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Aus der
Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Kardiologie und Angiologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Effekt des hERG-Aktivators NS1643 auf die kardiale
Repolarisation transgener Kaninchen mit Long QT
Syndrom in-vivo und in-vitro
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2010
von Anna Sophia Bahrke
geboren in Halle/Saale
Dekan:
1. Gutachter:
2. Gutachter:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum
PD Dr. med. Michael Brunner
Prof. Dr. med. Brigitte Stiller
Jahr der Promotion: 2011
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Das Long QT Syndrom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Physiologische Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1 Das kardiale Aktionspotential . . . . . . . . . . . . .
1.2.2 Die repolarisierenden K+ -Auswärtsgleichrichter . . .
1.2.3 Speziesunterschiede . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.4 Transmurale und regionale Verteilung von IKr und IKs
1.3 Das angeborene Long QT Syndrom . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Pathomechanismus des Long QT Syndroms . . . . .
1.3.2 Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.3 Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.4 Long QT Syndrom Typ 1 und Typ 2 . . . . . . . . . .
1.4 NS1643: Wirkmechanismus und publizierte Daten . . . . .
1.5 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2 Material und Methoden
2.1 Tiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 EKG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Substanzen und Bezugsquellen . . . . . . .
2.2.2 Infusionslösungen . . . . . . . . . . . . . .
2.2.3 Versuchsaufbau und Versuchsdurchführung
2.2.4 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 Langendorff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1 Substanzen und Bezugsquellen . . . . . . .
2.3.2 Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.3 Versuchsaufbau . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.4 Versuchsdurchführung . . . . . . . . . . . .
2.3.5 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Genotypisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 DNA-Extraktion . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.2 Polymerase-Kettenreaktion . . . . . . . . .
2.4.3 Gel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . .
2.4.4 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3 Ergebnisse
3.1 EKG (in-vivo) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1 QT- und RR-Intervall . . . . . . . . . .
3.1.2 Auftreten von Arrhythmien . . . . . .
3.2 Langendorff (in-vitro) . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 APD-Verkürzung . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Dispersion der MAPs . . . . . . . . . .
3.2.3 Effektive ventrikuläre Refraktärzeit . .
3.2.4 Adaptation der APDs an HF-Wechsel .
3.2.5 Mechanischer Alternans . . . . . . . .
3.2.6 Kontraktilität . . . . . . . . . . . . . .
3.2.7 Induzierbarkeit von Kammerflimmern
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4 Diskussion
4.1 EKG (in-vivo) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.1 QT- und RR-Intervall . . . . . . . . . .
4.1.2 Auftreten von Arrhythmien . . . . . .
4.2 Langendorff (in-vitro) . . . . . . . . . . . . .
4.2.1 APD-Verkürzung . . . . . . . . . . . .
4.2.2 Dispersion der MAPs . . . . . . . . . .
4.2.3 Effektive ventrikuläre Refraktärzeit . .
4.2.4 Adaptation der APDs an HF-Wechsel .
4.2.5 Mechanischer Alternans . . . . . . . .
4.2.6 Kontraktilität . . . . . . . . . . . . . .
4.2.7 Induzierbarkeit von Kammerflimmern
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5 Zusammenfassung
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6 Literaturverzeichnis
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7 Abkürzungen
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8 Danksagung
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9 Lebenslauf
98
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
1.3
1.4
Das kardiale Aktionspotential nach Hedley et al. (2009) . . . . . . . . . .
Kv LQT1 mit Mutationsstellen nach Chiang and Roden (2000) . . . . . . .
hERG-Kanal mit Mutationsstellen nach Chiang and Roden (2000) . . . . .
Speziesunterschiede der Aktionspotentialform nach Sampson and Henriquez
(2005) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Beispiel für Torsades de Pointes nach Chiang and Roden (2000) . . . . . .
1.6 Initiation von Torsades de Pointes nach El-Sherif et al. (1997) . . . . . . .
1.7 Frühe Nachdepolarisationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8 Zusammenhang zwischen elektrischem und mechanischem Alternans nach
Laurita and Rosenbaum (2008) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9 Schematisches EKG LQT1 nach Ruan et al. (2008) . . . . . . . . . . . . . .
1.10 Schematisches EKG LQT2 nach Ruan et al. (2008) . . . . . . . . . . . . . .
1.11 NS1643 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2.8
2.9
Cross-over Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Schema Langendorffmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Langendorff-Apparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Herz in der Langendorff-Apparatur . . . . . . . . . . . . . .
Lage der MAP-Elektroden . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Screenshot von Isoheart während eines LQT1-Experiments.
Versuchsprotokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Auswertung des mechanischen Alternans . . . . . . . . . . .
Gel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3.11
3.12
EKG-Beispiel eines LQT1-Kaninchens vor und nach NS1643
RR- und QT-Intervalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
QTindex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
EKG im Vergleich der Genotypen aufgezeichnet mit Isoheart
Beispiel der APD-Verkürzung eines LQT1-Kaninchens . . . .
Verkürzung der APD90 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Subgruppenanalyse der APD-Verkürzung bei LQT1 . . . . .
Effektive ventrikuläre Refraktärzeiten . . . . . . . . . . . . .
Effektive ventrikuläre Refraktärzeiten bei 3 Hz . . . . . . . .
Beispiele für APD-Adaptation . . . . . . . . . . . . . . . . .
APD-Adaptation bei HF-Wechsel von 3 Hz auf 4 Hz . . . . . .
Beispiel von MA bei LQT2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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3.13 Amplitude von mechanischem Alternans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.14 Abfall der Kontraktilität A: absolut, B: Basiswert normiert auf 100% . . . . . 64
Tabellenverzeichnis
1.1 Überblick über die Long QT Syndrome nach Hedley et al. (2009) . . . . . . 16
1.2 Diagnosekriterien des Long QT Syndroms nach Schwartz et al. (1993) . . . 23
1.3 Therapierichtlinien nach Roden (2008); Zipes et al. (2006) . . . . . . . . . 25
2.1 Versuchsprotokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1
3.2
3.3
3.4
APD90 -Werte bei Versuchsbeginn [ms] . . . . . . . . .
Häufigkeit von mechanischem Alternans Basismessung
Häufigkeit von mechanischem Alternans nach NS1643
Prävalenz von Kammerflimmern . . . . . . . . . . . . .
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Einleitung
1 Einleitung
1.1 Das Long QT Syndrom
Das Long QT Syndrom (LQTS) ist eine seltene Erkrankung mit verlängerter QT-Zeit im
EKG, die bei strukturell herzgesunden, häufig jungen Menschen zu lebensgefährlichen
ventrikulären Tachykardien vom Typ Torsade-de-Pointes, zu Synkopen und zum plötzlichen
Herztod führen kann (Moss et al., 1991). Die Prävalenz wird nach neusten Studien auf
1:2000 geschätzt (Schwartz et al., 2009). Ursächlich sind Abnormitäten der für das Aktionspotential verantwortlichen Ionenströme. Dabei sind Veränderungen der repolarisierenden
K+ -Ströme am häufigsten betroffen. Diese können durch Mutationen angeboren oder durch
medikamentöse Blockierung der Ionenkanäle erworben sein. Gegenstand dieser Studie ist
das angeborene Long QT Syndrom. Es wurde erstmals 1957 von Jervell und Lange-Nielsen
in Verbindung mit kongenitaler Taubheit, Synkopen, plötzlichem Herztod und verlängertem
QT-Intervall bei 4 Geschwistern beschrieben (Jervell and Lange-Nielsen, 1957). In dieser
Studie wird ein neuer therapeutischer Ansatz erstmalig an einem transgenen Tiermodell
untersucht werden. Zum Verständnis der zugrundeliegenden Pathomechanismen sollen
zunächst die physiologischen Grundlagen, das Aktionspotential der Herzmuskelzellen mit
den beteiligten Ionenströmen, im Besonderen die repolarisierenden K+ -Ströme, erläutert
werden.
1.2 Physiologische Grundlagen
1.2.1 Das kardiale Aktionspotential
Das kardiale, ventrikuläre Aktionspotential (AP) ist das Potential über der elektrisch isolierenden Zellmembran des Kardiomyozyten während einer Systole und der darauffolgenden
Diastole. Es wird durch das abgestimmte, aufeinanderfolgende Öffnen verschiedener Ionenkanäle der Kardiomyozyten hervorgerufen. Die dadurch generierten Ionenströme lassen
sich in depolarisierende (Na+ - und Ca2+ -) und in repolarisierende (K+ -) Ströme unterteilen.
7
Einleitung
Abbildung 1.1: Das kardiale Aktionspotential nach Hedley et al. (2009)
Einwärtsströme sind definitionsgemäß nach unten aufgetragen, Auswärtsströme nach oben
Das Aktionspotential wird in 5 Phasen (0–4) eingeteilt, wie in Abbildung 1.1 dargestellt.
Bei ausreichender Depolarisierung des Membranpotentials öffnen sich die spannungsgesteuerten Na+ -Kanäle, generieren den schnellen einwärtsgerichteten IN a und verschieben
das Membranpotential von -85 mV auf +40 mV. Sie sind somit für den schnellen Aufstrich
verantwortlich (Phase 0) und inaktivieren sehr schnell. Nach dem schnellen Aufstrich folgt
eine kurze, transiente Repolarisation, hervorgerufen durch die schnelle Inaktivierung der
Na+ -Kanäle und den transienten Auswärts-K+ -Strom Ito (Phase 1). Die Depolarisation des
Membranpotentials führt auch zur Öffnung der long-lasting Ca2+ -Kanäle. Diese inaktivieren
nur sehr langsam und somit bildet deren einwärtsgerichteter ICa−L das lange Plateau (Phase 2). Der Ca2+ -Einstrom triggert gleichzeitig die Ca2+ -Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, was zu einem enormen Anstieg der intrazellulären Ca2+ -Konzentration
führt und die Kontraktion ermöglicht (elektro-mechanische Kopplung). Gleichzeitig werden
durch die Depolarisation die K+ -Auswärtsgleichrichter geöffnet, deren Ströme aufgrund
ihrer Kinetik später als die ICa−L einsetzen. Während der Plateau-Phase konkurrieren
die Einwärts-Ca2+ -Ströme und die Auswärts-K+ -Ströme (IK ). Die Antriebskraft für den
K+ -Ausstrom ist bei diesem Membranpotential sehr hoch, und wenn die Ca2+ -Kanäle langsam inaktivieren, dominiert der K+ -Ausstrom und das Membranpotential strebt wieder
8
Einleitung
Richtung Repolarisation (Phase 3). Dabei ist hERG für die schnelle Komponente IKr und
Kv LQT1 für die langsame Komponente IKs der repolarisierenden K+ -Ströme verantwortlich. Ab einem gewissen Grad an Repolarisation deaktivieren hERG und Kv LQT1 und der
Einwärtsgleichrichter Kir2.1 stabilisiert mit seinem auswärtsgerichteten K+ -Strom (IK1 )
das Membranpotential in der Diastole auf -85mV, nahe dem K+ -Gleichgewichtspotential
(Phase 4). Weiterhin tragen geringere Ströme zum Aktionspotential bei, zum Beispiel
die des ATP-gesteuerten K+ -Kanals, der Na+ /K+ -ATPase und des Na+ /Ca2+ -Austauschers
(Nerbonne and Kass, 2005).
Ein Ungleichgewicht der eben beschriebenen Ionenströme führt zu Veränderungen der
Dauer und Form des Aktionspotentials und zu verschiedenen Herzrhythmusstörungen. Eine
Verringerung der repolarisierenden K+ -Ströme sowie eine Erhöhung der depolarisierenden
Na+ - und Ca2+ -Ströme führt zu einer verlängerten Dauer des Aktionspotentials und damit
zum Long QT Syndrom. Da es in dieser Arbeit um das angeborene Long QT Syndrom Typ1
und Typ2 durch Verringerung von IKs und IKr und die pharmakologische Modulation von
IKr geht, sollen diese beiden repolarisierenden K+ -Ströme nun genauer erläutert werden.
1.2.2 Die repolarisierenden K+ -Auswärtsgleichrichter
1.2.2.1 Die langsame Komponente der repolarisierenden K+ -Auswärtsgleichrichter:
IKs
KVL
QT1
NH2
NH2
mi
nK
COOH
COOH
Abbildung 1.2: Kv LQT1 mit Mutationsstellen nach Chiang and Roden (2000)
IKs beschreibt die langsamer aktivierende, nicht inaktivierende der beiden Komponen-
9
Einleitung
ten des repolarisierenden IK . Der Strom wird erzeugt durch das Zusammenspiel der 4
porenbildenden α-Untereinheiten von Kv LQT1, auch Kv 7.1, (Gen: KCNQ1) und der regulatorischen β-Untereinheiten der Gene KCNE1-5 (Bendahhou et al., 2005), von denen
minK (Gen:KCNE1) die am längsten bekannte und relevanteste ist (Sanguinetti et al., 1996;
Barhanin et al., 1996). Die α-Untereinheiten bestehen aus den intrazellulären N- und Cterminalen Domänen und 6 transmembranären Segmenten, von denen S5 und S6 die Pore
formen und S4 als Potentialsensor dient. Dies stellt die typische Form der spannungsgesteuerten K+ -Kanäle dar (Snyders, 1999). Es existiert weiterhin eine Spleißvariante von KCNQ1,
die Isoform 2, mit einem Anteil von 28% im humanen Ventrikel, die bei Co-Expression
einen dominant negativen Effekt gegenüber der Isoform 1 besitzt. Diese Isoform ist vor
allem in der midmyokardialen Zone (M-Zellen) vertreten (Péréon et al., 2000), resultierend
in den geringsten IKs und somit die wahrscheinliche molekulare Grundlage für die längste
Aktionspotentialdauer (APD) in dieser Schicht (Liu and Antzelevitch, 1995). Im Gegensatz
zu IKr zeigt IKs keine Inaktivierungseigenschaften, sondern erhöht sich graduell mit der
Depolarisation und trägt so wesentlich zur Plateauphase und Phase 3 des Aktionspotentials
bei (Niwa and Nerbonne, 2010; Nerbonne and Kass, 2005; Tamargo et al., 2004).
Die Bedeutung von IKs für die Repolarisation des myokardialen Aktionspotentials wurde durch Untersuchungen deutlich, die zeigten, dass eine Verringerung des Stroms mit
kardialen Arrhythmien assoziiert ist. Wang et al. entdeckten 1996, dass Mutationen im
kodierenden Gen für KCNQ1 zum Long QT Syndrom (LQT1) führen (Wang et al., 1996b).
Mutationen in KCNE1 führen zum LQTS Typ5 mit ebenfalls vermindertem IKs (Splawski
et al., 1997). Bei beiden Typen des Long QT Syndroms sind Bewegung und Emotionen
Trigger für ventrikuläre Tachykardien, wodurch eine sympathische Regulation von Kv LQT1
wahrscheinlich wurde. Der K+ -Strom wird durch β-adrenerge Stimulation entweder über
den cAMP/PKA- (Sanguinetti et al., 1991) oder über den Protein Phosphatase1/YotiaoSignalweg (Marx et al., 2002) erhöht, indem die Aktivierung beschleunigt und die Aktivierungskurve zu negativeren Potentialen hin verschoben wird (Han et al., 2001). Durch die
langsame Deaktivierung haben die Kanäle weiterhin nicht ausreichend Zeit vor dem nächsten AP in den geschlossenen Zustand überzugehen, wodurch offene Kanäle akkumulieren
und so den hohen IKs bei hoher Herzfrequenz ermöglichen (Ravens and Wettwer, 1998).
Die Blockierung von IKs unter normalen Bedingungen zeigt keine Verlängerung der APD
bei Kaninchen (Lengyel et al., 2001), während unter β-adrenerger Stimulation eine Verlängerung der APD bei Hunden festgestellt wurde (Han et al., 2001). Obwohl also IKs unter
10
Einleitung
normalen Bedingungen einen nur geringen Anteil des repolarisierenden IK bildet, bedeutet
die zusätzliche Aktivierung bei sympathischer Stimulation eine Limitierung der bereits
verlängerten APD. Somit ist die Rolle von IKs die einer Sicherheitsmaßnahme (Varro et al.,
2000) – eine Repolarisationsreserve bei APD-Verlängerung, um frühe Nachdepolarisationen
(EAD) und damit ventrikuläre Tachykardien zu verhindern. Während IKr durch Klasse III
Antiarrhythmika und zahlreiche weitere Medikamente blockiert wird, wird IKs selektiv
durch Chromanole blockiert (Bosch et al., 1998).
Seit 2004 sind ebenfalls gain-of-function Mutationen für KCNQ1 bekannt (Bellocq
et al., 2004). Diese führen zum Short QT Syndrome (Typ2) und sind mit Vorhofflimmern,
ventrikulären Tachykardien und plötzlichem Herztod assoziiert (Hong et al., 2005).
1.2.2.2 Die schnelle Komponente der repolarisierenden K+ -Auswärtsgleichrichter: IKr
NH2
hERG
Mi
RP1
NH2
COOH
COOH
Abbildung 1.3: hERG-Kanal mit Mutationsstellen nach Chiang and Roden (2000)
IKr beschreibt die schneller aktivierende Komponente des repolarisierenden IKr . 1995
beschrieben Sanguinetti et al. den Kanal des ether-a-go-go related genes (hERG) Kv 11.1
(Gen:KCNH2) mit nahezu identischen Leitungseigenschaften wie IKr (Sanguinetti et al.,
1995). Später wurde gezeigt, dass eine Regulierung der α-Untereinheiten durch die βUntereinheiten minK (Gen:KCNE1) (McDonald et al., 1997) und MiRP1 (Gen:KCNE2)
(Abbott et al., 1999) sowie weitere hERG-Isoformen durch alternatives Spleißen nötig
sind, um die nativen Leitungseigenschaften von IKr nachzubilden (London et al., 1997;
Larsen et al., 2008). Der Aufbau von hERG entspricht wie bei Kv LQT1 dem der spannungs-
11
Einleitung
gesteuerten K+ -Kanäle. Während des Ruhemembranpotentials ist der Kanal geschlossen
und öffnet bei Depolarisation kurz. Er besitzt hohe einwärtsgleichrichtende Eigenschaften,
die durch die spannungsabhängige, schnelle Inaktivierung bei Depolarisation verursacht
werden, wodurch IKr die lange depolarisierte Plateauphase (Phase 2) ermöglicht. Mit der
Repolarisation durch Inaktivierung der L-Typ-Ca2+ -Kanäle und der langsameren Aktivierung von IKs deaktiviert hERG langsam vom inaktiven Zustand über den offenen in den
geschlossenen Zustand. Durch die langsame Deaktivierungskinetik wird der hohe Strom
IKr in Phase 3 ermöglicht (Tamargo et al., 2004).
Die entscheidende Rolle von IKr für die Repolarisation wurde erstmals deutlich, als 1995
gezeigt wurde, dass dominant negative Mutationen in KCNH2 (Curran et al., 1995) zum
Long QT Syndrom (Typ2) führen. Mutationen in KCNE2 (Abbott et al., 1999) bilden das
Long QT Syndrom Typ6. Unter normalen Bedingungen ist IKr in Kaninchen (Cheng et al.,
1999), Hunden (Varro et al., 2000) und wahrscheinlich in Menschen (Cheng and Kodama,
2004) der wesentliche repolarisierende K+ -Strom. Seine pharmakologische Blockierung
führt zum viel häufigeren erworbenen Long QT Syndrom. IKr kann im Gegensatz zu IKs
durch Klasse III Antiarrhythmika blockiert werden und bildet deren Hauptangriffspunkt
(Sanguinetti and Jurkiewicz, 1990). Inzwischen sind aber eine Vielzahl an kardiologischen
und nichtkardiologischen Substanzen bekannt, die den hERG-Kanal blockieren, darunter
Antibiotika, Antipsychotika, Antidepressiva und Antihistaminika. Einen Überblick gibt die
Webseite: www.azcert.org. QT-verlängernde Substanzen wurden zum Hauptgrund der
Rücknahme vom Markt (Roden, 2004), weshalb jedes Medikament vor der Zulassung
in präklinischen Studien auf seine hERG-blockierenden Eigenschaften hin geprüft wird.
Allerdings wird eine genetische Komponente als zusätzliche Prädisposition für ventrikuläre
Tachykardien bei hERG blockierenden Substanzen immer wahrscheinlicher (Kannankeril
and Roden, 2007).
Im Gegensatz zu IKs galt IKr lange Zeit als nicht durch β-adrenerge Stimulation beeinflussbar (Sanguinetti et al., 1991). Allerdings zeigten spätere Studien eine Verringerung
von IKr nach Stimulation des β1 -Adrenorezeptors über eine Erhöhung von cAMP und
Aktivierung der Proteinkinase A (Karle et al., 2002; Cui et al., 2000) mit schnellerer Inaktivierung und Verschiebung der Aktivierungskurve zu depolarisierteren Potentialen hin.
Eine direkte Bindung von cAMP an hERG hingegen bewirkt eine Zunahme von IKr über
eine schnellere Aktivierung, wobei insgesamt der hERG-Strom über die schnellere Deaktivierung abgeschwächt ist (Cui et al., 2000). Somit könnte der Sympathikus auf IKr einen
12
Einleitung
gegensätzlichen Effekt als auf IKs haben. Weiterhin wurde gezeigt, dass bei Erhöhung der
Stimulationsfrequenz IKr bei höheren Frequenzen abfällt, während IKs zunimmt (Diness
et al., 2006).
Wie bei KCNQ1 führt eine gain-of-function Mutation in KCNH2 zum Short QT Syndrom (Typ 1), ebenfalls assoziiert mit Vorhofflimmern, ventrikulären Tachykardien und
plötzlichem Herztod (Brugada et al., 2004).
1.2.3 Speziesunterschiede
Maus
Kaninchen
Mensch
Abbildung 1.4: Speziesunterschiede der Aktionspotentialform nach Sampson and Henriquez (2005)
Zur Untersuchung der Ionenströme und Ursachen von Arrhythmien mussten Tiermodelle
entwickelt werden. Dafür wurden häufig Mäuse verwendet, da die Generierung transgener Mausmodelle relativ einfach ist (London, 2001; Charpentier et al., 2004). Jedoch
unterscheidet sich das Aktionspotential ventrikulärer Myozyten von Mäusen erheblich von
dem der Menschen. Das Aktionspotential ist kürzer und ohne ausgeprägte Plateauphase
(London, 2001; Nerbonne, 2004), wie in Abbildung 1.4 zu sehen. Bei Mäusen und Ratten
wird die Repolarisierung durch den transienten K+ -Auswärtsstrom Ito getragen und IKr
und IKs spielen nur eine sehr geringe Rolle (Wang et al., 1996a; Babij et al., 1998). Beim
Menschen hingegen bilden IKr und IKs die wesentlichen repolarisierenden Ströme, Ito
ist viel geringer ausgeprägt und hat während der Repolarisation keine Bedeutung (Cheng
and Kodama, 2004) (siehe Abbildung 1.1). Somit scheint das transgene Mausmodell für
die Untersuchung des LQTS ungeeignet (Nerbonne, 2004). Im Gegensatz dazu sind die
repolarisierenden Ströme von IKr und IKs bei Kaninchen (Veldkamp et al., 1993) und
Hunden (Liu and Antzelevitch, 1995) dem Menschen sehr ähnlich, mit einer ähnlichen
Morphologie der Aktionspotentiale und vergleichbaren Aktiverungs- und Deaktiverungs-
13
Einleitung
zeiten für IKr und IKs (Cheng and Kodama, 2004). Zur Untersuchung des kongenitalen
Long-QT-Syndroms und der Wirkung der IKr -Erhöhung wurde diese Studie daher mit
transgenen Kaninchen durchgeführt.
1.2.4 Transmurale und regionale Verteilung von IKr und IKs
Die Heterogenität der Expression der verschiedenen K+ -Kanäle und deren Untereinheiten
führen zu wesentlichen regionalen und transmuralen Unterschieden der Aktionspotentialdauer und -form (Nerbonne and Kass, 2005). Dies ist für die normale, in eine Richtung
verlaufende kardiale Erregungsausbreitung und damit für die geordnete Kontraktion von
entscheidender Bedeutung. Die Depolarisation verläuft von endokardial nach epikardial
und in umgekehrter Richtung von epikardial nach endokardial während der Erregungsrückbildung. Damit zeigt die transmurale Dispersion der Repolarisation (TDR) subepikardial
kürzere Aktionspotentialdauern als subendokardial. Dies ist übereinstimmend bei vielen
Säugetierspezies (Antzelevitch et al., 1991), unter anderem auch bei Kaninchen (Xu et al.,
2001; Idriss and Wolf, 2004). Diese unterschiedlichen Längen der Aktionspotentiale sind
auf die heterogene Distribution der K+ -Kanäle in den drei Schichten des Myokardes zurückzuführen. Sicouri und Antzelevitch entdeckten 1991 neben der subepikardialen und
subendokardialen Zellschicht Zellen im linksventrikulären Midmyokardium mit von den anderen Zellpopulationen verschiedenen elektrophysiologischen Eigenschaften und nannten
diese die M-Schicht (Sicouri and Antzelevitch, 1991). So wird heute von einer transmuralen
Heterogenität der drei Myokardschichten ausgegangen. Der transiente K+ -Auswärtstrom
Ito und IKs sind subepikardial höher als subendokardial, während IKr subendokardial und
subepikardial gleich ausgeprägt ist, wodurch die APDs subepikardial kürzer sind und eine
ausgeprägtere transiente Repolarisation (Phase1) haben als subendokardial (Wettwer et al.,
1994; Xu et al., 2001). Die längsten APDs transmural sind in der mittleren Myokardschicht,
den M-Zellen, vorzufinden (Sicouri and Antzelevitch, 1991), was auf niedrigere IKs -Ströme
zurückzuführen ist (Liu and Antzelevitch, 1995). Allerdings ist unklar, ob diese Experimente
an isolierten Myozyten auf das gesamte Herz übertragen werden können. Experimente
in situ zeigten geringere transmurale Unterschiede in den Refraktärzeiten (Anyukhovsky
et al., 1996).
Neben der transmuralen Dispersion können auch unterschiedliche Aktionspotentialdauern epikardial differenziert werden. Beim Kaninchen ist IK und besonders IKs basal
ausgeprägter als apikal, hingegen ist das Verhältnis bei IKr umgekehrt, mit einem ausge-
14
Einleitung
prägteren Strom apikal (Cheng et al., 1999). Dies resultiert in längere apikale als basale
APDs. Auch die Dauer und Form der Aktionspotentiale zwischen rechtem und linkem Ventrikel differieren. Bei Hunden sind die APDs rechts kürzer als links mit stärker ausgeprägterem
IKs im rechten Ventrikel, während IKr in beiden Ventrikeln gleich ist (Volders et al., 1999).
Abweichungen von dieser normalen Distribution der Ionenströme können zu einer
Vielzahl von angeborenen und erworbenen Erkrankungen mit lebensbedrohlichen Arrhythmien führen. Die angeborenen Ionenkanalerkrankungen unterteilen sich in das Long QT
Syndrom (LQTS), Short QT Syndrom (SQTS), Brugada Syndrom und die Katecholaminerge
polymorphe ventrikuläre Tachykardie (CPVT), von denen das LQTS das häufigste ist (Wilde,
2008).
Dieses soll nun ausführlicher dargestellt werden, mit genauerer Betrachtung der Typen 1
und 2, die Mittelpunkt dieser Studie sind. Zusätzlich werden die Pathomechanismen für die
gefährlichen Tachykardien, die Diagnostik und konventionelle und neuere Therapieansätze,
von denen der hERG-Öffner NS1643 in dieser Studie untersucht werden wird, erläutert.
1.3 Das angeborene Long QT Syndrom
Das kongenitale Long QT Syndrom ist eine Kanalopathie einer der für die Generierung des
Aktionspotentials verantwortlichen Ionenkanäle. Mittlerweile sind mehr als 700 Mutationen
in 12 Genen auf 8 Chromosomen beschrieben (Hedley et al., 2009).
Klinisch wird das LQTS in vier Formen eingeteilt, bezeichnet nach den Erstbeschreibern. Die häufigste Form (1:2500) ist das Romano-Ward-Syndrom (RWS) und wurde
erstmals 1963/1964 als autosomal-dominant vererbtes LQTS mit rein kardialem Phänotyp
geschildert (Romano et al., 1963; Ward, 1964). Das erstbeschriebene und schon erwähnte Jervell-Lange Nielsen Syndrom (Jervell and Lange-Nielsen, 1957) ist verbunden mit
kongenitaler Taubheit und einer autosomal-rezessiven Vererbung (Prävalenz: 1:50000).
Das JLNS ist neben dem RWS eine weitere klinische Form des LQT1 und LQT5. Die Reduktion von IKs führt durch verminderte K+ -Sekretion der Marginalzellen des Innenohrs
zu veränderter Endolymphhomeostase und damit zu kongenitaler Taubheit (Lee et al.,
2001). Weiterhin gibt es zwei seltenere Formen: Das Andersen Syndrom (AS, LQT7) kann
im Zusammenhang mit weiteren Arrhythmien, rezidivierenden Paralysen und skelettalen
Fehlbildungen auftreten (Andersen et al., 1971; Tristani-Firouzi et al., 2002). Das Timothy
Syndrom (TS, LQT8) ist mit ausgeprägtem LQTS, Syndaktylie, kongenitalen Herzfehlern,
15
Einleitung
Immundefekten und Autismus das schwerste der LQTS (Splawski et al., 2004).
Diese klinische Einteilung wird jedoch zunehmend durch die Einteilung nach der genetischen Ursache ersetzt. Einen Überblick über die Formen des LQTS gibt Tabelle 1.1.
Typ
Syndrom Gen
LQT1
Protein
KCNQ1
LQT2
RWS,
JLNS
RWS
LQT3
RWS
SCN5A
Nav 1.5
LQT4
RWS
ANK2
Ankyrin B
LQT5
KCNE1
MinK
LQT6
RWS,
JLNS
RWS
KCNE2
MiRP1
LQT7
AS
KCNJ2
Kir2.1
LQT8
TS
CACNA1C
Cav 1.2
LQT9
LQT10
LQT11
LQT12
RWS
RWS
RWS
RWS
CAV3
SCN4B
AKAP9
SNTA1
M-Caveolin
Nav β4
Yotiao
α1Syntrophin
KCNH2
Kv 7.1
(Kv LQT1)
Kv 11.1
(hERG)
Ionenstrom
Trigger
IKs ↓
Bewegung,
Emotionen
IKr ↓
Schlaf,
Geräusche,
Emotionen
IN a ↑
Ruhe,
Emotionen
IN a−K , Bewegung
IN a−Ca ↓
IKs ↓
Bewegung,
Emotionen
IKr ↓
Ruhe,
Bewegung
IK1 ↓
Ruhe,
Bewegung
ICa ↑
Bewegung,
Emotionen
IN a ↑
Ruhe, Schlaf
IN a ↑
Bewegung
IKs ↓
Bewegung
IN a ↑
Ruhe
Prävalenz[%]
bei LQTS
Patienten
40–50
35–45
2–8
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<0,1
<0,1
<0,1
RWS: Romano-Ward Syndrom, JLNS: Jervell und Lange-Nielsen Syndrom,
AS: Andersen Syndrom, TS: Timothy Syndrom
Tabelle 1.1: Überblick über die Long QT Syndrome nach Hedley et al. (2009)
Die Tabelle zeigt, dass sowohl verschiedene Genmutationen zum gleichen Phänotyp
führen können (Heterogenie), als auch die gleiche Genmutation verschiedene Phänotypen
hervorbringen kann (Pleiotropie). Bei gleichem Genotyp kann sich der Phänotyp des LQTS
also sehr unterschiedlich ausprägen (Priori et al., 1999). Diese variable Expressivität kann
auch zu reinen Mutationsträgern ohne Ausprägung des Phänotyps führen (Imboden et al.,
2006). Die Prävalenz von potentiell LQTS-verursachenden Mutationen wird auf 0,3 %–1 %
16
Einleitung
geschätzt (Berge et al., 2008), während die Prävalenz des LQTS deutlich darunter liegt.
Beim Menschen wurde eine Überlappung des QTc von 63 % zwischen Mutationsträgern
und Nicht-Trägern beschrieben (Vincent et al., 1992). Besonders bei Mutationen in KCNQ1,
die zum LQT1 führen, haben Patienten häufig ein normales QT-Intervall mit mehr als 30 %
asymptomatischen Mutationsträgern (Priori et al., 2003). Diese Patienten können dennoch
eine reduzierte Repolarisationsreserve und damit ein erhöhtes Risiko für ventrikuläre
Tachykardien haben (Morita et al., 2008).
Bei der Ausprägung des Phänotyps bestehen auch geschlechtsspezifische Unterschiede.
Frauen sind häufiger vom LQTS betroffen als Männer (Hashiba, 1992), was in einer
erhöhten Übertragung der LQTS-Mutationen auf Mädchen gegenüber Jungen sowie in
einer erhöhten Expressivität gründet (Imboden et al., 2006). Bis zur Pubertät ist das
Risiko für Torsades de Pointes (TdP) im Vergleich zu Mädchen bei Jungen höher, nach der
Pubertät allerdings steigt das Risiko bei Frauen und ist gegenüber Männern erhöht (Locati
et al., 1998). Das Risiko für TdP ist während der Schwangerschaft vermindert, aber post
partum gesteigert (Seth et al., 2007). So wird ein proarrhythmischer Effekt von Östrogenen
(Kurokawa et al., 2008) und ein protektiver Effekt von Testosteron (Ridley et al., 2008)
angenommen.
Weiterhin ist das kongenitale Long QT Syndrom bedeutsam bei der Aufklärung des
plötzlichen Kindstodes (SIDS) (Schwartz et al., 1998). Bei einer molekularen Studie mit
201 Fällen von SIDS wurden in 26 Fällen Mutationen in LQTS-auslösenden Genen gefunden
(Arnestad et al., 2007). Ein Rückschluss, dass es sich dabei um die Todesursache handelte,
ist jedoch aufgrund der variablen Expressivität nicht möglich. Ein Neugeborenen-Screening
ist dennoch Diskussionsgegenstand, mit dem Ziel, die frühen, tödlichen Erstmanifestationen
zu verhindern (Schwartz et al., 2009).
1.3.1 Pathomechanismus des Long QT Syndroms
1.3.1.1 Torsades de Pointes
Das Long QT Syndrom ist assoziiert mit ventrikulären Tachykardien vom Typ Torsade
de Pointes (TdP), Synkopen und plötzlichem Herztod, oft bei strukturell herzgesunden
jungen Menschen. Torsades de Pointes sind ventrikuläre Tachykardien mit Drehung der
Erregungsachse (el Sherif and Turitto, 1999), die ein charakteristisches Bild geben, wie
in Abbildung 1.5 zu sehen. TdP sind mit dem LQTS assoziiert und meist innerhalb von
Sekunden selbstlimitierend. Bei Repetition können sie Synkopen auslösen oder in Kam-
17
Einleitung
merflimmern übergehen, welches nicht selbstlimitierend ist, und damit zum plötzlichen
Herztod führen. Der Reentry-Mechanismus ist von vorzeitigen Kammererregungen (Extrasystolen (ES)) innerhalb kurzer Abstände getriggert. Pausen nach den ES führen zu einer
verlängerten Diastole und verlängertem nachfolgenden Aktionspotential. Neu-einfallende
ES können so auf die T-Welle treffen (R-auf-T-Phänomen) und TdP triggern (Morita et al.,
2008).
Abbildung 1.5: Beispiel für Torsades de Pointes nach Chiang and Roden (2000)
Die zugrundeliegende Basis in der Entstehung von TdP beim LQTS ist eine erhöhte
Dispersion bei verlängerten APDs und als Trigger für ES sind frühe Nachdepolarisationen
verantwortlich (Gallacher et al., 2007; Ueda et al., 2004). Beide Mechanismen sollen nun
erläutert werden.
1.3.1.2 Basis für Torsades de Pointes: erhöhte Dispersion
Wie schon beschrieben zeigen die K+ -Kanäle regionale und transmurale Heterogenitäten
in deren Expression. Die geringe Heterogenität der Repolarisation, die normalerweise
die unidirektionale Erregungsausbreitung erzeugt, kann beim LQTS durch die gestörte
Repolarisation vergrößert werden. Weiterhin ist unter normalen Bedingungen das Verhältnis
des Aktionspotentials zur Erregungsleitung sehr groß, so dass die Zellen sich lange in der
Refraktärzeit befinden und nicht vorzeitig stimuliert werden können. Diese Refraktärzeit
kann als effektive Refraktärzeit (ERP) gemessen werden (Varró, 2010). Somit lässt sich
zusammenfassend sagen, dass eine schnelle Leitung sowie eine homogene Repolarisation
angrenzender Myozyten die Entwicklung von Erregungskreisen verhindert.
Beim LQTS ist die Expression der Ionenkanäle verschoben und dadurch die Dispersion
der Repolarisation und der ERPs erhöht (Antzelevitch, 2007; Lubinski et al., 1998). Bei
erhöhter Dispersion kann ein zusätzlicher Stimulus, wie etwa eine Extrasystole, auf Zellen
mit kürzerer ERP treffen, während er bei anderen Zellen mit längerer ERP geblockt ist.
Diese Erregung würde dann mit einer langsameren Erregungsausbreitung ungeordnet von
18
Einleitung
Zelle zu Zelle wandern und zu Reentry-Kreisen, TdP oder Fibrillationen führen (Varró,
2010). Die erhöhte Heterogenität während der Repolarisation beim LQTS bildet somit die
Basis für kreisende Erregungen. Die Abbildung 1.6 zeigt sehr anschaulich ein Beispiel einer
Initiation von TdP mit anschließender konfuser, langsamer Erregungsausbreitung durch
das Herz.
Abbildung 1.6: Initiation von Torsades de Pointes nach El-Sherif et al. (1997)
Die dreidimensionale Aktivierungskarte des Herzen zeigt die Erregungsleitung nach fokaler endokardialer
Initiation (Stern in Feld 1) im Vergleich zum EKG. Die Schichten 1–5 stellen die Schnitte von Herzbasis (1) bis
Herzspitze (5) dar, die einzelnen Felder 1–54 den Weg der Erregung in Abständen von 20 ms.
1.3.1.3 Trigger für Torsades de Pointes: frühe Nachdepolarisationen
Neben der Basis bildet die verlängerte APD allerdings gleichzeitig den Ursprung der Trigger,
welche beim LQTS häufig die frühen Nachdepolarisationen darstellen (Yan et al., 2001).
Die Plateauphase (Phase 2) des Aktionspotentials wird getragen von dem Gleichgewicht
der depolarisierenden Ca2+ -Ströme (ICa−L ) und der repolarisierenden K+ -Ströme (IK , vor
allem IKs ). Bei Verringerung der IK ist somit ein Übermaß der ICa−L vorhanden, was zu
einer erneuten Depolarisation und damit zu EADs der Phase 2 führen kann (January and
19
Einleitung
Riddle, 1989). Weiterhin führen verlängerte Aktionspotentiale zu einem Ca2+ -Overload der
Zelle. Durch die im Verhältnis zu kurze Diastole bleibt weniger Zeit für die Entfernung von
Ca2+ aus der Zelle durch die Sarco-Endoplasmatische-Retikulum-Ca2+ -ATPase (SERCA)
und den Na+ -Ca2+ -Austauscher (NCX). Dies führt zu einem Ca2+ -Overload, der den NCX
zusätzlich antreibt. Der NCX transportiert dann 1 Ca2+ -Ion auswärts gegen 3 Na+ -Ionen
einwärts, was zu erneuter Depolarisation, zu EADs in Phase 3, führt (Burashnikov and
Antzelevitch, 1998; Varró, 2010). Im LQT7 mit Verringerung von IK1 sind als Trigger späte
Nachdepolarisationen (DAD) verantwortlich (Tristani-Firouzi et al., 2002).
Abbildung 1.7: Frühe Nachdepolarisationen
Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass durch die verschobene Expression der
Ionenkanäle einerseits die APD-Heterogenität erhöht wird und andererseits die APDs
verlängert werden, was zu erhöhter Induzierbarkeit von EADs führt. Somit bildet das
LQTS durch unterschiedliche Mechanismen sowohl die Grundlage als auch die Trigger für
Torsades de Pointes.
1.3.1.4 Kardialer Alternans
Ein weiteres Zeichen für die Heterogenität der Ropolarisation ist der kardiale Alternans
beim LQTS, der als mechanischer und T-Wellen Alternans (MA bzw. TWA) sichtbar wird
(Schwartz and Malliani, 1975). Mechanischer Alternans war schon früh als Pulsus alternans
messbar und wird in dieser Studie in Form von Alternans des linksventrikulären Drucks
(LVP) gemessen werden. Patienten mit T-Wellen Alternans haben ein erhöhtes Risikio für
ventrikuläre Tachykardien und kardiale Ereignisse (Rosenbaum et al., 1994), wodurch
TWA auch als eines der EKG-Merkmale in die Diagnosekriterien des LQTS eingegangen
ist, die noch vorgestellt werden (Schwartz et al., 1993). Mechanischem Alternans liegt
der TWA zugrunde und resultiert aus Alternans der APDs, besonders der M-Zone, und aus
Alternans im Ca2+ Zyklus (Surawicz and Fisch, 1992; Shimizu and Antzelevitch, 1999).
20
Einleitung
Dabei kann bereits geringer, kaum sichtbarer TWA relevanten APD-Alternans widerspiegeln
und klinisch bedeutsam sein (Cutler and Rosenbaum, 2009). Kardialer Alternans ist stark
frequenzabhängig mit einem vermehrten Auftreten bei höheren HF ab einer bestimmten
Schwellenfrequenz (Pastore et al., 1999). Bei dieser Frequenz wird die nötige Zeitspanne
zur vollständigen Deaktivierung einer oder mehrerer Ionenkanäle unterschritten und es
kommt zu Heterogenitäten der Ionenströme (Luo and Rudy, 1991). Der Hauptmechanismus für die Entstehung des APD-Alternans, der vor allem in Phase 2 und Phase 3 des
Aktionspotentials zu sehen ist, ist der Alternans im Ca2+ -Zyklus (Pruvot et al., 2004). Bei
gleichbleibender Herzfrequenz ist die Ca2+ -Abgabe des Ryanodinrezeptors (RyR) aus dem
Sarko-Endoplasmatischen Retikulum (SR) gleich der Aufnahme ins SR durch die SERCA.
Eine Erhöhung der Herzfrequenz kann nun zu Schwankungen der Ca2+ -Abgabe (Picht
et al., 2006; Xie et al., 2008) oder der Ca2+ -Aufnahme (Xie et al., 2008) und damit zu
einem alternierenden Ca2+ -Zyklus und alternierenden APDs führen. Zum Beispiel bedeutet
eine reduzierte Ca2+ -Aufnahme durch die SERCA einen vermehrten Antrieb des NCX mit
verlängerter Depolarisation und Aktionspotentialdauer. Andererseits inhibiert eine vermehrte Abgabe durch den RyR die L-Typ Ca2+ -Kanäle, was eine Verkürzung der APDs zur Folge
hat (Laurita and Rosenbaum, 2008).
EKG
APD
2
+
Ca
Abbildung 1.8: Zusammenhang zwischen elektrischem und mechanischem Alternans nach
Laurita and Rosenbaum (2008)
Pastore et al. zeigten erstmals auf zellulärer Ebene den Zusammenhang zwischen
TWA und Induktion von Kammerflimmern. Ab einer gewissen Schwellenfrequenz ging
konkordanter Alternans der Aktionspotentiale mit gleichmäßigem Lang-Kurz-Wechsel in
diskordanten Alternans, also Alternans in entgegengesetzter Phase mit Lang-Kurz- und
21
Einleitung
Kurz-Lang-Wechseln der APDs angrenzender Myozyten über. Damit vergrößert diskordanter
Alternans bereits bestehende Heterogenitäten der Repolarisation. Kammerflimmern ging
immer diskordanter Alternans voran, im Gegensatz zu konkordantem Alternans (Pastore
et al., 1999). Es zeigte sich, dass diskordanter Alternans in LQT2-Kaninchen höher und
bei niedrigeren Stimulationsfrequenzen auftritt als in LMC-Kaninchen (Ziv et al., 2009).
Somit lässt sich sagen, dass kardialer Alternans nicht zu Kammerflimmern führt, sondern
ein weiterer Ausdruck für Inhomogenitäten während der Repolarisation ist, die per se zu
kreisenden Erregungen führen, wie bereits erläutert.
Zur Analyse des Effekts von NS1643, wird in dieser Studie nicht nur die APD- und
QT-Verkürzung untersucht werden, sondern auch die Induzierbarkeit von Kammerflimmern
und die zugrundeliegenden Pathomechanismen in Form von APD-Dispersion, effektiven
ventrikulären Refraktärzeiten und mechanischem Alternans.
1.3.2 Diagnostik
Die Verlängerung des QT-Intervalls ist das wichtigste diagnostische Kriterium beim Long QT
Syndrom. Da sich das QT-Intervall aber mit sinkender Herzfrequenz verlängert, entwickelte
Bazett 1920 eine Formel zur Errechnung des frequenzadaptierten QT-Intervalls QTc =
√QT
RR
(Bazett, 1920). Diese Formel verliert bei hohen und niedrigen HF ihre Genauigkeit, gibt
aber in der Klinik ein gutes Orientierungsmaß. Zur Therapiekontrolle werden allerdings
auch dort zunehmend individuelle Regressionsformeln verwendet (Malik et al., 2002). In
dieser Studie werden ebenfalls genotypspezifische Regressionsformeln eingesetzt, die von
Brunner et al. entwickelt wurden (Brunner et al., 2008). Die klinischen Diagnosekriterien
des LQTS wurden 1993 von Schwartz entwickelt (Schwartz et al., 1993). Darin sind die
Hauptkriterien, wie in Tabelle 1.3.2 zu sehen, EKG-Befunde, klinische Anamnese und
Familienanamnese. Genetische Komponenten wurden noch nicht einbezogen.
Mit der Entdeckung der genetischen Ursache des LQTS 1995 wurden genetische Tests
unabdingbar für die Diagnostik und Risikostratifizierung (Schwartz, 2006). GenotypPhänotyp-Korrelationen zeigen, dass vom Genotyp auf das Risiko kardialer Ereignisse
geschlossen werden kann. So ist bei LQT1 das Risiko erheblich geringer als bei LQT2
oder LQT3 (Priori et al., 2003). Neben der Länge des QT-Intervalls kann die spezifische
Genmutation und bei Mutationen im gleichen Gen die exakte Lokalisation der Mutation
prognostische Bedeutung haben (Moss et al., 2007). Andererseits führt die erwähnte
variable Penetranz des LQTS zu Schwierigkeiten bei der Diagnostik und Risikostratifizierung
22
Einleitung
Punkte
EKG-Befundea
A
B
C
D
E
QTc
≥480 ms
460–480 ms
450 ms (bei Männern)
Torsades de Pointesb
T-Wellen Alternans
gekerbte T-Wellen in 3 Ableitungen
altersbezogen zu niedrige Herzfrequenz in Ruhec
Klinische Anamnese
A
Synkopeb
stressbedingt (psychisch/physisch)
ohne Stress
B
kongenitale Taubheit
Familienanamnesed
A
Familienmitgleider mit LQTS
plötzlicher Herztod bei FamilienmitB
gliedern unter 30 Jahren
3
2
1
2
1
1
0,5
2
1
0,5
1
0,5
a
QTc berechnet nach Bazett, ohne Medikation oder Funktionsstörungen, die das EKG beeinflussen. b Darf nicht bei beiden
Punkten zählen. c HF unterhalb der 2. altersentsprechenden Perzentile. d Das gleiche Familienmitglied darf nicht bei A und
B zählen.
Auswertung: ≤1 Punkt: LQTS unwahrscheinlich, 2–3 Punkte: mittlere Wahrscheinlichkeit,
≥4 Punkte: hohe Wahrscheinlichkeit für LQTS
Tabelle 1.2: Diagnosekriterien des Long QT Syndroms nach Schwartz et al. (1993)
(Vincent et al., 1992).
Es ist also einerseits schwierig, die Diagnose und Risikostratifizierung aufgrund der
diagnostischen Kriterien von 1993 zu stellen, andererseits reicht die genetische Information
allein ebenfalls nicht aus. Die Diagnostik bei erstmaligem Auftreten in der Familie sollte
dementsprechend die Diagnosekriterien, insbesondere die QTc-Zeit und das Geschlecht
einbeziehen und bei wahrscheinlichem LQTS die Genotypisierung folgen lassen (Priori
et al., 2003), da dies die therapeutische Vorgehensweise beeinflußt. Bei der folgenden familiären Abklärung wird die genetische Komponente entscheidender, da selbst ein normales
QTc bei LQTS in der Familie ein LQTS mit erhöhtem Risiko für Tachyarrhythmien nicht
23
Einleitung
ausschließen kann (Berge et al., 2008) und somit die Genotypisierung unerlässlich ist. Für
die Risikostratifizierung wurden 2006 internationale Richtlinien entwickelt. Dabei stellt
ein QTc>500 ms bei LQT1 und LQT2 den größten Risikofaktor da, während männliche
LQT3-Patienten per se ein höheres Risiko für kardiale Ereignisse haben, unabhängig vom
QTc. Weiterhin sind die klinischen Syndrome mit geringstem Risiko bei rein kardialem
Phänotyp (RWS) und häufige kardiale Ereignisse von Bedeutung (Zipes et al., 2006).
1.3.3 Therapie
Nicht nur die Diagnostik und die Risikostratifizierung, sondern auch die Therapie entwickelt
sich hin zu Genotyp-spezifischen Ansätzen.
Die wichtigste medikamentöse Therapie beim LQTS sind β-Blocker (Moss et al., 2000).
Diese zeigen allerdings je nach Genotyp einen unterschiedlichen Effekt. LQT1-Patienten
profitieren stärker als LQT2- und LQT3-Patienten, welche trotz Therapie eine höhere
Gefährdung für ventrikuläre Tachykardien haben (Priori et al., 2004). Weiterhin sind implantierbare Kardioverter-Defibrillatoren (ICD) eine Therapieoption bei stark gefährdeten
Patienten, die nicht auf β-Blocker ansprechen (Zareba et al., 2003). Mit der Erkenntnis,
dass die ventrikulären Tachykardien bevorzugt durch physischen und emotionalen Stress
ausgelöst werden, wurde 1971 erstmals die chirurgische Entfernung des linken Ganglion stellatum therapeutisch erprobt (Moss and McDonald, 1971). Mittlerweile wird die
Linkskardiale Sympathische Denervation (LCSD) bei Patienten angewandt, die trotz βBlocker-Therapie an wiederholten Synkopen leiden und nicht durch einen implantierbaren
Defibrillator eingestellt werden können (Schwartz et al., 2004). 2006 wurden internationale Therapierichtlinien entwickelt, die in Tabelle 1.3 zusammengestellt sind (Zipes et al.,
2006).
Der genetischen Entschlüsselung der Ursachen des LQTS, der Beschreibung mutationsspezifischer Trigger und EKG-Charakteristika und der Einbeziehung genetischer Grundlagen
in die Risikostratifizierung folgten mutations-spezifische Therapieansätze (Napolitano et al.,
2006). Diese sind alle noch experimenteller Art und sollen kurz vorgestellt werden. Ein
hoher K+ -Spiegel führt zur Erhöhung von IKr mit Verkürzung des QT-Intervalls und könnte
die IKr -Verringerung bei LQT2 kompensieren (Compton et al., 1996). Dies wurde auch für
die chronische Behandlung gezeigt (Etheridge et al., 2003). Allerdings fehlen Daten, ob
diese Therapie nur die Repolarisationsanomalien beseitigt oder auch das Auftreten kardialer
Ereignisse verhindert (Ruan et al., 2008). Patienten mit LQT3 mit erhöhtem späten IN a
24
Einleitung
Therapie
Auslösende Trigger vermeiden/kein Leistungssport
β-Blocker
ICD + β-Blocker
Evidenzgrad
I
I
IIa
I
IIa
IIb
LCSD
IIb
Kommentar
nur bei genetischer Diagnose
bei klinischer Diagnose
bei molekularem LQTS mit normalem
QTc
Überlebende nach Herzstillstand
bei anhaltenden Synkopen trotz βBlocker
als Primärprävention bei Hochrisikopatienten (z. B. LQT2, LQT3,
QTc>500ms)
falls ICD nicht möglich oder bei hoher
ICD-Entladungsrate
Tabelle 1.3: Therapierichtlinien nach Roden (2008); Zipes et al. (2006)
könnten von Na+ -Blockern profitieren. Mexiletin verkürzt signifikant das QT-Intervall
(Schwartz et al., 1995) und könnte in Verbindung mit β-Blockern zur First-Line-Therapie
des LQT3 werden (Shimizu et al., 2005). Allerdings wurde bei einigen LQT3-Patienten
durch Mexiletin eine Überlappung mit dem Brugada Syndrom und erhöhtem Risiko für
den plötzlichen Herztod ausgelöst (Roden, 2008). Ein weiterer therapeutischer Ansatz
sind K+ -Kanal Öffner, z. B. Nicorandil, welches IK−AT P erhöht. Es konnte gezeigt werden,
dass Nicorandil die Adrenalin-induzierte Verlängerung des QT-Intervals und der APDs
in LQT1-Patienten reduziert (Shimizu et al., 1998) und für LQT1 und LQT2 Patienten
therapeutischen Wert erlangen könnte (Shimizu et al., 2005). Allerdings werden durch
die orale Applikation die notwendigen Wirkspiegel nicht erreicht, so dass Nicorandil i. v.
gegeben werden muss (Shimizu et al., 2005). Verapamil, ein Hemmer des ICa−L , hat
ebenfalls in Studien das QT-Intervall und die APD verkürzt, sowie EADs reduziert bei
Patienten mit kongenitalem LQTS (Shimizu et al., 1995) und könnte eine therapeutische
Option für LQT1, LQT2 und LQT3 sein (Shimizu et al., 2005).
Diese Ansätze zeigen bereits, dass neuere Therapien nicht mehr nur darauf ausgerichtet
sind, symptomatisch die gefährlichen ventrikulären Tachyarrhthmien oder deren tödlichen
Ausgang zu verhindern, sondern bereits an den eigentlichen Gründen der Erkrankung,
den veränderten Ionenströmen ansetzen. So wird auch diese Studie einen neuen Ansatz
zur Therapie des Long QT Syndroms Typ 1 durch die Öffnung des hERG-Kanals und die
Erhöhung von IKr untersuchen.
25
Einleitung
1.3.4 Long QT Syndrom Typ 1 und Typ 2
Da es in dieser Studie um die Typen 1 und 2 des Long QT Syndroms geht, sollen diese hier
genauer besprochen werden.
1.3.4.1 Long QT Syndrom Typ 1
II
V2
Abbildung 1.9: Schematisches EKG LQT1 nach Ruan et al. (2008)
Das Long QT Syndrom Typ 1 ist mit 40 %–50 % das häufigste der LQTS. Es wird verursacht
durch eine dominant-negative Mutation in KCNQ1, welches für den K+ -Kanal Kv LQT1
(Kv 7.1) kodiert, und führt somit zum Verlust von IKs . Es wurden über 250 Mutationen
in KCNQ1 entdeckt, die zum LQT1 führen können. Neben den dominant-negativen lossof-function Mutationen können zum Beispiel ein defekter Einbau der Kanalproteine in
die Zellmembran (Yamashita et al., 2001), Fehler in der Formung des Kanals durch die 4
Untereinheiten, Dysfunktion der Kanäle (Wang et al., 1996b) und Bindungsstörungen der
β-Untereinheiten (Bianchi et al., 2000) vorkommen. Wie schon bei der Beschreibung von
IKs erwähnt, hat sympathische Stimulation normalerweise einen steigernden Effekt auf
IKs . Da dieser bei LQT1 aber nicht aktiviert werden kann, kann die Repolarisationsreserve
nicht ausgeschöpft werden, die APDs sind im Verhältnis zur Herzfrequenz zu lang und
die APD-Dispersion ist erhöht (Shimizu and Antzelevitch, 2000). Dies wird im EKG in der
typischen breitbasigen T-Welle sichtbar (Morita et al., 2008). Weiterhin kommt es durch den
Verlust von IKs zum Übergewicht des durch sympathische Stimulaton zusätzlich erhöhten
IL−Ca während der Plateauphase und damit zum Ca2+ -Overload, was zu EADs führen kann
(Roden et al., 2002). Somit sind Basis und Trigger für die Entwicklung von Tachykardien
besonders während sympathischer Stimulation gegeben. Sie werden daher häufig ausgelöst
26
Einleitung
bei Bewegung (68 %), besonders beim Schwimmen und Tauchen, oder bei emotionalem
Stress (14 %) (Ruan et al., 2008). Klinisch erleiden LQT1-Patienten seltener Synkopen
und kardiale Ereignisse (Priori et al., 2003) mit eher selbstlimitierenden ventrikulären
Tachykardien im Vergleich zu LQT2-Patienten (Yinbin et al., 2005). Trotz des Verlustes von
IKs muss das LQT1 nicht zu einem verlängerten Aktionspotential führen, da der wesentliche
Repolarisationsstrom IKr noch erhalten ist. Die mittlere QTc-Zeit beträgt 457 ±38 ms (Ruan
et al., 2008). Eine zusätzliche Blockade von IKr hingegen, z. B. durch Medikamente, würde
zu unerwarteter QT-Verlängerung führen und könnte TdP triggern (Paulussen et al., 2004).
Therapeutisch ist eine antiadrenerge Therapie mit β-Blockern mit 90 % der Patienten
ohne kardiale Ereignisse nach 5 Jahren sehr effektiv (Priori et al., 2004). Implantierbare
Defibrillatoren oder linkskardiale sympathische Denervation werden beim LQT1-Syndrom
eher selten benötigt (Ruan et al., 2008).
1.3.4.2 Long QT Syndrom Typ 2
II
V2
Abbildung 1.10: Schematisches EKG LQT2 nach Ruan et al. (2008)
Das Long QT Syndrom Typ 2 ist mit 35 %–45 % das zweithäufigste der LQTS. Es wird verursacht durch eine dominant-negative Mutation in KCNH2, welches für hERG (Kv 11.1) kodiert
und so zum Verlust von IKr führt. Über 300 Mutationen können zum LQT2 führen, z. B.
durch defekten Transport zur Zellwand (Anderson et al., 2006), Dysfunktion der Kanäle,
Kanäle mit fehlerhaften Öffnungseigenschaften oder defekte Adaptorproteine (Zhou et al.,
1998). Es wurden auch Mutationen in nichtkodierenden Regionen beschrieben (Zhang
et al., 2004). Weiterhin können latente Mutationen und Polymorphismen von KCNH2
trotz klinischer Unauffälligkeit zum erworbenen LQT2 in Situationen mit reduziertem IKr
27
Einleitung
(z. B. durch Medikamente) führen. Die Verringerung von IKr führt zu stark verlängertem
Aktionspotential und verlängerter QT-Zeit sowie zu erhöhter transmuraler Dispersion der
APDs durch Verlängerung der APD vor allem in der M-Zone. Dies wird im EKG durch die
für LQT2 charakteristische biphasische T-Wellen mit niedriger Amplitude sichtbar (Morita
et al., 2008).
Die ventrikulären Tachykardien vom Typ TdP werden oft im Schlaf (49 %) oder durch
emotionalen Stress (29%̇), vor allem bei Aufwachreaktionen durch plötzliche laute Geräusche (Wecker) ausgelöst (Ruan et al., 2008). Durch die plötzliche sympathische Stimulation kommt es zu einem raschen Anstieg der HF mit akut verlängerter APD, bevor
IKs die APD der neuen HF anpassen kann. Diese akute Verlängerung führt zu erhöhter
trasmuraler Dispersion und kann so zu TdP führen. Dabei geht den ventrikulären Tachykardien eine Pause voran (Tan et al., 2006), während bei LQT1 der Beginn von TdP direkt
der HF-Erhöhung folgt. Weiterhin kann Bradykardie ein Trigger sein, weshalb Schlaf ein
häufiger Auslöser für TdP bei LQT2 ist (Morita et al., 2008). Betrachtet man den realtiv
hohen Anteil von IKr bei langsamen Frequenzen im Gegensatz zu hohen Frequenzen, wo
IKs eine stärkere Rolle spielt und IKr abfällt (Diness et al., 2006), ist verständlich, dass
eine zusätzliche Verringerung von IKr zu den bradykard-ausgelösten Tachykardien führt.
Klinisch ist das LQT2 schwerer als das LQT1. 46 % der Patienten haben kardiale Ereignisse
bis zum 40. Lebensjahr im Gegensatz zu 30 % beim LQT1 (Priori et al., 2003). Die mittlere
QTc-Zeit ist ebenfalls länger und beträgt 467 ±36 ms (Ruan et al., 2008).
Therapeutisch werden auch beim LQT2 β-Blocker eingesetzt, allerdings mit geringeren
Erfolgsraten als beim LQT1, mit kardialen Ereignissen bei 23 % trotz Therapie (Priori et al.,
2004). Die Gefahr der β-Blocker bei LQT2 ist das Auslösen von Bradykardien, die, wie
bereits beschrieben, ebenfalls zu TdP führen können. Somit müssen bei LQT2 häufiger
Defibrillatoren implantiert werden als bei LQT1. Weiterhin ist es wichtig, den K+ -Spiegel
auf hochnormalem Niveau zu halten, um IKr so weit wie möglich zu erhöhen (Etheridge
et al., 2003).
1.4 NS1643: Wirkmechanismus und publizierte Daten
In dieser Studie wird der hERG-Öffner NS1643 als neuer therapeutischer Ansatz beim Long
QT Syndrom Typ 1 untersucht und soll nun genauer vorgestellt werden.
Die Substanz NS1643 (1,3-bis-(2-hydroxy-5-trifluoromethyl-phenyl)-urea) wurde 2006
28
Einleitung
OH
H
N
H
N
OH
O
CF3
CF3
Abbildung 1.11: NS1643
erstmals generiert als ein neuer, partieller Öffner des repolarisierenden K+ -Kanals hERG.
NS1643 erhöht IKr konzentrations- und spannungsabhängig. In Patch-Clamp-Ableitungen
zeigte sich eine Erhöhung sowohl des Steady-state-Stroms während der langsameren Inaktivierung (Hansen et al., 2006; Casis et al., 2006) als auch des Tail-Stroms während
der langsameren Deaktivierung (Hansen et al., 2006). Außerdem wurde ein rechts-shift
der Inaktivierungskurve zu depolarisierteren Potentialen hin festgestellt (Hansen et al.,
2006; Casis et al., 2006). NS1643 wirkte nicht bei hERG-Mutanten ohne Inaktivierung
(Casis et al., 2006), so dass die Veränderungen der Inaktivierungseigenschaften die zentrale Rolle bei der Erhöhung von IKr darstellen (Peitersen et al., 2008). Während des
Aktionspotentials sind die Tail-Ströme aufgrund der sehr schnellen Inaktivierung des Kanals
viel relevanter als die Steady-state-Ströme. Diese Studien zeigen allerdings, dass bei der
Verkürzung der Aktionspotentiale durch NS1643 beide Ströme von Bedeutung sind. Die
Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und die Erholung von der Inaktivierung bleiben
dagegen unverändert (Casis et al., 2006), wobei in anderen Studien eine beschleunigte
Aktivierung beobachtet wurde (Xu et al., 2008). Genauere Untersuchungen des Angriffspunktes von NS1643 am hERG-Kanal zeigten, dass es von außen an die Pore bindet und
als Gating-Modifikator fungiert, indem es den aktivierten Zustand des Kanals stabilisiert
(Xu et al., 2008).
Bei der Prüfung der Effekte auf andere Ionenkanäle der Myozyten zeigte NS1643
blockierende Eigenschaften auf IKs . In Experimenten mit Coexpression von hERG und
KCNQ überragten allerdings die Effekte auf IKr gegenüber IKs , insbesondere während der
Tail-Ströme. Weitere Untersuchungen des Effekts von NS1643 auf andere Kanäle zeigten
eine leichte Blockierung von Ito und keinen Einfluss auf IKur , ICa−T , ICa−L und IN a .
In dieser Patch-clamp-Studie wurde auch erstmals in Kardiomyozyten die Verkürzung
der APDs ohne Änderung der AP-Form, die Verkürzung von ERPs und das Potential zur
Verhinderung von EADs durch NS1643 nachgewiesen (Hansen et al., 2006).
29
Einleitung
Antiarrhythmische Eigenschaften von NS1643 wurden erstmals bei hypokalämischen
Mausherzen in der Langendorff-Perfusion gezeigt, wobei die Substanz spontane und provozierte EADs und VTs inhibierte (Killeen et al., 2008). In vivo wurde die Substanz erstmalig
an zwei Kaninchenmodellen mit verlängerter QT-Zeit und Vulnerabilität für Torsades-dePointes Tachykardien getestet. Für das eine Modell wurde ein AV-Block III ◦ generiert mit
folgender Downregulation von IKr , das andere Modell war ein pharmakologisches LQTModell mit dem IKr -Blocker Dofetelide. In-vitro Patch-Clamp Studien zeigten dabei, dass
NS1643 downregulierte IKr und pharmakologisch geblockte IKr wiederherstellen kann. Invivo wurden neben der QT-Verkürzung durch NS1643 bei beiden Modellen arrhythmische
Eigenschaften wie ventrikuläre Extrasystolen und Torsades-de-Pointes inhibiert (Diness
et al., 2008). Es wurden allerdings auch schon proarrhythmische Effekte der Substanz in einer mathematischen Simulationsstudie gezeigt. Die Verkürzung der absoluten Refraktärzeit
und die Verlängerung der vulnerablen Phase führte trotz Unterdrückung von Extrasystolen
zu einer erhöhten Persistenz von Arrhythmien, (Peitersen et al., 2008).
30
Einleitung
1.5 Zielsetzung der Arbeit
Alle bislang angewandten Therapien behandeln das Long QT Syndrom nur symptomatisch
und verhindern lediglich das Auftreten oder den tödlichen Ausgang der ventrikulären
Tachykardien. Dabei bringen die Therapien viele Nachteile mit sich und erreichen nicht
in allen Fällen eine hohe Effektivität. Bei trotz β-Blocker fortdauerndem Auftreten von
Synkopen müssen beispielsweise implantierbare Defibrillatoren angewandt werden. In
diesem Fall wiederum leiden viele Menschen, vor allem Kinder, unter häufigen Entladungen
(Roden, 2008). Einige neuere Konzepte, die an den Ursachen der Erkrankung, den veränderten Ionenströmen, ansetzen, wurden bereits vorgestellt. Weitere Substanzen haben
als Hauptangriffspunkt die beiden repolarisierenden K+ -Kanäle, mit dem Ziel die Repolarisationsreserve zu erhöhen. Eine IKs -Erhöhung wurde durch das Benzodiazepinderivat
L-364,373 bei Meerschweinchen und Kaninchen nachgewiesen (Salata et al., 1998; Xu et al.,
2002), allerdings nicht bei Hunden (Magyar et al., 2006), so dass der Effekt noch nicht klar
eingeordnet werden kann. Weiterhin wurden zahlreiche Substanzen mit IKr -aktivierenden
Eigenschaften entwickelt, darunter NS1643. Wie schon vorgestellt wurde diese Substanz
bereits in einigen Studien getestet, allerdings ausschließlich bei Modellen des erworbenen
Long QT Syndroms mit Reduktion von IKr . Diese Studie soll nun erstmals den Effekt
von NS1643 beim angeborenen Long QT Syndrom Typ 1 untersuchen. Dabei stellen die
transgenen Kaninchen aufgrund der dem Menschen ähnlichen Repolarisationsströme von
IKr und IKs ein sehr geeignetes Modell dar. Ziel ist es, durch die Erhöhung von IKr die
QT-Zeit und die APD zu verkürzen, damit den Phänotyp des LQT1 zu normalisieren und
so die Ursache des Long QT Syndroms zu beheben. Zum Vergleich werden zwei weitere
Modelle herangezogen: Geschwistertiere mit normalem Genotyp (LMC) und transgene
LQT2-Kaninchen mit einer loss-of-function Mutation in hERG.
Es wird in dieser Arbeit die Wirkung von NS1643 in-vivo und in-vitro untersucht. In-vivo
werden EKG-Studien durchgeführt und die Wirkung auf das QT-Intervall im Vergleich
von NS1643 zu einer Kontrollträgerlösung bei LQT1 und LMC analysiert. In-vitro werden Langendorff-Studien ausgeführt. Dabei wird analog zum QT-Intervall die Dauer des
Aktionspotentials durch MAP-Elektroden unter NS1643-Perfusion bei gleichbleibender physiologischer Herzfrequenz von 150/min gemessen. Neben der APD-Verkürzung werden
potentiell proarrhythmische Ursachen untersucht. Darunter zählen die Dispersion der APDs,
die effektiven ventrikulären Refraktärzeiten, das Auftreten von mechanischem Alternans,
31
Einleitung
die Schnelligkeit der Adaption an HF-Wechsel und die Induzierbarkeit von Kammerflimmern, vor und nach NS1643. Insofern wird diese Studie nicht nur den potentiellen Nutzen
der Substanz als Therapeutikum analysieren, sondern Einblicke in die physiologischen
Aufgaben der beiden repolarisierenden K+ -Ströme bei veschiedenen transgenen Modellen
unter möglichst physiologischen Bedingungen geben.
32
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Tiere
Die verwendeten Kaninchen waren New Zealand White Rabbits und stammten von Nachkommen der aus eigener Zucht generierten transgenen Gründungstiere. Diese hatten
eine herzmuskelspezifische Überexpression der loss-of-function Mutation der Pore in den
α-Untereinheiten von IKs (KvLQT1-Y315S) für die LQT1-Kaninchen oder von IKr (hERGG628S) für die LQT2-Kaninchen und zeigten einen LQT-Phänotyp in-vivo und in-vitro
(Brunner et al., 2008). Zum Vergleich wurden als Kontrollgruppe Geschwistertiere (LMC)
mit normalem Genotyp und Phänotyp herangezogen. Die Tiere wurden in der Tierhaltung
Landwasser und für die Dauer der Experimente im ZKF (Zentrale Klinische Forschung)
Freiburg gehalten. Sie hatten einen natürlichen Tag-Nacht-Rhythmus mit Tageslicht. Die
Kaninchen wurden entweder in Bodenhaltung zu 8–15 Tieren nach Geschlechtern getrennt
in 2,2 m×4 m großen Boxen oder in Einzelkäfigen gehalten. Der Boden war mit Sägemehleinstreu ausgestreut. Als Futter erhielten sie Kraftfutterpellets für Kaninchen und
Heu, Möhren und Wasser ad libitum. Die Temperatur betrug 16–22 ◦ C bei einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 %. Es wurden nur Weibchen nach Abschluss der Pubertät verwendet,
um einen ausgeprägten Phänotyp zu erreichen und den unterschiedlichen Einfluss der
Sexualhormone gering zu halten (Kurokawa et al., 2008; Ridley et al., 2008). Das Alter der
10 LMC-Kaninchen betrug 19,8 ±2,3 Wochen, der 13 LQT1-Kaninchen 17,6 ±1,6 Wochen
und der 6 LQT2-Kaninchen 35,0 ±5,4 Wochen. Sie hatten ein Gewicht von 2,8 ±0,2 kg für
die LQT1-, 3,0 ±0,2 kg für die LMC- und 3,2 ±0,4 kg für LQT2-Kaninchen. Alle Versuche
wurden über den Tierschutzbeauftragten der Universitätsklinik Freiburg vom Regierungspräsidium Freiburg über den Antrag G09/09 genehmigt und in Abstimmung mit dem
deutschen Tierschutzgesetz § 7 – § 9 in der Fassung vom 18. Mai 2006 durchgeführt.
33
Material und Methoden
2.2 EKG
2.2.1 Substanzen und Bezugsquellen
R
Augen- und Nasensalbe): Bayer, Leverkusen, Deutschland
• Dexpanthenol (Bepanthen
• DMSO (Dimethylsulfoxid): Sigma-Aldrich, St. Louis, USA (#41639)
R
• Esketaminhydrochlorid (Ketanest
S): Pfizer, New York, USA
R
• Glukose-Monohydrat 5 % (Glucosteril
): Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland
• Heparin-Natrium: Braun, Melsungen, Deutschland
• NaCl 0,9 %: Braun, Melsungen, Deutschland
• NS1643 (1,3-bis-(2-hydroxy-5trifluoromethyl-phenyl)-urea): NeuroSearch A/S, Ballerup, Dänemark
• PEG400 (Polyethylenglykol): Sigma-Aldrich, St. Louis, USA (#91893)
R
• Pilca
Enthaarungs-Crème: GlaxoSmithKline, London, UK
R
• Xylazinhydrochlorid (Rompun
2 %): Bayer, Leverkusen, Deutschland
2.2.2 Infusionslösungen
• NS1643 (1,5 mg/kg/min) aufgelöst in 50 % PEG400 und 50 % Glukose-Monohydrat
5%
• Trägerlösung aus 50 % PEG400 und 50 % Glukose-Monohydrat 5 %
2.2.3 Versuchsaufbau und Versuchsdurchführung
Das 12-Kanal-EKG wurde mit einer digitalen EKG-Maschine (HEART-Exercise IT Case V5.11,
GE Healthcare Medical Systems, Freiburg, Deutschland) aufgezeichnet.
Die Versuchsreihe wurde als Crossover-Studie angelegt, in der jedes Versuchstier entweder für 45 min NS1643 (1,5 mg/kg/min) oder Trägerlösung i. v. erhielt. Nach mindestens
7 Tagen wurden die Gruppen getauscht und die jeweils andere Lösung verabreicht. Die
Zuteilung erfolgte zufällig (siehe Abbildung 2.1).
Die Analgosedierung der Kaninchen (6 LMC und 9 LQT1) efolgte durch 2 i. m. InjekR
R
tionen im Abstand von 15 min mit Ketanest
S/Rompun
2 % (12,5/3,75 mg/kg). Die
Dosierung wurde von vorherigen Experimenten übernommen, die zusätzlich zeigten, dass
die Kombination Ketamin/Xylazine keine Veränderung des QT-Intervals hervorruft und
somit die ideale Form der Anästhesie darstellt, um QT-Veränderungen in-vivo zu untersuchen (Odening et al., 2008). Nach der zweiten Injektion wurden die Fellabschnitte durch
34
Material und Methoden
T
a
g1
45mi
nE
KG
45mi
nE
KG
T
a
g2 Kont
r
ol
l
E
KG
T
a
g8
45mi
nE
KG
45mi
nE
KG
T
a
g9 Kont
r
ol
l
E
KG
Abbildung 2.1: Cross-over Design
Rasur und Enthaarungscreme entfernt, die für die EKG-Elektroden benötigt wurden. Das
Kaninchen wurde auf seine rechte Seite auf einer Wärmematte (37 ◦ C) gelagert und die
Klebeelektroden wurden angebracht. Für das 12-Kanal-EKG wurden, entsprechend den
Ableitungen beim Menschen, 4 periphere Elektroden an den proximalen Extremitäten und
6 Brustwandelektroden befestigt (V1 und V2 parasternal im 4. ICR re und li, V3 auf der
Verbindungsline von V2 und V4 , V4 medioclavicular im 5. ICR, V5 in der vorderen und V6 in
der mittleren Axillarlinie jeweils im 6. ICR). Weiterhin wurde ein venöser Zugang in die
Ohrvene gelegt, der mit 0,9 % NaCl-Lösung gespült und über welchen Heparin (50 U/kg)
appliziert wurde, was der Dosis der vollen Antikoagulation beim Menschen entspricht.
R
Das Auftragen der Bepanthen
Augensalbe diente dem Schutz der Hornhaut während
der Analgosedierung, da unter Ketamin die Augen nicht geschlossen werden. 5 min vor
R
R
Beginn der EKG-Aufzeichnung wurde eine dritte Injektion mit Ketanest
S/Rompun
2%
verarbreicht.
Nach einer 12minütigen Stabilisierungsphase wurde entweder die NS1643-Infusion
oder die Kontrollinfusion mit 2 ml/kg/h für 45 min kontinuierlich i. v. appliziert. Diese Dosierung und Infusionsrate zeigte in früheren in-vivo Studien eine Normalisierung
des QT-Intervals und Unterdrückung arrhythmogener Aktivitäten bei zwei verschiedenen
Kaninchen-Modellen mit verlängerter QT-Zeit (Diness et al., 2008). Das 12-Kanal-EKG
wurde am Ende der Stabilisierungsphase mit Beginn der Infusion als Basismessung und
anschließend nach 7,5 min, 15 min, 22,5 min, 30 min, 37,5 min und 45 min aufgezeichnet.
Am nachfolgenden Tag wurde ein einminütiges Kontroll-EKG aller Tiere, die die NS1643R
R
Infusion erhielten, nach erneuter Analgosedierung mit einer Dosis Ketanest
S/Rompun
2%
aufgezeichnet, um die Normalisierung des Phänotyps zu überprüfen.
35
Material und Methoden
2.2.4 Auswertung
Die Auswertung erfolgte durch manuelle Messung der RR- und QT-Intervalle auf dem
Bildschirm anhand von digitalen Markierungen, wobei pro Zeit aus 3 Ableitungen (eine
Ableitung aus I, II oder III, eine aus aVR, aVL oder aVF und eine aus V1 –V6 ) über jeweils 3
aufeinanderfolgende Schläge gemittelt wurde. Das Ende der T-Welle wurde als Schnittpunkt
der T-Welle mit der isoelektrischen Linie definiert. Der Auswertende war gegenüber den
Gruppen der verabreichten Infusionslösung und des Genotyps verblindet. Anhand des RRIntervalls konnte mit Genotyp-spezifischen Formeln das erwartete QT-Intervall berechnet
werden: QTLQT 1 = 80 + 0.32 × RR und QTLM C = 86 + 0.22 × RR (Brunner et al.,
2008). Das gemessene QT-Intervall wurde als prozentualer Anteil des erwarteten QTIntervalls ausgedrückt (QTindex ). Aufgrund großer individueller Schwankungen des QTIntervalls bei Kaninchen (Brunner et al., 2008) wie auch beim Menschen (Malik et al.,
2002) wurden die individuellen Basismessungen auf 100 % normiert. Von der Auswertung
der Experimente ausgenommen wurden 3 Experimente, bei denen die Kaninchen gestorben
waren und ein Experiment, bei welchem die Herzfrequenz eines LMC-Kaninchens sehr
unphysiologisch anstieg auf 330/min (RR=182ms), so dass das EKG nicht mehr auswertbar
war und die generierten Formeln für das erwartete QT-Intervall in diesem unphysiologischen
Bereich nicht anwendbar sind. Die normale Herzfrequenz von sedierten Kaninchen liegt
um 156/min (RRLMC =384 ±39 ms (Odening et al., 2008)).
Die statistische Auswertung der EKG-Messungen sowie sämtliche andere statistische
R
Tests dieser Arbeit wurden mit GraphPad Prism
4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA)
realisiert. Die Basismessungen der RR- und QT-Intervalle der unterschiedlichen Genotypen
wurden mit Hilfe von ungepaarten t-Tests verglichen. Der QTindex bei Basismessung der
Einzeltiere innerhalb der Genotypen wurde mit Hilfe von gepaarten t-Tests verglichen.
Die Verkürzung der QT- und RR-Intervalle wurde durch Two-Way-ANOVA und Bonferroni
post-test mit den Kontrollexperimenten und durch One-Way-Anova und Dunnett post-test
mit der Basismessung verglichen. Der QTindex wurde ebenfalls durch Two-Way-ANOVA mit
den Kontrollexperimenten verglichen. Als signifikant wurde jeweils p<0,05 angenommen.
2.3 Langendorff
2.3.1 Substanzen und Bezugsquellen
• DMSO (Dimethylsulfoxid): Sigma-Aldrich, St. Louis, USA (#41639)
36
Material und Methoden
R
• Esketaminhydrochlorid (Ketanest
S): Pfizer, New York, USA
• Heparin-Natrium: Braun, Melsungen, Deutschland
• NaCl 0,9 %: Braun, Melsungen, Deutschland
• NS1643 (1,3-bis-[2-hydroxy-5trifluoromethyl-phenyl]-urea): NeuroSearch A/S, Ballerup, Dänemark
R
• Xylazinhydrochlorid (Rompun
2 %): Bayer, Leverkusen, Deutschland
• Thiopental-Natrium: Inresa, Freiburg, Deutschland
• Alle Chemikalien für das Krebs-Henseleit-Perfusat entstammen Sigma-Alrich, St. Louis,
USA
2.3.2 Puffer
modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer (Perfusat)
NaCl 118 mM (#S5886)
KCl 3,8 mM (#P5405)
KH2 PO4 1,2 mM (#P5655)
NaHCO3 24,9 mM (#S5761)
CaCl2 1,8 mM (#C5670)
MgSO4 0,8 mM (#M2643)
Glukose 5,5 mM (#G7021)
C3 H3 NaO3 (Natrium Pyruvat) 2,0 mM (#P5280)
Der Puffer wurde durch 0,22 µm Cellulose Acetate Filter gefiltert. Um einer Präzipation
von Phosphor- und Calciumionen vorzubeugen, wurden diese Komponenten erst direkt vor
Beginn des Experiments vermengt.
2.3.3 Versuchsaufbau
Das Set-Up (IH5) ist ein Produkt der Firma Hugo Sachs Elektronik (HSE) – Harvard
Apparatus GmbH, Hugstetten, Deutschland.
Der Krebs-Henseleit-Puffer, das Perfusat, kann in einem Reservoir auf 37 ◦ C vortemperiert und mit Carbogen (95 %O2 und 5 %CO2 zur Aufrechterhaltung eines pH Wertes
von 7,4±0,05) über eine Glasfritte begast werden. Durch eine Rotationspumpe (Ismatec,
Deutschland) wird der Puffer über einen Wärmeaustauscher und einen Dreiwegehahn, über
welchen weitere Substanzen gegeben werden können, durch eine rostfreie Metallkanüle in
die Aorta ascendens befördert und so das Herz retrograd perfundiert. Eventuelle Luftblasen
37
Material und Methoden
werden von dem Luftpolster im Aortenblock aufgefangen, um Luftembolien zu vermeiden.
Zusätzlich wird dadurch die Windkesselfunktion der Aorta nachgebildet. Das Herz ist für
die gesamte Zeit des Experiments von 37 ◦ C- temperiertem Krebs-Henseleit-Puffer in der
Herzkammer umgeben.
Während des Experiments werden Herzfrequenz (HF), Koronarfluss (CF), Aortendruck
(AP), linksventrikulärer Druck (LVP) und Kontraktilität (dLVP/dt), 6 monophasische Aktionspotentiale (MAP) und EKG nach Einthoven und Goldberger permanent über die entsprechenden Module von HSE gemessen und aufgezeichnet. Der Koronarfluss kann anhand
der Rotationspumpe konstant gehalten werden. Der Aortendruck kann durch einen Flusswiderstand, in Form einer Membran, angepasst werden. Der Druck über dieser Membran
ist über eine drehbare Kontrolldruckpumpe veränderbar, die mit einem analogen Manometer verbunden ist. Zusätzlich wird der Aortendruck, wie oben angegeben, durch einen
Druckaufnehmer gemessen und aufgezeichnet. Ein Katheter, mit einem wassergefüllten
Latexballon bestückt, wird in den linken Ventrikel eingeführt und ist an einen Druckaufnehmer gekoppelt. Durch Aufpumpen des Ballons mit Wasser durch die Spindelspritze kann
so der linksventrikuläre Druck gemessen, der end-diastolische Druck (LVedP) eingestellt
und der entwickelte Druck (LVdP) als Differenz zwischen end-systolischen (LVesP) und
end-diastolischem Druck bestimmt werden. Die Kontraktilität wird als maximale linksventrikuläre Druckänderung über der Zeit während der Kontraktion ((dLVP/dt)max ) und
während der Relaxation ((dLVP/dt)min ) gemessen. Der Puls-Stimulator (HSE Simulator
C, type 224) wurde als Grundstimulation auf 2,5 Hz mit 8,82 mV für 1 ms (Verzögerung
0,4 ms, biphasische Polarität) eingestellt. Für die Refraktärzeiten wurde die Stimulation mit
einer eigens angefertigten Software für LabVIEW V6/Win ausgeführt. Alle Aufzeichnungen
R
wurden mit Isoheart
W, Version 1.1.1.218(32) von HSE mit 500 Hz generiert.
2.3.4 Versuchsdurchführung
Die Versuchsreihe war so angelegt, dass zwischen den EKG-Experimenten und den Langendorff-Experimenten mindestens eine Woche lag, um die komplette Normalisierung des
Phänotyps zu gewährleisten, welche bereits durch die EKGs einen Tag nach der NS1643Infusion geprüft wurde.
2.3.4.1 Präparation
Vor Beginn wurde die Langendorff-Apparatur mit Millipore-Wasser zur Reinigung gespült,
mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllt, das Perfusat auf 37 ◦ C durch die Wärmeaustauscher
erwärmt und mit Carbogen oxiginiert. Die Werte der Lösung wurden ionometrisch in einem
38
Material und Methoden
Wasser 37 °C
5
7
11
4
17
10
9
15
13
Carbogen
16
6
14
2
22
8
21
18
1
20
19
3
12
Wasser 37 °C
[1] Eingehängtes, isoliertes Herz
[2] Perfusat-Reservoir (doppelwandig)
[3] Glasfritte zur Begasung mit Carbogen
[4] Rotationspumpe
[5] Wärmeaustauscher
[6] Dreiwegehahn
[7] Spritze zur Gabe von Medikamenten
über den Dreiwegehahn
[8] Aorten-Metallkanüle
[9] Aortenblock
[10] Luftpolster zur Nachahmung des
Windkesseleffekts und Luftembolievermeidung
[11] Spritze zur Regulation der Luft
[12] Herzkammer (doppelwandig)
[13] Durchflussmesser zur Messung des
Koronarflusses
[14] MAP-Elektrode
[15] Einstellbarer Flusswiderstand zur
Anpassung des Aortendrucks
[16] Drehbare Kontrolldruckpumpe zur
Einstellung des Flusswiderstands
[17] Aortendruck-Manometer
[18] Druckaufnehmer des Aortendrucks
[19] Latexballon zur Simulation der Vorlast
[20] Katheter zwischen Ballon und Druckaufnehmer
[21] Druckaufnehmer des LVP
[22] Spindelspritze zur Volumenfüllung
des Ballons
Abbildung 2.2: Schema Langendorffmodell
(Modifiziert nach Hugo Sachs Elektronik)
39
Material und Methoden
Abbildung 2.3: Langendorff-Apparatur
BGA-Analysator der Uniklinik Freiburg überprüft. Die Temperatur wurde über die Dauer des
Experiments wiederholt mit einem Thermometer gemessen. Weiterhin wurde kontrolliert,
dass sich keine Luftblasen im System befanden, um Luftembolien vorzubeugen.
Die Sedierung der Kaninchen (10 LMC, 13 LQT1 und 6 LQT2) efolgte erneut durch 2
R
R
i. m.-Injektionen im Abstand von 15 min mit Ketanest
S/Rompun
2 % (12,5/3,75 mg/kg).
Abermals wurde die Ohrvene für den i. v.-Zugang punktiert, um anschließend Heparin
(100 U/kg) zu applizieren und mit 0,9 % NaCl-Lösung zu spülen. Das Kaninchen wurde auf
dem Rücken gelagert. Zur Tötung wurde Thiopental-Natrium (40 mg/kg) in 5 ml autoklaviertem H2 O mit 5 ml 0,9 % NaCl-Lösung i. v. injiziert. Die Dosierung wurde von vorherigen
Experimenten übernommen (Brunner et al., 2008). Direkt anschließend wurde das Herz
schlagend durch Thorakotomie extrahiert und sofort in kalte (4 ◦ C) Krebs-Henseleit-Lösung
gelegt, um die Stoffwechselaktivitäten zu minimieren und es somit für die Zeit bis zur
Reperfusion zu schützen. In der kalten Krebs-Henseleit-Lösung konnte nun, nach Stillstand
der Kontraktionen, die Aorta frei präpariert und unterhalb des Aortenbogens abgeschnitten
werden. In die Aorta ascendens, oberhalb der Aortenklappe, wurde dann die Metallkanüle
zur retrograden Perfusion der Koronararterien nach Langendorff mit Kabelbindern befestigt. Wenige Sekunden nach Beginn der Reperfusion mit begaster Krebs-Henseleit-Lösung
40
Material und Methoden
Abbildung 2.4: Herz in der Langendorff-Apparatur
begann das Myokard sich spontan zu kontrahieren.
Die Perfusion wurde konstant auf einen Koronarfluss von 50 ml/min durch die Rotationspumpe eingestellt. Der Aortendruck wurde wie oben beschrieben auf 60 mmHg
eingestellt. Von dem rechten Vorhof wurde in Nähe der Vena cava superior der Sinusknoten
mechanisch entfernt, bis die autonome Herzfrequenz unter 150/min fiel. Dadurch blieb
bei einer Stimulation von 2,5 Hz die Herzfrequenz stabil und die APDs somit vergleichbar.
Die Einmündungen der Pulmonalvenen in den linken Vorhof wurden für die Einführung
des flüssigkeitsgefüllten Ballons in den linken Ventrikel über den linken Vorhof erweitert.
Dieser wurde dann aufgepumpt und dadurch die Vorlast erhöht, bis der LVedP 2–6 mmHg
betrug und das Herz sich optimal kontrahieren konnte. Anschließend wurden die MAPElektroden platziert. Vier Elektroden wurden gleichmäßig linksventrikulär positioniert:
MAP1 apikal-anterior, MAP2 mittig-lateral, MAP3 mittig-posterior, MAP4 basal-posterior.
MAP5 wurde rechtsventrikulär mittig-lateral und MAP6 rechtsventrikulär endokardial positioniert. Damit konnte auch eine Dispersion apikal-basal, linksventrikulär-rechtsventrikulär
und epikardial-endokardial untersucht werden.
41
Material und Methoden
Abbildung 2.5: Lage der MAP-Elektroden
2.3.4.2 Versuchsprotokoll
Vor Beginn des Experiments war eine 20-minütige Adaptationsphase vorgesehen. Dabei
wurde das Herz mit 2,5 Hz am linken Vorhof stimuliert. Nach Stabilisierung der Messparameter begann das Experiment mit der Untersuchung der Adaption der APDs auf plötzliche
HF-Erhöhungen. Eine stufenweise Frequenzerhöhung wurde wie folgt durchgeführt: Die
Grundstimulation wurde auf 3 Hz eingestellt und nach ausreichender Anpassungszeit abrupt auf 4 Hz erhöht. Nach höchstens 2 min fielen die APDs auf einen konstanten Wert,
definiert als Plateau-Wert. Dies wurde mit einer Grundstimulation von 4,5 Hz und Wechsel auf 5 Hz wiederholt. Ventrikuläre effektive Refraktärzeiten (ERP) wurden bei einer
ventrikulären Grundstimulation, 10 Schläge (S1) von 3 Hz, 4 Hz und 4,5 Hz, bestimmt,
welchen ein vorzeitiger Extrastimulus (S2) folgte. Innerhalb dieser Untersuchung wurde
auch die Induzierbarkeit von Kammerflimmern untersucht. Aufgrund der hohen Rate von
Kammerflimmern wurde ein step-up Protokoll im Gegensatz zum kliniküblichen step-down
42
Material und Methoden
Abbildung 2.6: Screenshot von Isoheart während eines LQT1-Experiments.
Im linken Abschnitt sind die 6 MAPs in der Momentaufnahme zu sehen. Im rechten Abschnitt sieht man den
Trend der APDs ab dem Moment der NS1643-Perfusion mit deutlicher Verkürzung an allen MAPs, ganz rechts
sind die aktuell gemessenen Werte.
Protokoll festgelegt. Die S1-S2-Zeit wurde schrittweise erhöht bis S2 beantwortet werden
konnte oder Kammerflimmern ausgelöst wurde. Diese S1-S2-Zeit wurde als effektive Refraktärzeit festgelegt. Bei Kammerflimmern wurde dieses durch einen K+ -Bolus beendet. Dabei
wurden über den Dreiwegehahn 0,2–0,5 ml 50 mM K+ -Lösung verabreicht und nach Normalisierung des EKGs das Experiment fortgesetzt. Vorherige Kontrollexperimente zeigten,
dass die APDs und der LVedP nach spätestens 10 min mit Normalisierung des EKGs wieder
die Ausgangswerte erreichten. Nach den ERP-Messungen folgten erneut einige Minuten
Anpassungszeit an die Grundstimulation von 2,5 Hz, wobei die Parameter MAP-Signale, HF,
CF und AP kontrolliert und gegebenenfalls angepasst wurden.
Dann wurde NS1643 in das Krebs-Henseleit-Perfusat gegeben. Nach 45-minütiger Perfusion mit 5 µM NS1643 enthaltender Krebs-Henseleit-Lösung wurde das Protokoll zur
Bestimmung der Adaptation auf HF-Erhöhungen und der effektiven Refraktärzeiten wie im
ersten Teil des Experiments wiederholt. Nach Beenden des Experiments wurde das Herz
von der Metallkanüle entfernt und in 4 % Formaldehydlösung bei 4 ◦ C aufbewahrt. Die
43
Material und Methoden
Abbildung 2.7: Versuchsprotokoll
Langendorff-Apparatur wurde abschließend mit Millipore-Wasser gespült.
44
Material und Methoden
Tabelle 2.1: Versuchsprotokoll
Versuchsabschnitt
Beschreibung
Versuchsbeginn
• Anschluss des kanülierten Herzens an das LangendorffModell
• Einstellen des AP von 60 mmHg und CF von 50 ml/min
• Entfernung des Sinusknotens bis autonome HF<150/min
• Einführen des Ballons in den linken Ventrikel und Erhöhen
des Ballondrucks auf LVedP 2–6 mmHg
• Stimulation mit 2,5 Hz atrial
• Anlegen der 6 MAP-Elektroden
Stabilisierungsphase
20 min
HF-Wechsel Adaptation
vor NS1643
ERP-Messung vor
NS1643
Stabilisierungsphase
5 min
NS1643 Infusion 45 min
HF-Wechsel Adaptation
nach NS1643
• Adaptation des Herzens und Stabilisierung der Parameter
• Beginn des Experiments
• Grundstimulation von 3 Hz für 3 min mit abruptem Wechsel
auf 4 Hz
• Grundstimulation von 4,5Hz für 3 min mit abruptem Wechsel auf 5 Hz
•
•
•
•
•
Stimulation am Ventrikel
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 3 Hz
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 4 Hz
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 4,5 Hz
Gabe von K+ bei Kammerflimmern
• Überprüfung der MAP-Signale, AP, CF, LVedP, HF und EKG
• Hinzugabe von 5 µm NS1643 pro Liter Krebs-HenseleitPerfusat
• Grundstimulation von 3 Hz für 3 min mit abruptem Wechsel
auf 4 Hz
• Grundstimulation von 4,5 Hz für 3 min mit abruptem Wechsel auf 5 Hz
45
Material und Methoden
Versuchsabschnitt
ERP-Messung nach
NS1643
Versuchsende
Beschreibung
•
•
•
•
•
Stimulation am Ventrikel
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 3 Hz
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 4 Hz
S1-S2 Stimuli mit Grundfrequenz 4,5 Hz
Gabe von K+ bei Kammerflimmern
• Entfernung des Herzens aus dem Langendorff-Modell
• Aufbewahrung in 4 % Formaldehyd bei 4 ◦ C
2.3.5 Auswertung
Bei allen Auswertungen wurde wiederum p<0,05 als signifikant angenommen.
2.3.5.1 Aktionspotentialdauer
Die Auswertung der APDs erfolgte anhand von Matlab R2009a (Mathworks Inc. Natick,
USA). Dabei wurde die MAP-Dauer bei 90 % Repolarisation (APD90 ) an jeweils 40 aufeinanderfolgenden APDs gemessen und über sie gemittelt. Die isoelektrische Linie und die
maximale Depolarisation wurden manuell festgelegt, anschließend konnte das speziell
angefertigte Programm auf Matlab-Basis die APD90 errechnen. Mit GraphPad Prism 4 wurde
anschließend statistisch ausgewertet. Zum Vergleich der Genotypen wurden die APD90 der
Basismessungen anhand von ungepaarten t-Tests miteinander verglichen. Die Verkürzung
der APDs, aller epikardialen MAPs und der einzelnen MAPs wurde durch One-Way-ANOVA
ausgewertet und durch Dunnett’s als post-test mit der Basismessung verglichen.
2.3.5.2 Dispersion der MAPs
Für die Auswertung der Dispersion der MAPs wurden die Differenzen zwischen den jeweiligen MAPs berechnet. Diese Differenzen wurden dann durch ungepaarte t-Tests zwischen
den Genotypen und durch gepaarte t-Tests innerhalb der Genotypen am selben Tier zwischen Basis und nach NS1643 verglichen.
2.3.5.3 Effektive ventrikuläre Refraktärzeit
Die effektiven ventrikulären Refraktärzeiten wurden, wie im Versuchsprotokoll beschrieben,
bestimmt und dann durch gepaarte t-Tests miteinander verglichen. Im Zusammenhang mit
46
Material und Methoden
den ERP-Messungen wurde auch die Induzierbarkeit von Kammerflimmern beobachtet. Die
Häufigkeiten wurden anschließend in einer Kontingenztafel mit dem exakten Fisher-Test
statistisch ausgewertet.
2.3.5.4 Adaptation der APDs an HF-Wechsel
Für die APD-Adaption bei HF-Änderungen wurde ebenfalls Matlab verwendet, wobei
diesmal jeder APD-Wert zur Auswertung herangezogen und nicht über 40 Schläge gemittelt
wurde. Die APDs wurden in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt und ergaben einen
exponentiellen Abfall folgender Funktion: AP Dt = AP DP lateau + ∆AP D × e
−t
τ
mit t als
Zeit nach der HF-Erhöhung und τ als Zeitkonstate der APD-Adaptation. Generiert wurden
die Daten mit Igor Pro (Wavemetrics, Lake Oswego, USA). Anschließend wurden die τ Werte statistisch ausgewertet, die Basiswerte zwischen LMC und LQT1 mit ungepaarten
t-Tests und der Unterschied zwischen Basis und NS1643 innerhalb des Genotyps mit
gepaarten t-Tests.
2.3.5.5 Mechanischer Alternans
Weiterhin wurde mechanischer Alternans untersucht. Der höhere LVesP wurde mit 1 benannt, der niedrigere mit 2. Die von Isoheart generierten Werte für LVesP1 , LVesP2 und LVedP
wurden manuell über 3 Schläge gemessen und über sie gemittelt. Der diastolische Wert
alternierte zwar ebenfalls, wie in Abbildung 2.8 zu sehen, als Messgrundlage wurde aber
nur der jeweils niedrigere Wert genommen, also der LVedP vor LVesP1 . Als mechanischer
Alternans wurde ein Verhältnis von mindestens 5 % zwischen den zwei Schlägen definiert:
LV esP1 −LV esP2
LV esP1 −LV edP
× 100 % ≥ 5 %. Als weitere Bedingung wurde (dLVP/dt)max >400 mmHg/s
festgelegt, unterhalb dieses Wertes war die Auswertung sehr schwer zu realisieren. Die
statistische Auswertung der Genotypunterschiede und des Effekts von NS1643 erfolgte in
einer Kontingenztafel mit dem Exakten Fisher-Test.
2.3.5.6 Kontraktilität
Der Abfall der Kontraktilität im Vergleich zum Basiswert wurde jeweils durch One-WayANOVA mit Dunnett als post-test statistisch ausgewertet. Zum Vergleich der Genotypen
wurde der jeweilige Basiswert auf 100 % normiert und der relative Abfall zwischen LMC,
LQT1 und LQT2 mit Two-Way-ANOVA und Bonferroni post-test verglichen .
47
Material und Methoden
L
Ves
P
1
1
2
L
Ves
P
1
2
2
L
VedP
Abbildung 2.8: Auswertung des mechanischen Alternans
2.4 Genotypisierung
Zur Genotypisierung erfolgte eine Blutabnahme im Alter von zwei Monaten. Diese wurde
kontrolliert durch erneute Genotypisierung des Blutes nach Explantation des Herzens für
die Langendorff-Experimente.
2.4.1 DNA-Extraktion
R
R
Für die DNA-Extraktion wurde das Kit QIAamp
DNA Mini (Quiagen
, Venlo, Niederlande)
verwendet. Es wurden 20 µl Protease in ein Eppendorf-Gefäß gegeben und mit 200 µl
Blut und 200 µl AL Puffer auf dem Vortex vermengt. Die Mischung wurde 10 min bei
56 ◦ C inkubiert, um die Proteine zu spalten und anschließend entfernen zu können. Dafür
wurde das Gemisch in Mini Spin Columns umgefüllt und anschließend zentrifugiert (1 min,
6000×g). Dabei bindet die DNA an den Filter. Das Filtrat wurde verworfen und der Filter
in ein neues Mini Spin Column überführt. Nun wurde der Filter mit der DNA gereinigt.
Hierfür wurde 500 µl AW1 Puffer hinzugegeben, erneut zentrifugiert (1 min, 6000×g) und
das Filtrat verworfen. Der Filter mit der DNA wurde wiederum in ein neues Mini Spin
Columns überführt, 500µl AW2 Puffer addiert, zentrifugiert (3 min, 20000×g) und das
Filtrat verworfen. Der Filter wurde in ein Eppendorf-Gefäß überführt und 200 µl AE Puffer
(destilliertes Wasser) hinzugegeben, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die DNA
auszuwaschen, und anschließend erneut zentrifugiert (1 min, 6000×g). Das Filtrat mit der
gelösten DNA-Matrize konnte nun für die PCR weiterverwendet werden.
2.4.2 Polymerase-Kettenreaktion
Für die Polymerase-Kettenreaktion wurde das Kit TaqDNAPolymerase 1000 units (QuiaR
gen
, Venlo, Niederlande) verwendet. Pro Probe wurden folgende Substanzen in einem
48
Material und Methoden
PCR-Eppendorf-Gefäß vermengt:
• 3 µl 10xPCR Puffer, 15 mM MgCl2 beinhaltend
• 0,5 µl 5xQ Lösung
• 0,3 µl dNTP 10 mM
• 2 µl Primer1: LQT1: 5’ - CTT AAT TTT ATT AGG ACA AGG CTG GTG - 3’
LQT2: 5’ - GAA CCA GCT TCT TCC GCT CAC TAC AGG TAC AG - 3’
• 2 µl Primer2: LQT1: 5’ - CAC ATC ACC CAG CCC TGC GGC AGT G - 3’
LQT2: 5’ - GGG CAC ATC CAC CAG ACA TAG GAA GCA - 3’
• 0,5 µl taqDNAPolymerase 5 units/µl
• 3 µl destilliertes H2 O
• 3 µl DNA-Matrize
Für den PCR-Prozess wurden 35 Zyklen in einem Thermozykler (PTC-100TM Programmable
Thermal Controller, MJ Research, St. Bruno, Canada) durchgeführt.
• 1 min, 94 ◦ C: Denaturierung, zur Trennung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den zwei DNA-Strängen
• 1 min, 60 ◦ C: Primerhybridisierung, zur Anlagerung der Primer an die DNA
• 1 min, 72 ◦ C: Elongation, zur Verlängerung der DNA-Stränge durch die DNA-Polymerase, beginnend am 3’-Ende des angelagerten Primers
Nach Abschluss der 35 Zyklen wurde der PCR-Prozess auf 4 ◦ C bis zur Weiterverarbeitung
in der Gel-Elektrophorese abgekühlt.
2.4.3 Gel-Elektrophorese
Für die Gel-Elektrophorese wurde zunächst das Gel hergestellt, indem 50 ml 1×TAE (TrisAcetat-EDTA-Puffer (#T-9650)) mit 0,5 g Agarose (#A9539) vermengt und erhitzt wurden.
Beide Substanzen wurden von Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, bezogen. Anschließend wurde
mit 10 µl Ethidiumbromid (1 mg/ml) das Gel gefärbt, um anschließend unter UV-Licht die
Banden sichtbar machen zu können. Nun wird das Gel in die Gelelektrophoreseapparatur
gegossen und nach Erkalten jeweils 15 µl der PCR-Resultate in die Geltaschen pipettiert. Als
Marker wurden 5 µl 100bp Marker (TrackItTM 100 bp DNA Ladder, InvitrogenTM , Carlsbad,
USA) in die Seitentaschen pipettiert. Dann wurde eine Spannung von 90 V für 50 min
angelegt. Durch das elektrische Feld wandern die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle
vom negativen zum positiven Pol, wobei die kleineren Moleküle schneller als die größeren
49
Material und Methoden
wandern und so eine Auftrennung nach der Größe möglich ist.
Abbildung 2.9: Gel-Elektrophorese
2.4.4 Auswertung
Die Auswertung fand unter UV-Licht (peqlab, Biotechnology GmBH, Erlangen, Deutschland)
statt. Die Abbildung 2.9 zeigt ein Agarose-Gel nach der Gel-Elektrophorese. Die Banden
im oberen Abschnitt zeigen positive LQT2-Kaninchen mit einer Bande bei 420 bp. Im
unteren Abschnitt sind links drei LMC-Kaninchen jeweils doppelt und rechts wiederholt die
6 LQT2-Kaninchen des oberen Abschnitts. Bei LQT1-Kaninchen zeigte sich ein Bande bei
405 bp.
50
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 EKG (in-vivo)
3.1.1 QT- und RR-Intervall
351ms
354ms
178ms
183ms
183ms
291ms
291ms
292ms
145ms
348ms
147ms
147ms
Ba
s
i
s
mes
s
ung
RR=351ms
QT
=181,
3ms
QT
=94%
i
nde
x
45mi
nNS
1643
RR=291,
3ms
QT
=146,
3ms
QT
=
8
4%
i
nde
x
Abbildung 3.1: EKG-Beispiel eines LQT1-Kaninchens vor und nach NS1643
Zunächst wurde die Wirkung des hERG-Öffners NS1643 in-vivo untersucht. Dafür wurden sowohl die LQT1- mit den LMC-Kaninchen als auch die Effekte von NS1643 mit
der Kontrolllösung verglichen. Abbildung 3.2 zeigt die RR- und QT-Intervalle. Die LQT1Kaninchen zeigten einen Phänotyp mit verlängertem QT-Intervall von 11,9 ±6,2 ms gegenüber den LMC-Kaninchen (QTLQT1 =173,1 ±4,4 ms, QTLMC =161,2 ±4,1 ms), der allerdings keine Signifikanz erreichte (p<0,08). Die Subgruppenanalyse zwischen den
LQT1 mit einem Phänotyp oberhalb der 50. Perzentile zeigte ein signifikant längeres
QT-Intervall von 20,3±5,6 ms im Vergleich zu LMC (p<0,01). Die Herzfrequenz war in
beiden Gruppen gleich (RRLQT1 =343,3 ±10,3 ms, RRLMC =337,7 ±9,9 ms, p=0,72). Weiterhin wurde als Basiswert das für die Herzfrequenz nach Genotypen korrigierte QTIntervall (QTindex ) zwischen den zwei Genotypen verglichen. Für die Einzeltiere waren
jeweils keine signifikanten Unterschiede des QTindex bei Beginn der Experimente (Basismes-
51
Ergebnisse
sung) im Abstand von einer Woche festzustellen. Dies gilt sowohl für die LQT1-Kaninchen
(QTindex NS=92,4 ±1,8 %, QTindex Kontrolle=89,7 ±1,3 %, p=0,15) als auch für die LMCKaninchen (QTindex NS=100,2 ±3,0 %, QTindex Kontrolle=100,9 ±3,5 %, p=0,37). Bei der
EKG-Messung einen Tag nach der NS1643-Infusion zeigte sich, dass die Verkürzung des
QT-Intervalls durch NS1643 vollständig aufgehoben war. Allerdings zeigte sich eine signifikante Vergrößerung des QTindex im Vergleich zur Basismessung des Vortages von 9,4 ±2,4 %
(p<0,001) bei den LQT1- und von 9,1 ±4,1 % (p<0,05) bei den LMC-Kaninchen.
Abbildung 3.2: RR- und QT-Intervalle
NS1643 verkürzte die QT-Dauer signifikant in LQT1. Das QT-Intervall verkürzte sich
nach 45 min um 37,4 ±7,8 ms (p<0,01). Der Unterschied zu den Kontrollexperimenten
betrug nach 45 min 22,7 ±7,0 ms (p<0,05). Ebenfalls verkürzte sich das RR-Intervall
signifikant nach 45 min um 81,7 ±17,6 ms (p<0,01), die Differenz zur Kontrolllösung
52
Ergebnisse
Abbildung 3.3: QTindex
betrug nach 45 min 66,3 ±19,4 ms (p<0,05). Bei den Kontrollexperimenten zeigte sich
kein Effekt zwischen der Basismessung und der 45 min-Messung bei den QT- und RRIntervallen. Bei den LMC verkürzten sich die QT- und RR-Intervalle im Vergleich zu den
Kontrollexperimenten nicht signifikant. Der Unterschied betrug nach 45 min 11,3 ±10,2 ms
für das QT-Intervall und 43,9 ±24,0 ms für das RR-Intervall.
Zur besseren Vergleichbarkeit soll nun der QTindex , d. h. das Verhältnis von gemessenem
QT-Intervall zu erwartetem QT-Intervall bei der jeweiligen Herzfrequenz mit Normierung
der Basismessung auf 100 % herangezogen werden (Abbildung 3.3). Im Vergleich zu den
Kontrollexperimenten verkürzte sich der QTindex der LQT1 signifikant bereits nach 15 min
und erreichte bei 30 min sein Plateau. Die Verkürzung betrug nach 37,5 min und 45 min
7,3 ±2,1 % (p<0,001)und 5,5 ±1,8 % (p<0,01). Im Vergleich zur normierten Basismessung
liegt die Verkürzung bei 8,4 %. Bei LMC zeigte sich keine signifikante Verkürzung des QTindex
im Vergleich der NS1643-Messungen mit den Kontrollmessungen. Die Verkürzung lag nach
37,5 min und 45 min bei 2,7 ±1,8 % und 1,0 ±2,5 %.
3.1.2 Auftreten von Arrhythmien
Während der Infusion von NS1643 wurden Arrhythmien und EKG-Veränderungen bei den
LMC- und LQT1-Kaninchen beobachtet. 3 LMC starben vor Beendigung der Experimente
nach AV-Block II ◦ und III ◦ und ST-Streckenhebungen aus dem absteigenden R in aVR. Die
direkt anschließende Autopsie zeigte bei 2 der 3 Kaninchen Blutkoagel im rechten Ventrikel.
Bei zwei weiteren LMC-Kaninchen traten vorrübergehend polymorphe Extrasystolen mit
53
Ergebnisse
Bigemini, Couplets und Salven (LOWN IIIa-IVb) ohne R-auf-T-Phänomen (LOWN V) auf.
Bei einem LMC-Kaninchen stieg die Herzfrequenz auf über doppelt so hohe Werte im
Vergleich zur Ausgangsmessung an. Dies war verbunden mit ST-Streckenhebungen aus dem
absteigenden R in den linkslateralen Ableitungen. Diese ST-Streckenhebungen wurden bei
zwei weiteren LQT1-Kaninchen beobachtet. Kammerflimmern trat nicht auf.
3.2 Langendorff (in-vitro)
L
MC
L
QT
1
L
QT
2
Abbildung 3.4: EKG im Vergleich der Genotypen aufgezeichnet mit Isoheart
3.2.1 APD-Verkürzung
Zur Untersuchung der Wirkung von NS1643 in-vitro im Langendorffmodell wurden zunächst die Aktionspotentialdauern bei 90 % Repolarisation (APD90 ) zwischen den Genotypen und über die 45 min der Perfusion von 5µM NS1643 verglichen. Die Tabelle 3.1 zeigt
die Werte der Basismessung im Vergleich aller drei Genotypen. Bei allen Ableitungen zeigte
sich eine hoch signifikant längere APD90 der LQT2-Kaninchen im Vergleich zu den LQT1und LMC-Kaninchen (p<0,0001). Für die epikardialen Ableitungen des linken Ventrikels
waren die APD90 bei LQT2 49,0 ±7,6 ms (p<0.0001) länger im Vergleich zu LQT1 und
59,4 ±7,1 ms (p<0.0001) länger verglichen mit LMC. Zwischen LQT1 und LMC zeigte sich
kein signifikanter Unterschied, die APD90 der LQT1-Kaninchen war 10,4 ±6,1 ms länger als
die der LMC-Kaninchen (p=0,11). Beim Vergleich der APD90 der LQT1 oberhalb der 50.
Perzentile als Subgruppenanalyse zeigte sich allerdings eine signifikant längere APD90 von
21,2 ms im Vergleich zu LMC (p<0,01).
54
Ergebnisse
LMC (n=10)
LQT1 (n=13)
LQT2 (n=6)
APD90 LV
(Map1–4)
132,2 ±4,1***
142,5 ±4,3***
191,5 ±6,1
APD90 RV
(Map5)
146,2 ±4,9***
155,1 ±4,5***
203,1 ±4,9
APD90 LV+RV
(Map1–5)
135,5 ±3,9***
145,0 ±4,1***
193,7 ±5,8
APD90 RVendo
(Map6)
162,2 ±7,03
159,2 ±7,3
keine Werte
*** p<0,0001 verglichen mit LQT2
Tabelle 3.1: APD90 -Werte bei Versuchsbeginn [ms]
NS1643 verkürzte die APD90 bei LQT1 und LMC signifikant. Die Verkürzung der epikardialen APD90 (MAP1–5) der LQT1 war bereits nach 15 min signifikant und betrug
25,5 ±3,7 ms (p<0,01) und 30,9 ±4,2 ms (p<0,01) nach 30 min und 45 min. Die epikardialen APD90 der LMC verkürzten sich signifikant nach 30 min um 17,2 ±3,0 ms (p<0,05)
und um 24,6 ±3,1 ms (p<0,01) nach 45 min. Abbildung 3.5 zeigt ein Beispiel für die
APD-Verkürzung bei LQT1. Die Qualität der rechtsendokardialen Elektrode ließ über die
Zeitdauer so stark nach, dass sie nach 45 min nicht mehr auszuwerten war. Die APD90 der
LQT2 verkürzten sich nicht signifikant. Der Unterschied lag nach 45 min bei 22,5 ±6,4 ms
(p>0,05). Der obere Teil der Abbildung 3.6 zeigt die Verkürzung der APD90 , aufgeteilt in
linksventrikulär (MAP1–4) und rechtsventrikulär (MAP5).
Abbildung 3.5: Beispiel der APD-Verkürzung eines LQT1-Kaninchens
grau: vor NS1643, schwarz: nach NS1643
Wenn man MAP1–5 separat betrachtet, wie im unteren Teil der Abbildung 3.6, ist bei
LMC und den LQT1 für jede MAP eine signifikante Verkürzung der APD90 festzustellen.
Bei LQT2 hingegen verkürzten sich MAP2 und MAP3 signifikant, MAP1, MAP4 und MAP5
verkürzten sich nicht signifikant, betrachtet man aber alle 5 MAPs zusammen, ist kein
signifikanter Effekt festzustellen.
Die Subgruppenanalyse der LQT1-Kaninchen zeigt beim Vergleich der linksventrikulären
APDs ober- und unterhalb der 50. Perzentile einen signifikanten Unterschied vor NS1643
55
Abbildung 3.6: Verkürzung der APD90
Ergebnisse
56
Ergebnisse
sowohl zwischen den beiden LQT1-Gruppen (Abbildung 3.7) als auch zwischen den LQT1
mit längeren APDs und den LMC. Mit der Verkürzung der APDs durch NS1643 wurden
diese Unterschiede bereits nach 15 min aufgehoben, mit einer Verkürzung um 40,8 ms und
21,6 ms bei den LQT1 mit den jeweils längeren und kürzeren APDs.
Abbildung 3.7: Subgruppenanalyse der APD-Verkürzung bei LQT1
3.2.2 Dispersion der MAPs
Weiterhin wurde die Dispersion zwischen den APDs der unterschiedlichen MAPs untersucht.
Dabei zeigten sich zwischen den Genotypen keine signifikanten Unterschiede der Dispersion zwischen Herzspitze und Herzbasis (MAP1-MAP4) mit längeren APDs apikal: LMC:
11,6 ±6,7 ms, LQT1: 3,4 ±7,0 ms und LQT2: 4,6 ±12,0 ms; zwischen rechtem und linkem
Ventrikel epikardial (MAP5-MAP2) mit längeren APDs rechts: LMC: 4,5 ±7,2 ms, LQT1:
6,3 ±6,8 ms (p<0,05) und LQT2: 4,0 ±7,6 ms und transmural rechtsventrikulär (MAP6MAP5) mit längeren APDs endokaridal: LMC: 16,0 ±8,3 ms und LQT1: 4,1 ±8,1 ms. Die
NS1643-Perfusion veränderte die apikal-basale Dispersion bei allen drei Genotypen nicht
signifikant. Die links-rechtsventrikuläre Dispersion vergrößerte sich bei LQT1 signifikant auf
16,6 ±3,8 ms (p<0,05) mit hoch signifikant längerer APD rechtsventrikulär im Vergleich
zu linksventrikulär (p<0,001). Bei LMC und LQT2 vergrößerte sie sich nicht signifikant.
Die transmurale Dispersion der Repolarisation (TDR) konnte nach der Applikation von
NS1643 nicht untersucht werden, da die Qualität der endokardialen Elektrode über die
57
Ergebnisse
Zeit zu stark abnahm. Der untere Teil der Abbildung 3.6 gibt Einblick über die Dispersion
der einzelnen MAPs.
3.2.3 Effektive ventrikuläre Refraktärzeit
Die Verkürzung der APDs spiegelte sich in der Verkürzung der effektiven ventrikulären
Refraktärzeiten (ERP) wider. Diese wurden bei einer Grundstimulation von 3 Hz, 4 Hz, und
4,5 Hz vor und nach der Perfusion mit 5µM NS1643 gemessen. Bei den Basismessungen
hatten beim Vergleich der Genotypen die LQT2-Kaninchen signifikant längere ERPs bei
3 Hz um 33,3 ±14,0 ms als LMC- (p<0,05) und um 30,6±12,2 ms als LQT1-Kaninchen
(p<0,05).
Abbildung 3.8: Effektive ventrikuläre Refraktärzeiten
Wie bei den APDs verkürzten sich die ERPs der LQT1 und LMC signifikant. Bei den LQT2
verkürzten sie sich nicht signifikant. Wie in Abbildung 3.8 zu sehen, verkürzten sich bei
3 Hz die Refraktärzeiten der LQT1 um 23,7 ±8,7 ms (p<0,05), der LMC um 22,6 ±11,7 ms
58
Ergebnisse
(p<0,05) und der LQT2 um 18,7 ±25,9 ms (p=0,49). Bei der Grundstimulation von 4 Hz
und 4,5 Hz erreichten die ERP-Verkürzungen bei LQT1-Kaninchen keine Signifikanz im Gegensatz zu den LMC-Kaninchen. Abbildung 3.9 zeigt die ERP-Verkürzung für die einzelnen
Tiere bei 3 Hz.
Abbildung 3.9: Effektive ventrikuläre Refraktärzeiten bei 3 Hz
Jede Gerade entspricht einem Tier
3.2.4 Adaptation der APDs an HF-Wechsel
3.2.4.1 Adaptation vor NS1643
Nach einem Wechsel der Herzfrequenz passt sich die Dauer der Aktionspotentiale der neuen
Herzfrequenz an. Eine langsamere Anpassung prädestiniert zu Kammerflimmern (Baher
et al., 2007). In dieser Studie wurden der abrupte Übergang von 3 Hz (180/min) auf 4 Hz
(240/min) analysiert. Die Anpassung erfolgte mit einem initialen raschen Abfall der APD
59
Ergebnisse
APD � � [ms]
AP
130
LQT1
Tau
Tau == 28.1
28.1 ss
120
110
LMC
Tau = 18.9 s
100
0
20
40
Zeit [s]
60
80
3
100x10
Abbildung 3.10: Beispiele für APD-Adaptation
und anschließend einem langsamen exponentiellen Abfall in Abhängigkeit der Zeit, der
mit der Gleichung AP Dt = AP DP lateau + ∆AP D × e
−t
τ
beschrieben werden kann. Dabei
gibt τ die Zeitkonstante an. Je kleiner τ , desto schneller ist die Anpassung. Abbildung
3.10 zeigt je ein Beispiel von LMC und LQT1 mit langsamerer Anpassung bei LQT1. Zur
Untersuchung der Rolle von IKs bei der Anpassung der APDs, wurde die APD-Anpassung
der LQT1 und LMC als Basiswert miteinander verglichen. Dabei zeigte sich eine signifikant
langsamere Adaptation (gemessen in τ ) der LQT1 an allen linksventrikulär gemessenen
MAPs (Appildung 3.11): apikal-anterior (MAP1): 6,4 ±2,8 s (p<0,05), mittig-posterior
(MAP3): 11,2 ±4,3 s (p<0,05), basal-posterior (MAP4): 8,9 ±3,7 s (p<0,05). Rechtsventrikulär war die Adaptation der LQT1 langsamer, allerdings nicht signifikant. Im Gegensatz zur
Anpassungsrate war die absolute Größe der APD-Verkürzung bei beiden Genotypen gleich.
Für LQT1 und LMC war die Verkürzung jeweils bei MAP1 17,5 ±1,2 ms und 14,8 ±1,0 ms,
MAP3 19,3 ±1,3 ms und 17,3 ±1,7 ms, MAP4 16,5 ±1,7 ms und 12,6 ±1,5 ms und MAP5
17,6 ±2,2 ms und 15,4 ±1,0 ms (p jeweils ns).
60
Ergebnisse
Abbildung 3.11: APD-Adaptation bei HF-Wechsel von 3 Hz auf 4 Hz
3.2.4.2 Adaptation unter Einfluss von NS1643
Um zu untersuchen, inwieweit NS1643 dieses Verhältnis beeinflussen könnte, wurde die
Anpassungsfähigkeit nach der 45-minütigen Applikation von NS1643 durch Vergleich der
τ -Werte analysiert. Bei den LQT1 zeigte sich keine veränderte Anpassung der APDs an die
HF-Änderung. Bei den LMC-Kaninchen hingegen wurde die Anpassungsfähigkeit durch
NS1643 verlangsamt, die τ -Werte glichen sich denen der LQT1-Kaninchen an, wie in der
Abbildung 3.11 zu sehen. Die Vergrößerung von τ bei den LMC nach NS1643 betrug bei
MAP1 12,6 ±3,8 s (p<0,01), bei MAP3 11,85 ±5,3 s (p<0,05) und bei MAP4 8,9 ±3,2 s
(p<0,05).
61
Ergebnisse
3.2.5 Mechanischer Alternans
3.2.5.1 Inzidenz von mechanischem Alternans
Das Auftreten von mechanischem Alternans (MA) wurde als alternierender LVP über
5 % bei 3 Hz, 4 Hz, 4,5 Hz und 5 Hz bei allen drei Genotypen untersucht. Die Tabelle
3.2 zeigt das prozentuale Auftreten von mechanischem Alternans bei allen untersuchten
Stimulationsfrequenzen zwischen den Genotypen. Bei 3 Hz und 4 Hz zeigte sich kein
signifikanter Unterschied zwischen den Genotypen, während bei 4,5 Hz deutlich mehr
LQT1- und LQT2-Tiere alternierenden LVP entwickelten. Dies ergab einen Trend zwischen
LQT1 und LMC (p<0,1) und ein signifikant häufigeres Auftreten bei LQT2 verglichen
mit LMC (p<0,05). Weiterhin trat mechanischer Alternans bei schnellerer Stimulation
häufiger auf als bei langsamerer Stimulation. Bei 4,5 Hz war der Unterschied zu 3 Hz bei
LQT1 signifikant (p<0,05), bei LMC war das häufigere Auftreten erst bei 5 Hz signifikant
(p<0,05). Bei LQT2 erreichte der Effekt keine Signifikanz (p<0,1).
LMC
LQT1
LQT2
3 Hz
1/10 (10 %)
1/13 (7,7 %)
1/6 (17 %)
4 Hz
3/10 (30 %)
3/13 (23 %)
3/6 (50 %)
4,5 Hz
2/10 (20 %)
8/13 (62 %)A
5/6 (83 %)B
5 Hz
3/4 (75 %)A
3/4 (75 %)
2/2 (100 %)
A p<0,05 im Vergleich zu 3 Hz, B p<0,05 im Vergleich zu LMC
Tabelle 3.2: Häufigkeit von mechanischem Alternans Basismessung
LMC
LQT1
LQT2
3 Hz
0/6
0/9
0/6
4 Hz
0/5
0/8
0/3
4,5 Hz
0/4
0/7*
0/3*
5 Hz
0/1
0/2
keine Werte
* p<0,05 im Vergleich zur Basismessung
Tabelle 3.3: Häufigkeit von mechanischem Alternans nach NS1643
Erstaunlicherweise war nach der Perfusion mit 5µM NS1643 der mechanische Alternans
durchgehend bei allen Genotypen und Stimulationsfrequenzen aufgehoben (Tabelle 3.3).
Dieser Effekt ist bei 4,5 Hz signifikant für LQT1 (p<0,05) und LQT2 (p<0,05), bei LMC
zeigte sich kein Effekt (p=1), dort war bereits vor NS1643 weniger Alternans zu beobachten. Bei 5 Hz und nach der NS1643-Perfusion ist die Anzahl der Werte geringer, da die
Versuchsreihe mit 5 Hz erst später begonnen wurde und die Kontraktiliät nach NS1643
62
Ergebnisse
deutlich herabgesetzt war. Der mechanische Alternans wurde nur ausgemessen, wenn
(dLVP/dt)max >400 mmHg/s betrug.
Abbildung 3.12: Beispiel von MA bei LQT2
grau: vor NS1643, schwarz: nach NS1643
3.2.5.2 Amplitude von mechanischem Alternans
Abbildung 3.13 stellt die Höhe des mechanischen Alternans als Verhältnis des schwaesP1 −LV esP2
chen zum starken Schlag ( LV
LV esP1 −LV edP × 100 %) dar. Dabei ist auffällig, dass der Un-
terschied bei den LQT-Kaninchen zwischen den beiden Schlägen größer war als bei den
LMC-Kaninchen. Aufgrund der geringen Anzahl der Werte können diese allerdings nicht
statistisch verglichen werden und die Beobachtung kann nur als Trend verstanden werden.
Abbildung 3.13: Amplitude von mechanischem Alternans
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mechanischer Alternans häufiger und in ausgeprägterer Form bei LQT1 und LQT2 im Gegensatz zu LMC auftrat und dass nach der
Verkürzung der APDs durch NS1643 der mechanische Alternans generell unterdrückt
wurde.
63
Ergebnisse
3.2.6 Kontraktilität
Während der 45-minütigen Perfusion mit 5µM NS1643 war ein deutlicher Abfall der
Kontraktilität (gemessen in (dLVP/dt)max ) zu beobachten. Dieser Abfall war signifikant bei
allen drei Genotypen, nach 15 min für LMC und LQT1 und nach 30 min für LQT2, wie in
Abbildung 3.14A zu sehen. Nach 45 min verringerte sich die (dLVP/dt)max der LMC um
883,4 ±116,0 mmHg/s, der LQT1 um 564,2 ±72,3 mmHg/s (jeweils p<0,01) und der LQT2
um 321,5 ±130,5 mmHg/s (p<0,05). Um herauszufinden, ob der Abfall an Kontraktilität
auf die hERG-Aktivierung zurückzuführen ist, wurden die drei Genotypen miteinander
verglichen. Abbildung 3.14B zeigt den relativen Abfall der Kontraktilität für alle drei
Genotypen, die Basismessungen jeweils normiert auf 100 %. Dabei wird deutlich, dass der
relative Abfall der Kontraktilität bei LQT1 (p<0,01) und LMC (p<0,01) im Vergleich zu
LQT2 signifikant größer ist. Der prozentuale Abfall der Kontraktilität betrug bei LMC 62 %,
bei LQT1 49 % und bei LQT2 25 %.
Abbildung 3.14: Abfall der Kontraktilität A: absolut, B: Basiswert normiert auf 100%
3.2.7 Induzierbarkeit von Kammerflimmern
Während der Durchführung der effektiven Refraktärzeiten wurde gleichzeitig die Induzierbarkeit von Kammerflimmern erfasst. Das Auftreten von Kammerflimmern wurde bei der
Basisstimulation von 2,5 Hz vor und während der NS1643-Perfusion registriert. Weiterhin
wurde die Induzierbarkeit durch vorzeitige Stimuli in Folge der ERP-Messungen vor und
nach der NS1643-Perfusion beobachtet. Die Tabelle 3.4 zeigt die Häufigkeiten von Kammerflimmern an. Zwischen den Genotypen zeigten sich keine Verschiedenheiten. Hingegen war
64
Ergebnisse
LMC (n=10)
LQT1 (n=13)
LQT2 (n=6)
Basis Grundstimulation
0/10 (0 %)
0/13 (0 %)
0/6 (0 %)
Basis ERP
2/10 (20 %)
5/13 (38 %)
0/6 (0 %)
NS1643 Grundstimulation
1/10 (10 %)
4/13 (31 %)
0/6 (0 %)
NS1643 ERP
8/10 (80 %)*
11/13 (85 %)*
5/6 (83 %)*
* p<0,05 verglichen mit Basis ERP-Messungen
Tabelle 3.4: Prävalenz von Kammerflimmern
nach der NS1643-Perfusion die Induzierbarkeit von Kammerflimmern bei allen Genotypen
signifikant auf 80 %–85 % gegenüber den Basis-ERP-Messungen erhöht (p<0,05 in allen
drei Gruppen).
65
Diskussion
4 Diskussion
4.1 EKG (in-vivo)
4.1.1 QT- und RR-Intervall
Zunächst wurde der Phänotyp der LQT1- und LMC- Kaninchen verglichen und zeigte ein
leicht verlängertes QT-Intervall von 11,9 ±6,2 ms (p<0,08) gegenüber LMC. Damit ist
ein Phänotyp sichtbar, der allerdings nicht so deutlich ausgeprägt ist wie bei früheren
Studien mit den transgenen Kaninchen (Brunner et al., 2008). Dies hat seine Gründe in
der variablen Expressivität der Mutation, was durch die Subgruppenanalyse mit signifikant
längerem QT-Intervall der LQT1 oberhalb der 50. Perzentile im Vergleich zu LMC deutlich
wird. Neben der variablen Expressivität beim LQTS ist bekannt, dass der Verlust von IKs
nicht immer zu einer starken Ausprägung des Phänotyps führen muss. Beim Menschen
haben 30 % der Mutationsträger ein normales QT-Intervall (Priori et al., 2003). Beim
Kaninchen wurde pharmakologisch gezeigt, dass eine Blockierung von IKs nicht zu einer
Verlängerung des QTc führt (Lengyel et al., 2001). Somit ist ein leicht, nicht signifikant
verlängertes QT-Intervall gut mit dem Genotyp vereinbar.
NS1643 verkürzte bei LQT1 das QT-Intervall nach 37,5 min und den QTindex nach
15 min signifikant im Vergleich zur Kontrolllösung. Dieser Effekt zeigt den Anstieg von
IKr im Repolarisationsstrom. Bei LMC zeigte sich zwar auch eine Verkürzung. Diese
war allerdings nicht signifikant. Der Unterschied zwischen LQT1 und LMC liegt in der
Expression von IKs . IKs -blockierenden Eigenschaften von NS1643 wurden beschrieben
(Hansen et al., 2006). So ist es möglich, dass die IKs -Blockierung die Verkürzung des
QT-Intervalls durch die IKr -Erhöhung bei LMC teilweise aufhebt. Die Verkürzung des
QT-Intervalls nach der NS1643-Infusion bei LQT1 ist nicht so ausgeprägt wie bei der
vorhergehenden Studie am erworbenen LQTS durch AV-Block III ◦ oder den IKr -Blocker
Dofetelide (Diness et al., 2008). Obwohl diese Studie die einzige andere in-vivo-Studie
mit NS1643 ist, ist sie jedoch nur bedingt vergleichbar. Die Kaninchen mit AV-Block
wurden mit 60/min (RR=1000ms) stimuliert, einer Herzfrequenz, die weit außerhalb des
66
Diskussion
physiologischen Bereichs von sedierten Kaninchen liegt (156/min (RRLMC =384 ±39 ms)
(Odening et al., 2008)). Die Kaninchen für das pharmakologische LQT-Modell bekamen
eine Infusion von Dofetelide und Methoxamine. Beide Medikamente führen wiederum
zu einer unphysiologischen RR-Verlängerung auf 480 ms, und die gleichzeitige Infusion
der zwei Medikamente und darauffolgend NS1643 macht Interaktionen wahrscheinlich.
Die geringere Verkürzung in dieser Studie ist wahrscheinlich auf die schnellere, aber
physiologischere Herzfrequenz von 176/min (RR=400 ms) zurückzuführen.
Mit der Infusion von NS1643 zeigte sich nicht nur eine Verkürzung des QTindex , sondern auch des RR-Intervalls. Eine Blockierung von hERG in Zellen des Sinusknotens bei
Kaninchen durch E-4031 führte in Studien zur Verlängerung des RR-Intervalls und inhibierte in höheren Konzentrationen die spontane Generation des AP komplett, ohne dabei
If zu inhibieren. Daraus folgt, dass IKr wesentlich an der Automatie der sinoatrialen
Zellen bei Kaninchen beteiligt ist (Verheijck et al., 1995). Eine Erhöhung von IKr wie
in dieser Studie könnte nun über den entgegengesetzten Mechanismus zur Steigerung
der Automatie im Sinusknoten führen. Auch bei dem pharmakologischen LQT-Modell
von Diness et al. wurde ein Anstieg der Herzfrequenz beobachtet (Diness et al., 2008).
Warum der Anstieg der Herzfrequenz bei LMC geringer ist, lässt sich schwer erklären. IKs
ist wahrscheinlich nicht an der Automatie des Sinusknotens bei Kaninchen beteiligt (Lei
and Brown, 1996). Wie schon beschrieben, konnte bei den Langendorff-Experimenten
ein starker Abfall der Inotropie beobachtet werden. Es wäre dementsprechend als zweiter
Mechanismus ein kompensatorischer Anstieg der Herzfrequenz auf den Inotropie-Abfall
möglich. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde deshalb das QT-Intervall für die Frequenz
mit den genotypspezifischen Regressionsformeln korrigiert (QTindex ).
Die EKGs einen Tag nach der Applikation zeigten keine anhaltende Verkürzung des
QT-Intervalls nach NS1643. Das bedeutet eine kurze Halbwertszeit der Substanz, so dass
die Wirkung zum Zeitpunkt der Langendorff-Experimente eine Woche später aufgehoben
sein musste. Allerdings war der QTindex signifikant länger gegenüber den Basiswerten der
jeweiligigen Versuchsbeginne. Dies liegt höchstwahrscheinlich an der Analgosedierung,
R
R
S/Rompun
2 % für den 1 1/2
da die Kaninchen vor den Versuchen 3 Dosen Ketanest
stündigen Versuchsablauf bekamen, während sie bei der kurzen EKG-Messung am nächsten
R
R
Tag nur eine Dosis erhielten. Ketanest
S/Rompun
2 % verändert zwar nicht die QT-Dauer
(Odening et al., 2008), jedoch sind die sympathischen Einflüsse bei tieferer Analgosedierung
gemindert.
67
Diskussion
4.1.2 Auftreten von Arrhythmien
Es wurden während der Infusion von NS1643 EKG-Auffälligkeiten und Arrhythmien beobachtet. Diese waren allerdings nicht signifikant erhöht. Die Blutkoagel im rechten Ventrikel während der Autopsie bei zwei der drei verstorbenen LMC-Kaninchen lassen eine
Lungenembolie vermuten. Dazu passen die eher unspezifischen Veränderungen mit STStreckenhebungen und Extrasystolen. Eine Erhöhung der Herzfrequenz passt ebenfalls,
allerdings wurde diese, wie beschrieben, bei allen Tieren beobachtet. Die Trägersubstanz
(PEG400 und Glukose-Monohydrat 5 %) könnte für die Koagel eine wesentliche Rolle
spielen, jedoch ist NS1643 aufgrund der hohen Lipophilie nur in dieser lösbar und i. v.
zu verabreichen. Weiterhin kann vermutet werden, dass NS1643 zu Koronarspasmen mit
ischämischen Bildern führt. Aufgrund der bisher wenigen Studien mit dieser Substanz und
nur einer weiteren in-vivo Studie ist eine Aussage dazu bislang nicht möglich. Bei Diness
et al. wurde eine signifikante Abnahme der ektopen Schläge bei beiden LQT-Modellen
beobachtet. Allerdings ist, wie schon beschrieben, der experimentelle Aufbau sehr verschieden. Die bradykard stimulierten Kaninchen mit AV-Block III ◦ und die Kaninchen mit
Dofetilide-Infusion hatten eine hohe Anzahl von Extrasystolen vor der NS1643-Infusion,
während bei unseren Kaninchen in Ruhe keine Auffälligkeiten beobachtet wurden. Der
stark negativ inotrope Effekt der Substanz an sich könnte aber ebenfalls zu den genannten
EKG-Veränderungen führen.
4.2 Langendorff (in-vitro)
4.2.1 APD-Verkürzung
Zunächst wurden auch bei den in-vitro Experimenten die Genotypen untereinander verglichen, wobei in diesem Teil die LQT2-Kaninchen hinzukommen. Analog zu den in-vivo Experimenten zeigten die LQT1-Kaninchen nur einen leichten Phänotyp von einer 10,4 ±6,1 ms
längeren APD gegenüber den LMC Kaninchen (p=0,11). Studien am Langendorff-Modell
mit pharmakologischer Blockierung von IKs hatten bereits eine nur geringe Verlängerung
der APD von unter 7% gezeigt (Lengyel et al., 2001), vergleichbar mit der 6,6% längeren
APD bei LQT1 gegenüber LMC in dieser Studie. Selbige Untersuchung zeigte eine signifikante Verlängerung der APD um 28% durch Blockierung von IKr , vergleichbar mit unseren
Ergebnissen von 30% bei einer Verlängerung von 58,2 ms von LQT2 gegenüber LMC. Diese
Ergebnisse am Kaninchen sind vergleichbar mit Ergebnissen beim Hund (Varro et al., 2000)
68
Diskussion
und beim Menschen (Jost et al., 2005) mit erheblich längeren APDs durch IKr - als durch
IKs -Blockierung.
Die 45-minütige Perfusion mit NS1643 führte bei LMC und LQT1 zu einer signifikanten
Verkürzung der APDs aller MAPs. Dies zeigt, dass die Erhöhung von IKr auch in-vitro zur
Verkürzung der APD beim angeborenen LQT1 führt. Wie bei dem in-vivo Teil ist auch hier
eine stärkere Verkürzung bei LQT1 im Vergleich zu LMC festzustellen, erklärbar durch
die IKs -blockierenden Eigenschaften von NS1643. Bei der Subgruppenanalyse innerhalb
der LQT1 zeigt sich eine größere Verkürzung bei LQT1 mit den APDs oberhalb der 50.
Perzentile im Vergleich zu den anderen LQT1. Die unterschiedliche Länge der Aktionspotentiale als Basiswert wird mit Verkürzung durch NS1643 aufgehoben. Dies geschieht durch
die Rekrutierung aller möglichen hERG-Kanäle mit maximaler Erhöhung von IKr durch
NS1643. Die Verkürzung der APD durch NS1643 wurde ebenfalls in zahlreichen anderen
Studien beschrieben (Diness et al., 2006; Killeen et al., 2008; Peitersen et al., 2008).
Bei LQT2 zeigt sich eine nicht-signifikante Verkürzung der gesamt-epikardialen APDs.
Dadurch wird deutlich, dass durch die loss-of-function Mutation in hERG bei LQT2 der
hERG-Öffner NS1643 den hERG-Strom IKr nicht in dem Maße wie bei LQT1 und LMC
erhöhen kann. Allerdings ist dennoch ein Trend zur APD-Verkürzung mit signifikanter
Verkürzung bei MAP2 und MAP3 sichtbar, der nicht zu erwarten war. Bei Betrachtung
der Graphik 3.6 sind die hohen Standardfehler (SEM) bei LQT2 im Vergleich zu LQT1
und LMC auffällig, die eine große Streuung der APDs zeigen. Diese große Streuung weist
auf eine unterschiedliche Expression von IKr hin. Die Überexpression der loss-of-function
Mutation schließt eine Expression des normalen Gens KCNH2 und somit eine teilweise
normale Funktion des Kanals nicht aus. Normalerweise ist durch die Überexpression der
loss-of-function Mutation der Anteil normaler Kanäle sehr gering. Die große Streuung
in dieser Studie legt allerdings bei manchen Tieren einen höheren Anteil von IKr und
damit der normalen hERG-Tetramere nahe. Dies müsste anhand von Patch-Clamp-Studien
überprüft werden. Weiterhin lässt sich nicht ausschließen, dass die APD-Verkürzung durch
NS1643 neben der IKr -Zunahme auch noch auf weitere Effekte zurückzuführen ist.
Auffällig ist beim Betrachten des oberen Teils der Abbildung 3.6 weiterhin der Unterschied im Verlauf der Verkürzung zwischen den Genotypen. Bei LQT1 ist ein direkter Abfall
der APDs bereits nach 15 min, der linksventrikulär schon signifikant ist, zu sehen. Bei LMC
hingegen zeigt sich nur ein sehr leichter Abfall und bei LQT2 sogar eine Verlängerung der
APD nach 15 min. Dies könnte auf die Blockierung von IKs (Hansen et al., 2006) durch
69
Diskussion
NS1643 zurückzuführen sein, die anfänglich der IKr -Erhöhung entgegenwirkt.
Beim Vergleich der in-vitro und in-vivo Experimente wird deutlich, dass die Verkürzung
der APDs (21,3 % und 18,2 % für LQT1 und LMC) stärker ausgeprägt ist als die Abnahme des QTindex (8,4 % und 3,8 % für LQT1 und LMC). Die in-vivo Plasmakonzentration
lässt sich nicht ermitteln und könnte unterhalb der Perfusionskonzentration von 5 µM im
Langendorffexperiment liegen. Insofern sind die EKG- und die Langendorff-Experimente
quantitativ nur bedingt vergleichbar. Wichtig ist jedoch, dass durch NS1643 sowohl das
QT-Intervall in-vivo als auch die APDs in-vitro verkürzt wurden.
4.2.2 Dispersion der MAPs
Cheng et al. zeigte 1999 erstmals die unterschiedliche Verteilung von IKr und IKs beim
Kaninchen mit einem höheren Anteil von IK und IKs basal und IKr apikal, resultierend
in einer apikal längeren APD als basal (Cheng et al., 1999). Dies steht in Einklang mit
diesen Ergebnissen, die bei allen drei Genotypen eine im Vergleich zu basal (MAP4) leicht
längere APD apikal (MAP1) zeigen, wenn auch nicht signifikant. Bei diesen Ergebnissen
ist zu beachten, dass aufgrund der Lage der MAPs (siehe Abbildung 2.5) die apikale
Elektrode anterior liegt, während die basale Elektrode posterior liegt und ein Einfluss auf
die Dispersion nicht ausgeschlossen werden kann.
Die Dispersion zwischen linkem und rechtem Ventrikel zeigte bei allen drei Genotypen
keine signifikanten Unterschiede, mit geringfügig längeren APDs rechts. Bei Hunden hingegen wurden signifikant kürzere APDs der M-Zone rechtsventrikulär als linksventrikulär
gemessen (Volders et al., 1999). Ergebnisse bei Kaninchen liegen allerdings nicht zum
Vergleich vor.
Weiterhin wurde die transmurale Dispersion der Repolarisation (TDR) untersucht,
welche nach Antzelevitch die entscheidende Dispersion in der Ursache für Reentry-Tachykardien darstellt (Antzelevitch and Shimizu, 2002). Hier konnte nur der rechte Ventrikel
untersucht werden, da sich im linken Ventrikel der Latexballon für die Simulation der
Vorlast befand. Es zeigten sich längere APDs endokardial als epikardial bei LMC und LQT1,
wie schon in vorhergehenden Studien auch bei Kaninchen beschrieben (Xu et al., 2001;
Idriss and Wolf, 2004). In dieser Studie waren die Unterschiede zwar nicht signifikant,
allerdings lassen sich Patch-Clamp-Ergebnisse hinsichtlich der Quantität nur bedingt auf
das gesamte Herz übertragen (Anyukhovsky et al., 1996). Bei LQT2 reichte die Anzahl der
Versuche und die Qualität der endokardialen Elektrode für eine statistische Auswertung
70
Diskussion
nicht aus, aber auch dort waren endokardial längere APDs als epikardial festzustellen.
Nach Xu at al. sind IKs und Ito in Kaninchenventrikeln subepikardial höher ausgeprägt als
subendokardial, was die längeren APDs subendokardial erklären könnte, während IKr in
beiden Schichten gleich ausgeprägt ist (Xu et al., 2001). So ist, wie zu erwarten, bei den
LQT1 Kaninchen die Dispersion epi- und endokardial auch geringer als bei LMC, wenn auch
nur minimal. Interessant wäre die Auswertung nach NS1643 mit der Frage, ob hier eine
erhöhte Dispersion zu der beobachteten erhöhten Induzierbarkeit von Kammerflimmern
führen könnte. Leider ließ die Qualität der Messung an der endokardialen Elektrode mit
der Zeit so stark nach, dass eine Auswertung nicht möglich war. In vorherigen Studien
führte NS1643 zu erhöhter transmuraler Dispersion (Lu et al., 2008).
NS1643 veränderte die regionale Dispersion der APDs apikal-basal nicht signifikant.
Die links-rechtsventrikuläre Dispersion vergrößterte sich signifikant bei LQT1 auf hoch
signifikant längere APDs rechts. Bei LMC und LQT2 vergrößerte sie sich ebenfalls, allerdings
nicht signifikant.
Somit zeigen diese Ergebnisse kein eindeutiges Bild, da die apikal-basale-Dispersion
unverändert blieb während die links-rechtsventrikuläre-Dispersion sich erhöhte. Die einzelnen Elektroden können allerdings nur eine Tendenz geben. Um genauer angeben zu
können, ob eine gesteigerte Dispersion eine Ursache für die erhöhte Induzierbarkeit von
Kammerflimmern sein kann, müssten neben der regionalen Dispersion noch weitere Heterogenitäten beobachtet werden. Wie schon unter Pathomechanismen des LQTS in der
Einleitung erklärt, sind für die Entstehung von Reentry-Kreisen die transmurale Dispersion,
vor allem durch Verlängerung der M-Zone, und die Dispersion angrenzender Myozyten
wesentlich. Dies müsste mittels Patch-Clamp aller drei myokardialen Zellschichten und
Optical-Mapping untersucht werden. Aufgrund der heterogenen Verteilung von IKr und
IKs wäre es jedoch gut vorstellbar, dass eine Erhöhung von IKr bei vermindertem IKs
durch NS1643 die Heterogenitäten eher erhöht.
4.2.3 Effektive ventrikuläre Refraktärzeit
Beim Vergleich der Genotypen zeigte sich, wie auch beim APD-Basis-Vergleich, bei LQT2
im Vergleich zu LMC und LQT1 eine längere effektive ventrikuläre Refraktärzeit (ERP) bei
allen Frequenzen. Diese war bei 3 Hz signifikant. Damit spiegeln längere APDs längere
ERPs wider. Nach der NS1643-Perfusion verkürzten sich die ERPs signifikant bei 3 Hz für
LMC und LQT1, allerdings nicht für LQT2. Zwar verkürzten sich wiederum einige ERPs
71
Diskussion
bei LQT2, allerdings mit hoher Streuung, was sich durch die unterschiedliche Expression
von hERG erklären lässt. Die Verkürzung der APD durch die hERG-Öffnung geht also mit
der Verkürzung der effektiven Refraktärzeit einher. Eine Verkürzung der ERP wurde schon
in früheren Studien mit NS1643 beschrieben (Peitersen et al., 2008), trotz Verlängerung
der Postrepolarisations-Refraktärzeit (Peitersen et al., 2008; Hansen et al., 2006). Dies
könnte jedoch, neben der eventuell erhöhten Dispersion, ein weiterer Mechanismus sein,
der zu erhöhter Induzierbarkeit von Kammerflimmern führt. Eine kürzere ERP bei gleicher Erregungsausbreitungsgeschwindigkeit führt zu kürzerer Wellenlänge (λ = ERP ×
Erregungsausbreitungsgeschwindigkeit), also der Strecke, die ein Impuls während der
Refraktärzeit zurücklegt. Ist diese Strecke groß, müsste der Reentry-Kreis ebenfalls groß
sein und wird daher unwahrscheinlich. Ist diese Strecke klein, kommt es schneller zu
kleinen Reentry-Kreisen und damit zu Fibrillationen (Smeets et al., 1986). Die Verkürzung
der ERP durch NS1643 könnte also zu einer kürzeren Wellenlänge und damit zu einer
höheren Wahrscheinlichkeit und vor allem zu größerer Persistenz von Reentry-Erregungen
führen. Dieser proarrhythmische Effekt, bereits beschrieben bei Peitersen et al. (Peitersen
et al., 2008), könnte eine wesentliche Erklärung für die signifikant höhere Induzierbarkeit
von Kammerflimmern nach NS1643 in dieser Studie sein.
4.2.4 Adaptation der APDs an HF-Wechsel
Die Anpassung der APD an HF-Wechsel ist eine wesentliche dynamische Eigenschaft. Da
besonders bei LQT1 die Arrhythmien oft bei HF-Anstiegen durch sympathische Stimulation
ausgelöst werden, wurde in dieser Studie die APD-Anpassung bei LQT1 mit LMC verglichen.
Bei der Basismessung der APD-Adaptation ist auffällig, dass an allen gemessenen MAPs
die Adaptation an die neue Herzfrequenz, gemessen in τ , bei LQT1 langsamer als bei
LMC war (siehe Abbildungen 3.10 und 3.11). Zwei Mechanismen führen bei HF-Erhöhung
normalerweise zur Rekrutierung von mehr IKs . Einerseits führt β-adrenerge Stimulation
über verschiedene Signalwege zur Erhöhung von IKs (Sanguinetti et al., 1991; Marx
et al., 2002). Andererseits ist IKs bei schnelleren Frequenzen per se erhöht (Diness et al.,
2006). Wahrscheinlich haben die Kanäle aufgrund ihrer langsamen Kinetik nicht genügend
Zeit vor dem nächsten AP zu deaktivieren und kumulieren im offenen Zustand (Ravens
and Wettwer, 1998). In dieser Studie wurde also der zweite Mechanismus im Vergleich
von LQT1 und LMC vor und nach der NS1643-Perfusion untersucht. Dabei ist zu sehen,
dass die APD Adaptation aufgrund der rekrutierbaren Kv LQT1, die bei LQT1 eine loss-of-
72
Diskussion
function Mutation aufweisen, schneller ist bei LMC. Dies zeigt die Bedeutung von IKs bei
abrupter HF-Erhöhung. Eine langsamere Anpassung kann in dieser vulnerablen Phase zu
Kammerflimmern führen (Baher et al., 2007) und geht mit der Beobachtung einher, dass
Tachyarrhythmien bei LQT1 besonders von HF-Erhöhung und sympathischer Stimulation,
wie etwa bei Bewegung und emotionalem Stress, getriggert werden. Hier zeigen sich
genotypische Unterschiede. Obwohl die APDs bei LQT1 gegenüber LMC nicht signifikant
länger sind, zeigt sich hier deutlich der Verlust von IKs . Damit wird erneut dessen Rolle,
nicht als der wesentliche K+ -Repolarisationsstrom, sondern als Repolarisationsreserve bei
APD-Verlängerung besonders bei erhöhten Herzfrequenzen deutlich (Varro et al., 2000).
Nach der Erhöhung von IKr durch NS1643 wäre vielleicht eine Angleichung der LQT1
an LMC durch zusätzliche Rekrutierung von hERG-Kanälen bei LQT1 zu erwarten gewesen.
Es zeigte sich jedoch ein konträrer Effekt. Die τ -Werte der LQT1 änderten sich nicht. Bei
den LMC hingegen vergrößerten sie sich, glichen sich denen der LQT1 an. Die Adaptionsfähigkeit bei LMC wurde nach NS1643 also verlangsamt. Dies ist wahrscheinlich auf die
IKs -Blockierung zurückzuführen, der bei NS1643 beschrieben wurde (Hansen et al., 2006).
Bei Co-Expression der beiden Kanäle überwiegt zwar der Effekt auf hERG (Hansen et al.,
2006; Diness et al., 2006), dabei wird aber erneut deutlich, dass bei der Anpassungsrate, im
Gegensatz zur APD-Länge, hERG nicht die wesentliche Rolle spielt, sondern Kv LQT1 und
damit in diesem Fall den blockierenden Eigenschaften der Substanz die größere Bedeutung
zukommt.
Es wäre interessant, das gleiche Experiment unter β-adrenerger Stimulation mit Isoproterenol durchzuführen. Zu erwarten wäre, dass bei der Basismessung der Unterschied
der Adaption zwischen LMC und LQT1 aufgrund der zusätzlichen Aktivierung von IKs bei
LMC stärker ist als ohne sympathische Stimulation. Dies würde weitere Auskünfte über den
Pathomechanismus der ventrikulären Tachykardien unter sympathischer Stimulation bei
LQT1 geben.
4.2.5 Mechanischer Alternans
Mechanischer Alternans (MA) und T-Wellen Alternans (TWA) sind wichtige diagnostische
Kriterien beim LQTS (Schwartz et al., 1993). Sie spiegeln Heterogenitäten während der
Repolarisation wider und sind dadurch Prädiktoren für Kammerflimmern (Pastore et al.,
1999; Rosenbaum et al., 1994).
Mechanischer Alternans ist stark frequenzabhängig mit verstärktem Alternans ab einem
73
Diskussion
bestimmten HF-Schwellenwert (Pastore et al., 1999). Ein HF-Schwellenwert konnte mit
diesem Versuchsprotokoll zwar nicht ermittelt werden, es zeigt sich aber übereinstimmend
auch in dieser Studie ein häufigeres Auftreten bei höheren Frequenzen, wie in Tabelle 3.2
zu sehen. Dieses war für LQT1 und LMC signifikant, für LQT2 wird dies ebenfalls deutlich,
allerdings erreicht der Effekt aufgrund der geringeren Anzahl der Tiere keine Signifikanz.
Dabei war ein verstärktes Auftreten bereits bei niedrigeren Frequenzen und ein häufigeres
Auftreten bei den LQT-Kaninchen im Vergleich zu den LMC-Kaninchen auffällig (bei 4,5 Hz
MALMC :20 %, MALQT1 :62 % und MALQT2 :83 %). In einer Optical-Mapping Studie wurde
ebenfalls das Auftreten von APD-Alternans bei niedrigeren Stimulationsfrequenzen und
höherer Alternans von LQT2-Kaninchen im Vergleich mit LMC-Kaninchen beobachtet, was
sich in dieser Studie hinsichtlich des mechanischen Alternans bestätigt (Ziv et al., 2009).
Nach Xie et al. liegt die Ursache des MA im Alternans des Ca2+ -Zyklus mit Beeinträchtigung der Ca2+ -Abgabe oder Ca2+ -Aufnahme bei höheren Herzfrequenzen (Xie et al.,
2008). Es ist also möglich, dass eine im Verhältnis zur Systole zu kurze Diastole, wie beim
LQTS, aufgrund der zu geringen Zeit für die Wiederaufnahme des Ca2+ ins SR oder für
die Erholung der L-Typ-Ca2+ -Kanäle zu kardialem Alternans führt (Fox et al., 2002). So ist
verständlich, dass sich die höchste Amplitude des Alternans bei LQT2 mit längster APD,
die nächsthöhere Amplitude sich bei LQT1 und die niedrigste Amplitude sich bei LMC
zeigt. Dies stimmt mit oben genannter Optical-Mapping Studie überein, die bei LQT2 einen
höheren diskordanten Alternans als bei LMC feststellt (Ziv et al., 2009).
Nach der Verkürzung der APDs durch NS1643 war der mechanische Alternans bei allen
Genotypen und auch bei hohen Stimulationsfrequenzen aufgehoben. Dies ist signifikant
bei LQT1 und LQT2. Bei LMC war schon vor NS1643 weniger MA zu beobachten. Der
Effekt der Suppression des kardialen Alternans durch die Erhöhung von IKr wurde bereits in Computersimulations- (Fox et al., 2002) und Patch-Clamp-Studien beschrieben
(Hua et al., 2004). Dabei ist sowohl möglich, dass der Effekt aufgrund der IKr -Erhöhung
an sich, als auch durch die APD-Verkürzung verursacht ist. Ein rechts-shift der hERGInaktivierungskurve zu depolarisierteren Potentialen hin wie durch NS1643 (Hansen et al.,
2006; Casis et al., 2006) führt an sich (über bisher nicht verstandene Mechanismen) zur
Suppression von APD-Alternans (Hua et al., 2004). Andererseits verlängert sich auch
die Diastole mit Verkürzung der APDs. Dadurch können die L-Typ-Ca2+ -Kanäle sich komplett erholen, die Ca2+ -Abgabe und -Aufnahme wieder angleichen und den mechanischen
Alternans damit aufheben.
74
Diskussion
Fraglich ist jedoch, warum NS1643 einerseits zur Suppression von kardialem Alternans
führt, andererseits wahrscheinlich zur Erhöhung der transmuralen Dispersion (Lu et al.,
2008). Lu et al. beobachteten ebenfalls vermehrt Kammerflimmern nach NS1643 trotz
nur geringem APD-Alternans. NS1643 scheint also einerseits zeitliche Heterogenitäten zu
supprimieren, andererseits regionale Heterogenitäten zu erhöhen. Aufgrund des starken
Abfalls der Kontraktilität vor allem bei LQT1 und LMC nach NS1643 kann ein direkter
Zusammenhang zwischen geringer Kontraktilität und Aufhebung des mechanischen Alternans allerdings nicht ausgeschlossen werden. Offen bleibt aber, warum bei LQT2 mit nur
geringer APD-Verkürzung und loss-of-function Mutation in hERG der kardiale Alternans
nach NS1643 dennoch supprimiert wurde.
4.2.6 Kontraktilität
Die Perfusion von NS1643 hatte einen signifikant negativ inotropen Effekt bei allen drei
Genotypen, gemessen in (dLVP/dt)max (Abbildung 3.14A). Dieser Effekt wurde bereits bei
anderen hERG-Öffnern wie NS3623 beschrieben. Dabei wurde von einem unbestimmten
Effekt ausgegangen, der nicht direkt mit der IKr -Zunahme in Verbindung steht, da die Kontraktilität auch mit gleichzeitiger Applikation des hERG-Blockers E-4031 absank (Hansen
et al., 2007). Dies könnte auf diese Studie mit NS1643 übertragbar sein. Jedoch wurde
hier ein signifikant größerer negativ inotroper Effekt bei LMC und LQT1 im Verhältnis zu
LQT2 beobachtet (siehe Abbildung 3.14B). Damit ist darüber hinaus von einem direkten
Effekt durch die hERG-Öffnung auszugehen. Durch die starke APD-Verkürzung und somit
im Verhältnis zur Diastole sehr kurze Systole ist, ähnlich den Konzepten des mechanischen
Alternans, ein Missverhältnis im Ca2+ -Stoffwechsel wahrscheinlich. Die reduzierte Plateauphase könnte für den Ca2+ -Einstrom zu kurz sein und eine reduzierte elektromechanische
Kopplung und reduzierte Kontraktion zur Folge haben.
4.2.7 Induzierbarkeit von Kammerflimmern
NS1643 erhöhte das Auftreten von induziertem Kammerflimmern signifikant bei allen drei
Genotypen. Dieser proarrhythmische Effekt wurde bereits in anderen Studien beschrieben,
mit einer erhöhten Inzidenz von Kammerflimmern im Kaninchen-Langendorff-Modell durch
10 µm NS1643 zusammen mit einer verkürzten Repolarisation, wie in dieser Studie, und einer Erhöhung der transmuralen Dispersion (Lu et al., 2008), die hier leider nicht untersucht
werden konnte. Neben der erhöhten transmuralen Dispersion könnte die Verringerung
75
Diskussion
der ERP durch den bereits beschriebenen Mechanismus der kürzeren Wellenlänge und
die somit erhöhte Persistenz von Kammerflimmern eine Erklärung des proarrhythmischen
Effekts sein. Weiterhin ist durch die starke Verkürzung der APD90 in-vitro von 21,3 % und
18,2 % für LQT1 und LMC die Entwicklung eines SQTS und folgender Prädisposition für
Kammerflimmern möglich. Dies ist vergleichbar mit einer Studie, in der die Aktivierung von
IKr durch einen anderen hERG-Öffner (PD-118057) als Modell des SQTS gebraucht wurde.
Die IKr -Aktivierung führte darin zur Verkürzung des QT-Intervalls und der ERP, jedoch
auch zu erhöhter transmuraler Dispersion der Repolarisation und erhöhter Induzierbarkeit
von polymorphen ventrikulären Tachykardien (Patel and Antzelevitch, 2008). So könnte
auch in dieser Studie die zu weite Verkürzung der APDs proarrhythmisch wirken.
Beim Vergleich mit den in-vivo Ergebnissen ist eine Diskordanz festzustellen, ohne
signifikantes Auftreten von Arrhythmien in-vivo. Eine Erklärung könnte die unterschiedlich
starke Verkürzung sein. Auch in-vivo wurden jedoch polymorphe Extrasystolen und Salven
beobachtet, die zwar nicht signifikant erhöht waren, aber dennoch Hinweise auf einen
proarrhythmischen Effekt der Substanz geben können. Ein weiterer Unterschied ist die
erhöhte Induzierbarkeit von Kammerflimmern in-vitro durch vorzeitige Extrastimuli, die
in-vivo nur durch eine EPU hätte bestätigt werden können, was allerdings ethisch nicht
vertretbar wäre. Der vierte mögliche Grund wäre, dass der stark negativ inotrope Effekt
der Substanz per se eine proarrhythmische Wirkung hat.
Wie schon erwähnt, zeigen andere Studien hingegen antiarrhythmische Effekte von
NS1643. NS1643 senkte die Prävalenz ektoper ventrikulärer Schläge signifikant beim
erworbenen LQTS durch Blockierung oder Downregulation von IKr (Diness et al., 2008).
Dies wurde von Diness et al. in-vivo gezeigt und von einer mathematischen Simulationsstudie bestätigt (Peitersen et al., 2008). Nach Peitersen et al. verhindert NS1643 zwar
EADs um die APD90 , was auch an einzelnen Myozyten gezeigt wurde (Hansen et al., 2006),
vergrößert jedoch durch die Verringerung der ERP das vulnerable Fenster nach der APD90
und erhöht die Persistenz von Kammerflimmern (Peitersen et al., 2008). Es ist demzufolge
denkbar, dass NS1643 zwar die Inzidenz von EADs überwiegend im Kontext von erhöhter
Anzahl ektoper Schläge durch Downregulation/Blockierung von IKr im Ausgangszustand
supprimiert, allerdings durch Verringerung der ERP, Erhöhung der transmuralen Dispersion, negative Inotropie und zu weite Verkürzung der APD die Wahrscheinlichkeit von
Kammerflimmern an sich erhöht. Der Unterschied der antiarrhythmischen Wirkung dieser Substanz an Modellen des erworbenen LQTS und der proarrhythmischen Wirkung in
76
Diskussion
diesem Kontext ist folgender: Durch Hypokaliämie (Killeen et al., 2008), AV-Block III ◦
und Dofetelide (Diness et al., 2008) findet eine starke Verminderung von IKr statt, die
per se proarrhythmisch wirkt und mit NS1643 durch Kompensation der unphysiologischen
Zustände aufgehoben werden kann. In dieser Studie war der Ansatz ein anderer. Der
Mangel an IKs sollte durch die IKr -Zunahme kompensiert werden. Dies führt zu einer
starken APD-Verkürzung, da IKr der wesentliche repolarisierende Strom ist, es führt jedoch
nicht zum Ersatz von IKs , wie besonders bei der APD-Adaptation deutlich wurde, und
so eben nicht zur Normalisierung des Phänotyps, sondern zu erhöhter Arrhythmogenität.
Es wäre also eher vorstellbar, dass hERG-Öffner in Zukunft beim LQTS mit erheblicher
QT-Verlängerung bei bestimmten LQT2-Mutationen Bedeutsamkeit erlangen werden.
77
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Einleitung: In dieser Studie wurden erstmalig die Effekte eines hERG-Aktivators an transgenen Kaninchen des Long QT Syndroms Typ 1 und Typ 2 gezeigt. Diese haben eine
loss-of-function Mutation in KvLQT1 (LQT1) oder hERG (LQT2) und zeigen den Phänotyp
eines verlängerten QT-Intervals im EKG gegenüber den Geschwister-Kontrolltieren (LMC).
In vorherigen Studien wurde gezeigt, dass IKr durch NS1643 aktiviert werden kann. Ziel
dieser Studie war es, durch die IKr -Erhöhung die Repolarisationszeit der LQT1-Kaninchen
zu verkürzen und damit den Phänotyp zu korrigieren.
Methodik: Die Wirkung von NS1643 wurde in-vivo anhand von EKG-Studien und
in-vitro im Langendorff-Modell untersucht. In-vivo bekamen die sedierten Kaninchen
eine Infusion mit NS1643 oder Trägerlösung als cross-over-Studie und das QT-Intervall
wurde als Basiswert und über 45 Minuten gemessen. In-vitro wurden die explantierten
Herzen im Langendorffmodell mit NS1643 perfundiert und monophasische APDs über
45 min anhand von MAP-Elektroden gemessen. Weiterhin wurden effektive ventrikuläre
Refraktärzeiten (ERP) durch vorzeitige Extrastimuli, die Dispersion der APDs, das Auftreten
von mechanischem Alternans, die Adaptionsfähigkeit an HF-Wechsel und die Induzierbarkeit
von Kammerflimmern vor und nach NS1643 untersucht.
Ergebnisse: Die QT-Zeit in-vivo und die APDs in-vitro konnten bei LQT1 durch NS1643
signifikant verkürzt werden. Bei LMC war die Verkürzung in-vivo und in-vitro geringer
ausgeprägt. Bei LQT2 verkürzten sich die APDs nicht signifikant, da NS1643 hier aufgrund
der Mutation in hERG IKr nicht erhöhen konnte. Insgesamt nahm die Induzierbarkeit von
Kammerflimmern bei allen drei Genotypen in-vitro durch NS1643 jedoch signifikant zu.
Als Ursache dieser proarrhytmischen Effekte zeigte sich die extensive Verkürzung der APD
und der ERP durch die IKr -Erhöhung bei LQT1 und LMC. Dies führte zu einem verkürzten
Phänotyp mit erhöhter Vulnerabilität, vergleichbar mit dem Short QT Syndrom. Dazu trägt
der negativ-inotrope Effekt der Substanz bei, der in allen drei Gruppen gezeigt werden
konnte. Bei der Analyse der APD-Adaptation an HF-Wechsel zeigte sich, dass NS1643 die
gestörte Adaptation bei LQT1 nicht verbessern konnte. Der fehlende Repolarisationsstrom
IKs konnte dabei nicht mit einer Erhöhung von IKr kompensiert werden.
Schlussfolgerung: Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass durch einen hERG-Aktivator eine pharmakologische Verkürzung des QT-Intervals in-vivo und der APD in-vitro bei
transgenen LQT1 Kaninchen möglich ist. Die Verkürzung der APD auf unphysiologisch kurze Werte ging aber mit einer erhöhten Inzidenz von Arrhythmien und einer verminderten
Kontraktilität in vitro einher. Insofern zeigt diese Studie auch die Schwierigkeit, verlängerte
APDs bei Long QT Patienten pharmakologisch auf das physiologische Maß zu korrigieren.
78
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Abkürzungen
7 Abkürzungen
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Ao Aorta
AP Aortendruck (aortic pressure)
APD Aktionspotentialdauer
APD90 Aktionspotentialdauer bei 90 % Repolarisation
AS Andersen Syndrom
cAMP Cyclisches Adenosinmonophosphat
CF Koronarfluss (coronary flow)
CPVT Katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie
DAD Späte Nachdepolarisation (delayed afterdepolarization)
EAD Frühe Nachdepolarisation (early afterdepolarization)
ERP Effektive Refraktärzeit (effective refractory period)
EPU Elektrophysiologische Untersuchung
ES Extrasystole
(dLVP/dt)max Kontraktilität während der Kontraktion (maximal delta left ventricular
Pressure over delta time
(dLVP/dt)min Kontraktilität während der Relaxation (minimal delta left ventricular
Pressure over delta time)
hERG K+ -Kanal von IKr (auch Kv 11.1) (human Ether-a-go-go Related Gene)
HF Herzfrequenz
HSE Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH
ICa−L Ca2+ -Strom mit langsamer Deaktivierung (longlasting)
ICa−T Transienter Ca2+ -Strom
If Depolarsierender Schrittmacherstrom im Sinusknoten (funny)
IK Repolarsierender K+ -Strom (bestehend aus IKr und IKs )
IK−AT P ATP-gesteuerter K+ -Strom
IK1 K+ -Strom des K+ -Einwärtsgleichrichters
IKr Schneller repolarisierender K+ -Strom der K+ -Auswärtsgleichrichter (rapid)
IKs Langsamer repolarisierender K+ -Strom der K+ -Auswärtsgleichrichter (slow)
IKur Sehr schneller repolaraisierender K+ -Strom (ultra rapid)
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IN a Depolarisierender Na+ -Strom
Ito Transienter Auswärts K+ -Strom (transient outward)
ICD Implantierbarer Kardioverter-Defibrillator (implantable cardioverter-defibrillator)
ICR Intercostalraum
JLNS Jervell-Lange Nielsen Syndrom
KCNH2 Gen für hERG
KCNQ1 Gen für Kv LQT1
Kv LQT1 K+ -Kanal von IKs (auch Kv 7.1)
L-Typ Ca2+ -Kanal langsam deaktivierender Ca2+ -Kanal (longlasting)
LA Linker Vorhof (left atrium)
LCSD Linkskardiale Sympathische Denervation (left cardiac sympathetic denervation)
LMC Geschwistertiere zur Kontrolle (Littermate Control)
LQTS Long QT Syndrom
LV Linker Ventrikel
LVP Linksventrikulärer Druck (left ventricular pressure)
LVdP Linksventrikulär entwickelter Druck (left ventricular developed pressure)
LVedP Linksventrikulärer enddiastolischer Druck (left ventricular end diastolic pressure)
LVesP Linksventrikulärer endsystolischer Druck (left ventricular end systolic pressure)
M-Schicht Midmyokardiale Schicht
MAP Monophasisches Aktionspotential
MA Mechanischer Alternans
MiRP1 regulatorische β-Untereinheit von hERG (minK-related-protein 1)
minK regulatorische β-Untereinheit von Kv LQT1 (minimal K+ -channel)
NCX Na+ /Ca2+ -Austauscher (Na+ /Ca2+ -Exchanger)
PKA Protein-Kinase-A
QTc HF-korrigierte QT-Zeit nach Bazett (QT corrected)
RA Rechter Vorhof (right atrium)
RV Rechter Ventrikel
RWS Romano-Ward-Syndrom
RyR Ryanodinrezeptor
SR Sarco-Endoplasmatisches Retikulum
SEM Standardfehler (Standard Error of Mean)
SERCA Sarco-Endoplasmatische-Retikulum-Ca2+ -ATPase
SIDS Plötzlicher Kindstod (sudden infant death syndrome)
SQTS Short QT Syndrom
SR Sarkoendoplasmatisches Retikulum
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TS Timothy Syndrom
TdP Torsade de Pointes Tachykardie
TDR Transmurale Dispersion der Repolarisation
TWA T-Wellen Alternans
VF Kammerflimmern (ventricular fibrillation)
VT Ventrikuläre Tachykardie
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Danksagung
8 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt PD Dr. med. Michael Brunner für die Ermöglichung der Dissertation. Ich danke dir für die sehr engagierte Betreuung und Unterstützung während der
Experimente und beim Schreiben der Arbeit, die unkomplizierte Arbeitsatmosphäre und
für die Möglichkeit, Einblick in dieses spannende Gebiet zu bekommen.
Frau Prof. Dr. med. Brigitte Stiller danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
I wish to thank Bo Bentzen. Thank you for the good and fun time we had in the lab and all
your help, explanations and discussions during the experiments and afterwards per email
and for the danish songs I learned.
Ich danke meinen Eltern. Vielen Dank für die finanzielle und sonstige Unterstützung
während dieser Arbeit und des Studiums und die Ermöglichung all meiner Auslandspläne.
Papa, dir möchte ich besonders für das mühevolle Korrekturlesen danken.
Ganz besonders danke ich Stefan. Ich danke dir für deine so häufige und geduldige technische Hilfestellung bei Latex und allen anderen Schwierigkeiten, für das Korrekturlesen,
deine liebevolle Unterstützung in jeder Hinsicht und dafür, dass du dir so oft etwas über
Herzen und Kaliumkanäle angehört hast.
Ich danke allen Mitarbeitern der Forschungslabore, insbesondere Irene, für die Hilfe
während der Experimente und den Mitarbeitern in Landwasser und im ZKF für die gute
Zusammenarbeit.
Dr. med. Katja Odening danke ich für die Beratung und die gemeinsame Durchführung
einiger Experimente.
Ich danke meiner Familie und meinen Freunden für ihre Unterstützung.
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Die Seite 98 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der
Online-Veröffentlichung.
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Die Seite 99 (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie ist deshalb nicht Bestandteil der
Online-Veröffentlichung.
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