Biochemie I_11
Werbung
Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression • Inhibitoren der Transkription: Rifampicin, Actinomycin α-Amanitin • Inhibitoren der Translation: Puromycin, Streptomycin, Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Rifamycin & Rifampicin inhibieren prokaryotische, aber nicht eukaryotische RNA-Polymerasen Rifampicin ist ein halbsynthetisches Derivat von Rifamycin B, das von Streptomyces mediterranei produziert wird. Actinomycin D • aus Streptomyces antibioticus • inhibiert DNA- und RNA-Polymerasen • interkaliert zwischen Basenpaare der dsDNA α-Amanitin (Amatoxine) • aus Amanita phalloides (Grüner Knollenblätterpilz) • Inhibiert v.a. eukaryotische RNA-Polymerase II u. III, aber nicht I, und nicht prokaryot. RNA-Polymerasen Puromycin (inhibiert die Translation) Bindet ohne EF-Tu die A-Stelle im Ribosom und es wird ein Peptidylpuromycin gebildet. Eine weiter Transpeptidierung kann nicht stattfinden. Chloramphenicol Bindet an die grosse Untereinheit und inhibiert die Peptidyltransferase Aktivität von prokaryotischen Ribosomen Tetracycline Binden an die kleine Untereinheit prokaryotischer Ribosomen und verhindert die Bindung von AminoacyltRNAs. Streptomycin Streptomycin und andere Aminoglycoside inhibieren die Initiation (bei hoher Konzentration) und verursachen bereits bei niedriger Konzentration Fehleinbau Diphterie-Toxin (inhibiert die Translation) Diptherie-Toxin ist ein Protein aus Corynebacterium diphteriae, das in der infizierten Zelle in zwei Fragmente gespalten wird. Ein Fragment ist ein Enzym, das ADP-Ribose auf ein modifiziertes Histidin im EF-2 überträgt und dadurch EF-2 inaktiviert. Methoden zur Analyse und Manipulation von DNA Techniken der Protein- und Nukleinsäure-Biochemie Klonierung in einen ExpressionsVektor Bestimmung der DNASequenz Transformation von E.coli oder andere Zellen Präparation von synthetischen Peptiden Protein Herstellung von spezifischen Antikörpern Gen oder cDNA Bestimmung der Aminosäuresequenz Synthetische Oligonukleotide als Sonden Herstellung spezifischer Antikörper Protein Analyse einer cDNA Bank mit Southern blotting Expression einer DNA Library und Analyse durch Western blotting Gen oder cDNA Klonierung von DNA 1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen. 2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden. 3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt. 4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren. Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenz erlaubt einfache Selektion der transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen Schnittstelle Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen. Diese Sequenzen sind meistens Palindrome. 7.1 Selected restriction enzymes Restriktionsenzyme schneiden DNA in definierte Stücke Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden Figure 7-7 Modifizierte Plasmid Vektoren enthalten Polylinker, die eine Klonierungen mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen ermöglichen. Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden Figure 7-24 Restriktionsfragmente können durch GelElektrophorese getrennt werden (Agarose Gel) Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder radioaktive Markierung Ethidiumbromid DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode (oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode) Die Sanger Methode Es werden 4 getrennte DNAPolymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs) Die Sanger Methode (II) Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet Chemische Synthese von DNA Molekülen: Festphasen-Synthese Chemische DNA Synthese Synthetische Peptide werden auch durch eine FestphasenMethode hergestellt (Bruce Merrifield) Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende Kopplung mit der nächsten Aminosäure Ablösen des fertigen Peptids DNA wird durch ‘Southern blotting’ spezifisch nachgewiesen mRNAs werden durch ‘Northern blotting’ spezifisch nachgewiesen PCR (Polymerase Chain Reaction) Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden. Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein. PCR (polymerase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction) PCR (polymerase chain reaction) Herstellung rekombinanter Proteine Überexpression eines Gens oder cDNA in - E. coli - S. cerevisiae - Insektenzellen (Bacculovirus-System) Industrielle Produktion rekombinanter Proteine Protein Beispeil /Anwendung Insulin Diabetes Gerinnungsfaktoren Faktor VIII (Hämophilie) Intereferone Virusinfektionen, Krebs Interleukine HIV, Krebs, Immunschwäche Monoklonale Antikörper Diagnostik Erythropoietin Anämie (Erythozytenprodukt.) Impfstoffe Virushüllproteine Wachstumshormon Kleinwuchs in vitro Mutagenese • Deletionen N- oder C-terminale Verkürzung Entfernen von Domänen • Substitutionen Gerichtete Mutagenese • Insertionen Cassetten Mutagenese • Designer Gene Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis) mit Hilfe der PCR Cassetten Mutagenese Gezielter Genaustausch
