modifikationen sind UDPGlucosylierung (LCCs), ADP-Ribosylierung (C3-Exoenzyme), Transglutaminierung (DNT) und Deamidierung (CNF). Nicht kovalente Modifikationen, die die Rho-GTPasen beeinflussen, sind die Nachahmung von GEF-Funktionen (SopE) oder GAP-Funktionen (ExoS, SptP, YopE) (Abb. A11). Abb. A11: ModifikationsmechaRho Rho C3 Asn41 + NAD+ LCCs Thr35/37 + UDP-Glucose Rho Rho ADP-Ribose + Nikotinamid + H+ Glucose + UDP nismen bakterieller Toxine Bakterielle Toxine modifizieren Rho-GTPasen kovalent UDP-Glucosylierung, Rho α-Toxin Thr35/37 + UDP-GlcNAc Rho GlcNAc + UDP Ribosylierung, durch ADP- Transglutami- nierung und Deamidierung. Nicht CNF Rho Rho Gln61/63 + H2O Rho Gln61/63 + 2HN primäres Amin/ tTG DNT Peptidyllysin GTP Rho GDP + GTP Arten, die Rho- GTPasen zu beeinflussen, sind Rho primäres Amin/ Peptidyllysin + NH3 die Nachahmung von GEF- oder GAP-Funktionen. ExoS/SptP/YopE Rho kovalente Glu63 + NH3 Rho GDP + Pi Rho GTP SopE 14 Rho-inaktivierende Toxine C3-Exoenzyme Clostridium botulinum C3-ADP-Ribosyltransferase (verschiedene Isoformen) Clostridium limosum Transfrase Staphylococcus aureus Transferase (EDIN) Bacillus cereus Transferase große clostridiale Zytotoxine (LCCs) Clostridium difficile Toxin A Clostridium difficile Toxin B Clostridium sordelii Hämorrhagisches Toxin (HT) Clostridium sordelii Lethales Toxin (LT) Clostridium novyi α-Toxin GAP-ähnliche Toxine Pseudomonas aeruginosa Exoenzym S Salmonella Typhimurium SptP Yersinia YopE Rho-aktivierende Toxine Deamidierende/transglutaminierende Toxine Escherichia coli Zytotoxisch Nekrotisierender Faktor (CNF1 und CNF2) Bordetella bronchiseptica Dermonekrotisches Toxin (DNT) Yersinia pseudotuberculosis Zytotoxisch Nekrotisierender Faktor (CNFy) GEF-ähnliche Toxine Salmonella Typhimurium SopE Tab. A1: Übersicht Rho-GTPasen modifizierende bakterielle Toxine Das Angriffsziel vieler bakterieller Exotoxine sind die niedermolekularen GTP-bindenden Proteine der RhoFamilie. Die Toxine modifizieren die Rho-GTPasen kovalent oder üben GEF- oder GAP-Funktionen aus, um die Rho-GTPasen zu aktivieren oder zu inaktivieren. 15 II.4 Rho-aktivierende Toxine CNF („Cytotoxic necrotizing factor“) E. coli Bakterien sind physiologische Bewohner des Darmtraktes und können durch die Aufnahme von Pathogenitätsfaktoren (LT, ST, Vero-Toxin) zu Krankheitserregern verschiedener Art werden. Viele uropathogene E. coli Stämme und einige enteropathogene Stämme von E. coli produzieren neben anderen Exotoxinen CNF (Boquet, 2001), das zum ersten Mal 1983 beschrieben wurde (Caprioli, 1983). CNF bewirkt bei intradermaler Injektion lokale nekrotische Läsionen bei Kaninchen, intraperitoneale Injektion ist lethal (De Rycke, 1990). In verschiedenen Zelltypen bewirkt CNF Aktin-Kabel-Bildung, Entstehung vielkerniger Zellen und Zellabflachung (Fiorentini, 1988). Zwei Typen von CNFs werden von E. coli produziert, CNF1 und CNF2, die sich durch teilweise unterschiedliche Wirkungen unterscheiden (De Rycke, 1990), deren Aminosäuresequenz aber zu 90% identisch ist (Oswald, 1994). CNF1 ist auf dem Chromosom kodiert, während CNF2 auf einem Plasmid kodiert ist. Das 115 kDa schwere CNF ist ein monomeres AB-Toxin mit C-terminaler enzymatischer Aktivität (Lemichez, 1997; Schmidt, 1998) und N-terminaler Rezeptorbindungsdomäne (Lemichez, 1997; Fabbri, 1999). Zentral gelegen gibt es hydrophobe Domänen, die vermutlich für die Translokation des Toxins ins Zytosol verantwortlich sind (Lemichez, 1997; Falbo, 1993). Im aktiven Zentrum von CNF liegt eine katalytische Triade aus Cystein 866, Histidin 881 und Valin 833, die an die katalytische Triade von Cystein-Proteasen erinnert. Für die Reaktion essentiell sind Cystein 866 und Histidin 881 (Schmidt, 1998; Buetow, 2001). In der Kristallstruktur zeigt sich, dass das Zentrum der katalytischen Domäne, das in einer tiefen Einbuchtung liegt, von α-Helices und neun Schleifenregionen umgeben wird. Schleife 8 und 9 sind für die Substraterkennung- und bindung notwendig, Schleife 2 hingegen wirkt sich negativ auf die Modifizierung der Substrate aus (Buetow, 2003). Neben CNF1 und CNF2 wird von Yersinia pseudotuberculosis CNFy produziert, das 65% Sequenzidentität zu CNF1 und CNF2 aufweist (Lockman, 2002). In der Zielzelle wirkt CNF, indem es Rho, Rac und Cdc42 spezifisch modifiziert (Lerm, 1999b). Es deamidiert sein Substrat am Glutamin 63 und hemmt dessen GTPase-Aktivität (Flatau, 1997; Schmidt, 1997). Außerdem besitzt CNF Transglutaminierungsaktivität, die jedoch geringer ist als die Deamidierungsaktivität (Schmidt, 1998). Für die Substraterkennung durch CNF1 ist ein Peptid aus der Switch II-Region von RhoA, das die Aminosäuren 59 bis 78 beinhaltet, ausreichend (Lerm, 1999a). Das kleinste Peptid, 16 das als Substrat von CNF1 nachgewiesen werden konnte, erstreckt sich von Aminosäure 59 bis 69 von RhoA (Flatau, 2000). DNT („Dermonecrotic Toxin“) Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens, produziert drei bekannte Toxine, das Pertussis-Toxin, das LPS-Endotoxin und ein hitzelabiles Toxin (HLT) (Livey, 1984), dessen Effekte zum ersten Mal 1909 von Bordet und Gengou beschrieben wurden, und das heute als Dermonekrotisches Toxin, DNT, bekannt ist. DNT wird auch von Bordetella parapertussis und bronchiseptica produziert (Matsuzawa, 2002). Für die Pathogenese des Keuchhustens spielt DNT offenbar keine Rolle. Bei Mäusen löst intradermale Injektion von DNT nekrotische Läsionen aus, intravenöse Injektion ist letal (Horiguchi, 1989), und auch splenoatrophische Effekte wurden beobachtet (Iida, 1971). Die „Turbinate Atrophy“ bei Schweinen wird durch DNT verursacht (Brockmeier, 2002). DNT ist wie CNF ein monomeres AB-Toxin mit einer molekularen Masse von 160 kDa. Es besitzt eine N-terminale Rezeptorbindungsdomäne (Matsuzawa, 2002) und eine C-terminale Enzymdomäne (Kashimoto, 1999), in der nach proteolytischer Spaltung eine Translokationsdomäne freigelegt wird (Matsuzawa, 2004). In der katalytischen Domäne von DNT sind die für die Cystein-Proteasen typischen Aminosäuren Cystein und Histidin enthalten, die die Reaktion katalysieren. Behandelt man Zellkulturen mit DNT, weisen die Zellen vermehrt Aktin-Kabel, multinukleäre Zellen und Zellabflachung auf (Horiguchi, 1991). Diese Effekte werden durch die Modifikation von RhoA, Rac und Cdc42 (Masuda, 2002) an Glutamin 63 und deren Aktivierung hervorgerufen (Masuda, 2000). DNT transglutaminiert sein Substrat bevorzugt, besitzt aber auch die Fähigkeit, es zu deamidieren. Im Gegensatz zu CNF1 ist für DNT das Peptid von Aminosäure 59 bis 78 der Switch-II-Region von RhoA nicht ausreichend für die Substraterkennung (Lerm, 1999a). 17 II.5 Transglutaminasen Transglutaminasen katalysieren die posttranslationale Modifikation von Proteinen durch Transglutaminierung. Dabei werden niedermolekulare primäre Amine wie Spermin, Spermidin oder Putreszin an Substratproteine angehängt, oder zwei Substratproteine werden miteinander verknüpft („cross-linking“). Die Transglutaminierungsreaktion ist eine Acyltransfer-Reaktion, bei der der Glutaminrest eines Proteins den Acylakzeptor und ein primäres Amin oder der Lysinrest eines Polypeptids bzw. Proteins den Acyldonor darstellt. Je nachdem, ob der Acyldonor ein niedermolekulares primäres Amin oder die ε-Aminogruppe eines Peptidyllysins ist, entsteht durch die Transglutaminierung entweder eine γ-glutamylBindung oder eine ε(γ-glutamyl)lysin-Bindung (Griffin, 2002). Diese Bindungen sind resistent gegen Proteasen und machen das durch Transglutaminasen modifizierte Gewebe stabiler gegenüber chemischem, enzymatischem und physikalischem Abbau (Griffin, 2002; Greenberg, 1991). Die Substratspezifität der Transglutaminasen ist im Allgemeinen gegenüber dem Acyldonor-Lysin geringer als gegenüber dem Acylakzeptor-Glutamin (Grootjans, 1995). Bei fehlendem Kosubstrat und in saurem Milieu sind Transglutaminasen in der Lage, die Deamidierung des Substrates zu katalysieren (Schmidt, 1998). Gewebstransglutaminase Die Gewebstransglutaminase (tTG) ist eine von acht bisher bekannten Transglutaminasen des Säugetierorganismus. Das monomere, globuläre Protein von 85 kDa weist vier Domänen auf und wird durch Ca2+ und GTP/GDP reguliert. Die Bindung von Ca2+ löst eine Konformationsänderung aus, die dazu führt, dass das enzymatische Zentrum in Domäne 2 für Substrate zugängig wird. GTP-Bindung wirkt dieser Aktivierung entgegen. Die Transglutaminierungsreaktion wird im aktiven Zentrum mit Hilfe der Aminosäuren Cystein 277, Histidin 335 und Aspartat 358 katalysiert (Griffin, 2002). Die Gewebstransglutaminase kommt im menschlichen Organismus in Gefäßendothelzellen, glatten Muskelzellen, mesangialen Zellen und anderen organspezifischen Zellen vor (Greenberg, 1991). Unter physiologischen Bedingungen wirkt die Gewebstransglutaminase sowohl an intrazellulären als auch an extrazellulären Prozessen mit. Zu den Prozessen, an denen die extrazelluläre Matrix beteiligt ist, zählen die Zellmigration (Balklava, 2002), die Zelladhäsion (Akimov, 2001) und die Gewebsstabilisierung durch Verknüpfung extrazellulärer Proteine (Aeschlimann, 2000). Zu den intrazellulären Prozessen gehören Apoptose (Boehm, 2002; Fesus, 2005) und Signaltransduktion (Singh 2001, Singh, 2003). Bei Apoptose oder Zellschädigung verknüpft die Gewebstransglutaminase intrazelluläre Proteine, so dass die Zelle stabilisiert und der Verlust von intrazellulärem Material verhindert wird 18 (Knight, 1991; Nicholas, 2003). Nach Stimulation durch Retinolsäure aktiviert die Gewebstransglutaminase RhoA durch Transglutaminierung und vermittelt Aktin-KabelBildung und neuronale Differenzierung. RhoA wird in vitro an Glutamin 52, 63 und 136 transglutaminiert (Schmidt, 1998). Die Gewebstransglutaminase ist auch an pathologischen Prozessen beteiligt. Bei Autoimmunerkrankungen wie der Zöliakie (Reif, 2004; Lock, 2004; Skovbjerg, 2004), bei neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer disease, Huntington’s disease) (Cooper, 1997; Lesort, 2000), bei chronischen Entzündungen wie der rheumatoiden Arthritis (Choi, 2004; Verderio, 2004) und bei Fibrosen von Leber, Lunge und Niere (Grenard, 2001a; Johnson, 2003) spielt sie eine Rolle. Sie löst z.B. die Bildung von Zytokinen aus, die das Fortschreiten der Gelenkdeformation bei der rheumatoiden Arthritis begünstigen. Bei der Zöliakie trägt sie durch die Deamidierung von Glutaminresten in Gliadin möglicherweise zur Bildung von Autoantikörpern bei. Physiologische Substrate der Gewebstransglutaminase sind Fibronectin (Jones, 1997), Kollagen (Kleman, 1995), Crystallin (Groenen, 1992), Tau (Tucholski, 1999), RhoA und viele andere. In mehrfachen Studien wurde versucht, die Substratspezifität der Gewebstransglutaminase gegenüber den Acylakzeptor-Glutaminen aufzuklären und eine Aminosäuresequenz zu finden, die für Erkennung und Modifizierung notwendig ist (Gorman, 1981; Gorman, 1984). Zeeuwen et al. haben durch den Vergleich der TransglutaminaseErkennungsmotive von mehreren Mitgliedern der Trappin-Familie (TRansglutaminase substrate and wAP containing ProteINs, Schalkwijk, 1999) ein Peptid von sechs Aminosäuren identifiziert, das ein sehr effizientes Substrat der Gewebstransglutaminase ist. Es hat die Abfolge „GQDPVK“ und wird als Transglutaminase-Konsensus-Sequenz bezeichnet (Zeeuwen, 1997). II.6 Bakterielle Toxine als Werkzeuge der Zellbiologie und Erforschung der Rho-GTPasen Seit der Identifizierung der kleinen GTP-bindenden Proteine als Substrate der C3-Exoenzyme (Braun, 1989), der großen clostridialen Toxine (Just, 1994; Just, 1995) und der Rhoaktivierenden Toxine DNT und CNF (Oswald, 1994) wurden Wirkungsweise und Substratspezifität der Toxine für die verschiedenen Proteinfamilien und Subgruppen erforscht, um das Verständnis für die pathogenetische Bedeutung dieser bakteriellen Toxine zu erhöhen, aber auch um sie als Werkzeuge in der Erforschung der niedermolekularen GTP-bindenden Proteine zu nutzen. 19 Die bakteriellen Toxine, die die Rho-GTPasen modifizieren, haben den Rho-Isoformen gegenüber alle eine unterschiedliche Substratspezifität. So modifizieren beispielsweise Toxin A und B aus C. difficile Rho, Cdc42 und Rac. C3- Exoenzyme modifizieren RhoA, RhoB und RhoC, nicht aber Rac und Cdc42 (Wilde, 2001). Eine besondere Substratspezifität hat das C3Exoenzym von S. aureus (C3stau2). Es modifiziert zusätzlich RhoE und Rnd3 (Wilde, 2002). CNF und DNT modifizieren erwiesenermaßen Rho, Rac und Cdc42 (Lerm, 1999b; Masuda, 2002). Ihre Spezifität für die anderen Rho-Isoformen hingegen ist nicht bekannt. Die Kenntnis der Substratspezifität ist für die Verwendung der bakteriellen Toxine zur Erforschung der Rho-GTPasen notwendig. Außer mit Hilfe von bakteriellen Toxinen können die Rho-GTPasen durch Mikroinjektion dominant negativer und konstitutiv aktiver Mutanten der Rho-Proteine in Zellen erforscht werden. Konstitutiv aktive Mutanten werden durch den Austausch der Aminosäuren 14 oder 63 hergestellt, durch den es zum Verlust der GTPase-Aktivität kommt. In dominant negativen Mutanten ist die Aminosäure 19 ausgetauscht. Diese Mutation bewirkt, dass die GTPase aufgrund einer geringeren GTP/GDP-Affinität keine Effekte mehr vermitteln kann, aber trotzdem mit endogenen GTPasen um GEFs konkurriert. So blockieren die dominant negativen Mutanten die Effekte der entsprechenden Rho-GTPase. Auch mit Hilfe von siRNA (small interfering RNA) können endogene Rho-GTPasen spezifisch ausgeschaltet werden (Simpson, 2004). Die Etablierung neuer Methoden mit höherer Spezifität für einzelne Rho-Isoformen ist in Zukunft eine wichtige Aufgabe. 20 B Zielsetzung Ziel der Arbeit ist es, die Substratspezifität der Rho-aktivierenden Toxinen CNF1 und DNT sowie der Gewebstransglutaminase für die Rho-Isoformen RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, RhoG, Cdc42, TC10 und RhoD zu untersuchen. Mit Hilfe von in vitro Experimenten, die die Modifizierung der Rho-GTPasen nachweisen, sollen diese Rho-GTPasen zunächst auf ihre Modifizierbarkeit durch CNF1, DNT und die Gewebstransglutaminase getestet werden. Da bakterielle Toxine wichtige Werkzeuge in der Erforschung der Rho-GTPasen sind und die Substratspezifität der Gewebstransglutaminase bisher nicht bekannt ist, sollen diese Experimente einen Überblick darüber geben, welche Rho-Isoformen Substrate dieser drei Enzyme sind. Die Aminosäuresequenzen der Rho-GTPasen sollen untersucht werden, um Aminosäuren zu identifizieren, die für die Substratspezifität eine Rolle spielen. Aminosäuren, die in modifizierten und nicht modifizierten Rho-GTPasen nicht homolog sind, sollen mit Hilfe der zielgerichteten Mutagenese ausgetauscht werden, um ihre Relevanz für die Substraterkennung zu überprüfen. Durch die Identifizierung von für die Substratspezifität wichtigen Aminosäuren sollen die biologischen Eigenschaften von CNF1, Gewebstransglutaminase und der Rho-GTPasen genauer charakterisiert werden. DNT, der 21 C Material und Methoden I Material I.1 Puffer, Nährmedien und Antibiotika Alle Puffer und Medien wurden mit Aqua bidest. angesetzt und autoklaviert. Zur Selektion transformierter Bakterien wurde zu allen Nährmedien nach dem Abkühlen auf unter 50 °C Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml gegeben. Nährmedien LB-Medium 10 g Bactotrypton 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl Aqua bidest. ad 1000 ml LB-Agarplatten 400 ml LB Medium 6,5 g Bacto-Agar SOC-Medium 10 mM MgSO4 10 mM MgCl2 20 mM D-Glucose in LB-Medium TSS-Medium 85% v/v LB-Medium 10% v/v Polyethylenglycol 5% v/v Dimethylsulfoxid 50 mM MgCl2 Puffer Lysispuffer A: 50 mM Hepes pH 7,4 2 mM MgCl2 B: 20 mM Tris/HCl pH 7,4 10 mM NaCl 5 mM MgCl2 1% Triton X-100 vor Gebrauch zugeben: DTT (5 mM) und PMSF (1 mM) oder Complete (nach Angabe des Herstellers) 22 Waschpuffer 50 mM Hepes pH 7,4 150 mM NaCl 2 mM MgCl2 Glutathion-Elutionspuffer 10 mM reduziertes Glutathion 50 mM Tris/HCl pH 8,0 100 mM NaCl Thrombinspaltpuffer 150 mM NaCl 50 mM TEA pH 7,5 2,5 mM CaCl2 Blotpuffer 25 mM Tris 192 mM Glycin 20 % v/v Methanol TTBS 200 mM NaCl 50 mM Tris/HCl 0,05 % Tween ECL-Lösung Die Lösung wird direkt vor Gebrauch hergestellt. Lösung 1 und Lösung 2 werden im Verhältnis 1 : 1 gemischt. Lösung 1 2,5 mM Luminol 0,4 mM p-Cumarsäure 100 mM Tris/HCl pH 8,0 Lösung 2 5 mM H2O2 100 mM Tris/HCl pH 8,0 Ponceau S-Lösung 0,15 % w/v Ponceau S in 0,5 % Essigsäure 10 x Transglutaminase-Puffer 80 mM CaCl2 50 mM MgCl2 1 mM EDTA 500 mM Tris/HCl pH 7,4 vor Gebrauch zugeben: 10 x CNF-Puffer 10 mM DTT 100 mM MgCl2 10 mM EDTA 500 mM Tris/HCl pH 7,4 vor Gebrauch zugeben: 10 mM DTT 23 P2*-Puffer 1 NADH-Tablette (ca. 0,4 mg NADH) gelöst in 4 ml Lösung aus Flasche 1 (Triethanolaminpuffer pH 8,0 und 2-Oxoglutarat) Puffer A 50 mM TRIS/HCl pH 7,5 50 mM NaCl 5 mM MgCl2 PBS-Puffer 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM Na2HPO4 x 2 H2O 1,4 mM KH2PO4 pH 7,4 Probenpuffer 0,01% w/v Bromphenolblau 125 mM Tris/HCl pH 6,8 0,2 M DTT 4% w/v SDS 20% v/v Glycerin SDS Laufpuffer pH 8,3 25 mM Tris Base 192 mM Glycin 0,1% SDS Bradford-Reagenz 0,035% (m/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 25% (v/V) Ethanol 50% H3PO4 (v/v) Färbelösung 0,05% w/v Coomassie Brilliant Blue R-2510 45% v/v Methanol 9% v/v Essigsäure Entfärber 7% v/v Essigsäure 5% v/v Methanol 6 x DNA-Stopp-Puffer 0,25 % w/v Bromphenolblau 40 % w/v Saccharose Ethidiumbromid-Stammlösung feste Substanz 10 mg/ml H2O TAE-Puffer 40 mM Tris-Acetat 1 mM EDTA pH 8,0 24 10 x Pfu-Polymerase-Puffer 200 mM Tris/HCl pH 8,8 20 mM MgSO4 100 mM KCl 100 mM (NH4)2SO4 1% Triton X-100 1 mg/ml BSA I.2 Bakterienstämme Bakterienstamm Genotyp E. coli TG-1 ∆lac-pro, thi-1, supE, hsdD5, [F’traD36, pro AB+, lacIq, lacZ ∆M15] E. coli BL 21 (DE3) K12 (F-hsdS gal ompT rB-, mB-) I.3 Vektoren pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech) pGEX-2T-GL (Heinrich Flaswinkel) I.4 Glycerin-Kulturen Die Glycerin-Kulturen der rekombinanten Proteine RhoA, Rac1, Cdc42, RhoB, RhoC, RhoD, RhoG, TC10 und RalA, ∆DNT, ∆CNF1 und CNF1vollständig waren bereits im Labor vorhanden und wurden bei -80°C aufbewahrt. I.5 Radionuklide [γ−35S]GTP [γ−32P]GTP Die verwendeten Radionuklide wurden von der Firma Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig, bezogen. 25 Radioaktive Lösungen 200 µM [γ−35S] GTP-Lösung Aqua bidest. ad 200 µl 4 µl 10 µM unmarkiertes GTP (final: 200 µM) 1 µl [γ−35S] GTP-Stammlösung 200 µM [γ−32P]GTP-Lösung Aqua bidest. ad 200 µl 4 µl 10 µM unmarkiertes GTP (final: 200 µM) 1-10 µl [γ−32P]GTP-Stammlösung I.6 Enzyme Gewebstransglutaminase aus Meerschweinchenleber (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) Pfu-Polymerase (Stratagene GmbH, Heidelberg) Dpn1 (New England Biolabs GmbH, Schwalbach) Thrombin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) I.7 Antikörper RhoA(26C4), monoklonaler Maus IgG Santa Cruz (Heidelberg) Peroxidase-konjugierter Zweitantikörper Biotrend (Köln) I.8 Verbrauchsmaterialien Glutathion-SepharoseTM 4B Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) Benzamidin-SepharoseTM 6B Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) Monodansylcadaverin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) Protran Nitrocellulose Transfer Membrane (Schleicher & Schuell, Bioscience, Dassel) Polyvinylidendifluorid-Membran (Pierce, USA) „Complete“ Proteaseinhibitor (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) “High Flash-point LSC-cocktail” (Perkin Elmer, Boston) Quarzwolle, 5-30 µm (Roth GmbH & Co, Karlsruhe) 26 I.9 Firmen Alle weiteren Chemikalien wurden in der notwendigen Reinheit von folgenden Herstellern bezogen: Boehringer, Mannheim DIFCO Laboratories, Detroit (USA) Genomed, Bad Oenhausen Greiner GmbH, Frickenhausen ICN Biomedicals, Ohio (USA) Merck, Darmstadt New England Biolabs GmbH, Schwalbach Quiagen GmbH, Hilden Roth GmbH & Co, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen Stratagene GmbH, Heidelberg I.10 Reagenzienkits E.Z.N.A. Miniprep Kit I (PeQLab, Erlangen) TC Ammonia (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Weiterstadt) QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Heidelberg) I.11 Geräte Elektrophoresekammer Mini-Protean 3 Cell-Apparatur, Bio-Rad, München Zentrifugen Biofuge pico (Haereus, Osterode) Biofuge fresco (Haereus, Osterode) Megafuge (Haereus, Osterode) RC-5B Superspeed Refrigerated Centrifuge (Sorvall) mit SS-34 und GS-3 Rotor Inkubatoren Refrigerated Incubator Shaker, Innova 4330, New Brunswick Scientific, Nürtingen Thermomixer Compact, Eppendorf French Press French Pressure Cell Press, SIM AMINCO, Spectronic Instruments 27 Ultraschall-Pulser “Sonopuls HD 60”, Bandelin, Berlin Netzgerät Power Pac 3000, BioRad, München Blotapparatur Semi-Dry Transfer Cell, Biorad, München Fluoreszenzspektrometer Luminescence Spectrometer LS 50B, Perkin Elmer, Überlingen Photometer Ultrospec 2100 pro, UV/Visible Spectrometer, Pharmacia Biotech, Freiburg DNA-Sequenzierer ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems, Weiterstadt PCR-Gerät Thermocycler, Biometra, Göttingen UV-Leuchtschirm Eagle Eye II, Stratagene, Heidelberg Szintillationszähler Liquid Scintillation Counter, 1209 Rackbeta, LKB Wallac, Gräfelfing I.12 Primer Primer für die zielgerichtete Mutagenese (5’ nach 3’): Einfachmutanten RhoA RhoA E137K sense CAAGATGAAGCAGAAGCCGGTGAAACC RhoA E137K antisense GGTTTCACCGGCTTCTGCTTCATCTTG RhoA K140T sense GGAGCCGGTGACACCTGAAGAAGGC RhoA K140T antisense GCCTTCTTCAGGTGTCACCGGCTCC RhoA D65E sense TGGGCAGGAAGAGTATGATCGCCTGAG RhoA D65E antisense CTCAGGCGATCATACTCTTCCTGCCCA RhoA P71T sense GATCGCCTGAGGACACTCTCCTACCCAGATAC RhoA P71T antisense GTATCTGGGTAGGAGAGTGTCCTCAGGCGATC RhoA S73F sense CCTGAGGCCCCTCTTCTACCCAGATACC RhoA S73F antisense GGTATCTGGGTAGAAGAGGGGCCTCAGG 2 x RhoA E64D RhoA E64D sense GCTGGGCAGGATGATTATGATCGC RhoA E64D antisense GCGATCATAATCATCCTGCCCAGC RhoA E64D sense GACACAGCTGGGCAGGACGATTATGATCGCC RhoA E64D antisense GGCGATCATAATCGTCCTGCCCAGCTGTGTC 28 RhoG RhoG E63D sense GGGCCAGGAGGACTATGACCGCCTCC RhoG E63D antisense GGAGGCGGTCATAGTCCTCCTGGCCC RhoG T69P sense GACCGCCTCCGTCCACTCTCCTACC RhoG T69P antisense GGTAGGAGAGTGGACGGAGGCGGTC RhoD RhoD D76E sense GCCGGGCAAGAAGACTATGACCGC RhoD D76E antisense GCGGTCATAGTCTTCTTGCCCGGC RhoD F85S sense CGGCCCTTGTCCTATCCTGATGCC RhoD F85S antisense GGCATCAGGATAGGACAAGGGCCG Doppelmutanten RhoA RhoA Q63E E64D sense GACACAGCTGGGGAGGACGATTATGATCGCC RhoA Q63E E64D antisense GGCGATCATAATCGTCCTCCCCAGCTGTGTC RhoD RhoD Q75E D76E sense GGGACACAGCCGGGGAAGAAGACTATGAC RhoD Q75E D76E antisense GTCATAGTCTTCTTCCCCGGCTGTGTCCC Sequenzierprimer (5’ nach 3’) 5’-pGEX TAGCATGGCCCTTGCAGGG 3’-pGEX TGTGTCAGAGGTTTTCACCG Alle verwendeten Primer wurden bei den Firmen Hermann GbR, Synthetische Biomoleküle, Freiburg, und MWG-Biotech GmbH, Ebersberg, erworben. 29 II Methoden II.1 Arbeiten mit Proteinen Alle Arbeiten mit Proteinen wurden soweit möglich auf Eis durchgeführt, und die aufgereinigten Proteine wurden nach dem Aliquotieren bei -20°C gelagert. 1.1 Expression und Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen Für die Transkription rekombinanter Proteine in E. coli-Zellen wurde ein pGEX-2T-GL Vektor verwendet. Das Prinzip dieses Vektor-Systems ist folgendes: Die rekombinanten Proteine werden als Fusionsproteine mit der Glutathion-S-Transferase (GST) aus dem Fadenwurm Schistosoma japonicum exprimiert und besitzen eine Thrombinschnittstelle zwischen GST-Anhang und rekombinantem Protein. Der GST-Anhang dient der Isolierung der Proteine aus den Bakterienzellen. Er bindet mit hoher Affinität an sein Substrat Glutathion und ermöglicht die Aufreinigung über Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Glutathion. Durch Abspaltung an der Thrombinschnittstelle mit Hilfe von Thrombin oder durch kompetitive Elution mit einem Überschuss an reduziertem Glutathion kann das rekombinante Protein gewonnen werden. Die Expression des GST-Fusionsproteins steht unter der Kontrolle eines lac-induzierbaren Promotors. Durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG) kann die Transkription des Genabschnitts gezielt induziert werden. Ebenfalls auf dem pGEX-2T-GL-Plasmid kodiert ist ein Gen für β-Lactamase. Die βLactamase ermöglicht es den Bakterien im ampicillinhaltigen Nährmedium zu überleben, so dass die Bakterien, die das Plasmid tragen, selektiert werden. Die Abkürzung „-GL“ steht für einen Abschnitt des pGEX-2T-Vektors, den „Glycin-Linker“, der für fünf Glycinreste kodiert. Diese Glycinreste ermöglichen einen besseren Zugang zur Thrombinschnittstelle und erleichtern die Abspaltung des GST-Proteins. 1.1.1 Expression in E. coli Für die Expression der Proteine wurde zunächst eine Vorkultur aus der Glycerin-Kultur angelegt. Das entsprechende Volumen LB-Medium wurde mit dem gewünschten Klon angeimpft und die Kultur über Nacht bei 37°C im Schüttler hochgezogen. Aus Vorkultur und LB-Medium wurde am folgenden Morgen im Verhältnis 1 : 10 eine Hauptkultur von 2-8 l hergestellt. 30 Die Hauptkultur wurde zunächst bei 37°C im Schüttler bis zu einer optischen Dichte von 0,71,0 (λ=600 nm) wachsen gelassen. Dann wurde durch Zugabe von IPTG (0,2 mM) die Expression des Proteins stimuliert. Die Expressionsbedingungen wurden für das jeweilige Protein optimiert. Die Expressionszeit von RhoA, Rac1 und Cdc42 betrug 3 Stunden, die von RhoB, RhoC, RalA, CNF1 und DNT 4 Stunden und die von RhoG, RhoD 5 Stunden. Die Ernte der Kulturen erfolgte mit Hilfe einer 10-minütigen Zentrifugation bei 4°C mit 6000 rpm. Die Bakterienpellets wurden bei – 20 °C eingefroren. 1.1.2 Lyse der Bakterienzellen Die Bakterienpellets wurden für die Lyse in 10 ml Lysispuffer pro Liter Kultur resuspendiert. Dem Lysispuffer waren Proteaseinhibitoren und das Reduktionsmittel DTT zugesetzt. Die Lyse der Bakterienzellen erfolgte entweder mit Hilfe einer „French Press“ (Lysispuffer A) oder mit Hilfe von Ultraschall (3 x 1 min, 70 % Schalleistung, Lysispuffer B). In der „French Press“ wird die Bakteriensuspension unter hohem Druck (50 bar) durch eine kleine Öffnung gepresst und wieder aufgefangen. Durch den abrupten Wechsel von hohem zu niedrigem Druck zerplatzen die Bakterienzellen. 1.1.3 Affinitätschromatographie mit Gluthation-Sepharose-Beads Für die Affinitätschromatographie zur Isolierung des rekombinanten Proteins aus dem Bakterienzelllysat wurden Glutathion-Sepharose-Beads verwendet. Diese perlenförmige Matrix (engl. beads = Perlen), die immobilisiertes Glutathion trägt, bindet das GSTFusionsprotein. Für die Kopplung des Fusionsproteins an die Beads wurde das Bakterienzelllysat bei 4°C und 12000 rpm 10 Minuten lang abzentrifugiert und der Überstand 1h lang bei 4°C mit Glutathion-Sepharose-Beads im Überkopfschüttler inkubiert. 1.1.4 Glutathion-Freisetzung Bei der Glutathion-Freisetzung nutzt man die kompetitive Bindung von immobilisiertem und gelöstem Glutathion an den GST-Anhang der rekombinanten Proteine, um die Proteine zu eluieren. Die Glutathion-Freisetzung wurde auf zwei verschiedene Weisen durchgeführt. Säulen-Elution Bei größerem Bedarf an Protein bot sich die Elution über eine Säule an. Hierbei wurden die Glutathion-Sepharose-Beads mit dem gebundenen Protein in eine Säule eingebracht, auf deren Boden sich als Filter eine dünne Schicht Quarzwolle befand. Auf die Säule wurden 31 nacheinander 50 ml Waschpuffer und 5 ml Glutathion-Elutionspuffer gegeben. Das Eluat wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen aufgefangen und bei Bedarf weiter eingeengt. Batch-Methode Für die zweite Variante der Elution wurden die Beads in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt und darin fünf Mal durch einminütige Zentrifugation mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden sie 2x 10 min bei Raumtemperatur mit Glutathion-Elutionspuffer inkubiert und nochmals zentrifugiert. Im Überstand befand sich das GST-Protein in Lösung. 1.1.5 Thrombinspaltung Bei der Thrombinspaltung wird das rekombinante Protein gewonnen, indem der GST-Anhang durch Thrombin abgespalten wird. Thrombingespaltene Proteine wurden nur für den „ShiftAssay“ verwendet. Die Beads wurden nach der Bindung des Proteins in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Darin wurden sie mit Waschpuffer fünf Mal gewaschen. Anschließend folgte eine 40-minütige Inkubation mit Thrombinspaltpuffer bei Raumtemperatur. Das nun in der Lösung vorhandene Thrombin wurde durch 10-minütiges Überkopfschütteln bei 4°C mit Benzamidin-Beads gebunden, so dass nur noch das gewünschte Protein in Lösung vorhanden war. Die beiden Schritte für die Elution wurden zweimal durchgeführt. 1.1.6 Konzentration der Proteinlösung War die durch die Aufreinigung erzielte Proteinkonzentration nicht hoch genug, wurden die Proteinlösungen mit Hilfe eines Vivaspin Concentrator Membransystems von Vivascience mit einer Membranporengröße von 30 kDa konzentriert. 1.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Das von Bradford 1976 beschriebene Verfahren zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen beruht darauf, dass es nach Bindung von Proteinen an den Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250 zu einem Wechsel des Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm kommt. 5-20 µl einer Proteinlösung wurden mit Aqua bidest. auf 800µl aufgefüllt und anschließend mit 200 µl Bradford-Reagenz versetzt. 32 Die Absorption der Proteinlösung wurde photometrisch bei 595 nm gegen einen Nullwert gemessen und die Proteinkonzentration über folgende Formel berechnet: Extinktion x Bradfordfaktor = Proteinkonzentration Volumen der Probe x 0,1 Der Bradfordfaktor wird mit Hilfe einer BSA-Eichkurve ermittelt. 1.3 Optische Bestimmung der Proteinkonzentration Eine andere Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist die optische Bestimmung. Hierzu wurde die Proteinlösung auf ein 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und die betreffende Proteinbande nach Färben, Entfärben und Trocknen mit Proteinbanden bekannter Proteinkonzentrationen verglichen. 1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die diskontinuierliche SDS-PAGE wurde nach der Methode von Lämmli (1970) durchgeführt. Die Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE beruht auf der Wanderung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld. Aufgrund ihrer Wanderung durch ein Polyacrylamidgitter können die Proteine geordnet nach ihrer Masse aufgetrennt werden. Proteine mit niedrigem Molekulargewicht wandern im elektrischen Feld schneller durch das Polyacrylamidgitter als solche mit höherem Molekulargewicht. Die Porengröße des Gitters hängt vom Verhältnis zwischen Acrylamidmonomeren und dem Vernetzer Methylenbisacrylamid ab und bestimmt den Massenbereich, in dem die Auftrennung stattfindet. Für die in dieser Arbeit verwendeten Proteine wurden 12,5%ige Trenngele verwendet. Da die Wanderungseigenschaft von Proteinen neben der Masse auch von der Faltung und der Ladung abhängt, müssen sie vor dem Auftragen auf das Gel denaturiert werden. Dazu wurden die Proben mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Etwaige Disulfidbrücken wurden durch das im Probenpuffer enthaltene DTT reduziert. Der Gellauf erfolgte in einem glycinhaltigen Laufpuffer bei einer Stromstärke von 25-40 mA und dauerte 35-60 Minuten. Als Referenz für das Molekulargewicht lief ein Marker mit Proteinen bekannten Molekulargewichts auf einer Bahn des Gels mit. 33 Protein-Marker 1. peqGOLD Protein-Marker Protein Herkunft Molekulargewicht (kDa) β-Galaktosidase E. coli 116.0 Bovines Serum-Albumin Rinderserum 66,2 Ovalbumin Hühnereiweiß 45,0 Laktatdehydrogenase Schweinemuskel 35,0 RE Bsp981 E. coli 25,0 β-Laktoglobulin Kuhmilch 18,4 Lysozym Hühnereiweiß 14,4 2. peqGOLD Prestained Protein-Marker Protein Herkunft Molekulargewicht (kDa) β-Galaktosidase E. coli 121,6 Bovines Serum-Albumin Rinderserum 81,4 Ovalbumin Hühnereiweiß 46,8 Karboanhydrase Rindererythrozyten 32,0 β-Laktoglobulin Kuhmilch 24,5 Lysozym Hühnereiweiß 20,4 Die Proteinbanden wurden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 bei 50°C im Wasserbad angefärbt, überflüssiger Farbstoffs wurde durch 1- bis 2-stündige Inkubation mit Entfärber entfernt. Für die Aufbewahrung wurden die Gele mit Hilfe einer Vakuumpumpe auf einem Stück Whatmanpapier bei 80 °C getrocknet. 1.5 Herstellung der Polyacrylamidgele Zur Herstellung der Gele, wurden die Substanzen nach den Mengenangaben der folgenden Tabellen zusammengegeben. Die Zugabe der Starter der Polymerisierungsreaktion APS und TEMED erfolgte als letztes. 34 2 Polyacrylamidgele Sammelgel 5% (ml) Trenngel 12,5% (ml) H2O 2,020 0,75 M TRIS pH 8,8 0,480 3,750 0,625 M TRIS pH 6,8 0,660 30% Acrylamid 0,570 3,127 20% SDS 0,015 0,037 10% APS 0,030 0,075 TEMED 1:10 0,030 0,030 Den Harnstoffgelen, die für den Shift-Assay verwendet wurden, war Harnstoff als zusätzliches Denaturierungsmittel zugefügt. 2 Polyacrylamidgele mit Harnstoff H2O Sammelgel 5% (ml) Trenngel 12,5% (ml) 1,687 1 M TRIS pH 8,8 0,667 2,813 0,625 M TRIS pH 6,8 0,660 10 M Harnstoff 0,333 0,750 30% Acrylamid 0,570 3,127 20% SDS 0,015 0,037 10% APS 0,030 0,075 TEMED 1:10 0,030 0,030 1.6 Proteinnachweis durch Immunoblot-Analyse (Westernblot) Der Westernblot ist eine Methode zum Nachweis bestimmter Proteine mit Hilfe spezifischer Antikörper. Nach dem Transfer der Proteine vom SDS-Gel auf eine PVDF-Membran (PVDF = Polyvinylidendifluorid) werden nacheinander zwei Antikörper an die Proteine gekoppelt, mit Hilfe derer die Proteine nachgewiesen werden können. Der Erstantikörper richtet sich gegen das nachzuweisende Protein, während sich der Zweitantikörper gegen den Erstantikörper richtet und eine Peroxidase aus Meerrettich trägt. Sie katalysiert die 35 Nachweisreaktion. Bei der Nachweisreaktion kommt es zu einer Lichtemission, die auf einem Film festgehalten wird (Abb. C1). Abb. C1: Prinzip des Westernblots 1. Ak 2. Ak mit Peroxidase Nachweisreaktion An das nachzuweisende Protein auf der Membran bindet zuerst ein Antikörper gegen das Protein, danach ein Antikörer Protein gegen den Erstantikörper. Der Zweitantikörper trägt die Peroxidase, die die Membran Nachweisreaktion katalysiert. Für den Transfer der Proteine wird eine PVDF-Membran zuerst 30 s lang in Methanol aktiviert. Dann wird sie mit dem SDS-Gel und Whatman-Papier nach der SDSGelelektrophorese zwischen Anode und Kathode einer Blotapparatur gelegt. Bei einer konstanten Spannung von 20 V (35 min) werden die Proteine vom Gel auf die Membran übertragen. Die unspezifischen Bindungsstellen der Membran werden anschließend mit einer 5 % Milchpulverlösung (15 min, RT) geblockt und der Blot mit TTBS gewaschen (5 min , RT). Der spezifische Erstantikörper wird in einer Verdünnung von 1:500 hinzu gegeben und mit dem Blot über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach erneutem Waschen des Blots (3 x 10 min, RT) wird der spezifische Zweitantikörper in einer Verdünnung von 1:3000 zugegeben (1h, RT). Für die Nachweisreaktion wird der Blot 30 s lang in „Enhanced Chemiluminescence“-Lösung (ECL-Lösung) geschwenkt. Die ECL-Lösung enthält Luminol, p-Cumarsäure und H2O2. Die Meerrettichperoxidase katalysiert die Reaktion von Luminol zu 3-Aminophtalsäure, wobei es zur Lichtemission kommt. Das emittierte Licht wird durch Belichtung eines ECL-Films nachgewiesen, der dann entwickelt und fixiert wird. Die Blotmembran kann zur Kontrolle der Proteinbanden reversibel mit Ponceau S-Lösung gefärbt werden. 36 II.2 Tests der Substratspezifität 2.1 Auswahl der Konzentrationen für die Reaktionsansätze In dieser Arbeit ging es um die Frage, ob eine Interaktion zwischen Toxin und GTPase stattfindet. Ausschlaggebend für die Wahl der Konzentrationen der Reaktionspartner war vor allem, dass genügend Substrat zur Detektion eines Signals, sowie ausreichend aktives Toxin für die Modifikation vorhanden war. Vom Toxin DNT wurde z.B. im Verhältnis zum Substrat sehr viel zugegeben (1 : 2), weil die Aktivität von DNT nicht immer optimal war. Für den Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel wurde im Verhältnis zur GTPase weniger CNF1 (1 : 20) benötigt als für die Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin (1 : 10). Für die Messung der Ammoniakfreisetzung erwies sich eine noch geringere Toxinkonzentration (1 : 50) als günstiger für den Nachweis der Reaktion. 2.2 Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin Für den Nachweis einer Transglutaminierung der Rho-Proteine wurde Monodansylcadaverin als Kosubstrat verwendet. Monodansylcadaverin ist ein fluoreszierendes primäres Amin, dessen Einbau in ein Protein man mit Hilfe von UV-Licht nachweisen kann. Abb. C2 zeigt ein Schema der Nachweisreaktion. NH2 Abb. C2: Transglutaminierungsreaktion Das fluoresierende primäre Amin Monodansylcadaverin wird bei der Transglutaminierungsreaktion unter Abspaltung von Ammoniak am Glutamin 63 des Rho-Proteins angehängt und mit Hilfe von UV-Licht im SDSGel nachgewiesen. 37 Ein Ansatz enthielt Protein und Toxin im Verhältnis von ∆DNT : GTPase 1:2 CNF1full length : GTPase 1 : 10 tTG (1µg/µl) 3 µl in 30 µl Ansatz Ein Ansatz von 30 µl enthielt außerdem: 3 µl 10x-Transglutaminase-Puffer 5 µl gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung 50 mM Tris/HCl pH 8,0 ad 30 µl. In vivo laufen Transglutaminierungsreaktionen in leicht basischem Milieu ab. Daher wurde für die Versuche mit Transglutaminasen Tris/HCl mit einem pH-Wert von 8,0 als Puffer verwendet. Die gesättigte Monodansylcadaverin-Lösung wurde hergestellt, indem eine Spatelspitze Monodansylcadaverin in 400 µl Tris/HCl pH 8,0 resuspendiert und gut gevortext wurde. Nach dem Absinken des ausfallenden Monodansylcadaverins wurde der maximal mit Monodansylcadaverin gesättigte Überstand abgenommen und für den Versuch verwendet. Die Aktivität der Gewebstransglutaminase betrug 0,025 U/10 µl. Um unspezifische Bindung des Monodansylcadaverins an die GTPase auszuschließen, wurde je ein Ansatz mit und einer ohne Zusatz von Toxin inkubiert. Auf jedem Gel lief eine Probe mit RhoA als Referenzwert mit. Die Ansätze wurden nach Zugabe des Toxins 30 Minuten lang bei 29°C (DNT) bzw. 37°C (CNF1 und tTG) inkubiert, die Reaktion mit Probenpuffer gestoppt und die Proben gekocht und auf das Gel aufgetragen. Das Gel wurde vor dem Färben unter einem UV-Leuchtschirm ausgewertet. Für die qualitative Auswertung wurde das Fluoreszenzbild ausgedruckt. Die quantitative Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe eines Computerprogramm (ImageQuant 5.2, Molecular Dynamics). Dabei wurde die Fluoreszenz durch Densitometrie der Banden quantifiziert. Die Fluoreszenz von RhoA diente als Referenzwert von 100%. Mittelwert und Standardabweichung von je drei Versuchen pro GTPase wurden berechnet und graphisch dargestellt. 38 2.3 Messung der Ammoniakfreisetzung Die Deamidierung der Rho-Proteine wurde anhand einer gekoppelten enzymatischen Reaktion mit Hilfe eines Ammoniak-UV-Tests von Boehringer Mannheim nachgewiesen (Abb. C3). Bei diesem Versuchsaufbau reagiert der bei der Deamidierung frei werdende Ammoniak in einer zweiten Reaktion in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrogenase (GlDH) mit 2-Oxoglutarat und NADH. Aus NADH entsteht dabei NAD+, so dass die NADH-Konzentration als Maß für den freigewordenen Ammoniak dienen kann. Die Absorption wurde in einem Fluoreszenzspektrometer mit einem Programm von FL Winlab gemessen. 1. Reaktion 2. Reaktion Abb. C3: Nachweis der Ammoniakfreisetzung durch eine gekoppelte Reaktion Der bei der Deamidierung frei werdende Ammoniak wird anhand einer gekoppelten Reaktion nachgewiesen. Er reagiert in Anwesenheit von GlDH mit 2-Oxoglutarat und NADH, so dass L-Glutamat, NAD+ und H2O entstehen. Die Abnahme von NADH dient als Maß für den entstandenen Ammoniak. Jeder Ansatz enthielt ∆CNF und GTPase im Verhältnis 1:50. Ein Ansatz von 500 µl enthielt außerdem: 50 µl 10x-Transglutaminase-Puffer 166 µl P2*-Puffer 5 µl GlDH-Lösung 50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 500 µl. Die Messung erfolgte in zwei Phasen, einer Äquilibrierungsphase und einer Reaktionsphase. Für die Äquilibrierungsphase wurden alle Substanzen außer dem Toxin in eine Quarzküvette gegeben und der Ansatz bei 37°C bis zum Erreichen eines konstanten Wertes vermessen. Temperatureffekte sollten hierdurch vermieden werden. Durch Zugabe von CNF1 begann die 39 Reaktionsphase. Das Toxin wurde direkt in die Küvette gegeben und der Ansatz durch Invertieren der Küvette gemischt. Die Proben wurden mit λ=340 nm angeregt und die Emission bei λ=460 nm über einen Zeitraum von ca. 4000 s gemessen. Die verschiedenen Proteine erreichten in der Äquilibrierungsphase unterschiedliche Absorptionsniveaus. Daher wurde gegebenenfalls die Schlitzweite des Fluoreszenzspektrometers so verändert, dass die Werte im Messbereich zu liegen kamen. RhoD, RhoB und RhoG benötigten Schlitzweiten von 9-15 nm, ansonsten wurden Schlitzweiten von 5-7 nm gewählt. Als Kontrollen wurden neben der Küvette mit Protein und Toxin jeweils eine Küvette ohne Protein und eine Küvette ohne Toxin getestet. Anschließend erfolgte die Auswertung der Graphen. Um den Effekt des Toxins besser sichtbar zu machen, wurden aus den Originalkurven neue Kurven erstellt, bei denen die Kurven der Äquilibrierungsphase weggelassen und die Kurven der Reaktionsphase durch eine Berechnung auf den selben Anfangswert von 500 gebracht wurden: erhaltener Wert x 500 = neuer Wert Wert bei Zeitpunkt 0 Zusätzlich wurde die Regression der Absorptionskurven für die ersten 200 Sekunden der Reaktionsphase berechnet und die Regressionsgeraden graphisch dargestellt. 2.4 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel Eine weitere Art die Deamidierung von Rho-Proteinen nachzuweisen ist der Nachweis einer Änderung des Laufverhaltens der Proteinbanden im SDS-Gel. Der Nachweis beruht darauf, dass die RhoA-Bande nach der Deamidierung durch CNF1 langsamer wandert als vorher. Dieses Phänomen wird als Motilitätsänderung („Motilitäts-Shift“) bezeichnet. Auch eine Transglutaminierung kann durch die Motilitätsänderung nachgewiesen werden. Nach Transglutaminierung von RhoA wandert die RhoA Bande schneller. Jeder Ansatz enthielt CNF1vollständig und GTPase im Verhältnis 1 : 20 und für einen Ansatz von 20 µl: 2 µl 10x-CNF-Puffer 50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 20 µl. 40 Die Inkubationszeit betrug 3 Stunden, die Inkubationstemperatur 37 °C. Die Reaktion wurde mit Probenpuffer gestoppt und die Proben für fünf Minuten auf 95 °C erhitzt. Die gekochten Proben wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 µl Jodacetamid (20 mg/100 µl H2O) pro 20 µl Probe inkubiert. Jodacetamid modifiziert freie SH-Gruppen durch Alkylierung und verhindert die Bildung neuer Disulfidbrücken. Anschließend wurden die Proben auf ein Harnstoffgel aufgetragen. Als Marker wurde ein vorgefärbter Marker verwendet, mit dessen Hilfe der Lauf der Proteinbanden im Gel beobachtet werden konnte. Der Lauf wurde erst gestoppt, wenn die interessierende Bande möglichst weit gelaufen war, um einen deutlichen Shift zu erhalten. 2.5 Messung der GTP-Bindung Die korrekte Faltung der Proteine wurde anhand der Bindung des radioaktiv markierten [γ−35S]GTP nachgewiesen werden, einem Nukleotid, das aufgrund eines Schwefelatoms anstelle eines Phosphorsauerstoffs an Position γ nicht mehr zu GDP hydrolysiert werden kann. Die Bindung von [γ−35S]GTP an die Rho-GTPasen zeigt an, dass die Proteine in der richtigen Tertiärstruktur vorliegen, also korrekt gefaltet sind. Protein und [γ−35S]GTP wurden für die Beladung mit [γ−35S]GTP 90 Minuten lang bei 37°C inkubiert und der Anstieg der Radioaktivität als Folge der [γ−35S]GTP-Bindung im Zeitverlauf bestimmt. Für die Messung wurden die Proben nach 0, 5, 10, 30, 60 und 90 Minuten auf Filterpapiere gegeben, und freies [γ−35S]GTP wurde mit 20 ml Puffer A entfernt. Jeder Ansatz enthielt pro Filter: 1µg GTPase 1 µl 100 mM DTT 1 µl 100 mM Mg2Cl 1-5 µl 200 µM [γ−35S]GTP-Lösung und 50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 50 µl. Gemessen wurde die Radioaktivität der Filter im Szintillationszähler. Zur Verstärkung des Signals wurden die Proben in Messgefäßen mit „High Flash-point LSC-cocktail“ gemessen. Als Referenz wurde jeweils eine Probe von einem Mikroliter [γ−35S]GTP-Lösung gemessen, so dass auf den Anteil beladenen Proteins vom Gesamtprotein rückgeschlossen werden konnte. 41 Die Berechnung des beladenen Anteils: 1 µg GTPase entspricht einer Menge von ca. 50 pmol GTPase 1 µl 200 µM [γ−35S]GTP entspricht einer Menge von 200 pmol [γ−35S]GTP Mit Hilfe eines Dreisatzes konnte ausgehend von den oben genannten Angaben die Menge des an die GTPase gebundenen [γ−35S]GTP berechnet werden: 200 pmol x Cpm(Probe) = x pmol an GTPase gebundenes [γ−35S]GTP Cpm(Referenz) Der Anteil an gesamter GTPase auf dem Filter in Prozent wird berechnet wie folgt: x pmol an GTPase gebundenes [γ−35S]GTP x 100 50 pmol = Prozentsatz Die GTP-Bindung wurde mit Hilfe von Graphen dargestellt. 2.6 Messung der GTPase-Aktivität Anhand einer veränderten GTPase-Aktivität der Rho-GTPasen können Rückschlüsse auf ihre Modifizierung durch CNF1 gezogen werden. Die GTPase-Aktivität wird durch die Modifizierung durch CNF1 gehemmt, und das Rho-Protein wird konstitutiv aktiviert. Für die Messung der GTPase-Aktivität werden die Proteine zunächst mit [γ−32P]GTP beladen. Danach werden die intrinsische und die durch ExoS (ein GAP-Protein aus Pseudomonas aeruginsa) stimulierte GTPase-Aktivität der Rho-Proteine gemessen. Durch die Hydrolyse des GTP zu GDP wird das radioaktive γ-Phosphat abgespalten, und die Radioaktivität der Probe nimmt im Zeitverlauf ab. Die Proteine wurden vor der Messung der GTPase-Aktivität 3h lang bei 37°C mit CNF1 inkubiert. Der Reaktionsansatz enthielt: Toxin und GTPase im Verhältnis 1 : 10 und als Pufferlösung: 4 µl 10x-CNF-Puffer 50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 40 µl. 42 Für die Beladung mit [γ−32P]GTP wurde die GTPase 5 Minuten lang mit EDTA (10 mM) und DTT (2 mM) bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von unmarkiertem GTP (2 mM) und MgCl2 (35 mM) wurde der Beladungsvorgang abgeschlossen. Zur Messung der intrinsischen GTPase-Aktivität wurden die beladenen Proteinansätze bei 37°C inkubiert und ihre Radioaktivität je zweimal zu den Zeitpunkten 0, 5, 10, 20 und 30 Minuten durch Auftragen auf Filterpapier gemessen. Zur Messung der stimulierten GTPaseAktivität wurde zusätzlich ein Ansatz mit ExoS (100 ng pro Filter) versetzt und nach 4 Minuten gemessen. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne CNF1. Pro Filter enthielt jeder Ansatz: 1 µg GTPase 1 µl 100 mM DTT 1-5 µl 200 µM [γ−32P]GTP-Lösung 5 µl 100 mM EDTA 7 µl 250 mM MgCl2 1 µl 100 mM unmarkiertes GTP und 50 mM PBS ad 50 µl. Die Messung der Radioaktivität erfolgte in H2O im Szintillationszähler. Der Verlauf der GTPHydrolyse wurde anschließend graphisch dargestellt. II.3 Arbeiten mit DNA 3.1 Zielgerichtete Mutagenese und Polymerasekettenreaktion Die Methode der zielgerichteten Mutagenese macht sich die Polymerasekettenreaktion (PCR) zu Nutze, um Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen in Plasmid-DNA einzubringen. Ein PCR-Ansatz enthält Plasmid-DNA, Primer, die Desoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP (dNTPs) und eine hitzestabile DNA-Polymerase. Die Reaktion erfolgt in drei Schritten: Der Denaturierung der doppelsträngigen TemplateDNA durch Erhitzen auf ca. 95°C, dem „Annealing“, bei dem sich die Primer durch Abkühlung auf ca. 50-60°C komplementär an die DNA anlagern und einen Startpunkt für die DNA-Polymerase bilden, sowie der DNA-Elongation, d. h. der Synthese von DoppelstrangDNA. 43 Für die zielgerichtete Mutagenese werden zwei komplementäre Primer verwendet, die die erwünschte Mutation enthalten. In einer Mutagenese-PCR, die mit Hilfe des „Quik-Change site-directed mutagenesis Kit“ durchgeführt wurde, wird die mutierte Variante der PlasmidDNA durch mehrfache Wiederholung des oben beschriebenen Reaktionsablaufes vermehrt. Die Zielgerichtete Mutagenese beinhaltet folgende Schritte: • Primer Design • Plasmid-Präparation • Mutagenese-PCR • Dpn1-Verdau • Transformation von Bakterienzellen 3.2 Primer Design Wie oben beschrieben bilden Primer, die eine Mutation enthalten, die Grundlage für die Herstellung von mutierten Rho-Proteinen. Beim Entwurf der Primer wurde darauf geachtet, dass sich die erwünschte Mutation in der Mitte des Primers befand und der Primer insgesamt ca. 25-30 Basenpaare lang war. 3.3 Plasmid-Präparation Die Präparation der Plasmid-DNA für die Mutagenese-PCR wurde nach der Anleitung des „E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I“ durchgeführt. 3.4 DNA-Konzentrationsbestimmung und Abschätzung der Qualität Die Quantifizierung der Plasmid-DNA erfolgte im Spektrometer bei 260, 280 und 230 nm. Dafür wurden je 5 µl DNA-Lösung in 495 µl H2O gegeben und gegen einen Nullwert von 500 µl H2O gemessen. Eine Absorption von 1,0 bei 260 nm entspricht einer Konzentration von 50 µg DNA/ml. Die Konzentration kann nach der Formel: DNA-Konzentration (µg DNA/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor berechnet werden. Außerdem wurden zur Abschätzung der Qualität der Plasmid-DNA die 260/280-Ratio und die 230/260-Ratio berechnet. Sie dienen als Maße für die Reinheit der Plasmid-DNA. Eine 260/280-Ratio unter 1,6 spricht für Protein- oder Phenolreste, Werte über 2,0 deuten auf RNA-Reste hin. Werte über 0,9 in der 230/260-Ratio bedeuten, dass Zuckerreste in der 44 Lösung vorhanden sind. Auf diese Weise konnte Plasmid-DNA von guter Qualität identifiziert und für die Versuche verwendet werden. 3.5 Mutagenese-PCR Ein Ansatz für eine Mutagenese-PCR enthielt: 5 µl 10x Pfu-Polymerase-Puffer 1 µl dNTPs 10 mM (jedes 2,5 mM) 5 µl sense Primer 3 µM 5 µl antisense Primer 3 µM 1 µl Pfu-Polymerase (2,5 U/µl) 2 µl Template ca. 25 ng/µl 1 µl MgCl2 100 mM HPLC-H2O ad 50 µl Die PCR-Zyklen waren wie folgt eingestellt: Segment Zeit Temperatur Vorgang Anzahl 1 30 s 95°C Denaturierung 1x 2 30 s 95°C Denaturierung 1 min 50-60°C Annealing 2 min / kb Plasmidlänge 68°C 3 unbegrenzt 4°C 12-18x Elongation Konservierung Als DNA-Polymerase kam in dieser Arbeit die Pfu-Polymerase zum Einsatz. Sie hat eine Ablesegeschwindigkeit von ca. 550 Basenpaaren pro Minute. Gegenüber der klassischen TaqPolymerase zeichnet sich die Pfu-Polymerase durch eine ca. 10 mal höhere Ablesegenauigkeit und eine deutlich höhere Temperaturstabilität aus. Weil DNA-Polymerasen die Strangenden der synthetisierten DNA nicht verknüpfen können, lag die DNA nach der Mutagenese-PCR strangförmig vor. 3.6 Dpn1-Verdau Der Zweck des Dpn1-Verdaus ist die Zerstörung der parentalen Plasmid-DNA durch die Endonuklease Dpn1 vor der Transformation. Die Plasmid-DNA fast aller E. coli Stämme ist dam-methyliert, wohingegen die in der Mutagenese-PCR amplifizierte DNA, die die Mutation 45 trägt, nicht methyliert ist. Dpn1 schneidet spezifisch methylierte DNA an der Zielsequenz 5’Gm6AC-3’. 1 µl Dpn1 (10 U/µl) wurde pro Ansatz zugegeben und 1-2 Stunden bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. 3.7 Agarosegelelektrophorese Mittels Agarosegelelektrophorese können DNA-Fragmente, PCR-Produkte und Plasmid-DNA nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Sie wandern durch ein Netz, das durch das pflanzliche Poylsaccharid Agarose im Gel gebildet wird. Der Farbstoff Ethidiumbromid, der in das Gel gegeben wird, interkaliert in die DNA und fluoresziert unter UV-Licht. Die Agarosegelelektrophorese diente der Kontrolle der in der Mutagenese-PCR amplifizierten Plasmid-DNA. Es wurde sichtbar, ob die PCR ausreichend Produkt erbracht hatte. Anhand eines Markers konnte die molekulare Masse des Produkts abgeschätzt und kontrolliert werden. Zur Herstellung der Gele wurde 1g Agarose in 100 ml TAE-Puffer in der Mikrowelle unter Kochen gelöst. Nach dem Abkühlen auf ca. 60°C wurde auf 50 ml Agarose 3 µl Ethidiumbromid-Stammlösung gegeben und die Flüssigkeit in eine Gelkammer gegossen. Je 10 µl Plasmid-DNA-Probe wurden mit DNA-Stopp-Puffer versetzt und nach dem Erhärten der Gele in die Geltaschen gefüllt. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 100 V ca. 45 min lang durchgeführt. Ausgewertet wurde das Agarosegel unter einem UV-Leuchtschirm. DNA-Marker λ-DNA-Marker (HindIII-geschnitten) 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125 Basenpaare λ-DNA-Marker (BstEII geschnitten) 8454, 7242, 6369, 5686, 4822, 4324, 3675, 2323, 1929, 1371, 1264, 702 Basenpaare 3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen Bakterien, die die Fähigkeit besitzen, in Lösung befindliche DNA aufzunehmen, werden in der Mikrobiologie als „kompetent“ bezeichnet. Sie können diese Fähigkeit von Natur aus haben oder sie nach Behandlung mit geeigneten Methoden erlangen. Den Vorgang der Übertragung gereinigter, gelöster DNA auf Bakterien nennt man in der Gentechnik „Transformation“. 46 Die natürliche Kompetenz von E. coli ist gering und wird durch die folgende Methode erheblich gesteigert: Aus 5 ml einer Übernachtkultur, angeimpft mit TG1 oder BL21 Zellen aus vorher auf gleiche Weise hergestellten Glycerin-Kulturen, wurden 500 ml einer Hauptkultur hergestellt. Diese wurde bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 0,3-0,5 bei 37°C und 200 rpm im Schüttler inkubiert und anschließend 20 Minuten auf Eis abgekühlt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 12000 rpm pelletiert, um dann in TSS-Medium mit 10% Glycerin resuspendiert zu werden. Die Zellsuspension wurde auf Eis in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße aliquotiert und dann bei -80°C eingefroren. 3.9 Transformation Die Aufnahme der mutierten Plasmid-DNA in Bakterienzellen wird mit Hilfe eines Hitzeschocks erreicht. 125 µl TG1 oder BL21 E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 2 µl der in der MutagenesePCR amplifizierten Plasmid-DNA wurden hinzu gegeben und die Bakterienzellen dann zunächst für 20 Minuten auf Eis bei 4°C belassen. Anschließend wurden die Proben für 90 s bei 42°C inkubiert und danach für weitere 5 Minuten auf Eis gestellt. Bevor die Zellen auf Agarplatten ausgestrichen wurden, wurden sie in 400 µl SOC-Medium zur Vermehrung 1 Stunde bei 37°C im Schüttler inkubiert. Da auf dem pGEX-Vektorplasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen kodiert ist, konnten auf den Agarplatten über Nacht nur Bakterien wachsen, die das Plasmid besaßen. Von den gewachsenen Kolonien wurden am nächsten Tag einige herausgepickt, auf eine zweite Agarplatte („Masterplate“) aufgebracht und wieder über Nacht wachsen gelassen. Für die DNA-Sequenzierung und alle weiteren Verwendungen wurden die Bakterien von der Masterplate benutzt. 3.10 Kontrolle der Basensequenz Jede Mutation, die im Rahmen dieser Arbeit vorgenommen wurde, wurde durch die Bestimmung der Basensequenz bestätigt. Die Sequenzierung der Plasmid-DNA geschah mit Hilfe des „ABI PRISM TM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits“ der Firma Perkin Elmer. Die Methode basiert auf einer modifizierten Form der Kettenabbruchmethode, die von Sanger 1977 beschrieben wurde. 47 Ein PCR-Ansatz mit einer DNA-Polymerase, einem pGEX-Primer, den vier Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) und vier durch unterschiedliche Fluoreszenzmarker gekennzeichneten Didesoxyribonukleosidtriphosphaten (ddNTP) wird hergestellt. Der Primer ist ein 5’- oder ein 3’-Primer. Während der PCR der zu analysierenden Probe wird DNA polymerisiert. Die Polymerisierung wird beim Einbau eines ddNTP abgebrochen, da dann keine weitere freie 3’-OH-Gruppe mehr vorhanden ist. Es entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente. Gleichzeitig wird die DNA-Probe für die Messung amplifiziert. Die unterschiedlich langen DNA-Fragmente werden nach der PCR mittels Kapillarelektrophorese im Sequenziergerät aufgetrennt und das jeweilige ddNTP der Abbruchstelle detektiert. Die Gesamtheit der Daten über die Basen an den Abbruchstellen ergibt die Basensequenz der DNA. Ein PCR-Ansatz enthielt: 2 µl BTRRM (Big Dye Terminator Ready Reaction Mix) 2 µl Big Dye Sequencing Buffer (5x) 150-350 ng DNA (gelöst in HPLC-H2O) 1 µl Primer (10 pmol/µl) HPLC-H2O ad 10 µl Das PCR-Programm war wie folgt eingestellt: Segment Zeit Temperatur Vorgang Anzahl 1 2 10 s 10s 96°C 96°C Denaturierung Denaturierung 1x 5s 50°C Annealing 30x 4 min 60°C Elongation unendlich 4°C Konservierung 3 Für die Kapillarelektrophorese wurden die Proben zunächst von Kontaminationen gereinigt. Die DNA wurde in 250 µl Ethanol, 90 µl Aqua bidest., 10 µl 3 M Natriumacetat und 2 µl einer Dextranblau-Lösung (10 µg/µl) für 15 min bei Raumtemperatur gefällt und bei 4°C mit 14000 rpm 20 Minuten lang abzentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde mit 250 µl 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 16 µl Aqua bidest. aufgenommen. Eine Verdünnung (4 µl in 16 µl HPLC-H2O) dieser Lösung wurde für die Sequenzierung verwendet. BTRRM: A, C, G und T-Dye Terminator Desoxyribonukleosidtriphosphate 48 Ampli Taq DNA Polymerase, FS MgCl2 Tris/HCl pH 9,0 Markierte DdNTP’s (Dye Terminatoren) Name Bezeichnung DdATP R6G (N,N’-diethyl-2’,7’-dimethyl-6-carboxyrhodamin DdCTP ROX (6-carboxy-X-rhodamin) DdGTP R110 (6-carboxy-X-rhodamin 110) DdTTP TAMRA (N,N,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamin) 3.11 Konservierung transformierter E. coli-Bakterien In Form einer Glycerin-Kultur können Bakterienkulturen sehr lange aufbewahrt und immer wieder für die Herstellung frischer Kulturen verwendet werden. Eine Glycerin-Kultur wurde angelegt, indem 700 µl einer Vorkultur des Bakterienstammes und 700 µl 70 % Glycerin vermischt und bei -80°C eingefroren wurden. 49 D Ergebnisse Ziel der Arbeit war es, die Substratspezifität der Rho-aktivierenden Toxine CNF1 und DNT sowie der Gewebstransglutaminase gegenüber verschiedenen Isoformen der Rho-GTPasen zu untersuchen, und die biologischen Eigenschaften der drei Enzyme und der GTPasen genauer zu beschreiben. Um zu testen, ob eine GTPase das Substrat eines Toxins ist, kommen verschiedene Nachweismethoden zum Einsatz. Die Transglutaminierung durch ein Toxin kann nachgewiesen werden, indem für die Reaktion das fluoreszierende Kosubstrat Monodansylcadaverin verwendet wird. Die Deamidierung von RhoA kann durch den Nachweis einer Motilitätsänderung auf dem SDS-Gel nachgewiesen werden. Die Deamidierung anderer Rho-GTPasen, wie Rac und Cdc42, führt nicht zu einer Motilitätsänderung und wird am besten durch die Messung der Ammoniakfreisetzung nachgewiesen. Es wurden die Rho-GTPasen RhoA, Rac1, Cdc42, RhoB, RhoC, RhoG, RhoD und TC10 untersucht. Das Mitglied der Ras-Familie RalA wurde als Negativkontrolle der Rhospezifischen Toxine getestet. Für die Tests der Substratspezifität wurden sowohl die Cterminalen Toxin-Fragmente ∆DNT (As 1136 -1451) und ∆CNF1 (As 709 -1014) als auch das vollständige Toxin CNFvollständig verwendet. Die Toxin-Fragmente besitzen volle Aktivität. Die Aminosäuresequenzen aller in dieser Arbeit verwendeten Rho-GTPasen sind in Abb. H1 im Anhang dargestellt. Um für die Substratspezifität notwendige Aminosäuren zu identifizieren, wurde folgendermaßen vorgegangen. Als erstes wurde die Substratspezifität von DNT, CNF1 und der Gewebstransglutaminase für alle Rho-GTPasen mit Hilfe der Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin und der Bestimmung der Ammoniakfreisetzung ermittelt. Danach wurde mit Hilfe von Aminosäuresequenzvergleich und gezieltem Austausch von Aminosäuren untersucht, welche Aminosäuren für die Substratspezifität der drei Enzyme entscheidend sind. Verglichen wurden die Aminosäuresequenzen von Rho-GTPasen, die modifiziert werden mit denen, die nicht modifiziert werden. Das wichtigste Kriterium für die Auswahl auszutauschender Aminosäuren war, dass diese Aminosäuren Seitenketten besitzen, die sich in Eigenschaften wie Ladung, Polarität oder Länge voneinander unterscheiden. Ein zweites Kriterium war die Nähe zum modifizierten Glutaminrest. Wenn nicht anders angegeben, entspricht die Nummerierung der Aminosäuren der Nummerierung von RhoA. 50 I Nachweis der korrekten Faltung der getesteten Rho-Proteine Bevor Aussagen darüber gemacht werden können, ob ein rekombinantes Protein Substrat eines Toxins ist, muss gewährleistet sein, dass das Protein in der korrekten Tertiärstruktur vorliegt. Im Falle der Rho-GTPasen lässt sich aus der GTP-Bindung auf die korrekte Faltung schließen, da nur eine korrekt gefaltete Rho-GTPase die Fähigkeit besitzt, GTP zu binden. Für den Nachweis der GTP-Bindung wurde das radioaktiv markierte [γ−35S]GTP verwendet. [γ−35S]GTP wird nicht durch die Rho-GTPasen hydrolysiert, so dass die GTP-Bindung unabhängig von der intrinsischen GTPase-Aktivität gemessen werden kann. Die Rho-GTPasen tauschen während der Inkubation mit [γ−35S]GTP kontinuierlich GDP gegen GTP aus, wobei sie unterschiedliche Austauschraten aufweisen. Es resultiert eine Beladung der Proteine mit [γ−35S]GTP, die zu mehreren Zeitpunkten anhand der Radioaktivität gemessen wird. In Abb. D1 ist beispielhaft für alle getesteten Rho-GTPasen die [γ−35S]GTP-Beladung von RhoA, Cdc42, Rac1 und RhoG dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Rho-GTPasen jeweils unterschiedliche GTP-Beladungsraten aufweisen. RhoA zeigt die schnellste [γ−35S]GTPBindung. Auch die Mutanten der Rho-GTPasen wurden auf ihre [γ−35S]GTP- Bindungsfähigkeit getestet. Alle getesteten GTPasen waren in der Lage, [γ−35S]GTP zu binden. Abb. D1: Messung der GTP- Cpm Bindung 14000 Gezeigt ist die [γ−35S]GTP- 12000 Beladung der Rho- 10000 RhoA Cdc42 Rac1 RhoG 8000 6000 4000 GTPasen RhoA, Cdc42, Rac1 und RhoG zu verschiedenen Zeitpunkten, gemessen in 2000 Cpm (counts per minute). 0 0 20 40 60 80 100 Zeit (min) 51 II DNT und CNF1 II.1 Substratspezifität von DNT Das Rho-aktivierende Toxin DNT besitzt eine größere Transglutaminierungsaktivität als Deamidierungsaktivität (Masuda, 2000). Es modifiziert Rho-GTPasen am Glutaminrest 63. Zwei weitere Aminosäuren der Switch-II-Region, Arginin 68 und Leucin 72, sind für die Transglutaminierung von RhoA durch DNT notwendig (Lerm, 1999a). Sie sind in allen getesteten GTPasen vorhanden. Im Gegensatz zu CNF1 benötigt DNT für die Substraterkennung außer den Aminosäuren 59 bis 78 der Switch-II-Region noch weitere Strukturen der Rho-GTPase. Sowohl N- als auch C-terminale Anteile eines Rho-Proteins sind für die Modifizierung durch DNT notwendig (Lerm, 1999a). Die Substratspezifität von DNT wurde mit Hilfe des Transglutaminierungsexperiments untersucht, bei dem das fluoreszierende Monodansylcadaverin als Kosubstrat dient. Der Versuch wurde pro GTPase je dreimal durchgeführt, und die Fluoreszenz der Proteinbanden wurde densitometrisch quantifiziert. Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierung sind im Folgenden graphisch dargestellt. RhoB, RhoC, Rac1, Cdc42 und TC10 (Abb. D2): Die GTPasen RhoB, RhoC, Rac1, Cdc42 und TC10 werden durch DNT transglutaminiert. Die Modifizierung von TC10 und RhoC ist schwächer als die von Cdc42 und RhoB. Abb. D2: Transglutaminierung Transglutaminierung[%] 180 durch DNT 160 Dargestellt 140 glutaminierung 120 GTPasen RhoB, RhoC, Rac1, ist die Trans- der Rho- Cdc42 und TC10 durch DNT im 100 Vergleich zu RhoA. Kosubstrat 80 ist Monodansylcadaverin, als 60 Einheit 40 Fluoreszenz in Prozent (RhoA- 20 Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST- 0 dient die gemessene RhoA; Verhältnis von ∆DNT zu oA Rh oB Rh c1 oC Ra Rh c Cd 42 TC 10 GTPase: 1 : 2; Inkubation: 30 min bei 29°C). 52 RhoD, RhoG (Abb. D3): Die GTPasen RhoD und RhoG werden nicht von DNT transglutaminiert. Auch das nicht zur Rho-Familie gehörende niedermolekulare GTPbindende Protein RalA wird nicht transglutaminiert. Transglutaminierung[%] Abb. D3: Transglutaminierung 180 durch DNT 160 Dargestellt 140 120 ist die Trans- glutaminierung der Rho- GTPasen und RhoD RhoG, sowie der Ras-GTPase RalA 100 durch DNT im Vergleich zu 80 RhoA. 60 Monodansylcadaverin, 40 Einheit Kosubstrat dient die ist als gemessene Fluoreszenz in Prozent (RhoA- 20 Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST- 0 o Rh A oD Rh oG Rh lA Ra RhoA; Verhältnis von ∆DNT zu GTPase: 1 : 2; Inkubation: 30 min bei 29°C). Tabelle D1 zeigt eine Übersicht über die Ergebnisse der Transglutaminierungsversuche. GTPase Transglutaminierung RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD + + + + + + - - Tab. D1: Transglutaminierung durch DNT – Übersicht Cdc42, Rac1, TC10, RhoC und RhoB werden von DNT transglutaminiert. RhoG und RhoD werden nicht transglutaminiert. 53 II.2 Substratspezifität von CNF1 CNF1 aktiviert wie DNT die Rho-Proteine durch Modifikation an Glutamin 63 (Flatau, 1997; Schmidt, 1997). Es bewirkt die Aktivierung der GTPasen vornehmlich durch Deamidierung. Außerdem besitzt es eine geringe Transglutaminierungsaktivität (Schmidt, 1998). Für die Substraterkennung durch CNF1 ist eine Sequenz von 20 Aminosäuren ausreichend, die im Prinzip der Switch-II-Region von RhoA entspricht (Asp 59 - Asp 78). Innerhalb dieser Region sind Arginin 68 und Leucin 72 essentiell (Lerm, 1999a). Die Deamidierung der Substrate kann anhand der Messung der Ammoniakfreisetzung während der Inkubation mit CNF1 nachgewiesen werden. Der gemessene Ammoniak entsteht bei der Deamidierungsreaktion durch den Austausch von NH2 an Glutamin 63 gegen eine Hydroxylgruppe. Gemessen wird die Absorption von NADH, die infolge einer gekoppelten Reaktion, bei der NAD+ aus NADH entsteht, proportional zur Ammoniakentstehung abnimmt. Die Kinetik der Ammoniakentstehung lässt sich mit Hilfe der Regressionsgeraden der Absorptionskurven darstellen. Die Regression ist die Steigung einer Gerade, die im annähernd linear verlaufenden Anfangsbereich der Absorptionskurve durch die Messpunkte gelegt wird und angibt, wie schnell bei der Reaktion Ammoniak entsteht. Im Folgenden werden die Absorptionskurven der Reaktionsverläufe und deren Regressionsgeraden gezeigt. 54 RhoA, Cdc42, Rac1, TC10 (Abb. D4): Die Deamidierung von RhoA, Cdc42, Rac1 und TC10 wurde durch die Bestimmung der Ammoniakfreisetzung nachgewiesen. Die Absorptionskurven der Proteinansätze, die die RhoGTPase und CNF1 enthalten, fallen stärker ab als die Kurven der Ansätze, die nur die RhoGTPase oder nur CNF1 enthalten. Es entsteht dort also mehr Ammoniak. Auch die Regression der Kurven von GTPase und CNF1 zusammen ist in allen Fällen größer als die der Kontrollkurven, d. h. es entsteht schneller Ammoniak. 540 520 CNF1 400 RhoA RhoA + CNF1 300 200 Absorption 500 (arbiträre Einheiten) Absorption (arbiträre Einheiten) 600 100 2000 4000 6000 Rac1 300 Rac1 + CNF1 200 Absorption CNF1 400 (arbiträre Einheiten) Absorption (arbiträre Einheiten) 50 100 150 200 250 Zeit (s) 520 500 CNF1 500 m = -0,07 480 Rac1 Rac1 + CNF1 m = -0,16 460 440 Regression m = -0,27 420 400 0 0 2000 4000 6000 0 Zeit (s) 600 50 100 150 200 250 Zeit (s) 300 Cdc42 200 Cdc42 + CNF1 Absorption 400 CNF1 (arbiträre Einheiten) 540 500 520 CNF1 500 Cdc42 m = -0,11 480 460 m = -0,12 440 Regression m = -0,26 420 Cdc42 + CNF1 400 100 0 0 2000 4000 6000 50 100 150 200 250 Zeit (s) Zeit (s) 600 540 500 520 400 TC10 300 TC10 + CNF1 200 100 Absorption CNF1 (arbiträre Einheiten) Absorption Regression m = -0,21 420 540 100 (arbiträre Einheiten) RhoA + CNF1 440 Zeit (s) 600 Absorption RhoA m = -0,08 460 0 0 0 CNF1 480 400 0 (arbiträre Einheiten) m = -0,003 500 500 m = -0,06 480 m = -0,11 460 m = -0,18 440 CNF1 TC10 TC10 + CNF1 Regression 420 400 0 0 2000 4000 6000 Zeit (s) 0 50 100 150 200 250 Zeit (s) Abb. D4: Deamidierung durch CNF1 Absorptionskurven und Regression der Absorptionskurven im Anfangsbereich (Zeit: 0-200 s); die Bestimmung der Ammoniakfreisetzung wurde für jede Rho-GTPase einmal durchgeführt; 55 RhoC, RhoB, RhoG und RhoD (Abb. D5): Auch die Deamidierung von RhoC, RhoB und RhoG wurde nachgewiesen. Sowohl an den Absorbtionskurven der Proben, die die Rho-GTPase und CNF1 enthalten, als auch an deren Regressionsgeraden ist im Vergleich zu den Kontrollkurven ein schnellerer Abfall, und damit eine schnellere Ammoniakentstehung zu erkennen. RhoD hingegen wurde nicht durch CNF1 deamidiert. Weder die Absorptionskurve der Probe mit RhoD und CNF1 fällt stärker ab, noch hat die Regressionsgerade dieser Kurve eine andere Steigung als die Kurven der Einzelproteine. 540 CNF1 400 RhoC 300 RhoC + CNF1 200 Absorption 500 (arbiträre Einheiten) Absorption (arbiträre Einheiten) 600 520 CNF1 500 480 m = -0,14 RhoC 460 m = -0,14 RhoC + CNF1 440 m = -0,35 420 Regression 400 100 0 50 100 150 200 250 0 0 2000 4000 6000 Zeit (s) Zeit (s) 600 540 400 RhoB 300 RhoB + CNF1 200 100 Absorption Absorption (arbiträre Einheiten) CNF1 (arbiträre Einheiten) 520 500 440 m = -0,09 RhoB m = -0,14 RhoB + CNF1 m = -0,35 Regression 420 2000 4000 6000 50 100 150 200 250 Zeit (s) Zeit (s) 540 600 520 CNF1 400 RhoG 300 RhoG + CNF1 200 100 0 2000 4000 6000 Absorption 500 (arbiträre Einheiten) Absorption 460 0 0 (arbiträre Einheiten) 480 400 0 0 CNF1 500 500 m = -0,07 480 460 m = -0,12 RhoG + CNF1 m = -0,40 Regression 440 420 CNF1 RhoG 400 0 Zeit (s) 50 100 150 200 250 Zeit (s) 540 600 520 400 RhoD 300 RhoD + CNF1 200 100 0 0 2000 4000 6000 Zeit (s) 500 Absorption CNF1 (arbiträre Einheiten) Absorption (arbiträre Einheiten) 500 m = -0,03 480 m = -0,07 m = -0,14 460 440 CNF1 RhoD RhoD + CNF1 Regression 420 400 0 50 100 150 200 250 Zeit (s) Abb. D5: Deamidierung durch CNF1: Absorptionskurven und Regression der Absorptionskurven im Anfangsbereich (Zeit: 0-200 s); die Bestimmung der Ammoniakfreisetzung wurde für jede Rho-GTPase einmal durchgeführt; mit RhoD wurde der Versuch zweimal durchgeführt; Beachte: der Absorbtionsabfall der Kontrollkurven (nur GTPase) ist mit unspezifischer Ammoniakbildung zu erklären. 56 Tabelle D2 zeigt eine Übersicht der Ergebnisse der Bestimmung der Ammoniakfreisetzung. GTPase RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD Deamidierung + + + + + + + - Tab. D2: Deamidierung durch CNF1 – Übersicht Cdc42, Rac1, TC10, RhoC, RhoB und RhoG werden von CNF1 deamidiert. RhoD wird nicht deamidiert. II.3 Aminosäuresequenzvergleich der Switch-II-Regionen der getesteten Rho-GTPasen Zur Untersuchung der Substratspezifität von DNT und CNF1 wurden die Switch-II-Regionen der getesteten Rho-GTPasen verglichen, da diese Region besonders wichtig für das Angreifen der beiden Toxine ist. Es wurde nach Abweichungen der Aminosäuresequenzen von RhoD und RhoG gegenüber den modifizierbaren Rho-GTPasen gesucht, die die Ursache dafür sein könnten, dass RhoG und RhoD nicht transglutaminiert und RhoD nicht deamidiert wird. Rho-GTPase Switch-II-Region (As 62-78) 62 63 68 72 78 RhoA G Q E D Y D R L R P L S Y P D T D Rac1 G Q E D Y D R L R P L S Y P Q T D Cdc42 G Q E D Y D R L R P L S Y P Q T D RhoB G Q E D Y D R L R P L S Y P D T D RhoC G Q E D Y D R L R P L S Y P D T D TC10 G Q E D Y D R L R P L S Y P M T D RhoG G Q E E Y D R L R T L S Y P Q T N RhoD G Q D D Y D R L R P L F Y P D A N Abb. D6: Switch-II-Regionen aller getesteten Rho-GTPasen fett gedruckt: abweichende Aminosäuren; kursiv gedruckt: von Lerm et al untersuchte Aminosäuren R 68 und L 72 (Lerm, 1999a); RhoG unterscheidet sich in der Switch-II-Region von den anderen GTPasen durch drei, RhoD durch vier Aminosäuren (Abb. D6). RhoG weist an Position 65 ein Glutamat statt wie die anderen GTPasen ein Aspartat auf. Die Seitenkette von Glutamat ist um ein Kohlenstoffatom länger als die von Aspartat, aber in Ladung und Polarität gleich. Weiterhin befindet sich an Position 71 ein Threonin statt einem 57 Prolin. Die Seitenkette von Threonin ist hydrophil, während die von Prolin neutral ist. Die dritte abweichende Aminosäure von RhoG ist das Asparagin an Position 78. Dort steht in den anderen GTPasen ein Aspartat. Aspartat besitzt eine negativ geladene Carboxylgruppe, während in Asparagin eine positiv geladene Aminogruppe vorkommt. In RhoD befindet sich an Position 64 ein Aspartat statt einem Glutamat, und an Position 73 steht ein Phenylalanin statt einem Serin. Phenylalanin und Serin haben sehr unterschiedliche Seitenketten. Die von Phenylalanin ist hydrophob und hat einen aromatischen Ring. Serin dagegen ist hydrophil, und seine Seitenkette besteht aus einem Kohlenstoffatom. Wie RhoG besitzt RhoD an Position 78 ein Asparagin anstelle eines Aspartats. Die vierte Aminosäure, die sich in RhoD von den anderen GTPasen unterscheidet, ist das neutrale Alanin an Position 77. Es steht anstelle des hydrophilen Threonins der anderen GTPasen. II.4 Mutanten zur Untersuchung der Substratspezifität von DNT und CNF1 Mit Hilfe der zielgerichteten Mutagenese können gezielt einzelne Aminosäuren eines Proteins ausgetauscht werden. Ausgetauscht wurden zunächst die Aminosäuren 64, 65, 71 und 73 in RhoA. Die RhoA-Mutanten enthielten die entsprechenden Aminosäuren von RhoG und RhoD. Die Aminosäuren 64 und 65 wurden ausgetauscht, da sie direkt benachbart zum Glutamin 63 liegen. Die Aminosäuren 71 und 73 sollten wegen ihrer sehr unterschiedlichen Seitenketten ausgetauscht werden. Zusätzlich zu den RhoA-Mutanten wurden die jeweiligen reziproken Mutanten von RhoG und RhoD hergestellt, die die Aminosäuren enthielten, die in RhoA vorkommen. Da die Nummerierung der GTPasen RhoA, RhoG und RhoD unterschiedlich ist, sind in der Tabelle D3 die äquivalenten Aminosäuren zum besseren Verständnis extra dargestellt und hervor gehoben. RhoA-Mutante RhoG/D-Mutante äquivalente Aminosäuren RhoA D65E RhoG E63D RhoA 65 = RhoG 63 RhoA P71T RhoG T69P RhoA 71 = RhoG 69 RhoA E64D RhoD D76E RhoA 64 = RhoD 76 RhoA S73F RhoD F85S RhoA 73 = RhoD 85 Tab. D3: Mutanten von RhoA, RhoG und RhoD zur Untersuchung der Substratspezifität von DNT und CNF1 58 II.5 Untersuchung der Mutanten RhoG-Mutanten Der Ausgangspunkt für die ersten Transglutaminierungsversuche war die Frage, ob die Aminosäuren 65 und 71 entscheidend für die Substraterkennung durch DNT sind, ob also die RhoA-Mutanten, die an diesen Positionen die äquivalenten Aminosäuren von RhoG enthalten, keine Substrate mehr von DNT sein würden. Der Test von RhoA D65E und RhoA P71T zeigte, dass diese Mutanten im Gegensatz zu RhoA Wildtyp nicht transglutaminiert werden (Abb. D7). Da die Mutanten [γ−35S]GTP binden, also korrekt gefaltet sind, kann dieser Effekt auf die ausgetauschte Aminosäure zurückgeführt werden. RhoA Wildtyp - + RhoA D65E - RhoA P71T + - + RhoA K140T - + DNT Abb. D7: Transglutaminierung durch DNT Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurden zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; zweite Positivkontrolle: RhoA K140T; Das Ergebnis spricht dafür, dass die ausgetauschten Aminosäuren für die Transglutaminierung durch DNT notwendig sind. Um zu untersuchen, ob sie ausreichend sind, wurden die reziproken Mutanten von RhoG, RhoG E63D und RhoG T69P, getestet. RhoG T69P wurde nicht exprimiert. RhoG E63D wurde im Transglutaminierungsversuch untersucht. Diese Mutante wurde nicht von DNT transglutaminiert (nicht gezeigt, Anzahl der Versuche mit gleichem Ergebnis: zweimal). Um zu testen, ob ein Unterschied in der Substraterkennung durch DNT und CNF1 besteht, wurden die Mutanten im Transglutaminierungsversuch mit CNF1 getestet (Abb. D8). Weder RhoG Wildtyp noch die Mutante RhoG E63D wurden durch CNF1 transglutaminiert. Die RhoA-Mutante RhoA D65E wurde, wie im Versuch mit DNT, im Gegensatz zu RhoA Wildtyp nicht mehr von CNF1 transglutaminiert. 59 RhoA Wildtyp - RhoA D65E + - + RhoG Wildtyp - + RhoG E63D - + CNF1 Abb. D8: Transglutaminierung durch CNF1 Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurde zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; RhoD-Mutanten Als nächstes wurden die RhoD-Mutanten untersucht, die die Aminosäuren enthielten, die in RhoA vorkommen. Dabei zeigte sich, dass RhoD D76E Substrat von CNF1 war. RhoD Wildtyp wurde nicht modifiziert, und auch nicht RhoD F85S (Abb. D9). Die Aminosäure 76 in RhoD (64, RhoA-Nummerierung) ist folglich entscheidend für die Transglutaminierung durch CNF1. Anschließend wurde die reziproke RhoA-Mutante RhoA E64D getestet, um zu überprüfen, ob Aminosäure 64 (76, RhoD-Nummerierung) auch in RhoA für die Transglutaminierung notwendig ist. Die Transglutaminierungsreaktion mit RhoA E64D ergab, dass diese RhoA-Mutante nicht mehr von CNF1 transglutaminiert wird (keine Abb.). RhoA Wildtyp - + RhoD Wildtyp - + RhoD D76E - + RhoD F85S - + CNF1 Abb. D9: Transglutaminierung durch CNF1 Kosubstrat: Monodansylcadaverin, der Versuch wurde dreimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; 60 Dass die Aminosäure 76 in RhoD bzw. 64 in RhoA auch für die Transglutaminierung durch DNT notwendig ist, wurde durch die nächsten Versuche mit DNT bestätigt (Abb. D10). RhoD D76E wird in geringem Ausmaß auch von DNT transglutaminiert, im Gegensatz zu RhoD Wildtyp (nicht gezeigt) und RhoA E64D. RhoA Wildtyp - RhoD D76E + - RhoA Wildtyp + DNT - + RhoA E64D - + Abb. D10: Transglutaminierung durch DNT Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurde mit RhoD D76E zweimal (mit RhoA E64D einmal) mit gleichem Ergebnis durchgeführt; III RhoD D76E III.1 Deamidierung von RhoD D76E Die oben beschriebenen Versuche mit den mutierten Rho-GTPasen erbrachten das Ergebnis, dass RhoD D76E im Gegensatz zu RhoD Wildtyp von CNF1 und DNT transglutaminiert wird. Als nächstes sollte daher festgestellt werden, ob RhoD D76E auch durch CNF1 deamidiert wird, da CNF1 in vivo mehr Deamidierungsaktivität als Transglutaminierungsaktivität aufweist. Dazu wurden der Nachweis der Motilitätsänderung und der Westernblot eingesetzt. Der Nachweis der Motilitätsänderung beruht darauf, dass das getestete Protein nach Deamidierung durch CNF1 sein Laufverhalten ändert und im SDS-Gel langsamer wandert. Diese Motilitätsänderung kann auf dem Gel beobachtet oder durch einen Westernblot mit einem Antikörper gegen RhoA nachgewiesen werden. Für diesen Versuch wurden als Kontrollen zwei weitere Mutanten hergestellt, RhoA Q63E/E64D und RhoD Q75E/D76E. Diese Doppelmutanten dienten als Positivkontrollen, da das Vorhandensein der Aminosäure Glutamat an Position 63 (RhoA) bzw. 75 (RhoD) denselben Effekt auf das Laufverhalten im SDS-PAGE hat wie die Deamidierung durch CNF1. Laufen die Doppelmutanten im SDS-Gel langsamer als die jeweilige Einfachmutante, 61 beweist dies, dass es im Falle der Deamidierung des getesteten Proteins zu einer Motilitätsänderung kommt. Dass die Aminosäure 64 in RhoA einen Einfluss auf die Deamidierung durch CNF1 hat, wurde zunächst durch den Versuch mit den RhoA-Mutanten gezeigt. Die Mutante RhoA E64D, die statt Glutamat an Position 64 die RhoD-Aminosäure Aspartat besitzt, zeigt nach Inkubation mit CNF1 eine geringere Motilitätsänderung als RhoA Wildtyp, also eine verminderte Deamidierung (Abb. D11). CNF1 - + - + - + - + deamidiert WT RhoA Wildtyp RhoA E64D RhoA Q63E RhoA Q63E E64D Abb. D11: Deamidierung durch CNF1 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel mit Hilfe des Westernblots; der Versuch wurde zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; Als nächstes wurde der Nachweis der Motilitätsänderung für die RhoD-Mutanten durchgeführt (Abb. D12). Man erkennt auf dem SDS-Gel, dass die Mutante RhoD D76E schneller läuft als RhoD Wildtyp. Die Doppelmutante RhoD Q75E D76E läuft im Gegensatz zu RhoD D76E langsamer auf dem Gel, demnach wäre eine Motilitätsänderung zu erwarten, falls RhoD D76E durch CNF1 deamidiert wird. Nach Inkubation mit CNF1 zeigte RhoD D76E kein verändertes Laufverhalten und wird folglich nicht deamidiert. 62 - + - + - + - ToxinBande + CNF1 deamidiert WT RhoA Wildtyp RhoD Wildtyp RhoD D76E RhoD Q75E D76E Abb. D12: Deamidierung durch CNF1 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel; der Versuch wurde dreimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; III.2 GTPase-Aktivität von RhoD D76E In einem weiteren Versuch wurde die Frage, ob eine Deamidierung stattfindet oder nicht, nochmals untersucht und bestätigt. Die GTPase-Aktivität von RhoD D76E wurde nach Deamidierung durch CNF1 gemessen. Dafür wurde das Protein mit [γ−32P]GTP beladen, dessen radioaktives γ-Phosphat aufgrund der intrinsischen GTPase-Aktivität der Rho-GTPase abgespalten wird. Die Proben wurden vor der Messung der GTPase-Aktivität mit und ohne CNF1 inkubiert. Durch die Messung der Radioaktivität kann man überprüfen, ob die GTPase-Aktivität als Folge einer möglichen Deamidierung vermindert ist. Der Vergleich von RhoA Wildtyp mit RhoA E64D ergab, döass die GTPase-Aktivität von RhoA E64D nach der Behandlung mit CNF1 im Gegensatz zu RhoA Wildtyp gleich bleibt (nicht gezeigt), d. h. es findet keine Deamidierung statt. Die GTPase-Aktivität von RhoD D76E, die im Falle einer Deamidierung vermindert wäre, wird durch Inkubation mit CNF1 nicht verändert. Es konnte also keine Deamidierung von RhoD D76E nachgewiesen werden. 63 IV Gewebstransglutaminase IV.1 Substratspezifität der Gewebstransglutaminase Im Gegensatz zu Faktor XIII oder DNT gilt die Gewebstransglutaminase als relativ unspezifische Transglutaminase. RhoA wird durch die Gewebstransglutaminase an drei von fünf vorhandenen Glutaminresten, Gln 52, Gln 63 und Gln 136, transglutaminiert (Schmidt, 1998). Glutamin 52 wird in sehr geringem Maße transglutaminiert, und Glutamin 63, das in der Switch-II-Region liegt, wird schwächer modifiziert als Glutamin 136. Glutamin 136 liegt in der Insert-Region und wird besonders gut transglutaminiert (unveröffentlicht). Glutamin 136 ist Teil einer Sequenz in RhoA, die der Transglutaminase-Konsensus-Sequenz sehr ähnlich ist. Die Transglutaminase-Konsensus-Sequenz begünstigt das Angreifen der Gewebstransglutaminase (Zeeuwen, 1997). Um die Substratspezifität der Gewebstransglutaminase für die Rho-GTPasen zu testen, wurde der Transglutaminierungsversuch mit Monodansylcadaverin pro GTPase je dreimal durchgeführt, und die Modifizierung wurde anschließend anhand der fluoreszierenden Proteinbanden gemessen. Im Folgenden sind Mittelwert und Standardabweichung der Fluoreszenz dargestellt. RhoB und RhoC (Abb. D13): Die Graphik zeigt, dass RhoB und RhoC Substrate der Gewebstransglutaminase sind. Ihre Modifikation ist vergleichbar stark wie die von RhoA. D13: Transglutaminierung durch die Gewebstransglutaminase 120 Dargestellt ist die Transglutaminierung der Rho- 100 GTPasen RhoB und RhoC im Vergleich zu RhoA. 80 Kosubstrat ist Monodansylcadaverin, als Einheit 60 dient die gemessene Fluoreszenz in Prozent 20 tTG (1µg/µl): 3 µl in 30 µl Ansatz; Inkubation: 30 0 min bei 37°C). Rh oC (RhoA-Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST-RhoA; Rh oB 40 Rh oA Transglutaminierung[%] Abb. 64 RhoD, RhoG, TC10 (Abb. D14): RhoG, RhoD und TC10 sind ebenfalls Substrate der Gewebstransglutaminase, werden aber im Vergleich zu RhoB und RhoC schwächer transglutaminiert. Transglutaminierung[%] Abb. D14: Transglutaminierung durch die 120 Gewebstransglutaminase 100 Dargestellt ist die Transglutaminierung der Rho- 80 GTPasen RhoD, RhoG und TC10 im Vergleich zu RhoA. Kosubstrat ist Monodansylcadaverin, als 60 Einheit dient die gemessene Fluoreszenz in 40 Prozent (RhoA-Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST- 20 RhoA; tTG (1µg/µl): 3 µl in 30 µl Ansatz; Inkubation: 30 min bei 37°C). 0 oA Rh Rh oD Rh oG T 0 C1 Rac1, Cdc42 und RalA (Abb. D15): Rac1, Cdc42 und RalA werden nicht von der Gewebstransglutaminase modifiziert. Besonders auffällig ist das Ergebnis von Cdc42. Cdc42 weist von den Glutaminen, die in RhoA durch die Gewebstransglutaminase modifiziert werden, sowohl Gln 63 als auch Gln 136 auf. Trotzdem dient es nicht als Substrat der Gewebstransglutaminase. Transglutaminierung[%] Abb. D15: Transglutaminierung durch die 120 Gewebstransglutaminase 100 Dargestellt ist die Transglutaminierung der RhoGTPasen Rac1 und Cdc42, sowie der Ras-GTPase 80 RalA im Vergleich zu RhoA. Kosubstrat ist 60 Monodansylcadaverin, als Einheit dient die 40 gemessene 20 Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST-RhoA; tTG 0 (1µg/µl): 3 µl in 30 µl Ansatz; Inkubation: 30 min oA Rh c1 Ra c Cd 42 lA Ra bei 37°C). Fluoreszenz in Prozent (RhoA- 65 Tabelle D4 zeigt eine Übersicht über die Ergebnisse der Transglutaminierungsversuche. GTPase Transglutaminierung RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD + - - + + + + + Tab. D4: Transglutaminierung durch die tTG – Übersicht TC10, RhoC, RhoB, RhoG und RhoD werden von der tTG transglutaminiert. Cdc42 und Rac1 sind keine Substrate. IV.2 Aminosäuresequenzvergleich von Cdc42 und RhoA Um herauszufinden, welche Aminosäuren der Rho-GTPasen einen Einfluss auf die Substratspezifität der Gewebstransglutaminase haben, wurden die Aminosäuresequenzen von RhoA und Cdc42 verglichen. Verglichen wurden die Aminosäuren 135 bis 140 der beiden Rho-GTPasen, da diese Sequenz in RhoA der Transglutaminase-Konsensus-Sequenz sehr ähnlich ist (Abb. D16). Die Transglutaminase-Konsensus-Sequenz gilt als effektives Substrat der Gewebstransglutaminase und wurde aus dem Vergleich mehrerer Proteine der TrappinFamilie abgeleitet (Zeeuwen, 1997). Sie besteht aus den sechs Aminosäuren GQDPVK. GTPase „Konsensus-Sequenz“ (As 135-140) G Q D P V K RhoA K Q E P V K Cdc42 K Q K P I T Abb. D16: Vergleich der Aminosäuresequenzen von RhoA und Cdc42 mit der Transglutaminase-KonsensusSequenz fett gedruckt: abweichende Aminosäuren; Cdc42 unterscheidet sich in dieser Region durch drei Aminosäuren von RhoA. Statt dem kurzen, sauren Glutamat an Position 137 besitzt es das längere, basische Lysin. An Position 140 steht ein kurzes, polares Threonin anstelle eines Lysins. Die beiden Aminosäuren an Position 139, Isoleucin (Cdc42) und Valin (RhoA), sind aliphatische Aminosäuren, die sich nur durch ein Kohlenstoffatom in ihrer Länge und durch die Verzweigung der Kohlenstoffkette unterscheiden. 66 Die Aminosäureseitenketten von Cdc42 unterscheiden sich also an Position 137 und 140 stärker von RhoA als an Position 139. Aus diesem Grund sollten zunächst die Aminosäuren 137 und 140 mit Hilfe der zielgerichteten Mutagenese ausgetauscht werden. IV.3 Mutanten zur Untersuchung der Substratspezifität der Gewebstransglutaminase Es wurden zwei RhoA-Mutanten hergestellt, die an Position 137 und 140 die Aminosäuren besitzen, die in Cdc42 vorkommen, um deren Einfluss auf die Substratspezifität zu untersuchen (Tab. D5). RhoA-Mutante RhoA E137K RhoA K140T Tab. D5: Mutanten von RhoA zur Untersuchung der Substratspezifität der tTG IV.4 Untersuchung der Mutanten Die RhoA-Mutanten E137K und K140T wurden mit dem Transglutaminierungsversuch auf veränderte Modifizierbarkeit getestet. Sie zeigten sich in den ersten Versuchen als genauso gute Substrate der Gewebstransglutaminase wie RhoA Wildtyp (Abb. D17). RhoA Wildtyp RhoA E137K RhoA K140T Cdc42 Wildtyp Fluoreszenz der Proteinbanden unter UV-Licht Proteinbanden auf dem SDS-Gel tTG - + - + - + - + Abb. D17: Transglutaminierung durch die Gewebstransglutaminase Kosubstrat: Monodansylcadaverin; Fluoreszenz (oben) und SDS-Gel der Proteinbanden (unten); der Versuch wurde für RhoA K140T zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; für RhoA E137K wurde der Versuch einmal durchgeführt; Beachte: die etwas geringere Fluoreszenz von RhoA E137K lässt sich anhand der Proteinmenge erklären. 67 V Tabellarische Zusammenfassung der Ergebnisse Tabelle D6 fasst die Ergebnisse der Versuche mit den Wildtyp Rho-GTPasen zusammen. GTPase Transglutaminierung durch DNT Deamidierung durch CNF1 Transglutaminierung durch tTG Transglutaminierung durch CNF1 RhoA Cdc42 Rac1 TC10 RhoC RhoB RhoG RhoD + + + + + + - Tab. D6: Zusammenfassung: WT Rho-GTPasen: + + - + + + + + + + + + + + - + - „+“ = Substrat; „-“ = kein Substrat; Tabelle D7 fasst die Ergebnisse der Versuche mit mutierten Rho-GTPasen zusammen. RhoA RhoA RhoA RhoA RhoA RhoD RhoG E64D D65E P71T E137K K140T D76E E63D Transglutaminierung durch DNT Deamidierung durch CNF1 Transglutaminierung durch CNF1 Transglutaminierung durch tTG (+) - - - + + (+) + + Tab. D7: Zusammenfassung: mutierte Rho-GTPasen: „+“ = Substrat; „-“ = kein Substrat; leeres Feld = nicht getestet; - 68 E Diskussion Der Zytotoxische Nekrotisierende Faktor 1 (CNF1) und das Dermonekrotische Toxin (DNT) sind zwei bakterielle Exotoxine, die von Escherichia coli bzw. Bordetella bronchiseptica als Virulenzfaktoren produziert werden. Die Gewebstransglutaminase ist ein Enzym, das im Körper ubiquitär vorkommt und verschiedene Proteine posttranslational modifiziert. Die drei Enzyme haben gemeinsam, dass sie die Rho-GTPasen RhoA, Cdc42 und Rac1 kovalent modifizieren (Lerm, 1999b; Masuda, 2002). Dabei katalysieren sie die zwei Reaktionen Transglutaminierung und Deamidierung (Abb. E1). Transglutaminierung NH2 DNT CNF1 tTG Deamidierung DNT CNF1 tTG Abb. E1: Modifizierung der Rho-GTPasen durch DNT, CNF1 und tTG Die drei Enzyme DNT, CNF1 und tTG katalysieren zum einen die Transglutaminierung, bei der ein primäres Amin an einen Glutaminrest gehängt wird. Zum anderen katalysieren sie die Deamidierung, bei der an einem Glutaminrest NH2 gegen eine Hydroxylgruppe ausgetauscht wird. Bei beiden Reaktionen entsteht Ammoniak. Zu Beginn der Arbeit war nicht bekannt, ob CNF1, DNT und die Gewebstransglutaminase auch andere Rho-GTPasen modifizieren. Die Substratspezifität der drei Enzyme für die RhoGTPasen RhoB, RhoC, RhoG, RhoD und TC10 wurde in dieser Arbeit untersucht. Die Versuche dienten dazu, die biologischen Eigenschaften der Rho-GTPasen und der Enzyme CNF1, DNT und Gewebstransglutaminase genauer zu charakterisieren. Zunächst wurde ermittelt, welche Rho-GTPasen Substrate sind, und ob sich DNT, CNF1 und die Gewebstransglutaminase in ihrer Substratspezifität unterscheiden. Dabei wurde sowohl die Transglutaminierung als auch die Deamidierung untersucht. Durch Vergleich der Aminosäuresequenzen und durch Aminosäureaustausch wurden Aminosäuren identifiziert, die für die Substratspezifität entscheidend sind. 69 I DNT und CNF1 Substratspezifität Die Transglutaminierung der Rho-GTPasen wurde mit Hilfe des fluoreszierenden Kosubstrates Monodansylcadaverin nachgewiesen. Es wird an das Glutamin 63 der GTPase angehängt und kann unter UV-Licht in der Proteinbande auf dem SDS-Gel nachgewiesen werden. Die Deamidierung der GTPase kann anhand einer Motilitätsänderung der Proteinbande in der SDS-PAGE oder durch die Messung der Ammoniakfreisetzung während der Reaktion nachgewiesen werden. Die Tests der Substratspezifität von DNT und CNF1 ergaben, dass RhoG und RhoD im Gegensatz zu den anderen getesteten GTPasen weder durch CNF1 noch durch DNT transglutaminiert werden. Eine Besonderheit von RhoG ist, dass es zwar durch CNF1 deamidiert, aber nicht transglutaminiert wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass CNF1 und DNT, mit Ausnahme von RhoG, die gleiche Substratspezifität haben. Eine Frage, die sich zur Deamidierung durch CNF1 stellt, ist, warum in den Versuchen die Kontrollkurven, die die Ammoniakfreisetzung der Rho-GTPase ohne Toxin darstellen, auch gering abfallen, also eine Ammoniakentstehung zeigen. Eine Ursache ließ sich nicht sicher feststellen, aber möglicherweise entsteht in diesen Proben unspezifisch Ammoniak, z. B. durch die Zersetzung des Proteins durch die Lichtstrahlung im Fluoreszenzspektrometer. Aminosäuresequenzvergleich und Aminosäureaustausch Um zu klären, welche Aminosäuren für die Substratspezifität relevant sind, wurden die Aminosäuresequenzen der Switch-II-Regionen von RhoG, RhoD und RhoA verglichen und nicht identische Aminosäuren ausgetauscht. Über die Substratspezifität von CNF1 und DNT war zu Beginn der Arbeit bekannt, dass ein Peptid von 20 Aminosäuren (As 59-78) für die Modifizierung durch CNF1, aber nicht die von DNT, ausreicht. Innerhalb dieses Peptids sind die Aminosäuren 68 und 72 für die Modifizierung durch CNF1 und DNT notwendig (Lerm, 1999a). Die Versuche mit den RhoA-Mutanten ergaben, dass für die Transglutaminierung durch DNT und CNF1 auch die Aminosäuren Glutamat 64 und Aspartat 65 von Bedeutung sind. Für die Transglutaminierung durch DNT spielt außerdem Prolin 71 eine Rolle. Deamidierungsversuche mit der RhoA-Mutante RhoA E64D zeigten, dass Glutamat 64 für die Deamidierung durch CNF1 von Bedeutung ist. 70 Alle in RhoA identifizierten Aminosäuren, die für die Transglutaminierung oder die Deamidierung durch DNT oder CNF1 von Bedeutung sind, sind in Abb E2 zusammengefasst. 59 Asp Thr 63 Ala Gly Gln 64 65 Glu Asp Tyr 68 Asp Arg 71 Leu Arg Pro 72 Leu 78 Ser Tyr Pro Asp Thr Asp Abb. E2: Für die Substratspezifität von DNT und CNF1 notwendige Aminosäuren Dargestellt ist RhoA von Aminosäure 59 bis 78. Dunkelgrau unterlegt sind die für die Transglutaminierung oder Deamidierung notwendigen Aminosäuren, die in dieser Arbeit identifiziert wurden; hellgrau unterlegt sind die vorher bekannten notwendigen Aminosäuren (Lerm, 1999a). Lerm et al. haben gezeigt, dass Aminosäure 72 für die Deamidierung durch CNF1 notwendig ist, und dass ein Peptid von Aminosäure 59 bis 70 nicht deamidiert wird (Lerm, 1999a). Keine Aussagen wurden darüber gemacht, ob die Aminosäuren 59 bis 63 oder 72 bis 78 ebenfalls benötigt werden. Da nun gezeigt wurde, dass mehrere Aminosäuren in dem Abschnitt 63 bis 72 notwendig sind, lässt sich die Hypothese aufstellen, dass ein Protein, das die Sequenz 63QEDYDRLRPL-72 enthält (Abb. E2), das also alle notwendigen Aminosäuren für die Deamidierung besitzt, voraussichtlich ein Substrat von CNF1 wäre. Es ist aber auch möglich, dass einige der Aminosäuren 59 bis 63 bzw. 72 bis 78 für die Deamidierung essentiell sind. Dies wurde in dieser Arbeit nicht überprüft, da diese Aminosäuren in allen getesteten GTPasen übereinstimmen. Ein weiteres Protein mit der genannten Aminosäuresequenz ist RhoF/Rif. Es ist anzunehmen, dass diese Rho-GTPase voraussichtlich ein Substrat von CNF1 ist. Die Versuche mit den RhoD-Mutanten, die die Aminosäuren aus RhoA enthielten, ergaben, dass der Austausch nur einer Aminosäure (Aspartat 76 gegen Glutamat) in RhoD ausreicht, um die Transglutaminierung von RhoD durch DNT und CNF1 zu ermöglichen. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein kleiner Unterschied in der Aminosäuresequenz einer RhoGTPase große Auswirkungen auf ihre biologischen Eigenschaften haben könnte. Abbildung E3 zeigt die Kristallstruktur der Switch-II-Region von RhoA. 71 Abb. E3: Switch-II-Region von RhoA Die drei benachbarten Aminosäuren Gln 63, Glu 64 und Asp 65 sind dargestellt. Durch den Austausch von Glutamat 64 in RhoA gegen Glu 64 Aspartat werden Transglutaminierung und Asp 65 Deamidierung verhindert, obwohl sich diese Aminosäuren nur durch ein C-Atom Gln 63 unterscheiden. Die Seitenkette des Glutamats an Position 64 in RhoA ist nur um ein C-Atom länger als die des Aspartats, das an der entsprechenden Position (76) in Wildtyp RhoD vorkommt. Die negative Ladung der Carboxylgruppe des Glutamats ist daher gegenüber der des Aspartats verschoben. Es ist erstaunlich, dass dieser geringe Unterschied eine Auswirkung auf die Transglutaminierung hat. Vorstellbar ist, dass die Verschiebung der Ladungen, zu der es beim Austausch von Aspartat 76 in RhoD gegen Glutamat kommt, die Transglutaminierungsreaktion begünstigt, insbesondere wegen der Nähe zu Glutamin 63 (75, RhoD-Nummerierung). An den Tests mit RhoD und RhoG fiel weiterhin auf, dass DNT und CNF1 an derselben RhoGTPase nicht immer beide Reaktionen katalysieren, sondern dass eine Reaktion, Deamidierung oder Transglutaminierung, bevorzugt werden kann. RhoG Wildtyp wird z. B. von CNF1 deamidiert, aber nicht transglutaminiert, während die Mutante RhoD D76E zwar durch CNF1 transglutaminiert aber nicht deamidiert wird. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass unterschiedliche Aminosäuren der Rho-GTPasen einen Einfluss auf die Art der Modifizierung haben können. Die Erklärung für dieses Phänomen könnte in der Bindung des Kosubstrates liegen. Möglicherweise verhindern bestimmte Aminosäuren die Bindung des primären Amins für die Transglutaminierung, während andere die Bindung des Wassermoleküls für die Deamidierung erschweren. Vergleicht man das von Lerm et al. identifizierte RhoA-Peptid (As 59-78), das für Deamidierung und Transglutaminierung durch CNF1 ausreicht, mit dieser Region in RhoD D76E, das nur transglutaminiert wird, so fallen die Aminosäuren 73, 77 und 78 als abweichend auf. Möglicherweise haben sie einen entscheidenden Einfluss auf die Deamidierungsreaktion (Abb. E4). 72 RhoA RhoD D76E DTAGQEDYDRLRPL S YPD TD DTAGQEDYDRLRPL F YPD AN Abb. E4: Aminosäuresequenz 59-78 von RhoA und RhoD D76E grau unterlegt: abweichende Aminosäuren; Transglutaminierung und Deamidierung unterscheiden sich teilweise auch in Bezug auf ihre Auswirkungen, so dass es für die Wirkung des Toxins auf die Zelle von Bedeutung sein könnte, ob eine Rho-GTPase transglutaminiert oder deamidiert wird. Es kommt z. B. in mit DNT behandelten Zellen nicht wie in mit CNF behandelten zum „membrane ruffling“ (Pop, 2004), und in manchen Zellen führt DNT zur Zellabrundung (Pullinger, 1996) statt zur Zellabflachung. Diese unterschiedlichen Effekte könnten durch unterschiedliche Effektorbindung von transglutaminierten und deamidierten Rho-GTPasen verursacht werden. In Bezug auf RhoG ergibt sich aus den Ergebnissen die Frage, welche weiteren Aminosäuren in RhoG für die Substraterkennung durch CNF1 und DNT notwendig sein könnten. Im Gegensatz zu RhoD reicht der Austausch einer einzigen Aminosäure (Glutamat 63, RhoGNummerierung) in RhoG nicht aus, um es zu einem Substrat zu machen. In RhoD D76E sind offenbar alle weiteren Aminosäuren vorhanden, die für die Transglutaminierung durch DNT und CNF1 notwendig sind. Es ist denkbar, dass die nicht getesteten Aminosäuren der Switch-II-Region Threonin 69 und Asparagin 76 (RhoG-Nummerierung), durch die sich RhoG von RhoA unterscheidet, ebenfalls für die Transglutaminierung wichtig sind. Aber auch Aminosäuren der Switch-IRegion kommen in Betracht (Lerm, 1999a). In der Switch-I-Region unterscheiden sich RhoG und RhoD durch mehrere Aminosäuren voneinander. Von diesen könnte v. a. Lysin 32 (RhoA-Nummerierung) für die Substrateigenschaften von RhoG mit von Bedeutung sein. Die anderen GTPasen besitzen an dieser Position eine hydrophile bzw. neutrale Aminosäure, während Lysin basisch ist, sich also deutlich von ihnen unterscheidet (Tab.E1). 73 Rho-GTPase Switch-I-Region (As 32-41) Switch-II-Region (As 62-78) RhoA EVYVPTVFEN GQEDYDRLRPLSYPDTD RhoB EVYVPTVFEN GQEDYDRLRPLSYPDTD RhoC EVYVPTVFEN GQEDYDRLRPLSYPDTD Cdc42 SEYVPTVFDN GQEDYDRLRPLSYPQTD TC10 EEYVPTVFDH GQEDYDRLRPLSYPMTD Rac1 GEYIPTVFDN GQEDYDRLRPLSYPQTD RhoG KEYIPTVFDN GQEEYDRLRTLSYPQTN RhoD ESYSPTVFER GQDDYDRLRPLFYPDAN Tab. E1: Switch-I-Region und Switch-II-Region der getesteten Rho-GTPasen fett gedruckt: abweichende Aminosäuren; II Gewebstransglutaminase Substratspezifität Die Tests der Substratspezifität ergaben, dass die Gewebstransglutaminase die Rho-GTPasen RhoB, RhoC, RhoG, RhoD und TC10 alle in unterschiedlichem Ausmaß transglutaminiert. Damit wird bestätigt, dass die Gewebstransglutaminase eine geringe Substratspezifität besitzt. Welche Glutaminreste in den verschiedenen Rho-GTPasen durch die Gewebstransglutaminase modifiziert werden, kann aus diesen Ergebnissen nicht abgeleitet werden, da nicht nur ein einziges Glutamin in Frage kommt. RhoD besitzt beispielsweise von den in RhoA modifizierten Glutaminen 52, 63 und 136 nur das Glutamin an Position 63. Es besitzt aber vier weitere Glutamine und wird von der Gewebstransglutaminase transglutaminiert. RhoG besitzt Glutamin 63 und 136 und weitere 11 Glutamine. Ebenso hat TC10 zusätzlich zu Glutamin 52 und 63 weitere fünf Glutamine (Tab. E2). Es ist denkbar, dass außer den Glutaminen der Rho-Isoformen, die den RhoAGlutaminen 52, 63 und 136 entsprechen, weitere Glutamine modifiziert werden. Bei der breiten Substratspezifität der Gewebstransglutaminase ist es erstaunlich, dass Cdc42 und Rac1 nicht transglutaminiert werden, denn Rac1 besitzt Glutamin 63, und Cdc42 besitzt Glutamin 63 und 136 und fünf weitere Glutamine. Die Transglutaminierung von Cdc42 muss 74 folglich durch Aminosäuren in Cdc42 verhindert werden, die nicht mit denen von RhoA übereinstimmen. GTPase RhoA RhoB RhoC RhoD RhoG TC10 Rac1 Cdc42 RalA Modifizierte Gln in RhoA 52 63 136 52 63 136 52 63 136 63 63 136 52 63 63 63 63 136 weitere Gln 29 180 152 180 186 29 123 180 -8 1 47 4 45 76 145 150 163 93 118 143 4 76 143 4 76 118 -1 24 54 56 124 164 145 164 164 101 134 142 143 164 185 126 138 Tab. E2: Glutamine der getesteten Rho-GTPasen Dargestellt sind die Glutamine aller getesteten Rho-GTPasen; RhoA-Nummerierung; Aminosäuresequenzvergleich und Aminosäureaustausch Um zu klären, welche Aminosäuren die Transglutaminierung verhindern, wurden die Aminosäuresequenzen von RhoA und Cdc42 verglichen und RhoA-Mutanten hergestellt. In RhoA ist die Region, in der Glutamin 136 liegt (As 135-140), der so genannten Transglutaminase-Konsensus-Sequenz sehr ähnlich, einer Aminosäuresequenz (GQDPVK), die ein besonders effektives Substrat der Gewebstransglutaminase ist. Cdc42 unterscheidet sich in dieser Region durch drei Aminosäuren von RhoA (Tab. E3). Für die Untersuchung der Substratspezifität wurden die Aminosäuren 137 und 140 in RhoA gegen die in Cdc42 vorkommenden Aminosäuren ausgetauscht, da sich deren Seitenketten sehr unterschieden. GTPase RhoA Cdc42 „Konsensus-Sequenz“ G Q D P V K Q E P V K Q K P I (As 135-140) K K T Tab. E3: Aminosäure 135-140 von RhoA und Cdc42 fett gedruckt: abweichende Aminosäuren; Die Tests der RhoA-Mutanten zeigten, dass weder das Lysin an Position 137 noch das Threonin an Position 140 die Transglutaminierung verhinderten. Daraus lässt sich schließen, dass weder Glutamat 137 noch Lysin 140 in RhoA für diese Reaktion notwendig sind. Die Transglutaminase-Konsensus-Sequenz ist nicht als Abfolge von Aminosäuren definiert, die alle notwendig für die Transglutaminierung sind, sondern als sehr effektives Substrat der 75 Gewebstransglutaminase. In diesem Sinne lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit interpretieren. Obwohl die Region in RhoA, die der Konsensus-Sequenz entspricht, abgeändert wurde, findet eine Transglutaminierung statt. Darin zeigt sich die Flexibilität der Gewebstransglutaminase in ihrer Substratspezifität. Eher unwahrscheinlich erscheint die Möglichkeit, dass Glutamin 136 durch die Mutationen tatsächlich nicht mehr transglutaminiert wird und dies aufgrund der Transglutaminierung von Glutamin 63 nicht erkennbar ist. Da Glutamin 136 in RhoA sehr stark transglutaminiert wird, wäre zumindest eine Verringerung der Fluoreszenz zu erwarten, wenn dort keine Modifizierung mehr statt fände. Daher bleiben trotzdem die Fragen, warum Cdc42 nicht transglutaminiert wird, obwohl die Gewebstransglutaminase ansonsten so unspezifisch ist, und welche Aminosäuren die Transglutaminierung verhindern. Eine Ursache dafür, dass die RhoA-Mutanten weiterhin transglutaminiert werden, könnte darin liegen, dass sich Cdc42 in der untersuchten Region gleichzeitig in drei Aminosäuren von RhoA unterscheidet. In dieser Arbeit wurde aber jeweils nur eine Aminosäure ausgetauscht. III Ausblick Die wichtigste Frage, die sich aus den vorliegenden Ergebnissen ergibt, ist die nach den Aminosäuren in einer Rho-GTPase, die eine Transglutaminierung bzw. eine Deamidierung ermöglichen. Bisher sind als Faktoren, die sich darauf auswirken, ob eine Transglutaminierung oder eine Deamidierung stattfindet, das Toxin und das Kosubstrat (Schmidt, 1998) bekannt. Im aktiven Zentrum von DNT gibt es negative Ladungen, die in CNF1 nicht vorkommen (Buetow 2001), und die wahrscheinlich die Bindung des Kosubstrates für die Transglutaminierung begünstigen. Es wäre interessant, genauer zu untersuchen, wie sich die Aminosäuresequenz des Substrates darauf auswirkt, ob eine Deamidierung oder eine Transglutaminierung katalysiert wird. Des Weiteren lässt sich ausgehend von den Ergebnissen der Unterschied zwischen RhoG und RhoD genauer charakterisieren. Der Austausch weiterer Aminosäuren in RhoG kann mehr Aufschluss über Strukturen der Rho-GTPasen geben, die für die Substraterkennung durch CNF1 und DNT notwendig sind. Das Ergebnis, dass RhoD durch den Austausch von Aspartat 64 (76, RhoD-Nummerierung) zum Substrat von DNT und CNF1 wird, könnte Anlass zur weiteren Erforschung der Substratspezifität bakterieller Toxine geben. RhoD D76E könnte daraufhin getestet werden, 76 ob es Substrat für andere bakterielle Toxine ist. Möglicherweise gibt es Parallelen zwischen verschiedenen Toxinen in Bezug auf die Bindung des Substrates. Aufgrund der Identifizierung mehrerer notwendiger Aminosäuren in der RhoA-Region 63 bis 72, wäre es interessant zu testen, ob RhoF/Rif, das die notwendigen Aminosäuren in dieser Region besitzt, auch durch CNF1 deamidiert werden kann. Diese Untersuchung könnte weiteren Aufschluss über die Substratspezifität geben, da sich die Sequenz von RhoF/Rif zwischen Aminosäure 72 und 78 von den anderen getesteten Rho-GTPasen unterscheidet. Die hier beschriebenen Ergebnisse über die Gewebstransglutaminase regen dazu an, bei der Charakterisierung ihrer Substratspezifität nicht mehr nach Aminosäuren zu suchen, die die Transglutaminierung ermöglichen. Viel interessanter wäre die Suche nach Aminosäuren, die die Modifizierung effektiv verhindern. In dieser Arbeit wurde keine Aussage darüber gemacht, welche Glutamine die Gewebstransglutaminase in den verschiedenen Rho-GTPasen modifiziert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie oder anhand von Kristallstrukturen der Rho-Isoformen könnten diese Glutamine identifiziert werden. Möglicherweise haben einige davon auch eine regulatorische Funktion, z. B. durch die Beeinflussung von Protein-Protein-Interaktionen. 77 F Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der bakteriellen Toxine CNF1, DNT und der eukaryoten Gewebstransglutaminase für die Substrate RhoA, Rac1, Cdc42, RhoB, RhoC, TC10, RhoG und RhoD untersucht. Mit Hilfe einer Transglutaminierungsreaktion und der Bestimmung der Ammoniakfreisetzung wurden diese Rho-Proteine daraufhin getestet, ob sie Substrate von CNF1, DNT und der Gewebstransglutaminase sind. Zur Identifizierung von Aminosäuren, die für die Substraterkennung relevant sind, wurden gezielt die Aminosäuren in den Rho-Proteinen ausgetauscht, durch die sich Substrate und „Nicht-Substrate“ unterschieden. Die Ergebnisse zeigen, dass RhoA, Rac1, Cdc42, RhoB, RhoC und TC10 durch DNT transglutaminiert und durch CNF1 deamidiert werden. RhoD wird durch DNT und CNF1 weder transglutaminiert noch deamidiert. RhoG wird durch DNT und CNF1 nicht transglutaminiert, aber es wird durch CNF1 deamidiert. Die Versuche mit RhoA-Mutanten zeigen, dass Glutamat 64 und Aspartat 65 zu den Aminosäuren gehören, die für die Transglutaminierung durch DNT und CNF1 notwendig sind. Prolin 71 ist außerdem für die Transglutaminierung durch DNT essentiell, und Glutamat 64 spielt auch für die Deamidierung durch CNF1 eine Rolle. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die Einführung von Glutamat an Position 76 in RhoD ausreicht, um die Transglutaminierung durch CNF1 und DNT zu ermöglichen. Diese Ergebnisse belegen, dass einzelne Aminosäuren in den Rho-GTPasen entscheidend für die Substraterkennung durch CNF1 bzw. DNT sind. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Gewebstransglutaminase RhoA, RhoB, RhoC, TC10, RhoG und RhoD modifiziert. Cdc42 und Rac1 sind keine Substrate der Gewebstransglutaminase. Der Austausch der Aminosäuren 137 und 140 in RhoA durch die entsprechenden Aminosäuren von Cdc42 führte nicht zu einer Verminderung der Transglutaminierung von RhoA durch die Gewebstransglutaminase. Glutamat 137 und Lysin 140 liegen in einer Region von RhoA, die der so genannten Transglutaminase-Konsensus-Sequenz ähnlich ist. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die Aminosäuren 137 und 140 in RhoA nicht für die Substraterkennung durch die Gewebstransglutamninase notwendig sind, und dass die Determinanten der Substraterkennung durch die Gewebstransglutaminase nicht strikt auf die Transglutaminase-Konsensus-Sequenz zurückgeführt werden können. 78 G Literaturverzeichnis Aeschlimann, D. and V. Thomazy (2000). "Protein crosslinking in assembly and remodelling of extracellular matrices: the role of transglutaminases." Connect Tissue Res 41(1): 1-27. Akimov, S. S. and A. M. Belkin (2001). "Cell surface tissue transglutaminase is involved in adhesion and migration of monocytic cells on fibronectin." Blood 98(5): 1567-76. Alberts, A. S. (2001). "Identification of a carboxyl-terminal diaphanous-related formin homology protein autoregulatory domain." J Biol Chem 276(4): 2824-30. Allen, W. 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Switch I Region RhoA-Nummerierung 1 14 19 54 RhoA -------------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVE RhoB -------------------MAAIRKKLVVVGDGACGKTCLLIVFSKDEFPEVYVPTVFENYVADIEVDGKQVE RhoC -------------------MAAIRKKLVIVGDGACGKTCLLIVFSKDQFPEVYVPTVFENYIADIEVDGKQVE Rac1 ---------------------MQAIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNAFPGEYIPTVFDNYSANVMVDGKPVN RhoG ---------------------MQSIKCVVVGDGAVGKTCLLICYTTNAFPKEYIPTVFDNYSAQSAVDGRTVN Cdc42---------------------MQTIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNKFPSEYVPTVFDNYAVTVMIGGEPYT TC10 -------MPGAGRSSMAHGPGALMLKCVVVGDGAVGKTCLLMSYANDAFPEEYVPTVFDHYAVSVTVGGKQYL RhoD -------MNASQVAGEEAPQSGHSVKVVLVGDGGCGKTSLMMVFAKGAFPESYSPTVFERYNATLQMKGKPVH RalA ----------MAANKPKGQNSLALHKVIMVGSGGVGKSALTLQFMYDEFVEDYEPTKADSYRKKVVLDGEEVQ Switch II Region 55 63 126 RhoA LALWDTAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCP-NVPIILVGNKKDLRNDEH RhoB LALWDTAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSVDSPDSLENIPEKWVPEVKHFCP-NVPIILVANKKDLRSDEH RhoC LALWDTAGQEDYDRLRPLSYPDTDVILMCFSIDSPDSLENIPEKWTPEVKHFCP-NVPIILVGNKKDLRQDEH Rac1 LGLWDTAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLICFSLVSPASFENVRAKWYPEVRHHCP-NTPIILVGTKLDLRDDKD RhoG LNLWDTAGQEEYDRLRTLSYPQTNVFVICFSIASPPSYENVRHKWHPEVCHHCP-DVPILLVGTKKDLRAQPD Cdc42LGLFDTAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLVCFSVVSPSSFENVKEKWVPEITHHCP-KTPFLLVGTQIDLRDDPS TC10 LGLYDTAGQEDYDRLRPLSYPMTDVFLICFSVVNPASFQNVKEEWVPELKEYAP-NVPFLLIGTQIDLRDDPK RhoD LQIWDTAGQDDYDRLRPLFYPDANVLLLCFDVTNPNSFDNVSNRWYPEVTHFCK-GVPIIVVGCKIDLRKDKV RalA IDILDTAGQEDYAAIRDNYFRSGEGFLCVFSITEMESFAATADFREQILRVKEDENVPFLLVGNKSDLEDKRQ Insert Reg. Isoprenylierung 127 191 RhoA TRRELAKMKQEPVKPEEGRDMANRIGAFGYMECSAKT-KDGVREVFEMATRAALQ-ARRGKKK-------SGCL RhoB VRTELARMKQEPVRTDDGRAMAVRIQAYDYLECSAKT-KEGVREVFETATRAALQ-KRYGSQNGCI----NCCK RhoC TRRELAKMKQEPVRSEEGRDMANRISAFGYLECSAKT-KEGVREVFEMATRAGLQ-VRKNKRR-------RGCP Rac1 TIEKLKEKKLTPITYPQGLAMAKEIGAVKYLECSALT-QRGLKTVFDEAIRAVLC-PPPVKKRKRK------CL RhoG TLRRLKEQGQAPITPQQGQALAKQIHAVRYLECSALQ-QDGVKEVFAEAVRAVLN-PTPIK-RGRS------CI Cdc42TIEKLAKNKQKPITPETAEKLARDLKAVKYVECSALT-QRGLKNVFDEAILAALE-PPE-TQPKRK------CC TC10 TLARLNDMKEKPICVEQGQKLAKEIGACCYVECSALT-QKGLKTVFDEAIIAILT-PKKHTVKKRIGSRCINCC RhoD LVNNLRKKRLEPVTYHRGHDMARSVGAVAYLECSARL-HDNVEAVFQEAAEVALSSRRHNFWRRIT----QNCC RalA VSVEEAKNRAEQWNVNYVETSAKTRANVDKVFFDLMR-EIRARKMEDSKEKNGKKKRKSLAKRIR-----ERCC 192 RhoA VL-----------------------RhoB VL-----------------------RhoC IL-----------------------Rac1 LL-----------------------RhoG LL-----------------------Cdc42IF-----------------------Tc10 LIT----------------------RhoD LAT----------------------RalA IL------------------------ Abb. H1: Alignment; Aminosäuresequenzen von RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, RhoG, Cdc42, TC10, RhoD und RalA 85 II Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Abb. A1: Stammbaum niedermolekularer GTP-bindender Proteine Abb. A2: Einteilung der Rho-Familie Abb. A3: GTP/GDP-Zyklus der Rho-GTPasen Abb. A4: 3D-Struktur von RhoA Abb. A5: Posttranslationale Modifikation Abb. A6: Wirkungsmechanismus von Rho am Zytoskelett Abb. A7: Wirkungsmechanismus von Cdc42 am Zytoskelett Abb. A8: Wirkungsmechanismus von Rac am Zytoskelett Abb. A9: Aufnahmemechanismen bakterieller Toxine Abb. A10: Struktur bakteriellen Toxine Abb. A11: Modifikationsmechanismen bakterieller Toxine Abb. C1: Prinzip des Westernblots Abb. C2: Transglutaminierungsreaktion Abb. C3: Nachweis der Ammoniakfreisetzung durch eine gekoppelte Reaktion Abb. D1: Messung der GTP-Bindung Abb. D2 und D3: Transglutaminierung durch DNT Abb. D4 und D5: Deamidierung durch CNF1 Abb. D6: Switch-II-Regionen aller getesteten Rho-GTPasen Abb. D7: Transglutaminierung durch DNT (RhoG-Mutanten) Abb. D8: Transglutaminierung durch CNF1 (RhoG-Mutanten) Abb. D9: Transglutaminierung durch CNF1 (RhoD-Mutanten) Abb. D10: Transglutaminierung durch DNT (RhoD-Mutanten) Abb. D11: Deamidierung durch CNF1 (Westernblot, RhoA-Mutanten) Abb. D12: Deamidierung durch CNF1 (Nachweis der Motilitätsänderung, RhoD-Mutanten) Abb. D13-D15: Transglutaminierung durch die Gewebstransglutaminase Abb. D16: Vergleich der Aminosäuresequenzen von RhoA und Cdc42 mit der Transglutaminase-Konsensus-Sequenz Abb. D17: Transglutaminierung durch Gewebstransglutaminase (RhoA-Mutanten) Abb. E1: Modifizierung der Rho-GTPasen durch DNT, CNF1 und tTG Abb. E2: Für die Substratspezifität von DNT und CNF1 notwendige Aminosäuren Abb. E3: Switch-II-Region von RhoA Abb. E4: Aminosäuresequenz 59-78 von RhoA und RhoD D76E Abb. H1: Alignment; Aminosäuresequenzen von RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, RhoG, Cdc42, TC10, RhoD und RalA 86 Tab. A1: Übersicht Rho-GTPasen modifizierende bakterielle Toxine Tab. D1: Transglutaminierung durch DNT – Übersicht Tab. D2: Deamidierung durch CNF1- Übersicht Tab. D3: Mutanten von RhoA, RhoG und RhoD zur Untersuchung der Substratspezifität von DNT und CNF1 Tab. D4: Transglutaminierung durch die tTG – Übersicht Tab. D5: Mutanten von RhoA zur Untersuchung der Substratspezifität der tTG Tab. D6: Zusammenfassung: Wildtyp Rho-GTPasen Tab. D7: Zusammenfassung: mutierte Rho-GTPasen Tab. E1: Switch-I-Region und Switch-II-Region der getesteten Rho-GTPasen Tab. E2: Glutamine der getesteten Rho-GTPasen Tab. E3: Aminosäure 135-140 von RhoA und Cdc42 III Ein- und Dreibuchstaben-Code der Aminosäuren A Ala Alanin C Cys Cystein D Asp Aspartat E Glu Glutamat F Phe Phenylalanin G Gly Glycin H His Histidin I Ile Isoleucin K Lys Lysin L Leu Leucin M Met Methionin N Asn Asparagin P Pro Prolin Q Gln Glutamin R Arg Arginin S Ser Serin T Thr Threonin V Val Valin W Trp Tryptophan Y Tyr Tyrosin 87 V Abkürzungen Aqua bidest. Aqua bidestillatum APS Ammoniumpersulfat As Aminosäure ATP Adenosintriphosphat BTRRM “Big Dye Terminator Ready Reaction Mix” CNF „cytotoxic necrotizing factor“, Zytotoxischer nekrotisierender Faktor Cpm “counts per minute” CTP Cytosintriphosphat ddNTP Didesoxy-NTP DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxy-NTP DNT „dermonecrotic toxin“, Dermonekrotisches Toxin DTT Dithiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure ExoS Exoenzym S GDP Guanosindiphosphat „-GL“ „glycin linker“ GlDH Glutamatdehydrogenase Gln Glutamin GST Glutathion-S-Transferase GTP Guanosintriphosphat Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure IPTG Isopropyl-1-Thio-α-D-Galaktopyranosid kb Kilobasen LB-Medium Luria-Bertani-Medium LCCs “large clostridial cytotoxins”, große clostridiale Zytotoxine NADH Nikotinamidadenosindinukleotid NTPs Nukleotidtriphosphate OD Optische Dichte PBS isotonischer Phosphatpuffer PCR Polymerasekettenreaktion Rpm “rounds per minute” SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese TEA Triethanolamin TEMED Tetraethylmethylethylendiamin Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol tTG “tissue Transglutaminase”, Gewebstransglutaminase, TG2 TTP Thymidintriphosphat WT Wildtyp 88 VI Lebenslauf Persönliche Daten Name: Ulrike Pack Wohnort: Draisstr. 4 79106 Freiburg Geburtsdatum: 07.09.1977 Geburtsort: Berlin Schulbildung 1984-90 Hansa-Grundschule Berlin 1990-97 Paul-Natorp-Oberschule Berlin 1997 Abitur Universitätsausbildung 1999 Beginn des Studiums der Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg 2001 Physikum 2002 Erstes Staatsexamen WS 2002/03 einsemestrige Vollzeitforschungstätigkeit am Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Universität Freiburg, Abteilung I, Prof. Dr. Dr. Aktories 2003 – 2005 parallele Fortführung von Studium und Labortätigkeit 2005 Zweites Staatsexamen
