Übersicht über verschiedene Eigenherstellungsverfahren von

Übersicht über verschiedene Eigenherstellungsverfahren von Thrombozytenkonzentraten
Einleitung
von Dr. Dr. Gernot Weibrich, Philipp Streckbein, Thilo Weibrich, Mainz
Derzeit sind auf dem deutschen Markt fünf verschiedene Eigenherstellungsverfahren für die Herstellung von
Thrombozytenkonzentraten durch den präprothetisch tätigen Chirurgen verfügbar. Aufgrund der
verschiedenen Möglichkeiten der Herstellungstechnik wird dabei zwischen den weitgehend offenen und den
halbgeschlossenen Verfahren unterschieden. Im Folgenden werden die verschiedenen Verfahren vorgestellt,
der jeweilige Herstellungsprozess beschrieben und die Vor- sowie Nachteile der Systeme genannt.
Bei der Gewinnung von Thrombozytenkonzentraten werden üblicherweise die Blutkomponenten mittels
Zentrifugation entsprechend der Schwerkraft aufgetrennt. Oft geschieht dies mittels zweier unterschiedlich
harter Zentrifugationsvorgänge.
Nach der ersten Zentrifugation (soft spin) finden sich basal die Erythrozyten, darüber der so genannte "buffy
coat" (mit vielen Leukozyten, ca. 25 Prozent der Thrombozyten) und darüber das plättchenreiche Plasma,
welches die restlichen Thrombozyten enthält (nach der Nomenklatur der amerikanischen Blutbank das
"eigentliche" PRP ¿ Platelet-rich Plasma) (Vengelen-Tylor V 1999).
Bei der zweiten Zentrifugation (hard spin) des plättchenreichen Plasmas (für die Indikation
Knochenoptimierung meist mit Buffy coat und 1 mm Erythrozytenschicht) werden die Thrombozyten vom
Plasma abgetrennt und das plättchenarme Plasma (PPP ¿ Platelet-poor plasma) vom basal liegenden
Thrombozytenpellet abgetrennt. Anschließend wird durch Vermischen des Thrombozytenpellets in einer
geringen Menge PPP das Thrombozytenkonzentrat hergestellt.
Als Bezeichnung für dieses Thrombozytenkonzentrat hat sich in der nationalen und internationalen
zahnmedizinischen Literatur die medizinisch eigentlich inkorrekte Bezeichnung "Patelet-rich Plasma" - PRP
eingebürgert.
Bei der Herstellung von Thrombozytenkonzentraten zur Optimierung der Knochenregeneration werden meist
auch die neu gebildeten Thrombozyten mit verwendet, die, wie Reeder und Mitarbeiter zeigen konnten, nach
der ersten Zentrifugation im obersten Millimeter der Erythrozytenschicht enthalten sind (Reeder, G. et al.
1993). Auch die Leukozyten im Buffy coat sollten nach Auffassung mehrerer Autoren nicht verworfen
werden, um deren Wachstumsfaktorengehalte und immunologische Eigenschaften nicht zu verlieren.
Derzeit sind verschiedene Eigenherstellungsverfahren für Thrombozytenkonzentrate (PRP) in Deutschland
verfügbar, welche im Folgenden vorgestellt werden sollen.
PRP-Kit
Die Fa. Curasan bietet seit Ende 1998 den PRP-Kit in Deutschland an. Damit war sie der erste Anbieter auf
dem deutschen Markt, welcher ein Set zur Eigenherstellung von Platelet-rich Plasma kommerziell anbot
(Abb. 1). Ergänzend wird von der Firma zur Herstellung von PRP mit dem PRP-Kit eine konventionelle
Laborzentrifuge (Labofuge 300, Fa. Heraeus) vertrieben (Abb. 2).
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Abb. 1: Bestandteile des PRP-Kits (Fa. Curasan) im Einzelnen
Abb. 2: Heraeus Labofuge 300
Zur Herstellung von PRP werden 8,5 ml Zitratblut in einer herkömmlichen Laborzentrifuge für zehn Minuten
bei 2.400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Es entsteht eine Auftrennung in Erythrozytenschicht, buffy
coat und Thrombozyten enthaltendes Plasma. Anschließend wird das gelbe, die Thrombozyten enthaltende
Plasma mit einer langen Kanüle unter gleichzeitiger Anwendung einer Lufteinlasskanüle mit Sterilfilter in
eine weitere Monovette überführt. Um die Thrombozyten in einem Pellet zu konzentrieren, erfolgt in dieser
Monovette ein zweiter Zentrifugationsschritt für 15 Minuten bei 3.600 Umdrehungen pro Minute.
Der Plasmaüberstand, welcher jetzt nur noch sehr wenige Thrombozyten enthält, wird dann - ebenfalls
wieder unter Verwendung einer langen Kanüle und einer Lufteinlasskanüle - auf etwa 0,3 bis 0,5 ml
reduziert. Das entstandene Thrombozytenpellet wird anschließend mit Hilfe eines konventionellen
Laborrüttlers in dem verbleibenden 0,3 bis 0,5 ml thrombozytenarmen Plasma resuspendiert, wodurch das
Thrombozytenkonzentrat entsteht.
Kritisch beurteilt werden muss die fragliche Zulassung von verwendeter Zentrifuge sowie eingesetzten
Monovetten für therapeutische Zwecke. Auch birgt die Verwendung von 9 cm langen Kanülen "frei Hand"
eine erhöhte Verletzungsgefahr für Anwender.
Der Vacutainer PRP-Kit
Der Friadent-Schütze-PRP-Kit besteht aus den gleichen Materialien wie der PRP-Kit von Curasan, es besteht
jedoch zusätzlich die Alternative, statt der von Curasan favorisierten Sarstedt Monovetten so genannte
Vacutainer (silikonisierte Glasröhrchen) zu verwenden, welche die unerwünschte Thrombozytenanhaftung an
die Monovettenwand reduzieren sollen. Die Vorgehensweise zur PRP-Herstellung ist ebenfalls analog.
Ergänzend wird auch von Friadent-Schütze zur Herstellung von PRP mit dem PRP-Kit eine konventio−nelle
Laborzentrifuge angeboten.
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Platelet Concentrate Collection System
Das Platelet Concentrate Collection System (PCCS, Fa. 3i - Implant Innovations Incorporated) war das
zweite in Deutschland verfügbare System zur Eigenherstellung von PRP durch den Chirurgen. Es ist ein
halbgeschlossenes Verfahren und für therapeutische PRP-Herstellung entwickelt und zugelassen.
Zur Herstellung von PRP liefert die Fa. 3i® ein Set zum Einmalgebrauch (Abb. 3). Dieses beinhaltet als
wesentliche Bestandteile eine Einwegvorrichtung zur Herstellung von Thrombozytenkonzentrat (PRP),
bestehend aus zwei flexiblen Plastik-Doppelbeuteln, die an der Unterseite einer Kunststoffplatte befestigt
sind. Die vier dazugehörenden Einfüll- bzw. Entnahmeventile der einzelnen Beutelabschnitte befinden sich
auf der Oberseite der Platte. Ergänzend wird von 3i® eine Zentrifuge der Firma International Equipment
Company (IEC Modell 7427) vertrieben (Abb. 4).
Abb. 3: Bestandteile des PCCS-Systems
Abb. 4: Aufsicht auf Rotorsystem und spezielle Doppel-Becher-Einsätze der
IEC-Centra®-CL-2-Zentrifuge
Zur Vorbereitung der Blutentnahme werden mit der 20-Gauge-Kanüle 6 ml ACD-A in eine 60-ml-Spritze
aufgezogen und mit 54 ml Vollblut aufgefüllt.
Nach dem Einfüllen des Blutes in den zuvor in die Zentrifuge eingebrachten PCCS-Beutel erfolgt die erste
Zentrifugation für drei Minuten und 45 Sekunden bei 3.000 U/min. Nach der ersten Zentrifugation wird der
mit dem Vollblut beladene Behälter vorsichtig aus der Zentrifuge entnommen und das Thrombozyten
enthaltene Plasma, der buffy coat und eine kleine Menge roter Blutkörperchen (ca. 1 ml) in den zweiten
Doppelbehälter überführt.
Anschließend erfolgt zur Trennung von thrombozytenarmem Plasma und Thrombozyten der zweite
Zentrifugationsschritt für 13 Minuten bei 3.000 U/min. Danach wird der nicht benötigte Überschuss an
thrombozytenarmen Plasma (Platelet-poor Plasma, PPP) in den ersten Doppelbeutel zurückgeführt. Die so im
zweiten Doppelbeutel verbliebenen Bestandteile (Thrombozyten, Platelet-poor Plasma, buffy coat und einige
Erythrozyten) (Abb. 5) werden anschließend manuel resuspendiert, wodurch das gewünschte
Thrombozytenkonzentrat (ca. 7 ml PRP) entsteht, welches in eine sterile Spritze aufgezogen wird (Abb. 6).
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Abb. 5: Dreifachschichtung nach zweiter Zentrifugation: gelbes Platelet-poor
Plasma (PPP) (oben), weiß-gelbliches Thrombozyten-Pellet (mittig), rötliche
Rest-Erythrozyten-Schicht (unten)
Abb. 6: Ca. 7 ml PRP können am Ende der Zentrifugation mit der Spritze
entnommen werden
Smart-PReP-System
Das Smart-PReP-System (Fa. Harvest) ist das zweite halbgeschlossene Verfahren auf dem deutschen Markt
und seit Beginn des Jahres 2001 verfügbar. Seit April 2001 wird optional auch ein System zur Herstellung
von "Prokoagulanz" (Gemisch aus Thrombin enthaltendem Serum und Calciumchlorid) als
Thrombozytenaktivator angeboten.
Die zur Herstellung des PRP aus Vollblut benötigten Materialien werden von Firma Harvest Technologies
Corporation ebenfalls in Einwegsets geliefert (PRP-1 tray pack). Der PRP-1 tray pack (Abb. 7) ist geeignet,
um 50 ml Vollblut zur Herstellung von 7 bis 10 ml PRP zu verarbeiten. Vorgefertigte Distanzhülsen zur
Wahl des gewünschten PRP-Volumens zur Herstellung von 7 oder 10 ml sind im PRP-1 tray pack enthalten.
Optional wird neben dem PRP-1 tray pack von der Firma Harvest Technologies Corporation der PRP-2 tray
pack angeboten, welcher geeignet ist, 100 ml Vollblut zu verarbeiten, wodurch ungefähr 10 bis 20 ml PRP
gewonnen werden können.
Zusätzlich vertreibt die Firma Harvest Technologies Corporation die zur PRP-Herstellung empfohlene
Zentrifuge SMP-1000i (Abb. 8).
Zur Herstellung von Platelet-rich Plasma mit dem Smart-PReP-System werden zunächst 7 ml des
Zitratantikoagulanz (ACD-A) in die 60-ml-Spritze gefüllt. Zusätzlich werden 2 ml ACD-A in den (kleineren)
Plasmaraum des Doppelbehälters eingefüllt. Anschließend werden bei Männern 48 ml und bei Frauen 53 ml
Vollblut in die 60-ml-Spritze venös entnommen und in den Doppelbehälter gefüllt (Abb. 9).
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Abb. 7: PRP-1 tray pack (links) mit optionalem PD-1i-Kit zur
Herstellung von autologem Prokoagulanz (rechts)
Abb. 8: Zentrifuge SMP-1000i
Abb. 9: Doppelbehälter des Smart-PReP-Systems zur
PRP-Herstellung
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Abb. 10: Dünnes weißes Thrombozytenpellet über der
Erythrozytenschicht am Boden des Plasmaraumes nach dem
Zentrifugenlauf (rechte Kammer)
Abb. 11: 7 (oder 10) ml PRP können aus dem Smart-PReP-System
entnommen werden
Nach nur einem (allerdings automatisiert zweistufig durchgeführten) Zentrifugationsvorgang von insgesamt
12 Minuten Gesamtdauer enthält der Plasmaraum des Doppelbehälters dann oberhalb einer dünnen Schicht
Erythrozyten das Thrombozytenpellet und das thrombozytenarme Plasma (PPP) (Abb. 10). Der Blutraum
enthält den größten Teil der Erythrozyten (27 ml).
Nach Entnahme des Doppelbehälters wird das überschüssige PPP, das nicht für die Resuspension des
Thrombozytenpellets erforderlich ist, mit einer stumpfen Kanüle in eine Spritze aspiriert und in der
Indikation der präprothetischen Chirurgie meist verworfen. Nach Resuspension des verbliebenen Volumens
entsteht je nach verwendeter Distanzscheibe 7 oder 10 ml Thrombozytenkonzentrat (Abb. 11).
PRGF-Kit nach Anitua
Mit dem PRGF (Plasma Rich in Growth Factors)-System (G.A.C. Medicale San Antonio, 15-5°, 01005
Vitoria-Espana) steht seit Herbst 2001 ein weiteres System zur Gewinnung von autologem
thrombozytenreichem Plasma (PRP) zur Verfügung Die vorgestellte Technik gewinnt mittels einer
Zentrifuge aus einer geringen Menge Eigenblut drei unterschiedliche Thrombozyten enthaltende
Plasmafraktionen, das "Plasma Poor in Growth Factors" (PPGF), das "Plasma with Growth Factors" (PGF)
und das "Plasma Rich in Growth Factors" (PRGF).
Die zur Herstellung des PRGF (Plasma Rich in Growth Factors) aus Vollblut benötigten Materialien
einschließlich der Zentrifuge (Bti. Implant Company S.L. Spain) (Abb. 12) werden als "Starter-Paket" mit
Materialien für ca. 30-50 Patienten vertrieben (Fa. Wieland, Deutschland). Optional ist zusätzlich ein
Thermogerät erhältlich, das die Bildung des Koagulums durch Erwärmung des PRGF auf Körpertemperatur
beschleunigt.
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Abb. 12: Zentrifuge (Bti. Implant Company S.L. Spain) zum Anitua PRGFSystem
Abb. 13: Mit Blut gefüllter Zitrat- Vacutainer
Abb. 14: Nach der Zentrifugation entsteht basal die rote Erythrozytenschicht,
darüber eine sehr dünne, kaum zu sehende Buffy-Coat-Schicht (Pfeil) und
oben die gelbe Plasma-Schicht
Abb. 15: Das Plasma wird manuell mit zwei verschieden großen Pipetten
aufgeteilt
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Abb. 16: Aus drei Vacutainern Vollblut gewinnt man 1,5 ml PPGF (links), 1,5
ml PGF (Mitte) sowie eine individuell unterschiedlich große Menge PRGF
(rechts)
Zur Herstellung von Plasma Rich in Growth Factors werden dem Patienten, abhängig von der benötigten
Menge PRGF, präoperativ 10 bis 30 ml venöses Blut in zwei bis sechs sterile Vacutainerröhrchen mit
3,8-prozentigem Natriumzitrat entnommen (Abb. 13). Nach Einbringen der gefüllten Vacutainerröhrchen
erfolgt eine Zentrifugation für 8 Minuten bei 1.800 U/min, wodurch sich Erythrozyten-, Buffy-coat- und
Plasmaschicht entwickeln (Abb. 14).
Die Trennung der Plasmaschicht in drei Fraktionen geschieht manuell durch vorsichtiges Abpipettieren. Die
Fraktion 1 (erste bzw. obere 0,5 ml) entspricht dem PPGF, die Fraktion 2 (nächste 0,5 ml) ist das PGF und
Fraktion 3 (noch im Röhrchen befindliches Restplasma oberhalb der Buffy-coat- und Erythrozytenschicht)
wird PRGF genannt.
Die Fraktionen 1 und 2 werden mit Hilfe der 0,5-ml-Pipette entnommen und in zwei zuvor zu öffnende sterile
rote Vacutainerröhrchen (ohne Zusatz) überführt. Die dritte Plasmafraktion wird je nach Hämatokrit
zwischen fünf- und 15-mal mit einer 0,1- ml-Pipette (0,5 bis 1,5 ml Gesamtvolumen PRGF pro entnommenes
Vacutainerröhrchen Vollblut) abpipettiert (Abb. 15) und in ein drittes steriles, geöffnetes
Vacutainer-Glasröhrchen überführt.
Diese Vorgehensweise wird bei allen zentrifugierten Vacutainerröhrchen analog durchgeführt, wodurch man
am Ende drei Vacutainerröhrchen mit den drei Plasmafraktionen erhält (Abb. 16). Die Menge des nach der
Zentrifugation gewonnenen Plasmas unterliegt einer gewissen individuellen, vom Hämatokrit abhängigen
Variabilität. Für jedes entnommene Vacutainerröhrchen Vollblut resultieren 0,5 ml PGF und 0,5 ml PPGF
und je nach Hämatokrit ca. 0,5 bis1,5 ml PRGF.
Nach Herstellung der verschiedenen Plasmafraktionen kann zur Verbesserung des intraoperativen Handlings
optional die Bildung des Plättchenagglutinates beschleunigt werden.
Durch Zugabe von 0,05 ml Calciumchlorid (10 %) pro 1 ml PRGF bildet sich bei Raumtemperatur innerhalb
von 5 bis 8 Minuten (Herstellerangaben) ein Koagel. Die Koagelbildung ist abhängig von der
Thrombozytenanzahl und der Verarbeitungstemperatur. Bei einer Temperatur von 37 °C (durch das optionale
Thermo-Gerät möglich) bildet sich das Koagel laut Herstellerangaben bereits innerhalb von 2 bis 3 Minuten.
Fazit
Auf dem deutschen Markt sind verschiedene Eigenherstellungsverfahren zur Gewinnung eines autologen
Thrombozytenkonzentrates (Platelet-Rich-Plasma/PRP) verfügbar. Diese Verfahren erfordern einen
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unterschiedlich hohen Grad an Sterilitätskautelen und reichen von völlig offenen Herstellungsverfahren über
die halbgeschlossenen zu den weitgehend geschlossenen Produktionsmethoden. Bei der Entscheidung für das
individuell auszuwählende Herstellungssystem sind verschiedene Kriterien für den jeweiligen Zahnarzt von
Bedeutung. Zu nennen sind hier beispielsweise die Erfahrung des Zahnarztes und des Mitarbeiterteams mit
dem sterilen Arbeiten sowie die Häufigkeit der PRP-Anwendung. Weitere Studien werden zeigen in wieweit
Unterschiede in der Zusammensetzung des hergestellten Produktes Bedeutung für die resultierende
biologische Wirkung haben. Die klinische Anwendung von PRP sollte bei derzeitig nur begrenztem
Kenntnisstand über die erforderlichen Rahmenbedingungen und daraus resultierenden biologischen
Auswirkungen weitestgehend auf klinische Studien begrenzt werden.
Korrespondenzadresse:
Johannes-Gutenberg-Universität Mainz
Klinik für Mund-, Kiefer- u. Gesichtschirurgie
Dr. Dr. Gernot Weibrich
Augustusplatz 2
55131 Mainz
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