4 Nukleinsäuren Tag 2

Biochemieseminar 5.4 Proteinsortierung
5.4
erstellt von H. Wolfes und J. Alves
Proteinsortierung
Die Proteinbiosynthese findet im eukaryontischen
Cytosol statt. Dabei können die Ribosomen entweder frei vorliegen oder an das endoplasmatische Retikulum (ER) gebunden sein. Proteine, die an der
Membran des ER synthetisiert werden, treten durch
die Membran hindurch oder werden in sie eingebaut.
Sie werden im Lumen glycosyliert oder modifiziert.
Durch Vesikeltransport können sie über den Golgiapparat, in dem sie weiter modifiziert werden, zur
Zellmembran oder in die Lysosomen gebracht werden. Ferner müssen Proteine aus dem Cytosol in den
Kern, in die Mitochondrien und die Peroxisomen
transportiert werden.
Signalpeptide SRP und SRP-Rezeptor
Die freien und am ER gebundenen Ribosomen sind
Proteinsortierungswege in der Zelle
strukturell identisch, die Lokalisation der Ribosomen hängt von den Proteinen ab, die am Ribosom synthetisiert werden. Sekretorische
Proteine enthalten eine kurze Peptidsequenz aus hydrophoben Aminosäuren am N-Terminus
des Proteins, die man Leadersequenz nennt. Diese kann vom Signalerkennungspartikel (SRP)
erkannt und gebunden werden.
Dabei wird die Translation angehalten.
Das SRP ist ein Komplex aus
einem
RNA-Molekül,
sechs
Proteinuntereinheiten und einem GTP. Es wird vermutet,
Kristallstruktur einer Domäne des E.coli SRP: Science
2000, 287, 1232-1239. Blau dargestellt ist die SRPRNA, rot zeigt die Phosphatreste der RNA. Das Protein
ist magenta hervorgehoben mit gelben Bereichen der
hydrophoben Aminosäuren in der Bindungsspalte.
Rechts im Vergleich die freie Form der SRP-RNA. Die
RNA verändert bei Bindung an das Protein allosterisch
ihre Struktur.
dass die im SRP enthaltene
RNA den Zugang zur A-Stelle
versperrt, indem sie an die
ribosomale RNA bindet.
Der Komplex aus SRP und
Ribosomen diffundiert im Cytosol bis er an einen in der ER-
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Membran verankerten SRP-Rezeptor bindet. Der SRP-Rezeptor besteht aus zwei verschiedenen Polypeptidketten. Nach der Bindung wird das GTP zu GDP hydrolysiert und das SRP
dissoziiert ab. Ein aus mehreren Proteinen bestehendes Translokon bindet die Leadersequenz
und ermöglicht die Synthese des gesamten Proteins durch die Membran hindurch.
Andocken eines Ribosoms an die ER-Membran und Weiterführen der Proteinsynthese
Das Protein-Translokon kann eine inaktive und eine aktive Konformation einnehmen. Nach
der Bindung des Signalpeptids geht das Translokon in die aktive Form über und zieht die
wachsende Proteinkette schlaufenförmig durch die Lipid-Doppelschicht. Das Translokon ist
also eine wässrige, in der Membran verankerte Pore. Nach der
vollständigen Translokation wird
wieder die inaktive Konformation
eingenommen, der zur LipidDoppelschicht offen und damit zu
den wässrigen Kompartimenten
Inaktives und aktives Translokon. Die Ribosomen sind
in dieser Zeichnung nicht wiedergegeben.
geschlossen ist. Dies hat zur
Folge, dass das hydrophobe Signalpeptid in die Doppelschicht diffundiert, wo es vom Protein
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abgespalten und später abgebaut wird. Es gibt einen verwandten, essentiellen Proteinsekretionsapparat in Bakterien, der zur Toxizität der Antibiotika Chloramphenicol und Tetracyclin
beiträgt, da er vermehrt abgebaut wird, wenn ihn Ribosomen „verstopfen“, die während der
Translation von zu sekretierenden Proteinen gehemmt werden.
ER-Retentions-Signal
Im Lumen des endoplasmatischen Retikulums assoziieren die Untereinheiten neu
synthetisierter Proteine, ferner werden sie gefaltet. Proteine, die permanent im ER verweilen
enthalten am C-Terminus eine kurze Aminosäuresequenz, die als Retentions-Signal dient.
Viele von ihnen unterstützen die Faltung von Proteinen (Chaperone), die in das Lumen des
ER synthetisiert wurden. Im Gegensatz zum Cytosol befindet sich im ER ein höher oxidiertes
Milieu, sodass hier Disulfidbrücken ausgebildet werden können. Die im ER lokalisierte
Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) katalysiert die Umbildung von S-S-Brücken, sodass die
stabilste Proteinkonformation gefunden werden kann.
Synthese membranständiger Proteine.
Bei der Synthese membranständiger Proteine läuft der Transport zum Translokon genauso ab
wie bei der Synthese luminaler oder sekretorischer Proteine. Auch hier wird die
Signalsequenz im Translokon erkannt und gebunden. Ist sie endständig, wird sie später
abgeschnitten. Zusätzlich enthalten membranständige Proteine eine Transmembransequenz.
Sie besteht aus hydrophoben Aminosäuren, die von der lipophilen Membran gut
aufgenommen werden können. Das Translokon öffnet sich und gibt dann die
Transmembranregion frei. Das Ribosom löst sich ab und translatiert im Zytosol weiter.
Ablauf der Synthese eines membranständigen Proteins mit einer Transmembrandomäne.
Kernständige Proteine
In eukaryontischen Zellkernen wird die Kernmembran durch etwa 4000 Kernporen perforiert.
Diese Poren besitzen eine achtfache Symmetrie, bestehen aus über 100 Proteinen und haben
ein Molekulargewicht von etwa 125x106 g/mol. Die Kernpore ist ein ringförmiges Gebilde,
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das in die Kernhülle eingebettet ist und in der Mitte den „zentralen Transporter“ enthält. Die
Grundstruktur bilden speichenartige Proteinuntereinheiten,
Nucleoporine (NUP), die in der zentralen Ebene symmetrisch
und zu beiden Seiten teils asymmetrisch aufgebaut sind.
Entsprechend werden sie als die symmetrischen bzw. nucleound cytoplasmatischen NUPs bezeichnet. Im Nucleoplasma
laufen die NUP Fibrillen aufeinander zu und bilden
käfigförmige (körbchenförmige) Strukturen.
Der Durchmesser des offenen Kanals kann zwischen 9 und 26
nm variieren. Es wird vermutet, dass es sich um einen
blendenartigen Verschluss handelt. Kleine Proteine werden per
Struktur der Kernpore
Diffusion durch die Kernporen in den Kern transportiert.
Größere Proteine, die vom Cytoplasma in den Kern gelangen sollen, enthalten ein Signal zur
nukleären Lokalisation. Das „nuclear localization signal (NLS) ist eine Sequenz von 4-8 meist
positiv geladenen (Lys, Arg)
Aminosäuren, die sich auf der
Oberfläche des Proteins befinden und auch doppelt im
Abstand von 10 Aminosäuren
vorliegen können. Die NLS
des Proteins wird von Importin α erkannt und gebunden.
Der Komplex wird durch die
Kernpore
transportiert.
Im
Zellkern assoziiert das G-Protein Ran in seiner GTP-Form,
die hier durch ein GDP-Austauschprotein eingestellt wird,
an Importin β, sodass Importin α und das eingeschleuste
Protein
freigesetzt
werden.
Importin α und der Importin
β-Ran(GTP)-Komplex werden
Import von Proteinen in den Zellkern mit der Kontrolle
durch das G-Protein Ran
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aus dem Kern geschleust. Hier
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wird das GTP hydrolysiert, und Ran(GDP) lässt Importin α und β für die Bindung eines neuen
NLS-Proteins frei. Die NLS ist hinreichend für den Transport in den Kern. Wird ein Protein,
das üblicherweise im Cytosol lokalisiert ist, mit einer NLS exprimiert, wird dieses Protein in
den Kern importiert.
NLS können auch
durch ein gebundenes Protein maskiert
sein. Dies verhindert
den
Kernimport.
Beispielsweise liegt
der GlucocorticoidTranslokation des Glucocorticoidrezeptors in den Zellkern nach Stimulation der Zelle mit Glucocorticoid
Rezeptor in Abwesenheit des Hormons
gebunden an das Chaperon Hsp90 im Cytoplasma vor. In diesem Komplex ist die NLS nicht
zugänglich. In die Zelle diffundiertes Glucocorticoid bindet an den Rezeptor. Dadurch wird
der Komplex mit Hsp90 aufgelöst. Die dann zugängliche NLS befähigt den Rezeptor durch
eine Kernpore geschleust zu werden. Er bindet an spezifische DNA-Sequenzen und reguliert
die Expression Glucocorticoid-abhängiger Gene.
Proteintransport in die Mitochondrien
Mitochondrien enthalten 1000 – 2000 Proteine, von denen die allermeisten im Kern kodiert
sind und im Cytosol synthetisiert werden. In den Membranen der Mitochondrien gibt es keine
Poren, die ein nativ gefaltetes Protein passieren lassen könnten, da gerade die innere
mitochondrielle Membran sogar für kleine Ionen sehr undurchlässig sein muss. Es sind bisher
5 Wege charakterisiert worden, wie die Proteine je nach ihren speziellen Anforderungen in
die verschiedenen Kompartimente und Membranen der Mitochondrien gebracht werden.
Für den Hauptweg (Weg 1 in der Abbildung), der vor allem die vielen Matrixproteine transportiert, haben diese eine N-terminale Signalsequenz, die eine amphiphile α-Helix mit einer
stark positiv geladenen und einer hydrophoben Seite bilden kann. Dieses Signal bindet an den
TOM40 (transport through outer membrane)-Komplex und leitet sie durch die Membran an
den TIM23 (transport through inner membrane)-Komplex weiter. Auch durch diesen Komplex wird das Signalpeptid unter Ausnutzung des Membranpotentials bis auf die Innenseite
der inneren Membran (negativ) gebracht, wo es durch Chaperone gebunden wird. Der ganze
Prozess erfordert auch auf der cytosolischen Seite die Hilfe von Chaperonen, da das Protein
entfaltet werden muss, um durch die Poren von TOM und TIM hindurch zu passen. Unter
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Import von Proteinen in die Mitochondrien
ATP-Verbrauch wird in der mitochondriellen Matrix das Protein mit Hilfe von Chaperonen
gefaltet und das Signalpeptid wird abgespalten. Die schnelle Bindung an Chaperone im
Mitochondrium verhindert ein „Zurückrutschen“ des Proteins ins Cytosol. Einige der Proteine
haben auch eine zweite interne, hydrophobe Signalsequenz. Sie werden von TIM nicht
vollständig in die Matrix entlassen, sondern in die innere mitochondrielle Membran sortiert.
Eine ganze Reihe wichtiger Membranproteine der Mitochondrien sind so hydrophob, dass sie
sich nicht im Cytosol falten können. Sie werden deshalb von Chaperonen im ungefalteten
Zustand gehalten und zum Mitochondrium gebracht. Sie haben dafür Signalsequenzen an
verschiedenen Stellen der Primärsequenz, die bisher nur schlecht charakterisiert sind.
Nachdem sie TOM passiert haben, werden sie im Intermembranraum von Chaperonen
gebunden und zum TIM22-Komplex der inneren Membran (Weg 2) oder TOB/SAMKomplex in der äußeren Membran (Weg 3) geleitet, von denen sie eingebaut werden.
Proteine für den Intermembranraum werden von TOM an den TIM40-Komplex weiter geleitet
(Weg 4), der sie oxidiert indem er ihre Faltung durch Disulfidbrücken stabilisiert. Die dabei
abgezogenen Elektronen werden über Cytochrom c in die Atmungskette eingeschleust.
Die dreizehn in den Mitochondrien codierten Proteine sind Untereinheiten der Komplexe der
Atmungskette und werden direkt von den mitochondriellen Ribosomen an OXA in der
inneren Membran abgegeben und gefaltet (Weg 5).
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In die Peroxisomen werden Proteine und sogar Proteinkomplexe in fertig gefaltetem Zustand
hineintransportiert. Zwar sind die Membranen relativ durchlässig für die Substrate der
peroxisomalen Enzyme, der Mechanismus des Transports über die Membran ist aber noch
weitgehend unverstanden. Klar ist nur, dass zwei Rezeptorproteine die peroxisomalen
Proteine an spezifischen, kurzen Signalsequenzen im Cytosol erkennen und zu den
Peroxisomen bringen. Zusammen mit weiteren membranständigen Proteinen findet dann die
Translokation statt.
Grundlegende Literatur:
Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S. 277-279
Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S. 187-190, 301307
Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S. 359-360, 365-372, 470
Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten:
Synthese von Proteinen am rauen endoplasmatischen Retikulum
•
SRP
•
SRP-Rezeptor
•
Translokator
•
Protein-Disulfid-Isomerase
•
Membranständige Proteine
Kerntransport
•
NLS
•
Importin
•
Ran
Proteintransport in die Mitochondrien
•
TOM-Komplex
•
TIM-Komplexe
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