Einfluss von chronischer Hyperinsulinämie und Alter auf die tau
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Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. W. Krone Einfluss von chronischer Hyperinsulinämie und Alter auf die tau-Phosphorylierung in vivo Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Katrin Becker aus Waldbröl Promoviert am 06. Juli 2011 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatterin/ Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. W. Krone 2. Berichterstatterin/ Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. W. F. Haupt Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 15. März 2011 Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. med. M. Schubert und Frau Dr. med. S. Freude von mir selbst ausgeführt worden. Danksagung Verschiedene Personen haben zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen, bei denen ich mich an dieser Stelle ganz herzlich bedanken möchte: Mein Dank geht an erster Stelle an meinen Doktorvater Herrn Universitätsprofessor Dr. med. W. Krone für die Bereitstellung meines Themas und insbesondere dafür, dass er mich unterstützt hat, obwohl ich leider nie Internistin werden wollte. Mein ganz besonderer Dank gilt den Betreuern meiner Doktorarbeit, Frau Dr. med. Susanna Freude und Herrn Privatdozent Dr. med. Markus Schubert. Ihnen war von der ersten Stunde an kein Weg zu weit und keine Erläuterung noch so komplexer Fragestellungen zuviel. Beide haben mir sowohl bei der Datenerhebung und Datenauswertung als auch beim späteren Niederschreiben zu jeder Zeit geduldig mit Rat und Tat zur Seite gestanden. Ein weiterer besonderer Dank gilt Uschi Leeser, die über die gesamte Zeit der Laborarbeit mein „mobiler Windschatten“ war. Bedanken möchte ich mich von Herzen bei Harald. Durch Deine unerschöpfliche Geduld, Deine tatkräftige Unterstützung und Deine Motivationsgabe ist diese Arbeit heute fertig geworden. Danke. Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir diese Ausbildung ermöglicht und jederzeit und in jeder Hinsicht hinter mir gestanden haben. Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis/Einheiten 1 Einleitung 1.1 1.2 1.3 Diabetes mellitus 2 1.1.1 Definition 2 1.1.2 Epidemiologie des Diabetes mellitus Typ 2 2 1.1.3 Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 3 1.1.3.1 Die Signaltransduktionskaskade des Insulinrezeptors 4 1.1.3.2 Der PI3-Kinase-Weg 5 1.1.3.3 Der MAP-Kinasen-Weg 6 1.1.4 Klinik des Diabetes mellitus Typ 2 8 1.1.5 Screening und Diagnostik des Diabetes mellitus Typ 2 8 1.1.6 Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 9 1.1.7 Prognose des Diabetes mellitus Typ 2 9 Morbus Alzheimer 10 1.2.1 Definition 10 1.2.2 Epidemiologie des M. Alzheimer 10 1.2.3 Pathogenese des M. Alzheimer 11 1.2.4 Klinik des M. Alzheimer 12 1.2.5 Diagnostik des M. Alzheimer 12 1.2.6 Therapie des M. Alzheimer 13 1.2.7 Prognose des M. Alzheimer 13 Assoziation von Diabetes mellitus Typ 2 und M. Alzheimer 13 1.3.1 Klinische Studienlage 13 1.3.2 Zerebrales Insulin und seine Wirkung 14 1.3.3 Experimentelle Studienlage 15 1.3.4 Das tau-Protein 15 1.3.4.1 Physiologische Funktion 15 1.3.4.2 tau-Pathologie 16 1.3.5 1.4 1 tau-Phosphorylierung und der Einfluss der IR-Signaltransduktion 16 1.3.5.1 Proteinkinase B und Glykogen-synthase-kinase-3β 17 1.3.5.2 Die MAP-Kinasen ERK-1/-2 und JNK/SAPK 17 1.3.5.3 Cyclin-dependent-kinase-5 18 1.3.5.4 Proteinphosphatasen 18 1.3.5.5 Protein-Tyrosin-Phosphatase-1B 19 Zielsetzung der Arbeit 21 2 Material und Methoden 2.1 2.2 Material Chemikalien 23 2.1.2 Lösungen 25 2.1.3 Antikörper 28 2.1.4 Geräte/Verbrauchsmaterialien 29 Methoden Versuchstiere 30 30 2.2.1.1 Tierhaltung 30 2.2.1.2 Tiermodell 30 2.2.1.3 Narkotisierung der Tiere 30 2.2.2 Metabolische Charakterisierung 31 2.2.2.1 Glukose-Toleranz-Test (GTT) 31 2.2.2.2 Insulin-Toleranz-Test (ITT) 31 2.2.3 Insulinstimulation 31 2.2.4 Gewinnung von Hirngewebe 32 2.2.5 Herstellung von Gesamtproteinextrakten 32 2.2.5.1 Bestimmung der Proteinkonzentration in Gehirnlysaten nach Bradford 2.2.6 Western Blot 32 33 2.2.6.1 Auftrennung der Proteine mitels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 34 2.2.6.2 Semi-dry-blotting 35 2.2.6.3 Ponceau S-Färbung 35 2.2.6.4 Detektion 36 2.2.7 ELISA 3 Ergebnisse 37 38 Einfluss akuter Hyperinsulinämie auf die zerebrale tau-Phosphorylierung 12 Monate alter Wildtyp-Mäuse 3.2 23 2.1.1 2.2.1 3.1 22 39 Einfluss einer chronischen Hyperinsulinämie auf den Metabolismus und die zerebrale tau-Phosphorylierung fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse 3.2.1 42 Metabolische Charakterisierung fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 8 und 12-16 Wochen 43 3.2.1.1 Gewichtsverlauf 43 3.2.1.2 Verlauf der Seruminsulinkonzentration 45 3.2.1.3 Insulin- und Glukosetoleranztestung, Nüchternblutglukosespiegel 46 3.2.2 Analyse der Insulinrezeptor-Signaltransduktion in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen 47 3.2.2.1 Proteine des PI3-Kinasen-Wegs - pAKT/AKT & pGSK-3β/GSK-3β 48 3.2.2.2 Proteine des MAP-Kinasen-Wegs - pERK/ERK & pJNK/JNK 50 3.2.2.3 PTP1B, PP2A und CDK-5 3.2.3 Epitop-spezifische tau-Phosphorylierung in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen 55 Ser199/Thr231/Ser396 57 3.2.3.2 tau Analyse der IR-Signaltransduktion in Gehirnlysaten fettreich ernährter WildtypMäuse im Alter von 12-16 Wochen nach akuter Insulinstimulation 59 3.2.4.1 Expression des Insulinrezeptors 60 3.2.4.2 Der PI3-Kinasen-Weg - pAKT/AKT & pGSK-3β/GSK-3β 61 3.2.4.3 Der MAP-Kinasen-Weg - pERK/ERK & pJNK/JNK 62 3.2.4.4 PTP1B, PP2A und CDK-5 64 3.2.5 Epitop-spezifische tau-Phosphorylierung in Gehirnlysaten fettreich ernährter Mäuse im Alter von 12-16 Wochen nach zusätzlicher Insulinstimulation 66 Ser202/Thr181 66 Ser199/Thr231/Ser396 67 3.2.5.1 tau 3.2.5.2 tau 4 Disskussion 4.1 55 Ser202/Thr181 3.2.3.1 tau 3.2.4 53 70 Auswirkung einer Hyper-/Hypoglykämie auf die Ausbildung typischer histopathologischer Veränderungen bei Morbus Alzheimer 71 4.2 Auswirkung akuter Hyperinsulinämie bei 12 Monate alten Mäusen 72 4.3 Auswirkung chronischer Hyperinsulinämie bei 12-16 Wochen alten Mäusen 73 4.4 4.3.1 Analyse der Insulinrezeptor-Signaltransduktion 74 4.3.2 Analyse der tau-Phosphorylierung 75 Auswirkung einer akuten Insulinstimulation bei vorbestehender chronischer Hyperinsulinämie durch fettreiche Ernährung bei 12-16 Wochen alten Mäusen 4.5 78 Ausblick: Behandlung einer Insulinresistenz oder eines Typ 2 Diabetes als mögliche therapeutische Option zur Prophylaxe des Morbus Alzheimer 79 5 Zusammenfassung 82 6 Literaturverzeichnis 83 7 Lebenslauf 94 Abkürzungsverzeichnis Aβ β-Amyloid AKT/PKB Proteinkinase B APP Amyloid-Precursor-Protein APS Ammoniumpersulfat BMI body-mass-index BSA Bovine Serum Albumin bzw. beziehungsweise ca. circa cdk cyclin-dependent-kinase d.h. das heißt DM2 Diabetes mellitus Typ 2 DTT Dithiothreitol ERK extracellular-regulated-kinase etc. et cetera FTDP frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus GLUT4 Glukosetransporter 4 Grb-2 growth-factor-receptor-binding protein 2 GSK-3β Glykogen-synthase-kinase-3β HFD High fat diet HRP Meerettich-Peroxidase IDE insulin degrading enzyme IE internationale Einheiten IGF insulin like growth factor IR Insulinrezeptor IRS Insulinrezeptorsubstrat ITT Insulin-Toleranztest JNK c-jun-activated-kinase MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MEK MAP-ERK-Kinase NFT neurofibrilläre tangles NIRKO neuronal insulin-receptor knock-out NMDA N-Methyl-D-Aspartat oGTT oraler Glukosetoleranztest PDK PIP3-dependent-kinase PHF paired helical filaments PI3-Kinase Phospho-Inositol-3-Kinase PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat PIP3 Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat pNPP p-Nitrophenylphosphat PP Phosphoserin-/Phosphothreonin-Proteinphosphatase PTB Phosphotyrosin-Bindungsstellen PTP Protein-Tyrosin-Phosphatase RT Raumtemperatur s.c. subcutan SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEK stress-activated-kinase SEM standard error mean STD standard diet Tab. Tabelle TBS Tris Buffered Saline TBS-T Tris Buffered Saline Tween TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin u.a. unter anderem v. Chr. vor Christus z.B. zum Beispiel ZNS zentrales Nervensystem Einheiten °C Grad Celsius µg Mikrogramm µM Mikromol cm Zentimeter g Gramm h Stunden kD Kilodalton l Liter M Mol mA Milliampère min Minuten ml Milliliter µl Mikroliter mM Millimol mV Millivolt ng Nanogramm nm Nanometer s Sekunden V Volt 1 Einleitung Einleitung 2 1.1 Diabetes mellitus 1.1.1 Definition Diabetes mellitus ist bereits seit dem Jahr 2000 v. Chr. bekannt. Das Leitsymptom des Diabetes mellitus Typ 2 (DM2) ist eine Hyperglykämie, infolge derer es zu einer Glukosurie kommt. In der Antike wurde die Diagnose deshalb anhand einer Geschmacksprobe des Urins gestellt. Der süßliche Geschmack des Urins führte zur Bezeichnung Diabetes mellitus, was aus dem Griechischen bzw. Lateinischen übersetzt "honigsüßer Durchfluss" bedeutet. Heute weiß man, dass es sich bei Diabetes mellitus um eine Regulationsstörung des Stoffwechsels handelt, die durch chronische Hyperglykämie in Folge einer gestörten Insulinsekretion und/oder einer verminderten Insulinwirkung gekennzeichnet ist. Diabetes mellitus wird anhand der Ätiologie unterteilt, wobei Typ 1 und Typ 2 die häufigsten Erkrankungsformen darstellen. Bei Typ 1 Diabetes (ca. 5%) handelt es sich um eine meist immunologisch bedingte Zerstörung der β-Zellen des Pankreas, die zu einem absoluten Insulinmangel führt. In 90% der Erkrankungsfälle handelt es sich jedoch um einen Typ 2 Diabetes, gekennzeichnet durch eine zunehmende Insulinresistenz mit relativem Insulinmangel 1. 1.1.2 Epidemiologie des Diabetes mellitus Typ 2 Diabetes mellitus Typ 2 ist eine Erkrankung mit seit Jahren stetig steigender Inzidenz 27 . Im Rahmen einer Versichertenstichprobe der AOK-Hessen aus den Jahren 1998 bis 2001 wurden die Daten von mehr als 300.000 Versicherten im Hinblick auf Diagnose und Abrechnungsunterlagen ausgewertet. 2001 waren demnach knapp 7% der deutschen Bevölkerung aufgrund eines Diabetes mellitus in Behandlung. Dies entspricht etwa 5,5 Millionen Menschen mit bekannter Diabetes-Erkrankung in Deutschland und zeigt verglichen mit 1988 einen Anstieg der Diabetesfälle um ca. 43% 8,46 (Abb. 1.1a). Von allen Formen des Diabetes entfallen ca. 90% auf den Typ 2, der somit nicht nur bezüglich der Erkrankungshäufigkeit, sondern auch hinsichtlich entstehender Behandlungskosten eine wichtige Rolle spielt. Da die Zahl der Typ-2Diabetiker mit dem Ausmaß der Überernährung steigt 80 , ist bei zunehmender Inzidenz der Adipositas (Abb. 1.1b) auch mit einer Zunahme der Erkrankungsfälle an Diabetes mellitus Typ 2 zu rechnen. Einleitung 3 a) Diabetesprävalenz 1988-2004 in Deutschland b) Adipositasprävalenz 1987-2002 in Deutschland 8% 25% 6% 20% 15% 4% 10% 2% 5% 0% 0% 1988 1998 2001 2004 1987 1998 2002 Abb. 1.1a/b: Diabetes- und Adipositasprävalenz 1988-2004, bzw. 1987-2002. Modifiziert nach Hauner et al. 51 13 und Bramlage . Darüber hinaus verursachte die Behandlung und Versorgung von Patienten mit Diabetes mellitus und assoziierten Folgeerkrankungen im Jahr 2004 allein 6,9% der Gesundheitsausgaben der Bundesrepublik Deutschland 18. 1.1.3 Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass Typ 2 Diabetes eine starke genetische Komponente besitzt. So ist die Inzidenz bei Verwandten ersten Grades besonders hoch, ebenso wie die Konkordanz bei eineiigen Zwillingen 18,47,81,109 . Obwohl Defekte sowohl in der Insulinwirkung, als auch in der Insulinsekretion notwendig zu sein scheinen, um zum Vollbild der Erkrankung zu führen, geht eine Insulinresistenz und eine verminderte insulinstimulierte Glukoseaufnahme der manifesten Erkrankung oft Jahre voraus 93 . Verschiedene Pathomechanismen der Insulinresistenz sind untersucht worden. Es können Mutationen der an der Insulinrezeptorsignalkaskade beteiligten Proteine vorliegen, weiterhin kann die Expression dieser Proteine oder ihre Funktion durch posttranslationale Modifikation verändert sein. Der häufigste Polymorphismus konnte im IRS-1-Gen (Insulinrezeptorsubstrat-1 s. auch 1.3.1) identifiziert werden 2,3 . So trat bei rund 11% der Diabetiker ein Aminosäureaustausch in Codon 972 des IRS-1-Gens auf, während dieser in der Normalbevölkerung nur mit 5,8% nachgewiesen werden konnte 2. Bei der Mehrzahl der Diabetiker bleibt jedoch der genaue Pathomechanismus unklar 107. Einleitung 4 1.1.3.1 Die Signaltransduktionskaskade des Insulinrezeptors Auf molekularer Ebene vermittelt Insulin seine Effekte durch die Bindung und Aktivierung der membrangebundenen Insulinrezeptor-Tyrosinkinase 120 . Diese findet sich sowohl in den so genannten klassischen Insulin-sensitiven Geweben wie Leber, Muskel und Fett, als auch in Zellen des Endothels, der Gonaden und des Gehirns. Insulin α-Untereinheit Insulinrezeptor β-Untereinheit p IRS p SOS Grb2 p p IRS1-4 MAP-Kinasen-Weg IRS PI3-Kinase-Weg Abb. 1.2: Der Insulinrezeptor und die wichtigen intrazellulären Signalwege Der Insulinrezeptor (IR) (Abb. 1.2) besteht aus zwei α- und zwei β-Untereinheiten. Die beiden α-Untereinheiten stellen die extrazellulären Domänen und damit die Insulinbindungsstellen dar, während die transmembranären β-Untereinheiten durch ihre endogene Tyrosinkinaseaktivität für die intrazelluläre Signaltransduktion verantwortlich sind 66,66 . In Abwesenheit von Insulin inhibieren die α-Untereinheiten die Tyrosinkinaseaktivität der β-Untereinheiten 65 . Die Bindung von Insulin führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors und zu einer Aktivierung der βUntereinheiten, in deren Folge es zu einer Autophosphorylierung des Rezeptors kommt. Diese Phosphorylierung verschiedener Tyrosinreste am Insulinrezeptor kann durch Proteine, die Phosphotyrosin-Bindungsstellen (PTB-Domänen) wie die so genannten Insulinrezeptorsubstrate (IRS) 31 enthalten, erkannt werden 68 . Die IRS- Proteine werden aufgrund ihrer strukturellen und funktionellen Homologie zu einer Familie zusammengefasst, es können bisher vier IRS-Proteine (IRS-1 bis IRS-4) Einleitung 5 unterschieden werden. IRS-1 war das erste identifizierte und klonierte Substrat der Insulinrezeptortyrosinkinase 134 . IRS-1 und IRS-2 werden ubiquitär exprimiert IRS-3 findet sich ausschließlich in murinem Fettgewebe 133,135 . 77 , wohingegen IRS-4 in Thymus, Lymphknoten, Hypophyse, Hypothalamus und Nieren nachgewiesen wurde 35 . Die vier IRS-Proteine beinhalten zwischen 8 und 18 potentielle Tyrosin- Phosphorylierungsstellen an verschiedenen Aminosäuresequenz-Motiven. Nach ihrer Phosphorylierung binden sie unterschiedliche Effektor-Proteine, was zu einer Aktivierung zweier nachgeschalteter Signalwege führen kann: Zum einen über die regulatorischen Untereinheiten der Lipidkinase des Phosphatidyl-Inositol-3-KinaseWegs (PI3-Kinase-Weg) 99 (Abb. 1.3) und zum anderen über die Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), die Ras-Kaskade und die Signaltransduktion via MEK-1 (Abb. 1.4). 1.1.3.2 Der PI3-Kinase-Weg Im Zuge des PI3-Kinase-Wegs binden die membranständigen IRS-Proteine die regulatorische Untereinheit der PI3-Kinase, die anschließend die katalytische Untereinheit bindet und Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP2) zu Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PIP3) phosphoryliert. PIP3 aktiviert die PIP3dependent-kinase (PDK), die durch Phosphorylierung die Proteinkinase B (AKT/PKB) aktiviert. Diese Aktivierung induziert die Translokation des Glukosetransporters GLUT4 vom Zellinneren an die Zellmembran und ermöglicht so die gesteigerte Aufnahme von Glukose in Muskel- und Fettzellen 22 (Abb. 1.3). Außerdem scheint die Aktivierung der PI3-Kaskade auch einen antiapoptotischen Effekt von Insulin zu vermitteln 121. Einleitung 6 Insulin Zellmembran p p IRS1-4 p IRS PI3-K IRS p PI3-K PI3,4,5P p PDK GLUT4 PI3,4P PTEN p FOXO FOXO PKB/AKT Zellkern p GSK Abb. 1.3: Der PI3-Kinase-Weg 1.1.3.3 Der MAP-Kinasen-Weg Im Rahmen der Aktivierung des MAP-Kinasen-Wegs binden die IRS-Proteine an Grb-2 (growth-factor-receptor-binding protein 2). In der Folge kommt es zu einer Aktivierung der Raf1-Kinase und der MAP-Kinasen MEK-1 und MEK-2. Diese wiederum aktivieren unter anderem ERK-1 und -2 126 . Darüber hinaus führt die aktivierte Raf1-Kinase über MEK-1 und SEK (stress-activated-kinase) zu einer Aktivierung von JNK (c-jun-activated-kinase), die den Transkriptionsfaktor c-jun reguliert. Die Insulin-abhängige Aktivierung der MAP-Kinasen spielt somit eine bedeutende Rolle bezüglich Zellproliferation und Zell-Zyklus-Progression 1.4). 16,40 (Abb. Einleitung 7 Insulin Zellmembran p Ras p GDP IRS p SOS Grb2 GAP GTP Ras MEK-1 Raf SEK MEK p JNK JNK p p p c-jun Abb. 1.4: Der MAP-Kinasen-Weg ERK-1/2 ERK-1/2 c-fos Zellkern p Elk-1 IRS1-4 Einleitung 8 1.1.4 Klinik des Diabetes mellitus Typ 2 Begründet durch eine verminderte Insulinproduktion in den β-Zellen der Langerhans´schen Inseln des Pankreas und eine gestörte Insulinwirkung an der Zellmembran der Zielzellen, kommt es zum Symptom der Hyperglykämie. Bei Überschreitung der so genannten Nierenschwelle von 180 mg/dl (10 mmol/l) wird Glukose mit dem Harn ausgeschieden und führt als osmotisch wirksame Substanz zu einer vermehrten Harnausscheidung 125 . So können die Symptome bei der Erstmanifestation des Diabetes mellitus von Polyurie und Polydipsie bis hin zu nächtlichen Wadenkrämpfe durch Elektrolytmangel oder klassischen hypoglykämischen Symptomen wie z.B. Schwitzen, Heißhunger und Kopfschmerzen bei passagerer initialer Hyperinsulinämie reichen. Die Entwicklung bis hin zur manifesten Erkrankung geht meist schleichend voran und wird von den Patienten häufig nicht bemerkt, insbesondere wenn es sich um einen Typ 2 Diabetes handelt. 1.1.5 Screening und Diagnostik des Diabetes mellitus Typ 2 Bei allen Personen, die 45 Jahre oder älter sind, sollte eine Bestimmung der Nüchternblutglukose durchgeführt werden. Bei einem Normalbefund sollte eine Wiederholung nach 3 Jahren erfolgen. Für die Diagnostik des Diabetes mellitus Typ 2 stehen zwei gleichwertige Verfahren zu Wahl. Zum einen gilt die Erkrankung als erwiesen, wenn die Nüchternplasmaglukose in zwei unabhängigen Messungen ≥ 126 mg/dl liegt. Zum anderen kann ein Nachweis mittels oralem Glukosetoleranztest (oGTT) erfolgen. Dabei trinkt der Patient nach Entnahme der Nüchternplasmaglukose eine Testlösung mit 75 g Glukose. Nach 120 Minuten erfolgt eine erneute Plasmaglukosebestimmung und dieser Wert muss zur Diagnosestellung ≥ 200 mg/dl betragen. Bei einem Nüchternplasmaglukosewert von ≥100 mg/dl, jedoch ≤125 mg/dl bzw. einem 2h-Wert des oGTT zwischen 140 mg/dl und 199 mg/dl liegt definitionsgemäß eine pathologische Nüchternglukose respektive eine gestörte Glukosetoleranz und somit ein Prädiabetes vor 71. Einleitung 9 1.1.6 Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 Grundlage einer Maßnahmen. adäquaten Hierbei sind Diabetestherapie bilden Ernährungstherapie mit nicht-medikamentöse dem Ziel der Ernährungsumstellung und Übergewichtsreduktion, Erhöhung der körperlichen Aktivität und ggf. Alkoholgenusses, eine etc.) Lebensstiländerung von zentraler (Nikotinverzicht, Bedeutung. Sind Reduktion diese des Maßnahmen ausgeschöpft ohne nach drei Monaten die metabolischen Therapieziele erreicht zu haben, sollte zusätzlich eine medikamentöse Therapie erfolgen. Grundsätzlich unterscheidet man eine orale antidiabetische Therapie und eine Insulintherapie. Orale Antidiabetika können weiterhin hinsichtlich ihrer Wirkungsweise unterschieden werden: So können so genannte Insulin-Sensitizer verwendet werden, die zu einer gesteigerten Insulin-vermittelten Glukoseaufnahme in Muskel- und Fettgewebe führen (Metformin, Glitazone). Darüber hinaus werden auch Präparate verwendet, die die endogene Insulinsekretion stimulieren (Sulfonylharnstoffe, Glinide, etc.) 95. 1.1.7 Prognose des Diabetes mellitus Typ 2 Über Jahre hinweg führt eine Hyperglykämie vor allem bei inadäquater Therapie zu zahlreichen Folgeerkrankungen. Im Rahmen der Diabetes-assoziierten Mikro- und Makroangiopathie leiden 75,2% der Typ 2 Diabetiker an einer arteriellen Hypertonie und weisen ein deutlich erhöhtes Risiko für das Auftreten kardiovaskulärer Komplikationen wie Myokardinfarkt oder cerebrovaskuläre Ischämie auf 11 . Im Rahmen der diabetischen Mikroangiopathie kommt es zu einer progredienten Schädigung von Nieren, Augen und Nerven. Die diabetische Nephropathie stellt eine der häufigsten Indikationen für eine Hämodialyse-Therapie dar, die Folgen des Diabetes an peripheren Gefäßen und Nerven führen zu ca. 20.000 Amputationen jährlich 131 . Und nicht zuletzt ist die diabetische Retinopathie die häufigste Ursache für Erblindung in der westlichen Bevölkerung 129 (Abb. 1.5). Einleitung 10 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% RP NP MI pAVK CVI NPP Abb. 1.5: Häufigkeiten Diabetes-assoziierter Folgeerkrankungen (in %); RP Retinopathie, NP Neuropathie, MI Myokardinfarkt, pAVK periphere arterielle cerebrovaskulärer Insult, NPP Nephropathie, modifiziert nach Biermann E 1.2 Morbus Alzheimer 1.2.1 Definition Verschlusskrankheit, CVI 11 . Die heute unter dem Begriff Morbus Alzheimer bekannte dementielle Erkrankung wurde erstmals von Dr. Alois Alzheimer am 3. November 1906 auf der „37. Versammlung der Südwestdeutschen Irrenärzte“ in Tübingen beschrieben. Alzheimer hatte im Gehirn einer verstorbenen Patientin bisher unbekannte Veränderungen festgestellt, die er mit ihren erheblichen Persönlichkeitsveränderungen und einem progredienten Gedächtnisverlust in Verbindung brachte 14 . Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung mit progredienter Hirnatrophie, neurofibrillären tangles und senilen Plaques. 1.2.2 Epidemiologie des M. Alzheimer 6–9% der deutschen Bevölkerung ab dem 65. Lebensjahr leiden an einer Demenz. Nach aktueller Studienlage ist Morbus Alzheimer die häufigste Form der Demenzerkrankungen und in Deutschland kommen jährlich ca. 50.000 Neuerkrankungen hinzu. Der wohl wichtigste Risikofaktor für die Entwicklung einer Demenz vom Alzheimer-Typ ist fortgeschrittenes Alter 20,27,32 (Abb. 1.6). Einleitung 11 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 65-69 70-74 75-79 80-84 85-89 > 89 Abb. 1.6: Mittlere Prävalenz des Morbus Alzheimer in Deutschland in den verschiedenen 27 Altersgruppen (in Jahren) nach Bickel . 1.2.3 Pathogenese des M. Alzheimer Pathogenetisch liegt der Alzheimer-Erkrankung ein progredienter Untergang neuronaler Zellen zugrunde, der in einer Dezimierung der Gehirnsubstanz um bis zu 20% resultiert 26. Mittels magnetresonanztomographischer Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass Patienten jährlich bis zu 5% ihrer Hirnmasse einbüßen, in den für das Gedächtnis wichtigen Arealen bis zu 10% pro Jahr. Ältere Personen ohne M. Alzheimer weisen dagegen nur eine Reduktion der Hirnmasse von rund 1% pro Jahr auf 137 . Da dieser zelluläre Untergang nicht nur im Cortex auftritt, sondern auch in tieferen Hirnregionen, werden auch Strukturen geschädigt, die der Weiterleitung und Verarbeitung neuronaler Impulse dienen, und es resultieren Störungen der Informationsverarbeitung, die sich klinisch als Gedächtnisverlust manifestieren. Der Abbau beginnt im Bereich der Temporallappen, die für die Gedächtnisleistung von besonderer Bedeutung sind. Typisch für die Alzheimer-Krankheit sind diffuse oder reife Plaques und neurofibrilläre Bündel (tangles), die post mortem in den Gehirnen der Betroffenen nachgewiesen werden können. Die Plaques werden aus Proteinfragmenten, dem sogenannten β-Amyloid (Aβ), gebildet, das außerhalb der Neuronen akkumuliert. Die neurofibrillären Bündel bestehen aus hyperphosphoryliertem tau-Protein, das sich innerhalb der Axone ablagert. Die Hyperphosphorylierung von tau mit konsekutiver Bildung neurofibrillärer Bündel aus Einleitung 12 helikalen Filamenten kann zu einem Zusammenbruch des neuronalen Zytoskleletts und zum Untergang der Zelle führen. Obwohl verschiedene genetische Risikofaktoren identifiziert werden konnten, ist die Ätiologie des Morbus Alzheimer bisher unklar. 1.2.4 Klinik des M. Alzheimer Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch erhebliche Einbußen in Gedächtnis, Sprach- und Urteilsvermögen. Insbesondere das sogenannte explizite oder deklarative Gedächtnis ist zunehmend gestört und somit die Erinnerung an Fakten und Ereignisse deutlich eingeschränkt. Neben der Gedächtnisstörung erschweren jedoch auch Störungen der Sprache (z.B. Wortfindung), der räumlichen Leistung (z.B. Kleidung richtig anziehen) und/oder der Orientierung (zu Zeit oder Situation) die Alltagsbewältigung 25. 1.2.5 Diagnostik des M. Alzheimer Sichere diagnostische Marker für das Vorliegen von M. Alzheimer gibt es bis heute noch nicht, ausgenommen bei seltenen autosomal-dominant vererbten Fällen, bei denen eine Mutation des Amyloid-Präkursor-Proteins (APP) oder der GammaSekretase (Präsenilin) nachgewiesen werden kann. Die Diagnose ergibt sich aus der Summe klinischer und apparativer Befunde. Relevante Differentialdiagnosen müssen ausgeschlossen werden. Die Genauigkeit einer fundierten klinischen Diagnostik ist höher als die einzelner apparativer Verfahren. Zur Basisdiagnostik gehören neben einer ausführlichen Anamnese auch die Testung des Kurz- und Langzeitgedächtnisses, die Ermittlung einer möglichen Sprachstörung mittels Lautwechsel-Testinventar, eine neuropsychologische Untersuchung hinsichtlich Aphasie, Apraxie, Alexie, Agraphie, Akalkulie und Agnosie und eine strukturelle zerebrale Bildgebung, wobei die Magnetresonanztomographie die Methode der ersten Wahl darstellt. Darüber hinaus können Elektroenzephalogramm und Positronen-Emissions-Tomographie zur Früherkennug und gegenüber anderen Demenzformen hinzugezogen werden 28. zur Abgrenzung Einleitung 13 1.2.6 Therapie des M. Alzheimer Eine kausale Therapie der Demenz vom Alzheimer-Typ gibt es bislang nicht. Daher besteht das Therapieziel aus einer Verzögerung der Krankheitsprogression. Hierzu zählt im Bereich personenzentrierte der Pflege Stimulationsbehandlungen. nicht-medikamentösen und eine Vielzahl Pharmakologisch Behandlungsansätze an eine Bewegungs- werden und entweder Cholinesterasehemmer, die bei einigen Patienten die mnestischen Leistungen positiv beeinflussen oder NMDA-Rezeptor-Antagonisten eingesetzt, die bei mittelschweren bis schweren Demenzen Alltagsfähigkeit und kognitive Leistungsfähigkeit verbessern können 142. 1.2.7 Prognose des M. Alzheimer Aufgrund einer fehlenden kausalen Therapie ist eine kurative Behandlung zur Zeit nicht möglich und die Patienten werden meist frühzeitig pflegebedürftig. Durch fortschreitende Hirnatrophie kommt es zu einer Reduktion der verbalen und gestischen Ausdrucksfähigkeit, die im fortgeschrittenen Stadium auf stereotype Bewegungen beschränkt ist. Darüberhinaus führt die Hirnatrophie nicht selten zur Entwicklung einer Epilepsie und die Patienten versterben nach einer Krankheitsdauer von 5-8 Jahren meist an Komplikationen der Bettlägerigkeit, wie z.B. Pneumonie 94. 1.3 1.3.1 Assoziation von Diabetes mellitus Typ 2 und M. Alzheimer Klinische Studienlage Bereits in den 80er Jahren wurde ein Einfluss neuroendokriner Dysfunktionen wie Typ 2 Diabetes in der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen diskutiert 129 . Auch verschiedene klinische Studien haben eine Assoziation von Diabetes mellitus und neurodegenerativen Erkrankungen beschrieben. So zeigte die Rotterdam-Studie für Typ 2 Diabetiker im Vergleich zu Nicht-Diabetikern ein fast verdoppeltes relatives Risiko, an Morbus Alzheimer zu erkranken 81,104 . Insgesamt war Diabetes mellitus Typ 2 unabhängig von der Alzheimer-Krankheit mit einer eingeschränkten Gedächtnisleistung vergesellschaftet 90,130 . Auf der anderen Seite haben Alzheimer- Patienten ein erhöhtes Risiko, zusätzlich einen Typ 2 Diabetes zu entwickeln 61 . Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine gemeinsame pathogenetische Basis Einleitung 14 für den Verlust von Neuronen (Morbus Alzheimer) und pankreatischen β-Zellen, bzw. einer Insulinresistenz (Diabetes mellitus) existiert. 1.3.2 Zerebrales Insulin und seine Wirkung 1978 konnten Havrankova et al. zeigen, dass sich auch im Gehirn Insulinrezeptoren finden lassen 52 . In den folgenden Jahren wurde der aktive, Rezeptor-vermittelte Transport von Insulin über die Blut-Hirn-Schranke in das zentrale Nervensystem beschrieben 63,73,105,139 , wobei die höchste Dichte an Insulinrezeptoren im Gehirn in Bulbus olfactorius, Hypothalamus, Grosshirnrinde und Hippocampus nachgewiesen wurde 10,54,138,145 . Insulin überquert die Blut-Hirn-Schranke durch einen Rezeptor- vermittelten Transport 74,124 und erreicht den Liquor innerhalb von 5-10 Minuten 38 . Dabei gelangt bei Nagetieren lediglich 1% des peripher injizierten Insulins in das zentrale Nervensystem (ZNS) 9. Abb. 1.7: Zerebrale Insulinkonzentration nach peripherer Insulininjektion (prozentualer Anteil des peripher applizierten Insulinbolus). Modifiziert nach Banks et al. Transkortikal gemessene hyperinsulinämischen und Potentiale zeigen euglykämischen 9 bei gesunden Probanden Clamp-Untersuchungen in deutliche Veränderungen als Hinweis darauf, dass peripher zirkulierendes Insulin schnell und unabhängig von seinen systemischen Effekten die Gehirnfunktion beeinflussen kann 50 . Darüber hinaus ergaben diese Clamp-Studien bei Alzheimer-Patienten Gegensatz zu gesunden Probanden nach peripherer Insulininjektion. 70 23 im eine Verbesserung der Gedächtnisfunktion Einleitung 15 Nach peripherer Insulinstimulation werden sowohl der MAP-Kinasen-Weg als auch der PI3-Kinase-Weg innerhalb von 10 Minuten transient aktiviert 38 . Dies weist darauf hin, dass peripher zirkulierendes Insulin entgegen bisherigen Vorstellungen in der Lage ist, die zerebrale IR-Signaltransduktion zu beeinflussen. Einige Autoren sehen eine mögliche Verbindung zwischen Alzheimer-Demenz und Diabetes mellitus Typ 2 in einer, beiden Erkrankungen gemeinsamen, veränderten Signaltransduktion. So wird Morbus Alzheimer auch als “Typ 3 Diabetes” 128 oder “Diabetes des Gehirns” 58 bezeichnet. 1.3.3 Experimentelle Studienlage Geht man davon aus, dass beide Erkrankungen mit einer defekten oder fehlregulierten intrazellulären Signalweiterleitung assoziiert sind, ist es interessant, dass im Gehirn von Alzheimer-Patienten sowohl die Dichte der Insulinrezeptoren als auch die Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors, verglichen mit Kontrollpersonen, verringert ist. Zwar konnten im Rahmen post mortem durchgeführter Untersuchungen nicht immer signifikante Konzentrationsunterschiede von Insulin im Gehirn von Erkrankten und Kontrollpersonen gefunden werden Veränderungen der IR-Signaltransduktion 38 , doch es sind nachweislich vorhanden 12 . Biochemische Untersuchungen ergaben außerdem Grund zu der Annahme, dass es einen Zusammenhang zwischen einer Dysfunktion der Insulinrezeptorsignaltransduktion und den zwei histopathologischen Charakteristika des Morbus Alzheimer, Amyloidplaques und neurofibrilläre tangles, im Gehirn der Erkrankten gibt. Im neuronalen Zellkulturmodell konnte gezeigt werden, dass tau-Protein durch Bestandteile der IR-Signalkaskade phosphoryliert werden kann 58,76. 1.3.4 1.3.4.1 Das tau-Protein Physiologische Funktion Es handelt sich bei tau um ein hydrophiles, niedermolekulares Phospho-Protein, das, auf Chromosom 17 kodiert, im adulten humanen Zentralnervensystem in sechs Spleißisoformen und etwa 70 verschiedenen Phosphoisoformen dargestellt werden konnte. Im Folgenden soll auf die mit 441 Aminosäuren längste dieser Isoformen eingegangen werden. Als ein Bestandteil der Familie der axonalen Mikrotubulus- Einleitung 16 assoziierten Proteine ist tau unter physiologischen Bedingungen wichtig für die Polymerisation von Tubulindimeren in Mikrotubuli und deren Stabilisierung 21,144 . In der Folge entsteht ein Netzwerk, das zum einen die Zellform aufrecht erhält, zum anderen essentiell für das zielgerichtete axonale Wachstum ist 82 . Darüber hinaus transportieren Motorproteine ihre Ladung (z.B. Vesikel) entlang der Mikrotubuli, weshalb tau somit auch für den intrazellulären Molekültransport von großer Wichtigkeit ist. Die Expression der tau-Proteine wird durch alternatives Spleißen reguliert. 1.3.4.2 tau-Pathologie Im Fall der Alzheimerschen Erkrankung akkumuliert hyperphosphoryliertes tauProtein innerhalb der Axone in Form so genannter „paired helical filaments“ 4, welche Hauptbestandteil der für Morbus Alzheimer charakteristischen neurofibrillären Bündel (tangles) sind 79 . Die Folge ist eine Destabilisierung der Mikrotubuli 30 und des intrazellulären Netzwerkes 5. Konsekutiv kommt es u.a. zu Störungen axonaler Transportvorgänge und zum Zelluntergang. Neben Morbus Alzheimer gibt es eine Reihe anderer Erkrankungen, die unter dem Begriff der "Tauopathien" zusammengefasst werden. Darunter fallen die kortikobasale Degeneration, der Morbus Pick, die progressive supranukleäre Blickparese oder auch die Chromosom 17-gekoppelte frontotemporale Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17). Allen diesen Erkrankungen liegen Alterationen des tau-Proteins zugrunde. So führen neben der erläuterten Hyperphosphorylierung auch verändertes Spleißen, pathologische tauKonzentrationen und Mutationen im tau-Gen zur Manifestation neurodegenerativer Erkrankungen. 1.3.5 tau-Phosphorylierung und der Einfluss der IR- Signaltransduktion In vitro-Studien haben gezeigt, dass tau durch eine Vielzahl von Kinasen an unterschiedlichen Epitopen phosphoryliert werden kann. Ein Großteil dieser Kinasen spielt eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Insulinrezeptors und stellt somit eine mögliche pathogenetische Verbindung zwischen Diabetes mellitus Typ 2 und Morbus Alzheimer dar (Abb. 1.9). Ser396 Ser404 pS404 Thr217 pT217 pS396 Ser214 pT215 AT180 Thr212 pT212 Thr231 Thr205 pT205 AT100 Ser202 pS202 AT8 Ser199 AT270 Phosphorylierungsstellen pS199 Verwendete Antikörper Thr181 Einleitung 17 Abb. 1.8: tau-Protein, seine Phosphorylierungsstellen und Antikörper gegen spezifische Phosphorylierungsstellen. Modifiziert nach Yoshida et al. 1.3.5.1 149 . Proteinkinase B und Glykogen-synthase-kinase-3β GSK-3β ist Bestandteil der IR-Signaltransduktion, genauer gesagt des PI3-KinaseWegs (Abb. 1.3), und gehört zu den tau-Kinasen 20,57,60,84,132 . Wird AKT (Proteinkinase B) durch Bindung von Insulin an seinen Rezeptor über den PI3Kinase-Weg aktiviert, so phosphoryliert es GSK-3β und führt somit zu einer Inhibition. Phosphorylierung an Ser9 inaktiviert die Kinase, durch Phosphorylierung an Tyr216 wird GSK-3β aktiviert 110 . Die aktivierte Kinase ist in der Lage, tau an mehreren Epitopen zu phosphorylieren 59 , was sich anhand einer Überexpression von GSK-3β sowohl im Zellkulturmodell als auch bei transgenen Mäusen zeigen ließ 86 . Dabei scheinen vor allem Ser199, Ser396 und Ser404 GSK-3β-abhängig phosphoryliert zu werden 149. 1.3.5.2 Die MAP-Kinasen ERK-1/-2 und JNK/SAPK ERK (extracellular-regulated-kinase) und JNK/SAPK (c-jun-activated-kinase/stressactivated-proteinkinase) sind wichtige Bestandteile des MAP-Kinasen-Wegs, über den u.a. auch die Wirkung von Insulin vermittelt wird. Bindet Insulin an seinen Rezeptor, wird Ras aktiviert und es kommt über Raf und MEK zu einer Phosphorylierung von ERK und somit zur Aktivierung (s. Abb. 1.4). Auf zellulärer Einleitung 18 Ebene spielt ERK eine wesentliche Rolle bei der Regulation der Zellproliferation und der Genexpression 19 . Untersuchungen an Hirnschnitten und am Zellkulturmodell erbrachten die Erkenntnis, dass ERK eine tau-Kinase ist 32,39,48,85 . Holzer et al. konnten darüber hinaus nachweisen, dass eine Überexpression von ERK zu einer tau-Hyperphosphorylierung 55 führt . Als mutmaßlich ERK-abhängige Phosphorylierungsstellen des tau-Proteins werden Thr181, Ser199, Ser202, Ser396 , Ser404 und Ser422 (s. Tab. 1.1) diskutiert 36. Als weitere MAP-Kinase mit der Fähigkeit, tau-Protein zu phosphorylieren, ist JNK/SAPK zu nennen (s. Abb. 1.4). Planel et al. konnten zeigen, dass die Aktivität der JNKs in den Gehirnen von Mäusen unter Nahrungskarenz-induziertem Stress mit der Phosphorylierung von tau korreliert 112 . Aktivierte JNKs sind des weiteren bei fortgeschrittenem Morbus Alzheimer gehäuft in Bereichen mit neurofibrillären Schädigungen lokalisiert 149 . Die verschiedenen JNKs (JNK1, JNK2, JNK3) scheinen eine Vielzahl von Epitopen des tau-Proteins mit unterschiedlicher Affinität zu phosphorylieren (s. Tab. 1.1). 1.3.5.3 Cyclin-dependent-kinase-5 Cyclin-dependent-kinase (CDK-5) gewinnt im Hinblick auf die tau-Phosphorylierung zunehmend an Interesse. Es scheint sich um ein multifunktionales Protein zu handeln, das mit zahlreichen anderen Proteinen des Zytoskeletts interagiert und supramolekulare Komplexe formt 97 . Bezogen auf tau handelt es sich bei CDK-5 um eine Kinase, die Ser202, Thr205 und Ser404 (s. Tab. 1.1) phosphoryliert 93,96 . Auch diese Phosphorylierungsstellen sind bei gesunden Probanden nicht oder nur geringgradig phosphoryliert 93 , jedoch in den „paired helical filaments“ (PHF) bei Alzheimer-Patienten gehäuft phosphoryliert nachweisbar 6,106. 1.3.5.4 Den Proteinphosphatasen genannten tau-Kinasen gegenüber werden fünf Phosphoserin- /Phosphothreonin-Proteinphosphatasen (PPs) (PP2A, PP2B, PP2C, PP5 und PP1) im Gehirn von Säugetieren exprimiert, die – bis auf PP2C – in der Lage sind, tau in vitro und möglicherweise auch in vivo zu dephosphorylieren zeigen, dass die vier PPs je nach 45 . Liu et al. konnten Phosphorylierungsstelle mit jeweils unterschiedlicher Effizienz und Präferenz zu einer Dephosphorylierung von tau an Einleitung 19 Ser199, Ser202, Thr205, Thr212, Ser214, Ser235, Ser262, Ser396, Ser404 und Ser409 führen 84. Die Aktivität von PP2A korreliert negativ mit dem Ausmaß der tau-Phosphorylierung, was eine herausragende Rolle von PP2A im Hinblick auf die Regulation der tauPhosphorylierung vermuten lässt. Insbesondere Ser199 und Ser202 werden effizient durch PP2A dephosphoryliert 84. 1.3.5.5 Protein-Tyrosin-Phosphatase-1B PTP-1B ist ein Mitglied der Familie der Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) und ist in vivo ein wichtiger Negativ-Modulator der Insulinsensitivität. So ist PTP-1B fähig, sowohl den Insulinrezeptor selbst als auch IRS-1 zu dephosphorylieren 33,42,75 und damit zu inaktivieren. Es wird diskutiert, ob eine veränderte Expression von PTP-1B in den Insulinzielgeweben an der Pathogenese der Insulinresistenz bei Adipositas und Diabetes beteiligt ist 17,42 , denn PTP-1B-knockout-Mäuse weisen eine deutlich gesteigerte Insulinsensitivität auf und scheinen eine Resistenz gegenüber der Entwicklung von Übergewicht zu haben Ser50 phosphoryliert 114 33,74 . Außerdem wird PTP-1B durch AKT an und ist somit ein Bestandteil des Insulin-abhängigen PI3- Kinase-Wegs. Antikörper Epitop Kinasen JNK1 JNK2 JNK3 CDK-5 ERK PKA GSK3ß PP2A AT270 Thr181 (+) + + - + - (+) ? pS199 Ser199 + + + - + - + + AT8 Ser202+Thr205 (+) + + + + - (+) + pS202 Ser202 + + + + + - (+) + pT205 Thr205 + + + + (+) - (+) (+) AT100 Thr212+Ser214 - - - - - - - (+) pT212 Thr212 + + (+) - (+) - (+) (+) pS214 Ser214 - - - - - - - (+) pT217 Thr217 + + + - (+) - (+) ? AT180 Thr231 - (+) - - - + - ? pT231 Thr231 - (+) - - - - - ? pS396 Ser396 (+) + + - (+) - + (+) pS404 Ser404 + + + + + - + (+) Tab. 1.1: Übersicht der p-tau Antikörper und der an der Phosphorylierung beteiligen Kinasen. Modifiziert nach Yoshida et al. 149 , Maccioni et al. 93 83 und Liu et al. . Einleitung 20 Insulin MAP-Kinasen-Weg p GDP Ras GAP GTP PI3-Kinase-Weg IRS p SOS Grb2 p Ras PI3-K p IRS1-4 GLUT4 IRS p IRS PI3-K PTP1B PI3,4P PP2A MEK-1 p Raf PI3,4,5P PDK MEK SEK p JNK p PTEN p PKB/AKT ERK-1/2 CDK-5 GSK p p p p p p tau-Protein Abb. 1.9: Übersicht der Signalkaskade des Insulinrezeptors und seiner tau-Kinasen. Einleitung 21 1.4 Zielsetzung der Arbeit Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss von Hyperinsulinämie und Alter auf die tau-Phosphorylierung in vivo zu untersuchen. Es sollen die folgenden Fragen beantwortet werden: 1) Führt eine akute Insulininjektion bei älteren Tieren zu einer ähnlichen tauPhosphorylierung in vivo, wie sie bereits bei jüngeren Tieren gezeigt worden ist? 2) Führt eine milde chronische Hyperinsulinämie - hervorgerufen durch eine „high fat diet“ - zu einer vermehrten tau-Phosphorylierung in vivo? 3) Kann peripher injiziertes Insulin bei hyperinsulinämischen Tieren unter einer „high fat diet“ wie bei normoinsulinämischen Tieren unter einer normalen Nahrung eine tau-Phosphorylierung in vivo induzieren? 22 2 Material und Methoden Material und Methoden 23 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Chemikalie Firma Acrylamid / Bis-Acrylamid 30% Rotiphorese Gel 30 (37,5/1) Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GER Aprotinin Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER APS AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Benzamidin Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER Bradfordreagenz Bio-Rad Laboratories GmbH, GER Bromphenolblau AppliChem GmbH, Darmstadt,GER BSA Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER DTT AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Enhanced Chemiluminescence-Kit Amersham Biosciences, Chalfont, UK EDTA AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Essigsäure Merck, Darmstadt, GER Ethanol AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Ethidiumbromid Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER Glycerol AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Glycin AppliChem GmbH, Darmstadt, GER HEPES Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER HCl Merck, Darmstadt, GER Insulin Actrapid, Novo Nordisk, Bagsvaerd, DK Methanol 99% Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GER Milchpulver Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GER Natriumchlorid Carl Roth GmbH, Karlsruhe, GER Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Natriumorthovanadat Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER PMSF Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER Ponceau-S Serva Elektrophoresis, Heidelberg, GER Prestained Protein Marker New England BioLabs, Beverly, USA TEMED Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, GER Tris-Base AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Material und Methoden 24 Tris-HCl AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Triton-X 100 AppliChem GmbH, Darmstadt, GER Tween 20 Caesar und Lorentz GmbH, Bonn, GER Material und Methoden 25 2.1.2 Lösungen AP1: 0,3 M Tris-HCl 100 ml Methanol (20%) ad 500 ml Aqua bidest AP2: 25 mM Tris-HCl 100 ml Methanol (20%) ad 500 ml Aqua bidest CP: 40 mM 6-Aminohexansäure 0,5 ml SDS (10%) 100 ml Methanol (20%) ad 500 ml Aqua bidest Narkose der Tiere Kombination Ketanest/Xylazin 100 mg/kg Ketanest (intraperitoneal injiziert) 5 mg/kg Xylazin Proteinextraktion Organ-Lyse-Puffer: 50 mM HEPES (pH 7.4) 50 mM NaCl 1% Triton X-100 10 mM EDTA 0,1 M NaF 17 µg/ml Aprotonin 2 mM Benzanidin 0,1% SDS 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid 10 mM Na3VO4 Proteinbestimmung Lyse-Mix: 9 µl Organlysepuffer 10 µl 0,1M HCl 80 µl Aqua bidest Material und Methoden 26 Western Blot Sammelgel-Puffer pH 6,8: 0,5 M Tris Base 0,4% SDS Sammelgellösung: 25 ml Sammelgel-Puffer 59 ml ddH2O 16 ml Acrylamid (30% AA / 0,8% BisAA) Trenngel-Puffer pH 8,8: 1,5 M Tris-Base 0,4% SDS Laufpuffer (10x): 250 mM Tris-Base 1,92 Glycin 1% SDS APS (10%): 10 g APS ad 100 ml Aqua bidest SDS-Puffer (10%): 288 g Glycin 60,6 g Tris-HCl 20 g SDS ad 1 l Aqua bidest TBS (10x): 24,2 g Tris 80,0 g NaCl ad 1 l Aqua bidest ad pH 7,6 HCl TBS-T: 50 ml TBS (10x) 1 ml Tween (100%) ad 500 ml Aqua bidest Material und Methoden 27 4x SDS Probenpuffer: 1 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,617 g DTT 8 ml SDS (20%) 8 µl Bromphenolblau (100%) 8 ml Glycerol (100%) Blocking-Lösung: 1x TBS-T 5% Magermilchpulver Blocking-Lösung: 1x TBS-T (für Antikörper) 2% Magermilchpulver Ponceau-S-Färbelösung: 0,1% Ponceau-S 40% Methanol 15% Essigsäure Stripping-Lösung: 700 µl 2-Mercaptoethanol (14,2M) 20 ml 10% SDS 6,25 ml Tris HCl pH 6,8 (1M) ad 100 ml Aqua bidest Gelzusammensetzung (Ansatz für zwei Gele) Sammelgel: 4 ml Sammelgellösung 6 µl TEMED 12 µl 10% APS Trenngel: 10%iges Gel 12,5%iges Gel 15%iges Gel Trenngelpuffer 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml H2O bidest 3,67 ml 3,0 ml 2,0 ml Acrylamidlösung (30%/0,8%) 3,33 ml 4,0 ml 5,0 ml TEMED 6 µl 6 µl 6 µl 10% APS 12 µl 12 µl 12 µl Tab. 2.1 Gelzusammensetzung für unterschiedliche Acrylamid-Prozentanteile. Material und Methoden 28 2.1.3 Antikörper Erstantikörper Hersteller Verdünnung 2.AK Größe Gel Actin Cell Signaling 1:1.000 Mouse 60kDa 10% Akt Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 60kDa 10% pAkt (Ser473) Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 60kDa 10% AT 8 Perbio 1:1.000 Mouse verschiedene 10% AT 100 Perbio 1:1.000 Mouse verschiedene 10% AT 180 Perbio 1:1.000 Mouse verschiedene 10% AT 270 Perbio 1:1.000 Mouse verschiedene 10% CDK-5 Santa Cruz 1:1.000 Rabbit 30kDa 10% Erk (p44/42) Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 42/44kDa 10% pErk (p44/42) Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 42/44kDa 10% GSK-3β Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 46kDa 10% pGSK-3 β Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 46kDa 10% IR- β Santa Cruz 1:500 Rabbit 95kDa 10% JNK Cell Signaling 1:1000 Rabbit 46/54kDa 10% pJNK Cell Signaling 1:1.000 Rabbit 46/54kDa 10% PP2A Biomol/Upstate 1:1000 Mouse 36kDa 15% PTP-1B Biomol/Upstate 1:1000 Rabbit 55/97kDa 10% Tau pS199 Biosource 1:1.000 Rabbit 70kDa 10% Tau pS396 Biosource 1:1000 Rabbit 70kDa 10% Antikörper Tab. 2.2 Übersicht über die verwendeten Erstantikörper. Zweitantikörper Als Zweitantikörper wurden die HRP-gekoppelten Antikörper anti-Mouse IgG und anti-Rabbit IgG (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, GER) jeweils in der Verdünnung 1:1000 verwendet. Die Inkubation erfolgte über eine Stunde bei RT. Material und Methoden 29 2.1.4 Geräte/Verbrauchsmaterial 2D-Densitometrie: AIDA, Version 4.00.027; Raytest, Straubenhardt, GER Blottingkammer: TransBlot Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, USA Blotting Membran: Immun-BlotTM PVDF Membran Bio-Rad Laboratories, USA Blotting Papier: Whatman Schleicher und Schuell, GER Blutzucker-Messgerät: GlucoMen A. Menarini Diagnostics, GER Film-Entwicklermaschine: Curix 60 AGFA, Mortsel, BEL Gefrierschränke: Thermo Forma ULT Freeze -86°C Thermo Electron Corp. Waltham, USA Liebherr comfort Liebherr-International AG, Bulle, CH Gewebe-Homogenisator: VWR International, GER Luminometer: Mithras LB940 Berthold Technologies, GER Mikroplatten-Reader: Mithras LB 940 Berthold Technologies GmbH, GER Maxi electrophorese power supplies: E865, E835 + E833, Consort nv, Tumhout, BEL Röntgenfilm: Amersham HyperfilmTM ECL GE Healthcare UK Ltd, UK Thermomixer: Eppendorf, Hamburg, GER Material und Methoden 30 2.2 Methoden 2.2.1 Versuchstiere Zur Untersuchung der Wirkung einer fettreichen Diät, sog. high fat diet, auf die zerebrale tau-Phosphorylierung wurden C57BL/6-Wildtyp-Mäuse verwendet. Die Tierhaltung sowie die Versuche wurden nach §8 des Tierschutzgesetzes durch die Bezirksregierung Köln genehmigt. 2.2.1.1 Tierhaltung Die Tiere wurden in Makrolon-Käfigen bei einer standardisierten Raumtemperatur von 20-24°C sowie 50-60%iger Luftfeuchtigkeit gehalten. Der Tag-/Nacht-Rhythmus betrug 12 Stunden (07:00 Uhr hell/19:00 Uhr dunkel). Sowohl Nahrungs- als auch Wasserangebot erfolgte ad libitum. Der Zugang zu den Räumlichkeiten des Tierstalles war nur autorisiertem und eingewiesenem Personal gestattet. 2.2.1.2 Tiermodell C57BL/6-Wildtyp-Mäuse wurden 3 Wochen nach Geburt vom Muttertier getrennt. Zu diesem Zeitpunkt erhielt die eine Hälfte der Tiere eine fettreiche Diät (Altromin Art.Nr. 1057), wohingegen die Geschwistertiere mit einer Standarddiät (Altromin Art.-Nr. C 1320) ernährt wurden. 2.2.1.3 Narkotisierung der Tiere Zur Narkose der Mäuse wurden in allen Fällen 100 mg/kg Ketanest und 5 mg/kg Xylazin verwendet. Hierbei handelt es sich um eine Zusammensetzung, die sich aufgrund der schnellen und zuverlässigen Analgesie für eine Kurznarkose bis zu einer Stunde im Rahmen chirurgischer Eingriffe eignet. Da es intraperitoneal verabreicht werden kann, birgt es geringere Gesundheitsrisiken und erfordert einen geringeren technischen Aufwand als die Gabe volatiler Anästhetika. Material und Methoden 31 2.2.2 Metabolische Charakterisierung Um zu überprüfen, ob die Tiere unter der entsprechenden Ernährung tatsächlich eine chronische Hyperinsulinämie entwickeln, wurden bei den Tieren im Alter von 3 Monaten unter Normaldiät bzw. fettreicher Diät die zirkulierenden PlasmainsulinKonzentrationen mittels ELISA (s. 2.2.7) bestimmt. Zudem wurde das Vorliegen einer Insulinresistenz mittels Insulintoleranztest (ITT) und einer Glukosetoleranzstörung mittels Glukosetoleranztest (GTT) untersucht. 2.2.2.1 Glukose-Toleranz-Test (GTT) Vor der Durchführung des GTT wurden die Tiere über Nacht (16 Stunden) nüchtern gehalten. Am Folgetag wurden bei den Tieren vor Beginn des Tests zunächst das Körpergewicht (KG) und der basale Blutglukosewert jedes Tieres bestimmt. Anschließend erfolgte eine intraperitoneale Injektion von 10 µl 20%iger Glukoselösung/g KG in die Peritonealhöhle. Die Blutglukosekonzentrationen wurden mittels einer Blutprobe aus der Schwanzvene zu den Zeitpunkten 15, 30, 60 und 120 Minuten nach Glukoseinjektion mittels Blutzuckermessgerät detektiert. 2.2.2.2 Insulin-Toleranz-Test (ITT) Vor der Durchführung des ITT wurden die entsprechenden Tiere über Nacht (16 Stunden) nüchtern gehalten. Am Folgetag wurde vor Beginn des Tests zunächst das Körpergewicht (KG) und die basale Blutglukosekonzentration jedes Tieres bestimmt. Anschließend erfolgte eine intraperitoneale Injektion von 0,75 mU Insulin/g KG. Die Blutglukosewerte wurden 15, 30 und 60 Minuten nach Injektion mittels Blutzuckermessgerät gemessen. 2.2.3 Insulinstimulation Um zu untersuchen, ob bei den Tieren unter chronischer Hyperinsulinämie durch Gabe eines Insulinbolus ein zusätzlicher stimulierender Effekt auf die Insulinrezeptorsignaltransduktion und tau-Phosphorylierung zu erzielen ist, wurde eine Insulinstimulation durchgeführt. Hierfür wurden Mäuse im Alter von 3 Monaten ab 17:00 Uhr des Vortages nüchtern gehalten und am Folgetag um 8:00 Uhr mithilfe von Ketanest / Xylazin s.c. narkotisiert. Nach Verlust des Fußsohlen- und Material und Methoden 32 Cornealreflexes wurde die Bauchhöhle der Tiere eröffnet und 4 IE Insulin in 100 µl 0,9% steriler Kochsalzlösung in die Vena cava inferior injiziert. Den Kontrolltieren wurden 100 µl 0,9% steriler Kochsalzlösung ohne Insulin auf die gleiche Art verabreicht. In Zeitintervallen von 5 Minuten bis zur Entnahme des Hirngewebes wurden Blutproben aus der Schwanzvene gewonnen und die Blutzuckerkonzentration mit einem tragbaren Blutzuckermessgerät bestimmt. Nach 0, 5, 10, 15 oder 20 Minuten wurde das Hirngewebe entnommen, um eine Proteinextraktion für anschließende Western Blot Analysen durchzuführen. 2.2.4 Gewinnung von Hirngewebe Zur Gewinnung von Hirngewebe wurde den Tieren mit einer chirurgischen Schere der Kopf auf Höhe des zervikalen Rückenmarks abgetrennt und der Rest der Maus verworfen. Mit zwei Schnitten vom Rückenmark, entlang des Ohres Richtung Auge, wurde dann die Kopfschwarte vom Schädel des Tieres entfernt und die Schädelkalotte auf gleichem Weg durchtrennt. Die auf diese Weise mobilisierte Schädeldecke wurde abgehoben und das Gehirn der Maus entfernt. Das gewonnene Gewebe wurde unmittelbar in ein 15 ml Gefäß überführt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert. 2.2.5 Herstellung von Gesamtproteinextrakten Für die Analyse von Proteinen mittels Western Blot Untersuchung wurden Gesamtproteinextrakte hergestellt. Hierzu wurden die Gehirn-Proben zunächst in Organ-Lysepuffer homogenisiert. Die Proteinextraktion wurde anhand von Ganzhirnextrakten von 50-100 µg durchgeführt, welche in 4x SDS Probenpuffer gelöst und danach auf 10% bzw. 15% SDS-PAGE-Gele transferiert wurden. 2.2.5.1 Bestimmung der Proteinkonzentration in Gehirnlysaten nach Bradford Zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen der Gehirnlysate wurde die Proteinbestimmung nach Bradford angewendet. Der Bradford-Assay beruht auf der Anfärbung der Proteine durch Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliantblau G 250 an aromatische oder basische Aminosäuren. Der Kontakt des Farbstoffes mit Material und Methoden 33 den Proteinen führt zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes von rot (595 nm) nach blau (465 nm) in Abhängigkeit von der Menge der vorhandenen Proteine in der Probe. Die zu untersuchenden Lysate wurden gegen einen Standard mit bekannter Proteinkonzentration im Luminometer bei 595 nm gemessen. Hierzu wurde zu Beginn Bradford-Lösung 1:4 mit ddH2O verdünnt. Zur Erstellung einer Standardkurve wurden in einer 96-well-Platte die ersten 7 wells mit BSA befüllt und anschließend mit H2O auf 100 µl Gesamtvolumen aufgefüllt. BSA-Stock: 10 mg/ml und BSA-Verdünnung: 1 mg/ml. well 1 well 2 well 3 well 4 well 5 well 6 well 7 0 µg 1 µg 2,5 µg 5 µg 10 µg 15 µg 20 µg BSA BSA BSA BSA BSA BSA BSA Tab 2.3. Erstellung einer Standardkurve für die Proteinbestimmung mittels Luminometer. Anschließend wurden die folgenden wells mit 1 µl der jeweiligen Proteinprobe und 99 µl Lyse-Mix (9 µl Organlysepuffer, 10 µl 0,1M HCl, 80 µl ddH2O) gemischt. Je Probenansatz wurden 3,5 ml Bradford-Lösung zugegeben und der Probenansatz für mindestens 10 Sekunden gevortext. Im Anschluß folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten, bevor das Probengemisch mittels Luminometer bei 595 nm analysiert wurde. Die Auswertung der so ermittelten Daten erfolgte mittels MikroWin 2000 Application Software (Mikrotek, Version 4.0) und die jeweilige Berechnung der Konzentration anhand der Standardkurve mittels Excel (Microsoft). 2.2.6 Western Blot Mittels Western Blot werden Proteine unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes entsprechend ihrer Größe in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nachfolgend werden die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und so dem Einsatz von spezifischen Antikörpern zugänglich. Der Western Blot ermöglicht so eine hohe Genauigkeit bei der Analyse von Proteinexpression sowohl in Zellen als auch in Überständen bzw. Serum. Material und Methoden 34 2.2.6.1 Auftrennung der Proteine mittels SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) stellt den ersten Teil des Western Blot Verfahrens dar und dient der Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht. Das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) bindet an die durch Hitzebehandlung denaturierten Proteine, wobei die Anzahl der angelagerten SDS-Moleküle proportional zum Molekulargewicht der Polypeptide ist. Im elektrischen Feld erfolgt entsprechend eine Auftrennung der Proteine nach ihrer Ladung respektive ihrem Molekulargewicht. Diese Auftrennung erfolgt dadurch, dass die querveretzten Acrylamidmoleküle der Polyacrylamidgele wie ein Molekularsieb fungieren. Kleinere Proteine können dieses Netz schneller durchqueren als Proteine mit höherem Molekulargewicht. Anhand der Acrylamidkonzentration kann die Dichte dieses Netzes verändert werden. Grundsätzlich wurde bei den verwendeten SDS-Polyacrylamidgelen mit einem 5% Sammelgel gearbeitet, welches eine Fokussierung der Protein und somit einen gleichzeitigen Beginn der Trennung gewährleistet. Das Trenngel enthielt in Abhängigkeit von der Größe des zu untersuchenden Proteins 10-15% Acrylamid. Hochprozentige Acrylamidgele kamen bei hochmolekularen Proteinen zum Einsatz und vice versa. Die Bestandteile wurden gemischt, wobei APS und N,N,N`,N`Tetramethylethylenediamin (TEMED) zuletzt hinzu gegeben wurden, da durch diesen Schritt die Polymerisierung beginnt. Die zu untersuchenden Proteinproben wurden in gleichen Proteinmengen aufgetragen. Um ein Endvolumen von 20 µl zu erhalten, mit welchem je eine Geltasche befüllt wurde, wurden 100 µg des jeweiligen Proteinlysates mit 5 µl 4xSDS als Farbmarker auf 20 µl mit Organlysepuffer aufgefüllt. Diese Probenlösung wurde gevortext, 5 Minuten bei 95 °C inkubiert, um die enthaltenen Proteine zu denaturieren und zuletzt für 5 Minuten abzentrifugiert. Anschließend wurden die Proben in die Geltaschen pipettiert. Um später die Größe des zu untersuchenden Proteins nachvollziehen zu können, wurde bei jedem Gel ein Prestained Protein Marker als Größenstandard mitgeführt. Der Gellauf erfolgte bei 100 Volt für das Sammelgel und 200 Volt für das Trenngel, bis die Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte. Alternativ erfolgte die Elektrophorese über Nacht bei konstant 60 Volt. Als Laufpuffer wurden 100 ml des zehnfach konzentrierten SDS-Laufpuffers auf 1 l mit Aqua bidest aufgefüllt. Material und Methoden 35 2.2.6.2 Semi-dry-blotting Anschließend erfolgte die Übertragung der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran nach dem sogenannten „semi-dry-blotting“Verfahren. Hierbei werden Proteine mit Hilfe eines senkrecht zum Gel angelegten elektrischen Feldes aus dem Gel auf eine Polymer-Membran oder NitrozelluloseMembran übertragen. Auf dieser Membran werden sie aufgrund ionischer und hydrophober Wechselwirkungen fixiert. Zuerst wurden die Elektroden der Blottingapparatur mit Transferpuffer angefeuchtet. Danach wurden sieben Lagen Whatman-Papier auf die Größe des Gels zugeschnitten, mit Transferpuffer getränkt und sodann übereinander geschichtet. Hierbei wurden vier Lagen Whatman-Papier mit AP1 und drei Lagen Whatman-Papier mit AP2 getänkt. Im Anschluss wurde die Nitrozellulose-Membran 1 Minute in Methanol geschwenkt, um sie zu aktivieren und danach in AP2 getaucht. Anschließend wurde die Nitrozellulose-Membran auf die sieben Schichten Whatman-Papier gelegt. Darüber wurde das SDS-PAGE-Gel geschichtet. Hierbei wurde besonders darauf geachtet, dass der Transfer zwischen den einzelnen Schichten nicht durch Luftblasen behindert wurde. Auf das Gel wurden weitere vier Schichten des Whatman-Papieres gelegt, welche zuvor mit CP getränkt wurden. Diese bildeten nun den Kontakt zur Kathode der Apparatur. Der Transfer erfolgte bei 200 mA und einer Spannungsobergrenze von 25 V. Die Transferdauer war abhängig von der Größe der zu übertragenden Proteine und schwankte zwischen 1 Stunde für Proteine um 50 kDa und 2 Stunden für Proteine von 100-200 kDa. Die Vollständigkeit des Transfers wurde anhand des Proteinstandards kontrolliert, welcher vollständig aus dem Gel auf die Nitrozellulose-Membran übertragen wurde. 2.2.6.3 Ponceau S-Färbung Nach dem Transfer der Proteine zwischen Polyacrylamidgel und NitrozelluloseMembran wurde letztere für 5 Minuten in dem wasserlöslichen Farbstoff Ponceau-S geschwenkt und anschließend zweimal mit Aqua bidest gewaschen. Nachdem die angefärbten Proteinbanden sichtbar waren, konnten diese mit den aufgetragenen Proteinkonzentrationen abgeglichen werden. Daraufhin wurden die Membranen 5 Minuten in TBS-T gewaschen, um den Farbstoff zu entfernen. Material und Methoden 36 2.2.6.4 Detektion Vor der Behandlung mit spezifischen Antikörpern sollten die unspezifischen Bindungstellen der Proteine und Membranen blockiert werden. Hierzu wurden die Membranen für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 20 ml Blocking-Lösung 1:10 in Aqua bidest inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem verdünnten Erstantikörper über Nacht bei 4 °C in 5% Milchpulver in TBS-T auf einem Kippschüttler. Die Verdünnung des Erstantikörpers richtete sich dabei nach den jeweiligen Herstellerangaben und erfolgte mit Bocking-Lösung für Antiörper 1:20 verdünnt mit Aqua bidest. Die verwendeten Erstantikörper sowie deren Verdünnung sind der Tab. 2.2 zu entnehmen. Am Folgetag wurden die Membranen fünfmal zehnminütig in Blocking-Lösung geschwenkt, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen. Im Anschluss daran erfolgte eine Inkubation mit dem HRP-gekoppelten sekundären Antikörper für 1 Stunde bei RT. Danach wurden die Membranen erneut fünfmal für 5 min mit TBST gewaschen, um nun den Zweitantikörper zu entfernen. Die Detektion erfolgte mittels „Enhanced Chemiluminescence-Kit“. Die Membranen wurden für je 1 min mit der ECL-Detection-Lösung (im Kit enthalten) luftblasenfrei in einer Frischhaltefolie inkubiert, um ein zwischenzeitliches Austrocknen der Membran zu verhindern. Das entstandene Chemilumineszenssignal wurde mittels Hyperfilm™ ECL Röntgenfilm aufgenommen. Hierzu wurde der Hyperfilm™ 5 Sekunden bis 3 Stunden auf die Membran gelegt, je nach optimaler Belichtungszeit. Die anschließende Entwicklung der Röntgenfilme erfolgte in einer automatischen Entwicklermaschine (AGFA). Nach Detektion der entsprechenden Proteinbanden wurden die Membranen zur Kontrolle der aufgetragenen Proteinkonzentrationen 1 Stunde bei RT mit Aktin-Antikörper inkubiert und das Signal wie oben beschrieben erfasst. Die Quantifizierung der Proteinexpression erfolgt mittels spezieller Computersoftware durch 2D-Densitometrie der eingescannten Röntgenfilme. Material und Methoden 37 2.2.7 ELISA Nach Narkotisierung wurde den Mäusen das Herz mit einer 1 ml-Insulinspritze von unterhalb des Rippenbogens punktiert, um Serum für die ELISA-Untersuchungen zu gewinnen. Der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bezeichnet ein immunologisches Nachweisverfahren, welches auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert. Mittels ELISA können Proteine, aber auch niedermolekulare Verbindungen in einer Probe (Blutserum, Urin, etc.) nachgewiesen werden. Hierbei wird über monoklonale Antikörper das zu untersuchende Antigen in einem ersten Schritt an eine Mikrotiterplatte gebunden. Anschließend erfolgt über Enzym-gekoppelte Antikörper und Zugabe eines entsprechenden Substrats eine enzymatische Farbreaktion, welche mittels Photometer quantifiziert werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde der Insulin (Mouse) Ultrasensitive ELISA EIA-3440 von DRG Diagnostics (Marburg, Germany) entsprechend der Herstellerangaben verwendet. Hierzu wurde eine bereits mit Insulin-Antikörper beschichtete 96-well Mikrotiter-Platte mit der Probe mit dem nachzuweisenden Antigen inkubiert. Während dieser Zeit bindet der in der Beschichtung befindliche Antikörper das in der Probe enthaltene Antigen. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Platte mit Wash Buffer (im Kit enthalten) gewaschen, um alle ungebundenen Bestandteile der Probe zu entfernen. Im nächsten Schritt wurde ein (Detektions-)Antikörper hinzugegeben. In unserem Fall handelte es sich dabei um einen an (Merrettich-)Peroxidase gekoppelten monoklonalen Anti-Insulin Antikörper der Maus. Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen, er richtet sich jedoch gegen ein vom coating-Insulin-Antikörper unterschiedliches Epitop, um eine Interaktion und eine damit einhergehende Blockierung zu vermeiden. Durch erneutes Waschen der Platte wurde der überschüssige zweite Antikörper entfernt. Anschließend erfolgte die enzymatische Farbreaktion mittels p-Nitrophenylphosphat (pNPP, farblos), welches durch die AP in p-Nitrophenol (gelb) und einen Phosphatrest gespalten wurde und photometrisch gemessen wurde. Die Farbintensität was dabei proportional zu der entstandenen Nitrophenolkonzentration und damit auch zu der Konzentration des Antigens in der Probe. 38 3 Ergebnisse Ergebnisse 39 3.1 Einfluss akuter Hyperinsulinämie auf die zerebrale tauPhosphorylierung 12 Monate alter Wildtyp-Mäuse Peripher appliziertes Insulin erreicht innerhalb von 10 Minuten das Gehirn von 8 Wochen alten Wildtyp-Mäusen und aktiviert die zerebrale Insulinrezeptorsignaltransduktion. Außerdem führt diese periphere Hyperinsulinämie bei den Tieren innerhalb von 10 Minuten zu einer vermehrten tau-Phosphorylierung an Ser202, einer Phosphorylierungsstelle, bei der eine Phosphorylierung gehäuft und bereits im frühen Stadium in den „paired helical filaments“ bei Alzheimer-Patienten nachgewiesen werden kann. Die tau-Phosphorylierung an Thr231 verändert sich über einen Zeitraum von 60 Minuten nicht 38. Mit fortschreitendem Alter nimmt die neuronale Expression der Insulinrezeptoren ab. Zudem wird der aktive Transport von Insulin über die Blut-Hirn-Schranke zunehmend schlechter 38 . Bislang unklar ist, ob junge Tiere noch über Kompensations- mechanismen verfügen, die mögliche Effekte einer akuten Hyperinsulinämie mildern. Auf Grundlage dieser Überlegungen sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst untersucht werden, ob bei 12 Monate alten Mäusen die selben Effekte einer akuten Insulinstimulation auf die Phosphorylierung des tau-Proteins nachweisbar sind, wie sie bereits für junge Tieren (8 Wochen alt) gezeigt werden konnten. In vitro-Studien haben ergeben, dass tau an Ser202 durch ERK-2 Ser396 hauptsächlich durch GSK-3β Phosphorylierungsstellen-spezifische 202 Antikörper AT8 (Ser 20 118,149 phosphoryliert tau-Phosphorylierung 231 ), AT180 (Thr und an Thr231, Ser199 und wird. kann durch 199 ), tau pS199 (Ser Diese die 396 ) und tau pS396 (Ser ) nachgewiesen werden. Für die akute Insulinstimulation wurden 12 Monate alte Wildtyp-Mäuse narkotisiert und 4 IE Altinsulin in 100 µl 0,9% NaCl in die Vena cava inferior injiziert. Zu den Zeitpunkten 0, 5, 10, 15 und 20 Minuten wurde das Gehirn der Tiere zur Untersuchung entnommen. Als Kontrolle dienten 12 Monate alte Wildtyp-Mäuse, welchen 100 µl 0,9% NaCl injiziert wurden. Sowohl eine Nahrungskarenz-induzierte Hypoglykämie Hyperglykämie nach Injektion von Desoxyglukose 112 148 als auch eine führen bei Mäusen zu einer Ergebnisse 40 Beeinflussung der tau-Phosphorylierung. Da 4 IE Altinsulin im Verhältnis zum Körpergewicht der Maus eine supra-physiologische Dosis darstellen, wurden über die gesamte Beobachtungszeit von 20 Minuten alle 5 Minuten die Blutglukosewerte der Mäuse gemessen, um Artefakte ausschließen zu können. Abb. 3.1 zeigt den Blutglukose in [mg/dl] Verlauf der Blutglukosewerte über den Versuchszeitraum von 20 Minuten. 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 [min] Abb. 3.1 Blutglukoseverlauf während Insulinstimulation. Nach Insulinstimulation 12 Monate alter Wildtyp-Mäuse mit 4 IE Altinsulin lagen die Blutglukosewerte durchgehend im Normbereich, Hypoglykämien traten nicht auf. Die Tiere zeigten während des gesamten Versuchszeitraums nach Insulinstimulation physiologische Blutglukosewerte. Somit konnte eine Beeinflussung der späteren Versuchsergebnisse durch eine Hypo- oder Hyperglykämie ausgeschlossen werden. Da sich bei der akuten Insulinstimulation 8 Wochen alter Wildtyp-Mäuse eine signifikante Zunahme der tau-Phosphorylierung an Ser202 nachweisen ließ38, sollte in einem ersten Schritt untersucht werden, ob sich der Einfluss einer akuten Hyperinsulinämie auf den Phosphorylierungsstatus von Ser202 bei 12 Monate alten Mäusen bestätigen lässt. Ergebnisse 41 * * * 2,5 * x-faches 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 [min] 20 AT8 Actin 0 5 10 15 [min] 20 202 Abb. 3.2 Ser -tau-Phosphorylierung bei 12 Monate alten Wildtyp-Mäusen nach Injektion von 4 IE Insulin. Oberes Bild: Quantitative Auswertung der Immunoblots (*p<0,05). Unteres Bild: Die Western Blot Analyse von Gehirnlysaten mit Antikörpern gegen AT8 (Ser signifikanten Anstieg der Ser 202 202 ) zeigte einen tau-Phosphorylierung ab dem Zeitpunkt 5 Minuten nach Insulinstimulation (n=7 pro Gruppe und Zeitpunkt). In der Analyse der zerebralen tau-Phosphorylierung ergab sich nach Injektion von 4 IE Insulin ein signifikanter Anstieg der Ser202 tau-Phosphorylierung in Gehirnlysaten von Wildtyp-Tieren ab dem Zeitpunkt 5 Minuten über den gesamten Beobachtungszeitraum von 20 Minuten (n=7 pro Zeitpunkt, p<0,05) (Abb. 3.2). Der stimulierende Effekt einer akuten Hyperinsulinämie auf die tau-Phosphorylierung an Ser202 konnte bei jungen (8 Wochen) wie auch bei alten (12 Monate) Wildtyp-Mäusen nachgewiesen und somit als altersunabhängig bezeichnet werden. In einem weiteren Schritt wurde die tau-Phosphorylierung an Thr231 bei 12 Monate alten Wildtyp-Tieren nach Insulinstimulation untersucht. Diese Phosphorylierungsstelle zeigte bei jungen Tieren keine Beeinflussung durch akute Insulinstimulation. Um zu untersuchen, ob die Phosphorylierung von Thr231 altersabhängig ist, wurde auch bei den älteren Tieren eine akute Insulinstimulation und Messung der Phosphorylierung an Thr231 durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit Hilfe des Antikörpers AT180. Abb. 3.3 zeigt den Immunoblot mit Antikörper AT180 und der entsprechenden Actin-Ladekontrolle sowie die quantitative Auswertung der Western Blots (n=7 pro Gruppe und Zeitpunkt). Ergebnisse 42 x-faches 2 1,5 1 0,5 0 [min] AT180 Actin 0 231 Abb. 3.3 Thr 10 5 20 15 [min] tau-Phosphorylierung bei 12 Monate alten Wildtyp-Mäusen nach Injektion von 4 IE Insulin. Western Blot Analyse der Thr231 tau-Phosphorylierung mit AT180-Antikörper. Die Phosphorylierung an Thr 231 blieb nach intravenöser Injektion von 4 IE Insulin im Beobachtungszeitraum von 20 Minuten weitgehend unverändert. (n=7 pro Gruppe und Zeitpunkt). Aus Gehirnlysaten von 12 Monate alten Insulin-stimulierten Wildtyp-Mäusen wurden Immunoblots mit Antikörper AT180 (Thr231) angefertigt. Die tau-Phosphorylierung an Thr231 zeigte einen leichten, jedoch nicht signifikanten Anstieg nach Stimulation mit 4 IE Insulin. Damit war die tau-Phosphorylierung an Thr231 wie schon bei den jungen Tieren gezeigt auch im Alter nach Insulinstimulation nicht verändert. 3.2 Einfluss einer chronischen Hyperinsulinämie auf die zerebrale tau-Phosphorylierung fettreich ernährter WildtypMäuse Unterschiedliche Mausmodelle 122,124 für einen Diabetes mellitus Typ 2 haben Hinweise darauf erbracht, dass neben einer Insulinresistenz auch andere Faktoren bei der Entstehung der Phosphorylierungsstellen-spezifischen tau-Phosphorylierung eine Rolle spielen. Ein möglicher Faktor könnte eine Hyperinsulinämie sein, welche bereits im Frühstadium des Diabetes mellitus auftritt. Diesbezüglich wurden zur Generierung einer milden chronischen Hyperinsulinämie 8 Wochen und 12-16 Wochen alte Wildtyp-Mäuse fettreich ernährt. Ergebnisse 43 3.2.1 Metabolische Charakterisierung fettreich ernährter WildtypMäuse im Alter von 8 und 12-16 Wochen Um den Einfluss einer milden chronischen Hyperinsulinämie, wie sie bei Typ 2 Diabetikern häufiger zu finden ist, auf den Metabolismus zu untersuchen, wurden 1216 Wochen alte Wildtyptiere unter 15% fettreicher Nahrung gehalten und mit gleich alten Mäusen unter Standarddiät hinsichtlich folgender Kriterien verglichen: Körpergewicht, Insulinkonzentration, Nüchternglukosekonzentration. Glukosetoleranz, Untersucht wurden Insulinresistenz primär zwei und verschiedene Altersgruppen (8 Wochen, 12-16 Wochen). Da sich im Laufe der Analysen jedoch ergab, dass die 8 Wochen alten Wildtyp-Tiere ein nur geringfügig erhöhtes Körpergewicht aufwiesen und die Insulinkonzentration dieser Tiere ebenfalls nur wenig höher war als in der Kontrollgruppe (Daten nicht gezeigt), wurde auf eine weitere Untersuchung dieser Altersgruppe verzichtet. Im folgen werden die Daten der Altersgruppe 12-16 Wochen vorgestellt. 3.2.1.1 Gewichtsverlauf Wildtyp-Mäuse wurden 12-16 Wochen unter 15% fettreicher Nahrung (high fat diet, HFD) gehalten und nach dem entsprechenden Zeitraum das Körpergewicht bestimmt. Als Kontrolle fungierten 12-16 Wochen alte Wildtyp-Tiere unter Standarddiät (STD). 60 * Körpergewicht [g] 50 40 30 20 10 0 STD HFD Abb. 3.4 Körpergewicht STD und HFD im Vergleich. Der Vergleich 12-16 Wochen alter WildtypMäuse unter Standarddiät (n=7) bzw. fettreicher Diät (n=6) zeigte eine signifikante Zunahme des Körpergewichtes unter fettreicher Nahrung (*p<0,01). Ergebnisse 44 Nach 12-16 Wochen zeigte sich bei den fettreich ernährten Tieren im Vergleich zu Tieren unter Standarddiät eine signifikante Zunahme des Körpergewichts. Die Tiere unter Standarddiät (n = 7) hatten im Mittel ein Körpergewicht von 32,2 g, während das Körpergewicht der Mäuse unter fettreicher Nahrung 47,8 g betrug (p<0,01). Die fettreiche Ernährung führte somit zu einer signifikanten Gewichtszunahme um rund 48%. Abb. 3.5 Fotographie eines 12-16 Wochen alten Wildtyp-Tieres unter Standarddiät (oben) und einer gleichaltrigen Wildtyp-Maus unter Diät mit 15% Fettanteil (unten) im Alter von 1216 Wochen. Ergebnisse 45 3.2.1.2 Verlauf der Seruminsulinkonzentration Um den Einfluss fettreicher Nahrung auf die Insulinkonzentration zu untersuchen, wurden die Seruminsulinkonzentrationen in beiden Gruppen durch regelmäßige Blutentnahmen überwacht. Abbildung 3.6 zeigt die vergleichende Auswertung beider Gruppen hinsichtlich ihrer Insulinkonzentrationen bei 12-16 Wochen alten Tieren (n=5-6). 6 * 5 Insulin [µg/l] 4 3 2 1 0 STD HFD Abb. 3.6 Insulinkonzentration bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen. Vergleich von Tieren unter Standarddiät (STD) und fettreicher (15%) Diät (HFD) hinsichtlich ihrer Insulinkonzentration im Alter von 12-16 Wochen. Die Mäuse unter HFD zeigten 2,4fach erhöhte Insulinkonzentrationen. Die Daten sind Mittelwerte ±SEM (n=5-6). Bezüglich der Insulinkonzentration ergab sich bei den Tieren unter STD im Mittel eine Konzentration von 1,69 µg/L Insulin im Serum. Verglichen mit der STD zeigte die fettreich ernährte Gruppe mit 4,121 µg/L eine signifikant erhöhten Seruminsulinkonzentration (p=0,007) (n=7). Somit ergaben sich für die 12-16 Wochen alten Tiere unter HFD 2,4-fach erhöhte Insulinkonzentrationen. Ergebnisse 46 3.2.1.3 Insulin- und Glukosetoleranztestung, Nüchternblutglukosespiegel Ziel dieses Modells ist die Fokussierung der Untersuchung auf das prädiabetische Stadium und dementsprechend auf eine chronische, milde Hyperinsulinämie vor Eintreten einer Insulinresistenz. Hierzu wurden die Tiere im Rahmen eines Insulintoleranztests (ITT) hinsichtlich einer eventuell bestehenden Insulinresistenz untersucht. Abbildung 3.7 erläutert den Vergleich der Tiere unter STD und HFD bezüglich ihres Abschneidens im Rahmen des Insulintoleranztests. 100 [% des Ausgangswertes] Blutglukoseabnahme 90 80 70 60 50 40 MW STD 30 MW HFD 20 10 0 0 15 30 60 [min] Abb. 3.7 ITT bei 12-16 Wochen alten Tieren unter STD oder HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM, (n=12/Gruppe). Die Ergebnisse zeigten, dass die verwendete fettreiche Ernährung im direkten Vergleich mit Standarddiät nicht zu einer veränderten Insulintoleranz im ITT führt. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass eine Hyperglykämie zu einer Beeinflussung der Aktivität der Insulinrezeptorsignaltransduktion und auch der tauPhosphorylierung führen kann 111 . Um zu vermeiden, dass solche Effekte auch hier eine Rolle spielen, wurden alle Tiere bezüglich ihrer Glukosetoleranz untersucht. Ergebnisse 47 350 ■ MW STD Blutglukose [mg/dl] 300 ♦ MW HFD 250 200 150 100 50 0 0 15 30 60 120 [min] Abb. 3.8 Glukosetoleranz-Test bei 12-16 Wochen alten Tieren unter STD oder HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM, (n=12/Gruppe). Der Glukosetoleranztest der Tiere unter STD und HFD zeigte, dass die fettreiche Ernährung nicht zu einer veränderten Gluosetoleranz führt. Eine etwaige Beeinflussung der Ergebnisse durch eine veränderte Glukosetoleranz kann somit ausgeschlossen werden. 3.2.2 Analyse der Insulinrezeptor-Signaltransduktion in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen Nachdem im Rahmen der bereits beschriebenen Ergebnisse eventuelle Einflüsse von Hypo- oder Hyperglykämie und Insulinresistenz ausgeschlossen wurden, sollte im Folgenden der Einfluss einer milden, chronischen Hyperinsulinämie auf die an der Signaltransduktion des Insulin- und Glukosestoffwechsels beteiligten Kinasen bezüglich ihrer Aktivität (Phosphorylierungsstatus) als auch ihrer Expression untersucht werden Wie in Abb. 1.9 ersichtlich, teilt sich die IR-Signaltransduktionskaskade in zwei Wege der Signalweiterleitung. Die Aktivierung beider Wege wurde untersucht, zudem CDK5 und PTP1B. Letztere sind Proteine, bei denen entweder der Stellenwert im Glukosestoffwechsel bisher nur ungenügend geklärt ist oder deren Position in der Insulinrezeptorsignaltransduktion nicht eindeutig einem der beiden genannten Wege Ergebnisse 48 zugeordnet werden kann. Diese sollen im Anschluss an die beiden prominenten Wege der Insulinrezeptorsignaltransduktion behandelt werden. Ferner wurde eine Beeinflussung von PP2A, der wichtigsten tau-Phosphatase, analysiert, da die Aktivität von PP2A einen bedeutenden Einfluss auf den Phosphorylierungsstatus des tau-Proteins hat. 3.2.2.1 Proteine des PI3-Kinase-Wegs - pAKT/AKT & pGSK-3β β/GSK-3β β Wichtiger Bestandteil des PI3-Kinase-Wegs ist AKT (Proteinkinase B). Ihre Hauptaufgabe im Rahmen der Signalweiterleitung ist die Regulation der Transkription durch Beeinflussung von Transkriptionsfaktoren wie FOXO, sowie auch die Regulation der Translokation von GLUT4-Rezeptoren an die Zellmembran. AKT ist phosphoryliert aktiv und inhibiert GSK-3β (Glykogen-synthase-kinase-3β) durch Phosphorylierung. Dies ist insbesondere wichtig, weil eine aktive GSK-3β zu einer Phosphorylierung des tau-Proteins führt. x-faches 1,5 1 0,5 0 pAKT AKT STD HFD 473 Abb. 3.9 Western Blot Analyse von pAKT(Ser )/AKT bei 12-16 Wochen alten Wildtyp- Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten mit Antikörper gegen pAKT und anti-AKT als entsprechender Ladekontrolle. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich im Hinblick auf den Phosphorylierungsgrad keine signifikante Veränderung. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Ergebnisse 49 x-faches 1,5 1 0,5 0 AKT Actin STD HFD Abb. 3.10 Western Blot Analyse von AKT bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten durch Antikörper gegen AKT und Actin als entsprechender Ladekontrolle zur Detektion der Proteinexpression. Im Vergleich von WildtypMäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich im Hinblick auf die Proteinexpression keine signifikante Veränderung. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). x-faches 1,5 1 0,5 0 pGSK-3β GSK STD HFD 9 Abb. 3.11 Western Blot Analyse von pGSK(Ser )/GSK bei 12-16 Wochen alten WildtypMäusen unter STD und HFD. Untersuchung der Phosphorylierung von GSK mittels Western Blot Analyse. Als Antikörper wird anti-pGSK-3β und als Ladekontrolle Antikörper für unphosphoryliertes GSK-3β verwendet. Im Vergleich von Wildtypmäusen unter STD und HFD zeigte sich die Aktivität GSK-3β unbeeinflusst. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Ergebnisse 50 x-faches 1,5 1 0,5 0 GSK Actin STD HFD Abb. 3.12 Western Blot Analyse von GSK-3β bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Untersuchung der Proteinexpression von GSK-3β mittels Western Blot mit antipGSK-3β als Antikörper für GSK-3β, bzw. als Ladekontrolle Actin. Im Vergleich von Wildtypmäusen unter STD und HFD zeigt sich die Expression von GSK-3β unbeeinflusst. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Die Untersuchung 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere mittels Western Blot Analyse von AKT und GSK-3β als Bestandteile des PI3-Kinase-Wegs zeigte weder auf Aktivitäts- noch auf Expressionsebene eine Beeinflussung durch fettreiche Nahrung. 3.2.2.2 Proteine des MAP-Kinasen-Wegs – pERK/ERK & pJNK/JNK Die Kinasen ERK-1 und -2 sind in phosphoryliertem Zustand aktiv. Sie beeinflussen nach ihrer Translokation in den Zellkern Transkriptionsfaktoren wie c-fos und Elk-1. pJNK ist ein weiterer wichtiger Bestandteil des MAP-Kinasen-Wegs und beeinflusst ebenfalls nach Translokation in den Zellkern Transkriptionsfaktoren. Hierbei handelt es sich vor allem um c-jun. Sowohl ERK -1 und -2 als auch JNK sind darüber hinaus bekannte tau-Kinasen. Ergebnisse 51 Die Gehirnlysate 12-16 Wochen alter Tiere wurden mittels Western Blot Analyse untersucht. Zur Messung der Phosphorylierung von ERK-1/-2 und JNK wurde der jeweilige anti-phospho-Antikörper (anti-pERK-1/-2 und anti-pJNK) eingesetzt. Als Ladekontrolle wurde der entsprechende Antikörper gegen die unphosphorylierte Kinase (anti-ERK-1/-2 und anti-JNK) verwendet. Um die Proteinexpression zu untersuchen, wurden die jeweils unphosphorylierten Kinasen mittels anti-ERK-1/-2 oder anti-JNK nachgewiesen und diese Werte auf die Ergebnisse der Ladekontrolle anti-Actin normiert. x-faches 1,5 1 0,5 0 pERK ERK STD HFD 202 Abb. 3.13 Western Blot Analyse von pERK-1/-2(Thr 204 /Tyr )/ERK-1/-2 bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten durch Antikörper gegen pERK-1/-2 und anti-ERK-1/-2 als entsprechender Ladekontrolle. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich im Hinblick auf den Phosphorylierungsgrad und somit die Aktivität von ERK-1/-2 keine Veränderung. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Ergebnisse 52 x-faches 1,5 1 0,5 0 ERK Actin STD HFD Abb. 3.14 Western Blot Analyse von ERK-1/-2 bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten durch Antikörper gegen ERK-1/-2 und Actin als entsprechender Ladekontrolle zur Detektion der Proteinexpression. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich die Proteinexpression von ERK-1/-2 unbeeinflusst. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. x-faches 1,5 1 0,5 0 pJNK JNK STD HFD 183 Abb. 3.15 Western Blot Analyse von pJNK(Thr 185 /Tyr )/JNK bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten durch Antikörper gegen pJNK und JNK als entsprechender Ladekontrolle zur Detektion des Phosphorylierungsgrades. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich die Phosphorylierung und somit die Aktivität von JNK unbeeinflusst. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 53 Eine milde chronische Hyperinsulinämie bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Tieren führte weder bei den tau-Kinasen ERK -1 und -2 noch bei der tau-Kinase JNK zu einer signifikanten Beeinflussung sowohl der Aktivität als auch der Proteinexpression. Daher ist davon auszugehen, dass eine mögliche Beeinflussung der tau-Phosphorylierung im Rahmen einer milden Hyperinsulinämie nicht über den MAP-Kinasen-Weg vermittelt wird. 3.2.2.3 PTP1B, PP2A und CDK-5 PTP1B dephosphoryliert sowohl den Insulinrezeptor als auch IRS-1 69 und ist somit ein wichtiger Modulator der Insulinwirkung. PTP1B wird nicht durch Phosphorylierung aktiviert und wurde deshalb nur hinsichtlich der Proteinexpresssion untersucht. PP2A ist eine der wichtigsten tau-Phosphatasen. Es scheint als Inhibitor von AKT zu fungieren und ist ferner in der Lage, das tau-Protein zu dephosphorylieren. Hier wurde die katalytische Untereinheit der Phosphatase PP2A untersucht. CDK-5 (cyklin-dependent-kinase-5) ist eine tau-Kinase, die in der Lage ist, das tau-Protein an den Epitopen Ser202, Thr205 und Ser404 zu phosphorylieren 92. x-faches 1,5 1 0,5 0 PTP1B Actin STD HFD Abb. 3.16 Western Blot Analyse von PTP1B bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten mit anti-PTP1B und Ladekontrolle antiActin zur Detektion der Proteinexpression. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich die Proteinexpression von PTP1B unverändert. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von drei Lysaten nach STD im Vergleich zu drei Lysaten nach HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 54 x-faches 1,5 1 0,5 0 PP2A Actin STD HFD Abb. 3.17 Western Blot Analyse von PP2A bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten mit anti-PP2A (katalytische Untereinheit) und Ladekontrolle anti-Actin zur Detektion der Proteinexpression. Im Vergleich von WildtypMäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich die Proteinexpression von PP2A unverändert. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. x-faches 1,5 1 0,5 0 CDK-5 Actin STD HFD Abb. 3.18 Western Blot Analyse von CDK-5 bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse von Gehirnlysaten mit anti-CDK-5 und Ladekontrolle antiActin zur Detektion der Proteinexpression. Im Vergleich von Wildtyp-Mäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt sich die Proteinexpression von CDK-5 unverändert. Die Western Blot Analysen zeigen exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 55 Die Analyse der Gehirnlysate 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere unter STD bzw. HFD hinsichtlich der Proteinexpression ergab weder für PTP1B und PP2A noch für CDK-5 eine Beeinflussung durch fettreiche Ernährung (Abb. 3.17 - 3.19). Eine durch HFD induzierte, milde chronische Hyperinsulinämie scheint somit keine Auswirkungen auf diese drei Proteine des Glukose- und Insulinstoffwechsels zu haben. 3.2.3 Epitop-spezifische tau Phosphorylierung in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen Da es im Rahmen einer akuten Insulinstimulation sowohl bei den jungen (8 Wochen) als auch den alten Tieren (12 Monate) zu einer gesteigerten Phosphorylierung an Ser202 des tau-Proteins kam, wurden auch die Tiere unter HFD hinsichtlich ihrer tauPhosphorylierung untersucht. Im Fokus lagen hierbei die tau- Phosphorylierungsstellen, bei denen bereits im frühen Stadium des Morbus Alzheimer eine Hyperphosphorylierung in neurofibrillären tangles beschrieben ist. Die im Rahmen der akuten Insulinstimulation untersuchten Epitope wurden durch die Phosphorylierungsstelle Thr181 ergänzt, da es sich hierbei, wie auch bei Ser202, um ein Epitop handelt, welches ERK-abhängig phosphoryliert wird 149. 3.2.3.1 tauSer202/Thr181 Die Phosphorylierung an Ser202 wird durch den Antikörper AT8 nachgewiesen. AT270 dient als Antikörper für die Untersuchung von Thr181. Die Phosphorylierung an Ser202 und Thr181 wird als ERK-abhängig diskutiert 148 . Die Abbildungen 3.20 und 3.21 zeigen die Western Blot Analysen dieser beiden Phosphorylierungsstellen des tau-Proteins. Ergebnisse 56 x-faches 1,5 1 0,5 0 AT8 Actin HFD STD Abb. 3.19 Western Blot Analyse der tau-Phosphorylierung an Ser 202 bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse und quantitative Auswertung der tau-Phosphorylierung an Ser 202 mittels Antiköper AT8 und Ladekontrolle anti-Actin. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis dreier Lysate nach STD im Vergleich zu drei Lysaten nach HFD. Der Vergleich von 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt hinsichtlich der Phosphorylierung des tau-Proteins an Ser 202 keinen signifikanten Einfluss der HFD (n=5-7). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. * x-faches 1,5 1 0,5 0 AT270 Actin STD HFD 181 Abb. 3.20 Einfluss von HFD auf die Phosphorylierung von Thr bei 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse und quantitative Auswertung der Phosphorylierung an Thr 181 des tau-Proteins mittels Antikörper AT270. Als Ladekontrolle wurde anti-Actin verwendet. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach STD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD. Der Vergleich von 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD mit Tieren unter HFD zeigt hinsichtlich der Phosphorylierung des tau-Proteins eine signifikant gesteigerte Phosphorylierung an Thr (*p<0,05). Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). 181 Ergebnisse 57 Die Western Blot Analyse der Gehirnlysate 12 Monate alter Wildtyp-Mäuse unter Standard- bzw. fettreicher Diät zeigte eine signifikant gesteigerte Phosphorylierung an Thr181 unter fettreichen Bedingungen, allerdings keinen messbaren Einfluss der HFD-induzierten Hyperinsulinämie auf den Phosphorylierungsgrad des tau-Epitops Thr202 (p<0,05) (n=5-7). Somit steigert eine akute Insulinstimulation die Phosphorylierung von Ser202, eine milde chronische Hyperinsulinämie führt jedoch nicht zu einer Beeinflussung. Dem entgegengesetzt führt die HFD-induzierte Hyperinsulinämie zu einer schwachen Steigerung der tau-Phosphorylierung an Thr181, welche nach akuter Insulinstimulation nicht nachgewiesen werden konnte. 3.2.3.2 Der tauSer199/Thr231/Ser396 Antikörper pS199 ist 199 Phosphorylierung an Ser ein spezifischer Antikörper zur Detektion der des tau-Proteins. AT180 ist ein spezifischer Antikörper zur Detektion der Phosphorylierung an Thr321. Der Antikörper pS396 fungiert zum Nachweis einer vermehrten Phosphorylierung an Ser396 des tau-Proteins. x-faches 1,5 1 0,5 0 pS396 Actin STD HFD 396 Abb. 3.21 Einfluss von HFD auf die Phosphorylierung von Ser bei 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse und quantitative Auswertung der tauPhosphorylierung an Ser 396 bei Gehirnlysaten 12 Monate alter Wildtyp-Tiere unter STD oder HFD. Verwendet wurde der Antikörper pS396 sowie als Ladekontrolle anti-Actin. Es zeigte sich keine Beeinflussung der tau-Phosphorylierung an Ser 396 durch HFD-induzierte Hyperinsulinämie. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von drei Lysaten nach STD im Vergleich zu drei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Ergebnisse 58 x-faches 1,5 1 0,5 0 AT180 Actin STD HFD 321 Abb. 3.22 Einfluss von HFD auf die Phosphorylierung von Thr bei 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse und quantitative Auswertung der tau-Phosphorylierung an Thr 231 bei Gehirnlysaten 12 Monate alter Wildtyp-Tiere unter STD oder HFD. Verwendet wurde der Antikörper AT180 sowie als Ladekontrolle anti-Actin. Es zeigte sich keine Beeinflussung der tau-Phosphorylierung an Thr 231 durch HFD-induzierte Hyperinsulinämie. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von drei Lysaten nach STD im Vergleich zu drei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). 1,5 x-faches 1 0,5 0 pS199 Actin STD HFD 199 Abb. 3.23 Einfluss von HFD auf die Phosphorylierung von Ser bei 12-16 Wochen alten Wildtypmäusen unter STD und HFD. Western Blot Analyse und quantitative Auswertung der Phosphorylierung an Ser 199 bei Gehirnlysaten 12 Monate alter Wildtyp-Tiere unter STD oder HFD. Verwendet wurde der Antikörper pS199 sowie als Ladekontrolle anti-Actin. Mittels Western Blot Analyse zeigt sich keine Beeinflussung der tau-Phosphorylierung an Ser 199 durch HFD-induzierte Hyperinsulinämie. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von drei Lysaten nach STD im Vergleich zu drei Lysaten nach HFD. Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=5-7). Ergebnisse 59 Die Gehirnlysate von 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter Standard- bzw. 15% fettreicher Diät wurden mittels Western Blot Analyse im Hinblick auf ihre Phosphorylierung an den Epitopen Ser199, Thr231 und Ser396 des tau-Proteins untersucht. Verwendet wurden die Antikörper pS199, AT180 und pS396 und antiActin als Ladekontrolle. Vergleicht man die quantitativen Auswertungen der Western Blot Analysen, so hat eine fettreiche Diät über 12-16 Wochen keinen signifikanten Einfluss auf die tau-Phosphorylierung an den genannten drei Phosphorylierungsstellen. 3.2.4 Analyse der IR-Signaltransduktion in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen nach akuter Insulinstimulation Da gezeigt werden konnte, dass eine akute Insulinstimulation sowohl bei 8 Wochen als auch 12 Monate alten Wildtyp-Mäusen zu einer gesteigerten Phosphorylierung des tau-Epitopes Ser202 führt und des weiteren eine Nahrungs-induzierte chronische milde Hyperinsulinämie zu einer signifikanten Zunahme der Phosphorylierung von Thr181 führt, stellte sich die Frage, ob die Phosphorylierung des tau-Proteins bei hyperinsulinämen Tieren durch eine akute Insulinstimulation zusätzlich beeinflusst werden kann. Hierzu wurden Wildtyp-Mäuse unter 15% fettreicher Nahrung gehalten. Im Alter von 12-16 Wochen wurde entsprechend dem bereits verwendeten Versuchsaufbau eine akute Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin durchgeführt und den Mäusen 10 Minuten nach Insulininjektion die Gehirne entnommen, um sie mittels Western Blot Analyse zu untersuchen. Der Zeitpunkt 10 Minuten nach Injektion wurde gewählt, weil bereits in Vorarbeiten gezeigt wurde, dass peripher appliziertes Insulin binnen 10 Minuten zu einer signifikanten Steigerung der zerebralen tauPhosphorylierung führt 38. Da bei der akuten Insulinstimulation 12 Monate alter Wildtyp-Mäuse (s. Abb 3.1) keine Hypoglykämien zu verzeichnen waren, können auch hypoglykämische Ereignisse bei den fettreich ernährten, 12-16 Wochen alten Mäusen unter akuter Insulinstimulation ausgeschlossen werden. Ergebnisse 60 Blutglukose in [mg/dl] 200 150 100 50 0 0 min 5 min 10 min Abb. 3.24 Blutglukoseverlauf während Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Tieren unter HFD. Während Insulinstimulation 12-16 Wochen alter Wildtyp-Mäuse mit 4 IE Altinsulin lagen die Blutglukosewerte durchgehend im Normbereich, Hypoglykämien traten nicht auf. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-7). 3.2.4.1 Expression des Insulinrezeptors In einem ersten Schritt wurde untersucht, ob eine akute Insulinstimulation bei vorbestehender Hyperinsulinämie einen Einfluss auf die Expression des Insulinrezeptors hat. Als Antikörper wurde IRβ verwendet. x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin IRβ Actin Abb. 3.25 Western Blot Analyse von IRβ nach akuter Insulinstimulation mit 4 IE bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter fettreicher Diät. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten insulinstimulierter Tiere unter HFD im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Es zeigt sich im Hinblick auf die Expression des IRβ keine Veränderung im Rahmen einer akuten Insulinstimulation (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 61 Vergleicht man die Expression des Insulinrezeptors von Kontrolltieren und Tieren nach akuter Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin, so zeigt sich kein signifikanter Einfluss der zusätzlichen Insulininjektion unter fettreicher Ernährung. 3.2.4.2 Der PI3-Kinase-Weg - pAKT/AKT & pGSK-3β β/GSK-3β β In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob eine zusätzliche Insulinstimulation bei vorbestehender Hyperinsulinämie einen Einfluss auf den PI3-Kinasen-Weg hat. Da es sich bei AKT (Proteinkinase B) um einen wichtigen Bestandteil des PI3-KinaseWegs handelt, wird zum einen die Expression und zum anderen der Phosphorylierungsstatus von AKT untersucht und mit den Ergebnissen von Kontrolltieren verglichen, denen bei gleicher fettreicher Ernährung 0,9% NaCl statt Altinsulin injiziert wurde. Ebenso wird mit GSK-3β verfahren, einer tau-Kinase, die durch AKT phosphoryliert und somit hinsichtlich der Aktivität beeinflusst werden kann. 1,5 x-faches 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pAKT AKT Actin 473 Abb. 3.26 Western Blot Analyse von pAKT(Ser )/AKT nach akuter Insulinstimulation mit 4 IE bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter fettreicher Kost. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten unter HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigt sich weder im Hinblick auf den Phosphorylierungsgrad, noch auf die Expression von AKT eine Veränderung im Rahmen einer akuten Insulinstimulation im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 62 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pGSK-3β GSK-3β Actin 9 Abb. 3.27 Western Blot Analyse von pGSK-3β (Ser )/GSK-3β nach akuter Insulinstimulation mit 4 IE bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter fettreicher Diät. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten unter HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD weder der Phosphorylierungsgrad, noch die Expression von GSK-3β unter akuter Insulinstimulation signifikant beeinflusst (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die vergleichende Untersuchung 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere unter fettreicher Nahrung nach akuter Stimulation und entsprechend ernährten Kontrolltieren mittels Western Blot Analyse von AKT und GSK-3β zeigte weder auf Expressionsebene noch im Hinblick auf den Phosphorylierungsstatus der Kinasen eine Beeinflussung durch akute Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin. Eine zusätzliche Insulinstimulation bei vorbestehender Hyperinsulinämie verändert somit weder die Expression noch die Aktivität der Kinasen des PI3-Kinase-Wegs. 3.2.4.3 Der MAP-Kinasen-Weg – pERK-1/-2/ERK-1/-2 & pJNK/JNK In einem weiteren Schritt wurden auch die Kinasen ERK-1/-2 und JNK als Bestandteile des MAP-Kinasen-Wegs hinsichtlich einer Beeinflussung von Expression und Phosphorylierungsstatus durch akute Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin bei fettreich ernährten Wildtyp-Tieren untersucht. Beide Kinasen werden durch Phosphorylierung aktiviert, translozieren in diesem Zustand in den Zellkern und beeinflussen dort unter anderem verschiedene Transkriptionsfaktoren. Ergebnisse 63 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pERK-1/-2 ERK-1/-2 Actin 202 Abb. 3.28 Western Blot Analyse von pERK-1/-2(Thr 204 /Tyr )/ERK-1/-2 nach akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich nach akuter Insulinstimulation keine signifikanten Veränderungen des Phosphorylierungsgrades oder der Expression von ERK-1/-2 im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-6). x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pJNK JNK Actin 183 Abb. 3.29 Western Blot Analyse von pJNK(Thr 185 /Tyr )/JNK nach akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich nach akuter Insulinstimulation keine signifikanten Veränderungen des Phosphorylierungsgrades oder der Expression von JNK im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-6). Ergebnisse 64 Analysiert wurden die Gehirnlysate der Wildtyp-Tiere nach akuter Insulinstimulation mit 4 IE und Kontrolltieren nach Injektion von 0,9% NaCl-Lösung. Den Abbildungen 3.28 und 3.29 ist zu entnehmen, dass weder die Proteinexpression von ERK oder JNK noch der Phosphorylierungsstatus der beiden Kinasen durch eine akute Insulinstimulation signifikant moduliert wurde. 3.2.4.4 PTP1B, PP2A und CDK-5 Da die Proteine PTP1B, PP2A und CDK-5 selbst nicht Insulin-unabhängig phosphoryliert werden, wurden sie lediglich hinsichtlich ihrer Proteinexpression unter fettreicher Diät und akuter Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin untersucht. x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin PTP1B Actin Abb. 3.30 Western Blot Analyse von PTP1B/Actin nach akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich nach akuter Insulinstimulation keine signifikanten Veränderungen der Expression von PTP1B im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-6). Ergebnisse 65 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin PP2A Actin Abb. 3.31 Western Blot Analyse von PP2A/Actin nach akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich nach akuter Insulinstimulation keine signifikanten Veränderungen der Expression von PP2A im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-6). x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin CDK-5 Actin Abb. 3.32 Western Blot Analyse von CDK-5/Actin nach akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Bei Wildtyp-Mäusen unter HFD zeigen sich nach akuter Insulinstimulation keine signifikanten Veränderungen der Expression von CDK-5 im Vergleich zu Kontrolltieren unter HFD. Daten sind Mittelwerte ± SEM (n=5-6). Aus der Analyse der Gehirnlysate 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere unter HFD hinsichtlich der Proteinexpression ergab sich weder für PTP1B oder PP2A noch für CDK-5 eine Beeinflussung durch additive Insulinstimulation bei chronischer milder Hyperinsulinämie. Ergebnisse 66 3.2.5 Epitop-spezifische tau-Phosphorylierung in Gehirnlysaten fettreich ernährter Wildtyp-Mäuse im Alter von 12-16 Wochen nach zusätzlicher Insulinstimulation Da eine akute Insulinstimulation sowohl bei jungen als auch alten Tieren zu einer gesteigerten Phosphorylierung Ser202 an des tau-Proteins führt, wurden anschließend auch die Tiere unter fettreicher Nahrung hinsichtlich der Frage untersucht, ob die tau-Phosphorylierung bei chronischer Hyperinsulinämie unter fettreicher Nahrung zusätzlich durch akute Insulinstimulation modifiziert werden kann. Erneut wurden solche tau-Phosphorylierungsstellen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie bereits im frühen Stadium des Morbus Alzheimer in neurofibrillären tangles hyperphosphoryliert sind. 3.2.5.1 tauSer202/Thr181 In ersten einem Phosphorylierung Schritt von soll Ser202 untersucht bei werden, fettreicher ob Nahrung die ERK-abhängige und nachgewiesener chronischer, milder Hyperinsulinämie durch eine akute Insulinstimulation mit 4 IE Altinsulin zusätzlich beeinflusst werden kann, wie es bei Tieren gleichen Alters ohne chronische Hyperinsulinämie bereits gezeigt werden konnte. x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin AT8 Actin 202 Abb. 3.33 Einfluss akuter Insulinstimulation auf die tau-Phosphorylierung an Ser bei Tieren unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Der Vergleich von 12-16 Wochen alten Wildtyp-Tieren unter STD respektive HFD nach akuter Insulinstimulation zeigt hinsichtlich der Phosphorylierung des tauProteins an Ser 202 keine signifikante Veränderung (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 67 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin AT270 Actin 181 Abb. 3.34 Einfluss akuter Insulinstimulation auf die tau-Phosphorylierung an Thr bei Tieren unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von vier Lysaten nach HFD. Der Vergleich von 12-16 Wochen alten Wildtyp-Tieren unter HFD mit entsprechend ernährten Tieren nach zusätzlicher akuter Insulinstimulation zeigt hinsichtlich der Phosphorylierung des tau-Proteins an Thr 181 keine signifikante Veränderung (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die akute Insulinstimulation 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere unter fettreicher Diät zeigte keinen signifikanten Einfluss der Kombination aus Hyperinsulinämie und akuter Insulinstimulation auf die Phosphorylierung des tau-Proteins an Ser181. 3.2.5.2 tauSer199/Thr231/Ser396 Ser199 und Thr231 werden als GSK-3β-abhängige Phosphorylierungsstellen diskutiert. Bei Ser396 handelt es sich um eine Phosphorylierungsstelle, welche sowohl durch GSK-3β als auch durch ERK phosphoryliert zu werden scheint. Der Antikörper pS199 diente der spezifischen Detektion der Phosphorylierung an Ser199 des tau-Proteins. AT180 ist ein spezifischer Antikörper zur Analyse der Phosphorylierung an Thr231. Der Phosphorylierungsstatus von Ser396 des tau-Proteins wurde mit Hilfe des Antikörpers pS396 gemessen. Ergebnisse 68 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pS199 Actin 199 Abb. 3.35 Einfluss akuter Insulinstimulation auf die tau-Phosphorylierung an Ser bei Tieren unter HFD. Vergleich von Gehirnlysaten 12-16 Wochen alter Wildtyp-Tiere unter HFD nach akuter Insulinstimulation und Kontrolltieren unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von zwei Lysaten nach HFD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD und akuter Insulinstimulation. Es zeigt sich an diesem Epitop keine Beeinflussung der tau-Phosphorylierung durch akute Insulinstimulation und HFD (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin AT180 Actin 231 Abb. 3.36 Einfluss akuter Insulinstimulation auf die tau-Phosphorylierung an Thr bei Tieren unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von zwei Lysaten nach HFD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD und akuter Insulinstimulation. Mittels Western Blot Analyse zeigt sich an diesem Epitop keine Beeinflussung der tauPhosphorylierung durch akute Insulinstimulation und chronische Hyperinsulinämie (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 69 x-faches 1,5 1 0,5 0 HFD HFD + Insulin pS396 Actin 396 Abb. 3.37 Einfluss akuter Insulinstimulation auf die tau-Phosphorylierung an Ser bei Tieren unter HFD. Die Western Blot Analyse zeigt exemplarisch ein repräsentatives Ergebnis von zwei Lysaten nach HFD im Vergleich zu zwei Lysaten nach HFD und akuter Insulinstimulation bei 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen. Mittels Western Blot Analyse zeigt sich an Ser 396 keine Beeinflussung der tau-Phosphorylierung durch akute Insulinstimulation unter HFD (n=5-6). Daten sind Mittelwerte ± SEM. Die Gehirnlysate von 12-16 Wochen alten Wildtyp-Mäusen unter fettreicher Diät wurden mittels Western Blot Analyse im Hinblick auf eine veränderte Phosphorylierung an den Epitopen Ser199, Thr231 und Ser396 des tau-Proteins nach akuter Insulinstimulation untersucht. Als Kontrolltiere dienten 12-16 Wochen alte Wildtyp-Mäuse unter fettreicher Nahrung, welchen 0,9%ige NaCl Lösung statt des Altinsulins appliziert wurde. Zur Detektion der Phosphorylierung wurden die Antikörper pS199, AT180 und pS396 und als jeweilige Ladekontrolle anti-Actin verwendet. Vergleicht man die quantitativen Auswertungen der Western Blot Analysen, so hat eine akute Insulinstimulation weder auf die tau-Phosphorylierung an den genannten drei Phosphorylierungsstellen bei Tieren unter fettreicher Diät noch bei Tieren unter Standarddiät einen signifikanten Einfluss. 70 4 Diskussion Diskussion 71 Sowohl Diabetes mellitus Typ 2 als auch Morbus Alzheimer sind chronische, Altersassoziierte Erkrankungen. Aktuell sind in Deutschland etwa 5,5 Millionen Menschen von DM2 betroffen. Schätzungen gehen jedoch davon aus, dass die Anzahl Erkrankter von weltweit 171 Millionen im Jahr 2000 auf über 360 Millionen im Jahr 2030 ansteigt 146 . Ursächlich hierfür sind neben genetischer Prädisposition und Alter vor allem die Zunahme Übergewichtiger sowie mangelnde körperliche Aktivität 64 . Auch die Häufigkeit verschiedener Demenzformen steigt mit zunehmendem Alter, wobei in Deutschland etwa 1,1 Millionen 27 und weltweit etwa 24 Millionen Menschen erkrankt sind. Hier wird in Zukunft ebenfalls ein exponentieller Anstieg der Erkrankungen erwartet 37 . Unter den verschiedenen Demenzformen ist der M. Alzheimer die häufigste Entität. Risikofaktoren sind neben seltenen hereditären Formen 45 vor allem Umwelteinflüsse und zunehmendes Alter 119 . Sowohl für Diabetes mellitus Typ 2 als auch für Morbus Alzheimer ist die exakte molekulare Pathogenese noch nicht vollständig verstanden. Histopathologisch lassen sich bei M. Alzheimer die klassischen Plaques und so genannte neurofibrilliäre tangles im Gehirn der Erkrankten nachweisen. Letztere bestehen aus hyperphosphorylierten tau-Proteinen. Die Akkumulation von hyperphosphoryliertem tau-Protein kann zu einem progredienten Untergang von Neuronen führen. Interessanterweise konnte sowohl in epidemiologischen als auch in tierexperimentiellen Studien eine Assoziation von DM2 mit M. Alzheimer gezeigt werden 81. 4.1 Auswirkung Ausbildung einer Hyper-/Hypoglykämie typischer auf die histopathologischer Veränderungen bei Morbus Alzheimer Ein direkter Eingriff in den Glukosestoffwechsel durch eine Beeinflussung des Glukosemetabolismus führt zu Veränderungen der tau-Phosphorylierung. Dies gilt sowohl für hyperglykäme als auch für hypoglykäme Zustände. So konnten Yanagisawa et al. zeigen, dass eine Nahrungskarenz von 48 Stunden bei 8 Wochen alten Wildtypmäusen zu einer tau-Hyperphosphorylierung an Ser202, Ser199 und Ser396 führt, die jedoch nach Beendigung der Nahrungskarenz reversibel war Diese Hyperphosphorylierung von tau war hauptsächlich im 148 . Hippokampus nachweisbar, einer Gehirnregion, die in frühen Stadien des Morbus Alzheimer betroffen ist 24. Diskussion 72 Die Injektion von Streptozotocin führt zu einem Untergang von Inselzellen und löst so einen Insulinmangel-Diabetes und eine chronische Hyperglykämie aus. Bei Streptozotocin-behandelten pR5-transgenen Mäusen konnten Ke und Mitarbeiter 67 eine tau-Hyperphosphorylierung mit Ausbildung neurofibrillärer tangles nachweisen. pR5-transgene Mäuse werden als Modell einer Demenz vom Alzheimer-Typ verwendet, da sie mutiertes humanes tau-Protein exprimieren. Ziel des in dieser Arbeit gewählten experimentellen Aufbaus war es, Bedingungen zu schaffen, welche am ehesten dem prädiabetischen Stadium entsprechen. Daher sollte eine langsam entstehende, milde Hyperinsulinämie vor Entstehung einer Insulinresistenz vorliegen. Der Versuchsaufbau wurde so gewählt, dass mögliche Einflussgrößen wie Stress, Hyper- und Hypoglykämie sowie Hypothermie vermieden wurden. 4.2 Auswirkung einer akuten Hyperinsulinämie bei 12 Monate alten Mäusen Zunächst wurde untersucht, ob die in der internationalen Literatur bei jungen Tieren (jünger als 8 Wochen) beschriebenen Effekte einer akuten Hyperinsulinämie auf die tau-Phosphorylierung durch periphere Applikation von Insulin bei 12 Monate alten Mäusen ebenfalls beobachtet werden können. Dies war insbesondere deshalb notwendig, da mit fortschreitendem Alter nicht nur die neuronale Expression der Insulinrezeptoren, sondern auch der aktive Transport von Insulin über die Blut-HirnSchranke abnimmt 38 . Hierzu wurden den Tieren unter Narkose 4 IE Altinsulin in die Vena cava inferior injiziert. Die Ergebnisse wurden in Bezug zu einer Kontrollgruppe gesetzt, der NaCl 0,9% injiziert wurde. Aufgrund der supraphysiologischen Dosis an Insulin erfolgte bis zur Gewinnung der Gehirnlysate während der Narkose ein kontinuierliches Monitoring der Blutglukosekonzentration. So konnten Artefakte durch eine Hypoglykämie ausgeschlossen werden. Bereits nach 5 Minuten und über den gesamten Beobachtungszeitraum von 20 Minuten anhaltend, zeigte sich ein Anstieg der Ser202 tau-Phosphorylierung. Dies deckt sich mit den Ergebnissen der internationalen Literatur 38,147 ist folglich altersunabhängig. ; die Insulin-induzierte tau-Phosphorylierung an Ser202 Diskussion 73 4.3 Auswirkung einer chronischen Hyperinsulinämie bei 12-16 Wochen alten Mäusen Adipositas, Hyperinsulinämie, verminderte Glukosetoleranz und Diabetes mellitus sind pathologische Zustände, welche häufig mit dem Risiko für die Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung in Verbindung gebracht werden 88 . Es besteht jedoch ein zeitlicher Zusammenhang bei der Entstehung dieser Erkrankungen, wobei eine Hyperinsulinämie häufig bereits im Frühstadium des Diabetes mellitus nachgewiesen werden kann (Abb. 4.1). tau-Phosphorylierung Übergewicht Insulinresistenz Diabetes Typ 2 Hyperinsulinämie Lebensdauer Abb. 4.1 Zusammenhang und zeitliche Abfolge von Adipositas, Hyperinsulinämie, Insulinresistenz und manifestem Diabetes mellitus Typ 2. Sämtliche Faktoren können zu einer vermehrten Ablagerung von Amyloid-β und neurofibrillären tangles im Gehirn und damit möglicherweise zu M. Alzheimer führen. Die Insulinskonzentration kann mit der Zeit aufgrund einer 87 einsetzenden Pankreas-Insuffizienz zurückgehen. Modifiziert nach Luchsinger et al . Nach Validierung der aus der Literatur bekannten in vivo-Ergebnisse an 12-16 Wochen alten Mäusen erfolgte die Etablierung eines Mausmodells zur Ausbildung einer chronischen milden Hyperinsulinämie vor Entstehung einer Insulinresistenz, etwa dem grau unterlegten Zeitabschnitt in Abb. 4.1 entsprechend. Hierfür wurden 12-16 Wochen alte Wildtyp-Mäuse mit Futter ernährt, das einen 15%igen Fettanteil enthielt. Im Vergleich zur Kontroll-Gruppe unter Standarddiät zeigte sich unter fettreicher Ernährung eine Zunahme des Körpergewichts von 48% sowie eine um bis zu 2,4fach erhöhte Insulinkonzentration. Der gewählte Versuchsaufbau entspricht damit dem im klinischen Alltag zu beobachtenden Bild des übergewichtigen Patienten im prädiabetischen Stadium, bei welchem ebenfalls eine Hyperinsulinämie zu verzeichnen ist. Im Insulin-Toleranz-Test und Glukose-Toleranz-Test zeigte sich jedoch kein Unterschied im Vergleich von Mäusen unter Standarddiät und fettreicher Diskussion 74 Diät, was darauf schließen lässt, dass bei den fettreich ernährten Tieren die Insulinresistenz erst sehr mild ausgeprägt ist und sich deshalb trotz der nachgewiesenen Hyperinsulinämie der Darstellung im Insulin-Toleranz-Test entzieht. 4.3.1 Analyse der Insulinrezeptor-Signaltransduktion Wie bereits unter 4.1 erwähnt, waren die von Arendt et al. 7, Okawa et al. Planel et al. 112 bislang durchgeführten in welche vivo-Studien, 103 und einen Zusammenhang von Hyperinsulinämie und M. Alzheimer postulieren, mit einem hohen Ausmaß an Stress für die Untersuchungstiere in Form von Hypothermie, Anästhesie und intraperitonealer Injektion von Streptozotocin verbunden. Hierbei ist ein zusätzlicher Effekt von insulin like growth factor-1 (IGF-1), welcher bei Stress ausgeschüttet wird, nicht auszuschließen. Brüning et al. Schubert et al. 123 15 und im weiteren Verlauf konnten jedoch an Mäusen, die spezifisch im Gehirn eine Insulinrezeptor-Defizienz aufweisen (neuronal insulin-receptor knock-out, NIRKO), zeigen, dass peripher appliziertes Insulin ausschließlich über den Insulinrezeptor und nicht über den IGF-1 Rezeptor wirkt, so dass im Folgenden lediglich die an der Insulinrezeptorsignaltransduktion beteiligten Kinasen mittels Western Blot Analyse genauer untersucht wurden. Hierbei kam es weder zu einer Veränderung der Proteinkonzentration an zerebralem Insulinrezeptor noch zu einer Veränderung der Phosphorylierung der an der Insulinrezeptor-Signaltransduktion oder der tauPhosphorylierung beteiligten Enzyme pAKT, pGSK-3β, pERK-1/-2 und pJNK. Diese Ergebnisse stimmen mit den von Moroz et al. erhobenen Daten überein, wonach es bei C57BL/6 Wildtyp-Mäusen nach 16-wöchiger high-fat diet zu keiner Regulation von Insulinrezeptor und IRS-Proteinen auf Genebene kommt 98 . Eine mögliche Erklärung ist, dass die von uns gewählte high fat diet und damit verbundene Erhöhung der Insulinkonzentration, wie auch im Insulin-Toleranz-Test gezeigt, noch keine Insulinresistenz verursacht hat und es somit noch zu keiner kompensatorischen Regulation der Insulinrezeptor-Signaltransduktion gekommen ist. Hierfür spricht auch, dass es in dem in der vorliegenden Arbeit gewählten Modell zu keiner Beeinflussung von PT1B gekommen ist, einem Protein, dem durch Dephosphorylierung des Insulinrezeptors eine wesentliche Rolle in der Entwicklung einer Insulinresistenz zugesprochen wird 17,41. Diskussion 75 In einem interessanten Widerspruch hierzu stehen die von Ma et al. erhobenen Daten. In dem von ihr gewählten Versuchsaufbau wurden 3xTg-AD Mäuse, ein dreifach transgenes Mausmodell (Überexpression von humanem APP695, humanem tau und der Sekretase Presenilin-1) für die familiäre Alzheimer-Erkrankung, bis zu 4 Monate mit fettreicher Nahrung gefüttert. Dabei erhielt eine Population vor allem gesättigte Fettsäuren, sog. high-fat bad diet, eine zweite Population wurde mit ungesättigten Fettsäuren gefüttert. Hierunter zeigte sich eine vermehrte Aktivierung von JNK in den Gehirnen der Mäusen unter high fat bad diet, was zu einer gesteigerten Phosphorylierung von tau an Ser422 und verminderter Gedächtnisleistung im Y-Maze-Test führte. Der Y-Maze-Test dient der Evaluation des Kurzzeitgedächtnisses bei Mäusen, indem diese repetitiv in einem ypsilonförmigen Labyrinth den Weg zur Futterquelle finden sollen. Diese Effekte waren durch die Beimischung von ungesättigten Fettsäuren zur Nahrung der Tiere reversibel 91. Abgesehen von dem deutlichen kürzeren Beobachtungszeitraum finden sich hier jedoch keine Angaben über Gewichtsverlauf und Seruminsulinkonzentration der Tiere. Zudem unterscheidet sich die Art der fettreichen Diät in der Zusammensetzung gesättigte/ungesättigte Fettsäuren erheblich von derjenigen, die in der vorliegenden Arbeit gewählt wurde, so dass ein Vergleich schwer fällt. 4.3.2 Analyse der tau-Phosphorylierung Das tau-Protein wurde erstmalig 1975 von Weingarten und Mitarbeitern in Zusammenhang mit der Assoziation von Mikrotubuli im Gehirn erwähnt 145 einen sind tau-Proteine an der Stabilisierung von Mikrotubuli beteiligt 29 . Zum , zum anderen konkurrieren tau-Proteine mit dem Motor-Protein Kinesin um die Bindung an Mikrotubuli und führen so zu einer Abnahme des axonalen Transports 127 . In den Fokus der Alzheimer-Forschung gelangte das phosphorylierte tau-Protein im Jahr 1986 als Hauptbestandteil der neurofibrillären tangles (NFT), einem neben den Amyloid-Plaques wichtigen histopathologischen Merkmal der Alzheimer-Erkrankung. In diesem Zusammenhang sind bislang mehr Serin/Threonin-Phosphorylierungsstellen bekannt als dreißig verschiedenen 44 , welche durch unterschiedliche Kinasen beeinflusst werden. Zu diesen gehören unter anderem die unter 3.2.2.1 und 3.2.2.2 genannten Kinsasen AKT, GSK-3β, ERK-1/-2, JNK und CDK5 der IRSignaltransduktion. Wie bereits an dieser Stelle aufgeführt, fand sich trotz erhöhter Diskussion 76 Insulinkonzentration weder eine Regulation der Proteinexpression noch eine wesentliche Beeinflussung der Aktivität dieser Kinasen. Trotz umfangreicher Arbeiten, welche sich mit den unterschiedlichen Phosphorylierungsstellen der an der tau-Phosphorylierung beteiligten Kinasen beschäftigen, besteht immer noch eine weitgehende Unkenntnis über den Zeitpunkt, die Reihenfolge und Bedeutung der einzelnen tau-Phosphorylierungsstellen bei der Entwicklung der Alzheimer- Erkrankung. Daher wurde in dieser Arbeit der Effekt einer chronischen, milden Hyperinsulinämie, wie sie im prädiabetischen Stadium anzutreffen ist, auf die unterschiedlichen Phosphorylierungsstellen des tau-Proteins untersucht. Mittels Western Blot Analyse zeigte sich hier eine signifikante tau-Phosphorylierung an Thr181 bei fettreich ernährten Mäusen, wohingegen keine Modifikation an Ser202, Ser396, Ser199 oder Thr231 zu verzeichnen war. Diese Ergebnisse decken sich weitgehend mit den Daten von Kim et al. 72 bei 2 Wochen alten BKS.Cg-m +/+Lepradb/J-Mäusen. Diese Tiere sind homozygot für die Mutation des Leprdb-Gens und zeigen bereits nach zwei Wochen Charakteristika des Typ 2 Diabetes. So ergab sich bei der metabolischen Charakterisierung dieser Mäuse nach zwei Wochen eine signifikante Hyperinsulinämie ohne Veränderung der Blutglukose-Konzentration im Vergleich zu Kontrolltieren, entsprechend einem prädiabetischen Stadium. Eine Veränderung der Blutglukosewerte war erst nach 4 Wochen zu verzeichnen. Eine Beeinflussung der zerebralen tau-Phosphorylierung wurde nach zwei Wochen festgestellt. Diese stieg mit zunehmendem Alter und damit fortschreitender DiabetesErkrankung der Tiere deutlich an. In dieser Arbeit wurde die Thr181- Phosphorylierungsstelle jedoch nicht mit berücksichtigt. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Thr181-Phosphorylierung bleiben unklar. Eine vermehrte Aktivierung der GSK-3β als zelluläre Antwort auf eine erhöhte Insulinkonzentration, wie sie für die Skelettmuskulatur an Diabetes Typ 2 erkrankter Patienten bei Mäusen mit Diabetes nachgewiesen werden konnte 34 101 sowie (s. Abb. 4.2), ist nach den hier dargestellten Ergebnissen ausgeschlossen, da in der vorliegenden Arbeit auch auf Proteinebene keine Regulation von GSK-3β nachgewiesen werden konnte (s. Abb. 3.30). Diskussion 77 Insulin-Rezeptor p85 p110 p IRS tau-Phosphorylierung p IRS p AKT aktiv inaktiv GSK3 GSK3 Glykogensynthese p GSK GSK inaktiv aktiv Abb. 4.2 Schematische Darstellung der Insulin-Signalkaskade und Rolle von GSK-3β. Die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor führt zu dessen Autophosphorylierung gefolgt von der Aktivierung der PKB über IRS mit nachfolgender Phosphorylierung von GSK-3β. Letztere wird hierdurch inaktiviert, was zu einer vermehrten Glycogen-Synthese durch die Glycogensynthase führt. Ferner ist für GSK-3β auch eine Bedeutung in der tau-Phosphorylierung beschrieben. Modifiziert nach Rayasam et al. Den 115 Ergebnissen der vorliegenden Arbeit zufolge scheint die Thr181- Phosphorylierungsstelle daher eine der frühen tau-Modifikationen bei der AlzheimerEntstehung darzustellen. Diese Vermutung wird durch die Ergebnisse von Jaworski et al. gestützt, der altersabhängig eine signifikante Zunahme der Konzentration von Thr181-tau (p-tau) sowie total-tau (t-tau) im Liquor ansonsten gesunder Probanden 62 . Der Quotient p-tau/t-tau blieb weitgehend konstant. Eine nachweisen konnte 181 Zunahme der Thr -tau-Konzentration und damit des p-tau/t-tau-Quotienten findet sich jedoch in der zerebrospinalen Flüssigkeit von an M. Alzheimer erkrankten Personen 75 . Bislang finden sich keine Daten darüber, ob eine Diabetes-Erkrankung ebenfalls zu einer Veränderung dieses Quotienten führt. Zudem wäre interessant, ob eine Veränderung dieses Quotienten tatsächlich als Risikofaktor für die Entwicklung eines M. Alzheimer zu werten ist. Die Tatsache, dass bei dem in dieser Arbeit verwendeten Modell eine Steigerung der Phosphorylierung an Thr181 verzeichnet Diskussion 78 wurde, jedoch kein Einfluss auf die Insulinrezeptorsignalkaskade detektiert werden konnte, liegt möglicherweise an der Zusammensetzung bzw. einzelnen Bestandteilen der verwendeten fettreichen Diät. 4.4 Auswirkung einer vorbestehender akuten chronischer Insulinstimulation bei Hyperinsulinämie durch fettreiche Ernährung bei 12-16 Wochen alten Mäusen Über die Ausbildung einer Arteriosklerose stellt Diabetes mellitus einen Hauptrisikofaktor für die Entwicklung einer vaskulären Demenz dar. Die Verbindung zwischen Diabetes mellitus Typ 2 und Morbus Alzheimer scheint jedoch komplex. Die 1999 veröffentlichte Rotterdam-Studie, eine longitudinale Studie an über 6000 Personen über 55 Jahre ohne Demenz zu Beginn des Untersuchungszeitraums, zeigte ein relatives Risiko für die Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung von 1,9 bei vorbestehendem Diabetes. Bei zusätzlichem Insulin-Bedarf der Probanden erhöhte sich dieses Risiko sogar auf 4,9 105. Bereits unter 3.1 konnte gezeigt werden, dass eine akute Insulinstimulation bei Wildtypmäusen zu einer vermehrten Ser202-Phosphorylierung des tau-Proteins führt. In einem nächsten Schritt wurde daher in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob eine periphere Applikation von Insulin bei Tieren unter fettreicher Ernährung einen zusätzlichen Effekt auf die IR-Signaltransduktion und die tau-Phosphorylierung an unterschiedlichen Epitopen hat. Hierzu wurde den Tieren nach 12-16 Wochen unter HFD 4 IE Altinsulin injiziert und nach 10 Minuten die Gehirnlysate mittels Western Blot untersucht. Auch hier zeigte sich weder in der Proteinexpression von Insulinrezeptor, AKT, GSK-3β, ERK-1/-2, JNK, PTP1B, PP2A und CDK5 noch in deren Aktivierung eine wesentliche Beeinflussung nach einer Insulinstimulation im Vergleich mit Kontrolltieren. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte die Abnahme des Insulintransports über die Blut-Hirn-Schranke und damit ein ungenügender Anstieg der zerebralen Insulinkonzentration unter o.g. Versuchsbedingungen sein 101. Auf eine Steigerung der applizierten Insulindosis wurde bei ohnehin supraphysiologischer Menge und dadurch zu erwartender Hypoglykämie verzichtet. Diskussion 79 4.5 Ausblick: Behandlung einer Insulinresistenz oder eines Diabetes mellitus Typ 2 als mögliche therapeutische Option zur Prophylaxe des Morbus Alzheimer Nach wie vor ist der Zusammenhang der pathophysiologischen Prozesse, die zur Entstehung eines M. Alzheimer führen, nicht abschließend geklärt. Entsprechend existiert keine effektive Therapie für die Alzheimer-Erkrankung. Ziel der aktuellen Therapieformen ist es, den allgemeinen Symptomen des dementiellen Syndroms durch Steigerung der Acetylcholin-vermittelten Neurotransmission zu begegnen. Insbesondere Acetylcholinesterasehemmer kommen hierbei zum Einsatz. Insgesamt erfolgen die Diagnose und damit ein Beginn der Therapie meist erst im fortgeschrittenen Stadium, eine Progredienz der Erkrankung kann somit nicht verhindert werden. Wesentliche Bedeutung für die Behandlung des M. Alzheimer hat daher die Identifikation von Risikofaktoren, die Entwicklung verbesserter Methoden zu Frühdiagnostik sowie die Möglichkeit einer frühzeitigen Therapie. Neben familiärer Häufung stellt Diabetes mellitus einen Risikofaktor für die Entwicklung einer Alzheimer-Erkrankung dar. Ob die bei DM2 häufig ebenfalls zu beobachtende Übergewichtigkeit als unabhängiger Risikofaktor zu werten ist, wird kontrovers diskutiert. Bislang gibt es nur wenige Studien zu diesem Thema. Demnach gilt ein hoher body-mass index (BMI) bei Patienten bis zu einem Alter von 75 Jahren als Risikofaktor für die Entwicklung eines M. Alzheimer 49, wohingegen ein hoher BMI bei über 75-jährigen als protektiv zu werten ist 90 . Ferner postulieren andere Autoren einen Zusammenhang zwischen Untergewicht und M. Alzheimer 102 . Insgesamt scheint es hier eine starke Abhängigkeit von Geschlecht, Alter und ethnischen Zugehörigkeit zu geben 50,89,100 Einfluss die von Übergewicht Hyperinsulinämie auf . Unbestritten ist jedoch der bedeutende Entwicklung einer Insulinresistenz und 116 . Insulin kann die Blut-Hirn-Schranke überwinden und konkurriert zentral mit dem β-Amyloid um den Abbau durch Insulin-degradierende Enzyme (beispielsweise IDE, insulin degrading enzyme), was zu einer Akkumulation von βAmyloid und Ausbildung der für den M. Alzheimer typischen Plaques führen könnte 140 (s. Abb. 4.3). Auf der anderen Seite wird Insulin auch zu sehr geringen Mengen im Gehirn produziert und scheint einen positiven Einfluss auf den Abbau von βAmyloid zu haben. Periphere Hyperinsulinämie scheint zu einem verminderten Abbau des β-Amyloid zu führen, was möglicherweise ein erhöhtes Risiko für die Entstehung einer Alzheimer-Erkrankung zur Folge hat 117. Diskussion 80 Amyloid-Precursor-Protein Amyloid-β Akkumulation p-Insulin IDE Abbau z-Insulin Abb. 4.3 Schematische Darstellung der Wirkung von peripherem Insulin (p-Insulin) und zentralem Insulin (z-Insulin) auf dem zerebralen Amyloid-β-Abbau. (IDE= insulin degrading enzyme) Hieraus ergibt sich über die Senkung der peripheren Hyperinsulinämie ein möglicher therapeutischer Ansatz bei der Prävention und Behandlung eines M. Alzheimer. Eine entsprechende Medikamentengruppe stellen die Thiazolindione (TZDs). TZDs senken die Blutglukosekonzentration über eine Verminderung der peripheren Insulinresistenz, wirken also als so genannte Insulin-Sensitizer. Watson et al. konnten in einer Placebo-kontrollierten, doppel-blinden Studie an Patienten mit milder Form des M. Alzheimer eine signifikante Verbesserung der Merkfähigkeit sowie Erniedrigung der Plasma-β-Amyloid-Konzentration unter Therapie mit Rosiglitazon nachweisen 143 . Ähnliche Effekte ließen sich auch mit Pioglitazon bei Alzheimer-Mäusen beobachten 53. Eine weitere viel versprechende Medikamentengruppe, welche Einfluss auf die histopathologische Veränderungen des M. Alzheimer hat, stellen die so genannten GSK-3β-Inhibitoren. Hierzu gehören unter anderem Peptide 113 und Metall-Ionen 43 wie Lithium. Neben dem therapeutischen Einsatz bei bipolaren Störungen konnte für Lithium auch eine Inhibition von GSK-3 mit nachfolgender Verminderung der tauPhosphorylierung und Stabilisierung der neuronalen Mikrotubuli in vitro und in vivo gezeigt werden 56,78,108 . Auch in der klinischen Anwendung zeigte sich der therapeutische Effekt von Lithium bei der Alzheimer-Erkrankung. So konnte mittels Mini-Mental-Test eine signifikante Verbesserung des Erinnerungsvermögens bei psychiatrischen Patienten unter Lithium-Therapie nachgewiesen werden 136 . Aber genau wie bei Cholinesterase-Hemmern ist auch für Lithium oder andere GSK-3Inhibitoren kein prophylaktischer Einsatz, d.h. ein Therapie-Beginn erst bei Ausbruch Diskussion 81 der Erkrankung möglich. Hierzu ist die Identifikation von Risikofaktoren und deren Therapie unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Adipositas und die daraus resultierende Hyperinsulinämie bereits vor der Manifestation eines Diabetes 181 Phosphorylierung an Thr mellitus Typ 2 zu einer vermehrten tau- führt. Diese tau-Hyperphosphorylierung scheint demnach eine der frühesten tau-Modifikationen darzustellen und steht in enger Korrelation mit dem Ausbruch und Schweregrad der Alzheimer-Erkrankung 62,141 . Entsprechend sollte eine effiziente Alzheimer-Prophylaxe bereits im prädiabetischen Stadium erfolgen. Mögliche Optionen stellen hier strenge Gewichtskontrolle durch gesunde Ernährung, wie von Ma et al. für ungesättigte Fettsäuren gezeigt 92 , sowie eine Behandlung mit Insulin-Sensitizern dar. Zudem geben die Ergebnisse dieser Arbeit Hinweise darauf, dass eine vermehrte tau-Phosphorylierung an Thr181 und damit Zunahme des p-tau/t-tau-Quotienten (s. 4.3) im Liquor als früher Hinweis zur Identifikation gefährdeter Patienten dienen kann. Weiteren Studien bleibt vorbehalten, ob eine frühzeitige Therapie auf Grundlage dieses Quotienten zu einer Verbesserung bezüglich Fortschreiten und Schweregrad der Erkrankung dienen kann. Zusammenfassung 82 5 Zusammenfassung Diabetes mellitus Typ 2 (DM2) und Morbus Alzheimer (MA) sind chronische, altersassoziierte ErkrankungDoktorarbeit Enden mit stetig steigender Inzidenz. Studien konnten belegen, dass beide Erkrankungen vergesellschaftet sind, da Diabetiker ein doppelt so hohes Risiko aufweisen, an Alzheimer zu erkranken, wie Nicht-Diabetiker. Histopathologisch lassen sich bei MA Plaques und neurofibrilliäre tangles im Gehirn der Erkrankten nachweisen. Letztere bestehen aus hyperphosphorylierten tauProteinen, welche zu einem progredienten neuronalen Untergang führen. Dabei scheint die tau-Hyperphosphorylierung abhängig von unterschiedlichen äußeren Einflüssen wie Stress, Hyper- und Hypothermie sowie Störungen der Glukosehomöostase zu sein. In Voruntersuchungen konnte durch eine akute Insulinstimulation bei jungen Wildtyp-Mäusen eine signifikante Zunahme der tauPhosphorylierung an Ser202 erreicht werden. Somit hat Insulin bzw. die InsulinSignaltransduktion einen direkten Einfluss auf die tau-Phosphorylierung. Da MA eine alters-assoziierte Erkrankung ist, wurde in der vorliegenden Arbeit der gleiche Versuchsaufbau mit 12 Monate alten Wildtyp-Mäusen durchgeführt und es zeigte sich ebenfalls eine signifikante Zunahme der tau-Phosphorylierung an Ser202. Die Wirkung einer akuten Hyperinsulinämie ist somit altersunabhängig. Da die verabreichten Insulindosen unphysiologisch waren, wurde als nächster Schritt ein Mausmodell entwickelt, das dem prädiabetischen Stadium mit milder, chronischer Hyperinsulinämie entspricht. Hierzu wurden Wildtyp-Mäuse 12-16 Wochen lang mit einer fettreichen Diät gefüttert. Dies hatte ein im Mittel um 48% erhöhtes Körpergewicht (32g vs. 47g; p<0,01) und eine 2,4fach erhöhte Insulinkonzentration zur Folge. Signifikante Störungen des Glukosemetabolismus wurden mit Hilfe von Glukose- und Insulintoleranztests ausgeschlossen. In der Analyse der Hirnlysate ergab sich eine signifikante Zunahme der tau-Phosphorylierung an Thr181 ohne eine Beeinflussung anderer in der Literatur beschriebener tau-Epitope. Über welchen Signalweg diese Phosphorylierung vermittelt wird, ist unklar, da sich keine Veränderungen der IR-Signaltransduktion nachweisen ließen. Adipositas und eine konsekutive Hyperinsulinämie vor Manifestation eines DM2 führen demnach zu einer Hyperphosphorylierung an Thr181, was eine der frühesten durch Insulin bedingten tau-Modifikationen zu sein scheint. Eine vermehrte tau-Phosphorylierung an Thr181 und damit Zunahme des phospho-tau/total-tau-Quotienten im Liquor könnte ein früher Hinweis auf ein erhöhtes Risikos an Morbus Alzheimer zu erkranken sein. Literaturverzeichnis 83 6 Literaturverzeichnis 1. Alberti,K. & Zimmet,P. für the WHO Consultation: Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications, Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, Provisional Report of a WHO Consultation. Diab. Med. 15, 539-553 (1998). 2. Almind,K. et al. Aminoacid polymorphisms of insulin receptor substrate-1 in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Lancet 342, 828-832 (1993). 3. Almind,K. et al. 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Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 01/2009 Approbation Famulaturen 03/2005 Innere Medizin/Endokrinologie, Uniklinik Köln 08/2005 Allgemein- und Viszeralchirurgie, KKH Waldbröl 03/2006 Unfallchirurgie, Landeskrankenhaus Feldkirch, AT 02/2007 Rechtsmedizin, Uniklinik Köln Praktisches Jahr 08/2007– 11/2007 Allgemein- und Viszeralchirurgie, Inselspital Bern, CH 12/2007 – 03/2008 Radiologie, Kantonsspital Luzern, CH 04/2008 – 07/2008 Innere Medizin/Endokrinologie, Uniklinik Köln Berufserfahrung 02/2009 – 11/2009 Assistenzärztin, Institut für Pathologie, Münsterlingen, CH seit 12/2009 Assistenzärztin, Institut für Rechtsmedizin, Uniklinik Köln
