Pulmonale Lymphangioleiomyomatose
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Aus dem Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller Pulmonale Lymphangioleiomyomatose -Morphologische und immunhistochemische Untersuchungen zum Konzept des „Melano-Myoperizyten“- Inaugural Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität zu Bochum vorgelegt von Katharina Preisler aus Frankfurt 2003 Zusammenfassung Preisler Katharina Pulmonale Lymphangioleiomyomatose -Morphologische und immunhistochemische Untersuchungen zum Konzept des „Melano-Myoperizyten“Die pulmonale ausschließlich Lymphangioleiomyomatose Frauen betrifft. ist eine Erkrankung, Mikroskopisch fallen die atypische glattmuskelähnliche Infiltrate auf, die im Verlauf der Erkrankung zystiforme Strukturen ausbilden. Differentialdiagnostisch sind hierbei besonders interstitielle Lungenerkrankungen mit glattmuskulären Veränderungen mit zu berücksichtigen. Es wurden 20 Fälle einer LAM sowie 56 Vergleichsfälle anderer pulmonaler Erkrankungen immunhistochemisch untersucht. Gewebeproben wurden zum mikroskopisch Teil Die aufbereiteten quantitativ, zum Teil semiquantitativ beurteilt. Dabei konnten folgende Befunde dokumentiert werden: • Alle untersuchten LAM-Proben reagierten positiv mit HMB45. • Bei MitF zeigten wiederum alle LAM-Proben eine positive Reaktion. • Alle Proben reagierten mit den Markern glattmuskuläres Aktin und Desmin positiv. • Nicht alle Proben zeigten eine Expression von Östrogen- und/oder Progesteronrezeptoren. • Die gesamte Kontrollgruppe zeigte keine positive Reaktion mit HMB45. Somit lässt sich sagen, dass die immunhistochemische Untersuchung mit HMB45 essentiell für die sichere Diagnosestellung einer LAM ist. Des weiteren wurde durch die positiven Reaktionen mit HMB45 und MitF der melanozytäre Charakter der LAM-Zellen gezeigt. Aufgrund der positiven immunhistochemischen Reaktion der LAM-Zellen sowohl mit muskulären als auch mit melanozytären Markern kann der Begriff des „Melano-Myoperizyten“ definiert werden. Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. K.-M. Müller Koreferent: Prof. Dr. med. K. Morgenroth Tag der mündlichen Prüfung: 20.01.2004 Meinen Eltern Abkürzungsverzeichnis AML Angiomyolipom APAAP Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase DIP Desquamative interstitielle Pneumonie DNA Desoxyribonukleinsäure E.v.G Elastica van Gieson EDTA Ethylen-Diamin-Tetraacetat HCl Salzsäure HE Hämatoxylin-Eosin HMB45 Human Melanoma Black 45 IgG Immunglobulin G UIP idiopathische interstitielle Lungenfibrose LAM Lymphangioleiomyomatose LCH Langerhans-Zell-Histiozytose MAR Mouse-Anti-Rabbit-Serum MitF Microphthalmia-Transkriptionsfaktor NaCl Natriumchlorid Örez Östrogenrezeptoren PEC Perivascular Epitheloid Cell ProRez Progesteronrezeptoren TS Tuberöse Sklerose Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.4.1. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 2. 1 KLINIK RADIOLOGISCHES ERSCHEINUNGSBILD MORPHOLOGIE MAKROSKOPIE MORPHOLOGIE MIKROSKOPIE PERIVASKULÄRE EPITHELOIDE ZELLEN (PECS) STADIENEINTEILUNG DER LYMPHANGIOLEIOMYOMATOSE IMMUNHISTOCHEMIE DIFFERENTIALDIAGNOSEN DIAGNOSE UND THERAPIE FRAGESTELLUNG MATERIAL UND METHODEN 1 2 4 5 6 6 6 8 10 11 12 2.1. LYMPHANGIOLEIOMYOMATOSE 2.1.1. IMMUNHISTOCHEMISCHE REAKTIONEN 2.1.1.1. HMB45 2.1.1.2. Muskuläres Aktin glatt 2.1.1.3. Desmin 2.1.1.4. Östrogenrezeptoren 2.1.1.5. Progesteronrezeptoren 2.1.1.6. Microphthalmia Transkriptionsfaktor 2.1.1.7. Tyrosinase 2.1.1.8. Melan A 2.1.2. HISTOCHEMISCHE FÄRBUNGEN 2.1.2.1. Eisen für Melanin 2.1.2.2. Eisenfärbung (Berliner-Blau-Reaktion) 2.2. WEITERE LUNGENERKRANKUNGEN 2.3. AUSWERTUNGSMETHODIK 2.3.1. AUSWERTUNGSMETHODIK DER POSITIVEN REAKTIONEN GRUPPE 1 (LAM-GRUPPE) 2.3.2. AUSWERTUNGSMETHODIK DER POSITIVEN REAKTIONEN GRUPPE 2 (KONTROLLGRUPPE) 12 12 14 14 14 15 15 15 15 15 16 16 16 16 17 17 17 3. 18 ERGEBNISSE 3.1. GRAPHISCHE DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE 3.1.1. GLATTMUSKULÄRES AKTIN – HMB45 3.1.2. GLATTMUSKULÄRES AKTIN– DESMIN 3.1.3. GLATTMUSKULÄRES AKTIN – ÖSTROGENREZEPTOREN 3.1.4. GLATTMUSKULÄRES AKTIN – PROGESTERONREZEPTOREN 3.1.5. HMB45 – MICROPHTHALMIA FAKTOR (MITF) 3.1.6. GLATTMUSKULÄRES AKTIN – MICROPHTHALMIA FAKTOR 3.1.7. TYROSINASE RAKTIONEN 3.1.8. EISEN FÜR MELANIN REAKTIONEN 3.1.9. MELAN A REAKTIONEN 3.1.10. EISENFÄRBUNG (BERLINER-BLAU-REAKTION) 3.2. HISTOPATHOLOGIE 3.2.1. BEFUNDE DES LUNGENGEWEBES BEI LAM 3.2.1.1. Befunde der HE-Färbung 3.2.1.2. Befunde der imunhistochemischen Färbung Aktin-Glatt 3.2.1.3. Befunde der imunhistochemischen Färbung Desmin 3.2.1.4. Befunde der immunhistochemischen Färbung HMB45 3.2.1.5. Befunde der imunhistochemischen Färbung MitF 3.2.1.6. Befunde der immunhistochemischen Färbung der Östrogenrezeptoren (ÖRez) und Progesteronrezeptoren (ProRez) I 18 18 20 21 23 25 26 27 27 27 28 29 29 30 32 33 34 37 40 Inhaltsverzeichnis 3.2.1.7. Befunde der Berliner Blau Färbung 3.2.1.8. Elektronenmikroskopische Befunde 3.2.2. HISTOPATHOLOGISCHE BEFUNDE ANDERER LUNGENERKRANKUNGEN (KONTROLLGRUPPE) 44 45 48 4. 51 DISKUSSION 4.1. IMMUNHISTOCHEMIE – MUSKULÄRE MARKER 4.1.1. AKTIN 4.1.2. DESMIN 4.2. IMMUNHISTOCHEMIE - MELANOZYTÄRE MARKER 4.2.1. HMB45 4.2.1.1. Zusammenhang zwischen der LAM und der Tuberösen Sklerose 4.2.1.2. TSC-Loci 4.2.1.3. HMB45 bei anderen Lungenerkrankungen 4.2.2. MICROPHTHALMIA-TRANSKRIPTIONSFAKTOR 4.2.4.1. MitF-Reaktionen bei malignen Melanomen 4.2.4.2. MitF-Reaktionen bei Lymphangioleiomyomatose 4.2.3. MELANIN 4.2.4. MELAN A 4.2.5. TYROSINASE 4.3. HORMONREZEPTORENMARKER 4.4. DIFFERENTIALDIAGNOSEN DER LAM 4.5. KONZEPT DES „MELANO-MYOPERIZYTEN“ BEI PULMONALER LAM 51 51 51 52 52 53 54 56 56 57 57 58 58 59 59 60 61 5. ZUSAMMENFASSUNG 63 6. LITERATUR 66 7. ANHANG 76 A-1: LAM-FÄLLE A-2: ALTERS- UND KRANKHEITSVERTEILUNG DER KONTROLLGRUPPE 76 84 8. DANKSAGUNG 86 9. CURRICULUM VITAE 87 II Einleitung 1. Einleitung Die pulmonale Lymphangioleiomyomatose (LAM) wurde zuerst in den dreißiger Jahren unter dem Namen „muskuläre Cirrhose“ beschrieben (von Stößel,1937; Burell und Moss, 1937). Sie ist eine Lungenerkrankung unklarer Genese, die mit der Hyperplasie atypischer, „glatter“ Muskelzellen einhergeht. Diese proliferieren vorwiegend im Lungeninterstitium, aber auch in extrapulmonalen Lymphbahnen (Ductus thoracicus), Lymphknoten und Blutgefäßen im Thorax und Abdomen (Matsumoto et al., 1999). Die Erkrankung betrifft ausschließlich Frauen im prämenopausalen Alter (Berner et al., 1997). Es wurden aber auch Fälle in der Postmenopause beschrieben (Sinclair et al., 1985; Baldi et al., 1994). Trotz der geringen Inzidenz (Viskum, 1993) ist die LAM bei interstitiellen Lungenerkrankungen, die mit zystischen Veränderungen einhergehen, vor allen Dingen bei prämenopausalen Frauen als wichtige Differentialdiagnose mitzuberücksichtigen. 1.1. Klinik Klinisch ist die Erkrankung zunächst von einer deutlich progredienten Dyspnoe mit restriktiven und/oder obstruktiven Lungenfunktionsstörungen gekennzeichnet. Hinzu können rezidivierende chylöse Pleuraergüsse kommen, die aus der Kompression und dem daraus folgenden Lymphstau der Lymphbahnen durch die Zellproliferate resultieren. Hierbei ist vor allem die Mitbeteiligung des Ductus thoracicus, in seltenen Fällen mit Ruptur, entscheidend. Neben der Kompression von Lymphgefäßen kommt es auch zur Kompression von kleineren Blutgefäßen. Daraus resultieren rezidivierende Mikroeinblutungen, die klinisch die Symptome von rezidiv auftretenden Hämoptysen (Taylor et al., 1990; Chu et al., 1999; Johnson et al., 2000) und pathologisch-anatomisch in vorgeschrittenen Phasen eine deutliche Braunfärbung des Lungengewebes (Hämosiderose) erklären. Als weiteres charakteristisches Kennzeichen sind rezidivierende Pneumothoraces zu nennen, die sowohl uni- als auch bilateral vorkommen können. 1 Einleitung Die klinischen Symptome einer pulmonalen Lymphangioleiomyomatose können während der Menstruation oder einer Schwangerschaft verstärkt werden (Capron et al., 1983; Hauck et al., 1990; Warren et al., 1993), dagegen wird aber auch über Regressionen im Verlauf einer Schwangerschaft berichtet. 1.2. Radiologisches Erscheinungsbild Zu Beginn der Erkrankung sind die Thoraxübersichtsaufnahmen zunächst unauffällig. Im weiteren Verlauf sind im Röntgenbild Merkmale der interstitiellen Lungenveränderung mit diffuser retikulärer Zeichnungsvermehrung zu erkennen. Bei einem Fortschreiten der Erkrankung ist das röntgenologische Erscheinungsbild geprägt von dem Nebeneinander der Zeichen eines Lymphabflussstaus, ähnlich der Lymphangieektasie, einer obstruktiven Komponente und interstitiellen Veränderungen. Bei weiterer Verschlechterung der Erkrankung sind im Röntgenthorax zystische Hohlräume in der gesamten Lunge zu erkennen. Diese Veränderungen manifestieren sich im Endstadium als Wabenlunge, die sich klinisch schließlich durch eine generalisierte respiratorische Insuffizienz auszeichnet (Berger und Shaff., 1981). 2 Einleitung Abb. 1 Computertomogramm mit Darstellung multipler „Blebs“ und „Bullae“ im Lungenparenchym bei einer 39 Jahre alten Patientin (e7702/00). Der computertomographische Befund wird durch das Vorliegen multipler zystenähnlicher Strukturen bestimmt. Im Frühstadium sind die blasigen Veränderungen diffus verteilt; kleinste Zystchen sind in peripherer Lage zu erkennen. Die Zystenwand wird zum Teil von sich aufteilenden Venen markiert. Findet sich im Anfangsstadium zwischen diesen Zysten noch normales Lungengewebe, so nehmen beim Fortschreiten der Erkrankung die Anzahl der Zysten zu (vgl. Abb. 1) (Kirchner et al., 1997). Gerade im frühen Stadium sind die Befunde im Computertomogramm besser zu visualisieren als in der Thoraxübersicht (Aberle et al., 1990). 3 Einleitung 1.3. Morphologie Makroskopie Morphologisch-makroskopisch lassen sich auf der gesamten Lungenoberfläche, aber auch auf der Lungenschnittfläche, dünnwandige zystische Hohlräume erkennen (vgl. Abb. 2), die sowohl mit dem radiologischen Befund korrelieren, als auch eine Erklärung für die oben erwähnten rezidivierenden Pneumothoraces liefern. Des Weiteren findet man in diesem Stadium die aus den Einblutungen ins Parenchym resultierenden bräunlichen Verfärbungen des Gewebes (Corrin et al., 1975). Abb. 2 Makroskopischer Befund einer LAM-Lunge bei einer 30 Jahre alten Patientin. Auffällig ist der komplette zystisch-wabige Lungenumbau (Autopsiefall, s45/96). 4 Einleitung 1.4. Morphologie Mikroskopie Die Proliferate „glatter“ Muskelzellen fallen morphologisch mikroskopisch unregelmäßig verteilt auf. Diese befinden sich typischerweise sowohl um kleinere Blut- und Lymphgefäße (daher auch Bezeichnung als LymphangioLeiomyomatose) als auch um Bronchiolen und Alveolarsepten (Kane et al., 1978). Auch können in der Pleura glattmuskuläre Infiltrate um Lymphgefäße gefunden werden. Bei Progredienz der Erkrankung bilden sich zunächst kleinere zystenförmige Hohlräume aus, an deren Wandungen die glattmuskulären Faserbündel zum Teil auch mehrschichtig zu finden sind. Durch Konfluenz bilden sich dann größere Hohlräume, so dass das Lungengerüst nach und nach völlig zerstört wird. Die proliferierenden Zellen sind zytologisch auffällig. Sie bestehen teils aus spindeligen, teils aus epitheloiden Zellen mit einem zum größten Teil eosinophilen Zellplasma, wobei die epitheloiden Zellen ein helleres Zellplasma aufweisen. Die Kernstruktur ist isomorph, wobei jedoch das Nucleus Cytoplasma - Verhältnis größer als bei „normalen“ glatten Muskelzellen ist (Bonetti et al., 1993). Die Zellen der LAM zeigen nicht die typischen zigarrenförmigen Kernstrukturen glatter Muskelzellen und unterscheiden sich damit bereits zytologisch von einer „reinen“ glattmuskulären Differenzierung. Im Verlauf der Erkrankung nimmt die Menge an atypischen glatten Muskelzellen zu, woraus dicke glattmuskuläre Bänder zwischen den emphysematösen Räumen resultieren. Dies führt zu der Ähnlichkeit mit Honigwaben im makroskopisch-röntgenologischen Befund. Des weiteren sind Hämosiderinablagerungen bei in der mikroskopischen Makrophagen intraalveolär Betrachtung und interstitiell nachweisbar. Diese sind Zeichen rezidivierend abgelaufener Lungenblutungen Rahmen der Grunderkrankung einer LAM. LAM-Zellen besitzen durchaus auch Charakteristika glatter Muskelzellen, wie reichlich Myofilamente, Focal Densities, Attachement Plaques, sowie Vesikel der Pinozytose. Andererseits sind aber auch untypische Strukturen, wie rauhes endoplasmatisches Retikulum, Glykogen, Mitochondrien und manchmal elektronendichte Granula, die zum Teil membrangebunden sind, zu finden (Enzinger und Weiss, 1988; Kane et al., 1978). 5 Einleitung 1.4.1. Perivaskuläre epitheloide Zellen (PECs) Bonetti et al. (1991) führten für die Tumorzellen in Angiomyolipomen und so genannten Klarzelltumoren (Sugar tumors) der Lungen den Begriff der „perivaskulären epitheloiden Zelle“ („perivascular epitheloid cell“; PEC) ein, um hiermit einen besonderen Zelltyp hervorzuheben. Dieser Zelltyp, welcher auch bei der LAM gefunden wird, koexprimiert glattmuskuläre und melanozytäre Marker. Tumoren, bei denen die oben genannten PECs nachgewiesen werden können, werden auch als so genannte PEComas bezeichnet. 1.5. Stadieneinteilung der Lymphangioleiomyomatose Aufgrund der mikroskopischen Befunde der LAM kann die Erkrankung morphologisch in drei Stadien unterschieden werden: • Frühstadium: Hier sind histologisch überwiegend perilymphangisch mit lediglich diskrete beginnender Proliferate Lymphangiektasie nachweisbar. • Intermediärstadium: In diesem Stadium entwickeln sich zunehmend Proliferate auch perivaskulär mit Gefäßobstruktion, Hämosiderose, insbesondere pleuraler Beteiligung und ersten zystiformen Hohlraumbildungen. • Spätstadium: Hier findet sich ein vorgeschrittener, auch makroskopisch erkennbarer zystisch-wabiger Lungenumbau. 1.6. Immunhistochemie Immunhistochemisch zeigen die LAM-Zellen positive Reaktionen sowohl mit muskulären als auch mit melanozytären Markern (Kuhnen et al., 2001). Die immunhistochemischen Reaktionen liefern neben den Befunden der peribronchiolär und perivaskulär gelagerten epitheloiden bis spindeligen Zellformen ein wichtiges diagnostisches Instrument. Neben einer Reaktion mit den Muskelmarkern Aktin und zum Teil auch Desmin der LAM-Zellen wurde erstmals von Bonetti et al. (1991) die Reaktivität der LAM-Zellen mit dem 6 Einleitung melanozytären Marker HMB45 beschrieben. HMB45 ist ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein 100 kd schweres prämelanosomales Glykoprotein gerichtet ist. Vorwiegend wird dieser Marker zur Diagnose des malignen Melanoms eingesetzt (Kapur et al., 1992; Matsumoto et al., 1999). Bei dem prämelanosomalen Glykoprotein (= Antigen) handelt es sich um ein onkofetales premelanosomal assoziiertes Glykoprotein, dessen Expression induzierbar und reversibel ist und möglicherweise Antwort auf einen Wachstumsfaktor ist (Smoller et al., 1991). Es wird vermutet, dass die Reaktion mit HMB45 in den elektronendichten Granula aufgrund eines kreuzreagierenden Glykoproteins stattfindet (Chan et al., 1993). HMB45 reagiert auch mit Antigenen in Junktionsnävi, fetalen und neonatalen Melanozyten, sowie pränatalen und infantilen menschlichen epithelialen Retinapigmentzellen (Kapur et al., 1992). Des weiteren sind positive Reaktionen mit dem Antikörper HMB45 auch beim Angiomyolipom (AML) zu finden (Hoon et al., 1994). Das AML kann wie auch die LAM bei der tuberösen Sklerose auftreten (TS). Die TS oder M. Bourneville-Pringle ist eine autosomal-dominant vererbte komplexe Fehlbildungserkrankung, die den Phakomatosen zugeordnet werden kann und durch eine Tendenz zur multiplen Tumorbildung gekennzeichnet ist (Müller, 1983). Die klassische Trias besteht aus mentaler Retardierung, zerebralen Krampfanfällen und einem Adenoma sebaceum. Renale AML kommen dabei in 40 Prozent der Fälle vor, wohingegen die LAM nur in 15 Prozent der Fälle und ohne eine weitere Symptomatik vorkommt. Die LAM wurde auch als „forme fruste“ der TS bezeichnet (Müller, 1983; Kuhnen et al., 1994). Die immunhistochemische Reaktion gegen HMB45, sowohl bei der LAM als auch beim AML, legt zusätzlich eine vergleichbare Histogenese nahe. Durch King et al. wurde 1999 ein weiteres melanozytäres Antigen für die morphologische Diagnostik von Melanomen beschrieben. Dabei handelt es sich um den Microphthalmia(-assoziierten) Transkriptionsfaktor (King et al., 1999; King et al., 2001). Dieser stellt ein DNA-bindendes nukleäres Protein dar, welches für die Entwicklung und das Überleben von Melanozyten, für die Pigmentierung, aber auch für die Knochenentwicklung von Bedeutung ist. 7 Einleitung 1.7. Differentialdiagnosen In der histologischen Differentialdiagnostik interstitieller Lungenerkrankungen müssen neben der LAM besonders solche Erkrankungen berücksichtigt werden, die ebenfalls mit glattmuskulärer Proliferation einhergehen. Dazu gehören die reaktiven leiomyomatösen Proliferate bei Lungenfibrose, das sogenannte benigne metastasierende Leiomyom und die native gutartige glattmuskuläre Proliferation. Es sollten aber auch Mitbeteiligungen der Lunge im Zusammenhang mit rheumatischer Grunderkrankung, die Sarkoidose, die Langerhans-Zell-Histiozytose und die Pneumokoniosen mitberücksichtigt werden. Bei vorgeschrittener Lungenfibrose sind oft Bündel glatter Muskelzellen insbesondere pleural und peribronchiolär zu beobachten („muskuläre Zirrhose Meessen“). Angrenzend befinden sich jedoch, im Gegensatz zur LAM, entzündliche Infiltrate und eine interstitielle Fibrose (Ovenfors et al., 1990). Das benigne metastasierende Leiomyom zeigt meist größere knotige pulmonale Proliferate im Vergleich zur LAM. Zytologisch finden sich Merkmale typischer glatter Muskelzellen mit zigarrenähnlich geformten Zellkernen und abgestumpften Kernpolen. Immunhistochemisch liegt zumeist eine kräftige Reaktion gegen Aktin und vor allem gegen Desmin vor (Wolff et al., 1979; Banner et al., 1981). Die native gutartige glattmuskuläre Proliferation (NPMP) der Lungen ist durch eine variable Geschlechts- und Altersverteilung mit zumeist nur milden klinischen Symptomen charakterisiert. Mikroskopisch sind viele millimetergroße Krankheitherde mit unterschiedlichen glattmuskulären Proliferationsmustern zu erkennen. Lymphknoten werden, im Gegensatz zur LAM, nicht befallen. Immunhistochemisch zeigen die Zellen der NPMP keine positive Reaktion mit Hormonrezeptorenmarkern und HMB45 (Wöckel et al., 1997). Im Rahmen von Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises kann häufig eine Mitbeteiligung von Lunge und Pleura beobachtet werden (Theile und Müller, 1994). Dabei ist die häufigste Lungenveränderung die interstitielle Alveolitis, die je nach Verlauf in eine Lungenfibrose einmünden kann (MeierSydow e al., 1977; Hunninghake et al., 1979; Turner, 1981; Voisin et al., 1991). Histomorphologisch entspricht die Fibrose 8 der Rheumalunge in der Einleitung vorgeschrittenen Phase einer unspezifischen Lungenfibrose (Theile und Müller, 1994). Die bei der Sarkoidose entstehenden Granulome sind ein charakteristisches morphologisches Bild für diese Erkrankung. Sie bestehen aus locker aneinander gelagerten Epitheloidzellen, Riesenzellen und lymphozytären Zellansammlungen am Rande (Müller, 1996). Im Rahmen der chronisch verlaufenden Erkrankung kommt es zu einer Veränderung des mikroskopischen Bildes. Als Folge von Stoffwechselprodukten der Epitheloidzellen, der Riesenzellen und der T-Lymphozyten kommt es im Bereich der Granulome zu einer Fibrosierung (Müller, 1996). Bei der Langerhans-Zell-Histiozytose (LCH) sollte vor allem die primäre (isolierte) pulmonale LCH des Adulten differentialdiagnostisch mitberücksichtigt werden. Der Krankheitsverlauf lässt sich morphologisch in drei verschiedene Entwicklungsstadien unterscheiden (v. Hamsen und Otto, 1982; Müller, 1983). • Frühstadium: Dieses ist gekennzeichnet durch zellreiche granulomatöse Infiltrate, welche CD1a- und S100-positive Histiozyten, eosinophile Leukozyten, Lymphozyten und Fibroblasten enthalten. • Intermediärstadium: Hier kommt es zu einer zunehmenden Fibrosierung der wochen- und monatealten Granulome und zu einem Rückgang des zellulären Infiltrats. • Fibrosestadium: Im Vordergrund stehen oft sternförmig entwickelte Narbenherde mit zentralen, pseudozystischen Strukturen, die aus ehemaligen Bronchiolen hervorgegangen sind (Harms und Müller, 2001). Auch die Pathogenese der Pneumokoniosen lässt sich in drei Phasen einteilen (Müller und Grewe, 1992): • In der ersten Phase kommt es zu Überlastung der Selbstreingungsmechanismen der Lunge. Diese entstehen sowohl durch eine hohe alveoläre Staubbelastung als auch durch eine Schädigung des bronchialen Flimmerepithels (Kissler, 1983). Dadurch kommt es zu einer interstitiellen Inkorporation der Staubpartikel. 9 Einleitung • Handelt es sich bei den inkorporierten Substanzen nicht um inerte Stoffe, so kommt es in der zweiten Phase zu einer mehr nodulär-granulomatösen oder einer mehr disseminierten-alveolarseptalen Fibrose. • Die letzte Phase gekennzeichnet. ist Es durch kommt vermehrt zu auftretende Komplikationen Perfusionsstörungen, pulmonaler Hypertonie, pulmonaler Arteriosklerose und zur Entwicklung eines Cor pulmonale. 1.8. Diagnose und Therapie Die Diagnose der pulmonalen Lymphangioleiomyomatose wird häufig erst durch eine offene Lungenbiopsie gestellt, meist im Zusammenhang mit der Evaluation und der Therapie eines wiederholt auftretenden Pneumothorax. Eine Diagnose der Erkrankung nur über eine kleine transbronchiale Biopsie wird mit Hilfe der immunhistochemischen HMB45 Untersuchung sicherer (Bonetti et al., 1993). Da die Erkrankung nur Zustandsverschlechterungen bei Frauen während der vorkommt Menstruation und es oder zu einer Schwangerschaft kommen kann, ist ein hormoneller Therapieansatz schon lange diskutiert und durchgeführt worden, zumal LAM-Zellen teils über Östrogen- und auch über Progesteronrezeptoren verfügen (Brentani et al., 1984). Eine Therapie der Wahl der pulmonalen Lymphangioleiomyomatose wird zurzeit nicht beschrieben. Bis dato zeigen Androgene, Steroide, Immunsuppressiva oder palliative Chirurgie keinen sicheren Therapieerfolg (Corrin et al., 1975). Die Progredienz der Erkrankung kann jedoch durch Progesterontherapie, Östrogenunterdrückung und Ovarektomie positiv beeinflusst werden (Mc Carty et al., 1980). Im letzten Stadium der Erkrankung, verbunden mit vorschreitender Lungeninsuffizienz, bleibt als Mittel der Wahl nur noch die Lungentransplantation (Wellens et al., 1985). Jedoch sichert eine Lungentransplantation nicht den Heilungserfolg. Bittmann et al. (2003) beschreiben den Fall einer Patientin, der aufgrund einer LAM eine Lunge transplantiert wurde, die aus einem männlichen Spender stammte. Die Patientin entwickelte nach Transplantation ein Rezidiv der LAM und verstarb im weiteren Verlauf. Untersuchungen zeigten, dass die Zellen der rekurrierenden LAM- 10 Einleitung Läsionen aus dem Empfängerorganismus stammten und keine Neoformation aus der Spenderlunge selbst waren ( Bittmann et al., 2003). 1.9. Fragestellung Für das eigene Untersuchungsgut ergaben sich folgende Fragestellungen: 1. Eine genaue Charakterisierung der LAM-Zellen sollte durch verschiedene immunhistochemische Reaktionen erfolgen, vor allem Antikörper gegen HMB45, Östrogen- und Progesteronrezeptoren, sowie gegen Microphthalmia-Transkriptionsfaktor. Des weiteren wurden auch Antikörper gegen glattmuskuläres Aktin, Desmin, Melan A und Tyrosinase durchgeführt. Wie sieht die Relation zwischen den verschiedenen Reaktionen aus? Wie viele LAM-Zellen muss eine kleine transbronchiale Biopsie mindestens aufweisen, um eine sichere Diagnosestellung mit Hilfe der Immunhistochemie zu erlauben? Oder ist eine offene Lungenbiopsie immer zwingend erforderlich? Gibt es im Zusammenhang mit immunhistochemische der LAM Reaktionen, bislang welche die nicht gängige Diagnose einer Lymphangioleiomyomatose sicherer und gegen die Differentialdiagnosen besser abzugrenzen vermag? 2. Die immunhistochemische Reaktion im Lungengewebe bei anderen differentialdiagnostisch wichtigen Erkrankungen soll überprüft werden. Wie hoch ist die Spezifität und Sensitivität von HMB45? Gibt es andere Strukturen im Lungengewebe, wie z. B. Zellen in Bronchien oder Gefäßen, die eine HMB45-Reaktivität aufweisen? 3. Wie kann die Zellform der LAM bezüglich der Differentierungsrichtung eingeordnet werden? Diese Fragen werden im Folgenden anhand der Untersuchungsergebnisse analysiert und in der anschließender Diskussion versucht zu beantworten. 11 Material und Methoden 2. Material und Methoden Die untersuchten Gewebeproben wurden aus zwei verschiedenen Patientengruppen entnommen. Die erste Gruppe umfasste 20 Patientinnen, die alle an der pulmonalen Lymphangioleiomyomatose erkrankt waren. Das Patientengut entstammte dem Institut für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken „Bergmannsheil“, Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum. In 19 Fällen handelte es sich um Biopsiegut (transbronchial/offene Lungenbiopsie) und in einem Fall um Autopsiegut. Das Erkrankungsalter zur Zeit der Diagnosestellung reichte von 27 bis 63 Jahren mit einem Mittelwert von 47 und einem Median von 46. In der ersten Gruppe wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: 2.1. Lymphangioleiomyomatose 2.1.1. Immunhistochemische Reaktionen Bei allen immunhistochemischen Reaktionen wurde die sogenannte APAAPMethode (Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase) (Cordell et al., 1984) mit Hilfe des Tech Mate 500 der Firma Dako, Hamburg durchgeführt: 1. 3-4 µm dicke Schnittpräparate wurden formalinfixiert und in Paraffin eingebettet. Das so eingebettete Gewebe wurde auf einen speziellen Kapillarspaltobjektträger der Firma DAKO aufgezogen und bei 37°C im Wärmeschrank über Nacht getrocknet. 2. Die Schnittpräparate wurden für 2x10 Minuten in Xylol entparaffiniert und in einer absteigenden Alkoholreihe (100%, 96%, 70%) rehydriert. Anschließend wurden sie in einer Tris-gepufferten NaCl-Lösung (TBS pH 7,2) für 5-10 Minuten gespült. 12 Material und Methoden 3. Gegebenenfalls folgte dann die Vorbehandlung in Abhängigkeit vom verwendeten Primärantikörper. Die bei dieser Untersuchung verwendeten Primärantikörper verlangten zum Teil keine Vorbehandlung oder eine EDTA-Vorbehandlung: Die Schnitte wurden in Puffer (Antigen Retrieval Buffer) mit 1 mM EDTA, pH 8,0 für 15 Minuten bei 600 Watt in einer Mikrowelle gekocht, und anschließend für weitere 10 Minuten im warmen Puffer belassen. Die Bearbeitung der Schnittpräparate erfolgte ab hier automatisch mit Hilfe des Tech Mate 500 der Firma DAKO. 4. Der Primärantikörper wurde in der jeweiligen Gebrauchsverdünnung für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antikörperverdünnung erfolgte mit Hilfe eines Diluents der Firma Zymed. Zwischen den einzelnen Inkubationen erfolgten mehrer Waschvorgänge mit Puffern. Hierzu wurden Puffer aus einem Puffer-Kit der Firma DAKO (K5006) verwendet. Sollte es sich dabei um polyklonale Primärantikörper handeln, erfolgte nach der Primärantikörperinkubation ein weiterer Schritt. Die meisten polyklonalen Antiseren werden aus Kaninchen gewonnen, so dass eine Behandlung mit einem Maus-anti-KaninchenImmunglobulin erfolgen musste. Das MAR (Mouse-Anti-Rabbit)-Serum wurde mit dem Diluent im Verhältniß 1:300 verdünnt und für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bei monoklonalen Antikörpern aus der Maus entfiel dieser Schritt. 5. Die Präparate wurden gespült und anschließend für 25 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Sekundärantikörper = Link (APAAP-Kit K5000, Firma Dako, gebrauchsfertig) inkubiert. Beim Brückenantikörper handelte es sich um Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobuline aller Isotypen. 6. Nach weiteren Spülvorgängen wurde für weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur mit einem APAAP-Komplex (APAAP-Kit K5000, Firma DAKO, gebrauchsfertig) inkubiert. Der APAAP-Komplex besteht aus monoklonalen Maus IgG1-Antikörpern, welche spezifisch an die alkalische Phosohatase aus Kälberdarmmukosa gebunden sind. 13 Material und Methoden 7. Zur Verstärkung der Reaktion wurden nach Spülvorgängen wiederholt der APAAP-Komplex für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur eingesetzt. 8. Zur Farbentwicklung wurde ebenfalls das APAAP-Kit benutzt. Das Chromogen-Substrat wurde maximal 10 Minuten vor Gebrauch aus 4 Komponenten angesetzt. Es wurde Neufuchsin eingesetzt, das ein rotes, unlösliches Präzipitat an der Stelle des gesuchten Antigens ergibt. Die Inkubationszeit betrug 4x5 Minuten, wobei zwischendurch immer wieder mit Puffer gespült wurde. Die endogene Phosphatase wurde dabei durch Zugabe von Levamisol (0,2 mmol), ebenfalls im APAAP-Kit vorhanden, geblockt. 9. Die Gegenfärbung erfolgte in Mayers-Hämatoxylin der Firma Merck für 2 Minuten, dann Bläuen in Wasser für 2 Minuten, danach TBS-Puffer für 2 Minuten. Die Präparate wurden anschließend kurz in Water Wash (Firma DAKO, Pufferkit) abgespült, bevor sie durch die aufsteigende Alkoholreihe dehydriert wurden und über Xylol mit Eukitt oder Eindeckfolie (Eindeckautomat Firma Vogel) abgedeckt wurden. 2.1.1.1. HMB45 Die Schnittpräparate wurden keiner Vorbehandlung unterzogen. Es wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: HMB45) in der Verdünnung 1:50 der Firma BioGenex (Cat.No. MN001-NC) verwendet. 2.1.1.2. Muskuläres Aktin glatt Die Schnittpräparate wurden keiner Vorbehandlung unterzogen. Es wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: 1A4) in der Verdünnung 1:60 der Firma Immunotech (Cat.No.: 1144 ) (vorverdünnt) verwendet. 2.1.1.3. Die Desmin Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: D33) in der Verdünnung 1:1000 der Firma DAKO (Cat.No. M0760) verwendet. 14 Material und Methoden 2.1.1.4. Die Östrogenrezeptoren Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: ER1D5) in der Verdünnung 1:50 der Firma Immunotech (Cat.No. 1545) verwendet. 2.1.1.5. Die Progesteronrezeptoren Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: 1A6) in der Verdünnung 1:50 der Firma Immunotech (Cat.No. 2147) verwendet. 2.1.1.6. Die Microphthalmia Transkriptionsfaktor Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone C5 und C6) in der Verdünnung 1:25 der Firma Neo Markers, Fremont, USA verwendet. 2.1.1.7. Die Tyrosinase Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: T311) in der Verdünnung 1:50 der firma Novocastra (Cat.No. NCL-TYROS) verwendet. 2.1.1.8. Die Melan A Schnittpräparate wurden einer EDTA-Vorbehandlung unterzogen. Anschließend wurde ein monoklonaler Antikörper (Clone: A103) in der Verdünnung 1:800 der Firma BioGenex (Cat.No. MU361-UC) verwendet. 15 Material und Methoden 2.1.2. Histochemische Färbungen 2.1.2.1. Eisen für Melanin Die Schnittpräparate wurden entparaffiniert und in Aqua dest. gebracht. Anschließend wurden sie für eine Stunde in 2,5-prozentige wässrige Ferrosulfatlösung gebracht und anschließend vier mal fünf Minuten in Aqua dest. ausgewaschen. Danach wurden die Schnittpräparate für 30 Minuten in Kaliumferrizyanid gebracht und in 1 prozentiger Essigsäure ausgewaschen. Die ausgewaschenen Präparate werden für 10 Minuten in Kernechtrot gegengefärbt. In aufsteigender Alkoholreihe (70%, 96%, 2x100%) wurden sie dehydriert, folgend zweimal kurz in Xylol getaucht und in Eukitt eingedeckt. 2.1.2.2. Eisenfärbung (Berliner-Blau-Reaktion) Die Schnittpräparate wurden entparaffiniert und in Aqua dest. gestellt. Anschließend wurden sie in einem Gemisch aus 2-prozentigem Kaliumhexacynoferrat 2 und 2-prozentigem HCl im Verhältniss 1:1 für 10 Minuten inkubiert. Die Präparate wurden danach mit Aqua dest. abgespült und für 10 Minuten in Kernechtrot gegengefärbt. In aufsteigender Alkoholreihe (70%, 96%, 2x100%) wurden sie dehydriert, folgend zweimal kurz in Xylol getaucht und in Eukitt eingedeckt. 2.2. Weitere Lungenerkrankungen Die zweite Patientengruppe umfasste insgesamt 56 Patientinnen und Patienten die an den Lungenerkrankungen BOOP (8-mal), DIP (11-mal), Fibrose/UIP (13mal), Histiozytosis X (3-mal), Sarkoidose (5-mal), EAA (9-mal), Zytostatikapneumopathien (3-mal), DAD (2-mal) oder Rheumalunge (2-mal) litten. Diese Patientengruppe bestand aus 32 weiblichen und 24 männlichen Patienten. Bei der zweiten Gruppe wurde nur die immunhistochemische Färbung mit HMB45 durchgeführt, wobei die bereits angewendet wurde. 16 oben beschriebene Methode Material und Methoden 2.3. Auswertungsmethodik 2.3.1. Auswertungsmethodik der positiven Reaktionen Gruppe 1 (LAM-Gruppe) Bei den HMB45-, Microphthalmia-, glattmuskuläres Aktin-, Desmin-, Östrogenrezeptoren- und Progesteronrezeptorenreaktionen wurden LAMHerde, die in den Präparaten mit den oben genannten Färbungen reproduzierbar waren, gewählt. Dafür wurden die Schnittpräparate für diese fünf Reaktionen in Serie geschnitten. Die positiven Reaktionen in den reproduzierbaren Krankheitsherden wurden in Bezug auf die Zellzahl ausgezählt und miteinander verglichen. Die anderen immunhistochemischen und histochemischen Färbungen wurde semiquantitativ nach folgenden Kriterien bewertet: 0 = keine positiven Reaktionen 1 = bis 10% positive Reaktionen 2 = >10% bis 50% positive Reaktionen 3 = mehr als 50% positive Reaktionen Die dabei entstandenen Ergebnisse wurden jeweils innerhalb der LAM-Areale betrachtet. 2.3.2. Auswertungsmethodik der positiven Reaktionen Gruppe 2 (Kontrollgruppe) Hierbei wurde lediglich eine positive/negative Immunreaktion beurteilt. 17 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Graphische Darstellung der Ergebnisse 3.1.1. Glattmuskuläres Aktin – HMB45 Mit dem Antikörper gegen glattmuskuläres Aktin reagieren, wie der Abbildung 3 zu entnehmen ist, alle LAM-Zellen positiv. Im Gegensatz dazu reagieren nicht alle LAM-Zellen, die durch die positive Reaktion gegen glattmuskuläres Aktin als solche erkannt werden, mit dem Antikörper HMB45. Die Reaktivität mit HMB45 reicht von sehr gering (vgl. Patienten-Nummer e 6064/95 und e 4845/95) bis zu annähernd der gleichen Reaktivität wie gegen glattmuskuläres Aktin (vgl. e 4270/00). Die Anzahl der mit HMB45 positiv reagierenden Zellen überschreitet nie die Anzahl der mit glattmuskulärem Aktin positiv reagierenden Zellen. Es gibt jedoch keinen LAM-Herd, bei dem keine LAM-Zelle positiv reagiert, d.h. in jedem LAM-Krankheitsherd befinden sich bei der hier untersuchten Patientengruppe zumeist einzelne HMB45 positive Zellen. Vergleich HMB45 - glattmuskuläres Aktin 800 700 Anzahl der positiven Zellen 600 500 400 300 200 100 0 w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e7247/99 e233/98 w339/99 e17396/93 e761/98 w2215/93 w19309/92 e3748/97 e10229/95 w624/00 e7438/95 w1896/94 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Patientennummer Aktinzellen Abbildung 3: Vergleich HMB45 – glattmuskuläres Aktin 18 HMB45-Zellen Ergebnisse Die prozentuale Darstellung der glattmuskulären Aktin - HMB45 Relation ist der Abbildung 4 zu entnehmen. Es wird deutlich, dass bei 60 Prozent der untersuchten Patienten nur bis zu maximal 50 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen auch auf HMB45 positiv reagieren. Bei 35 Prozent sind sogar nur maximal ein Viertel der glattmuskulären Aktin positiven Zellen auch HMB45 positiv. Im Gegensatz dazu zeigen 40 Prozent der Fälle eine über 50 prozentige Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit HMB45. Eine 76 - 100 prozentige Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit HMB45 zeigen 30 Prozent. Bei der genaueren lichtmikroskopischen Betrachtung von sehr kleinen LAM-Herden zeigt sich, dass in den untersuchten Patientenproben eine positive HMB45-Zelle erst bei einer Anzahl von 25 positiven glattmuskulären Aktin Zellen erwartet werden kann. Prozentuale Darstellung der Aktin - HMB45 Relation 30% 35% 10% 25% 0 bis 25% 26 bis 50% 51 bis 75% 76 bis 100% Abbildung 4: Prozentuale Darstellung der Aktin – HMB45 Relation 19 Ergebnisse 3.1.2. Glattmuskuläres Aktin– Desmin Bei der immunhistochemischen Reaktion mit dem Muskelmarker Desmin zeigen einige der LAM-Zellen eine positive Reaktion. Diese Reaktion ist quantitativ jedoch nicht so stark ausgeprägt wie die Reaktion mit dem Muskelmarker glattmuskuläres Aktin. Wie der Abbildung 5 zu entnehmen ist schwankt die Anzahl der positiven Zellen im Vergleich zu glattmuskulärem Aktin von sehr gering (vgl. S54/96) bis zu sehr ausgeprägt (vgl. e4270/00). Vergleich Aktin - Desmin 800 Anzahl der positiven Zellen 700 600 500 400 300 200 100 0 w339/99 e3748/97 e4845/95 w2/01 w624/00 e4270/00 e7247/99 e233/98 e761/98 e15932/94 e6064/95 w2482/01 w2215/93 e10229/95 e7438/95 w1896/94 e20945/94 s54/96 e17396/93 w19309/92 Patientennummer Aktin Desmin Abbildung 5: Vergleich Aktin – Desmin Die prozentuale Darstellung der glattmuskulären Aktin - Desmin Relation ist der Abbildung 6 zu entnehmen. Hierbei zeigt es sich, dass bei 55 Prozent der untersuchten Fälle über 50 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen auch mit Desmin eine positive Reaktion aufweisen. Bei 15 Prozent der Fälle zeigen sogar 75-100 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen eine Reaktion mit Desmin. Bei 45 Prozent der untersuchten Fälle liegt der Anteil der glattmuskulären Aktin positiven Zellen bei unter 50 Prozent, die gleichzeitig auch eine positive Desmin-Reaktion aufweisen. Immerhin zeigen 30 Prozent der Fälle eine 25-50 prozentige Reaktion der positiven glattmuskulären Aktin Zellen mit Desmin. 20 Ergebnisse Prozentuale Darstellung der Aktin - Desminrelation 15% 15% 30% 40% 0% - 25% 25% - 50% 50% - 75% 75% - 100% Abbildung 6: Prozentuale Darstellung der Aktin - Desminrelation 3.1.3. Glattmuskuläres Aktin – Östrogenrezeptoren Wie aus der Abbildung immunhistochemischen 7 zu entnehmen Reaktion mit dem ist, zeigen Antikörper bei der gegen Östrogenrezeptoren 8 von 20 untersuchten Patienten keine positive Reaktion der LAM-Zellen. Bei den Fällen mit einer positiven Reaktion der LAM-Zellen liegt diese im Vergleich mit glattmuskulärem Aktin darunter. Die Reaktivität mit dem Östrogenrezeptorenmarker im Vergleich zu der positiven glattmuskulären Aktin Reaktion ist auch hier wieder weit gestreut, und reicht von sehr gering (vgl. e4845/95) bis sehr ausgeprägt (vgl.e233/98). 21 Ergebnisse Vergleich Aktin - Östrogenrezeptoren 800 Anzahl der positiven Zellen 700 600 500 400 300 200 100 0 e233/98 w339/99 e3748/97 e10229/95 w2215/93 w1896/94 e7247/99 e761/98 w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e17396/93 w19309/92 w624/00 e7438/95 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Patientennummer Aktin Östrogen Abbildung 7: Vergleich Aktin - Östrogenrezeptoren Die prozentuale Darstellung der glattmuskulären Aktin - Östrogenrezeptoren Relation ist der Abbildung 8 zu entnehmen. Prozentuale Darstellung der Aktin - Östogenrelation 20% 10% 60% 10% 0% - 25% 25% - 50% 50% - 75% 75% - 100% Abbildung 8: Prozentuale Darstellung der Aktin - Östrogenrelation 22 Ergebnisse In der Abbildung 8 ist zu erkennen, wie bei 60 Prozent der untersuchten Patienten nur 0-25 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Antikörper gegen Östrogenrezeptoren reagieren. In 10 Prozent der Fälle zeigt sich eine 25-50-prozentige Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Östrogenrezeptorenmarker. Bei nur 30 Prozent liegt die Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Antikörper gegen Östrogenrezeptoren bei über 50 Prozent. Bei 20 Prozent der Patientenfälle zeigt sich eine positive Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen von 75-100 Prozent mit dem Antikörper gegen Östrogenrezeptoren. 3.1.4. Glattmuskuläres Aktin – Progesteronrezeptoren Bei der immunhistochemischen Reaktion mit dem Antikörper gegen Progesteronrezeptoren zeigen 12 von 20 untersuchten Patienten keine positive Reaktion. Im Vergleich zu glattmuskulärem Aktin zeigt die Progesteronrezeptorreaktivität keine Gleichmäßigkeiten und reicht von sehr gering (vgl. e15932/949) bis sehr ausgeprägt (vgl. e233/98) wie Abbildung 9 zeigt. Vergleich Aktin - Progesteronrezeptoren 800 Anzahl der positiven Zellen 700 600 500 400 300 200 100 0 e233/98 w339/99 e3748/97 w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e7247/99 e17396/93 e761/98 w2215/93 w19309/92 e10229/95 w624/00 e7438/95 w1896/94 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Patientennummer Aktin Abbildung 9: Vergleich Aktin - Progesteronrezeptoren 23 Progesteron Ergebnisse Die genaue glattmuskuläres Aktin - Progesteronrezeptoren Relation ist der Abbildung 10 zu entnehmen. Prozentuale Darstellung der Aktin - Progesteronrelation 10% 5% 85% 0% - 25% Abbildung 10: 50% - 75% Prozentuale 75% - 100% Darstellung der Aktin - Progesteronrelation Wie der Abbildung 10 zu entnehmen ist, sind bei 85 Prozent der untersuchten Patientenfälle nur 0–25 Prozent der positiven glattmuskulären Aktin Zellen auch Progesteronrezeptoren positiv. Bei den verbleibenden 15 Prozent der Patienten liegt die positive Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Antikörper gegen Progesteronrezeptoren bei über 50 Prozent. 10 Prozent zeigen eine 50-75-prozentige Reaktion der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Antikörper gegen Progesteronrezeptoren und bei 5 Prozent liegt eine 75-100-pronzentige Reaktion vor. Wie der Abbildung 11 zu entnehmen ist, sind alle Fälle, die bei der Östrogenrezeptorenreaktion negativ reagieren, auch bei der Reaktion mit dem Antikörper gegen Progesteronrezeptoren negativ. Die Anzahl der progesteronrezeptorpositiven Zellen liegt immer unter der Anzahl der östrogenrezeptorpositiven Zellen. 24 Ergebnisse Östrogen - Progesteronrezeptoren Vergleich Anzahl der positiven Zellen 250 200 150 100 50 0 e233/98 w339/99 Progesteron e3748/97 e10229/95 w2215/93 w1896/94 e7247/99 e761/98 w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e17396/93 w19309/92 w624/00 e7438/95 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Patientennummer Östrogen Abbildung 11: Östrogen – Progesteronrezeptoren Vergleich 3.1.5. HMB45 – Microphthalmia Faktor (MitF) Bei der immunhistochemischen Reaktion mit dem Antikörper gegen Microphthalmia Faktor zeigen 5 der insgesamt 20 untersuchten Patientenfälle keine positive Reaktion der LAM-Zellen (vgl. Abb. 12). Bei den Fällen mit einer positiven Reaktion der durch HMB45 markierten LAM-Zellen liegt diese im Vergleich zu der HMB45 Reaktion in den meisten Fällen darunter. Bei zwei Patientenfällen liegt die Reaktion mit MitF eindeutig über der von HMB45 (vgl. w2482/01 und w2/01). Die Reaktivität mit dem Microphthalmia Faktor im Vergleich zu der positiven HMB45 Reaktion ist auch hier wieder weit gestreut und reicht von sehr gering (vgl. e1896/94) bis sehr ausgeprägt (vgl. e339/99). 25 Vergleich HMB45 - MitF 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 HMB45-Zellen Patientennummer w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e7247/99 e233/98 w339/99 e17396/93 e761/98 w2215/93 w19309/92 e3748/97 e10229/95 w624/00 e7438/95 w1896/94 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Anzahl der positiven Zellen Ergebnisse MiTf Abbildung 12: Vergleich HMB45 - MitF 3.1.6. Glattmuskuläres Aktin – Microphthalmia Faktor Bei der immunhistochemischen Reaktion mit dem Microphthalmia Faktor zeigen 5 der insgesamt 20 untersuchten Patientenfälle keine positive Reaktion der LAM-Zellen (vgl. Abb. 13). Bei den Fällen mit einer positiven Reaktion der LAMZellen liegt diese im Vergleich zu der glattmuskulären Aktin-Reaktion darunter. Die Reaktivität mit dem Antikörper gegen Microphthalmia Faktor im Vergleich zu der positiven glattmuskulären Aktin-Reaktion ist auch hier wieder weit gestreut und reicht von sehr gering (vgl. e1896/94) bis sehr ausgeprägt (vgl. e339/99). Anzahl der positiven Zellen Vergleich Aktin - MitF 800 700 600 500 400 300 200 100 0 w2/01 w2482/01 s54/96 e4270/00 e7247/99 e233/98 26 w339/99 Abbildung 13: Vergleich Aktin – MitF e17396/93 e761/98 w2215/93 w19309/92 e3748/97 e10229/95 w624/00 e7438/95 w1896/94 e20945/94 e15932/94 e4845/95 e6064/95 Patientennummer Aktinzellen MiTf Ergebnisse Die prozentuale Darstellung der glattmuskulären Aktin – Microphthalmia Faktor Relation ist der Abbildung 14 zu entnehmen. Aktin - MitF Relation 15% 5% 55% 25% 0% - 25% 25% - 50% 50% - 75% 75% -100% Abbildung 14: Aktin – MitF Relation Bei 55 Prozent der untersuchten Patientenfälle zeigen 0-25 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen eine positive Reaktion mit dem Antikörper gegen Microphthalmia Transkriptionsfaktor. In 25 Prozent der Fälle reagieren 25-50 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit dem Microphthalmia Faktor positiv und bei 20 Prozent der Fälle reagieren über 50 Prozent der glattmuskulären Aktin positiven Zellen mit MitF positiv. 3.1.7. Tyrosinase Raktionen Alle untersuchten LAM-Fälle zeigen keine positive Tyrosinasereaktion. 3.1.8. Eisen für Melanin Reaktionen Bei allen untersuchten Proben können keine Melaninpigmente nachgewiesen werden. 3.1.9. Melan A Reaktionen Alle untersuchten LAM-Fälle zeigen keine positive Melan A Reaktion. 27 Ergebnisse 3.1.10. Eisenfärbung (Berliner-Blau-Reaktion) Die semiquantitative Auswertung der Berliner-Blau-Reaktionen mit LAM-Zellen ergibt, dass in 35 Prozent der Patientenfälle die LAM-Herde keine Reaktion zeigen (Grad 0). In 30 Prozent der Fälle zeigen bis zu 10 Prozent der LAM Herde aktivierte Alveolarmakrophagen (Grad 1). Eine 10-50-prozentige positive Reaktion aktivierter Alveolarmakrophagen zeigen 20 Prozent der Patientenfälle (Grad 2). 15 Prozent der untersuchten Fälle zeigen eine positive Reaktion von über 50 Prozent (Grad 3) (vgl. Abb. 15). Positive Eisenreaktionen 15% 35% 20% 30% Grad 0 Grad 1 Grad 2 Abbildung 15: Positive Eisenreaktionen 28 Grad 3 Ergebnisse 3.2. 3.2.1. Histopathologie Befunde des Lungengewebes bei LAM Die typischen Befunde einer LAM werden im folgenden durch histologische Bilder verdeutlicht. Es sollen die für die LAM typischen glattmuskelähnlichen Zellproliferate dargestellt werden. Diese bilden oft knötchenförmige oder sternartige Proliferate, die sich häufig sowohl um kleinere Blut- und Lymphgefäße, als auch um Bronchiolen und Alveolarsepten finden. Im Verlauf der Erkrankung nimmt die Menge an glattmuskelähnlichen LAMZellen zu, woraus dicke glattmuskelähnliche Bänder zwischen dem emphysematösen Räumen resultieren. In stärkeren Vergrößerungen ist die Abweichung der Zellkerne der LAM-Zellen im Vergleich zu regelrechten glattmuskulären Zellkernen zu erkennen. Es handelt sich nicht um zigarrenförmigen Zellkernstrukturen, wie bei regelrechten Muskelzellen, sondern die Kerne wirken eher plumper. Auffällig sind bei der mikroskopischen Betrachtung Hämosiderinablagerungen in Alveolarmakrophagen. Diese Alveolarmakrophagen intraalveolär und interstitiell nachweisbar. 29 sind vorwiegend Ergebnisse 3.2.1.1. Befunde der HE-Färbung Die HE-Färbung zeigt deutlich die bereits oben erwähnten Auffälligkeiten der Zellproliferate einer LAM, wie die Abbildungen 16 bis 18 zeigen. Abbildung 16: LAM-Herde mit glattmuskelähnlichen Zellproliferaten und Gefäßlumina mit dezenten Einblutungen bei einer 57-jährigen Frau (w2482/01, Biopsiegut). 30 Ergebnisse Abbildung 17: LAM-Herde mit glattmuskelähnlichen Zellproliferaten bei derselben Patientin wie Abbildung 16. Abbildung 18: Glattmuskelähnliche Zellproliferate und dezente alveoläre Blutungen bei derselben Patientin wie Abbildung 16. 31 Ergebnisse 3.2.1.2. Befunde der imunhistochemischen Färbung Aktin-Glatt Die LAM Zellen zeigen mit dem Antikörper gegen glattmuskuläres Aktin eine kontinuierliche positive Reaktion (vgl. Abb. 19). Die zytoplasmatische Reaktion war hierbei jedoch im Vergleich zum Beispiel zur Reaktion in glatten Muskelzellen von Gefäßwänden schwächer ausgeprägt (vgl. Abb.20). Diese immunhistochemische Färbung verdeutlicht den muskulären Charakter der LAM-Zellen. Abbildung 19A: Aktindarstellung der LAM-Areale bei einer 57-jährigen Frau (w2482/01, Biopsiegut) und Abbildung 19B: Aktindarstellung der LAM-Areale einer 33-jährigen Frau (w761/98, Biopsiegut), diesmal in einer stärkeren Vergrößerung. Abbildung 20: Positive Reaktion der LAM-Herde auf glattmuskuläres Aktin bei einer 47-jährigen Frau (w2215/93, Biopsiegut). Übersicht- und Ausschnittvergrößerung von LAM-Herde mit Darstellung der Gefäßwände und knospenförmigen LAM-Proliferationsherden. Färbung braun dargestellten Siderophagen. 32 Anreicherung der in dieser Ergebnisse 3.2.1.3. Befunde der imunhistochemischen Färbung Desmin Die zytoplasmatische Reaktion mit Desmin lag quantitativ unter der Reaktion mit dem Antikörper gegen glattmuskuläres Aktin, war zum Teil jedoch auch sehr kräftig ausgeprägt und unterstreicht wie glattmuskuläres Aktin den muskulären Charakter der LAM-Zellen. Abbildung 21: Stark positive zytoplasmatische Desmin-Reaktion der LAM-Herde bei einer 33-jährigen Frau (w761/98, Biopsiegut). Abbildung 22: Stark positive zytoplasmatische Desmin-Reaktion der LAM-Herde bei einer 60-jährigen Frau (w2482/01, Biopsiegut). 33 Ergebnisse Abbildung 23: Im Vergleich zu Abbildung 22 zeigen sich etwas schwächere zytoplasmatische Desmin-Reaktionen bei einer 47-jährigen Frau (w2215/93, Biopsiegut). 3.2.1.4. Befunde der immunhistochemischen Färbung HMB45 Die zytoplasmatische Reaktion gegen HMB45 fiel zum großen Teil sehr dezent aus (vgl. Abb. 24). Sie zeigt den melanozytären Charakter der LAM-Zellen. Abbildung 24: Mikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerungen einer sehr schwachen zytoplasmatischen HMB45-Reaktion eines LAM-Areals bei einer 37-jährigen Frau (w2/01, offene Lungenbiopsie). 34 Ergebnisse Abbildung 25: Mikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerungen einer sehr schwachen zytoplasmatischen HMB45-Reaktion eines LAM-Areals bei einer 60-jährigen Frau (w2482/01, Biopsiegut). Abbildung 26: Mikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerungen einer stärkeren zytoplasmatischen HMB45-Reaktion einer LAM-Region bei einer 30jährigen Frau (s54/96, Autopsiefall). Weiterhin zu erkennen pigmentspeichernde Makrophagen. 35 Ergebnisse Abbildung 27: Mikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerung einer positiven zytoplasmatischen HMB45-Reaktion eines LAM-Areals bei einer 47jährigen Frau (2215/93, Biopsiegut). Die Reaktion fällt schwächer als mit glattmuskulärem Aktin aus (vgl. dazu Abbildung 20). Auch sind, wie in Abbildung 26 pigmentspeichernde Makrophagen zu erkennen. 36 Ergebnisse 3.2.1.5. Befunde der imunhistochemischen Färbung MitF MitF ist in höherem Maße als HMB45 mit nukleärer Reaktion in den Zellen der LAM zu belegen. Zudem sind neben Zellen der LAM auch Alveolarepithelien, meist angrenzend an verbreitertes Interstitium, sowie vor allem Alveolarmakrophagen nukleär positiv markiert. Trotz der unspezifischeren Reaktion der LAM-Zellen gegen MitF im Vergleich zu HMB45, unterstreicht sie noch einmal den melanozytären Charakter der Zellen. Abbildung 28: Übersicht- und Ausschnittsvergrößerungen einer deutlichen positiven nukleären Reaktion des LAM-Herdes. Im Vergleich dazu fällt die positive HMB45-Reaktion wesentlich schwächer aus (vgl. dazu Abbildung 24) (w2482/01, Biopsiegut). 37 Ergebnisse Abbildung 29: Stark positive nukleäre Reaktion des LAM-Areals mit MitF bei einer 52-jährigen Frau (w399/99, Biopsiegut). Nahezu alle LAM-Zellen weisen eine positive Reaktion mit MitF auf. Abbildung 30: Stark positive nukleäre Reaktion des LAM-Areals mit MitF bei einer 37-jährigen Frau (w2/01, offene Lungenbiopsie). Die Reaktion mit HMB45 fällt bei der gleichen Patientin sehr schwach aus (vgl. dazu Abbildung 24). 38 Ergebnisse Abbildung 31: Schwache MitF Reaktion des LAM-Herdes und dezente alveoläre Blutungen bei einer 47-jährigen Patientin (w2215/93, Biopsiegut). Deutlich zu erkennen sind die pigmentspeichernden Makrophagen. Die Befunde, die sowohl den muskulären als auch den melanozytären Charakter der LAM-Zellen gezeigt haben, nehmen einen besonderen Stellenwert in der Diagnose der LAM ein. Besonders der immunhistochemischen Reaktion gegen HMB45 kommt dabei eine wichtige Rolle zu. Den Reaktionen gegen Östrogen- und Progesteronrezeptoren kommt weniger eine diagnostische Stellung zu, als vielmehr der Ansatz für Therapiekonzepte. 39 Ergebnisse 3.2.1.6. Befunde der immunhistochemischen Färbung der Östrogenrezeptoren (ÖRez) und Progesteronrezeptoren (ProRez) Abbildung 32: Schwach positive nukleäre Reaktion des LAM-Areals mit ÖRez so wie braun pigmentierte Alveolarmakrophagen mit Siderinspeicherungen als Zeichen von abgelaufenen Mikroblutungen bei einer 47-jährigen Patientin (w2215/93, Biopsiegut). Abbildung 33: Kaum erkennbare positive nukleäre Reaktion der LAM-Zellen mit ProRez bei einer 47-jährigen Patientin (2215/93, Biopsiegut). Im Vergleich dazu fällt die Reaktion mit ÖRez deutlich stärker aus (vgl. Abbildung 32). 40 Ergebnisse Abbildung 34: Stark positive nukleäre Reaktion der LAM-Region mit ÖRez bei einer 52-jährigen Frau (w399/99, Biopsiegut). Abbildung 35: Schwache positive Reaktion mit ProRez bei einer 52-jährigen Patientin (w399/99, Biopsiegut). Auch in diesem Fall ist die Reaktion mit ÖRez deutlich ausgeprägter (vgl. Abbildung 34). 41 Ergebnisse Abbildung 36: Stark positive nukleäre Reaktion der LAM-Region mit ÖRez bei einer 60-jährigen Frau (w2482/01, Biopsiegut). Abbildung 37: Schwächere positive Reaktion des LAM-Areals mit ÖRez als in Abbildung 36 und Abbildung 34 bei einer 33-jährigen Patientin (w761/98, Biopsiegut). 42 Ergebnisse Abbildung 38: Keine positive Reaktion mit ProRez bei einer 33-jährigen Frau (w761/98, Biopsiegut). Im Gegensatz dazu ist die positive Reaktion mit ÖRez deutlich zu erkennen (vgl. Abbildung 37). Die pulmonale Lymphangioleiomyomatose zeichnet sich neben den oben genannten Befunden auch durch mehr oder weniger stark ausgeprägte Einblutungen ins Lungengewebe aus. Zeichen dieser rezidivierenden Mikroblutungen können durch eine so genannte Berliner Blau Reaktion dargestellt werden, die in diesem Fall die Siderinspeicherung in den Alveolarmakrophagen markiert. Abbildung 39 zeigt einen eindrucksvollen Befund einer solchen Einblutung. 43 Ergebnisse 3.2.1.7. Befunde der Berliner Blau Färbung Abbildung 39: Massive Hämosiderinspeicherung in zahlreichen Alveolarmakrophagen, aber auch im peribronchialen Interstitium als Zeichen rezidivierend abgelaufener Grunderkrankung einer LAM Lungenblutungen bei einer Biopsiegut). 44 im 47-jährigen Rahmen Frau der (2215/93, Ergebnisse 3.2.1.8. Elektronenmikroskopische Befunde Zusätzlich zu den immunhistochemischen Reaktionen lassen sich die Besonderheiten der LAM-Zellen im elektronenmikroskopischen Bild darstellen. Dabei lässt sich sowohl der muskuläre (vgl. Abb. 40) als auch der melanozytäre Charakter der Zellen erkennen. Der melanoztäre Charakter stellt sich als lysosomale Speicherstruktur mit Melanin-ähnlichen Substanzen dar (vgl. Abb. 41). Bei den Zellen der LAM handelt es sich letztlich um eine Art „Hybridzelle“ aus Muskelzelle und Melanozyt. Die positive Reaktion mit melanozytären Markern, wie HMB45 und MitF setzt eine Melaninsynthese voraus, wie sie in Abbildung 42 schematisch dargestellt wird. Die Melanisierung der Melanosomen findet jedoch nicht vollständig statt, da kein Melanin nachgewiesen werden konnte. Abb. 40: Rasterelektronenmikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerung von proliferierenden glattmuskelähnlichen LAM-Zellen bei einer 30 jährigen Patientin (Autopsiefall, s45/96) Bilder mit von P. Herter, Max-Planck-Institut, Dortmund 45 Ergebnisse Abb. 41: Transelektronenmikroskopische Übersicht- und Ausschnittvergrößerung der melanozytären Differenzierungsrichtung der LAMZellen bei einer 30 jährigen Patientin (Autopsiefall, s45/96). Zu erkennen sind lysosomale Speicherstrukturen mit Melanin-ähnlichen Substanzen. Bilder von P. Herter, Max-Planck-Institut, Dortmund Abb. 42: Schematische Darstellung eines Melanocyten mit Melanosomen in verschiedenen Entwicklungsstadien. (aus Löffler, Petriedes; Physiologische Chemie, 1988) 46 Ergebnisse Die Befunde von 20 gesicherten Fällen einer LAM sollen mit anderen Krankheitsbildern der Lunge, bei denen ebenfalls glattmuskuläre Proliferate in variabler Ausprägung mehr oder weniger charakteristisch sind, verglichen werden. Bei den folgenden hier mikroskopisch dargestellten Krankheitsbildern handelt es sich um die Langerhans-Zell-Histiozytose und Rheumalunge, sowie Beispiele von Lungenfibrosen. Bei der Langerhans-Zell-Histiozytose (LCH) ist ausschließlich die primäre pulmonale LCH des Adulten berücksichtigt worden. Das Frühstadium ist durch eine zellreiches granulomatöses Infiltrat gekennzeichnet (vgl. Abbildung 41). Sie ist im Spätstadium durch eine vermehrte Fibrosierung gekennzeichnet aus denen sich mehr und mehr sternförmigen Narbenherde entwickeln. Die Mitbeteiligung der Lunge bei einer rheumatischen Grunderkrankung entspricht in vorgeschrittener Phase einer unspezifischen Lungenfibrose. Bei vorgeschrittener Lungenfibrose sind oft Bündel glatter Muskelzellen insbesondere pleural und peribronchiolär zu beobachten. Angrenzend finden sich oft, im Gegensatz zur LAM, entzündliche Infiltrate. Die Untersuchung von differentialdiagnostisch wichtigen Lungenerkrankungen mit HMB45 soll die Spezifität des diagnostisch wichtigen Antikörpers untersuchen, um die Reaktion bei glattmuskulären Proliferaten, bzw. anderer Zellstrukturen, differentialdiagnostischer Lungenerkrankungen ausschließen zu können. 47 Ergebnisse 3.2.2. Histopathologische Befunde anderer Lungenerkrankungen (Kontrollgruppe) Abbildung 43: Zopfartige alveoläre Fibroblastenproliferate im Lungengewebe bei einer an BOOP erkrankten 67-jährigen Frau (e22941/99). Keine positive Reaktion mit dem HMB45-Antikörper. Abbildung 44: Buntes Infiltratmuster aus Langerhans-Zellen, eosinophilen Leukozyten und Lymphozyten in HE-Färbung bei einem 39-jährigen Mann (e22043/99). Keine positive Reaktion mit dem HMB45-Antikörper. 48 Ergebnisse Abbildung 45: Langerhanszell-Histiozytose bei einem 40-jährigen Mann (e7617/99). Fokale glattmuskuläre Areale am Rande eines Granuloms . Keine positive Reaktion mit demHMB45-Antikörper. Abbildung 46: Bild der Rheumalunge mit Cholesterinkristallen bei einer 65jährigen Frau (e16651/99). Die HMB45 Färbung weist keine positiven Reaktionen auf. 49 Ergebnisse Abbildung 47: Glattmuskuläre Proliferationsareale in Umbauzonen einer vorgeschrittenen idiopathischen interstitiellen Lungenfibrose (UIP) bei einer 67jährigen Frau (e17303/99). Keine positiven Reaktionen in der HMB45-Färbung. Abbildung 48: Gleiches Präparat wie in Abb. 45 in E.v.G-Färbung zur Verdeutlichung der fibrösen Fasern und glattmuskulärer Metaplasieareale. 50 Diskussion 4. Diskussion 4.1. Immunhistochemie – Muskuläre Marker Bei der Lymphangioleiomyomatose handelt es sich um eine Erkrankung, die mit der Proliferation „atypischer“ glattmuskelähnlicher Zellen einhergeht. Diese proliferierenden Zellen unterscheiden sich jedoch morpholgisch-mikroskopisch von regelrechten glatten Muskelzellen: die Zellen sind zum Teil spindelförmig, zum Teil epitheloid. Sie zeigen bei der stärkeren Vergrößerung ein eosinophiles Zytoplasma, wobei die mehr epitheloiden Zellformen ein oft vakuoläres auch helleres Zytoplasma aufweisen. Auch der Zellkern ist im Vergleich zu regelrechten glatten Muskelzellen eher rund und hell und nicht länglich und dunkel (Chan et al., 1993). Es finden sich keine für glatte Muskelzellen typischen Zigarrenkerne. Das Nukleus – Zytoplasmaverhältnis ist größer als bei regelrechten glatten Muskelzellen (Bonetti et al., 1993). Die Kerne sind relativ isomorph, ohne auffallende Atypien, so dass sich ein insgesamt blandes Erscheinungsbild ergibt. 4.1.1. Aktin Die immunhistochemische Untersuchung mit dem Antikörper gegen glattmuskuläres Aktin ergab eine vollständige positive Reaktion aller LAMZellen. Damit konnte der muskuläre Charakter der LAM-Zellen belegt werden. Aktin kommt in glatten Muskelzellen vor. Es ist der Hauptbestandteil der cytoplasmatischen Plaque (Peyrol et al., 1992; Battaglione et al., 1998). 4.1.2. Desmin Auch die Reaktion mit dem Muskelmarker Desmin fiel in allen untersuchten Fällen positiv aus. Jedoch lag die Anzahl der positiv reagierenden Zellen unter der mit glattmuskulärem Aktin positiv reagierenden Zellen (Peyrol et al., 1992). 51 Diskussion Somit ergibt sich, dass LAM-Zellen, wie von Peyroll et al. 1992 und von Battaglione 1998 beschrieben, mit den Antikörpern gegen glattmuskuläres Aktin und Desmin positiv reagieren, wobei aber nicht das zytologische Bild typischer glatter Muskelzellen und ebenso wenig typischer Myofibrobalsten vorliegt. Somit handelt es sich um eine „neue“ Zellform. Diese Zellform, die auch bei Tumorzellen des Angiomyolipoms und den so genannten Klarzelltumoren („Sugar tumor“) vorkommt, wurde von Bonetti et al. 1992 mit dem Begriff der „perivaskulären epitheloiden Zelle“ („perivascular epitheloid cell“, PEC) benannt (Bonetti et al., 1992). Damit soll ein besonderer Zelltyp mit Expression von glattmuskulären und melanozytären Markern hervorgehoben werden, der letztlich eine Art „Hybridzelle“ aus Muskelzelle und Melanozyt entspricht (vgl. Abb. 40). Tumoren, bei denen die oben genannten PECs nachgewiesen werden können, werden auch als so genannte PEComas bezeichnet. Zu diesen PEComas gehören das Angiomyolipom, der Klarzelltumor der Lunge, des Pankreas und Uterus und die Lymphangioleiomyomatose. Alle diese PEComas, mit Ausnahme der Pankreas- und Uterustumoren, sollen eine Assoziation zur tuberösen Sklerose zeigen (Folpe et al., 2000). Diese Tumoren sind charakterisiert durch morphologisch atypische Muskelzellen mit epitheloidem bzw. spindelförmigem Erscheinungsbild und der Koexpression glattmuskulärer und melanozytärer Marker. 4.2. Immunhistochemie - Melanozytäre Marker 4.2.1. HMB45 HMB45 ist ein melanozytärer Marker, der zuerst von Bonetti at al., 1991 im Zusammenhang mit der Lymphangioleiomyomatose genannt wurde. Alle hier untersuchten LAM-Fälle zeigten eine positive Reaktion mit HMB45. Somit wurde der melanozytäre Charakter der LAM-Zellen unterstrichen. Die Reaktionen fielen zum Teil jedoch sehr schwach aus, so dass eine positive HMB45 LAM-Zelle erst bei einer Anzahl von 25 positiven glattmuskulären Aktin LAM-Zellen erwartet werden konnte. Ursprünglich wurde dieser Marker als monoklonaler Antikörper gegen menschliche Melanomzellen entwickelt. Er erkennt ein 100 kD schweres 52 Diskussion Glykoprotein (gp100) in Prämelanosomen und unreifen Melanosomen. Die Bindungsstelle des Antikörpers ist sowohl bei malignen Melanomzellen als auch bei Zellen der Lymphangioleiomyomatose in cytoplasmatischen Granula lokalisiert. Diese ähneln unreifen Melanosomen (Matsumoto et al., 1999). Die Expression dieses onkofetalen Glykoproteins erfolgt regulär in fetalen Melanozyten, sowie dann erneut in neoplastischen Melanozyten. Aber auch nicht melanozytäre Tumoren bzw. tumorartige Läsionen wie das Rhabdomyom, das epitheloide Angiosarcom, sowie vor allem das Angiomyolipom und die Lymphangioleiomyomatose reagieren positiv mit HMB45. 4.2.1.1. Zusammenhang zwischen der LAM und der Tuberösen Sklerose Ein Erklärungsansatz für die positive Reaktion glattmuskelähnlicher LAM-Zellen mit dem melanozytären Marker HMB45 kann in der Assoziation der Lymphangioleiomyomatose mit der tuberösen Sklerose (TS) gefunden werden. Untersuchungen ergaben, dass bei bis zu 26 Prozent der Patientinnen mit einer TS eine LAM diagnostiziert werden konnte (Costello et al., 2000). Bei der tuberösen Sklerose handelt es sich um ein zu den Phakomatosen gehörendes Fehlbildungssyndrom, welches mit einer Häufigkeit von 1:20.000 bis 1:40.000 vorkommen kann. Zu den Symptomen gehört die klassische Trias aus Adenoma sebaceum, Epilepsie und progressiver geistiger Behinderung. Weitere Symptome können unter anderem das Auftreten von multiplen Angiofibromen, Hypopigmentierungen der Haut sowie Hamartomen des Herzens (Rhabdomyom), der Niere, Leber und Lunge sein. Die Lungenbeteiligung tritt erst im Erwachsenenalter und nur bei Frauen auf. Dabei ist dann die Expression der oben erwähnten Symptomatik sehr gering oder gar nicht vorhanden. Dominante Symptome sind dann hier, wie bei der LAM, progressive Dyspnoe in Verbindung mit rezidivierenden Pneumothoraces und chylösen Pleuraergüssen. Histologisch zeigt sich ein identisches Bild zur LAM. Es kommt zur Proliferation atypischer glattmuskelähnlicher Zellen, aus denen sich dann zystische Defekte bis hin zum völligen honigwabenartigen Umbau des Lungengewebes entwickeln. Die atypischen glatten Muskelzellen der TS reagieren wie bei der LAM mit dem monoklonalen Antikörper HMB45. 53 Diskussion Aufgrund dieser engen Assoziation wird die LAM auch als eine „forme fruste“ der tuberösen Sklerose betrachtet (Müller, 1983; Kuhnen et al., 1994). 4.2.1.2. TSC-Loci In Familienuntersuchungen konnten drei Genloci mit Bedeutung für die Pathogenese der tuberösen Sklerose nachgewiesen werden (TSC-Loci). Diese TSC-Loci sind in der Nähe von Genregionen dreier Enzyme lokalisiert, die ihrerseits an der Melaninsynthese beteiligt sind (Kimura et al., 1997; Lacronique et al., 1999). Es konnten auch somatische Mutationen des TSC²-Gens bei den Zellen der sporadischen LAM nachgewiesen werden (Carsillo et al., 2000). Durch Verbindung mit den TSC-Loci werden Störungen der Enzymwege in der Melaninbildung (Phenylalanindhydroxylase, Tyrosinase, Dopaminhydroxylase) in der Pathogenese der tuberösen Sklerose diskutiert. Bei der isolierten LAM als „forme fruste“ der tuberösen Sklerose könnten ebenso Veränderungen dieser Enzymwege eine pathogenetische Bedeutung erlangen, die sich dann auch „phänotypisch“ nachweisen ließen: Daraufhin sind mögliche Veränderungen im (Enzym)-Weg der Melaninsynthese bei der Erklärung der HMB45 Positivität der LAM-Zellen zu diskutieren. Diese Veränderungen könnten zu einer Induktion von prämelanosomenähnlicher Vesikel führen, die intrazellulär, ultrastrukturell darstellbar sind (Enzinger et al., 1988) (vgl. Abb. 41 und 49). 54 Diskussion Die Bindungsstelle des Antikörpers HMB45 in den LAM-Zellen findet, wie übrigens auch bei Melanomzellen, in cytoplasmatischen Granula statt, die unreifen Melanosomen/Prämelanosomen ähneln. Die positive Reaktion mit dem Antikörper HMB45 in LAM-Zellen stellt somit keine unspezifische Reaktion dar (vgl. Abb.49). Abb. 49: HMB45-Positivität bei Lymphangioleiomyomatose (nach PD Dr. C. Kuhnen) Die Untersuchung mit dem Antikörper HMB45 stellt eine ganz entscheidende Untersuchung, gerade auch bei kleinen transbronchialen Biopsien, beim Krankheitsbild der LAM dar (Bonetti et al., 1993). Diese Reaktion kann besonders in frühen Stadien der Erkrankung oft nur schwach intrazytoplasmatisch ausfallen, wie die eigenen Ergebnisse zeigten. In der Literatur werden verspätete Diagnosestellungen von bis zu 44 Monaten beschrieben (Berner et al., 1997). Die zum Teil nur ganz dezent ausfallende Reaktion muss bei der Auswertung der immunhistochemischen Ergebnisse unbedingt mitberücksichtigt werden. So konnten in den hier untersuchten LAMFällen in der Mehrzahl (56 Prozent) eine HMB45-Reaktivität von maximal 50 55 Diskussion Prozent der LAM-Zellen nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass zum größten Teil nur die Hälfte der LAM-Zellen mit dem Antikörper HMB45 reagierten. Das Ergebnis unterscheidet sich von Befunden anderer PECome. So ist in klarzelligen, myomelanozytären abdominellen Tumoren eine starke HMB45-Reaktivität von mehr als 50 Prozent der Tumorzellen gefunden worden (Folpe et al., 2000; Zavala-Pompa, 2001). 4.2.1.3. HMB45 bei anderen Lungenerkrankungen In sämtlichen Fällen anderer hier untersuchten Lungenerkrankungen (wie z.B. Fibrose, Sarkoidose) konnten keine HMB45-positiven Zellformen beobachtet werden. Auch waren in regelrechten Strukturen des Lungenparenchyms (z.B. Pulmonalarterien, Venen, Bronchialstrukturen, Pleura) keine HMB45 positiven möglichen Vorläuferzellen der LAM zu beobachten. Damit besitzt der Antikörper HMB45 in der Diagnose der pulmonale LAM eine 100-prozentige Sensitivität und Spezifität. 4.2.2. Microphthalmia-Transkriptionsfaktor Ein weiterer hier untersuchter melanozytärer Marker war der MicrophthalmiaTranskriptionsfaktor (MitF). Er stellt ein nukleäres Protein dar, welches eine große Bedeutung für die Entwicklung und den Bestand von Melanozyten hat (King et al., 2001). Es konnten bereits vier Isoformen identifiziert werden. MitF ist neben den melanozytär differenzierten Zellen auch in Mastzellen, Osteoklasten sowie in Pigmentzellen der Retina von Bedeutung (Hallson et al., 2000). Mäuse mit Mutationen des MitF-Genlocus bilden eine weiße Fellfarbe, kleine Augen (daher die Bezeichnung: „Microphthalmia“), eine Osteopetrose und defekte Mastzellen aus (Shibahara et al., 1999). Beim Menschen führt eine solche Mutation zum Waardenburg-Syndrom 2a. Dieses Syndrom geht mit Taubheit und Hypopigmentierung einher (Hallsson et al., 2000). Die eigenen Untersuchungen konnten erstmals an einem größeren Kollektiv von LAM-Fällen eine nukleäre Immunreaktivität gegen MitF in LAM-Zellen belegen. 56 Diskussion 4.2.4.1. MitF-Reaktionen bei malignen Melanomen MitF ist bei malignen Melanomen als hoch spezifisch und hoch sensitiv einzuordnen, wie in einer Untersuchung an 76 Melanomen gezeigt wurde. So konnte eine 100-prozentige nukleäre Reaktivität von MitF belegt werden (King et al., 2001). Koch et al. postulierte 2001 eine initiale Untersuchung mit dem MitF bei desmoplastischen Melanomen, da die Ergebnisse deutlicher waren als bei HMB45. Da in den Untersuchungen alle HMB45 positiven Tumorzellen auch MitF positiv waren, diskutierten diese Autoren eine Regulation des gp100/pmel-17-Proteins durch den Microphthalmia-Transkriptionsfaktor. 4.2.4.2. MitF-Reaktionen bei Lymphangioleiomyomatose Aufgrund des partiell melanozytären Charakters der LAM-Zellen und den Ergebnissen mit Hilfe der MitF-Diagnostik bei Melanomen lag die Vermutung nahe, mit einem Antikörper gegen MitF eine hohe spezifische und sensitive Diagnostik der LAM zu erreichen. Die hier vorgestellten Befunde bei der Lymphangioleiomyomatose ließen eine solche Interpretation jedoch nicht zu. Es ließen zwar zum Teil mehr Zellen eine positive immunhistochemische Reaktion mit MitF als mit HMB45 erkennen, was jedoch an der schlechteren Spezifität lag. Somit ist der Nachweis von MitF bei der Lymphangioleiomyomatose zwar als weiterer Hinweis einer melanozytären Differenzierung der LAM-Zellen zu sehen, jedoch nicht als Verbesserungsmöglichkeit der Diagnosestellung einer LAM. Zusammenfassend war der Antikörper HMB45 in der Diagnosestellung der LAM hochsensitiv und hochspezifisch. Hingegen weist MitF eine deutlich geringere Spezifität und auch Sensitivität (zusätzliche Markierung von Alveolarmakrophagen und Alveolarepithelien) bei dieser Erkrankung auf. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass der hier verwendete Antikörper gegen MitF die melanozytäre und nichtmelanozytäre Isoform detektiert. 57 Diskussion 4.2.3. Melanin Es gelang nicht histochemisch Melanin in den LAM-Arealen nachzuweisen. Melanin ist ein Pigment, mit der sich die Haut wirkungsvoll vor den schädlichen Folgen der Ultraviolettbestrahlung schützen kann. Ort der Melaninsynthese sind die Melanozyten, dendritische Zellen, welche zwischen den Basalzellen der Epidermis liegen. Ausgangsstoff der Melaninsynthese ist die Aminosäure Tyrosin (Hydroxyphenylalanin), die mittels des kupferhaltigen Enzyms Tyrosinase über Dopa (Dihydroxyphenylalanin) zu Dopachinon oxidiert wird. Entsprechend der Melaninbildung lassen sich bei den Melanozyten vier äquivalente Stadien differenzieren (vgl. Abb. 42) 1. Als Stadium I werden die aus dem Golgi-Apparat entstehenden, tyrosinasehaltigen Vesikel (Golgi-Bläschen) bezeichnet, die zunehmend melanisiert werden. 2. Im Stadium II sind die Melanosomen oval und enthalten Melanofilamente (Prämelanosom). 3. Im Stadium III nimmt der Melaningehalt soweit zu (Melanosom), so dass 4. In Stadium IV die Eumelaningranula entstehen. Da bei den hier durchgeführten Untersuchungen kein Melanin nachgewiesen werden konnte, ist eine unvollständige Melaninsynthese anzunehmen. 4.2.4. Melan A Auch die Untersuchung mit Melan A ergab keine positiven Reaktion der LAMZellen. Melan A (= Mart-1: „melanoma antigen recognized by T cells”) ist ein Antikörper gegen ein transmembrales Protein, welches nur in Melanozyten der Haut, Retinazellen und beim malignen Melanom vorkommt. Fetch et al. beschreiben 1998, im Gegensatz zu den hier gezeigten Ergebnissen, durchaus positive Reaktionen. So reagierten in seiner Untersuchung 1 von insgesamt 4 untersuchten LAM-Patientinnen mit Melan A positiv. 58 Diskussion 4.2.5. Tyrosinase Die immunhistochemische Reaktion gegen Tyrosinase fiel, wie auch bei Melan A, vollständig negativ aus. Tyrosinase ist ein für die Melaninsynthese essentielles Enzym. Aufgrund der negativen Reaktionen mit den oben genannten melanozytären Markern Melan A und Tyrosinase ist generell anzunehmen, dass in den Zellen der LAM eine atypische bzw. unvollständige („unreife“) Melanogenese stattfinden muß, zumal kein Melanin in den LAM- Zellen nachgewiesen werden konnte. 4.3. Hormonrezeptorenmarker Die Zellen der Lymphangioleiomyomatose reagierten zum Teil positiv mit Antikörpern gegen Östrogenrezeptoren und Progesteronrezeptoren (Graham et al., 1984; Brentani et al., 1984; Snen et al. 1987; Brentani et al., 1984; Viskum, 1993). Die hier vorliegend Ergebnisse zeigten, dass 7 von 20 untersuchten Fällen keine positive Reaktion für Östrogenrezeptoren und 10 von 20 untersuchten Fällen keine positive Reaktion für Progesteronrezeptoren zeigten. Somit ist diese immunhistochemische Untersuchung im Hinblick auf die Diagnosestellung einer LAM irrelevant. Sie kann jedoch einen therapeutischen Ansatz unterstützen: Durch die positive Reaktion mit oben erwähnten Hormonrezeptoren kann auf eine Krankheitsbeeinflussung durch Hormontherapie geschlossen werden. Auch das Auftreten der Erkrankung nur bei Frauen und zwar weitestgehend in der Prämenopause und die Verschlechterung oder Verbesserung der Erkrankung während einer Schwangerschaft (Kitzsteiner et al., 1980; Hughes et al., 1987), sowie der blandere Verlauf bei Frauen in der Postmenopause (Baldi et al., 1994), lässt auf eine hormonelle Beeinflussung schließen. Die Behandlungsstrategien reichen von Oophorektomie, Lupron- oder Progesterongaben bzw. antiöstrogener Medikation; in schweren Fällen wird eine Lungentransplantation in Erwägung gezogen (Welte, 1997; Urban et al., 1999; Shibahara et al., 2000). Die oben genannten Therapieansätze geben jedoch keine Garantie auf Heilung der Erkrankung, sondern führen in den meisten Fällen höchstens zu einer 59 Diskussion Stagnation bzw. langsameren Progredienz. Auch eine Lungentransplantation führt nicht zur Ausheilung, wie das Beispiel eines Rezidivs einer Lymphangioleiomyomatose nach Lungentransplantation in einer männlichen Spenderlunge mit Nachweis eines Spenderursprungs zeigte (Bittmann et al., 1997). Neuere Untersuchungen ergaben, dass die Zellen der rekurrierenden LAM-Läsionen in der Transplantatlunge aus dem Empfängerorganismus stammten und keine Neoformation der Transplantatlunge selbst waren (Bittmann et al., 2003). 4.4. Differentialdiagnosen der LAM In der histologischen Differentialdiagnose glattmuskulärer Proliferate müssen neben der LAM reaktive leiomyomatöse Proliferate bei Lungenfibrosen, ferner das so genannte benigne metastasierende Leiomyom sowie die native gutartige glattmuskuläre Proliferation der Lunge (Wöckel et al., 1997) berücksichtigt werden. Auch der Formenkreis der Rheumalunge, sowie die Sarkoidose, die Langerhanszellhistiozytose und der Formenkreis der Pneumokoniosen sollten erwähnt werden. Neben der morphologisch-mikroskopischen und der klinischen Unterscheidung ist besonders die seit 1991 bekannte immunhistochemische Reaktion mit dem melanozytären Antikörper HMB45 bei der Lymphangioleiomyomatose essentiell für eine frühzeitige Diagnose (Bonetti et al., 1991). Alle in dieser Studie untersuchten differentialdiagnostisch wichtigen Erkrankungen zeigten ausnahmslos keine positive Reaktion gegen HMB45. Es kann somit gesagt werden, dass bei einer negativen ausgeschlossen werden kann. 60 Reaktion mit HMB45 eine LAM Diskussion 4.5. Konzept des „Melano-Myoperizyten“ bei pulmonaler LAM Die pulmonale Lymphangioleiomyomatose, die nur Frauen, zumeist prämenopausal, betrifft, ist durch das Auftreten eines bestimmten Zelltypus charakterisiert, welcher auch bei anderen sogenannten „PEComen“ auftritt. Bei diesem Zelltyp handelt es sich um perivaskuläre Zellen („Myoperizyten“), die oft ein epitheloides Zellbild besitzen, betont perivaskulär verteilt sind und Aktin sowie HMB45 positiv sind, wie die hier vorgestellten Ergebnisse zeigten. Offensichtlich führen bestimmte genetische Defekte in der Gruppe der „PECome“ zur Aktivierung wahrscheinlich eines Genclusters, welches entscheidend für die melanozytäre Differenzierung der LAM-Zellen ist. Aufgrund der positiven immunhistochemischen Reaktionen der LAM-Zellen sowohl mit muskulären als auch mit melanozytären Markern kann der Begriff des „Melano-Myoperizyt“ definiert werden. Somit könnte die pulmonale Lymphangioleiomyomatose als eine hamartomatöse interstitielle Lungenerkrankung mit Differenzierungsmerkmalen perivaskulärer glatter Muskelzellen (Myoperizyten) und partiell melanozytären Merkmalen definiert werden. Im differentialdiagnostischen Bild interstitieller Lungenerkrankungen müssen insbesondere die Erkrankungen mit einer glattmuskulären Komponente mitberücksichtigt werden. Da die LAM-Zellen nicht nur muskuläre Marker exprimieren, sondern auch melanozytäre Antigene exprimieren („MelanoMyoperizyt“), ist die immunhistochemische Untersuchung mit dem melanozytären Marker HMB45 entscheidend. Die zum Teil sehr dezente Reaktion der LAM-Zellen mit HMB45 sollte in einer transbronchialen Biopsie berücksichtigt werden. HMB45 ist zur Darstellung pulmonaler LAM-Areale hochspezifisch und hochsensitiv (100 Prozent), wobei, wie oben bereits erwähnt und in dieser Studie belegt, nur diskrete, jedoch spezifische Markierungen einzelner Zellen, vorliegen können. 61 Diskussion Der immunhistochemische Nachweis des hier erstmals beim Krankheitsbild der LAM untersuchten nukleär lokalisierten Microphthalmia-Transkriptionsfaktors (MitF) zeigte eine deutlich geringere Sensitivität und besonders eine geringere Spezifität. Somit zeigte MitF keine Verbesserung in der histopathologischen Diagnostik der LAM. Diese Faktor belegt jedoch zusätzlich die neben der glattmuskulären Differenzierung vorhandene Differentierungsrichtung in den Zellen der LAM. 62 melanozytäre Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Die pulmonale Lymphangioleiomyomatose (LAM) ist ein seltenes Krankheitsbild, welches ausschließlich Frauen, zumeist im gebärfähigen Alter, betrifft. Die Erkrankung fällt unter den interstitiell akzentuierten Lungenerkrankungen durch glattmuskelähnliche Zellproliferate auf und ist durch einen zystiform fibrösen Umbau im fortgeschrittenen Stadium charakterisiert. Klinisch ist die Erkrankung zunächst von einer deutlich progressiven Dyspnoe mit restriktiven und/oder obstruktiven Lungenfunktionsstörungen gekennzeichnet. Hinzu können rezidivierende chylöse Pleuraergüsse kommen, die aus der Kompression und dem daraus folgenden Lymphstau der Lymphbahnen durch die Zellproliferate resultieren. Hierbei ist vor allem die Mitbeteiligung des Ductus thoracicus mit seltener Ruptur entscheidend. Radiologisch finden sich interstitielle Lungenveränderungen mit zystischen Hohlräumen. Diese Veränderungen manifestieren sich im Endstadium als Wabenlunge, die sich klinisch schließlich durch eine generalisierte respiratorische Insuffizienz auszeichnet. Korrelierend zum radiologischen Erscheinungsbild finden sich makroskopische zystische Hohlräume. Des weiteren ist im fortgeschrittenen Stadium die aus Einblutungen ins Parenchym resultierenden bräunlichen Verfärbungen des Lungengewebes zu erkennen. Die proliferierenden Zellen sind in ihrer mikroskopischen Morphologie „auffällig“. Sie bestehen teils aus spindeligen, teils aus epitheloiden Zellen mit einem zum größten Teil eosinophilen Zellplasma, wobei die epitheloiden Zellen ein helleres Zellplasma aufweisen. Die Kernstruktur ist isomorph, wobei jedoch das Nucleus – Cytoplasma – Verhältnis größer als bei regelrechten glatten Muskelzellen ist. Die Zellen der LAM zeigen nicht die typische zigarrenförmigen Zellkerne glatter Muskelzellen und unterscheiden sich damit schon zytologisch von einer „rein“ glattmuskulären Differenzierung. Bei der Zellform der LAM handelt es sich um so genannte perivaskuläre epitheloide Zellen (PEC), die immunhistochemisch sowohl gegen melanozytäre als auch gegen muskuläre Marker reagieren. Tumoren, bei denen die oben genannten PECs nachgewiesen werden können, werden auch als so genannte PEComas bezeichnet. Zu diesen PEComas gehören das Angiomyolipom, der 63 Zusammenfassung Klarzelltumor der Lunge, des Pankreas und des Uterus, und die LAM. Alle diese PEComas, mit Ausnahme der Pankreas- und Uterustumoren, sollen eine Assoziation zur tuberösen Sklerose zeigen. Diese Tumoren sind charakterisiert durch morphologisch atypische Muskelzellen mit epitheloidem bzw. spindelförmigem Erscheinungsbild und der Koeexpression glattmuskulärer und melanozytärer Marker. Es wurden 20 Fälle einer LAM untersucht. An Serienschnitten wurden immunhistochemische Untersuchungen mit Antikörpern gegen glattmuskuläres Aktin, Desmin, Microphthalmia-Transkriptionsfaktor (MitF), Tyrosinase, Melan A, Östrogen-, Progesteronrezeptoren sowie mit dem Antikörper HMB45 durchgeführt. Histochemisch wurden Eisen- (Berliner-Blau-Reaktion) sowie Melaninablagerungen analysiert. Die aufbereiteten Gewebeproben wurden mikroskopisch zum Teil quantitativ, zum Teil semiquantitativ bewertet Des weiteren wurden 56 Vergleichsfälle anderer Lungenerkrankungen mit dem Antikörper HMB45 untersucht und auf mögliche positive Reaktionsfälle analysiert. Folgende Befunde konnten dokumentiert werden: • Alle untersuchten Proben der LAM-Gruppe reagierten positiv mit HMB45. Zum Teil waren diese Reaktionen sehr dezent, so dass eine positive HMB45 Zelle erst bei einer Anzahl von 25 positiven glattmuskulären Aktin Zellen erwartet werden kann. • Alle untersuchten Proben der LAM-Gruppe reagierten mit MitF positiv. Jedoch wies MitF eine deutlich schlechtere Spezifität als HMB45 auf. Neben den Zellen der LAM waren auch Alveolarepithelien, meist angrenzend an verbreitertes Interstitium sowie vor allem Alveolarmakrophagen nukleär positiv markiert. • Nicht alle LAM-Proben zeigten eine Expression von Östrogen- und/oder Progesteronrezeptoren. • Die gesamte Kontrollgruppe zeigte keine positiven Reaktionen gegen HMB45. 64 Zusammenfassung Aufgrund der positiven immunhistochemischen Reaktionen der LAM-Zellen sowohl mit muskulären als auch mit melanozytären Markern kann der Begriff des „Melano-Myoperizyten“ definiert werden. Somit kann die pulmonale Lymphangioleiomyomatose Lungenerkrankung mit als eine hamartomatöse Differenzierungsmerkmalen interstitielle perivaskulärer glatter Muskelzellen (Myoperizyten) und partiell melanozytären Merkmalen definiert werden. Im differentialdiagnostischen Bild interstitieller Lungenerkrankungen müssen insbesondere die Erkrankungen mit einer glattmuskulären Komponente mitberücksichtigt werden. Bei der Diagnosestellung einer LAM ist die Untersuchung mit dem melanozytären Marker HMB45 entscheidend. Die zum Teil sehr dezente Reaktion der LAM-Zellen mit HMB45 sollte in einer transbronchialen Biopsie berücksichtigt werden. HMB45 ist zur Darstellung pulmonaler LAM-Areale hochspezifisch und hochsensitiv (100 Prozent), wobei nur diskrete, jedoch spezifische Markierungen einzelner Zellen vorliegen können. 65 Literatur 6. Literatur 1. Aberle DR, Hamsell DM, Bown K, Tashkin DP Lymphangiomyomatosis: CT, chest radiography and functional Correlation. Radiology 1990; 176:381-387. 2. Baldi S, Papotti M, Valente ML, Rapellino M, Scapaticci E, Corrin B Pulmonary lymphangiomyomatosis in postmenopausal Women. Eur Respir Rev 1994; 7: 1013 – 1016. 3. Banner A, Carrington C, Emory WB, Kittle F, Leonard G, Ringus J, Taylor P, Addington WM Efficacy of oophorectomie in lymphangiomyomatosis and benign metastasising leiomyoma. N Engl J Med 1981; 305: 204-209. 4. 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Anhang A-1: LAM-Fälle Tabelle 1: Aktinpositive-, HMB45positive Zellen Nummer Aktinzellen HMB45- Kategorie Zellen e6064/95 66 2 0% bis 25% e4845/95 47 2 0% bis 25% e15932/94 127 17 0% bis 25% e20945/94 183 28 0% bis 25% w1896/94 311 48 0% bis 25% e7438/95 206 59 25% bis 50% w624/00 145 53 25% bis 50% e10229/95 140 57 25% bis 50% e3748/97 53 22 25% bis 50% w19309/92 761 325 25% bis 50% w2215/93 174 93 50% bis 75% e761/98 289 190 50% bis 75% e17396/93 150 114 75% bis 100% w339/99 206 160 75% bis 100% e233/98 128 100 75% bis 100% e7247/99 159 125 75% bis 100% e4270/00 36 30 75% bis 100% s54/96 450 389 75% bis 100% w2482/01 111 2 0% bis 25% 54 5 0% bis 25% w2/01 76 Anhang Tabelle 2: Aktin-, Desminpositive Zellen Nummer Aktin Desmin Kategorie w19309/92 761 30 0% - 25% e17396/93 150 23 0% - 25% s54/96 450 14 0% - 25% e20945/94 183 82 25% - 50% w1896/94 311 103 25% - 50% e7438/95 206 65 25% - 50% e10229/95 140 57 25% - 50% w2215/93 174 68 25% - 50% w2482/01 111 48 25% - 50% e6064/95 66 45 50% - 75% e15932/94 127 72 50% - 75% e761/98 289 184 50% - 75% e233/98 128 78 50% - 75% e7247/99 159 102 50% - 75% e4270/00 36 27 50% - 75% w624/00 145 87 50% - 75% w2/01 54 30 50% - 75% e4845/95 47 37 75% - 100% e3748/97 53 42 75% - 100% w339/99 206 189 75% - 100% 77 Anhang Tabelle 3: Aktin-, Östrogenrezeptorpositive Zellen Nummer Aktin Östrogen Kategorie e6064/95 66 0 0% - 25% e4845/95 47 3 0% - 25% e15932/94 127 27 0% - 25% e20945/94 183 0 0% - 25% e7438/95 206 0 0% - 25% w624/00 145 0 0% - 25% w19309/92 761 101 0% - 25% e17396/93 150 0 0% - 25% e4270/00 36 0 0% - 25% s54/96 450 0 0% - 25% w2482/01 111 0 0% - 25% 54 13 0% - 25% e761/98 289 136 25% - 50% e7247/99 159 62 25% - 50% w1896/94 311 223 50% - 75% w2215/93 174 120 50% - 75% e10229/95 140 118 75% - 100% e3748/97 53 44 75% - 100% w339/99 206 175 75% - 100% e233/98 128 127 75% - 100% w2/01 78 Anhang Tabelle 4: Aktin-, Progesteronrezeptorpositive Zellen Nummer Aktin Progesteron Kategorie e6064/95 66 0 0% - 25% e4845/95 47 0 0% - 25% e15932/94 127 12 0% - 25% e20945/94 183 0 0% - 25% w1896/94 311 59 0% - 25% e7438/95 206 0 0% - 25% w624/00 145 0 0% - 25% e10229/95 140 23 0% - 25% w19309/92 761 0 0% - 25% w2215/93 174 25 0% - 25% e761/98 289 73 0% - 25% e17396/93 150 0 0% - 25% e7247/99 159 0 0% - 25% e4270/00 36 0 0% - 25% s54/96 450 0 0% - 25% w2482/01 111 0 0% - 25% w2/01 54 0 0% - 25% e3748/97 53 38 50% - 75% w339/99 206 143 50% - 75% e233/98 128 125 75% - 100% 79 Anhang Tabelle 5: Progesteronrezeptor-, Östrogenrezeptorvergleich Nummer Progesteron Östrogen e6064/95 0 0 e4845/95 0 3 e15932/94 12 27 e20945/94 0 e7438/95 0 0 w624/00 0 0 w19309/92 0 101 e17396/93 0 0 e4270/00 0 0 s54/96 0 0 w2482/01 0 0 w2/01 0 13 e761/98 73 136 e7247/99 0 62 w1896/94 59 223 w2215/93 25 120 e10229/95 23 118 e3748/97 38 44 w339/99 143 175 e233/98 125 127 80 Anhang Tabelle 6: HMB45-, MitF-positive Zellen Nummer HMB45- MitF Kategorie Zellen e6064/95 2 0 0% - 25% e4845/95 2 0 0% - 25% e15932/94 17 15 75% - 100% e20945/94 28 20 50% - 75% w1896/94 48 10 0% - 25% e7438/95 59 43 50% - 75% w624/00 53 37 50% - 75% e10229/95 57 30 50% - 75% e3748/97 22 20 75% - 100% w19309/92 325 83 25% - 50% w2215/93 93 50 50% - 75% e761/98 190 103 50% - 75% e17396/93 114 65 50% - 75% w339/99 160 145 75% - 100% e233/98 100 0 0% - 25% e7247/99 125 87 50% - 75% e4270/00 30 0 0% - 25% 389 0 0% - 25% s54/96 w2482/01 1 90 50% - 75% w2/01 5 27 75% - 100% 81 Anhang Tabelle 7: Aktin-, MitF-positive Zellen Nummer Aktinzellen MitF Kategorie e6064/95 66 0 0% - 25% e4845/95 47 0 0% - 25% e15932/94 127 15 0% - 25% e20945/94 183 20 0% - 25% w1896/94 311 10 0% - 25% e7438/95 206 43 0% - 25% w624/00 145 37 25% - 50% e10229/95 140 30 0% - 25% e3748/97 53 20 25% - 50% w19309/92 761 83 0% - 25% w2215/93 174 50 25% - 50% e761/98 289 103 25% - 50% e17396/93 150 65 25% - 50% w339/99 206 145 50% - 75% e233/98 128 0 0% - 25% e7247/99 159 87 50% - 75% e4270/00 36 0 0% - 25% s54/96 450 0 0% - 25% w2482/01 111 90 75% -100% 54 27 50% - 75% w2/01 82 Anhang Tabelle 8: Tabelle Eisenpositive Reaktionen (Berliner-Blau-Färbung) Graduierun Nummer g e7438/95 0 e10229/95 0 e3748/97 0 w19309/92 0 e761/98 0 w2482/01 0 w2/01 0 e6064/95 1 e4845/95 1 e20945/94 1 w624/00 1 e7247/99 1 e4270/00 1 e15932/94 2 w1896/94 2 e17396/93 2 e233/98 2 w2215/93 3 w339/99 3 s54/96 3 83 Anhang A-2: Alters- und Krankheitsverteilung der Kontrollgruppe Tabelle 9: Nummer Erkrankung Alter Geschlecht e11548/99 BOOP 66 weiblich e21284/99 BOOP 62 männlich e22939/99 BOOP 63 weiblich e22941/99 BOOP 67 weiblich e23895/99 BOOP 58 weiblich e7312/99 BOOP 36 weiblich e8732/99 BOOP 76 männlich e8956/99 BOOP 31 weiblich e18133/99 Zytostatikap 73 männlich e18799/99 Zytostatikap 54 weiblich e9231/99 Zytostatikap 62 männlich e12460/99 DAD 63 männlich e5030/99 DAD 52 männlich e12454/99 DIP 61 männlich e19414/99 DIP 63 männlich e20291/99 DIP 41 weiblich e20352/99 DIP 44 weiblich e21048/99 DIP 36 männlich e21612/99 DIP 55 männlich e22064/99 DIP 68 weiblich e22270/99 DIP 57 weiblich e6799/99 DIP 71 männlich e9102/99 DIP 41 männlich e9238/99 DIP 56 weiblich e22043/99 HistiozytoseX 39 männlich w833/99 HistiozytoseX 32 weiblich e5088/00 HistiozytoseX 45 weiblich e16651/99 Rheumalunge 65 weiblich e22273/99 Rheumalunge 59 männlich e20717/99 Fibrose, IUP 79 weiblich e10382/99 Fibrose, IUP 62 männlich e8825/99 Fibrose, IUP 44 weiblich e21050/99 Fibrose, IUP 65 weiblich w2782/99 Fibrose, IUP 60 männlich e17303/99 Fibrose, IUP 67 weiblich 84 Anhang e17459/99 Fibrose, IUP 66 männlich e19412/99 Fibrose, IUP 62 männlich e8395/99 Fibrose, IUP 64 männlich e13032/99 Fibrose, IUP 58 weiblich e8728/99 Fibrose, IUP 68 männlich e16237/99 Fibrose, IUP 67 weiblich w509/00 Fibrose, IUP 55 männlich w2289/99 EAA 61 weiblich e23369/99 EAA 48 männlich e25045/99 EAA 63 männlich e7101/99 EAA 30 weiblich e7476/99 EAA 63 weiblich e7560/99 EAA 13 weiblich e7617/99 EAA 41 männlich e7806/99 EAA 33 weiblich e25054/99 EAA 63 männlich e10787/99 Sarkoidose 44 weiblich e11149/99 Sarkoidose 59 weiblich e22275/99 Sarkoidose 43 männlich w2289/99 Sarkoidose 61 weiblich e23369/99 Sarkoidose 48 männlich 85 Danksagung 8. Herrn Danksagung Prof. Müller, Direktor des Institutes für Pathologie an den Berufgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil in Bochum gilt besonderer Dank für seine großzügige Unterstützung, die diese Arbeit erst möglich gemacht hat, sowie für die kritische Diskussion bei der Abfassung der Arbeit. Herrn PD Kuhnen danke ich für die Bereitschaft zur Betreuung des Themas sowie die kritische Diskussion und die Hilfe bei der Durchführung und Organisation der Untersuchungen. Den Mitarbeiterinnen des Instituts für Pathologie an den Berufgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil in Bochum, die mich bei der Durchführung der Arbeit fachlich beratend unterstützt haben, gilt besonderer Dank. Frau Schaub-Kuhnen, Frau Kochem und Frau Müller danke ich für die Durchführung der Immunhistochemie und Histochemie, sowie für die ständige Bereitschaft Probleme zu lösen. Frau Troske danke ich für die Hilfestellung beim Formatieren der Arbeit. Herrn Dr. P. Herter, Max-Planck-Institut Dortmund, danke ich für die elektronenmikroskopischen Bilder der LAM-Zellen. Meinen Eltern gilt besonderer Dank für den mentalen Rückhalt und für ihre Fähigkeit mich auch in „schlechten Zeiten“ motivieren zu können. Meinem Freund Jan Ising danke ich für technischen Hilfsmittel, sowie für seine kreative Hilfe bei der Umsetzung der Arbeit. 86 Curriculum Vitae 9. Curriculum Vitae Persönliche Daten Katharina Preisler Geb. am 10. November 1974 In Frankfurt am Main Schulausbildung Liborigrundschule in Dortmund von 1981 bis 1985 Stadtgymnasium in Dortmund von 1985 bis 1994 Abitur am Stadtgymnasium in Dortmund im Juni 1994 Studium Studium der Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde an der Universität Witten/Herdecke von 1994 bis 1999 Abschluss des Studiums mit dem Staatsexamen im Dezember 1999 mit der Note „sehr gut“ Famulaturen Klinikum rechts der Isar, Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Prof. Dr. Horch, September 1997 Organisation und Teilnahme am A.R.T.-Projekt der Universität Witten/Herdecke Aufenthalte im Rahmen des A.R.T.-Projektes in Gambia Februar 1998 und September 1998 University of Stellenbosch, Dept. of Maxillo-, Facial- and Oral Surgery, April bis Juni 2000 Klinische Erfahrung Mitarbeit im zahnärztlichen Notdienst der Universitätszahnklinik Witten/Herdecke November 1997 bis Mai 1999 Seit Anfang Januar 2000 in allgemeinzahnärztlichen Praxen als Zahnärztin mit Schwerpunkten Parodontologie und Prothetik 87
