1. Kurstag - TU Dresden

Fachrichtung Biologie
Institut für Mikrobiologie und
AG Molekulare Biotechnologie
MIKROBIOLOGISCHES GRUNDPRAKTIKUM
für die Bsc-Studiengänge
Biologie und Molekulare Biotechnologie
WS 2012/2013
Arbeitsanleitungen
Inhaltsverzeichnis
1.
KURSTAG .............................................................................................................. 1
1.1.
Einleitung ........................................................................................................ 1
1.2.
Vorkommen von Mikroorganismen................................................................ 3
1.2.1.
1.2.2.
1.2.3.
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
1.3.4.
Nachweis von Mikroorganismen in der Luft mittels Sedimentationsplatten...................3
Nachweis von Mikroorganismen auf Oberflächen ..........................................................4
Mikroorganismen auf der Haut ........................................................................................5
Impftechniken ................................................................................................. 6
Flüssigmedium (Nährbouillon NB) .................................................................................6
Schrägagar (Nähragar NA) ..............................................................................................6
Agarplatte (Nähragar NA) ...............................................................................................7
Hochschichtagar (HSA - Nähragar im Röhrchen)...........................................................7
1.4.
Übersichtsfärbungen ....................................................................................... 7
1.5.
Kalibrieren des Mikroskops und Größenbestimmung von
Mikroorganismen ............................................................................................ 8
1.6.
Mikroorganismen der Mundhöhle .................................................................. 9
2.
KURSTAG ............................................................................................................ 11
2.1.
Auswertung der Versuche 1.2.1. bis 1.2.3. – Mikroorganismen in der
Luft, auf Oberflächen und auf der Haut........................................................ 11
2.2.
Auswertung der Kultivierungen (Versuch 1.3.)............................................ 11
2.3.
Fortsetzung der Isolierung von Streptococcus salivarius (Versuch 1.6.)..... 11
2.4.
Fraktionierter Ausstrich ................................................................................ 11
2.5.
Ausstreichen einer Bakteriensuspension (Spatelplattenmethode) ................ 12
2.6.
Quantifizierung von Mikroorganismen ........................................................ 13
2.6.1.
2.6.2.
2.6.3.
2.7.
3.
Bestimmung der Gesamtzellzahl ...................................................................................13
Bestimmung der Lebendzellzahl....................................................................................14
Ermittlung der Trübung von Zellsuspensionen..............................................................15
Entnahme einer Wasserprobe........................................................................ 15
KURSTAG ............................................................................................................ 16
3.1.
Fortsetzung des Versuchs 1.6. (Isolierung von Streptococcen).................... 16
3.2.
Auswertung der Versuche 2.4. (Fraktionierter Ausstrich),
2.5. (Koloniebildende Einheiten), 2.6.2. (Lebendzellzahlbestimmung)....... 16
II
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
Zellwandaufbau: GRAM-Differenzierung ..................................................... 16
GRAM-Färbung...............................................................................................................16
Schnelltest zur GRAM-Differenzierung ..........................................................................17
Aminopeptidase-Test .....................................................................................................17
3.4.
Aerobe Kulturverfahren ................................................................................ 18
3.5.
Mikroorganismen aus Wasserproben............................................................ 20
4.
KURSTAG ............................................................................................................ 21
4.1.
Auswertung des Versuchs 1.6. - Isolierung von Streptococcus salivarius... 21
4.2.
Auswertung der aeroben Kulturverfahren (Versuch 3.4.) ............................ 21
4.3.
Auswertung des Versuchs 3.5. - Wasserproben ........................................... 21
4.4.
Physiologie der Mikroorganismen................................................................ 21
4.4.1.
4.4.2.
4.4.3.
4.4.4.
4.4.5.
4.5.
4.5.1.
4.5.2.
4.5.3.
4.6.
5.
Verhalten gegenüber Sauerstoff.....................................................................................22
Verwertung von Kohlenhydraten...................................................................................23
Weitere Tests der „Bunten Reihe“ .................................................................................26
Nachweis der Nitratreduktion und Denitrifikation ........................................................27
Mikrobieller Abbau von Biopolymeren - Stärkeabbau..................................................28
Anaerobe Kulturverfahren ............................................................................ 29
FORTNER - Platte ............................................................................................................29
Pyrogallol - Verfahren ...................................................................................................30
Hochschicht - Stichkultur ..............................................................................................30
Anreicherung sulfatreduzierender Bakterien aus Gewässersedimenten....... 31
KURSTAG ............................................................................................................ 32
5.1.
Auswertung der Kohlenhydratverwertung (Versuch 4.4.2.) und anderer
physiologischer Tests (Versuche 4.4.3., 4.4.4., 4.4.5.)................................. 32
5.2.
Auswertung des Versuchs 4.5. – Anaerobe Kulturverfahren ....................... 32
5.3.
Ermittlung einer Wachstumskurve von Escherichia coli ............................. 32
5.4.
Nachweis der Säurefestigkeit von Bakterien ................................................ 34
5.5.
Kapselfärbung nach MANEVAL ..................................................................... 34
5.6.
Nachweis von Speicherstoffen: Neutralfette und
Poly-β-hydroxybuttersäure ........................................................................... 35
5.7.
Hitzeresistenz und Sporenbildung ................................................................ 36
5.7.1.
5.7.2.
Prüfung der Hitzeresistenz.............................................................................................36
Färbung von Endosporen ...............................................................................................37
5.8.
Cyanobakterien ............................................................................................. 38
5.9.
Mikroorganismen des Bodens - Isolierung von Streptomyceten aus
Bodenproben ................................................................................................. 38
III
5.10. Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen ............................... 40
6.
KURSTAG ............................................................................................................ 41
6.1.
Auswertung der Untersuchungen zur Hitzeresistenz (Versuch 5.7.1.)......... 41
6.2.
Wirkung von Desinfektionsmitteln auf Mikroorganismen........................... 41
6.2.1.
6.2.2.
6.3.
6.3.1.
6.3.2.
6.4.
7.
Prüfung von Desinfektionsmitteln .................................................................................41
Inaktivierung von Mikroorganismen durch Desinfektionsmittel...................................43
Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen
(Makro- und Mikromorphologie) ................................................................. 44
Sexuelle Vermehrungsformen bei Hefen (Ascosporen) ................................................45
Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen
(Makro- und Mikromorphologie) ..................................................................................46
Fensterkulturen von Schimmelpilzen ........................................................... 48
KURSTAG ............................................................................................................ 49
7.1.
Auswertung der Wirkung von Desinfektionsmitteln
(Versuche 6.2.1. und 6.2.2.).......................................................................... 49
7.2.
Isolierung einer Reinkultur von Boden-Streptomyceten .............................. 49
7.3.
Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen ausgewählter Schimmelpilze
(Makro- und Mikromorphologie) ................................................................. 50
7.4.
Physiologie von Hefen .................................................................................. 52
7.4.1.
7.4.2.
7.4.3.
8.
Alkanverwertung............................................................................................................52
Lipidverwertung - Bildung extrazellulärer Lipasen.......................................................53
Proteasebildung und Eiweißabbau durch Hefen ............................................................54
KURSTAG ............................................................................................................ 55
8.1.
Auswertung der Physiologie von Hefen (Versuche 7.4.):
Erste Auswertung von Alkanverwertung (Versuch 7.4.1.),
Lipidverwertung (7.4.2.) und Proteinverwertung (7.4.3.) ............................ 55
8.2.
Auswertung der Anreicherung sulfatreduzierender Bakterien aus
Gewässersedimenten (Versuch 4.6.)............................................................. 55
8.3.
Bildung und Wirkung von Antibiotika ......................................................... 55
8.3.1.
8.3.2.
Nachweis der Bildung von Antibiotika - Überschichtungstest......................................56
Wirkungsspektrum von Antibiotika-Bildnern - Strichtest.............................................57
8.4.
Mikroskopie von Streptomyceten ................................................................. 58
8.5.
Nachweis von Bakteriophagen am Beispiel somatischer Coliphagen.......... 59
8.6.
Mikrobiologische Untersuchung von Kefir und Joghurt .............................. 60
IV
9.
KURSTAG ............................................................................................................ 62
9.1.
Zweite Auswertung der Physiologie von Hefen (Versuch 7.4.)................... 62
9.2.
Auswertung des Bakteriophagennachweises (Versuch 8.5.) ........................ 62
9.3.
Bildung und Wirkung von Antibiotika ......................................................... 62
Auswertung der Antibiotika-Bildung durch Boden-Streptomyceten Überschichtungstest (Versuch 8.3.1.) ............................................................................62
Fortsetzung des Wirkungsspektrums von Antibiotika-Bildnern Strichtest (Versuch 8.3.2.) .............................................................................................62
Empfindlichkeitsbestimmung von Bakterien gegenüber Antibiotika mit Hilfe des
Agardiffusionstests (Antibiogramm) .............................................................................63
9.3.1.
9.3.2.
9.3.3.
9.4.
Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln.................................... 64
Auswertung: Mikrobiologische Untersuchung von Kefir und Joghurt (Versuch 8.6.) .64
Untersuchung von Sauergemüse....................................................................................65
9.4.1.
9.4.2.
9.5.
Gärtest mit Hefen .......................................................................................... 66
10. KURSTAG ............................................................................................................ 68
10.1. Auswertung der Versuche zur Bildung und Wirkung von Antibiotika
(Versuche 9.3.1. bis 9.3.3.) ........................................................................... 68
10.2. Fortsetzung und Auswertung: Mikrobiologische Untersuchung von
Lebensmitteln ................................................................................................ 68
10.2.1
10.2.2
10.3
Fortsetzung Versuch 9.4.2. - Untersuchung von Sauergemüse
(Ausstriche der Lake) ...................................................................................................68
Mikrobiologische Untersuchung von Milch - Abschätzung des Keimgehalts
mittels Reduktionstest...................................................................................................68
Hefen zur Lebensmittelherstellung ............................................................... 70
10.3.1. Auswertung Gärtest mit Hefen (Versuch 9.5.) .............................................................70
10.3.2. Vitaltest mit Bäckerhefe ...............................................................................................70
10.3.3. Ausstrichpräparat von Sauerteig...................................................................................70
10.4. Mikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen in Milchprodukten....... 71
Literaturverzeichnis .................................................................................................. 73
Abkürzungen der im Praktikum benutzten festen und flüssigen Medien und
Lösungen .................................................................................................................. 74
V
Hinweise zur Anfertigung der Protokolle
Obwohl jede aus zwei Studierenden bestehende Gruppe nur eine Protokollsammlung
bis ca. zwei Wochen nach dem letzten Kurstag abgeben muss, sollten sich immer
beide Kursteilnehmer mit der praktischen Durchführung und der Auswertung jedes
Versuches befassen.
Es wird eine Protokollvorlage als pdf-Datei zur Verfügung gestellt
(Protokollvorlage_MGP2012_Teil 1 und Protokollvorlage_MGP2012_Teil 2). Dort
tragen Sie alle Ergebnisse, Zeichnungen und Grafiken ein, und haben Raum für die
Bewertung und Diskussion der Ergebnisse.
Ausfüllen der Protokollsammlung:
 Variante 1 (bevorzugt): Sie können die Protokollvorlage mit dem Adobe
Acrobat Reader/Professional ausfüllen und anschließend ausdrucken. Achtung:
nur mit dem Acrobat Professional kann das Dokument zwischendurch
abgespeichert werden. Mit dem Acrobat Reader können die ausgefüllten Daten
nicht gespeichert werden. Auf mehreren Rechnern des Bio-Pools steht eine
Version des Adobe Acrobat Professional zur Verfügung.
Als kostenfreie Alternative kann z. B. PDF-XChange Viewer genutzt werden.
Alle Felder der pdf-Datei, die ausgefüllt werden sollen, lassen sich z. B. in
Acrobat Professional mit Hilfe der Funktion „Felder markieren“ erkennen.
 Variante 2: Sie drucken sich das Dokument unausgefüllt aus und füllen es per
Hand aus.
 Formulieren Sie Ihre Angaben kurz und präzise – ggf. in Stichpunkten.
Auf die Anfertigung eines kompletten wissenschaftlichen Protokolls wird in diesem
Kurs verzichtet, insbesondere auf eine Einleitung/Aufgabenstellung (siehe dazu
jeweilige Einführungsvorträge!) und die Darstellung der Versuchsdurchführung (hier
sind nur evtl. Abweichungen von den Arbeitsanleitungen und Spezifikationen in die
Protokollvorlage einzutragen. Es wäre daher auch wünschenswert, wenn nach der
Durchsicht der Protokollsammlung durch die Praktikumsbetreuer die Protokolle
zusammen mit der Arbeitsanleitung aufbewahrt werden.
 Ergebnisse: Hier ist Wert auf eine exakte, vollständige und übersichtliche
Darstellung der Versuchsergebnisse zu legen, d.h. hier erscheinen auch die
ursprünglichen Messwerte, nicht nur daraus berechnete Ergebnisse oder
abgeleitete Grafiken. Beobachtungen sind genau zu beschreiben.
VI
 Mikroskopische Zeichnungen: Die Zeichnungen werden mit Bleistift auf
weißem Papier direkt im Labor bei der Mikroskopie im Vergleich mit den
vorgelegten typischen Bildern aus den Einführungsdateien erstellt. Die
entsprechenden typischen Bilder sollten Sie deshalb im Kurs ausgedruckt
vorliegen haben! Die Zeichnungen mit erläuternden Beschriftungen und
Größenmaßstab sind an der dafür vorgesehenen Stelle innerhalb der
Protokollsammlung direkt anzufertigen bzw. einzukleben oder einzufügen.
Bitte keine Zeichnungen als Anhang einfügen!
 Grafiken und vergleichende Gesamtauswertetabellen der Ergebnisse aller
Gruppen sind an die dafür vorgesehene Stelle der Protokollvorlage
einzuheften. Oft können erst durch diese Gesamtauswertung aller Gruppene
bessere Aussagen zu den Versuchsergebnissen getroffen werden.
 Diskussion/Auswertung: Bei der Nennung eines Ergebnisses oder
Beobachtung hört ein Protokoll nicht auf! Aus den Ergebnissen sollten
Schlussfolgerungen gezogen werden, die einen Bezug auf die eingangs
genannte Fragestellung haben. Hinweise dazu werden auch im Skript unter
Auswertung gegeben. Hier können auch methodische Fehler diskutiert werden.
Der in der Protokollvorlage vorgegebene Platz sollte für Ihre Diskussion
ausreichen.
Bitte heften Sie keine zusätzlichen Blätter dazu.
 Literatur: Es sollten die Quellen genannt werden, aus denen Informationen
zur Auswertung gewonnen werden bzw. in denen bestimmte methodische
Details beschrieben sind. Auf diese Quellen muss dann aber auch im Text
hingewiesen werden. Das Literaturverzeichnis für die Protokollsammlung kann
auch im Ganzen angefertigt werden (siehe dazu auch Hinweise zum
Urheberrecht und zu Plagiaten auf der Webseite der FR Biologie!).
VII
1. KURSTAG
1.1. Einleitung
Das Praktikum soll mit den grundlegenden mikrobiologischen Arbeitsmethoden
vertraut machen, verschiedene Eigenschaften der Mikroorganismen erkennbar
machen und eine Reihe von Mikroorganismen aus unterschiedlichen Gruppen
vorstellen. Ihr Vorkommen in verschiedenen Umweltbereichen wird nachgewiesen
und ihre Rolle in natürlichen Ökosystemen anhand verschiedener Experimente
deutlich gemacht. Weiterhin soll anhand verschiedener Versuche die Bedeutung von
Mikroorganismen in verschiedenen Industriezweigen deutlich gemacht und ihr
Potential für biotechnologische Nutzungen erkennbar werden.
Arbeitsschutzregeln:
1. Das Tragen eines kochbaren Arbeitskittels mit langen Ärmeln ist Pflicht. Dieser
verbleibt nach Abschluss der Arbeiten im Kursraum auf Garderobenständern.
2. Im Kursraum sind Essen, Trinken und Rauchen verboten. Nahrungsmittel und
Rauchutensilien dürfen nicht im Labor gelagert werden. Kosmetika dürfen nicht
im Kursraum benutzt oder dort aufbewahrt werden.
3. Eine Desinfektion der Hände ist vor Beginn der Arbeiten und nach deren
Beendigung (Achtung, erst desinfizieren, dann waschen!) vor dem Verlassen des
Raumes vorzunehmen.
4. Da es unter den Mikroorganismen pathogene Vertreter gibt, sind alle
unbekannten als potentiell pathogen zu betrachten, und es ist mit entsprechender
Vorsicht mit ihnen zu arbeiten. Die im Kurs ausgegebenen Mikroorganismen
gehören den Risikogruppen I oder II nach der Biostoffverordnung vom 27.01.99
an. Entsprechende Hinweise werden im Kurs gegeben bzw. können nachgelesen
werden unter:
http://www.gesetze-im-internet.de/bundesrecht/biostoffv/gesamt.pdf
5. Mikroorganismen dürfen nicht auf Kleidung, Arbeitsplätze, Geräte usw. gelangen. Verschüttetes Material ist mit Zellstoff abzudecken, der mit Desinfektionsmittel getränkt wurde. Kontaminierte Flächen sind mit Desinfektionsmittel
zu reinigen.
6. Mikroorganismen sind in verschlossenen Gefäßen zu halten, die beimpften
Kulturgefäße sind eindeutig zu beschriften. Impfösen sind nach jeder Benutzung
auszuglühen.
7. Nicht mehr benötigte Kulturen sowie kontaminierte Materialien (Glaspipetten,
Röhrchen usw.) müssen sachgerecht entsorgt werden. Vor der Entsorgung
müssen alle Proben mit Mikroorganismen durch Autoklavieren inaktiviert
werden (Einmal-Produkte in Entsorgungsbeutel, Glasgeräte und –gefäße
inklusive Objektträger werden separat gesammelt zum Autoklavieren).
MGP WS 2012/13
1
8. Beim Pipettieren sind Pipettierhilfen bzw. automatische (Mikro-)Pipetten zu
verwenden. Gebrauchte Glaspipetten sind in dafür vorbereitete Gefäße mit
Desinfektionsmittel (Vorsicht, verdünnte Peressigsäure!), nicht jedoch auf den
Arbeitsplätzen abzulegen. Pipettenspitzen sind in Entsorgungsbeutel am Platz
abzuwerfen, eine Kontamination des Pipettenschafts der Mikropipetten ist in
jedem Fall zu vermeiden!
9. Eine Reinigung der Arbeitsplätze und Flächendesinfektion soll auch am Ende
jedes Kurstages erfolgen.
10. Beim Mikroskopieren mit dem 100er-Objektiv ist Immersionsöl zu verwenden
(Achtung, intensiven Hautkontakt mit diesem Öl vermeiden!). Vor dem Wechsel
vom 100er zum 40er Objektiv ist das Öl mit einem Zellstofftuch vom
Objektträger zu entfernen. Zum Reinigen des Objektivs ist ein weiches,
fusselfreies Kleenex-Tuch zu verwenden. Die Objektive der Kursmikroskope
sind nicht mit Alkohol abzuwischen! Objektive und Okulare nicht abschrauben
oder zerlegen! Eine während des Kurses evt. notwendige Reinigung der
Objektive erfolgt mit Spezialreiniger durch die Praktikumsbetreuer bzw. in
Absprache mit diesen.
Erste Hilfe bei Laborinfektionen
Infektionsgefahr besteht, sobald infektiöses oder möglicherweise infektiöses Material
in den Mund, die Nase, die Augen oder durch eine Verletzung in die Haut gelangt.
Jeder derartiger Vorfall ist dem Praktikumsleiter zu melden! Ärztliche Hilfe ist so
schnell wie möglich in Anspruch zu nehmen, der Kursraum jedoch nicht ohne
Verständigung mit dem Praktikumsleiter zu verlassen. Eine Unfallanzeige ist
innerhalb von drei Tagen zu erstatten!
Gelangt kontaminiertes Material in
den Mund – sofern noch nicht geschluckt, sofort ausspucken! Mit Waschlösung (z. B.
frischer 1%iger H2O2-Lösung) wiederholt spülen, gurgeln und ausspucken.
Weitere Schritte nach Anweisung des Kursleiters bzw. des Arztes.
die Augen – dann nicht reiben, sondern mit Hilfe der Augendusche spülen!
die Nase – dann sofort ausschnauben, nicht mehr durch Nase einatmen! Weitere
Schritte nach Anweisung des Kursleiters bzw. des Arztes.
auf die Haut / in Wunden – Wunde erst leicht ausbluten lassen und dann
desinfizieren!
2
MGP WS 2012/13
1.2. Vorkommen von Mikroorganismen
In den Versuchen 1.2.1. bis 1.2.3. soll das ubiquitäre Vorkommen von
Mikroorganismen sichtbar gemacht werden. Dazu erfolgt der Nachweis von
Mikroorganismen in der Raumluft, auf verschiedenen Oberflächen und an den
Händen der Praktikumsteilnehmer mittels Kultivierung auf festen Nährböden. Daraus
können Rückschlüsse auf Möglichkeiten von Kontaminationen gezogen werden.
Jeder Praktikumsteilnehmer sollte versuchen, einen der isolierten Mikroorganismen
an den nachfolgenden Kurstagen näher zu charakterisieren.
1.2.1. Nachweis von Mikroorganismen in der Luft mittels
Sedimentationsplatten
Aufgabe:
Weisen Sie das Vorhandensein von Mikroorganismen in der Luft nach.
Durchführung:
1. Jede Gruppe gießt je zwei Agarplatten (1. Nähragar - NA, 2. SABOURAUD-Agar SA): Agar verflüssigen (im Koch- oder Dampftopf, vorbereitet) und auf 60 °C
abkühlen, in eine sterile Petrischale gießen (dabei die Mündung des
Reagenzglases vorher abflammen und den Petrischalendeckel nicht weiter als
nötig öffnen)
2. Nach Erstarren des Agars Deckel von der Petrischale abnehmen und die
Agarfläche für die vorgegebene Zeit offen an den verschiedenen Orten
exponieren (Gruppeneinteilung und Expositionsorte siehe Tabelle)
3. Petrischalen schließen und je Agartyp eine Schale bei Raumtemperatur und eine
bei 37 °C inkubieren.
Auswertung:
Ermitteln Sie die Koloniezahlen auf den unterschiedlichen Agarplatten und
beschreiben Sie die Bakterien- bzw. Pilzkolonien nach Größe, Farbe und
Morphologie (Strukturen der Oberfläche und des Randes, Profil).
 Vergleichen Sie die Zahlen der gewachsenen Kolonien
o bei unterschiedlicher Expositionsdauer (Vergleich mit anderen
Gruppen),
o bei den verschiedenen Inkubationstemperaturen,
o zwischen den beiden Nährböden.
o Treffen Sie auch Aussagen zu den unterschiedlichen Expositionsorten
(Vergleich mit anderen Gruppen).
MGP WS 2012/13
3
 Stellen Sie für ausgewählte Kolonien deren GRAM-Verhalten und
Mikromorphologie fest (am 3. Kurstag!, entsprechend der Anleitung für
Versuch 3.3)!
Expositionsort
Bruträume
Toilette
Kursraum Fensterbrett
Eingangsbereich
West
Eingangshalle
Flur vor dem
Kursraum
Außenbereich
Treppenhaus
(Westseite)
Zeit [min]
20
40
60
20
40
60
20
40
60
20
40
60
20
40
60
20
40
60
20
40
60
20
40
60
Gruppe
1 und 2
3 und 4
5 und 6
7 und 8
9 und 10
11 und 12
13 und 14
15 und 16
17 und 18
19 und 20
21 und 22
23 und 24
25 und 26
27 und 28
29 und 30
31 und 32
33 und 34
35 und 36
37 und 38
39 und 40
41 und 42
43 und 44
45 und 46
47 und 48
1.2.2. Nachweis von Mikroorganismen auf Oberflächen
Aufgabe:
Prüfen Sie ausgewählte glatte Oberflächen mit dem Abklatschverfahren und mit der
Abstrichmethode auf das Vorhandensein von Bakterien und Pilzen.
4
MGP WS 2012/13
sind selbst auszuwählen, z. B. Papier, Münzen, Geldschein,
Kreditkarte, Arbeitsmaterialien;
für Abstrichverfahren: z. B. Arbeitsfläche, Wasserhähne, Rohrleitungen, Computertastaturen
Objekte:
Durchführung:
Pro Gruppe soll je 1x das Abstrichverfahren und 1x das Abklatschverfahren
angewendet werden.
1. ABKLATSCHVERFAHREN: Die zu untersuchenden Gegenstände werden leicht aber
gleichmäßig auf die Oberfläche je einer vorbereiteten Agar-Platte mit Nähragar
(NA) bzw. SABOURAUD-Agar (SA) gepresst (ggf. sterile Pinzette benutzen), die
Gegenstände danach wieder abgenommen und die Petrischalen sofort geschlossen.
2. ABSTRICHVERFAHREN: Die zu untersuchende Fläche wird mit einem sterilen
Wattetupfer unter Drehen des Tupfers abgestrichen. Bei trockener Prüffläche wird
ein feuchter Tupfer (mit steriler PBS anfeuchten) verwendet. Der Tupfer wird
jeweils auf einer Agarplatte mit Nähragar und mit SABOURAUD-Agar unter Drehen
ausgestrichen.
3. Inkubation der Nähragar-Platten bei 37 °C, des SABOURAUD-Agars bei 28 °C,
jeweils für ca. 48 h.
Auswertung:
Kontrollieren Sie die bebrüteten Petrischalen hinsichtlich der Vielfalt von
Mikroorganismen auf unsterilen Oberflächen. Beschreiben Sie die gewachsenen
Kolonien adäquat zu Versuch 1.2.1.
1.2.3. Mikroorganismen auf der Haut
Aufgabe:
Untersuchen Sie die Bakterien an den Händen. Prüfen Sie, wie sich das Waschen der
Hände oder der Einsatz von Desinfektionsmitteln auf die Bakterienzahl auswirken.
Durchführung:
Für diesen Versuch stehen für jede Gruppe je 2 NA und 2 SA Platten bereit, die
geteilt und von beiden Kursteilnehmern genutzt werden können.
1. Drücken Sie die Fingerkuppen auf eine Hälfte einer Nähragarplatte (NA).
Wiederholen Sie das auf SABOURAUD-Agar (SA). Die Hände sind dafür
ungewaschen.
2. Waschen oder desinfizieren Sie Ihre Hände entsprechend der Tabelle und legen
Sie in gleicher Weise wieder je eine Nähragar- und SABOURAUD-Agarplatte an.
Achten Sie darauf, dass die Abdruckflächen etwa gleich groß sind und dieselben
Finger wieder verwendet werden.
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3. Die Agarplatten werden bei 37 °C (NA) bzw. 28 °C (SA) 24 bis 48 Stunden
bebrütet.
Behandlung der
Hände
1 mal gewaschen
2 mal gewaschen
Desinfiziert 0,5 min
Desinfiziert 2 min
Gruppen
1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45
2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46
3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47
4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48
Auswertung:
Zählen Sie die Kolonien auf den Platten (Koloniebildende Einheiten - KbE) und
ziehen Sie anhand des Vergleichs mit den anderen Gruppen Schlussfolgerungen zur
Wirkung der einzelnen Behandlungsmethoden. Beschreiben Sie die Morphologie der
gewachsenen Kolonien (siehe Versuch 1.2.1.). Stellen Sie für ausgewählte Kolonien
deren GRAM-Verhalten und Mikromorphologie fest (am 3. Kurstag!, entsprechend
der Anleitung für Versuch 3.3).
1.3. Impftechniken
Aufgabe:
Beimpfen Sie verschiedene Formen von Nährmedien mit einer Bakterien-Reinkultur
zur Kultivierung unter aeroben Bedingungen.
Objekt:
Micrococcus luteus
Durchführung:
Dieser Versuch wird von jedem Praktikumsteilnehmer separat durchgeführt!
1.3.1. Flüssigmedium (Nährbouillon NB)
Etwas Bakterienmaterial mit der sterilen Impföse aus einer Reinkultur
entnehmen, an der Glaswand mit der Nährbouillon verreiben und mit der
Bouillon vermischen.
1.3.2. Schrägagar (Nähragar NA)
Bakterien mit einer Öse auf der schrägen Oberfläche des Nähragars von unten
nach oben in Zickzacklinie ausstreichen (dabei die Agaroberfläche nicht
zerstören [„aufpflügen“]).
6
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1.3.3. Agarplatte (Nähragar NA)
Beimpfen mit einer Impföse: erst die eine Hälfte der Agar-Oberfläche mit
dicht liegenden Impfstrichen beimpfen, dann die Petrischale drehen und die
andere Hälfte beimpfen.
1.3.4. Hochschichtagar (HSA - Nähragar im Röhrchen)
Mit der Spitze der Impfnadel etwas Impfmaterial entnehmen, Impfnadel in die
Mitte des Agars einstechen (dabei Kulturröhrchen mit der Öffnung nach unten
halten, Nadel nicht bis auf den Grund stechen und KOLLE-Halter nicht mit
dem Agar in Berührung bringen).
Die beimpften Nährmedien im Brutraum bei 28 °C inkubieren, Petrischalen wegen
Kondenswasserbildung in umgekehrter Lage (also Boden mit dem Agar nach oben –
deshalb Beschriftung auf dieser Seite!) einstellen.
Auswertung:
Kontrollieren Sie an Hand der gewachsenen Bakterienkulturen die Qualität Ihrer
Überimpfungen. Beachten Sie die Wuchsform von Micrococcus luteus in der Stichkultur. Was leiten Sie daraus ab?
1.4.
Übersichtsfärbungen
Aufgabe:
Stellen Sie Ausstrichpräparate von den Objekten her und färben Sie diese mit den
drei Standardfarbstofflösungen aus der Färbebatterie.
Objekte:
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Farbstofflösungen:
Färbedauer
a) Methylenblaulösung nach LÖFFLER (MBL)
4 min
b) verdünnte Fuchsin-Phenol-Lösung (Carbol-Fuchsin)
1 min
c) Kristallviolett-Lösung
1 min
Achtung! Carbol-Fuchsin hat möglicherweise eine carcinogene Wirkung!
Durchführung:
1. Ausstrich herstellen: auf einem Objektträger in einem kleinen Tropfen
Kochsalzlösung wenig Bakterienmaterial mit der Öse verreiben und ausstreichen
2. Trocknen lassen!
3. Ausstrich hitzefixieren: dazu den Objektträger drei mal durch die Bunsenbrennerflamme ziehen
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7
4. Den gesamten Ausstrich mit der Farblösung bedecken und die angegebene Zeit
einwirken lassen
5. Objektträger mit Wasser spülen
6. Trocknen lassen!
7. Auswertung der Objekte unter dem Mikroskop (bei 1000facher Vergrößerung,
Immersionsöl benutzen! Kein Deckgläschen nötig!)
Auswertung:
Beschreiben Sie die Form und Anordnung der Mikroorganismen. Schätzen Sie die
Färbeintensität der drei Farblösungen ein. Vergleichen Sie die Eignung der
verschiedenen Färbungen für die einzelnen Objekte.
1.5. Kalibrieren des Mikroskops und Größenbestimmung von
Mikroorganismen
Aufgabe:
Kalibrieren Sie Ihr Mikroskop und bestimmen Sie dann die Größe einiger Mikroben.
Dazu wird ein Objektmikrometer benutzt, das eine in hundert Teilstriche unterteilte
Skala von 1 mm Länge aufweist (d. h. der Abstand zwischen zwei Teilstrichen beträgt
10 µm).
Objekte:
Bacillus subtilis
Escherichia coli (von 1.4.)
Saccharomyces cerevisiae
Micrococcus luteus (von 1.4.)
Gemisch Bakterien- und Hefekultur (E. coli / S. cerevisiae)
Durchführung:
1. Objektmikrometer auf den Objekttisch legen und scharf stellen, dabei den
Objekttisch immer nur von oben nach unten bewegen, damit die Objektmikrometer nicht zu Bruch gehen.
2. Nullstriche der Skalen von Messokular und Objektmikrometer einander genau
gegenüberstellen.
3. Ermitteln Sie für alle Objektive (10, 40 und 100fach), wie viele Teilstriche des
Objektmikrometers den 100 Teilstrichen der Okularskala entsprechen.
4. Wird dieser Wert durch 10 dividiert, erhält man den Mikrometerwert, also die
Strecke im Präparat, die dem Abstand zweier Teilstriche der Messokularskala
entspricht (µm = Skt(Obj.) * 10 µm / 100 Skt(Ok.)).
5. Bei schwächeren Objektiven wird ermittelt, wie viele Teilstriche der Okularskala
auf 100 Teilstriche des Objektmikrometers (also 1 mm) entfallen. Der
Mikrometerwert wird erhalten, indem man 1000 durch die Anzahl der Teilstriche
der Okularskala teilt.
8
MGP WS 2012/13
6. Fertigen Sie von den genannten Objekten Ausstrichpräparate an und färben Sie
diese mit dem Farbstoff an, den Sie in Versuch 1.4. als am besten geeignet eingeschätzt haben.
7. Messen Sie die Länge und Breite der Mikroorganismen in den Ausstrichpräparaten mit Hilfe des Messokulars und ermitteln Sie unter Zuhilfenahme des
Mikrometerwerts aus mindestens 10 Einzelmessungen die Größe der Bakterien
und der Hefe.
Auswertung:
Dokumentieren Sie die ermittelten Mikrometerwerte und vergleichen Sie Ihre
Messwerte mit den in der Literatur angegebenen. Beachten Sie die
Größenunterschiede zwischen Bakterien und Hefen im Mischpräparat E. coli / S.
cerevisiae!
1.6. Mikroorganismen der Mundhöhle
Die Mundhöhle ist ein nährstoffreiches Biotop und weist daher eine sehr hohe
Keimzahl auf (Speichel kann 108 bis 109 Keime pro ml enthalten). Darunter sind
jedoch viele Anaerobier, die auf Nähragar oft schwer kultivierbar sind. Besondere
Bedeutung erlangt die mikrobielle Besiedlung der Zähne (mit sehr hohen Zelldichten:
bis zu 1011 Keime je g Plaquemasse), da die als Gärungsprodukte der Bakterien (vor
allem Streptococcus mutans) anfallenden Säuren den Zahnschmelz lösen und so zu
Karies führen.
Typische Bakterien der Mundhöhle sind:
- Bacterionema (Corynebacterium)
1
matruchotii (Riesenstäbchen – 1);
5
- Leptotrichia buccalis (Riesenstäbchen – 2,
4
langgestreckt, tw. abgewinkelte Enden);
6
- Campylobacter sputorum (kommaförmig,
beweglich – 3);
- Neisseria, Veillonella (GRAM-negative
2
3
Kokken), Mikrokokken – 4;
- Treponema orale, Tr. denticola
(Spirochäten, geschlängelt – 5);
Abb. 1.6 - Mikroorganismen des Zahnbelages,
modifiziert nach Schröder (1991)
- Milchsäurebakterien:
Säurebildung - Hauptursache für Karies!
Streptokokken - Streptococcus salivarius, S. mutans, S. mitis, S. sanguis
(kokkoid), Lactobacillus-Arten (Stäbchen – 6);
- Rothia dentocariosa (kokkoider bis filamentöser Actinomycet, geflechtbildend).
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9
Aufgabe:
Mikroskopieren Sie Mikroorganismen aus der menschlichen Mundhöhle. Versuchen
Sie, das häufig im Zahnbelag vorkommende Milchsäurebakterium Streptococcus
salivarius mit Hilfe eines saccharosehaltigen Nährbodens zu isolieren.
Objekt:
Zahnbelag bzw. Abstrich der Mundschleimhaut
Durchführung:
A – MIKROSKOPIE (Jeder Kursteilnehmer!)
1. Mit dem Zahnstocher etwas Zahnbelag bzw. Material der Mundschleimhaut
entnehmen
2. Material in einem kleinen Tropfen Kochsalzlösung auf dem Objektträger
suspendieren, Ausstrichpräparat herstellen, trocknen und fixieren (s. 1.4.)
3. Nach dem Abkühlen 4 min mit Methylenblau-Lösung nach LÖFFLER färben
4. Mit Wasser spülen, trocknen und mikroskopieren.
B – DIREKTISOLIERUNG VON STREPTOCOCCUS SALIVARIUS (Pro Gruppe)
1. Etwas Zahn- oder Zungenbelag mit Hilfe eines sterilen Wattestäbchens entnehmen
und auf Saccharose-Agar (SACC) flächig ausstreichen, einige Tage bei 37 °C
bebrüten!
NACH INKUBATION DER PETRISCHALEN:
2. Von der bebrüteten Platte etwas Material einer schleimigen Kolonie entnehmen
und in einem kleinen Tropfen NaCl-Lösung auf dem Objektträger suspendieren
3. Entspricht das mikroskopische Bild den Erwartungen (Streptokokken, ggf. GRAMFärbung eines hitzfixierten Ausstrichs, s. 3.3.1.) erfolgt die Überimpfung auf eine
Glucose-Carbonat-Agarplatte (GCA, fraktionierter Ausstrich, s. 2.4.)
4. Nach erneuter Inkubation bei 37 °C (2-3 Tage) wird überprüft, ob eine Reinkultur
von Streptokokken vorliegt. Aufgehellte Bereiche im Agar deuten auf
Säurebildung hin! Bei Vorliegen einer Reinkultur wird der Katalase-Test (s.
4.4.1.) durchgeführt und eine Stichkultur in Glucose-Carbonat-Hochschichtagar
(GCA in Röhrchen) angelegt (Überprüfung des Verhaltens gegenüber Sauerstoff).
Auswertung:
A) Zeichnen Sie unterschiedliche Mikroorganismen in den Präparaten und versuchen
Sie, diese den o. g. Organismengruppen zuzuordnen. Machen Sie anhand der im
Versuch 1.5. ermittelten Mikrometerwerte Angaben zur Größe der beobachteten
Mikroorganismen.
B) Beschreiben Sie die auf dem Saccharose-Agar gewachsenen Kolonien und
dokumentieren Sie die Schritte bei der Isolierung von Streptococcus salivarius.
Erläutern Sie, wie die Bildung von Milchsäure nachgewiesen werden kann.
Diskutieren Sie die Bedeutung milchsäurebildender Streptokokken bei der
Entstehung von Karies!
10
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2. KURSTAG
2.1. Auswertung der Versuche 1.2.1. bis 1.2.3. – Mikroorganismen in
der Luft, auf Oberflächen und auf der Haut
Anfertigung hitzefixierter Präparate von interessierenden Kulturen für
GRAM-Färbung (am 3. Kurstag, Versuch 3.3.1)
2.2. Auswertung der Kultivierungen (Versuch 1.3.)
2.3. Fortsetzung der Isolierung von Streptococcus salivarius
(Versuch 1.6.)
2.4. Fraktionierter Ausstrich
Aufgabe:
Das Ziel des fraktionierten Ausstrichs ist die Erzielung von Einzelkolonien.
Objekte:
Isolat aus den Versuchen 1.2.1. bis 1.2.3.,
oder Micrococcus luteus (Versuch 1.3.)
Durchführung: (Jeder Kursteilnehmer)
Etwas Impfmaterial wird mit der Impföse in einer eng
geschwungenen
Impflinie
entsprechend
der
nebenstehenden Abbildung auf etwa ein Drittel einer
1.
Nähragarplatte (NA) aufgebracht. Nach Ausglühen der
2.
Impföse wird ohne erneut Material aufzunehmen
3.
mit der abgekühlten Öse vom Ende des vorangehenden
Impstrichs ein zweiter Impfstrich gezogen. Dieser
Vorgang wird nach erneutem Ausglühen wiederholt.
Impföse in flachem Winkel und ohne Druck über
Agarfläche bewegen, um diese nicht zu zerstören!
Abb. 2.4 – Fraktionierter
Ausstrich
Die Bebrütungstemperatur richtet sich nach den
verwendeten Keimen und ist den Ausführungen am ersten Kurstag zu entnehmen.
Auswertung:
Durch die Länge der Impflinien und den fraktionierten Ausstrich sollte das
Zellmaterial auseinander gezogen und „verdünnt“ werden, so dass am Ende des
Ausstrichs Einzelkolonien wachsen können. Bewerten Sie die Qualität Ihres
fraktionierten Ausstrichs!
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2.5. Ausstreichen einer Bakteriensuspension
(Spatelplattenmethode)
Aufgabe:
Eine Möglichkeit, Mikroorganismen gleichmäßig auf einem Nährboden
auszubringen, stellt das Verteilen eines geringen Flüssigkeitsvolumens mit Hilfe
eines DRIGALSKI-Spatels dar. Anwendung findet diese Methode beispielsweise bei
der Bestimmung der Zahl Kolonie-bildender Einheiten (KbE) einer
Bakteriensuspension, da für die Quantifizierung eine homogene Verteilung der
Kolonien auf einer Agarplatte Voraussetzung ist.
Besser Spatel immer schräg halten!
Abb. 2.5 - Benutzung eines Drigalski-Spatels
zum Aufbringen einer
Bakteriensuspension
(nach H. Bayrhuber, E. R. Lucius; 1992)
Quelle: http://www.hamburgerbildungsserver.de/welcome.phtml?
unten=/biotech/unterr/biot_255.htm
Durchführung: (Pro Gruppe)
1. Stellen Sie von einer Bakteriensuspension (E. coli) eine dezimale
Verdünnungsreihe her bis zu einer Verdünnungsstufe 10-7, indem Sie jeweils
0,1 ml der Suspension bzw. der vorhergehenden Verdünnungsstufe in einem
Reaktionsgefäß („Eppi“) zu 0,9 ml steriler phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
(PBS) pipettieren
2. Bringen Sie jeweils 0,1 ml der Verdünnungsstufen 10-5, 10-6 und 10-7 auf die
Agaroberfläche auf (Medium: Nähragar NA)
3. Verteilen Sie die Suspension gleichmäßig mit Hilfe eines schräg gehaltenenen
DRIGALSKI-Spatels (mittels kreisender Bewegung).
Auswertung:
Bestimmen Sie die Zahl der nach Inkubation bei 37 °C auf den Platten gewachsenen
Kolonien, vergleichen Sie die Koloniezahlen aller Verdünnungsstufen und berechnen
Sie die KbE je ml Original-Bakteriensuspension (aus der geeigneten
Verdünnungsstufe!).
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2.6. Quantifizierung von Mikroorganismen
Am Beispiel der Ermittlung der Zellzahl in 1 g Bäckerhefe werden Methoden
vorgestellt, die eine Quantifizierung von Mikroorganismen erlauben. Neben der
direkten Zählung kommen kultivierungsabhängige und indirekte Verfahren zum
Einsatz. Die jeweils erhaltenen Ergebnisse sollen verglichen und die
Aussagefähigkeit der verschiedenen Methoden diskutiert werden.
2.6.1. Bestimmung der Gesamtzellzahl
Aufgabe:
Ermitteln Sie mit Hilfe der THOMA-Zählkammer die Zellkonzentration (Zellzahl/ml)
in einer Hefesuspension und berechnen Sie die Zelldichte in 1 g Bäckerhefe.
Objekt:
Handelsübliche Bäckerhefe (frische Presshefe)
Saccharomyces cerevisiae
Durchführung:
1. Herstellen einer Hefesuspension, indem 0,5 g frische, handelsübliche Bäckerhefe
in ein steriles 50 ml-Zentrifugen-(Greiner-)Röhrchen überführt werden und
50 ml sterile phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugegeben werden
(Hefekonzentration 10 g/l)
2. Nach Homogenisieren der Suspension durch Schütteln (Vortexer!) wird eine
Verdünnungsreihe dieser Suspension bis zur Verdünnungsstufe 10-6 hergestellt,
indem Röhrchen z.B. mit 4,5 ml steriler PBS gefüllt werden und 0,5 ml der vorhergehenden Verdünnungsstufe dazu pipettiert werden (dazwischen vortexen!)
3. Auszählung mit 10-1-Verdünnung (zuvor gut mischen!) beginnen, dafür Zählkammer nach THOMA wie folgt füllen:
 Auflageflächen für das Deck1
glas leicht anfeuchten
 Deckglas unter Druck so aufGroßquadrat,
2
Kantenlänge 0,2 mm,
schieben, dass NEWTONsche
4 x 4 Kleinstquadrate
Ringe sichtbar werden
3
 vom Rand des Deckglases
etwas Hefesuspension (ca. 105
4
15 µl) einbringen
4. Mindestens 5 Großquadrate (GQ)
unter
Benutzung
des
40er Eingeschliffenes Deckglas
Objektivs mit der L-Regel auszählen (vier GQ diagonal und ein
Eckquadrat (vgl. Abb. 2.6)
Deckglasstütze
Abb. 2.6 - Aufbau der THOMA-Kammer
MGP WS 2012/13
13
5. Auszählung der weiteren Verdünnungsstufen fortsetzen bis Zelldichte zu gering
wird.
Auswertung:
1. Mittelwert (Zellzahl je Großquadrat) aus den einzelnen Zählungen errechnen
2. Zellzahl pro ml der jeweiligen Verdünnungsstufe berechnen (dabei Umrechnungsfaktor angeben und herleiten!)
3. Berechnen Sie die Zellzahl je g Hefe-Frischmasse und bewerten Sie die Präzision
der Zählergebnisse bei den unterschiedlichen Verdünnungsstufen.
2.6.2. Bestimmung der Lebendzellzahl
Aufgabe:
Wenden Sie die KOCHsche Plattenzählmethode zur Bestimmung der Lebendkeimzahl
einer Suspension einzelliger Mikroorganismen an.
Objekt:
Hefesuspension - siehe Versuch 2.6.1.
Durchführung:
1. Malzextraktagar (MA) verflüssigen und auf 45-50 °C temperieren (vorbereitet!)
2. Schätzen Sie zunächst ab, welche drei Verdünnungsstufen Sie verwenden wollen,
wenn die resultierende Koloniezahl zwischen 20 und 300 betragen soll!
3. Von diesen Verdünnungsstufen der Hefesuspension jeweils 0,2 ml in eine
Petrischale pipettieren und verflüssigten Malzextraktagar zugeben und beides
vorsichtig durch Schwenken vermischen
4. Nach Erstarren des Agars Petrischalen bei 28 °C inkubieren.
Auswertung:
- Anzahl der gewachsenen Kolonien auszählen
- Lebendzellzahl pro ml der jeweiligen Verdünnungsstufe und Lebendzellzahl je g
Hefe berechnen (wenn mehrere Ergebnisse gut auswertbar, Mittelwert bilden)
- Berechnen Sie aus dieser und dem Ergebnis der Gesamtzellzahlbestimmung
(Versuch 2.6.1.) den Anteil der lebenden Zellen in der Bäckerhefe.
Jeweils Werte geeigneter Verdünnungsstufen verwenden!
14
MGP WS 2012/13
2.6.3. Ermittlung der Trübung von Zellsuspensionen
Im Gegensatz zu den vorangegangenen, direkten Methoden zur Bestimmung der
Zellzahl stellt die Trübungsmessung eine indirekte Methode zur Ermittlung der
Zellmasse dar. Licht (zumeist wird sichtbares Licht im Wellenlängenbereich von 400
– 600 nm verwendet) wird durch Zellsuspensionen ab einer bestimmten Zelldichte
gestreut. Diese Verringerung des Strahlungsflusses (Intensität) wird als Extinktion
bzw. als sog. optische Dichte (OD) an einem Photometer gemessen und ist unter
bestimmten Bedingungen der Zelldichte proportional und kann somit zur
Bestimmung der Zellmasse einer Zellsuspension herangezogen werden. Handelt es
sich in der Suspension um Zellen einer konstanten durchschnittlichen Größe, besteht
auch eine lineare Beziehung zwischen OD und Zellzahl.
Aufgabe:
Untersuchen Sie die Beziehung zwischen der Zellzahl (N) und der optischen Dichte
(OD) einer Hefesuspension.
Objekt:
Hefesuspension - siehe Versuch 2.6.1.
Durchführung:
1. Stellen Sie von der Originalsuspension (10 g/l) eine 10-1-Verdünnung (1 g/l) her
(0,5 ml Hefesuspension zu 4,5 ml PBS)
2. Von dieser 10-1-Verdünnung (Ausgangssuspension) werden Verdünnungen von
1:2, 1:5 und 1:10 mit PBS hergestellt
3. Nach gründlichem Durchmischen wird die Zellzahl in der Ausgangssuspension
und den Verdünnungsstufen mittels THOMA-Zählkammer (entsprechend
Teilversuch 2.6.1.) ermittelt
4. Die optische Dichte (OD) der verschiedenen Verdünnungen wird an einem
Spektralphotometer bei λ = 600 nm bestimmt (Nullabgleich mit PBS).
Auswertung:
Stellen Sie den Zusammenhang zwischen der optischen Dichte der Suspension und
der in der jeweiligen Verdünnungsstufe ermittelten Zellzahl pro ml graphisch in
einem x-y-Diagramm dar. Bewerten Sie die Eignung des photometrischen Verfahrens
zur Zellmasse- und Zellzahlbestimmung, machen Sie die Grenzen dieses Verfahrens
deutlich und kennzeichnen Sie den Ihrer Meinung nach geeigneten Bereich der
Kalibrierkurve.
2.7. Entnahme einer Wasserprobe
Ausgabe steriler Flaschen zur Entnahme von Wasserproben
(Weiterbearbeitung  Versuch 3.5.)
MGP WS 2012/13
15
3. KURSTAG
3.1. Fortsetzung des Versuchs 1.6. (Isolierung von Streptococcen)
3.2. Auswertung der Versuche 2.4. (Fraktionierter Ausstrich),
2.5. (Koloniebildende Einheiten),
2.6.2. (Lebendzellzahlbestimmung)
3.3. Zellwandaufbau: GRAM-Differenzierung
Bakterien können anhand ihres Zellwandaufbaus charakterisiert werden. Die von dem
dänischen Arzt CHRISTIAN GRAM 1884 eingeführte Färbemethode stellt eine
wesentliche Differenzierungsmöglichkeit in der Bakteriensystematik dar. Da die
Anfärbbarkeit nach diesem Färbeverfahren mit weiteren Merkmalen korreliert,
werden zwei weitere Methoden zur Unterscheidung zwischen GRAM-positiven und
GRAM-negativen Bakterien durchgeführt. Es sind zwei Kulturen den GRAM-positiven
oder GRAM-negativen Bakterien zuzuordnen.
Objekte:
Escherichia coli
Staphylococcus epidermidis
Ausgewählte Kolonien aus den Versuchen 1.2.1., 1.2.3. und 1.6.
3.3.1. GRAM-Färbung
Aufgabe:
Wenden Sie die GRAM-Färbung für die angegebenen Objekte an und beschreiben Sie
Ihre Beobachtungen.
Durchführung:
1. Ausstrichpräparat herstellen (s. 1.4)
2. Trocknen und dann fixieren
3. Übergießen mit Kristallviolettlösung
(2 min Einwirkzeit)
4. Abspülen mit Wasser
5. Mit LUGOLscher Lösung übergießen
(2 min einwirken lassen)
6. Abgießen, nicht mit Wasser spülen
7. Differenzieren mit Alkohol (96 %) bis
keine Farbe mehr abgegeben wird
8. Danach sofort Abspülen mit Wasser
16
Abb. 3.3 - Ablauf der Gram-Färbung
MGP WS 2012/13
9. Mit Safranin-Lösung (0,25 %) ca. 30 - 60 s gegenfärben
10. Abspülen mit Wasser, danach trocknen lassen
11. Mikroskopie.
Auswertung:
GRAM-positiv:
blauschwarze Mikroben
GRAM-negativ:
rosa bis rote Mikroben
Fertigen Sie mikroskopische Zeichnungen an. Erklären Sie das unterschiedliche
Verhalten der Bakterien bei der GRAM-Färbung!
3.3.2. Schnelltest zur GRAM-Differenzierung
Aufgabe:
Bestimmen Sie das GRAM-Verhalten von Mikroorganismen im Schnelltest.
Durchführung:
1. Einen Tropfen KOH (3 %) auf einen Objektträger geben
2. Bakterien mit der Impföse von der Kultur abnehmen und in dem Tropfen
gründlich verreiben
3. Impföse vorsichtig vom Objektträger abheben (1 - 2 cm) und auf Fadenbildung achten.
Auswertung:
GRAM-positiv:
GRAM-negativ:
keine Fadenbildung
Fadenbildung
3.3.3. Aminopeptidase-Test
Aufgabe:
Bestimmen Sie mit diesem Test das GRAM-Verhalten von Mikroorganismen.
Durchführung:
1. Eine gut gewachsene Einzelkolonie vom Nährboden abnehmen und in 0,5 ml
sterilem A. dest. suspendieren (eine Trübung muss deutlich sichtbar sein)
2. Ein Teststäbchen für den Aminopeptidase-Test in das Röhrchen mit der Suspension einstellen und bei 37 °C 10 bis maximal 30 min im Wasserbad inkubieren
3. Farbe der Suspension ablesen und mit der Farbskala auf der Packung vergleichen.
Auswertung:
GRAM-positiv:
GRAM-negativ:
MGP WS 2012/13
keine Gelbfärbung, L-Alanin-Aminopeptidase-negativ
Gelbfärbung, L-Alanin-Aminopeptidase-positiv
17
Beachten Sie, dass bei Kolonien mit starker Eigenpigmentierung die Auswertung erschwert werden kann. Es sollten nur Kolonien von indikator- und farbstofffreien
Nährmedien verwendet werden. Erklären Sie das Zustandekommen der Gelbfärbung
der Lösung bei GRAM-negativen Bakterien. Vergleichen Sie die Ergebnisse der drei
Testmethoden. Stellen Sie das Gram-Verhalten ausgewählter Kulturen vom
1. Kurstag (Versuche 1.2.1. bis 1.2.3., sowie 1.6.) fest.
3.4. Aerobe Kulturverfahren
Das Wachstum von Mikroorganismen wird entscheidend von der Zusammensetzung
des Kulturmediums beeinflusst. Komplexe Medien, die einen oder mehrere chemisch
nicht genau definierte Bestandteile wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt,
Blutserum u.ä. enthalten („Komplettmedien“) werden zur Kultivierung vieler
Mikroorganismen eingesetzt. Im Gegensatz dazu weisen synthetische Nährmedien
eine chemisch definierte Zusammensetzung auf und werden je nach dem Zusatz
wachstumsfördernder Zusätze (Aminosäuren, Vitamine) als Minimalmedium oder
Vollmedium eingesetzt.
Die Kultivierung auf speziellen Nährböden macht es möglich, selektiv Mikroorganismen mit bestimmten Stoffwechseleigenschaften anzuzüchten bzw. bestimmte
biochemischen Leistungen sichtbar zu machen. Daher werden derartige
Selektivnährmedien bzw. Differenzierungsmedien bei der Isolierung und
Differenzierung von Mikroorganismen eingesetzt und sind für den Nachweis von
Krankheitserregern in klinischem Material aber auch z. B. bei der Trinkwasser- oder
Lebensmitteluntersuchung von großer Bedeutung.
Aufgabe:
Prüfen Sie das Wachstum der verschiedenen ausgegebenen Bakterien auf
unterschiedlichen Nährböden.
Objekte und Durchführung: (Pro Gruppe)
Beimpfen Sie Petrischalen mit verschiedenen Nährmedien entsprechend der
folgenden Tabelle. Die Inkubation erfolgt bei allen Nährböden bei 37 °C (24 bis
48 h), mit Ausnahme des MOSSEL-Agars, der bei 28 °C bebrütet wird.
18
MGP WS 2012/13
Nährboden
Nähragar
(NA)
Blutagar
BAIRDPARKER-Agar
(BP)
TTC-AzidAgar
(TTC)
Äsculin-Agar
(Äs)
ENDO-Agar (E)
Lichtgeschützt
aufbewahren!
MACCONKEYAgar
(Mac)
Cetrimid-Agar
(Ct)
MOSSELCEREUS-Agar
(MO)
Impfmethode Objekte
Impföse
Platte dritteln und jeweils einen Teil mit
Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus
und Enterococcus faecalis beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Micrococcus
luteus,
Staphylococcus
aureus
und
Staphylococcus epidermidis beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Micrococcus
luteus,
Staphylococcus
aureus
und
Staphylococcus epidermidis beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Micrococcus
luteus,
Enterococcus
faecalis
und
Staphylococcus epidermidis beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Micrococcus
luteus,
Enterococcus
faecalis
und
Staphylococcus epidermidis beimpfen
Impföse
Platte dritteln und jeweils einen Teil mit
Escherichia coli, Klebsiella oxytoca und
Proteus vulgaris beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Escherichia
coli, Klebsiella oxytoca und Proteus vulgaris
beimpfen
Impföse
Jeweils ein Drittel der Platte mit Escherichia
coli,
Pseudomonas
aeruginosa
und
Pseudomonas stutzeri beimpfen
Jeweils eine halbe Platte mit Bacillus cereus
Impföse
und Bacillus subtilis beimpfen
Achtung! hier nur zwei gerade Impfstriche!
Auswertung:
Beschreiben Sie Wachstum und Farbe der Bakterien (bzw. Verfärbungen des Agars)
auf den verschiedenen Nährböden. Ziehen Sie daraus Schlussfolgerungen hinsichtlich
der Stoffwechseleigenschaften der jeweiligen Mikroorganismen (in Form einer
Tabelle). Erläutern Sie kurz die Wirkungsweise der verschiedenen Selektiv- bzw.
Differenzierungsnährböden. Leiten Sie aus Ihren Beobachtungen Möglichkeiten zur
Differenzierung unbekannter Bakterien ab.
MGP WS 2012/13
19
3.5. Mikroorganismen aus Wasserproben
In diesem Versuch wird ein Anwendungsbeispiel für Selektivnährmedien und
unspezifische Nährböden bei der bakteriologischen Untersuchung von Wasserproben
gegeben. Ein wichtiges Kriterium für die Wasserqualität ist die Anzahl der im Wasser
enthaltenen Mikroorganismen sowie das Auftreten von Bakteriengruppen, die in
hygienischer Hinsicht besonders bedeutsam sind. Daher werden neben der
Gesamtkoloniezahl auf einem unspezifischen Nährmedium (z. B. DEV-NA oder
Plate-Count-Agar, HET) vor allem die Enterobakterien bzw. die sog. coliformen
Bakterien mit Hilfe von Selektivnährböden erfasst, um fäkale Verunreinigungen des
Wassers zu erkennen.
Der Tergitol-7-Agar (Tg+) ist ein solcher Selektivnährboden, da Tergitol-7
(Natriumheptadecylsulfat) die GRAM-positiven Begleitorganismen hemmt und
coliforme Bakterien aufgrund ihrer Fähigkeit zur Verwertung von Lactose erkannt
werden können. Während diese bei Escherichia coli durch einen Farbumschlag nach
Gelb angezeigt wird, erscheinen andere coliforme Keime infolge TTC-Reduktion rot
mit gelbem Hof.
Aufgabe:
Ermitteln Sie die Gesamtkoloniezahl (KbE auf DEV-NA - zur Gesamtkeimzahlbestimmung im Wasser nach DIN 38411) und die Keimzahl von colifomen Bakterien
(mit Hilfe eines Selektivagars [Tergitol-7-Agar]) in zwei Wasserproben eigener Wahl
(Trink- und Oberflächenwasser).
Objekte:
Pro Gruppe - Je eine Leitungs- (Trink-)wasserprobe und
ein Fluss-, Bach- oder Teichwasser nach eigener Wahl
Durchführung:
1. Für die Untersuchung des Leitungswassers wird die Gussplattentechnik
angewendet, d. h. es wird jeweils 1 ml der unverdünnten Probe in eine sterile
Petrischale pipettiert und mit vorher verflüssigtem Agar vermischt
2. Auf diese Weise werden zwei DEV-NA-Platten angelegt (eine der beiden
Petrischalen wird bei 22 °C, die anderen bei 37 °C inkubiert)
3. Für den Nachweis von E. coli und Coliformen wird eine Gussplatte mit
verflüssigtem Tergitol-7-Agar (Tg+) angelegt. Das Probenvolumen beträgt auch
hier 1 ml (abweichend von den Anforderungen der Trinkwasserverordnung)
4. Von der Oberflächenwasserprobe wird eine Verdünnungsreihe bis zu einer
Verdünnung von 10-3 hergestellt, indem jeweils 0,5 ml der vorhergehenden
Verdünnungsstufe (vorher auf Vortexer gut mischen) zu 4,5 ml sterilem
Leitungswasser gegeben werden
5. Jeweils 0,1 ml jeder Verdünnungsstufe auf je zwei DEV-Nähragarplatten
ausspateln (entsprechend Versuch 2.5.); bei sehr sauberen Gewässern auch die
Originalprobe ausbringen!
20
MGP WS 2012/13
6. 0,1 ml der Originalprobe sowie der Verdünnungsstufen 10-1 und 10-2 auf je einer
Petrischale mit Tergitol-7-Agar ausspateln
7. Inkubation bei 22 °C und 37 °C für 48 bzw. 24 h (Tergitol-7-Agar nur 37 °C!).
Auswertung:
Ermitteln Sie die Gesamtkoloniezahl auf DEV-Nähragar, indem Sie aus den
Koloniezahlen geeigneter Verdünnungsstufen (ca. zwischen 20 und 300 Kolonien je
Platte) die KbE/ml in der Originalprobe berechnen. Differenzieren Sie unter den auf
dem Tergitol-7-Agar gewachsenen Kolonien zwischen Escherichia coli, anderen
coliformen Bakterien und der Begleitflora und geben Sie auch hier die jeweiligen
Koloniezahlen an. Erläutern Sie den Nachweis dieser Bakterien. Vergleichen Sie die
Koloniezahlen auf dem Selektivnährmedium mit der Gesamtkoloniezahl auf DEVAgar und bewerten Sie das Auftreten von coliformen Bakterien in den Wasserproben
hinsichtlich der Wasserqualität.
4. KURSTAG
4.1. Auswertung des Versuchs 1.6. - Isolierung von Streptococcus
salivarius
4.2. Auswertung der aeroben Kulturverfahren (Versuch 3.4.)
4.3. Auswertung des Versuchs 3.5. – Wasserproben
4.4. Physiologie der Mikroorganismen
Mit den folgenden Methoden werden wesentliche physiologische Eigenschaften von
Mikroorganismen, in vielen Fällen wichtige Reaktionen des mikrobiellen
Energiestoffwechsels, nachgewiesen. Der Nachweis erfolgt in der Mehrzahl der Fälle
durch eine Farbänderung oder Farbstoffbildung nach Zugabe eines bestimmten
Reagenzes. Die Erfassung mehrerer physiologischer Merkmale mittels einer sog.
„Bunten Reihe“ erlaubt eine taxonomische Differenzierung der Bakterien. In
miniaturisierter Form sind diese Tests die Basis standardisierter Testsysteme für die
Routinediagnostik. Legen Sie als Zusammenfassung der in diesem Abschnitt
aufgeführten Versuche und der Ergebnisse der aeroben Kulturverfahren (Versuch
3.4.) eine Tabelle an, in der alle ermittelten physiologischen Merkmale der einzelnen
Untersuchungsobjekte eingetragen werden. Vergleichen Sie in einer
zusammenfassenden Diskussion die untersuchten Mikroorganismen vor allem
hinsichtlich ihres Kohlenhydratstoffwechsels.
MGP WS 2012/13
21
4.4.1. Verhalten gegenüber Sauerstoff
OXIDASE-NACHWEIS
Die Cytochrom-Oxidase ist das terminale Enzym in der Atmungskette vieler
Bakterien. Dieser Test ist ein wesentliches Kriterium bei der Differenzierung GRAMnegativer Stäbchen.
Aufgabe:
Überprüfen Sie verschiedene Bakterien auf das Vorhandensein von CytochromOxidase.
Objekte:
Escherichia coli
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas stutzeri
Durchführung:
Verwendung von BactidentR Oxidase-Teststreifen (mit N,N-Dimethyl-1,4Phenylendiammoniumdichlorid und 1-Naphthol, MERCK) nach Vorschrift:
1. Mit einem sterilen Holzzahnstocher (keine metallischen Gegenstände wie
Impfösen verwenden!) etwas Bakterienmaterial von der Agarplatte entnehmen
und auf dem Teststreifen verreiben
2. Feststellen der Farbänderung innerhalb eines kurzen Zeitraums von 20 bis 60
Sekunden und Vergleich mit der Farbskala.
Auswertung:
Das Reagenz wird durch die Cytochrom-Oxidase oxidiert, wodurch eine blauviolette
Färbung auftritt. Diese Farbänderung muss bei einer positiven Reaktion innerhalb
von wenigen Sekunden (maximal 60 s) auftreten. Der Test sollte mit jungen Kulturen
durchgeführt werden.
KATALASE-NACHWEIS
Das Enzym Katalase ist für das Verhalten von Bakterien gegenüber elementarem
Sauerstoff verantwortlich. Gleichzeitig wird es als physiologisches Merkmal vor
allem bei der Differenzierung GRAM-positiver Kokken herangezogen.
Aufgabe:
Weisen Sie in verschiedenen Bakterien das Enzym Katalase nach.
22
MGP WS 2012/13
Objekte:
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Pseudomonas aeruginosa
Isolate aus Versuch 1.6. (Streptokokken)
Durchführung:
1. Einen Tropfen 3%ige Wasserstoffperoxidlösung auf einen Objektträger auftropfen
2. Etwas Material von einer Bakterienkolonie entnehmen und im Tropfen verreiben
3. Bei positiver Reaktion setzt sofort eine Bildung von Gasblasen ein.
Auswertung:
Geben Sie an, bei welchen der untersuchten Testorganismen Sie das Enzym Katalase
nachgewiesen haben. Welche Reaktion spielt sich bei der Bildung der Gasbläschen
ab?
4.4.2. Verwertung von Kohlenhydraten
OXIDATION-FERMENTATION- (OF) TEST NACH HUGH UND LEIFSON
Aufgabe:
Prüfen Sie die Fähigkeit unterschiedlicher Bakterien zur oxidativen oder
fermentativen Verwertung zweier Zucker (Glucose und Lactose) anhand des OFTests nach HUGH und LEIFSON.
Objekte:
Jede Gruppe setzt nur zwei Testorganismen ein:
Escherichia coli
Proteus vulgaris (nur gerade Gr.-Nr.)
Pseudomonas aeruginosa (nur ungerade Gr.-Nr.)
Durchführung:
1. Von jedem Testorganismus wird die Verwertung beider Zucker überprüft, d.h. es
werden jeweils zwei Teströhrchen mit jeder Kohlenstoffquelle (OF-Glu bzw.
OF-L) mit diesem Bakterium mit einer Impfnadel beimpft (die Zucker wurden
dem autoklavierten Nährboden beim Abkühlen zugesetzt)
2. Jeweils eines der beiden Röhrchen je Zucker wird mit ca. 1 ml sterilem Paraffinöl
überschichtet
3. Röhrchen bei 37 °C inkubieren.
MGP WS 2012/13
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Auswertung:
Stellen Sie fest, welche der Bakterien zu einem oxidativen und/oder fermentativen
Abbau der eingesetzten Zuckers fähig sind.
Angezeigt wird die Säurebildung durch Farbumschlag des pH-Indikators
Bromthymolblau. Gelbfärbung nur im offenen Röhrchen bedeutet oxidativen Abbau,
während Gelbfärbung im überschichteten Röhrchen den fermentativen Abbau des
entsprechenden Zuckers, d. h. dessen Vergärung unter Luftabschluss, nachweist.
Dabei findet der oxidative Abbau an und nahe der Oberfläche des Nährbodens statt,
während der fermentative Abbau sowohl an der Oberfläche als auch in der Tiefe des
Nährbodens abläuft. Achten Sie darüber hinaus auf eine mögliche Gasbildung!
ZWEIZUCKER-MEDIUM NACH KLIGLER
Aufgabe:
Charakterisieren Sie Mikroorganismen anhand ihrer Umsetzung von Glucose und
Lactose in einem Eisen-Zweizucker-Nährboden nach KLIGLER. Dieses Medium
enthält Phenolrot als Indikator (saurer Bereich - gelb; alkalisch - rot).
Objekte:
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Durchführung:
1. Beimpfen Sie jeweils ein Röhrchen mit KLIGLER-Medium (Kl) mit den genannten
Mikroorganismen. Dabei ist sowohl die Schrägfläche mit einer Impföse zu
beimpfen (Zickzack-Linie), als auch ein Impfstich in den unteren Teil des Agars
hinein mit der Impfnadel auszuführen
2. Röhrchen bei 37 °C inkubieren.
Auswertung:
Geben Sie die Kohlenhydratverwertung der untersuchten Bakterien an. Die Färbung
des Nährbodens bedeutet:
Schrägfläche:
gelb
Glucose und Lactose +
rot
Glucose +, Lactose Stich:
gelb
Glucose stark + (fermentativ)
rot
Glucose schwach +
schwarz
H2S-Bildung
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MGP WS 2012/13
VOGES-PROSKAUER-REAKTION UND METHYLROT-TEST
Diese beiden Tests dienen der genaueren Charakterisierung des Glucosestoffwechsels
vor allem der Enterobakterien. Da der Indikator Methylrot erst bei einem pH-Wert
unter 4,4 nach rot umschlägt, kann mit diesem Test eine sehr starke Säureproduktion
nachgewiesen werden, wie sie beim E. coli-Typ auftritt, bei dem organische Säuren
(Acetat, Lactat) als Gärungsprodukte überwiegen. Das von einigen Bakterien als
Intermediat gebildete Acetoin (Gärungshauptprodukt ist Butandiol – EnterobacterTyp) wird durch die VOGES-PROSKAUER-Reaktion in einem Aliquot der beimpften
und bebrüteten Glucose-Pepton-Bouillon nachgewiesen.
Aufgabe:
Prüfen Sie Bakterien auf ihre Fähigkeit, das Stoffwechselprodukt Acetoin und/oder
Säure bei der Umsetzung von Glucose zu bilden.
Objekte:
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Durchführung:
1. Je ein Reagenzglas mit Methylrot-VOGES-PROSKAUER (MR-VP)-Bouillon
(Glucose-Pepton-Bouillon) mit einer Öse der Bakterienkulturen beimpfen und bei
der optimalen Wachstumstemperatur (bei 37 °C, nur B. subtilis bei 28 °C)
inkubieren
2. Nach erfolgter Inkubation etwa die Hälfte der Kulturflüssigkeit entnehmen, in ein
neues Reagenzglas überführen und mit ca. 1 ml Methylrotlösung versetzen
3. Die restliche Kulturflüssigkeit zuerst mit 3-4 Tropfen -Naphthollösung (5 % in
96%igem Ethanol) und dann mit 3-4 Tropfen 40%iger KOH vermischen (VOGESPROSKAUER-Test).
Auswertung:
Methylrot-Test:
Prüfen Sie den Farbumschlag des zugesetzten Indikators. Die Reaktion gilt als
positiv, wenn der Indikator rot wird, d. h. der pH-Wert unter 4,4 absinkt.
VOGES-PROSKAUER-Reaktion:
Prüfen Sie die Farbänderung nach Zugabe der Nachweisreagenzien. Wurde durch die
Bakterien Acetoin gebildet, tritt eine Rotfärbung auf (manchmal mit zeitlicher
Verzögerung, evtl. nur als roter Ring an der Oberfläche erkennbar). Stellen Sie im
Protokoll den Chemismus der Acetoinbildung dar.
MGP WS 2012/13
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4.4.3. Weitere Tests der „Bunten Reihe“
CITRATVERWERTUNG
Der Nachweis der Citratverwertung wird zusammen mit dem Methylrot-Test, der
VOGES-PROSKAUER-Reaktion zum Nachweis von Acetoin (siehe Versuch 4.4.2.) und
dem Nachweis der Indolbildung als sog. IMVOC-Reihe vor allem zur
Differenzierung von Enterobakterien genutzt.
Aufgabe:
Überprüfen Sie die Fähigkeit von Bakterien zur Verwertung von Citrat als
Kohlenstoffquelle.
Objekte:
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Pseudomonas aeruginosa
Durchführung:
1. Überimpfen der Testorganismen von Agarkulturen (Über-Nacht Kultur) auf je ein
Röhrchen mit SIMMONS-Citrat-Agar (CA)
2. Bebrütung bei 37 °C für 24 - 48 h.
Auswertung:
Citratverwertung
positiv: Farbumschlag von grün nach blau (Indikator Bromthymolblau, bei pH 6,8 grün)
negativ: kein Farbumschlag, bleibt grün
BILDUNG VON H2S UND INDOL
Mit Hilfe des SIM (Sulfid-Indol-Motility)-Agars (SIM) werden zwei weitere Stoffwechselprodukte nachgewiesen: Die Bildung von Indol aus Tryptophan und die
Produktion von H2S bei Zersetzung schwefelhaltiger Proteine bzw. durch Reduktion
anorganischer S-Verbindungen wie Sulfat oder Thiosulfat. Gleichzeitig kann auch
anhand der Ausbreitung der Bakterien vom Impfkanal aus die Beweglichkeit
(„Motility“) von Bakterien geprüft werden.
Aufgabe:
Führen Sie den qualitativen Nachweis der H2S- und der Indolbildung durch
verschiedene Bakterien und überprüfen Sie deren Beweglichkeit.
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MGP WS 2012/13
Objekte:
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Durchführung:
1. Je ein Reagenzglas mit SIM-Hochschichtagar mit einer Impfnadel beimpfen
2. Mindestens 24 h bei 37 °C inkubieren
3. Nach erfolgter Inkubation zum Indol-Nachweis die Röhrchen mit 0,5 - 1 ml
KOVACS-Reagens (p-Dimethylaminobenzaldehyd-Lösung) überschichten.
Auswertung:
Der gebildete Schwefelwasserstoff wird als schwarzgefärbtes Eisensulfid im Bereich
des Wachstums nachgewiesen. Indolbildung führt zur Rotfärbung der
Reagenzschicht. Erklären Sie die Entstehung des Indols.
UREASE-TEST
Aufgabe:
Untersuchen Sie verschiedene Bakterien auf Urease-Aktivität.
Objekte:
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Proteus vulgaris
Durchführung:
1. Jeweils ein Schrägagarröhrchen mit Harnstoffagar nach CHRISTENSEN (HA) mit
einer Öse der jeweiligen Bakterienkultur beimpfen
2. Bei 37 °C inkubieren und nach 24 h oder 48 h auf Farbumschlag prüfen.
Auswertung:
Protokollieren Sie, ob für die verschiedenen Bakterien eine Urease-Aktivität anhand
des Farbumschlags des im Medium enthaltenen Indikators Phenolrot festgestellt
werden konnte. Notieren Sie die durch die Urease katalysierte Reaktion und erklären
Sie das Nachweisprinzip.
4.4.4. Nachweis der Nitratreduktion und Denitrifikation
Nitrat kann von Mikroorganismen sowohl assimilatorisch als auch dissimilatorisch
reduziert werden. Im letzteren Fall dient es bei Abwesenheit von O2 als
Elektronenakzeptor für die „anaerobe Atmung“. Mit dem Nachweis der Reduktion
von Nitrat zu Nitrit bzw. zu molekularem Stickstoff wird ein weiteres taxonomisch
relevantes Kriterium beschrieben.
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Aufgabe:
Weisen Sie die Nitratreduktion durch ausgewählte Bakterien nach.
Objekte:
Escherichia coli
Micrococcus luteus
Pseudomonas stutzeri
Durchführung:
1. Jeweils ein Röhrchen Nitrat-Bouillon (Nit) mit einer Impföse der jeweiligen
Bakterienkultur beimpfen
2. Bei der jeweils optimalen Wachstumstemperatur bebrüten (Ps. stutzeri und M.
luteus bei 28 °C, E. coli bei 37 °C)
3. Nach zwei Tagen (oder längerer Inkubation, je nach Wachstum) Nitritbildung
durch Zugabe von GRIESS-ILOSVAY-Reagens überprüfen. Bei Nitritbildung tritt
innerhalb einer Minute eine intensive Rotfärbung ein
4. Bei negativem Testergebnis einige Körnchen Zinkstaub zugeben. Ist noch Nitrat
vorhanden, erscheint innerhalb von 1-2 min eine rötliche Färbung in der Nähe der
Zinkkörnchen. Im Falle einer Reduktion des Nitrats zu N2 ist auch der
Zinkstaubtest negativ.
Auswertung:
Protokollieren Sie, welche Bakterien Nitrat reduzieren können und bis zu welcher
Oxidationsstufe diese Reduktion erfolgt. Erklären Sie die Notwendigkeit des Zinkstaubtests.
4.4.5. Mikrobieller Abbau von Biopolymeren - Stärkeabbau
Heterotrophe Mikroorganismen haben ein großes Potential zum Abbau organischer
Verbindungen, natürlichen wie auch industriellen Ursprungs. Ein großer Teil des
organischen Kohlenstoffs liegt in der Natur in Form von Makromolekülen wie
Cellulose, Lignin und Stärke vor. Mikroorganismen, die diese Biopolymere als
Kohlenstoff- und Energiequelle zum Wachstum verwerten, müssen Enzyme
ausscheiden, die diese Polymere in Monomere bzw. Oligomere spalten, die von der
Zelle aufgenommen und dort weiter metabolisiert werden können. Am Abbau von
Stärke, die aus α-1,4- und α-1,6-glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen besteht,
sind α-Amylasen, β-Amylasen und Glucoamylasen beteiligt, die in das Medium
ausgeschieden werden und auf stärkehaltigen Festnährböden zu typischen Klärhöfen
um die Kolonien herum führen.
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MGP WS 2012/13
Aufgabe:
Weisen Sie die Fähigkeit verschiedener Mikroorganismen, Stärke durch
Ausscheidung extrazellulärer Amylasen zu verwerten, in einer Agarkultur nach.
Objekte:
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Durchführung:
1. Beimpfen Sie jeweils eine Hälfte einer Platte mit Stärke-Agar (ST,
Komplexmedium, das 1 % Stärke enthält) mit einem der Testorganismen
2. Nach einer Inkubationsdauer von 3 bis 7 Tagen bei 30 °C werden die Platten mit
LUGOLscher Lösung überschichtet.
Auswertung:
Stärke verwertende Stämme sind nach Überschichtung mit LUGOLscher Lösung durch
farblos durchsichtige Bereiche um die Kolonien (Klärhöfe) charakterisiert, während
Zonen mit nicht hydrolysierter Stärke im Festmedium schwarzblau erscheinen.
4.5.
Anaerobe Kulturverfahren
Aufgabe:
Erproben Sie unterschiedliche Verfahren zur Kultivierung obligat anaerober
Mikroorganismen (pro Gruppe).
4.5.1. FORTNER - Platte
Objekte:
Clostridium pasteurianum
Serratia marcescens
Durchführung:
1. Aus einer Nähragar-Platte mit einem Skalpell einen Steg herausschneiden
2. Auf einer Hälfte des so geteilten Nährbodens Serratia marcescens dicht
ausstreichen, die andere Hälfte mit Clostridium pasteurianum beimpfen
3. Petrischale mittels Plastilina luftdicht verschließen
4. Bei 37 °C inkubieren.
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Auswertung:
Stellen Sie fest, ob das anaerobe Bakterium gewachsen ist. Erläutern Sie den
Zusammenhang zwischen dem Wachstum der beiden Mikroben. Wodurch wäre es zu
erklären, wenn Clostridium pasteurianum nicht, dafür aber Serratia marcescens
auffällig rot gewachsen sein sollte?
4.5.2. Pyrogallol - Verfahren
Objekt:
Clostridium pasteurianum
Durchführung:
1. Eine Petrischale mit Clostridien-Agar (Cl) mit Clostridium pasteurianum
beimpfen
2. Rundfilter (11 cm Durchmesser) so falten (vierteln), dass eine Tasche entsteht, in
diese Tasche ein Gemisch aus folgenden Substanzen geben (siehe Muster!):
ca. 0,3 g Pyrogallol (= ½ kleinerer Spatellöffel),
ca. 0,5 g K2CO3 (= ½ kleinerer Spatellöffel),
ca. 1,2 g Kieselgur (= 1 gestr. großer Spatellöffel)
3. Tasche auf den Petrischalendeckel auflegen, den beimpften Schalenboden umgekehrt darüber setzen, so dass der Taschenrand wenig hervorragt und abgeklemmt wird
4. Winkel zwischen Schalenboden und Auflagefläche ringsum luftdicht mit Plastilina verschließen (Filterpapier darf nicht unter der Dichtungsmasse hervorragen)
5. Bei 37 °C inkubieren.
Auswertung:
Stellen Sie fest, ob und warum das obligat anaerobe Bakterium unter diesen
Bedingungen gewachsen ist.
4.5.3. Hochschicht - Stichkultur
Objekte:
Clostridium pasteurianum
Durchführung:
1. Jeder Studierende beimpft ein Hochschichtagarröhrchen (enthält Nähragar) mit
Clostridium pasteurianum mittels Impfnadel
2. Das Kulturröhrchen durch wiederholtes Eintauchen der Öffnung mit dem
Wattestopfen in verflüssigtem Paraffin luftdicht verschließen, vor dem letzten
Eintauchen Stopfen auskühlen lassen, damit ein geschlossener Paraffinfilm
entstehen kann.
3. Bei 37 °C inkubieren.
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MGP WS 2012/13
Auswertung:
Beurteilen Sie visuell gegen das Licht das Wachstum des eingeimpften Bakteriums.
4.6. Anreicherung sulfatreduzierender Bakterien aus
Gewässersedimenten
Sulfat ist ein wichtiges Intermediat im Schwefelkreislauf und kann durch eine Reihe
anaerober Bakterien anstelle von Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor für
Atmungsprozesse (dissimilatorische Sulfatreduktion) genutzt werden. Physiologisch
können zwei Gruppen von Sulfatreduzierern unterschieden werden. Einige sind in der
Lage, Acetat vollständig zu oxidieren (z. B. Desulfobacter sp.), während die Vertreter
der zweiten Gruppe (z. B. Desulfovibrio sp.) Acetat nicht oxidieren können und
stattdessen Lactat, Pyruvat oder H2 als Elektronendonatoren nutzen. Die Nutzung von
molekularem Wasserstoff und die Ausfällung von Fe2+ als FeS sind auch die
Ursachen der mikrobiell induzierten, anaeroben Eisenkorrosion.
Aufgabe:
Anaerobe, sulfatreduzierende Bakterien sollen aus einem geeigneten Habitat
(Faulschlamm, anaerobe Gewässersedimente) angereichert werden und die anaerobe
Korrosion von Eisen demonstriert werden.
Objekt:
Material von anaeroben Gewässersedimenten
Durchführung:
1. Ein großes Reagenzglas wird mit einem Eisennagel versehen, etwas (2-3 ml)
Sedimentmaterial („Schlamm“) hinzugegeben und das Reagenzglas komplett mit
Desulfurikanten-Nährlösung (enthält Lactat als C-Quelle) gefüllt
2. Das mit einer Kapsenberg-Kappe (oder Alu-Folie) bedeckte Reagenzglas wird bei
30 °C im Anaerobiertopf nach Zugabe des Reagenzien-Beutels zur Entfernung des
Sauerstoffs inkubiert
3. Nach 1 – 2 Wochen erfolgen eine sensorische Prüfung der Bildung von H2S und
eine makroskopische und mikroskopische Betrachtung des Eisennagels bzw. der
anhaftenden Bakterien.
Auswertung:
Beschreiben Sie Ihre Beobachtungen und fertigen Sie Zeichnungen der im Mikroskop
beobachteten Mikroorganismen an. Erklären Sie kurz den durch sulfatreduzierende
Bakterien induzierten Korrosionsprozess.
MGP WS 2012/13
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5. KURSTAG
5.1.
Auswertung der Kohlenhydratverwertung (Versuch 4.4.2.) und
anderer physiologischer Tests (Versuche 4.4.3., 4.4.4., 4.4.5.)
Fassen Sie die Ergebnisse dieser physiologischen Tests und der aeroben
Kulturverfahren (4.1.) in einer Übersichtstabelle zusammen!
5.2. Auswertung des Versuchs 4.5. – Anaerobe Kulturverfahren
5.3. Ermittlung einer Wachstumskurve von Escherichia coli
Bei einer statischen Kultur von Mikroorganismen treten verschiedene
Wachstumsphasen auf, so dass man beim Auftragen eines Wachstumsparameters
(Bakterienzahl oder Bakterienmasse) über einer Zeitachse eine typische
Wachstumskurve erhält. Das Wachstum geht bei einzelligen Organismen mit
Vergrößerung und Zellteilung einher, d. h. es wird zwischen der Zunahme der
Zellmasse und der Erhöhung der Zellzahl unterschieden. Die Zellzahl kann
mikroskopisch als Gesamtzellzahl oder nach Kultivierung als Zahl lebens- (und
vermehrungs-) fähiger Zellen bestimmt werden. Zur Bestimmung der Zellmasse
können verschiedene direkte (Frischmasse, Trockenmasse, Gesamt-N- oder -CGehalt) oder indirekte (Trübungsmessung, O2-Verbrauch) Verfahren eingesetzt
werden.
Aufgabe:
Es ist der Verlauf der Wachstumskurven von E. coli in verschiedenen Medien
(Minimalmedium mit verschiedenen Kohlenstoffquellen, Vollmedium) zu erfassen
(gruppenweise). Das Wachstum wird durch Trübungsmessung (Messung der
optischen Dichte bei 620 nm) verfolgt.
Objekt:
Escherichia coli
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MGP WS 2012/13
Gruppeneinteilung für Wachstumsversuch:
Medium
Gruppen
Vollmedium
1, 9, 17,
25, 33, 41
2, 10, 18,
26, 34, 42
3, 11, 19,
27, 35, 43
4, 12, 20,
28, 36, 44
Vollmedium 1:10
verdünnt
Minimalmedium +
0,1 % Glucose
Minimalmedium +
0,2 % Glucose
Inkubationstemperatur
30 °C
30 °C
30 °C
30 °C
Gruppen
5, 13, 21,
29, 37, 45
6, 14, 22,
30, 38, 46
7, 15, 23,
31, 39, 47
8, 16, 24,
32, 40, 48
Inkubationstemperatur
37 °C
37 °C
37 °C
37 °C
Durchführung:
1. Beimpfung des jeweiligen (auf 30 °C oder 37 °C temperierten) Nährmediums mit
2-3 ml einer 6 bis 16 Stunden alten Vorkultur von E. coli in Nährbouillon
2. Nach guter Durchmischung wird die t0-Probe entnommen (ca. 1,5 ml) und der
Erlenmeyerkolben mit dem Nährmedium danach sofort wieder in den Schüttler
gestellt (30 °C oder 37 °C, 150 rpm)
3. Möglichst unmittelbar nach Entnahme der Probe wird die optische Dichte der
Suspension bei 620 nm (Leerwert-Abgleich mit A. dest.!) gemessen, im Falle
einer Verzögerung sollte die Probe vorübergehend ins Eisbad gestellt werden. Es
ist zu beachten, dass OD-Werte über 0,4-0,5 ungenau sind und eine lineare
Abhängigkeit zwischen Trübung und Bakterienmasse nur in einem relativ engen
Bereich gegeben ist. Daher muss die Probe gegebenenfalls vor der Messung
verdünnt werden!
4. Weitere Probenahmen erfolgen über einen Zeitraum von 4 Stunden in etwa
30minütigem Abstand (genaue Zeit protokollieren).
Auswertung:
Die Wachstumskurven werden ermittelt, indem die gemessenen Extinktionswerte
logarithmisch über der Zeitachse aufgetragen werden. Anhand der
Regressionsgeraden für die Werte der exponentiellen Wachstumsphase (nur diese
Werte nutzen!) sind die Wachstumsrate und (rechnerisch aus dieser) die
Verdopplungszeit zu ermitteln. Darüber hinaus ist die Dauer der lag-Phase und, falls
beobachtet, auch das Erreichen der stationären Phase einzuschätzen.
Im Vergleich mit anderen Gruppen sollen die Auswirkungen der verschiedenen
Medien und der unterschiedlichen Temperatur auf das Wachstum von E. coli
diskutiert werden.
MGP WS 2012/13
33
5.4. Nachweis der Säurefestigkeit von Bakterien
Die Säurefestigkeit bestimmter Bakterien (Mycobakterien und Nocardien) beruht auf
dem besonderen Aufbau der Zellwand und stellt ein taxonomisches Merkmal dieser
Bakteriengruppe dar.
Aufgabe:
Weisen Sie mit Hilfe der ZIEHL-NEELSEN-Färbung säurefeste Stäbchen nach.
Objekt:
Mycobacterium phlei
Escherichia coli
Durchführung:
1. Präparat anfertigen, Hitzefixierung
2. Mit Fuchsin-Lösung nach ZIEHL übergießen,
Abspülen mit Wasser
3. Mit 3%igem Salzsäure-Alkohol differenzieren bis
keine Farbwolke mehr abgeht
4. Mit Wasser abspülen
5. Gegenfärben mit Methylenblaulösung
6. Abspülen mit Wasser, danach trocknen lassen.
Auswertung:
Säurefeste Mikroben:
Übrige Mikroben und Zellen:
20 min
2 min
rot
blau
Benennen Sie die Ursache der Säurefestigkeit der untersuchten Mikroben.
5.5. Kapselfärbung nach MANEVAL
Viele Bakterien sind von Kapseln oder Schleimhüllen umgeben, die z. B. für die
Virulenz pathogener Bakterien von Bedeutung sind. Diese stark wasserhaltigen
Hüllen bestehen aus der Zellwand aufgelagerten Polysacchariden (sog. Exopolysacchariden) z.T. aber auch aus Polypeptiden (Bacillus megaterium), die im Fall von
Kapseln relativ fest mit der Zellwand verbunden sind. Hingegen werden lose oder gar
nicht mit der Zellwand in Kontakt stehende Anhäufungen von Exopolysacchariden
als Schleime bezeichnet. Der lichtmikroskopische Nachweis beruht auf einer
„Negativdarstellung“ nach Zusatz von Farbstoffen (z. B. Tusche, Kongorot), die nicht
in die Kapsel eindringen können.
Aufgabe:
Weisen Sie Kapseln bzw. Schleimhüllen von Bakterien mikroskopisch nach.
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MGP WS 2012/13
Objekte:
Micrococcus luteus
Bacillus megaterium
Xanthomonas campestris
Durchführung:
1. Ausstrich in einem Tropfen Kongorot herstellen, dünn ausstreichen, trocknen
lassen
2. Abspülen mit MANEVAL’scher Lösung (wird kurz zuvor aus 5%igem Phenol,
20%igem Eisessig, 30%igem FeCl3 und Säurefuchsin hergestellt), diese 3 - 4 min
einwirken lassen
3. Mit verdünnter HCl (3 - 5%ig) spülen
4. Mit Aqua dest. nachspülen (kein Leitungswasser!), trocknen lassen.
Auswertung:
Fertigen Sie eine Zeichnung an. Es erscheinen im mikroskopischen Bild
Bakterien:
rot
Kapsel:
weiß
Hintergrund:
blau
5.6. Nachweis von Speicherstoffen:
Neutralfette und Poly-β-hydroxybuttersäure
Viele Mikroorganismen lagern unter bestimmten Milieubedingungen intrazellulär
Substanzen als Speicher- oder Reservestoffe ein. Reservepolysaccharide wie Stärke
oder Glykogen, Neutralfette und Poly-β-hydroxybuttersäure dienen als Kohlenstoffund Energiereserve, Polyphosphate werden von einigen Mikroorganismen als
Phosphatspeicher angelegt. Außerdem finden sich bei einigen Bakterien wie Bacillus
thuringiensis kristallförmige Einschlusskörper.
Aufgabe:
Weisen Sie Speicherstoffe in Mikroorganismen nach Anfärbung mikroskopisch nach.
Objekte:
Bacillus megaterium (Anzucht auf M1 Medium mit Glucose, M1)
Yarrowia lipolytica (Vorkultur mit Ölsäure)
Durchführung:
1. Ausstrichpräparate herstellen, trocknen lassen und fixieren
2. Objektträger vollständig mit Sudanschwarzlösung bedecken, diese 10 min
(Bacillus) bzw. 15 min (Hefen) einwirken lassen
3. Farblösung abgießen und Objektträger mit Filterpapier trocknen
4. mit ROTI-Histol differenzieren (dabei Aufhellungsvorgang ggf. im Mikroskop
kontrollieren), mit Filterpapier trocknen
5. Mit Safranin (0,25 %) 30 - 60 s gegenfärben
MGP WS 2012/13
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6. Mit Wasser spülen und trocknen.
Auswertung:
Zeichnen Sie die grau gefärbten PHB- bzw. Fettablagerungen in den sonst rot
gefärbten Zellen. Charakterisieren Sie die Milieubedingungen, die zur Einlagerung
dieser Speicherstoffe führen.
5.7. Hitzeresistenz und Sporenbildung
Während die meisten Bakterien durch Temperaturen über 80 °C abgetötet werden, ist
die Hitzeresistenz einiger Bakterien auf die Bildung von Endosporen zurückzuführen.
Sporen können viele Jahre unter ungünstigen Umweltbedingungen überdauern und
unter geeigneten Bedingungen wieder auskeimen. Die Sporenbildung wird auch als
taxonomisches Merkmal bei der Bakteriendifferenzierung herangezogen.
5.7.1. Prüfung der Hitzeresistenz
Aufgabe:
Stellen Sie fest, ob die ausgewählten Bakterienstämme eine Temperatureinwirkung
von 100 °C überdauern können, also hitzeresistent sind.
Objekte:
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Durchführung:
1. Für jeden Organismus wird eine Nähragarplatte (NA) genutzt, auf dem Boden die
Hälfte der Petrischalen markiert und beschriftet
2. Bakterien in je ein Reagensglas mit sterilem Leitungswasser (5 ml) einimpfen und
gut suspendieren
3. Die Bakteriensuspensionen jeweils auf einer Hälfte der jeweiligen Petrischale im
Hilfe der Impföse ausstreichen (Kontrolle)
4. Reagenzgläser mit den Suspensionen in ein Wasserbad mit 80 °C stellen und die
Suspension nach ca. 15 min wieder entnehmen
5. Die hitzebehandelten Suspensionen auf der anderen Hälfte der jeweiligen Platte
ausstreichen
6. Petrischalen bei 28 °C (B. subtilis) bzw. 37 °C (E. coli) inkubieren.
Auswertung:
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MGP WS 2012/13
Vergleichen Sie das Bakterienwachstum auf beiden Petrischalen und stellen Sie fest,
ob und welche Bakterien hitzeresistent sind.
5.7.2. Färbung von Endosporen
Aufgabe:
Weisen Sie mit Hilfe der Färbemethode nach SCHAEFFER-FULTON Sporen im
mikroskopischen Präparat nach und überprüfen Sie auf diese Weise die Fähigkeit von
Bakterien, Sporen zu bilden.
Objekte:
Bacillus subtilis
Clostridium pasteurianum
Durchführung:
1. Dichtes Ausstrichpräparat herstellen
2. Trocknen und ausführlich fixieren (ca. 20mal durch die Bunsenbrennerflamme
ziehen)
3. Mit Malachitgrünlösung 10 min (ohne Hitzeeinwirkung) färben
4. Mit Wasser spülen
5. Mit Safraninlösung (1 %) 2 min gegenfärben
6. Mit Wasser spülen.
Achtung! Bei den verwendeten Farbstoffen Malachitgrün und Safranin besteht
der Verdacht auf eine mögliche carcinogene Wirkung!
Auswertung:
Fertigen Sie Zeichnungen der Präparate an. Machen Sie Angaben zur Lage und
Größe der Endosporen, sowie zur Häufigkeit sporentragender Zellen im Vergleich zu
vegetativen Zellen.
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5.8. Cyanobakterien
Die früher als „Blaualgen“ dem Pflanzenreich zugeordneten Cyanobakterien sind die
größte, formenreichste und am weitesten verbreitete Gruppe photosynthetisch tätiger
Prokaryonten. Im Gegensatz zu anderen Bakteriengruppen verfügen sie über einige
stark differenzierte Zellen.
Aufgabe:
Weisen Sie mikroskopisch Heterocysten bei Cyanobakterien nach.
Objekt:
Anabaena azollae (Symbiont in Azolla sp.)
Durchführung:
1. Lebendpräparate (Schnitt- bzw. Quetschpräparate von Azolla) herstellen
2. Mit dem 40er Objektiv (im Phasenkontrastverfahren) betrachten.
Auswertung:
Machen Sie anhand einer Zeichnung die Unterschiede zwischen Heterocysten und
vegetativen Zellen deutlich. Erläutern Sie die Funktion dieser spezialisierten Zellen.
5.9. Mikroorganismen des Bodens - Isolierung von Streptomyceten
aus Bodenproben
Der Boden ist reich an Mikroorganismen mit unterschiedlichen ökologischen
Ansprüchen und einem großen Stoffwechselpotential. Die Mikroorganismen des
Bodens sind maßgeblich an den Mineralisierungs- und Abbauprozessen im Boden, an
der Humusbildung, am N- und P-Kreislauf in enger Wechselwirkung mit höheren
Organismen beteiligt.
Die Anzahl und die Arten der Bodenmikroorganismen sind abhängig von dem
Bodentyp, der Tiefe (dem Bodenhorizont) und weiteren, damit verbundenen
abiotischen Faktoren wie Wassergehalt, pH-Wert und Nährstoffgehalt, aber auch von
biotischen Faktoren wie der Pflanzenbedeckung und saisonalen Einflüssen
(Temperatur).
Eine bedeutende Gruppe der Mikroorganismen des Bodens repräsentieren die
coryneformen Bakterien und Actinomyceten. Es handelt sich bei ihnen um
überwiegend aerobe GRAM-positive Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt der DNA,
die durch eine zunehmende morphologische Differenzierung bis zur Mycelbildung
charakterisiert sind. Actinomyceten sind auch für den typischen Geruch frisch
umgebrochenen Bodens aufgrund der Produktion von Geosmin, eines höheren
Alkohols, verantwortlich. Insbesondere die artenreiche Gattung Streptomyces ist als
Produzent antibiotisch wirkender Verbindungen von industrieller Bedeutung. Ihre
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Rolle als Produzenten von Antibiotika (s. Einleitung Versuch 8.2.) wurde zuerst
durch die Arbeiten von WAKSMAN und Mitarbeitern bekannt, die 1944 die Bildung
von Streptomycin durch Streptomyces griseus beschrieben.
Streptomyceten sind an ihrer meist kreidigen Oberfläche des Luftmycels (Lufthyphen
oder Sporophoren) der ausdifferenzierten, oft unterschiedlich gefärbten Kolonien zu
erkennen. Im folgenden Versuch sollen im Boden natürlich vorkommende
Streptomyceten isoliert und im weiteren Verlauf des Kurses auf ihre Fähigkeit zur
Bildung von Antibiotika geprüft werden. Weiterhin wird das Wirkungsspektrum
bekannter Streptomyceten-Reinkulturen (Versuch 8.3.2.) getestet.
Aufgabe:
Isolieren Sie mit Hilfe einer Selektivkulturmethode verschiedene Streptomyceten aus
Bodenproben.
Objekte:
Humusreiche Bodenproben
Durchführung:
Bitte die Gruppeneinteilung (Gr.-Nr. gerade - Bodenprobe A, ungerade Bodenprobe B) beachten! Es werden unterschiedliche Bodenproben untersucht.
1. 1 g Boden in 10 ml sterilem Leitungswasser in kleinen Erlenmeyerkölbchen gut
suspendieren (vorbereitet)
2. 1 ml der Suspension in 9 ml 1,4%iger Phenollösung in Kunststoffröhrchen
pipettieren, verschließen und gut schütteln
3. Gemisch 10 min bei Raumtemperatur stehen lassen, dabei mehrmals aufschütteln
4. Teil des Gemisches mit sterilem Wasser 1:10 verdünnen und je 0,1 ml des
Gemisches und der 1:10 Verdünnung auf zwei GAUZE-Agarplatten (GAU)
ausspateln
5. Bei 28 °C ca. 4 bis 10 Tage inkubieren: Fortsetzung und Auswertungen unter 7.2.
und 8.3.1.
Auswertung:
Beschreiben Sie die auf dem GAUZE-Agar gewachsenen Kolonien (Betrachtung mit
dem Binokularmikroskop!). Die Gesamtkoloniezahl und die Zahl der
wahrscheinlichen Streptomyceten (KbE) je g Boden sind zu bestimmen (vgl. 7.2. und
8.3.1.; Protokollvorlage Tab. 37 und 49). Streptomyceten sind an der meist
„kreidigen“ Oberfläche (Luftmycel) ihrer oft gefärbten Kolonien und am spezifischen
Geruch (Geosmin) zu erkennen. Beurteilen Sie das Ergebnis der Selektionsversuche
und erläutern Sie kurz das genutzte Selektionsprinzip für Streptomyceten aus dem
Boden.
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5.10. Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen
Aufgabe:
Erfassen Sie die Makro- und Mikromorphologie von Hefen nach Wachstum auf dem
Vollmedium SABOURAUD-Agar und dem Mangelnährmedium Reis-Agar.
Objekte:
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Geotrichum candidum
Rhodotorula spec.
Trichosporon cutaneum
Yarrowia lipolytica
Alle Stämme auf
SABOURAUD-Agar
Durchführung:
Ansetzen von Kulturen auf SABOURAUD- und Reis-Agar
1. Überimpfen Sie alle 6 Hefestämme auf zwei Platten mit SABOURAUD-Agar (SA)
und auf zwei Platten mit Reis-Agar (R) - jeweils drei Stämme pro Platte
2. Decken Sie die Ausstriche auf Reis-Agar mit sterilen Deckgläsern ab (sterile
Pinzette benutzen bzw. Pinzette abflammen!): Nach der Bebrütung entstehen
sogenannte Deckglas-Mikrokulturen (vgl. Einführung)
3. Bebrütung über zwei Tage bei 28 °C oder länger bei Raumtemperatur:
Fortsetzung unter 6.3.2. zur direkten Mikroskopie der Deckglas-Mikrokulturen
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6. KURSTAG
6.1. Auswertung der Untersuchungen zur Hitzeresistenz
(Versuch 5.7.1.)
6.2. Wirkung von Desinfektionsmitteln auf Mikroorganismen
Desinfektion ist die weitgehende Abtötung oder Inaktivierung von (pathogenen oder
produktionsschädigenden) Keimen in totem oder lebendem Material durch
Anwendung physikalischer und/oder chemischer Verfahren, so dass keine Infektion
mehr möglich ist. Sterilisation bedeutet dagegen eine vollständige Abtötung und/oder
die Eliminierung aller Mikroorganismen und deren Dauerstadien (Sporen).
Eine chemische Desinfektion, d. h. der Einsatz von Desinfektionsmitteln erfolgt vor
allem bei der Händedesinfektion, Hautdesinfektion, Flächendesinfektion (Wisch-,
Scheuer- oder Sprühdesinfektion), Raumdesinfektion, Gerätedesinfektion oder
Wäschedesinfektion. Bei Industrieanlagen der Lebensmittel- und pharmazeutischen
Industrie folgt die Desinfektion auf den Reinigungsvorgang.
Als Desinfektionsmittel von Bedeutung sind wässrige Lösungen oder Verdünnungen
von Alkoholen, Phenolen, quaternären Ammoniumverbindungen oder Peressigsäure.
Gerätedesinfektionsmittel, die auch Endosporen abtöten, sind z. B. alkalische
Glutaraldehydlösungen (ca. 2 % [w/v]) und Peressigsäure in saurer Lösung
(Gebrauchslösung 0,1 – 0,2 % [w/v]). Desinfektionsmittel mit viruzider Wirkung
inaktivieren Viren, z. B. Percarbonsäuren, Glutaraldehyd, Formaldehyd (bei längerer
Einwirkungszeit).
Die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln hängt z. B. vom pH-Wert, der Temperatur
und von der Anwesenheit von Schmutz- und Begleitstoffen ab. Auch die
Keimbelastung vor der Desinfektion ist für den Desinfektionserfolg von erheblicher
Bedeutung.
6.2.1. Prüfung von Desinfektionsmitteln
Aufgabe:
Prüfen Sie die mikrobizide Wirkung von ausgewählten Desinfektionsmitteln auf
Bakterien und Hefen mit dem Agardiffusiontest.
Objekte:
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Bakterien auf Nähragar (NA):
Escherichia coli (GRAM-negativ), Micrococcus luteus
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (GRAM-positiv);
Hefe auf SABOURAUD-Agar (SA):
Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica
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Durchführung:
Beachten Sie die Gruppeneinteilung (Einführung und Protokollvorlage Tab. 39) für
die Auswahl der zu testenden Stämme!
1. Von den Agar-Kulturen der ausgewählten Mikroorganismen mit der Impföse
wenig Material entnehmen und an der Wand des Röhrchens an der Grenze zur
Flüssigkeit in das Verdünnungsmedium (5 ml sterile PBS) einreiben und gut
verteilen, so dass eine Trübung noch gut erkennbar ist (für die Bakterien), für
Hefen kann die Trübung etwas stärker sein:
Vergleich der Trübung mit vorgelegten Zellsuspensionen für Versuch 6.2.2.:
Orientierung auf ca. 108 Zellen / ml)
2. Entnahme von Zellmaterial aus der verdünnten Kultur durch Eintauchen eines
sterilen Wattetupfers (Tupfer darf nicht tropfen, geringfügig an der
Reagenzglaswand ausdrücken), und damit zur Beimpfung gleichmäßig über die
gesamte Fläche des Testagars streichen. Bei Bedarf (Tupfer ist eventuell zu
schnell trocken) das Ausstreichen mit dem Tupfer wiederholen
3. Mit einem sterilen Korkbohrer (dazu untersten Teil ca. 2 cm in Alkohol tauchen
und kurz abflammen, dabei den Korkbohrer immer schräg nach unten halten, da
sonst brennender Alkohol auf die Hand laufen kann!) wird ein zylindrisches Loch
(10 mm Durchmesser) in der Mitte des Nährbodens ausgestanzt. Dann werden 0,1
ml der zu testenden Desinfektionslösung (0,5 % Peressigsäure, 70 % Ethanol,
sowie Knoblauch oder Zwiebelsaft zum Vergleich) in das ausgestanzte Loch
appliziert
4. Bebrütung der Nähragarplatten bei 37 °C über 1 bis 2 d und der SABOURAUDAgarplatten bei 28 °C über 2 bis 3 d
5. Ermittlung der Hemmhofdurchmesser (d in mm, s. Abb. 6.2).
Auswertung:
Vergleichen
Sie
die
Wirkung
der
eingesetzten
Desinfektionsmittel
auf
die
unterschiedlichen
Mikroorganismen durch Ausmessung der Hemmhöfe. Legen
Sie eine Tabelle zur Beurteilung der Desinfektionswirkung an
(Protokollvorlage Tab. 38 und Tab. 39 als Gesamtauswertung
aller Gruppen).
Abb. 6.2 - Ausbildung von Hemmhöfen
durch die Einwirkung von
Desinfektionsmitteln
(Süßmuth et al. 1999)
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6.2.2. Inaktivierung von Mikroorganismen durch Desinfektionsmittel
Aufgabe:
Bestimmen Sie den Grad der Inaktivierung von Mikroorganismen durch die
Einwirkung verschiedener Desinfektionsmittel.
Objekte:
Bakterien auf Nähragar (NA):
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis;
Hefen auf SABOURAUD-Agar (SA):
Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica
Durchführung:
Beachten Sie die Gruppeneinteilung (Einführung und Protokollvorlage Tab. 41) für
die Auswahl der zu untersuchenden Mikroorganismen und Desinfektionslösungen!
1. Von den Agar-Kulturen der ausgewählten Mikroorganismen mit der Impföse
wenig Material entnehmen und an der Wand der Kulturkölbchen mit ca. 10 ml
NB oder YPD flüssig einreiben und gut verteilen. Zwei Tage kultivieren, so dass
Zellzahlen von ca. 5 x 108 Zellen / ml (Hefen) und 109 Zellen / ml (Bakterien)
erreicht werden (bereits vorbereitet). Diese Kulturen werden allen Gruppen zur
Verfügung gestellt. Beachte Sie bitte die Erläuterungen zur Einführung
2. Zu jeweils 1 ml der Zellsuspension in Reagenzgläsern 9 ml sterile PBS
(Kontrolle) bzw. 9 ml der zu testenden Desinfektionsmittel (0,2 % Peressigsäure
und 70 % Ethanol) zugeben, gut mischen und 10 min einwirken lassen. Diese
Desinfektionsansätze und die PBS-Kontrolle werden dann als unverdünnte
Proben (Ansatz uv) betrachtet!
3. Von allen drei Proben Verdünnungsreihen herstellen (1:10 Verdünnungsschritte
in steriler PBS in Eppendorfgefäßen):
Erarbeiten Sie sich das weitere Vorgehen im Versuch selbst und beachten Sie
dabei die folgenden Fragen:
Welche Verdünnungen müssen von den jeweiligen Proben hergestellt werden,
um nach Ausspateln auf Agarplatten gut zählbare Koloniezahlen ermitteln
(geeignetes Zählfenster ab ca. 20 bis maximal 200-300 Kolonien pro Platte,
vgl. 2.6.2.) zu können? Ihnen stehen für jede der drei Proben maximal vier
Agarplatten (NA oder SA) zur Bestimmung der Lebendkeimzahl zur
Verfügung.
Berechnen Sie selbst (als Überschlag) die einzusetzenden Verdünnungsstufen,
wenn jeweils 0,1 ml dieser Verdünnungstufen ausgespatelt werden.
Beachten Sie dabei die zu erwartenden Inaktivierungsraten durch die Desinfektionsmittel (99,9 % und mehr) und die hohe Überlebensrate (mindestens
50 % der gezählten Zellzahl) in der Kontrollprobe (PBS-Kontrolle).
Berücksichtigen Sie dabei auch die in der Einführung zum Versuch gegebenen
Hinweise, insbesondere zum Verhalten verschiedener Organismen.
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4. Jeweils 0,1 ml der geeigneten Verdünnungen (zwei bis vier Verdünnungsschritte)
auf Keimzählplatten (Nähragar NA für Bakterien, SABOURAUD-Agar SA für die
Hefen) bis zur Trockene ausspateln
5. Bebrütung: 1-2 Tage bei 37 °C für Bakterien, 2-3 Tage bei 28 °C für die Hefen
Auswertung:
Ermitteln Sie die Koloniezahlen auf jeder Platte und geben Sie das Ergebnis als
KbE/ml der Ausgangssuspension (Ansatz uv) an. Stellen Sie die Ergebnisse in Form
einer Tabelle dar und ermitteln Sie die Überlebensrate (Prozentsatz der
Überlebenden) für die verschiedenen Desinfektionsmittel (Protokollvorlage Tab. 40).
Vergleichen Sie die Resultate aller Gruppen zur Wirkung verschiedener
Desinfektionsmitteln auf unterschiedliche Mikroorganismen (Gesamtauswertung:
Protokollvorlage Tab. 41).
Vergleichen Sie die Ergebnisse der Versuche 6.2.1. und 6.2.2.!
6.3. Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen
(Makro- und Mikromorphologie)
In den folgenden Versuchen werden wichtige Vertreter von Hefen und
Schimmelpilzen vorgestellt. Sie lernen die Besonderheiten der Makro- und
Mikromorphologie dieser eukaryotischen Mikroorganismen kennen.
Für die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die Spalthefe Schizosaccharomyces
pombe und die nichtkonventionelle, alkanverwertende Hefe Yarrowia lipolytica, die
das wichtigste Objekt der Forschungsarbeiten am Lehrstuhl für Allgemeine
Mikrobiologie ist, werden die sexuellen Vermehrungsformen (Ascosporen) durch
verschiedene Färbemethoden dargestellt (Versuch 6.3.1.).
Für diese und weitere Hefearten lernen Sie weiterhin die asexuellen Dauer- und
Vermehrungsformen (Blastosporen, Arthrosporen, Pseudomycel und echtes Mycel)
kennen (Versuch 6.3.2.).
Ausgewählte und teilweise für ihre Anwendung in der Lebensmittelindustrie wichtige
Schimmelpilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, Alternaria und Mucor werden
vorgestellt und durch ihre makro- und mikromorphologischen Erscheinungsformen
näher charakterisiert (Versuch 7.3.).
Aus diesen Versuchen sollen Sie die wichtigsten morphologischen Charakteristika
der vorgestellten Hefen und Schimmelpilze erkennen und auch als typische
Zeichnungen wiedergeben können.
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6.3.1. Sexuelle Vermehrungsformen bei Hefen (Ascosporen)
Aufgabe:
Machen Sie Ascosporen in Ausstrichpräparaten von Hefen durch die Färbung mit
Malachitgrün nach SCHAEFER-FULTON sowie mit Carbol-Fuchsin nach ZIEHLNEELSEN sichtbar.
Objekte:
Durchführung:
Saccharomyces cerevisiae H17 (diploid)
Yarrowia lipolytica (diploid)
Schizosaccharomyces pombe (diploid)
auf Acetat-Agar (Ac)
auf CSM-Agar
auf ME-Agar
Bitte die Gruppeneinteilung beachten:
Für die Mikroskopie Austausch guter Präparate zwischen
Nachbargruppen mit ungerader und gerader Gruppen-Nr.
Achtung! Bei den verwendeten Farbstoffen Malachitgrün, Safranin und CarbolFuchsin besteht der Verdacht auf eine mögliche carcinogene Wirkung!
Vorsicht beim Umgang mit diesen Färbelösungen!
Färbung nach SCHAEFFER-FULTON:
Ungerade Gruppen-Nr.
1. Anzucht der zu untersuchenden Hefen auf den Sporulationsmedien (vorbereitet)
2. Eine Probe der Hefekolonien vom Sporulationsmedium entnehmen und in einem
Tropfen PBS auf einem Objektträger ausstreichen und trocknen lassen
3. Hefeausstrich auf dem Objektträger durch Hitze fixieren
4. Objektträger mit Malachitgrün-Lösung überschichten und 5 min einwirken lassen.
Dabei mehrfach das Präparat vorsichtig mit dem Bunsenbrenner erhitzen bis
Dampfbildung einsetzt.
Darauf achten, dass Farblösung nicht kocht und nicht eintrocknet!
5. Arbeitsgang 4 dreimal wiederholen mit jeweils 5 min Einwirkzeit
6. Farblösung kurz mit Wasser aus kleinem Becherglas abspülen
7. Gegenfärbung mit Safranin-Lösung für ca. 30 s
8. Präparat kurz mit Wasser abspülen und trocknen
9. Betrachtung im Lichtmikroskop:
Die Ascosporen erscheinen blau-grün, die vegetativen Zellen rot.
Färbung nach ZIEHL-NEELSEN:
Gerade Gruppen-Nr.
1. Anzucht der zu untersuchenden Hefen auf den Sporulationsmedien (vorbereitet)
2. Eine Probe der Hefekolonien vom Sporulationsmedium entnehmen und in einem
Tropfen PBS auf einem Objektträger ausstreichen und trocknen lassen
3. Hefeausstrich auf dem Objektträger durch Hitze fixieren
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4. Objektträger mit Carbol-Fuchsin-Lösung nach ZIEHL-NEELSEN überschichten, 2
bis 3 min einwirken lassen und dabei vorsichtig erhitzen (s. Färbung mit
Malachitgrün!)
5. Mit Salzsäure-Alkohol-Gemisch (Vorsicht!) entfärben, bis das Präparat keine
Farbwolken mehr abgibt
6. Präparat kurz mit Wasser aus kleinem Becherglas abspülen
7. Präparat ca. 20 s mit gepufferter Methylenblau-Lösung (MBP: 0,01 %
Methylenblau in Phosphatpuffer, pH 7,2) gegenfärben
8. Präparat kurz mit Wasser abspülen und trocknen
9. Betrachtung im Lichtmikroskop:
Die Ascosporen erscheinen rot, die vegetativen Zellen blau
Auswertung:
Charakterisieren und zeichnen Sie die beobachteten
Zellformen (Asci mit Ascosporen sowie vegetative Zellen;
nach Austausch der Präparate zwischen den Nachbargruppen Darstellung der typischen Formen!) und
kennzeichnen Sie die Ascosporen der verschiedenen Hefen
(Größenangaben und Beschriftungen der mikroskopischen
Zeichnungen). Vergleichen Sie dazu und auch in den
folgenden Versuchen immer mit den vorgelegten typischen
Bildern aus der Einführungsdatei zum Versuch (Ausdruck
zum Versuchstag bitte mitbringen!).
Bestimmen Sie die Anzahl der Ascosporen pro Ascus.
Schätzen Sie den Anteil der Asci unter den vorhandenen
Zellen ein (Protokollvorlage Tab. 42).
Welche Bedeutung hat die sexuelle Vermehrung für die
Verbreitung von Hefen?
Abb. 6.3.1 – Der Mikrobiologe
(Cartoon von Joachim Czichos:
http://www.joachim-czichos.de/)
6.3.2. Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen von Hefen
(Makro- und Mikromorphologie)
Aufgabe:
Erfassen Sie die Makro- und Mikromorphologie von Hefen nach Wachstum auf dem
Vollmedium SABOURAUD-Agar und dem Mangelnährmedium Reis-Agar.
Objekte:
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Geotrichum candidum
Rhodotorula spec.
Trichosporon cutaneum
Yarrowia lipolytica
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Durchführung:
Fortsetzung von Versuch 5.10.
4. Charakterisieren Sie die Makromorphologie der Hefen nach Farbe, Geruch,
Größe, Aussehen und Form der Ausstriche bzw. Kolonien auf dem Vollmedium
SABOURAUD-Agar (SA) und vergleichen Sie dies mit dem Mangelnährboden
Reis-Agar (R)
5. Stellen Sie Nativ- (oder Lebend-) präparate (Deckglaspräparate) von allen 6
Hefestämmen sowie zwei Färbepräparate mit Methylenblau der Hefekulturen
S. cerevisiae und Y. lipolytica nach Wachstum auf dem Vollmedium SA her
6. Direkte Mikroskopie der Deckglas-Mikrokulturen: Die auf Reis-Agar (R)
erhaltenen Kulturen werden direkt mit der Petrischale im Bereich der schon
aufgelegten Deckgläschen mikroskopiert (nur bis 40er Objektiv möglich!
Vorsicht, dabei nicht die Kultur oder den Agar mit dem Objektiv berühren!). Auf
Reis-Agar werden die typischen morphologischen Strukturen einiger Hefen
besonders gut sichtbar. Vergleichen Sie mit der Mikromorphologie auf dem
Vollmedium SA.
7. Mikroskopieren Sie die erzeugten Präparate und Deckglas-Mikrokulturen und
fertigen Sie Zeichnungen im Vergleich mit den vorgelegten typischen Bildern aus
der Einführungsdatei zum Versuch an. Vergleichen Sie die Nativ- und die
Färbepräparate der beiden Hefen.
Auswertung:
Beschreiben Sie die Makromorphologie der Hefen (Protokollvorlage Tab. 43).
Charakterisieren Sie die Mikromorphologie der verschiedenen Hefearten. Fertigen
Sie mikroskopische Zeichnungen mit Beschriftungen im Vergleich mit den
vorgelegten typischen Bildern an.
Vergleichen Sie die Bilder der Nativ- und Färbepräparate.
Vergleichen Sie die Makro- und Mikromorphologie der Hefen auf Voll- (SA) und
dem Mangelmedium Reis-Agar (R).
Stellen Sie eine Übersicht zur die Mikromorphologie der verschiedenen Hefearten auf
dem Vollmedium (SA), Reis-Agar (R) und den Sporulationsmedien Ac, ME bzw.
CSM (siehe Versuch 6.3.1.) zusammen (Protokollvorlage Tab. 44).
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6.4. Fensterkulturen von Schimmelpilzen
Aufgabe:
Objekte:
Stellen Sie Fensterkulturen zur Beobachtung der Konidien von
ausgewählten Schimmelpilzen nach YTO und REFAR her.
Aspergillus niger
Penicillium spec.
Alternaria spec.
Mucor spec.
Vorkulturen auf
Vollmedium
(SABOURAUD-Agar)
Durchführung:
1. Sporulationsmedium (CZ: CZAPEK-DOX-Agar für Penicillium spec. und Mucor
spec.; Ac: Acetat-Agar für Alternaria spec. und für Aspergillus spec.) dünn
(3 mm) in Petrischalen ausgießen (vorbereitet)
2. Aus den Agarplatten mit sterilem Skalpell (Abflammen mit Alkohol) U-Form mit
ca. 4 cm Außenlänge und ca. 1 cm Breite ausschneiden. Ränder der so
angefertigten „Fenster“ punktartig mit Pilzsporen bzw. Konidien beimpfen und
mit sterilen Deckgläschen mit steriler Pinzette abdecken (vgl. Einführung)
3. Inkubation 2 bis 3 Tage bei Zimmertemperatur
4. Fortsetzung unter 7.3.: Mikroskopie der Fenster- (oder Mikro-)kulturen direkt im
„Fenster“ der Petrischalen (Nutzung der Objektive 5 und 10, Vorsicht, dabei nicht
die Kultur oder den Agar mit dem Objektiv berühren!), bzw. dann nach
vorsichtigem Übertragen der mit Pilzmaterial bewachsenen Deckgläser in einen
Tropfen Lactophenolblau auf einem Objektträger (vgl. 6. unter 7.3.) im Vergleich
mit den vorgelegten typischen Bildern (Einführungsdatei zum Versuch).
Auswertung:
Beschreiben Sie die Makromorphologie und die Mikromorphologie der vorliegenden
Pilzkulturen und fertigen Sie Zeichnungen an (siehe unter 7.3.).
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7. KURSTAG
7.1. Auswertung der Wirkung von Desinfektionsmitteln
(Versuche 6.2.1. und 6.2.2.)
7.2. Isolierung einer Reinkultur von Boden-Streptomyceten
Aufgabe:
Stellen Sie eine Streptomyceten-Reinkultur aus einer Boden-Mischkultur durch
fraktionierten Ausstrich des Bakterien-Rohisolates her.
Objekte:
Streptomyceten einer Mischkultur (aus Versuch 5.9.)
Durchführung:
1. Erste Auswertung Versuch 5.9.: Beschreiben Sie die auf dem GAUZE-Agar
gewachsenen Kolonien (Betrachtung mit dem Binokularmikroskop!) und
ermitteln Sie die Gesamtkoloniezahl und die wahrscheinliche Anzahl der
Streptomyceten (meist kreidige Oberfläche des Luftmycels der ausdifferenzierten,
oft deutlich gefärbten Kolonien; Geosmingeruch) als KbE je g Boden (vgl. 5.9.
und 8.3.1. A; Protokollvorlage Tab. 37 und Tab. 49).
Achtung, diese Platten aus Versuch 5.9. nicht entsorgen, sondern weiter
inkubieren bis zum 8. Kurstag zur Fortsetzung und finalen Auswertung!
2. Fraktionierter Ausstrich: Material von vier wahrscheinlichen Streptomycetenkolonien mit der Öse auf der Hälfte von zwei GAUZE-Agarplatten (GAU)
fraktioniert ausstreichen (Platte 1 und 2) und dies wiederholen (Platte 3 und 4):
- Platten 1 und 2 für den Antibiotikanachweis durch Überschichten (V. 8.3.1.)
- Platten 3 und 4 für die Mikroskopie von Streptomyceten – Versuch 8.4.
3. Nach erstem Ausstrich Öse ausglühen; nach dem Erkalten einmal quer durch den
ersten Ausstrich führen und zweiten Ausstrich anlegen, Vorgang nach erneutem
Ausglühen wiederholen (vgl. Abb. 2.4, hier jedoch fraktionierten Ausstrich je
Stamm auf der Hälfte einer Platte anlegen!)
5. Petrischalen bei 28 °C mehrere Tage inkubieren
6. Fortsetzung und Auswertung unter 8.3.1. und 8.4.
Auswertung:
Beurteilen Sie die fraktioniert beimpften GAUZE-Agarplatten nach dem Auftreten von
Einzelkolonien mit den typischen Eigenschaften von Streptomyceten.
Prüfen Sie die erhaltenen vier Reinkulturen und die Kolonien auf ausgewählten
Primärisolationsplatten auf ihre Fähigkeit, Antibiotika zu produzieren (Fortsetzung
Versuch 8.3.1.; Protokollvorlage Tab. 49).
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7.3. Asexuelle Dauer- und Vermehrungsformen ausgewählter
Schimmelpilze (Makro- und Mikromorphologie)
Aufgabe:
Erfassen Sie die Makro- und Mikromorphologie von ausgewählten Schimmelpilzen
nach Wachstum auf Voll- und Selektivnährböden und führen Sie eine Färbung mit
Lactophenolblau durch.
Objekte:
Aspergillus niger
Penicillium spec.
Alternaria spec.
Mucor spec.
Rhizopus spec. (R. wurde nur im
Schrägröhrchen mit Ac-Agar
vorbereitet – Bitte nicht öffnen!)
Kulturen auf dem Vollmedium SA vorbereitet
und auf den Sporulationsmedien als Fensterkulturen
angesetzt (Versuch 6.4.)
Durchführung: Bitte die hier empfohlene Reihenfolge der Durchführung beachten!
1. Erfassen Sie die Makromorphologie der Schimmelpilze (Farbe, Größe,
Aussehen und Form) nach Wachstum auf dem Vollmedium SABOURAUD-Agar
(SA) und vergleichen Sie mit den Sporulationsmedien (Fensterkulturen auf Ac
oder Cz; Ansätze aus Versuch 6.4.)
2. Erfassen Sie zuerst die Grundzüge der Mikromorphologie der
Schimmelpilzkulturen auf SABOURAUD-Agar bei geringerer Vergrößerung mit
dem Stereomikroskop (Binokular-Mikroskop - Zoomobjektiv 1,6x bis 4x).
Rhizopus spec. wird dabei direkt im Schrägröhrchen zur Erkennung der rhizioden
Strukturen mikroskopiert.
3. Betrachten Sie die Mikromorphologie in der Übersicht, jedoch besser vergrößert
durch direkte Mikroskopie der Fensterkulturen von Schimmelpilzen mit dem
Kursmikroskop im Vergleich mit den vorgelegten typischen Bildern (Objektiv 5x
und 10x, oder maximal 40x mit besonderer Vorsicht, insbesondere bei starkem
Wachstum der Schimmelpilzkulturen, vgl. Versuch 6.4.)
4. Stellen Sie Nativpräparate (Deckglaspräparate) der Aspergillus- oder der
Penicillium-Kulturen nach Wachstum auf Vollmedium her und mikroskopieren
Sie mit dem Kursmikroskop.
Vorsicht bei der Probennahme, Material nur wenig mechanisch beanspruchen.
Vorsicht beim Arbeiten wegen möglicher Sporenstreuung!
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5. Führen Sie zur besseren Erkennung von Details der Mikromorphologie
ausgewählter Bereiche der Schimmelpilze eine Lactophenolblaufärbung der
Nativpräparate auf Objektträgern durch:
A. Einen Tropfen Lactophenolblau-Lösung auf den Objektträger geben
B. Entnehmen Sie von den auf dem Agarmedium gewachsenen
Schimmelpilzen vorsichtig Probematerial (mit der Impföse und / oder
Impfnadel; Vorsicht bei der Probenahme, siehe unter 4.)
C. Verteilen Sie das Pilzmaterial in der Flüssigkeit sehr vorsichtig und
decken Sie mit einem Deckglas ab
D. Mikroskopie
6. Als alternative Methode wird die Übertragung der Deckgläschen von nicht mehr
benötigten Fensterkulturen (Ansätze aus 6.4.) in einen Tropfen Lactophenolblau
auf einem Objektträger und die anschließende Mikroskopie zur guten Darstellung
der Mikromorphologie von Schimmelpilzen empfohlen
7. Als eine weitere alternative Methode kann die Abnahme von Probematerial von
der Oberfläche der Schimmelpilzkulturen mit Hilfe eines Stückes Tesafilm und
anschließender Mikroskopie nach Auflegen auf einen Objektträger (ungefärbt
oder in einem kleinen Tropfen Lactophenolblau) genutzt werden.
Auswertung:
Beschreiben Sie die Makromorphologie der ausgewählten Schimmelpilze
(Protokollvorlage Tab. 45).
Charakterisieren Sie die Mikromorphologie der verschiedenen Schimmelpilze und
fertigen Sie beschriftete Zeichnungen an. Vergleichen Sie dazu Ihre Zeichnungen
immer direkt bei der Mikroskopie mit den vorgelegten typischen Bildern
(Einführungsdatei zum Versuch). Vergleichen Sie die Aussagekraft der Nativ- und
Lactophenolblau-Färbepräparate sowie der Binokular- und Durchlichtmikroskopie
von Vollmedium- und Fensterkulturen.
Charakterisieren Sie die wesentlichen Unterschiede in der Mikromorphologie von
Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus und Alternaria (Protokollvorlage
Tab. 46).
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7.4. Physiologie von Hefen
Im Kapitel 4.4. wurde bereits eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung
physiologischer Eigenschaften von Mikroorganismen vorgestellt (Tests zur „Bunten
Reihe“), die hauptsächlich für Untersuchungen zur taxonomischen Differenzierung
von Bakterien genutzt werden.
In den folgenden Versuchen sollen einige physiologische Merkmale von Hefen
demonstriert werden, die neben der Kohlenhydratverwertung ebenfalls zur
taxonomischen Einordnung genutzt werden können.
Einige besondere Eigenschaften haben darüber hinaus Bedeutung für die
biotechnologische Anwendung dieser heute als „nichtkonventionell“ bezeichneten
Hefen und Pilze. So können bestimmte Hefen neben Kohlenhydraten auch andere
zum Teil recht ungewöhnliche Substrate wie n-Alkane, Fette, Öle, Phenole
(alkanverwertende Hefen, z. B. Yarrowia lipolytica oder Candida-Arten) oder
Methanol (methylotrophe Hefen, z. B. Pichia pastoris, Candida boidinii) als einzige
C-Quellen verwerten. Diese Hefen verfügen daher im Vergleich mit der Bäckerhefe
S. cerevisiae über zusätzliche Gen- bzw. Enzymausstattungen, die die gute
Verwertung dieser Substrate gewährleisten und ein zusätzliches Potential für eine
biotechnologische Anwendung (Gewinnung von Einzellerprotein, Produktbildung,
z. B. Citronensäure oder Dicarbonsäuren) darstellen.
Legen Sie als Zusammenfassung der in diesem Abschnitt aufgeführten Versuche und
der Ergebnisse zum Gärtest (9.5.) Tabellen (Protokollvorlage Tab. 47 und Tab. 48)
an, in die alle ermittelten physiologischen Merkmale der untersuchten Hefen
eingetragen werden.
7.4.1. Alkanverwertung
Aufgabe:
Prüfen Sie die Fähigkeit von Hefen zum Wachstum auf n-Alkanen
(Dodecan, C12) als einzige Kohlenstoffquelle.
Objekte:
Candida maltosa
Cryptococcus albidus
Trichosporon cutaneum
52
Candida tropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Yarrowia lipolytica
MGP WS 2012/13
Durchführung:
Hinweis: Die Versuche 7.4.1. bis 7.4.3. gehören zusammen und
werden von allen Gruppen für alle Hefestämme durchgeführt.
Die Kontrollen mit Glucose (MG) bzw. ohne C-Quelle (M)
müssen deshalb nur einmal pro Gruppe angesetzt werden.
1. Alle Stämme auf je eine Platte der unten aufgeführten festen Minimalmedien
(festes Mineralsalzmedium M mit 2 % Agar) nach Einteilung der Platte in 6
Sektoren animpfen. Überimpfen der Hefekulturen vom Vollmedium durch dünnes
Ausstreichen (wenig Biomasse) mit der Öse in Form zweier Kreisflächen (keine
Ringe!) von etwa 5-7 mm Durchmesser pro Sektor auf MinimalmediumAgarplatten mit den folgenden C-Quellen (vorbereitet):
2.
MG: M-Agar + 2 % Glucose
MD: M-Agar + Dodecan (wird über die Gasphase gefüttert, d.h. das Alkan
wird als C-Quelle durch Tränken eines sterilen Filterpapiers im Deckel
der Petrischale mit 200 µl Dodecan appliziert); Die Platten mit Dodecan
werden deshalb separat in Pastetüten eingepackt bebrütet!
M: M-Agar ohne C-Quelle als Kontrolle für MD und MG
3. Bebrütung bei 28 °C für 3-7 Tage (Auswertung unter 8.1. und 9.1.).
Auswertung:
Beurteilen Sie das Wachstum der Hefestämme auf den angebotenen Substraten
Alkan und Glucose. Fassen Sie die Ergebnisse in Tabellen (Protokollvorlage
Tab. 47 - alle Einzelresultate der Gruppe von 7.4., Zusammenfassung - Tab. 48)
zusammen. Welche Stoffwechselwege gewährleisten die Verwertung von Alkanen?
7.4.2. Lipidverwertung - Bildung extrazellulärer Lipasen
Aufgabe:
Prüfen Sie die Fähigkeit von Hefen zur Bildung extrazellulärer
Lipasen zur Spaltung von Triglyceriden und zur Verwertung der
Spaltprodukte als einzige Kohlenstoffquelle.
Objekte:
Candida maltosa
Cryptococcus albidus
Trichosporon cutaneum
Candida tropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Yarrowia lipolytica
Durchführung:
1. Überimpfen der Hefekulturen vom Vollmedium durch dünnes Ausstreichen mit
der Öse in Kreisform (vgl. 1. unter 7.4.1.) auf Minimalmedium-Agarplatten
(festes Mineralsalzmedium M mit 2 % Agar; bzw. mit 1,2 % Agar für MTTB und
MTOO: Vorsicht beim Impfen, da der 1,2%ige Agar recht weich ist!) mit
folgenden C-Quellen (vorbereitet):
MG: M-Agar (M-A) + 2 % Glucose (vgl. 7.4.1.)
MTTB: M-A + 0,05 % Tween 80 (mit Phosphatpuffer, pH 6,8), 1 % Tributyrin
MGP WS 2012/13
53
MTOO: M-A + 0,05 % Tween 80 (mit Phosphatpuffer), 1 % Olivenöl (nativ)
MT: M-A ohne C-Quelle mit 0,05 % Tween 80 (mit Puffer) als Kontrolle
Alle Stämme auf je eine Platte beimpfen durch Einteilung in 6 Sektoren;
Beimpfen dieser Sektoren durch Auftragen von wenig Biomasse in Form zweier
Kreisflächen (keine Ringe!) von etwa 3-4 mm Durchmesser
2. Bebrütung bei 28 °C für 3-6 Tage (Auswertung unter 8.1. und 9.1.).
Auswertung:
Beurteilen Sie die Bildung extrazellulärer Lipasen (Klärungshöfe) und das
Wachstum der Hefestämme auf den angebotenen lipidartigen Substraten und auf
Glucose. Fassen Sie die Ergebnisse in Tabellen (Protokollvorlage Tab. 47 - alle
Einzelresultate der Gruppe von 7.4., Zusammenfassung Tab. 48) zusammen.
7.4.3. Proteasebildung und Eiweißabbau durch Hefen
Aufgabe:
Prüfen Sie die Fähigkeit von Hefen zur Bildung extrazellulärer Proteasen
und zur Verwertung von Protein als einzige C-Quelle.
Objekte:
Candida maltosa
Cryptococcus albidus
Trichosporon cutaneum
Candida tropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Yarrowia lipolytica
Durchführung:
1. Überimpfen der Hefekulturen vom Vollmedium durch dünnes Ausstreichen mit
der Öse in Kreisform (vgl. 1. unter 7.4.1.) auf Minimalmedium-Agarplatten
(festes Mineralsalzmedium M bzw. YNB mit 2 % Agar) mit folgenden C-Quellen
(vorbereitet):
MG: M-Agar + 2 % Glucose (vgl. 7.4.1.)
YSM: YNB-Agar + 1 % Magermilch (oder Skim milk-Agar = SKM-Agar)
M: M-Agar ohne C-Quelle als Kontrolle (vgl. 7.4.1)
Alle Stämme auf je eine Platte beimpfen durch Einteilung in 6 Sektoren;
Beimpfen der Sektoren durch Auftragen von wenig Biomasse in Form zweier
Kreiseflächen von etwa 3-4 mm Durchmesser
2. Bebrütung bei 28 °C für 2-4 Tage
3. Auswertung unter 8.1. und 9.1.: Das Wachstum der Hefekulturen und die Bildung
eines klaren Hofes wird überprüft und protokolliert.
Auswertung:
Beurteilen Sie die Bildung extrazellulärer Proteasen (Klärungshöfe) und das
Wachstum der Hefestämme auf dem Substrat Protein und auf Glucose. Werten Sie
die Versuche 7.4.1. bis 7.4.3. in Form der zusammenfassenden Tabellen 47 und 48
aus. Ergänzen Sie später diese Tabellen mit den Ergebnissen zum Gärtest (9.5.).
54
MGP WS 2012/13
8. Kurstag
8.1. Auswertung der Physiologie von Hefen (Versuche 7.4.)
Erste Auswertung von Alkanverwertung (Versuch 7.4.1.),
Lipidverwertung (7.4.2.) und Proteinverwertung (7.4.3.)
8.2. Auswertung der Anreicherung sulfatreduzierender Bakterien
aus Gewässersedimenten (Versuch 4.6.)
8.3. Bildung und Wirkung von Antibiotika
Antibiotika sind niedermolekulare Stoffwechselprodukte (Sekundärmetabolite) von Mikroorganismen mit Molekulargewichten unter 2000, die
bei geringen (<200 µg/ml) Konzentrationen das Wachstum von Bakterien,
Hefen oder Schimmelpilzen hemmen, jedoch den Antibiotika-Bildner selbst
nicht im Wachstum beeinflussen.
Diese ursprüngliche Definition von Antibiotika (geht auf WAKSMAN zurück)
muss heute erweitert werden, da mikrobielle Sekundärstoffwechselprodukte
auch gegen Tumoren bzw. Stoffwechselstörungen des Menschen klinisch
angewandt werden.
Von den heute ca. 10.000 bekannten Antibiotika werden ca. 50 – 60 % durch
Actinomyceten (und ca. 20 % durch Pilze) gebildet. Etwa 200 Antibiotika
mikrobiellen Ursprungs werden heute industriell hergestellt, wobei semisynthetische
Substanzen, d. h. chemisch oder enzymatisch modifizierte Antibiotika an Bedeutung
gewinnen. Weltweit werden therapeutische Antibiotika im Wert von mehr als 25
Milliarden US$ produziert.
Das Wirkungsspektrum eines Antibiotika-Produzenten, bzw. von Antibiotika oder
Hemmstoffen gegenüber verschiedenen Testorganismen (Indikatororganismen) kann
mit verschiedenen Methoden festgestellt werden. Beispiele für qualitative Tests
(Agardiffusionstest als Strichtest, vgl. auch Versuch 6.2. - Lochtest für die Wirkung
von Desinfektionsmitteln) werden in den folgenden Versuchen vorgestellt. Weitere
Methoden (Verdünnungsreihentest, quantitativer Agardiffusionstest), die auch eine
Quantifizierung der Antibiotika-Wirkung zulassen, werden im weiteren Verlauf des
Studiums vorgestellt.
Die Produktion antibakteriell wirkender Substanzen durch Streptomyceten kann
sowohl durch Überschichten einer bewachsenen Agarplatten mit einer zweiten
Agarschicht, die einen Indikatororganismus enthält („Seed“-Schicht, Zwei-SchichtenAgar), als auch mit dem sog. Strichtest nachgewiesen werden. Letzterer gibt auch
MGP WS 2012/13
55
Auskunft über das Wirkungsspektrum des gebildeten Antibiotikums bzw.
Antibiotika-Gemisches. Eine Form des Agardiffusionstest, der Blättchentest, dient
der Empfindlichkeitsprüfung mikrobieller Krankheitserreger gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen (Erstellung eines Antibiogramms). Grundlage ist die
Diffusion der in den Testplättchen enthaltenen Substanzen in den Agar und die
Ausbildung von Hemmhöfen, die eine Einstufung der Reaktion des zu testenden
Mikroorganismus als sensibel, intermediär oder resistent ermöglicht (s. auch DIN
58940-3).
8.3.1. Nachweis der Bildung von Antibiotika - Überschichtungstest
Aufgabe:
Weisen Sie die Bildung von Antibiotika durch Streptomyceten nach, die aus
Bodenproben isoliert wurden (Fortsetzung von Versuch 5.9. und 7.2.).
Objekte:
Streptomyceten-Isolate (Mischkulturen der Primärisolationsplatten und Reinkulturen aus den Versuchen 5.9. und 7.2.):
Jede Gruppe wählt dazu mindestens je eine geeignete Platte aus
Versuch 5.9. (Selektivkulturmethode, bevorzugt aus 1:10
Verdünnung mit weniger Einzelkolonien) und aus Versuch 7.2.
(Fraktionierter Ausstrich) aus.
Bacillus subtilis (Sporensuspension)
Durchführung:
A Zweite Auswertung der Primärisolationsplatten aus Versuch 5.9. nach 10 Tagen
B Überschichtungstest:
1. Eine 1:100 Verdünnung der Sporensuspension des Testbakteriums Bacillus
subtilis in sterilem Wasser herstellen (vorbereitet)
2. 16 ml Weich-Nähragar (WNA, Nährbouillon mit 0,6 % Agar) verflüssigen und
auf 55-60 °C temperieren (mindestens zwei Röhrchen pro Gruppe vorbereitet)
3. Verflüssigten Weich-Nähragar mit 0,1 ml der verdünnten Sporensuspension von
Bacillus subtilis beimpfen und gut mischen
4. Die mit Streptomyceten-Kolonien bewachsenen Petrischalen werden mit dem
beimpften Weich-Nähragar überschichtet, dabei Weichagar vorsichtig verlaufen
lassen, um Streptomycetenbiomasse nicht abzuschwemmen
5. Petrischalen bei 30 °C für mehrere Tage inkubieren (Auswertung unter 9.3.1.).
Auswertung:
Suchen Sie nach Streptomyceten-Kolonien, um die im Rasen von Bacillus subtilis
Hemmhöfe unterschiedlichen Ausmaßes entstanden sind. Bestimmen Sie die
Häufigkeit von Streptomyceten mit antibiotischer Wirkung gegen Bacillus subtilis
(Gesamtauswertung in Protokollvorlage Tab. 49).
56
MGP WS 2012/13
8.3.2. Wirkungsspektrum von Antibiotika-Bildnern - Strichtest
Aufgabe:
Ermitteln Sie mit Hilfe des Strichtests das Wirkungsspektrum eines AntibiotikaProduzenten gegenüber verschiedenen Testorganismen.
Objekte:
Ausgewählte Streptomyceten als Antibiotikabildner:
Streptomyces chrysomallus K, 1 (Wildtypen) und Mutante X2,
Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces griseus,
Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces noursei,
Streptomyces rimosus,
Streptomyces venezuelae,
Neuisolate von Streptomyceten aus Versuchen 5.9. und 7.2.
Bakterien als Testorganismen:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis
Durchführung:
Bitte die Gruppeneinteilung (Einführung und Tab. 51) beachten.
1. Eine Petrischale mit Nähragar, dem 1 % Stärke zugesetzt wurde (NAST),
strichförmig (am linken Rand) mit einem Streptomyceten-Stamm beimpfen und
einige Tage bei 28 °C inkubieren. Es werden die aufgeführten Reinkulturen von
Streptomyceten eingesetzt, es soll aber auch von jeder Gruppe ein neu isolierter
Streptomycet aus den Versuchen 5.9. und 7.2. getestet werden!
2. Fortsetzung unter 9.3.2.: Nach guter Entwicklung des Impfstriches die
Testorganismen senkrecht dazu vom Impfstrich des Antibiotika-Produzenten
beginnend zum Rand der Petrischale hin aufimpfen, ohne den Antibiotikabildner
zu berühren
3. Einige Tage bei 28 °C inkubieren (Auswertung unter 10.1.).
Auswertung:
Stellen Sie fest, welche Testorganismen durch die von den Streptomyceten
ausgeschiedenen Antibiotika gehemmt werden. Diskutieren Sie gegebenenfalls die
unterschiedliche Hemmung des Wachstums der Testorganismen (Protokollvorlage
Tab. 50 und Tab. 51 als Gesamtauswertungstabelle aller Gruppen).
MGP WS 2012/13
57
8.4. Mikroskopie von Streptomyceten
Bei der Kultivierung von Streptomyceten auf einem Agarmedium kommt es nach der
Entwicklung von Substratmycel zur Ausprägung von Luftmycel während der
Ausdifferenzierung. Das Luftmycel von Vertretern der artenreichen Gattung enthält
Lufthyphen (Sporophoren). Daraus werden Konidien abgeschnürt.
Aufgabe:
Erfassen Sie die Makro- und Mikromorphologie von Streptomyceten nach Wachstum
und Ausdifferenzierung.
Objekte:
Mindestens zwei Streptomyceten-Isolate aus dem Boden
(Reinkulturen aus den Versuchen 5.9. und 7.2.) und mindestens
zwei der vorgelegten Reinkulturen von bekannten Streptomyceten
(Auswahl wie unter 8.3.2.)
Durchführung:
1. Beschreiben Sie die Makromorphologie von mindestens vier StreptomycetenKulturen (zwei unbekannte Neuisolate und zwei bekannte Stämme) – Betrachtung
mit dem Binokularmikroskop
2. Anfertigung von Nativpräparaten (Deckglas-Präparate auf Objektträgern) und
Färbepräparaten (Methylenblau oder Kristallviolett) und anschließende
Mikroskopie im Vergleich mit den vorgelegten typischen Bildern
(Einführungsdatei zum Versuch)
3. Als Alternative kann die Abnahme des Luftmycels mit Tesafilm und Mikroskopie
nach Aufkleben auf einen Objektträger erfolgen.
Auswertung:
Beschreiben Sie die Makromorphologie von ausgewählten Streptomyceten (aus
Versuchen 5.9., 7.2., 8.3.2. – Protokollvorlage Tab. 52).
Charakterisieren Sie zusammenfassend die Mikromorphologie der verschiedenen
Streptomyceten-Stämme (Protokollvorlage Tab. 53). Beachten Sie die Formen des
Luftmycels und fertigen Sie beschriftete Zeichnungen an.
.
58
MGP WS 2012/13
8.5. Nachweis von Bakteriophagen am Beispiel somatischer
Coliphagen
Bakteriophagen, also Viren, die Bakterien als Wirtszellen befallen, sind vor allem
dort zu finden, wo auch die betreffenden Bakterienart natürlicherweise vorkommt, da
die Vermehrung der Phagen an die Wirtszelle und ihren Stoffwechsel gebunden ist.
Bakteriophagen sind vor allem in der genetischen Forschung von großer Bedeutung,
spielen aber auch in der industriellen Mikrobiologie eine wichtige Rolle, z. B. als
Verursacher von Fermentationsstörungen.
Da nur wachsende Zellen Phagen vermehren können, ist für ihren Nachweis eine
Kultur der entsprechenden Wirtsbakterien in der exponentiellen Wachstumsphase
notwendig. Neben dem Nachweis der phagenbedingten Bakterienlyse durch
Trübungsmessung können Phagen durch die Auszählung der Löcher in einem
Bakterienrasen, der sog. Plaques, quantifiziert werden. Letzteres kann mit Hilfe des
Oberflächenverfahrens oder des Schichtagarverfahrens (welches auch in diesem
Versuch angewendet werden soll) erfolgen.
Aufgabe:
Weisen Sie am Beispiel somatischer Coliphagen das Vorhandensein von
Bakteriophagen in verschiedenen Wasserproben mit Hilfe des Schichtagarverfahrens
nach.
Objekte:
Wirtsstamm Escherichia coli C (ATCC 13706) – Arbeitskultur
Wasserprobe (Abwasser)
Durchführung:
1. Herstellung einer Inokulumskultur des Wirtsstamms (vorbereitet!): 50 ml MSBMedium werden mit 0,5 ml einer bei –70 °C gelagerten und auf Raumtemperatur
temperierten E. coli-Kultur (aus der exponentiellen Wachstumsphase) inokuliert
und bei 37 °C inkubiert. Die Kultur kann verarbeitet werden, wenn die Zelldichte
ca. 108 je ml beträgt (Lagerung auf Eis, maximal 8 h!).
2. Vorbereitung von insgesamt drei MSA-Platten (für Oberflächen- bzw. Abwasser);
dazu werden jeweils ca. 16 ml verflüssigtes MSA-Basalmedium in sterile
Petrischalen gegossen (vorbereitet!).
3. Zu jeweils 50 ml ssMSA-Basalmedium, die im Wasserbad gelöst und bei 46 °C
temperiert wurden, werden 300 µl vorgewärmte CaCl2-Lösung (14,6 g in 100 ml)
steril zugegeben.
4. Der flüssige Agar wird zu 2,5 ml Aliquots in Röhrchen verteilt und im Wasserbad
bei 46 °C gelagert.
Bis zu diesem Arbeitsschritt ist im Kurs alles vorbereitet!
MGP WS 2012/13
59
5. Pro Ansatz wird 1 ml Probe bzw. der Verdünnung (Verdünnungsstufen werden in
der Einführung bekannt gegeben) zu den 2,5 mL ssMSA (mit CaCl2-Lösung!)
hinzugefügt
6. Zugabe von 1 ml Inokulumskultur je Ansatz, vorsichtig schwenken,
Blasenbildung vermeiden
7. Der gesamte Ansatz wird jeweils auf eine vorbereitete MSA-Agarplatte (MSA)
ausgegossen
8. Nachdem die Platte abgekühlt und der Agar erstarrt ist, kann die Platte umgedreht
und bei 37 °C ca. 20 h inkubiert werden
9. Nach der Inkubation Auszählung der Plaques
Auswertung:
Auf der Agarplatte mit dem Bakterienrasen wird eine Phagenkolonie als Loch
(„Plaque“) sichtbar. Berechnen Sie aus den ausgezählten Plaques die Plaque
bildenden Einheiten (pfu - plaque forming units) je ml Originalprobe.
8.6. Mikrobiologische Untersuchung von Kefir und Joghurt
Mit diesen Versuchen wird der Versuchskomplex zur mikrobiologischen
Untersuchung von Lebensmitteln begonnen. Der (damals noch unbewusste) Einsatz
von Mikroorganismen zur Herstellung von Brot, Bier, Wein und diversen
Milchprodukten stellte die ersten biotechnologischen Anwendungen von Bakterien,
Hefen und anderen Pilzen dar. Die Veränderung pflanzlicher und tierischer Produkte
durch mikrobielle Stoffwechselleistungen, d. h. die mikrobielle Fermentation von
Lebensmitteln, kann zur Erhöhung der Haltbarkeit, des Nährwertes oder des
Kaloriengehalts, zur Verbesserung des Geschmacks, des Geruchs, des Aussehens
oder der Konsistenz und auch zur Beseitigung von Toxinen führen. Fermentierte
Lebensmittel stellten daher in der Vergangenheit und stellen teilweise auch heute
noch eine wichtige Grundlage der menschlichen Ernährung dar. Während die
Herstellung vieler traditioneller Lebensmittel im kleinen Maßstab erfolgt und auf
Erfahrungswerten basiert, die von Generation zu Generation überliefert wurden,
werden einige wie z. B. Joghurt heute kommerziell im industriellen Maßstab
hergestellt. Hierbei spielt auch der gezielte Einsatz sog. „Starterkulturen“ eine
wichtige Rolle.
Joghurt entsteht, wenn man Vollmilch mit Hilfe der beiden Milchsäurebakterien
Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus vergärt. Der Vorgang läuft
bei einer Temperatur von etwa 40 °C ab. Der typische Joghurtgeschmack ist auf die
Milchsäure zurückzuführen, die aus dem in der Milch enthaltenen Milchzucker
(Lactose) entsteht, sowie auf Acetaldehyd - beide entwickeln sich vornehmlich unter
der Einwirkung von Lactobacillus bulgaricus.
60
MGP WS 2012/13
Dem Joghurt verwandt sind eine Reihe anderer Milchprodukte, beispielsweise saure
Sahne, Buttermilch. Weitere Produkte wie Bulgarische Milch, Kefir und Koumis
entstehen durch Gärung von ganz oder teilweise entrahmter Milch, die von einer
Mischung aus Milchsäurebakterien und Hefen ausgelöst wird.
Einen Schwerpunkt dieses Versuchskomplexes bildet die Vorstellung von
Mikroorganismen bzw. mikrobiellen Leistungen, die bei der Herstellung haltbarerer,
verbesserter und geschmacklich veränderter Nahrungsmittel vielfach schon seit
Tausenden Jahren genutzt werden.
Durch den Einsatz von „Starterkulturen“ wird die mikrobielle Besiedlung eines
Produkts gesteuert, dadurch das Produkt in hygienischer Hinsicht sicherer und die
Produktionszeit verkürzt. Milchsäurebildende Bakterien sind für die Haltbarmachung
von Gemüse, die Brotherstellung und die Produktion fermentierter Milchprodukte
entscheidend. Ihr Nachweis erfolgt sowohl mikroskopisch als auch nach Kultivierung
auf Selektivnährböden (z. B. MRS-Agar).
Aufgabe:
Mikroskopische und mikrobiologische Untersuchung von industriell hergestelltem
Joghurt und von selbst erzeugtem Kefir.
Durchführung:
A – Mikroskopie von Präparaten aus den Originalproben von Joghurt und Kefir:
1. Herstellung von Ausstrichpräparaten von Joghurt-Proben, Hitzefixierung
2. Anfertigung eines Ausstrichpräparats der Kefir-Milch, Hitzefixierung
3. Vorbehandlung von Kefirknöllchen für die Mikroskopie: Reinigung mit
Wasserstrahl, mit der Rasierklinge (oder Skalpell) ein kleines Stück abschneiden
und zwischen zwei Objektträgern zerdrücken, danach Objektträger trennen,
Hitzefixierung
4. Übersichtsfärbung (Methylenblau nach LOEFFLER, MBL, 4 min)
5. Mikroskopie (mit 100x-Objektiv, Immersionsöl verwenden!) - Achten Sie auf
verschiedene Milchsäurebakterien und Hefen (Vergleich mit den vorgelegten
typischen Bildern aus der Einführungsdatei)!
B – Kultivierung (Mikrobiologische Qualitätskontrolle von Lebensmitteln):
1. Vom Joghurt und der Kefirmilch jeweils fraktionierte Ausstriche auf MRS-Agar
zur Anzüchtung von Lactobacillus-Arten herstellen
2. Etwas Material von einem Kefirknöllchen mit der Impföse entnehmen und
fraktioniert auf YGC-Agar (Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar)
ausstreichen
3. Inkubation: MRS-Agar: anaerob (im Anaeroben-Topf) bei 37 °C, 3 Tage
YGC-Agar: aerob bei 25 °C, 3 Tage
MGP WS 2012/13
61
4. Auswertung unter 9.4.1.:
- Mikroskopie der auf den Medien MRS und YGC angewachsenen
unterschiedlichen Kolonietypen (Färbepräparate mit Methylenblau) zur
Zuordnung der verschiedenen Milchsäurebakterien und Hefen;
Anfertigung von mikroskopischen Zeichnungen im Vergleich mit den
vorgelegten typischen Bildern (Einführungsdatei zum Versuch)
- Bei den auf MRS-Agar gewachsenen Kolonien: Katalase-Test (siehe 4.4.1.).
Auswertung:
Vergleichen Sie die mikrobielle Zusammensetzung von Joghurt und Kefir!
Fertigen Sie dazu Zeichnungen der mikroskopischen Präparate (zu Teil A und B) an
und vergleichen Sie die in beiden Milchprodukten gefundenen Mikroorganismen
(Originalproben Teil A und nach Plattenkulturen Teil B - Protokollvorlage Tab. 54).
9. KURSTAG
9.1. Zweite Auswertung der Physiologie von Hefen (Versuch 7.4.)
Zweite Auswertung von Alkanverwertung (Versuch 7.4.1.),
Lipidverwertung (7.4.2.) und Proteinverwertung (7.4.3.)
9.2. Auswertung des Bakteriophagennachweises (Versuch 8.5.)
9.3. Bildung und Wirkung von Antibiotika
9.3.1. Auswertung der Antibiotika-Bildung durch BodenStreptomyceten - Überschichtungstest (Versuch 8.3.1.)
9.3.2. Fortsetzung des Wirkungsspektrums von Antibiotika-Bildnern Strichtest (Versuch 8.3.2.)
62
MGP WS 2012/13
9.3.3. Empfindlichkeitsbestimmung von Bakterien gegenüber
Antibiotika mit Hilfe des Agardiffusionstests (Antibiogramm)
Aufgabe:
Prüfen Sie die Empfindlichkeit verschiedener GRAM-negativer und GRAM-positiver
Bakterien gegenüber verschiedenen Antibiotika mit Hilfe des Blättchentests nach
KIRBY und BAUER (Ermittlung eines Antibiogramms, s. auch DIN 58 940).
Objekte:
Testorganismen:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli (ungerade Gruppen-Nr.)
Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa (gerade Gr.-Nr.)
Durchführung:
1. Von Agar-Kulturen der ausgewählten Mikroorganismen mit der Impföse 3-5
Kolonien abimpfen und in 5 ml steriler PBS suspendieren. Einstellen einer
geeigneten Zelldichte (108 Zellen oder KbE pro ml) durch Vergleich mit dem 0.5
MCFARLAND-Standard (oder einer vorliegenden Zellsuspension).
2. Entnahme von Zellmaterial aus der Suspension durch Eintauchen eines sterilen
Wattetupfers (Tupfer darf nicht tropfen, etwas an der Reagenzglaswand
ausdrücken). Zur Beimpfung gleichmäßig über die gesamte Fläche des Testagars
(MUELLER-HINTON-Agar, MHA) streichen!
3. Nach ca. 5 bis 15 min werden Testplättchen mit definierten Mengen
verschiedener Antibiotika mit einer sterilen Pinzette auf den Agar aufgelegt und
die Petrischalen innerhalb von 15 min danach in den Brutschrank gestellt und 1618 h bei 37 °C bebrütet.
Es ist darauf zu achten, dass der Abstand der Testplättchen untereinander und
vom Rand der Petrischale so bemessen ist, dass kreisförmige Hemmhöfe ohne
Überschneidung entstehen können.
4. Die Auswertung erfolgt am nächsten Kurstag durch Ausmessen der
Hemmhofdurchmesser.
Auswertung:
Bewerten Sie die Antibiotika-Empfindlichkeit der von Ihnen und der Nachbargruppe
untersuchten Bakterienstämme unter Zuhilfenahme der folgenden Tabelle
(Gesamtauswertung mit der Nachbargruppe: Protokollvorlage Tab. 56). Ziehen Sie
Schlussfolgerungen, wie Infektionen mit den untersuchten Bakterien am effektivsten
therapiert werden könnten.
MGP WS 2012/13
63
Tabelle zur Interpretation der Hemmhofdurchmesser (nach DIN 58940-3):
Antibiotikum
Beladung
resistent
(µg)
( mm)
Ampicillin
10
14
15-21
22
Ciprofloxazin
5
18
19-22
23
Erythromycin
15
16
17-20
21
Gentamicin
10
14
15-20
21
Penicillin G
6 (10 I.U.)
12
13-23
24
bei Staphylococcus ssp.
intermediär
sensibel
( mm)
28
Tetracyclin
30
16
29
17-21
22
9.4. Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln
Neben dem Nachweis der technologisch erwünschten Mikroorganismen (vgl.
Versuche 8.6., 9.4.2.) liegt der Schwerpunkt der mikrobiologischen Untersuchung
von Lebensmitteln im Nachweis von den Bakterien und Pilzen, die als Erreger von
Infektionskrankheiten oder Toxinbildner zu einer Gesundheitsgefährdung der
Konsumenten
führen
können.
Darüber
hinaus
können
mikrobielle
Stoffwechselaktivitäten zum Verderb von Lebensmitteln führen, so dass auch
derartige Mikroorganismen nachgewiesen werden (vgl. Versuch 9.4.2.).
Die mikrobiologischen Kriterien für bestimmte Lebensmittel werden durch
entsprechende Gesetzte und Verordnungen vorgeschrieben. Für alle Lebensmittel
übergreifende Untersuchungsmethoden existieren nur in Ausnahmefällen, in der
Regel gibt es für die diversen Einzelprodukte genormte Verfahren, z. B. ISOMethoden (International Organization for Standardisation), DIN-Methoden
(Deutsches Institut für Normung e.V.) oder die Amtliche Sammlung von
Untersuchungsmethoden nach LFGB § 64 (bis 2005 LMBG §35).
9.4.1. Auswertung: Mikrobiologische Untersuchung von Kefir
und Joghurt (Versuch 8.6.)
64
MGP WS 2012/13
9.4.2. Untersuchung von Sauergemüse
Bei der Herstellung von Sauerkraut spielen folgende Mikroorganismen
(„Sauerkrautorganismen“) eine wesentliche Rolle:
Milchsäurebakterien - bewirken die die natürliche Säuerung (Bildung von
Milchsäure, Essigsäure, Ethanol, Dextran, Mannit, CO2 (verschiedene
Milchsäuregärungstypen): Lactobacillus spp. - a oder c; Streptococcus lactis oder
Leuconostoc mesenteroides - b (hier nicht unterschieden); Sarzinen (Tetraden, z. B.
Pediococcus acidilactici, P. cerevisiae - d); Hefen (Saccharomyces-Arten - e).
Als Verderbniserreger treten die so genannten
Kahmhefen auf (hauptsächlich Candida valida,
auch als C. mycoderma bezeichnet, sowie die
als „Milchschimmel“ bezeichnete Hefe
Geotrichum
candidum;
führen
bei
Luftanwesenheit zur Hautbildung auf der Lake
von Sauerkraut, Salz- oder Gewürzgurken, bzw.
auf alten, verdorbenen Fruchtsäften, Wein und
Bier).
Deren
oxidativer
Abbau
der
konservierenden
organischen
Säuren
(Milchsäure) führt in der Folge zum Verderb
Abb. 9.4 – Mikroorganismen der
durch andere Bakterien.
Sauerkrautlake, aus Schröder 1991,
S. 181 (modifiziert)
Aufgabe:
Mikroskopieren Sie Nativpräparate bzw. Färbepräparate von Mikroorganismen aus
Sauergemüse.
Objekte:
Lake von Sauerkraut (SK, alle Gruppen),
Lake von Salz- oder Sauergurken (SG)
Probe A: Sauergurken, frisch vom Fass - gerade Gr.-Nr. und
Probe B: Sauergurken abgepackt - ungerade Gr. Nr.
Durchführung:
1. Herstellung von Ausstrichpräparaten und Methylenblaufärbung nach LÖFFLER
(MBL)
2. Mikroskopie zur Charakterisierung der Mikroorganismen der Sauergemüselaken
mit dem 40er und dem 100er Objektiv (Ölimmersion) im Vergleich mit den
typischen Bildern
3. Nach Einteilung der Platten in Sektoren fraktionierter Ausstrich der beiden
Sauergemüselaken auf MRS und NA (Darstellung thermophiler
Milchsäurebakterien) und SA (Darstellung von Hefen und Schimmelpilzen) und
Bebrütung bei 37 °C (NA aerob, MRS anearob) bzw. 28 °C (SA) für ca. 2-3 Tage
MGP WS 2012/13
65
4. Fortsetzung unter 10.2.1.: Auswertung durch Mikroskopie von jeweils zwei
unterschiedlichen Kolonien der auf den verschiedenen Medien gewachsenen
Kulturen aus Sauergemüselake.
Auswertung:
Charakterisieren Sie die im Sauergemüse gefundenen Mikroorganismen (Bakterien,
Hefen, Schimmelpilze) und fertigen Sie beschriftete Zeichnungen (immer im
Vergleich mit den vorgelegten typischen Bildern) der Originalproben und der
Plattenkulturen an (Tab. 57). Analysieren Sie das Auftreten von Hefekolonien
unterschiedlicher Form auf SA und diskutieren Sie in diesem Zusammenhang die
Anwesenheit und Funktion von Kahmhefen im Sauergemüse.
9.5. Gärtest mit Hefen
Insbesondere Hefen und eine Reihe von anderen Pilzen spielen seit Jahrtausenden
eine wesentliche Rolle bei der Herstellung von Lebensmitteln (Bier-, Wein-, und
Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, Sauerteig, Kefirhefen, Schimmelpilze und
Hefen bei der Käseherstellung).
Wie Archäologen herausfanden, war die Vergärung von Getreideextrakten bereits vor
6000 Jahren bei den Sumerern eine hoch entwickelte Kunst. Das so gewonnene Bier
schmeckte nicht nur besser als Wasser, sondern war auch ungefährlicher, weil sich
wegen der in ihm enthaltenen Säure und der aus dem Hopfen abgeleiteten
antimikrobiellen Verbindungen keine krankheitserregenden Organismen entwickeln
konnten. Ähnlich trifft dies auch auf Wein zu, der seit etwa 5000 Jahren erzeugt wird.
Heute, in einer Zeit, in der man die Lebensprozesse der Mikroorganismen gut
versteht, haben Speisen und Getränke, bei deren Herstellung Gärungsprozesse eine
Rolle spielen, einen bedeutenden Anteil am gesamten Nahrungsmittelangebot (vgl.
Versuch 8.6.). Die alkoholische Gärung, d. h. die Umwandlung von Glucose zu
Ethanol und CO2 bei der Bier- und Weinherstellung, ist heute einer der wichtigsten
biotechnologische Prozesse nach seinem Wertumsatz.
Bei den technischen Fermentationen benutzen die Mikroorganismen ihr C-Substrat
zum Aufbau von Biomasse und auch zum Energiegewinn in Form von ATP. Das am
besten studierte C-Substrat ist Glucose, aus der während der Glycolyse unter anderem
ATP und NADH entstehen. Wenn der Wasserstoff von NADH unter anaeroben
Bedingungen auf normale Zwischenprodukte oder auf extra synthetisierte
Wasserstoffakzeptoren übertragen wird, spricht man von Gärungen. Andere
Möglichkeiten zur Entfernung des Wasserstoffs sind die Atmung (Übertragung auf
O2), die anaerobe Atmung (Übertragung auf Nitrate oder Sulfate) und die
unvollständige Oxidation (Ausscheiden von Brenztraubensäure, Essigsäure oder
Zitronensäure unter aeroben Bedingungen).
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MGP WS 2012/13
Aufgabe:
Vergleichen Sie die Gärfähigkeit der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae mit den
Hefen Yarrowia lipolytica und Candida maltosa.
Objekte:
Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) als frische Presshefe,
Yarrowia lipolytica und Candida maltosa (beide auf SA-Agar)
Durchführung:
Bitte die Gruppeneinteilung beachten! Jede Gruppe untersucht die
Bäckerhefe und eine der beiden anderen Hefen (Gruppen 1-12, 2536: Y. lipolytica; Gruppen 13-24, 37-48: C. maltosa)
1. Vorbereitete Reagenzgläser (2 pro Gruppe) enthalten Glucose-Bouillon (GB, 1 %
Pepton, 2 % Glucose, autoklaviert) und DURHAM-Röhrchen (Gasfang-röhrchen)
in der Nährlösung
2. Je ein Röhrchen gut mit Presshefe (ca. drei Impfösen) bzw. mit der anderen Hefe
beimpfen damit eine deutliche Trübung eintritt, das DURHAM-Röhrchen jedoch
noch deutlich sichtbar ist
3. Bebrütung der Ansätze bei 28 °C über einen Zeitraum von 2, 4 und 20-24 h (über
Nacht, dann bei 4 °C gelagert bis zum 10. Kurstag) und dabei Kontrolle zur
Abschätzung der Intensität der Gasentwicklung.
Die Gäreigenschaften werden wie folgt eingestuft:
+++... DURHAM-Röhrchen vollständig mit
Gas gefüllt,
+/++ DURHAM-Röhrchen teilweise mit Gas gefüllt,
(+)…. DURHAM-Röhrchen nur mit einzelner
Gasblase oder deutlich verzögert gefüllt,
- ..... negativ, keine Gasbildung.
Abb. 9.5 – Gärtest mit Gasfangröhrchen
nach DURHAM (Schröder 1991)
Auswertung:
Schätzen Sie die Gasentwicklung nach verschiedenen Inkubationszeiten ab (Tab. 58).
Vergleichen Sie die Gärfähigkeit der beiden Hefearten und begründen Sie die
Unterschiede. Legen Sie eine zusammenfassende Tabelle aller Gruppen zu den
Versuchsergebnissen an (Tab. 59) und tragen Sie die Ergebnisse zur Gärfähigkeit als
Ergänzung in die Tabelle zur Auswertung der Versuche 7.4. ein (Tab. 47-48).
Erläutern Sie den physiologischen Vorgang der Gärung von Zuckern durch Hefe.
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10. KURSTAG
10.1. Auswertung der Versuche zur Bildung und Wirkung von
Antibiotika (Versuche 9.3.1. bis 9.3.3.)
10.2. Fortsetzung und Auswertung:
Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln
10.2.1. Fortsetzung Versuch 9.4.2. - Untersuchung von Sauergemüse
(Ausstriche der Lake)
10.2.2. Mikrobiologische Untersuchung von Milch – Abschätzung des
Keimgehalts mittels Reduktionstest
Die ursprünglich weitgehend keimfreie Kuhmilch wird beim Melken rasch von
Mikroorganismen infiziert (primäre Infektion). Diese können u. a. den Milchzucker
(Lactose) in Milchsäure umwandeln (Sauerwerden) und zum weiteren Verderb der
Milch führen.
Nur wenige Mikroorganismen überleben die für die Gewinnung von Trinkmilch
geforderte Pasteurisierung (Kurzzeiterhitzung: 72-75 °C, 30 s; oder Hocherhitzungsverfahren: 85 °C, 4 s) der Milch. Nur hitzeresistentere Mikroorganismen sind in der
Trinkmilch nachweisbar, wie Bacillus, Clostridium, Microbacterium, Enterococcus,
Streptococcus, Ascosporen und Konidien zahlreicher Schimmelpilze. Die
mikrobiologische Qualität der Trinkmilch hängt somit entscheidend von der
Reinfektion (sekundäre Infektion) nach dem Erhitzen ab (Rohrleitungen, Tanks,
Maschinenteile usw.).
Für die hygienische Beurteilung von Milch werden u. a. folgende Parameter
bestimmt:
Milchsäure bildende Bakterien (Streptokokken der serologischen Gruppe N:
S. lactis, S. cremoris; Lactobacillen);
Saprophytäre Bakterien
(Aerobe und anaerobe, hitzeresistente Sporenbildner);
Pathogene Bakterien
(Tuberkulose-Erreger Mycobacterium tuberculosis,
Galt-Erreger Streptococcus agalactiae u. a.);
Indikatorbakterien zur Anzeige von fäkalen Verunreinigungen
(z. B. coliforme Keime und E. coli).
Welche Parameter zu untersuchen sind, wird durch gesetzliche Vorschriften geregelt,
wobei genormte Methoden angewendet werden (mikrobiologische Qualitätskontrolle
nach DIN). Im Folgenden soll ein Test vorgestellt werden, der auf der Grundlage des
Nachweises reduzierender Enzyme eine Abschätzung des Bakteriengehalts von Milch
erlaubt.
68
MGP WS 2012/13
Aufgabe:
Überprüfen Sie den Keimgehalt von Milchproben mittels Reduktionstest mit 2,3,5Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC).
Sauermilch - Trinkmilch länger gelagert (alle Gruppen)
Kefirmilch - Frische Kefirmilch (alle Gruppen)
Trinkmilch (gerade Gruppen-Nr.) oder
H-Milch
(ungerade Gruppen-Nr.):
1. Frisch, kühl gelagert
2. 1 d bei Raumtemperatur gelagert
3. 1 d bei 37 °C gelagert
Objekte:
Durchführung:
Bitte die Gruppeneinteilung (5 Proben pro Gruppe plus Kontrolle) beachten.
1. 5 ml Milch werden mit 0,5 ml 1%iger TTC-Lösung (TTC-L) vermischt und bei
20 - 22 °C im diffusen Tageslicht beobachtet; Milchprobe ohne TTC als
Kontrolle mitführen (für jede zweite Gruppe bereitgestellt)
2. Zeitpunkt der Rötung der Testansätze innerhalb von etwa 3-4 Stunden feststellen,
Resultate mit den Nachbargruppen vergleichen und Ergebnisse bis zum Ende des
Kurstages in eine Gesamtauswertetabelle eintragen (Protokollvorlage Tab. 60).
Auswertung:
Bewerten Sie die Qualität der Milchproben. Bei Abgabe der Milch aus der Molkerei
soll die Rötung erst nach 108 Minuten eintreten.
Tabelle 10.2:
Korrelation des Auftretens einer sichtbaren Rotfärbung mit dem
Keimgehalt der Milch
Rötung nach Minuten
Keimzahl/ml Milch
10
20
30
60
90
120
150
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20 000 000
6 000 000
2 000 000
370 000
150 000
80 000
50 000
69
10.3
Hefen zur Lebensmittelherstellung
10.3.1. Auswertung Gärtest mit Hefen (Versuch 9.5.)
10.3.2. Vitaltest mit Bäckerhefe
Aufgabe:
Untersuchen Sie frische und thermisch behandelte Bäckerhefe (Presshefe) zur
Feststellung des Anteils von lebenden und toten Zellen (Vitaltest durch
Methylenblaufärbung).
Objekte:
Saccharomyces cerevisiae (Presshefe frisch und gealtert durch
thermische Behandlung: 1 h bei 60 °C)
Durchführung:
1. Wenig Hefe der verschiedenen Proben wird mit der Impföse, Lanzettnadel oder
Präpariernadel abgenommen und auf einem Objektträger in einem Tropfen
gepufferter Methylenblau-Lösung (MBP: 0,01 % Methylenblau in 0,67 mM
Phosphatpuffer pH 7,2) mit der Impföse gut verteilt
2. Abdecken mit einem Deckglas nach ca. 10 min Farbstoffeinwirkung und
mikroskopieren.
Auswertung:
Mikroskopieren Sie die beiden Proben und schätzen Sie in der frischen und in der
gealterten Presshefe den prozentualen Anteil an lebenden (blassblau - farblos) und
toten (blau) Zellen. Erläutern Sie das Nachweisprinzip.
In welchen Zweigen der Lebensmittelindustrie spielt das Verhältnis von lebenden und
inaktiven (toten) Hefezellen eine wichtige Rolle?
10.3.3. Ausstrichpräparat von Sauerteig
Aufgabe:
Fertigen Sie von einem Ausstrichpräparat von Sauerteig eine GRAM-Färbung an.
Objekt:
Sauerteig (käufliches Präparat) mit Zusatz von Hefe
Durchführung:
1. Entnehmen Sie eine kleine Probe des Sauerteigs zur Herstellung eines
Ausstrichpräparates (Probe gut verteilen in physiologischer NaCl-Lösung)
2. Präparat lufttrocknen, fixieren, GRAM-Färbung anwenden
3. Mikroskopie der Präparate.
Auswertung:
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Achten Sie auf die unterschiedlichen Größen und die Mengenverhältnisse der
Mikroorganismen (Hefezellen und Lactobacillen). Beachten Sie die Anwesenheit von
Stärkekörnern im Präparat. Fertigen Sie mikroskopische Zeichnungen an.
10.4. Mikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen in
Milchprodukten
Eines der ersten landwirtschaftlichen Erzeugnisse dürfte Milch gewesen sein. Da
Milch rasch von Bakterien infiziert wird, die den Milchzucker (Lactose) in
Milchsäure umwandeln und die Milch sauer werden lassen, ist anzunehmen, dass
eines der ersten Gärungsprodukte der Käse war. Unter den Nahrungsmitteln, deren
Herstellung auf der Aktivität von Mikroorganismen beruht, stehen Milchprodukte
heute umsatzmäßig an zweiter Stelle hinter alkoholischen Getränken.
Schon vor etwa einem Jahrhundert war die Kunst der Käseherstellung so hoch
entwickelt, dass man nicht länger auf die spontane Infektion der Milch durch
Bakterien angewiesen war, sondern statt dessen eine oder mehrere Arten von
Bakterien einsetzen konnte, die eigens als Starterkulturen herangezüchtet wurden.
Die Wahl solcher Starterbakterien ist einer der verschiedenen Faktoren, die zu der
reichen Vielfalt an Käsesorten beitragen. Weitere Faktoren sind beispielsweise die
während der Herstellung herrschende Temperatur und die An- oder Abwesenheit
einer zweiten Mikrobenflora auf dem Käse.
Die Vertreter einer anderen Gattung von Milchprodukten unterscheiden sich von
Käse dadurch, dass sie flüssig oder halbflüssig sind (Joghurt, saure Sahne,
Buttermilch, Kefir und Koumis, vgl. Versuch 8.6.).
Aufgabe:
Weisen Sie in Milchprodukten mikroskopisch Mikroorganismen nach.
Objekte:
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Sauermilch sowie verschiedene Käsesorten:
Sauermilchkäse (Rinde), Camembert, Roquefort
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Durchführung:
1. Herstellung von Ausstrichpräparaten aus Sauermilch
2. An die frische Schnittstelle von Camembert, Roquefort und Sauermilchkäse
(Bereich der "Gelbschmiere") Objektträger zur Probenahme andrücken und
wieder ablösen, bzw. kleine Probestücken in einem Tropfen Wasser auf dem
Objektträger gut verteilen
3. Alle Präparate trocknen lassen und fixieren
4. Färbung mit Methylenblau-Lösung nach LÖFFLER (MBL) über 4 min
5. Abspülen mit Wasser und trocknen
6. Mikroskopieren der Präparate: Vergleichen Sie bei der Mikroskopie immer direkt
mit den vorgelegten typischen Bildern aus der Einführungsdatei zum Versuch
7. Alternative für die Mikroskopie: Abklatschproben mit Tesafilm von der
Käseoberfläche nehmen und direkt bzw. mit Lactophenolblau mikroskopieren
8. Betrachten der Löcher im Roquefort und der Oberflächen der anderen Käsesorten
mit dem Stereomikroskop zur direkten Beobachtung der Penicillium-Arten.
Auswertung:
Zeichnen Sie die Mikroorganismen der verschiedenen Milchprodukte.
72
MGP WS 2012/13
Literaturverzeichnis
zur Versuchsdurchführung und weiterführenden Erläuterungen, sowie zur
Zusammensetzung und Wirkungsweise der Medien
Alexander Steve K, Strete Dennis (2006) Mikrobiologisches Grundpraktikum: Ein Farbatlas,
Pearson Education Deutschland GmbH, München, Übersetzung der 1. Auflage, Deutsche
Bearbeitung von Erika Kothe
Bast Eckhard (1999) Mikrobiologische Methoden: eine Einführung in grundlegende
Arbeitstechniken. Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin
Baumgart Jürgen (1999) Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln. 4. Aufl. Behr´s
Verlag, Hamburg, bzw. Neuauflagen bis 2009
Biotest Trockennährböden, Handbuch. Biotest AG, Dreieich
Birkenbeil Helmut (1983) Einführung in die praktische Mikrobiologie, Laborbücher Biologie,
Verlag Moritz Diesterweg, Otto Salle Verlag, Frankfurt/Main
Blaschke Renate (1983, 1990) Lehrheft zum Praktikum - Allgemeine Mikrobiologie,
Lebensmittelmikrobiologie, Wasserbakteriologie, Technische Mikrobiologie. Technische
Universität Dresden, Institut für Medizinische Mikrobiologie
Brock TD, Madigan MT, Martinko JM, Parker J (2001) Mikrobiologie. Spectrum Akademie
Verlag, Heidelberg (siehe auch 11. Auflage Brock unter Madigan & Martinko von 2006)
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Kreisel Hanns, Schauer Frieder (1987) Methoden des mykologischen Laboratoriums. Gustav
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Deutschland GmbH, München, Übersetzung der 11. Auflage Brock
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Schröder Helga (1991) Mikrobiologisches Praktikum. Volk und Wissen Verlag GmbH, Berlin
Schlegel, Hans Georg (1992) Allgemeine Mikrobiologie. 7., überarbeitete Auflage unter Mitarbeit
von Christiane Zaborosch, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (und neuere Auflagen)
Steinbüchel Alexander, Oppermann-Sanio Fred Bernd, unter Mitarbeit von Christian
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und Theorie. Springer-Verlag, Berlin. Heidelberg , New York
Süßmuth Roland, Eberspächer Jürgen, Haag Rainer, Springer Wolfgang (1999)
Mikrobiologisch-Biochemisches Praktikum. 2. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart,
New York
Weber Herbert unter Mitarbeit von Gerold Barth (1982) Zellbiologie und Genetik der Hefen.
Akademie-Verlag Berlin
Die Zusammensetzung der im Praktikum verwendeten Lösungen und Nährböden kann den oben
genannten Materialien bzw. den im Praktikumsraum ausliegenden Vorschriften entnommen
werden.
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Abkürzungen der im Praktikum benutzten festen und flüssigen Medien und Lösungen
Abkürzung(en)
Ac
Äs
BP
CA
Ct
Cl
CSM
CZ
E
GAU
GB
GCA
HA
HET
HSA
Kl
M1
Mac
MA
ME
MBL
MBP
M
MD
MG
MT
MTOO
MTTB
MO
MR-VP
MRS
MSA
MHA
NA
NAST
NB
Nit
OF-Glu / OF-L
PCA
PBS
R
SA
SACC
SIM
ST
Tg+
TTC
TTC-L
WNA
YGC
YPD
YSM
Medium / Lösung
Acetat-Agar
Äsculin-Agar (Äsculin-Galle-Agar mit Azidzusatz, SIFIN)
BAIRD-PARKER-Agar (BP-Agar)
SIMMONS-Citrate-Agar (mit Bromthymolblau)
Cetrimid-Agar
Clostridium-Agar
Citrate Sporulation Medium
CZAPEK-DOX-Agar
ENDO-Agar
GAUZE-Agar
Glucose-Bouillon (1 % Pepton, 2 % Glucose)
Glucose-Carbonat-Agar (Agarplatte oder Hochschichtagar)
Harnstoff-Agar nach CHRISTENSEN
Hefeextrakt-Trypton-Agar (Plate-Count-Agar f. Wasseruntersuchung, DIN EN ISO 6222)
Hochschicht-Agar (NA in Röhrchen)
KLIGLER-Medium (Eisen-Zweizucker-Agar nach KLIGLER)
Medium M1 (DSMZ) mit 1% Glucose
MACCONKEY-Agar
Malzextrakt-Agar (MA)
ME-Agar (5 % Malz-Agar, Difco)
Methylenblaulösung nach LÖFFLER (alkoholisch, aus Färbebatterie)
Methylenblaulösung (0,01 %) in 67 mM Phosphatpuffer (pH 7,2)
Minimalmedium-Agar ohne C-Quelle für Hefen (Minimalmedium M) als Kontrolle
Minimalmedium-Agar + Dodecan (wie M, Dodecan wird über Gasphase gefüttert)
Minimalmedium-Agar + 2 % Glucose
Minimalmedium-Agar + 0,05 % Tween 80 (Kontrolle für MTTB und MTOO)
Minimalmedium-Agar + 0,05 % Tween 80 + 1 % Olivenöl (nativ)
Minimalmedium-Agar + 0,05 % Tween 80 + 1 % Tributyrin
MOSSEL-CEREUS-Agar (MOSSEL-Agar)
Meythlrot-VOGES-PROSKAUER-Bouillon (MR-VP-Bouillon, Glucose-Pepton-Bouillon)
MRS-Agar – Lactobacillus-Agar nach DE MAN, ROGOSA und SHARPE
MSA-Agar
MUELLER-HINTON-Agar
Nähragar (NA I – SIFIN, Peptone-Caseinhydrolysat-Hefeextrakt-Agar)
Nähragar mit 1 % Stärke
Nährbouillon (Hefeextrakt-Pepton-Bouillon, SIFIN)
Nitrat-Bouillon
OF-Medium nach HUGH und LEIFSON mit Glucose / mit Lactose
Plate-Count-Agar + 1 % Magermilch
Phosphate buffered saline -Phosphatgepufferte (physiologische) Kochsalz-Lösung (0,9 %
NaCl)
Reis-Agar
SABOURAUD-2 %-Glucose-Agar
Saccharose-Agar
Sulfid-Indol-Motility-Agar (Hochschichtagar)
Stärke-Agar (Komplexmedium, das 1 % Stärke enthält)
Tergitol-7-Agar (mit Natriumheptadecylsulfat = TergitolR 7 und TTC)
TTC-Azid-Agar
TTC-Lösung 1 %
Weich-Nähr-Agar (Nährbouillon mit 0,6 % Agar)
Hefeextrakt (Yeast extract)-Glucose-Chloramphenicol-Agar
Yeast Extrakt-Pepton-Glucose (Dextrose) Flüssigmedium (YPD flüssig)
YNB-Agar + 1 % Magermilch (Skim milk) = SKM-Agar
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© 2012. Alle Rechte vorbehalten. Änderungen möglich.
Institut für Mikrobiologie, Fachrichtung Biologie, TU Dresden