immunobiology of surface‐assembled poly(i:c) - ETH E

DISS. ETH No. 20278 IMMUNOBIOLOGY OF SURFACE‐ASSEMBLED POLY(I:C) ON MICROSPHERES AS SAFE AND EFFICACIOUS IMMUNOSTIMULANT IN VACCINATION A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by ANNINA MARIA HAFNER Dipl. Natw. ETH Zürich born on March 19, 1979 citizen of Liestal, BL, and Holderbank, SO, Switzerland accepted on the recommendation of Prof. Dr. Jean‐Christophe Leroux, examiner Prof. Dr. Hans P. Merkle, co‐examiner Prof. Dr. Marcus Textor, co‐examiner PD Dr. Blaise Corthésy, co‐examiner 2012 SUMMARY 7 SUMMARY The development of modern subunit vaccines is focused on synthetic oligopeptides or ‐saccharides, highly purified recombinant proteins or defined viral subunits. Such antigens are highly pathogen‐specific and exhibit an excellent safety profile, but are often barely immunogenic and prone to degradation. Hence, they call for efficient delivery systems and potent immunostimulants, jointly denoted as adjuvants. Particulate delivery systems, such as emulsions, liposomes, nanoparticles and microparticles/microspheres, may address the issues of antigen degradation and facilitate the co‐formulation of both the antigen and the immunostimulant. Synthetic or isolated pathogen‐associated molecular patterns (PAMPs) represent a novel type of immunostimulants. Among others, synthetic mimics of viral double‐stranded (ds) RNAs, like polyriboinosinic acid‐polyribocytidylic acid, commonly denoted as poly(I:C), are promising candidates for immunostimulation against intracellular pathogens. Poly(I:C) signaling is primarily dependent on Toll‐
like receptor 3 (TLR3) and the melanoma differentiation‐associated gene‐5 (MDA‐5). It induces cell‐mediated immunity and a potent type I interferon response. However, stability and toxicity issues so far prevented the clinical application of poly(I:C) as it undergoes rapid ribonuclease‐based enzymatic cleavage and bears the potential for immune overstimulation and autoimmunity. In chapter I we address these concerns and phrase recommendations to improve the safety and efficacy of immunostimulatory dsRNA formulations as adjuvants in vaccination. We propose that such a formulation should (i) facilitate a locally‐restricted rather than a systemic administration, (ii) support the administration of very low immunostimulant dosages, (iii) actively or passively target poly(I:C) together with a co‐formulated antigen to antigen‐presenting cells (APCs), namely dendritic cells (DCs), (iv) control the activation of non‐
hematopoietic cells and, last but not least, (v) minimize the translocation of 8 SUMMARY poly(I:C) into the cytoplasm of non‐hematopoietic cells. We particularly discuss various technological means to meet these recommendations. In the experimental part of this PhD thesis, we evaluated the application of surface‐modified microspheres for the safe and efficacious delivery of surface‐assembled poly(I:C) as immunostimulant. The potential hazards of poly(I:C) to trigger systemic overstimulation or autoimmune disorders were attributed, among other causes, to the activation of non‐
hematopoietic cells. Therefore, we attempted to either hide surface‐
assembled poly(I:C) or reduce its recognition by TLR3 on non‐
hematopoietic cells by means of a poly(ethylene glycol) (PEG) corona. PEG coronas with increasing PEG chain densities ranging from open‐structured (“mushroom”) to densely packed (“brush”) architectures were built up through electrostatically‐driven surface assembly of a small library of polycationic poly(L‐lysine)‐graft‐PEG copolymers (PLL‐g‐PEG). Stable surface assembly of poly(I:C) was subsequently achieved by incubation of such microspheres in an aqueous poly(I:C) solution. In chapter II, as proof of concept, we evaluated the immunostimulatory potential of surface‐assembled poly(I:C) on PLL‐ and PLL‐g‐PEG‐coated polystyrene (PS) microspheres. In particular, we studied their capacity to induce the maturation of human monocyte‐derived dendritic cells (MoDCs), a commonly accepted in vitro model for DCs. Surface‐assembled poly(I:C) exhibited a strongly enhanced efficacy to stimulate maturation of MoDCs by up to two orders of magnitude, as compared to free poly(I:C). Multiple phagocytosis events were the key factor to enhance the efficacy. The cytokine secretion pattern of MoDCs after exposure to surface‐assembled poly(I:C) differed from that of free poly(I:C), while their ability to stimulate allogeneic T cell proliferation was similar. We postulate that a synergy between TLR3 and phagocytic signaling plays an important role in defining the resulting immune response to particulate adjuvant formulations with poly(I:C) as immunostimulant. In chapter III we assessed the efficiency of PLL‐g‐PEG‐coated PS microspheres to control their phagocytosis by non‐hematopoietic cells on SUMMARY 9 the one hand, and their potential to inhibit the immunostimulation of non‐
hematopoietic cells by surface‐assembled poly(I:C). For this purpose we used primary human foreskin fibroblasts (HFFs) as in vitro model with extracellular TLR3 expression. Fibroblasts are well known as non‐
professional phagocytes and play an important role in stimulating and modulating the response of the innate immune system. Notably, recognition of both surface‐assembled and free poly(I:C) by extracellular TLR3 on HFFs halted their phagocytic activity. Ligation of surface‐assembled poly(I:C) with extracellular TLR3 on HFFs could be controlled by tuning the grafting ratio g and thus the chain density of the PEG corona. When assembled on PLL‐5.7‐PEG‐coated microspheres, the PEG corona strongly inhibited the poly(I:C)‐mediated upregulation of class I major histocompatibility complex (MHC) molecule expression by HFFs. Secretion of interleukin (IL)‐6 by HFFs after exposure to surface‐assembled poly(I:C) was distinctly lower as compared to free poly(I:C). Thus, surface assembly of poly(I:C) may have potential to contribute to the clinical safety of this vaccine adjuvant candidate. In chapter IV, as the final step in this study, we expanded our concept to the clinically more relevant poly(lactic‐co‐glycolic acid) (PLGA) microspheres that were loaded with encapsulated tetanus toxoid (tt) as model antigen, further encoded as PLGA(tt). PLGA(tt) microspheres were manufactured by microextrusion‐based solvent extraction. Complementary to our previous studies with PS microspheres, negatively charged PLGA(tt) microspheres where equipped with a PEG corona either through coatings with PLL‐10.1‐PEG or with PLL‐2.2‐PEG, i.e., with an either open‐structured or a densely packed PEG corona, respectively. Alternatively, we used the two unPEGylated polymers PLL and protamine for surface modification. Subsequent surface assembly of poly(I:C) was performed as mentioned above. We evaluated the immunostimulatory potential of these PLGA(tt) formulations on MoDCs as well as HFFs. With respect to maturation‐related surface marker expression by MoDCs and their secretion of cytokines, surface assembly of poly(I:C) potentiated its efficacy by at least one order of 10 SUMMARY magnitude as compared to free poly(I:C). The capacity of MoDCs for directed migration was similar when matured with either surface‐
assembled or free poly(I:C). Phagocytosis of PLGA(tt) microspheres by HFFs was markedly inhibited by a dense PEG corona as well as by both free and surface‐assembled poly(I:C), while their phagocytosis by MoDCs remained unaffected. Differences in surface chemistry and particle size distribution of the PLGA(tt) formulations were discussed to explain contrasts to previous results with PS microspheres. Based on the results of this PhD thesis and the reviewed literature, it became apparent that free as well as surface‐assembled poly(I:C) profoundly affects non‐hematopoietic cells. In view of their broad PRR expression spectrum, we propose that when developing PAMP‐based immunostimulants, non‐hematopoietic cells deserve careful consideration. Within this context, PEGylated PLGA microspheres offer a versatile platform to meet the formulated recommendations as defined in chapter I and hold promise to improve both safety and efficacy of poly(I:C) as immunostimulant in vaccination. ZUSAMMENFASSUNG 11 ZUSAMMENFASSUNG Im Gegensatz zu klassischen Schutzimpfungen konzentriert sich die heutige Entwicklung der sog. Subunit‐Impfstoffe auf biotechnologisch hergestellte Oligopeptide oder ‐saccharide, hochaufgereinigte rekombinante Proteine oder definierte virale Fragmente. Diese modernen Antigene sind zwar hoch Erreger‐spezifisch, verfügen aber selbst kaum über immunogene Eigenschaften und sind sehr anfällig für Degradation. Sie benötigen daher Darreichungsformen, welche die empfindlichen Antigene schützen, und die Zugabe von Immunstimulanzien. Gemeinsam werden diese als Adjuvanzien bezeichnet. Partikuläre Darreichungsformen, wie Emulsionen, Liposomen, Nano‐ und Mikropartikel bzw. Mikrosphären zeigen vielfach das Potenzial, solchen Ansprüchen gerecht zu werden. Sie schützen das Antigen vor Degradation und ermöglichen eine kombinierte Formulierung mit geeigneten Immunostimulanzien. Synthetische oder isolierte Pathogen‐assoziierte molekulare Muster (engl.: pathogen­associated molecular patterns, PAMPs) stellen eine neue Kategorie von Immunstimulanzien dar. Unter anderem sind dies synthetisch hergestellte doppelsträngige (ds) Ribonukleinsäuren (dsRNA), wie das Polynukleotid Polyriboinosin‐Polyribocytidinsäure, abgekürzt Poly(I:C), welche als vielversprechende Kandidaten für eine Immunostimulation gegen intrazelluläre Erreger gelten. Solche Polynukleotide imitieren virale dsRNA und führen zu einer zellvermittelten Immunität und einer starken Interferon (IFN) Antwort vom Typ I. Die wichtigsten Rezeptoren für Poly(I:C) sind der Toll‐like‐Rezeptor 3 (TLR3) sowie MDA‐5 (engl.: melanoma differentiation­associated gene­5). Trotz seiner hervorragenden Immunstimulation haben geringe Stabilität und potentiell toxische Nebeneffekte von Poly(I:C) dessen klinische Anwendung bis heute verhindert. Insbesondere wurde Poly(I:C) im Tiermodell mit einer Überstimulation des Immunsystems und mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen in Zusammenhang gebracht. 12 ZUSAMMENFASSUNG Kapitel I dieser Dissertation setzt sich mit diesen Befürchtungen auseinander und erarbeitet Empfehlungen für eine sichere und wirksame Formulierung von dsRNA‐basierten Immunstimulanzien. Diese sollen (i) zu einer stark lokal begrenzten Exposition des Immunstimulanz führen, (ii) eine kleine aber wirksame Dosierung von Antigen und Immunstimulanz ermöglichen, und (iii) beide Stoffe entweder auf aktivem oder passivem Weg gezielt an Antigen‐präsentierende Zellen (APZ) heranführen, wie z.B. dendritische Zellen (DZ). Ausserdem sollten diese Formulierungen (iv) eine kontrollierte Aktivierung von nicht‐hämatopoetischen Zellen zulassen, letztlich aber (v) eine Translokalisation von dsRNA in das Zytoplasma dieser Zellen auf ein Minimum begrenzen. Insbesondere werden technologische Aspekte diskutiert, mit denen sich diese Anforderungen erfüllen lassen. Der experimentelle Teil dieser Dissertation untersucht den möglichen Einsatz von oberflächenmodifizierten Mikrosphären als sicheres und wirksames Darreichungsystem für auf deren Oberfläche assembliertes Poly(I:C) als Immunstimulanz. Das potenzielle Risiko, dass Poly(I:C) eine systemische Überstimulation des Immunsystems oder eine Autoimmunerkrankung auslöst, wurde unter anderem der starken Aktivierung von nicht‐hämatopoetischen Zellen zugeschrieben, wie z.B. Fibroblasten. In Anbetracht dessen wurde hier versucht, auf Oberflächen von Mikrosphären assembliertes Poly(I:C) mit Hilfe einer auf Polyethylenglycol (PEG) basierten Korona gegenüber nicht‐
hämatopoetischen Zellen zu maskieren. PEG‐Hüllen mit zunehmender PEG‐
Dichte wurden durch elektrostatische Beschichtung der Mikrosphären mit einer Serie polykationischer Pfropfpolymere vom Typ Poly(L‐Lysin)‐graft‐
PEG (PLL‐g‐PEG) erreicht. Durch anschliessendes Inkubieren solch PLL‐g‐PEG‐beschichteter Mikrosphären in einer wässrigen Poly(I:C)‐
Lösung konnte eine stabile Oberflächenassemblierung des anionischen Poly(I:C) erreicht werden. Um die Durchführbarkeit dieses Konzepts zu bestätigen untersucht Kapitel II die immunstimulierende Wirkung von Oberflächen‐
ZUSAMMENFASSUNG assembliertem Poly(I:C) auf 13 PLL‐ und PLL‐g‐PEG‐beschichteten Mikrosphären aus Polystyrol (PS). Dazu wurde deren Potenzial analysiert, die Maturierung von Monozyten‐abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDZ) (engl.: monocyte­derived dendritic cells) zu stimulieren. MoDZ sind ein weit verbreitetes In­vitro‐Modell für primäre humane dendritische Zellen. Verglichen mit freiem Poly(I:C) erwies sich Oberflächen‐assembliertes Poly(I:C) um bis zu zwei Grössenordnungen wirksamer. Ausschlaggebend war dabei, dass die MoDZ die Gelegenheit zur Phagozytose mehrerer Mikrosphären hatten. Ausserdem unterschieden sich die Zytokinsekretionsmuster der MoDZ nach Stimulation mit freiem von denen mit Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C). Hingegen war deren Fähigkeit vergleichbar, die Proliferation von allogenen T‐Zellen zu stimulieren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine synergetische Beziehung zwischen der Signalgebung über TLR3 und durch Phagozytose partikulärer Adjuvantien eine wichtige Rolle spielt. Sie beeinflusst einerseits die immunstimulierende Wirksamkeit von Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C), und moduliert andererseits die Immunantwort. In Kapitel III wurde der Einfluss der Dichte der PEG‐Korona auf die Phagozytose von PLL‐g‐PEG‐beschichteten PS‐Mikrosphären durch nicht‐
hämatopoetische Zellen untersucht. Als weiterer wichtiger Aspekt wurde abgeklärt, ob sich die Aktivierung nicht‐hämatopoetischer Zellen mittels Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C) durch eine PEG‐Korona geeigneter Dichte verhindern lässt. Dabei wurden humane Vorhaut‐Fibroblasten (engl.: human foreskin fibroblasts, HFF) als In­vitro­Modell mit extrazellulärer TLR3‐Expression verwendet. Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle bei der Einleitung und Regulierung der Immunantwort des angeborenen Immunsystems. Ausserdem sind sie als nicht‐professionelle Phagozyten bekannt. Bemerkenswerterweise führte die Stimulation der Fibroblasten mit freiem ebenso wie mit Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C) zur Hemmung derer phagozytischen Aktivität. Das Erkennen von Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C) durch extrazellulären TLR3 war abhängig vom PEGylierungsgrad des Polymers bzw. von der jeweiligen 14 ZUSAMMENFASSUNG Dichte der PEG‐Korona. Insbesondere die Beschichtung mit PLL‐5.7­PEG verhinderte eine Poly(I:C)‐induzierte Hochregulation von Haupthisto‐
kompatibilitätskomplex‐Molekülen (engl.: major histocompatibility complex, MHC) der Klasse I. Des Weiteren war die Sekretion von Interleukin‐6 nach Stimulation mit Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C) im Vergleich zu freiem Poly(I:C) stark reduziert. Somit besteht die Möglichkeit, dass eine Oberflächen‐Assemblierung von Poly(I:C) auf Mikrosphären massgeblich zur klinischen Sicherheit dieses Immunstimulanz beiträgt. Kapitel IV unternimmt als letzten Schritt dieser Dissertation den Versuch dieses Konzept auch auf einen klinisch relevanteren Typus an Mikrosphären zu übertragen, nämlich auf Mikrosphären aus dem biologisch abbaubaren Polylactid‐co‐Glycolid (engl.: poly(lactic­co­glycolic acid); PLGA). Als Modellantigen wurde Tetanus‐Toxoid (tt) verkapselt. Die im Folgenden als PLGA(tt) bezeichneten Mikrosphären wurden mittels Lösungsmittelextraktion durch Mikroextrusion in einem stationären Mikromischer hergestellt. Analog zu den PS‐Mikrosphären in den vorhergehenden Kapiteln wurden die PLGA(tt) zunächst mit Polymeren unterschiedlicher PEG‐Dichte beschichtet. Dazu wurden PLL‐10.1­PEG und PLL‐5.7­PEG eingesetzt. Als Alternative wurden auch zwei PEG‐freie polykationische Polymere untersucht, PLL und Protamin. Anschliessend wurde das anionische Poly(I:C) auf die kationischen Mikrosphären assembliert. In einem ersten Schritt wurde die immunstimulierende Wirkung solcher Mikrosphären sowohl an MoDZ als auch an Fibroblasten untersucht. Hinsichtlich Zytokinsekretion und Expression von Maturierungmarkern durch MoDZ zeigte Oberflächen‐assembliertes Poly(I:C) eine um mindestens eine Grössenordnung verstärkte Wirksamkeit im Vergleich zu freiem Poly(I:C). Das Potenzial von freiem und Oberflächen‐
assembliertem Poly(I:C), die Migration maturierter MoDZ in Richtung eines Chemokingradienten auszulösen, war vergleichbar. Die Phagozytose von PEGylierten PLGA(tt) durch Fibroblasten wurde durch eine dichte PEG‐
Korona merklich gehemmt. Ebenso führte die Stimulation der Fibroblasten mit freiem ebenso wie mit Oberflächen‐assembliertem Poly(I:C) zur ZUSAMMENFASSUNG 15 Hemmung ihrer phagozytotischen Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte weder eine PEG‐Korona noch Oberflächen‐assembliertes Poly(I:C) die Phagozytose durch MoDZ behindern. Unterschiede bezüglich typischer Muster der Zytokinexpression, der Aktivierung von MoDZ und Fibroblasten sowie der Phagozytose von oberflächenmodifizierten PLGA(tt)‐ im Vergleich zu PS‐Mikrosphären wurden auf eine unterschiedliche Oberflächenchemie und unterschiedliche Partikelgrössenverteilungen der beiden Typen an Mikrosphären zurückgeführt. Anhand der Ergebnisse dieser Dissertation und auf Grund der dabei zusammengetragenen Literatur konnte gezeigt werden, dass freies wie auch Oberflächen‐assembliertes Poly(I:C) weit reichende Auswirkungen auf nicht‐hämatopoetische Zellen hat. Da diese, neben TLR3 und MDA‐5, über ein breites Spektrum von weiteren Rezeptoren zur Erkennung anderer PAMPs verfügen, regen wir an, dass bei der Entwicklung von PAMP‐
basierten Immunostimulanzien deren Wirkung auf nicht‐hämatopoetische Zellen stärker berücksichtigt werden sollte bzw. einer gründlichen Evaluation bedarf. Innerhalb dieses Kontexts stellen PEGylierte PLGA‐
Mikrosphären eine viel versprechende Darreichungsform für Oberflächen‐
assembliertes Poly(I:C) dar. Aufgrund ihrer technologischen Vielfalt besitzen sie Potenzial, eine wirkungsvolle und sichere Anwendung von Poly(I:C) als Immunstimulanz in Impfstoffen zu ermöglichen.