Universitätsprofessor Dr. rer. nat Dr. hc H. Pfister Immu

Aus dem Institut für Virologie
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. rer. nat Dr. h.c. H. Pfister
Immunmodulatorische und antivirale CD40-Funktionen:
Repression der HPV18-Promotoraktivität und ChemokinInduktion in HPV positiven Zervixkarzinomzellen
in Synergismus mit Interferon-
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Andreas Altenburg
aus Köln
promoviert am: 12.03.2014
2
Aus dem Institut für Virologie
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. rer. nat Dr. h.c. H. Pfister
Immunmodulatorische und antivirale CD40-Funktionen:
Repression der HPV18-Promotoraktivität und ChemokinInduktion in HPV positiven Zervixkarzinomzellen
in Synergismus mit Interferon-
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Andreas Altenburg
aus Köln
promoviert am: 12.03.2014
3
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2014
4
Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg
1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat Dr. h.c. H. Pfister
2. Berichterstatterin: Frau Universitätsprofessor Dr. med. R. K. Schmutzler
Erklärung:
Ich erkäre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne
Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden
Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes
habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
Frau Prof. Dr. med. Sigrun Smola.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt.
Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin / eines Promotionsberaters
in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher
oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, 26.09.2013
5
6
Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch
Frau Prof. Dr. Sigrun Smola von mir selbst ausgeführt worden.
Die Ergebnisse wurden von mir selbst ausgewertet. Die statistischen Berechnungen wurden
von mir selbst durchgeführt.
Die im Anhang aufgeführten CD40-Färbungen mit dem monoklonalen CD40-Antikörper
G28-5 auf normalem Zervixepithel, CIN III und zervikalem Plattenepithelkarzinom sowie
die
Anfärbung
von
Makrophagen
und
des
CD40-Liganden
im
Infiltrat
eines
Zervixkarzinoms wurden ohne meine Mitarbeit von Herrn Prof. Dr. med. Stephan E. Baldus,
Institut für Pathologie der Universität zu Köln, durchgeführt
.
7
8
Danksagung:
Frau Prof. Dr. Sigrun Smola und Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Herbert Pfister möchte ich für die
freundliche Überlassung des Themas und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes danken.
Beiden danke ich für jede erdenkliche, hilfreiche Unterstützung.
Frau Prof. Dr. Smola, die jede Phase dieser Arbeit intensiv begleitete, verdanke ich die
unermüdliche, professionelle Einführung in die Labortechniken sowie wertvolle inhaltliche
Anmerkungen bei der Planung und Auswertung der vorliegenden Arbeit und viele
konstruktive Diskussionen.
Frau Dr. Gertud Steger danke ich für die Überlassung des Plasmids 4321-Luc.
Mein Dank geht an alle Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter des Instituts für Virologie für die
außerordentlich gute Zusammenarbeit.
9
10
gewidmet meinen Eltern, die mir das Studium der Medizin ermöglichten
11
12
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis
I. Einleitung ……....................….........................…………....................................Seite
1. Humane Papillomviren
1
............................................................................................ 1
1.1. Klassifikation und klinische Relevanz .................................................................. 1
1.2. Die Zervixkarzinom-assoziierten HPV-Typen 16 und 18 und deren
onkogenes Potential .............................................................................................. 2
2. Immunologische Reaktionen in zervikalen Neoplasien............................................... 6
2.1. Die Bedeutung von Zytokinen im Rahmen zellulärer Immunreaktionen bei
genitalen HPV-Infektionen ................................................................................. 6
2.1.1. Das tumorizide Potential zytokinsezernierender Effektorzellen ..............
6
2.1.2. Chemokine ................................................................................................... 8
2.1.3. Interleukin-6 und GM-CSF ......................................................................... 10
3. Die immunmodulatorische Funktion von CD40 ...................................................... 12
4. Ziel der Arbeit ............................................................................................................. 15
II. Material ........................................................................................................................ 16
1. Zellen ........................................................................................................................ 16
1.1. Eukaryote Zellen ................................................................................................. 16
1.1.1..humane Zelllinien .......................................................................................16
1.1.2. Säugetierzellen ............................................................................................17
1.2. Bakterien ............................................................................................................. 17
2. Nukleinsäuren...............................................................................................................18
2.1. Rekombinante Plasmide ....................................................................................... 18
2.2. Längenstandard ................................................................................................... 18
3. Enzyme ........................................................................................................................ 18
4. Medien ........................................................................................................................ 18
4.1. Medien für die Zellkultur ..................................................................................... 18
4.2. Medien für die Bakterienkultur ........................................................................... 19
5. Humane rekombinante Zytokine...................................................................…............ 19
6. Antikörper .................................................................................................................... 19
6.1. Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen
...…...........................................…..... 19
13
6.2. ELISA-Antikörper.…........................................................................................... 19
7. Reagenzien.................................................................................................................. 20
8. Fertige Reagenzsysteme ............................................................................................ 21
9. Lösungen und Puffer................................................................................................... 21
10. Geräte und Laborhilfsmittel ...................................................................................... 22
11. Software .................................................................................................................... 24
III. Methoden ...................................................................................................................... 25
1. Zellkultur.................................................................................................................... 25
1.1. Kultivierung ..................................................................................................... 25
1.2. Langzeitlagerung .............................................................................................. 25
1.3. Zellzählung
..................................................................................................... 26
1.4. Herstellung Paraformaldehyd-fixierter BHK-Zellen .......................................... 26
1.5. Zytotoxizitätstest .............................................................................................. 27
1.6. Transiente Transfektion
................................................................................... 28
1.6.1. Elektroporation ....................................................................................... 28
1.6.1.1. Optimierung der Transfektionseffizienz …................................... 28
1.6.1.2.Reportergen-Assays ………………………….............................. 29
1.7. Induktion der Zytokinproduktion in Zelllinien ................................................. 30
1.7.1. Stimulation mit BHKCD40L- und BHKwt-Zellen und TNF- ................... 30
1.7.2. Stimulation mit BHKFasL-Zellen
........................................................... 30
1.7.3. Vergleichsstimulation mit paraformaldehyd-fixierten BHKCD40L-Zellen
und nich fixierten BHKCD40L-Zellen …..……………….…………………31
1.7.4. Kontrolle des Zellwachstums mit Kristallviolett ...................................... 31
1.7.5. Kurz- und Langzeitinkubation von HPKIa mit Interleukin-6 .................... 32
1.7.6. Aufbewahrung der Zellkulturüberstände ................................................. 32
2. Bakterienkultur ........................................................................................................... 33
2.1. Transformation kompetenter Bakterien ............................................................ 33
2.2. Kulturen für Plasmidisolierungen .................................................................... 33
3. DNA-Methoden ...................................................................................................... 33
3.1. Präparative Gewinnung von Plasmid-DNA aus Bakterien .................................. 33
3.2. Ethanol-Fällung von DNA ................................................................................ 33
3.3. DNA-Konzentrationsbestimmung ..................................................................... 34
14
4. Transiente Expressionstests
..........................………................................................... 34
4.1. Luciferase-Essay................................................................................................. 34
4.2. „In situ“--Galaktosidase-Färbung .................................................................... 35
4.3. -Galaktosidase-Essay ....................................................................................... 35
5. Proteinmessung .......................................................................................................... 36
6. Bestimmung der Zytokinkonzentrationen mittels ABTS-ELISA ............................... 36
6.1. IL-6, MCP-1 und IL-8 und GM-CSF ................................................................. 36
6.2. MCP-3, IP-10 und TGF- .................................................................................. 37
6.3. RANTES .......................................................................................................... 38
7. Immunfluoreszenz ................................................................................................... 38
7.1. Durchflusszytometrie ......................................................................................... 38
7.2. Fluoreszenz-Mikroskopie .................................................................................... 39
8. Formeln und Berechnungen ...................................................................................... 40
IV. Ergebnisse ..................................................................................................................... 41
1. Die CD40-Expression auf HPV positiven Zelllinien in vitro ..................................... 41
2. Funktionalität des CD40-Liganden auf Paraformaldehyd-fixierten
BHK-Zellen ............................................................................................................... 46
3. Optimierung der Transfektionseffizienz mittels Elektroporation bei HeLaCD40Zellen ....................................................................................................................... 48
4. Die Interaktion zwischen CD40L und CD40 reduziert die HPV18-P105-Promotoraktivität ..................................................................................................................... 49
5. Die CD40L - CD40-Interaktion induziert Chemokine in HPV positiven Zervixkarzinomzelllinien in Synergismus mit Interferon-.......................................................... 52
5.1. Differenzielle Induktion von MCP-1 und IL-6 ................................................... 52
5.1.1. MCP-1-Produktion in HPV positiven Zelllinien........................................ 52
5.1.2. CD40 mediiert die Produktion von MCP-1 und IL-6 in Zervixkarzinomzelllinien und von MCP-1 in der in-vitro-transformierten Zellinie
HPKIA ....................................................................................................... 52
5.1.3. Konstitutive IL-6-Produktion in Karzinomzelllinien ................................ 54
5.1.4. IL-6 induziert MCP-1 und erhöht die C40L-vermittelte MCP-1-Induktion
in in-vitro-transformierten Zellen .............................................................. 57
15
5.1.5. IFN- induziert MCP-1 in HPV positiven Zelllinien................................... 60
5.2. IFN- inhibiert das Wachstum von Zervixkarzinomzellen.......................... 60
5.3. IFN- sensibilisiert Zervixkarzinomzellen für die CD40-mediierte MCP-1Produktion .......................................................................................................... 61
5.4. Vergleichsstimulation mit Paraformaldfehyd-fixierten und nicht fixierten
BHKCD40L-Zellen
........................................................................................... 63
5.5. IFN- sensibilisiert HPV positive Keratinozyten für die CD40L-mediierte
Produktion von CC-Chemokinen und IP-10....................................................... 64
6. CD40 induziert IL-8 .................................................................................................. 69
7. CD40 induziert den hämatopoetischen Wachstumsfaktor GM-CSF in Zervixkarzinomzellen .......................................................................................................... 71
8. Zytokin-Induktion und Zelltodregulation durch den CD40-verwandten Rezeptor
F Fas.............................................................................................................................. 73
V. Diskussion ..................................................................................................................... 78
VI. Zusammenfassung ....................................................................................................... 90
VII. Literaturverzeichnis ................................................................................................... 92
VIII. Vorabveröffentlichung von Ergebnissen ......................................................................117
IX. Anhang .......................................................................................................................... 118
X. Lebenslauf....................................................................................................................... 121
16
Abkürzungsverzeichnis
AP-1
Asa
(r)ATP
BAFFR
BCMA
BHK
bp
BSA
C
CAT
CD40L
CDC2
CHX
CIN
CIS
DMEM
DMSO
DTT
E6-AP
EDTA
EGF
ELISA
EtOH
F(ab’)2
FACS
FasL
FITC
FKS
GADD45
G-CSF
GCP-2
GM-CSF
gp
ICAM-1
IFN-
IL-6, -8
IP-10
Ig
JAK
kb
KCl
kDa
Aktivator-Protein-1
American Standards Association
(rekombinantes) Adenosintriphosphat
„B cell-activating factor receptor”, auch TNFRSF13C
„B cell maturation antigen“, auch TNFRSF17
„baby hamster kidney"
Basenpaare
Rinderserumalbumin
Coulomb
Chloramphenicolacetyltransferase
CD40-Ligand
Zyklin-abhängige Kinase 2
Cycloheximid
zervikale intraepitheliale Neoplasie
Carcinoma in situ
Dulbeco’s modified Eagle medium
Dimethylsulfoxid
Dithiothreitol
E6-Aktivierungsprotein
Ethylendiamintetraacetat
„epidermal growth factor“
„enzyme-linked immunosorbent assay“
Ethanol
bivalentes Fab-Fragment eines Antikörpers
„fluorescence activated cell sorter“
Fas-Ligand
Fluoresceinisothiocyanant
fötales Kälberserum
„growth arrest and (DNA) damage dependent 45“
Granulozyten-Koloniestimulierender Faktor
Granulozyten-chemotaktisches Protein 2
Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor
Glykoprotein
„intercellular adhesion molecule-1“
Interferon-gamma
Interleukin-6, -8
Interferon-gamma-induziertes-Protein 10
Immunglobulin
Janus-Kinase
Kilobasenpaare
Kaliumchlorid
Kilo-Dalton
17
KI
LAK-Zelle
LARC
LB-Medium
LCR
LFA-1
M
MCP-1, -3
M-CSF
MHC
MIP-1
F
NaN3
NAP-2
NF-1
NF-B
ng
NGFR
nm
OD
ONPG
ORF
PARC
PBS
PCNA
pg
pRB
PS
RANK
RANTES
RLU
rpm
RT
SDF1
SLC
STAT
TACI
TARC
TBE
TBS
TE
TGF-, -
TNFR
18
Konfidenzintervall
Lymphokin-aktivierte Killerzelle
„liver and activation-regulated chemokine“, auch MIP-3
Luria-Bertani-Medium
Lange Kontrollregion („long control region“)
„lymphocyte function-associated antigen-1“
Mol (oder molar)
Monozyten-chemotaktisches-Protein-1, -3
Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor
„major histocompatibility complex“
„macrophage inflammatory protein-1“
Mikrofarad
Natriumazid
„neutrophil activating protein-2“
„Nuclear Factor 1“
„Nuclear Factor kappa-B“
Nanogramm
„nerve growth factor receptor“
Nanometer
optische Dichte
O-Nitrophenyl--D-Galactosidase
offener Leserahmen („open reading frame“)
„pulmonary and activation-regulated chemokine“
phosphatgepufferte Salzlösung
„proliferating cellular nuclear antigen“
Pikogramm
Retinoblastoma-Protein
Polystyrol
„receptor activator of NF-B“, auch TNFRSF11A
„regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted“
„relative light units“
Umdrehungen pro Minute („rounds per minute“)
Raumtemperatur
„stromal cell-derived factor 1“
„secondary lymphoid-tissue chemokine“
„signal transducer and activator of transcription“
“transmembrane activator and CAML interactor”, auch
TNFRSF13B
„thymus and activation-regulated chemokine“
Tris-Borat-EDTA
„tris-buffered saline”
Tris-EDTA-Puffer
„transforming growth factor , “
Tumornekrosefaktor-Rezeptor
TNFRSF1
TRANCE
Tris
wt
YY-1
“tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1”
„TNF-related activation-induced cytokine“, auch TNFSF11
Trishydroxymethylethylendiamin
Wildtyp
Ying and Yang-1
19
20
I. EINLEITUNG
1. Humane Papillomviren
1.1. Klassifikation und klinische Relevanz
Humane Papillomviren (HPV) sind Haut und Schleimhäute des Menschen infizierende
unbehüllte DNA-Viren. Sie weisen in einem 55nm großen ikosaedrischen Kapsid eine
zirkuläre, doppelsträngige DNA von 7200 bis 8000bp auf (Pfister, 1984). Alle kodierenden
Sequenzen („open reading frames“, ORFs) befinden sich auf einem der beiden DNA-Stränge.
Er enthält die Leserahmen der frühen („early“, E) Gene, deren Proteine Funktionen bei der
Replikation, Transkriptionskontrolle und auch bei der Transformation ausüben, sowie die der
späten Gene („late“, L), welche für die Kapsidproteine L1 und L2 kodieren (Pfister und Fuchs,
1987). Es wird angenommen, dass humane Papillomviren über Mikroverletzungen epidermale
Basalzellen befallen. Die Replikation der HPV-DNA und die Synthese von Strukturproteinen
wird allerdings hauptsächlich in den oberen Schichten des Plattenepithelverbandes initiiert.
Genotypisch wurden mehr als 120 HPV-Typen, deren Übereinstimmung in der DNA-Sequenz
des L1 ORF per Definition kleiner als 90% sein muss, identifiziert. Die Familie der
Papillomaviridae umfasst 16 Genera, die jeweils weniger als 60% Sequenzhomologien im L1Gen aufweisen. HPV gehören den fünf Genera Alpha, Beta, Gamma, Mu und Nu an (Bernard et
al., 2010; de Villiers 2004). Die bei Patienten mit der chronischen Hauterkrankung
Epidermodysplasia verruciformis gefundenen humanen Papillomviren (5, 8 und verwandte
Typen) werden unter klinischem als auch phylogenetischem Gesichtspunkt zusammengefasst
und gehören dem Genus Beta an (Van Ranst, Kaplan und Burk, 1992; Chan et al., 1995).
Kutane HPV-Typen von sich meist spontan zurückbildenden Vulgär-, Plantar- oder flachen
Warzen (z.B. HPV 1, 2, 3, 4, 10, 26-29, 41, 75-77) sind den Genera Alpha, Gamma, Mu und
Nu zugeordnet.
Als weitere Hauptgruppe einer klinischen Einteilung werden die „genitalen“ HPV-Typen, die
hauptsächlich zum Genus Alpha zugehören, in Läsionen des äußeren und inneren
Anogenitalbereiches als auch in Läsionen der oberen Atemwege, insbesondere des Mundes, des
Pharynx und des Larynx gefunden. Besonders empfänglich für eine Infektion im Bereich des
Gebärmutterhalses ist der als „Transformationszone“ bezeichnete Übergang vom Zylinder- in
das Plattenepithel. Nach der Klinik der Läsionen werden die genitalen HPV in die Kategorien
1
der „low-risk“-Typen (z.B. HPV Typ 6, 11, 70), die „high-risk“-Typen 16 und 18 und die
„other high-risk or possibly high-risk“-Typen (26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66,
68, 73, 82) eingeteilt (IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to
Humans, 2007). HPV 16 und 18 wurden unter allen HPV-Typen am häufigsten in
Zervixkarzinomen und zudem drei- bzw. zweimal häufiger in Plattenepithelkarzinomen im
Vergleich zu niedriggradigen Dysplasien der Cervix uteri gefunden. Manche der zu den „other
high-risk or possibly high-risk“-HPV zählenden Typen wurden gleich oder moderat häufiger in
niedriggradigen Dysplasien als in Plattenepithelkarzinomen (z.B. HPV 31, 33, 45, 53, 66, 73
und 82), andere nur selten in Plattenepithelkarzinomen gefunden. Die mit wenig onkogenem
Risiko verbundenen Typen 6, 11 und 70 kommen vorrangig in genitalen Feigwarzen
(Condylomata acuminata) und mehr als das 10fache häufiger in niedriggradigen Dysplasien als
in Plattenepithelkarzinomen der Cervix uteri vor (IARC Working Group on the Evaluation of
Carcinogenic Risks to Humans, 2007). Der „high-risk“ Typ HPV16 war nach einer weltweiten
Studie von Lörincz et al. (1992) zu ca. 48% mit hochgradigen intraepithelialen Läsionen und
Karzinomen assoziiert und die „high-risk“ Typen HPV 18, 45 und 56 zu 27% mit invasiven
Karzinomen. Mehr als zwei Drittel der CIN I („cervical intraepithelial neoplasia grade I“)Läsionen bilden sich spontan zurück und auch Regressionen im CIN II-Stadium wurden in ca.
30% beobachtet (Hording et al., 1995; Östör, 1993). Der Nachweis hochonkogener Typen gilt
allerdings als prognostisch ungünstiges Zeichen und alleine eine Infektion mit HPV16 erhöht
das Risiko für eine maligne Entartung um das 10 bis 30fache (Nasiell, Naslund und Auer, 1984;
Koutsy et al., 1992; Remmink et al., 1995). Weltweit tritt das Zervixkarzinom als häufigster
maligner Genitaltumor der Frau auf. Walboomers et al. (1999) wiesen DNA humaner
Papillomviren in 99,7% aller getesteten Zervixkarzinome nach.
1.2. Die Zervixkarzinom-assoziierten HPV-Typen 16 und 18 und deren onkogenes
Potential
HPV16- und HPV18-Nukleinsäuresequenzen sind neben ihrer Prävalenz von ca. 70% in
Zervixkarzinomen (Dürst et al., 1983; Gissmann et al., 1984) auch in der überwiegenden
Anzahl sich davon ableitetender Zelllinien vorhanden (s. Tabelle 3A). Im Gegensatz zu
ausschließlich episomal persistierender HPV-DNA in benignen proliferativen Erkrankungen
und bei latenten Infektionen wird die Integration von Papillomvirus-DNA in das menschliche
Genom als Kennzeichen maligner Läsionen angesehen. Während HPV18-positive Karzinome
sowie alle in dieser Arbeit verwendeten HPV16 positiven (CaSki, SiHa, HPKIa) und HPV18
2
positiven Karzinomzelllinien (C4-I, HeLa, SW756) integrierte HPV-DNA aufweisen, wurde in
einem Fünftel der HPV16 positiven Karzinome neben integrierter auch episomale und in etwa
einem Drittel nur episomale HPV-DNA gefunden (Fuchs, Girardi und Pfister, 1989; Cullen et
al., 1991). Einen Schritt der Karzinogenese stellt der während des Integrationsvorganges im
Allgemeinen am 3’-Ende des E1-ORFs oder am 5’-Ende des E2-ORFs stattfindende Bruch des
zirkulären Genoms dar. Die virale Integration in Zervixkarzinomen und abgeleiteten Zelllinien
weist vergleichbare Muster in der Neustrukturierung des HPV-Genoms auf. Während die von
der nicht-kodierenden Region (NCR, „non-coding region“, auch LCR, „long control region“)
abwärts liegenden, transformierenden Gene E6 und E7, sowie die ca. 850bp umfassende NCR,
einschließlich des frühen viralen Promotors, erhalten bleiben, sind die davor liegenden frühen
Gene, d.h. entweder E2 alleine oder zusammen mit E1 bzw. E4 oder E5, deletiert und
inaktiviert (Schwarz et al., 1985; Wilczynski, Perlan und Walker, 1988; Turek, 1994). Der
resultierende Verlust des als Trans-Repressor wirkenden Proteins E2, welches über E2Bindestellen nahe der TATA-Box den frühen HPV18 P105- bzw. HPV16 P97-Promotor negativ
reguliert, trägt bei integrierter viraler DNA wesentlich zur Derepression der E6/E7-Leserahmen
im Verlaufe der Tumorprogression bei (Romanczuk, Thierry und Howley, 1990).
Tabelle 1: Wichtige Funktionen der frühen Gene genitaler HPV-Typen:
ORF Funktion des Proteins
E1
E2
E4*
E5
E6
E7
Initiation der Replikation der viralen DNA
virale Replikation, Transkriptionskontrolle
Degradierung von Zytokeratin
Transformation; Interaktion mit Zellmembranrezeptoren (EGFR, PDGFR)
Transformation; Degradation von p53, hDLG, Bak, Induktion der Telomerase
Transformation; Inaktivierung von p105Rb, p107, p130, Destabilisation von
Centrosomen, Interaktion mit Zyklinen **
* E4 wird während der aktiven Infektion in ausdifferenzierten Keratinozyten produziert, außerdem
in Präkanzerosen und Karzinomen oder beispielsweise der Zelllinie CaSki (Doorbar et al., 1986;
1991 ; 1994; Böhm et al., 1993). Die Zuordnung von E4 zu den frühen Proteinen ist historisch
begründet.
** Tommasino et al., 1993
Indem das Onkoprotein E6 der Typen 16 und 18 des menschlichen Papillomavirus einen
Komplex mit dem zellulären E6-assoziierten Protein (E6-AP) und dem Tumor-SuppressorProtein p53 bildet, wird die Ubiquitin-abhängige Proteolyse von p53 induziert. Unter anderem
3
inhibiert p53 die Transkription der Onkogene FOS und JUN und eine p53-vermittelte Apoptose
kann irreparabel geschädigte Zellen eliminieren.
Die Wirkung des HPV-E7-Proteins resultiert zum einen aus der funktionellen Aktivierung des
zellulären Transkriptionsfaktors E2F, indem das E7-Protein an die hypophosphorylierte Form
des Retinoblastoma-Proteins (pRB, p105RB) über kompetitive Verdrängung von E2F bindet.
E2F-Bindestellen finden sich typischerweise an regulatorischen Sequenzen von Genen, die in
die Zellteilung und DNA-Replikation involviert sind, wie Thymidin-Kinase, c-MYC, N-MYC,
CDC2, DNA-Polymerase  und Dihydrofolatreduktase. E7 bindet auch die ebenfalls an der
E2F-Kontrolle beteiligten pRB verwandten Proteine p107 und p130. Es fördert zudem über die
Expression der Zykline A, B und E die Aktivierung der entsprechenden Zyklin-abhängigen
Kinasen CDK2 und CDC2, die für den Eintritt in die Mitose bzw. in die S-Phase essentiell sind
(Smola-Hess und Pfister, 2002). Die E7-Proteine von HPV16 und 18 inhibieren über die
Bindung an Smad-Proteine TGF--vermittelte Signalwege, die zur Hemmung des
Zellwachstums führen (Habig et al., 2006).
In genetischen Studien konnte gezeigt werden, dass die E6- und E7-Leserahmen von HPV16
oder von HPV18 notwendig und ausreichend für eine effektive Immortalisierung humaner
Keratinozyten sind (Hawley-Nelson et al., 1989; Münger et al., 1989). Auch E7 alleine besitzt
die Fähigkeit zur Immortalisierung epithelialer Zellen, wenngleich in geringerem Maße als in
Kombination mit E6 (Halbert, Demers und Galloway, 1991; Hudson et al., 1990). Obwohl die
HPV-Infektion wichtig für die Entstehung des Gebärmutterhalskrebses ist, ist sie alleine noch
nicht ausreichend. Dementsprechend sind mit HPV16 in-vitro-immortalisierte Keratinozyten
wie die Zelllinie HPKIa in athymischen Mäusen mit homozygoter Nude-Mutation zunächst
nicht tumorigen (Dürst et al., 1991). Mit HPV-DNA in-vitro-immortalisierte Keratinozyten wie
HPKIa zeichnen sich allerdings durch zytogenetische Abnormalitäten wie Aneuploidie und die
Entfaltung dysplastischer Differenzierungsmuster in organotypischen „Raft“-Kulturen aus
(Pirisi et al., 1987; Kaur und McDougall, 1988; Pei, Gorman und Watt, 1991; McCance et al.,
1988). Die Zervixkarzinomzelllinien CaSki, SiHa, C4-I, HeLa und SW756 besitzen dagegen
die Fähigkeit, in Nacktmäusen innerhalb von Tagen oder wenigen Wochen nach subkutaner
Injektion oder Implantation sicht- und tastbare Tumoren hervorzurufen (Tan und Ting, 1995;
Waggoner et al., 1990; Freedman et al., 1982). Zur Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps
von Zervixkarzinomzellen scheint die kontinuierliche Expression der E6/E7-ORFs notwendig
zu sein (Von Knebel-Döberitz et al., 1992; He und Huang, 1997). In vivo entspricht dieser
4
Beobachtung der Anstieg von E6/E7-Transkripten in CIN III, CIS (Carcinoma in situ) und
invasiven Karzinomen im Vergleich zu mit HPV16 oder 18 assoziierten geringgradigen
intraepithelialen Läsionen, bei denen unter den HPV-Transkripten die E4- und E5-Proteine
vorwiegen (Stoler et al., 1992).
Die Transkription der E6- und E7-RNAs beginnt im Falle von HPV16 aufwärts des E6Leserahmens an Position 97 und im Falle von HPV18 an Position 105. Die transkriptionelle
Aktivität des frühen P97- bzw. P105-Promotors wird über zahlreiche positive und negative
Kontrollelemente der nichtkodierenden LCR reguliert. Letztere kann bei HPV18 und den
anderen genitalen HPV-Typen funktionell in drei Segmente, eine 5’ Region beginnend am L1Terminationscodon (390bp), einen zentralen Epithelzell-spezifischen Enhancer (230bp) und
eine 3’ Region (240bp), jeweils durch E2-Bindestellen voneinander getrennt, unterteilt werden
(Gius et al., 1988; Bernard et al., 1989). Das zentrale Segment enthält die Mehrzahl der
Bindestellen ubiquitärer zellulärer Transkriptionsfaktoren, die den Enhancer entweder stimulieren, wie AP-1 und -2, KRF-1, NF-I, PEF-1, SP-1, TEF-1 und -2 u.a., oder reprimieren, wie
NF-IL6, Oct-1 oder YY1 (Mack und Laimins, 1991; Chong, Chang und Bernard, 1990; Turek,
1994; O’Connor, Chan und Bernard et al., 1995). Beispielsweise regulieren AP-1 Faktoren, die
sich als Dimere von JUN- und FOS-Proteinen zusammensetzen, auch einige Zytokingene, wie
IL-6, MCP-1 und GM-CSF (Kick et al., 1995; Martin et al., 1997; Thomas et al., 1997). Das
HPV16-E7-Genprodukt kann an AP-1 Faktoren binden und deren Aktivität verstärken
(Antinore et al., 1996). NF-IL6, AP-1 und Oct-1 sind durch Interleukin-6 induzierbar (Hsu und
Chen-Kiang, 1993; Stephanou et al., 1998). Zwar wurde von Kyo et al. (1994) keine Beeinflussung der E6/E7-mRNA-Transkripte oder des HPV16-Promotors infolge einer exogenen IL-6Stimulation beobachtet, von einigen anderen Zytokinen, beispielsweise von TGF-1 und TGF2, EGF („epidermal growth factor“), Leukoregulin, IL-1, IFN- und TNF- wird jedoch
berichtet, dass sie die Expression von E6/E7 in immortalisierten Keratinozyten und in HeLaZellen unterdrücken können (Woodworth, Notario und DiPaolo, 1990; Yasumoto, Taniguchi
und Sohma, 1991; Woodworth et al., 1992; Kyo et al., 1994).
5
2. Immunologische Reaktionen in zervikalen Neoplasien
2.1. Die Bedeutung von Zytokinen im Rahmen zellulärer Immunreaktionen bei
genitalen HPV-Infektionen
2.1.1. Das tumorizide Potential zytokinsezernierender Effektorzellen
Gegen verschiedene Proteine genitaler HPV-Typen wurden humorale Immunreaktionen
gefunden (Galloway und Jenison, 1990; Nonnemacher et al., 1995; Baud et al., 2004).
Antikörperantworten von B-Lymphozyten sind in der Regel von TH2-Lymphozyten abhängig
und in erster Linie bei der Bekämpfung von Viren bzw. Pathogenen in extrazellulären Medien
effektiv. Zur Prävention genitaler HPV-Läsionen befinden sich prophylaktische Vakzinierungen
seit 2006 im klinischen Einsatz (Szarewski, 2007; Dillner et al., 2011). Eine nahezu
vollständige Wirksamkeit einer Vakzine mit L1-Proteinen von HPV-6, -11, -16 und –18
(Gardasil®) wurde bei zuvor sexuell nicht aktiven Frauen zur Vermeidung HPV16/18assoziierter zervikaler, vulvärer und vaginaler Neoplasien sowie HPV6/11-assoziierter
Genitalwarzen gesehen (Munoz et al., 2010). Um die Progression bestehender zervikaler
Neoplasien abzuwenden, trägt jedoch maßgeblich die zelluläre Immunität bei, welche als Basis
möglicher therapeutischer Impfstoffe oder sogenannter „Biological Immune Response
Modifiers“ dient. Die Bedeutung T-Zell-vermittelter Immunität im Rahmen genitaler HPVInfektionen wird vor allem bei chronisch Immunsupprimierten evident: Bei HIV-Infizierten,
Transplantatempfängern oder Patienten mit dem Nezelof-Syndrom, bei welchen der zelluläre
Arm des Immunsystems pathologisch verändert ist, lässt sich ein dramatischer Anstieg in der
Inzidenz und Schwere HPV-induzierter Läsionen beobachten (Rüdlinger et al., 1986; Maimann
et al., 1990; Kiviat et al., 1990; Lawlor et al., 1974).
Verschiedentlich wurde gezeigt, dass die Regression zervikaler, intraepithelialer Neoplasien
von einer massiven Immunzellinfiltration, bestehend aus CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen sowie
Makrophagen und einer geringeren Anzahl natürlicher Killerzellen, begleitet ist (Tay et al.,
1987; Evans et al., 1997). In Makrophagen, welche selbst eine Hauptquelle von TNF- sind,
wird über IFN-γ sowie über TNF-α oder CD40L als mögliche akzessorische Stimuli die
Produktion des reaktiven Stickstoffoxids (NO) und toxischer Sauerstoffradikale eingeleitet
(Kuroiwa et al., 1999; Bingaman, Pearson und Larsen, 2000). Auch MCP-1 („monocyte
chemoattractant protein-1“), der Prototyp der CC-Chemokinfamilie, induziert in humanen
6
Monozyten den „Respiratory Burst“ (Rollins, Waltz und Baggiolini, 1991; Uguccioni et al.,
1995; Opdenakker et al., 1992).
Die Aktivierung der ruhenden T-Zelle erfordert die Antigen-Kodierung im Kontext des
entsprechenden MHC-Moleküls und akzessorische Signale. Zu den kostimulierenden Signalen
zählen die auf spezialisierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierten Moleküle CD40
sowie CD80 (BB1, B7-1) und CD86 (B7-2) (Cayabyab, Phillips und Lanier, 1993; Borrow et
al., 1996; van Gool et al., 1996). CD54 oder ICAM-1 („intercellular adhesion molecule-1“)
besitzt als weiteres kostimulierendes Molekül die Fähigkeit zur Adhäsion von T-Zellen und
Monozyten über den zugehörigen Membranliganden LFA-1. In vitro kann ICAM-1 durch TNF oder IFN- auf HPV positiven Zelllinien induziert werden und in vivo korreliert die ICAM-1und HLA-DR-Dichte in HPV-assoziierten Läsionen wiederum mit der Anwesenheit
immunzellulärer Infiltrate (Coleman und Stanley, 1994; Morelli et al., 1994).
CD4+-T-Zellen induzieren auch die Proliferation von B-Zellen und von zytotoxischen TLymphozyten. Zytotoxische CD8+-T-Zellen können selektiv mit Viren infizierte Zellen abtöten.
Sie erkennen hierbei kurze Peptide, die sich von viralen Proteinen ableiten und die an den
sogenannten MHC-(„major histocompatibility complex“)-Klasse I-Proteinen, gebunden sind.
Eine starke Immunantwort zytotoxischer T-Zellen wurde im Rahmen experimenteller
therapeutischer Vakzinierungen mit einem HPV16 E7 Antigen im Tierversuch beobachtet
(Bungener et al., 2006). Der auf der zytotoxischen Zellmembran identifizierte Ligand für Fas
oder APO-1, ein Mitglied der TNF-Rezeptor-Familie, kann auf Fas-exprimierenden Zielzellen
Apoptose auslösen (Suda und Nagata, 1994; Sung et al., 1997). Dieser Apoptoseweg hat zwar
in erster Linie für die Hämoöstase der Lymphozyten Bedeutung, eine Fas-Expression wurde
allerdings auf manchen, wenn auch nicht auf allen CIN-I- bis CIN-III-Läsionen und
Zerxixkarzinomen beobachtet (Zhou et al., 2006). Außerdem konnte der Fas-Ligand in
manchen Zervixkarzinomen sowie auf der Zervixkarzinomzelllinie CaSki nachgwiesen werden.
Deshalb wurde vermutet, dass die Tumorzellen selbst eine Fas-Ligand-mediierte Apoptose in
tumorinfiltrierenden T-Zellen induzieren können (Ibrahim et al., 2006).
Fast alle Zellen exprimieren in unterschiedlichem Maße MHC Klasse I-Moleküle, welche den
zytotoxischen T-Zellen z.B. virale Peptide anzeigen, die im Zytosol der Zellen synthetisiert
werden. Cromme und Mitarbeiter (1993; 1994) beschreiben mit der MHC-Klasse IVerminderung auf CIN-Läsionen und auf Zervixkarzinomen ein generelles Phänomen diverser
maligner Tumorzellen, die aufgrund einer schwachen Antigenizität ihrer Eliminierung entgehen
7
können (Andersson et al., 1991; Brocker et al., 1985). Darüberhinaus wurde eine quantitative
Abnahme von Langerhanszellen in nicht-regressiven CIN II- und III-Läsionen im Vergleich
zum normalen Gewebe beobachtet (Morelli et al., 1993). Langerhanszellen, B-Zellen,
dendritische Zellen und Makrophagen besitzen als professionelle antigenpräsentierende Zellen
zusätzlich zu Haupthistokompatibilitätskomplexen der Klasse I auch solche der Klasse II.
MHC-Klasse II-Moleküle können durch GM-CSF, IFN- und IL-3 auch auf Neutrophilen
induziert werden (Gosselin et al., 1993). Die meisten epithelialen Zellen weisen konstitutiv nur
Klasse I-Moleküle auf, jedoch kann die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen auch auf
diesen Zellen durch Zytokine wie Interferon- und TNF- angeregt werden (Frazer und Tindle,
1992; Bornstein et al., 1997).
Natürliche Killerzellen sind Nicht-T-, Nicht-B-Lymphozyten, die zur Produktion von IFN- und
TNF- und zur Lyse von Tumorzellen aktiviert werden können. CC-Chemokine wie MCP-1
können NK-Zellen in vitro aktivieren und die Freisetzung von Granzym A und N-Acethyl--DGlucosaminidase induzieren (Loetscher et al., 1996). Allerdings wurde gezeigt, dass die Anzahl
von NK-Zellen in Zervixkarzinomen gegenüber niedriggradigen Dysplasien der Cervix uteri
verringert ist (Alves et al., 2010). Zudem wiesen NK-Zellen von Zervixkarzinom-Patientinnen
eine Reduktion des zur vollen Aktivierung gegen Tumorzellen nötigen Rezeptorprofils auf
(Garcia-Iglesias et al., 2009).
2.1.2. Chemokine
Die Rekrutierung infiltrierender Effektorzellen (Monozyten, T-Zellen und NK-Zellen) an den
Ort der HPV-Infektion ist für die Regression der Läsionen von entscheidender Bedeutung.
Immunreaktionen in neoplastischen Läsionen werden mit Hilfe löslicher chemotaktischer
Faktoren, welche von den Karzinomzellen produziert werden, initiiert und mit Hilfe eines
interzellulären Zytokinnetzwerkes aufrechterhalten. Chemokine sind kleine, strukturverwandte
Proteine von 7-10kD, die die Fähigkeit besitzen, Heparin zu binden. Vier hochkonservierte
Zysteinreste legen die Selektivität der Chemokinliganden für die Bindung an die
unterschiedlichen Rezeptorengruppen, CXC-R1 bis CXC-R6 und CC-R1 bis CC-R9, fest
(Murphy, Travers und Walport, 2009). In Abhängigkeit davon, ob zwischen den ersten beiden
NH2-terminalen Zysteinresten ein variabler Aminosäurerest interponiert ist oder nicht,
unterscheidet man CXC-Chemokine (-Chemokine) und CC-Chemokine (-Chemokine).
8
Eine potente chemotaktische Wirkung vorwiegend gegenüber neutrophilen Granulozyten
besitzen solche CXC-Chemokine, die ein terminales ELR-(Glutamat-Leucin-Arginin)Aminosäuremotiv vor dem ersten Zystein aufweisen, wie IL-8 (CXCL8), GRO- („growth
stimulatory activity-“, CXCL1), - (CXCL2), und - (CXCL3), ENA-78 („epithelial
neutrophil activating protein-78“, CXCL5), GCP-2 („granulocyte chemotactic protein-2“,
CXCL16) und NAP-2 („neutrophil activating protein-2“, CXCL7). IL-8 und GRO- sind
außerdem für CD4+- und CD8+-Lymphozyten und für Basophile chemotaktisch (Jinquan et al.,
1995). In vitro induzieren beide Chemokine in Synergismus mit TNF- auch die
Granulafreisetzung und den „Respiratory Burst“ der neutrophilen Granulozyten (Baggiolini,
Dewald und Moser, 1997; Geiser et al., 1993). CXC-Chemokine ohne ELR-Sequenz besitzen
dagegen generell nur eine schwache Wirkung auf Neutrophile. Diese Chemokine, zu denen die
beiden Interferon--induzierbaren CXC-Chemokine IP-10 (CXCL10, „IFN- inducible
protein“) und MIG („monokine induced by IFN-“) sowie SDF1- und - (CDXCL12,
„stromal cell-derived factor 1“) gehören, wirken in unterschiedlichem Maße chemotaktisch auf
aktivierte bzw. tumorinfiltrierende T-Lymphozyten (Rollins, 1997). Für IP-10 wurde
darüberhinaus eine chemotaktische Aktivität gegenüber humanen Monozyten und NK-Zellen
nachgewiesen (Taub et al., 1993; 1995).
CC-Chemokine, wie MCP-1 (CCL2), MCP-2 (CCL8), -3 (CCL7) und –4 (CCL13), RANTES
(CCL5), und MIP-1 und - (CCL3 und CCL4) ziehen in erster Linie Monozyten, des
Weiteren T-Lymphozyten, NK-Zellen, Eosinophile und Mastzellen an. LARC (CCL20), PARC
(CCL18), SLC (CCL21) und TARC (CCL17) sind weitere für T-Zellen chemotaktische CCChemokine (Hieshima et al. 1997a,b; Imai et al., 1996; Nagira et al., 1997). MCP-1, ein
wichtiger Mediator zwischen mononukleären Zellen und dem mit Papillomviren infizierten
Zervixepithel, wird in Monozyten durch Zytokine (IL-1, TNF, GM-CSF und IFN-) induziert.
An den lokalen Immunreaktionen nehmen Keratinozyten selbst mit ihren Zytokinen,
Wachstumsfaktoren und Adhäsionsmolekülen teil. Chemokine wie MCP-1, IL-8 und IP-10
können von vielen Zellen, z.B. Monozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und auch von
Keratinozyten produziert werden. Riethdorf und Mitarbeiter (1996) konnten zeigen, dass MCP1 in vivo auf zervikalen Plattenepithelkarzinomen mit einer dichten entzündlichen
Makrophagenreaktion am Tumorrand exprimiert wird. Hierbei überwog die MCP-1-Produktion
der Karzinomzellen selbst, aber auch angrenzende Stromazellen, Makrophagen und
Endothelzellen waren positiv für MCP-1. Im Gegensatz dazu waren JE/MCP-1-Transkripte in
9
vivo
in
niedrig-
und
hochgradigen
intraepithelialen
Läsionen
mit
nur
geringer
Makrophageninfiltration oder in vitro in der Zelllinie HeLa kaum oder gar nicht nachweisbar
(Rösl et al., 1994, Kleine-Lowinski et al., 1999). Interessanterweise resultierte die Transfektion
von HeLa-Zellen mit einem Expressionsvektor für JE/MCP-1 in einer Abnahme der
Tumorigenität
dieser
Zellen
in
Makrophageninfiltration, wohingegen
Nacktmäusen,
begleitet
von
einer
starken
die Inokulation von JE-negativen HeLa-Zellen zu
schnell wachsenden Tumoren ohne Makrophageninfiltration führte (Kleine et al., 1995).
Während
eine
deutliche
MCP-1-Produktion
zumindest
nach
IFN-γ-Stimulation
in
Vorhautkeratinozyten gesehen werden konnte, war die MCP-1-Produktion in mit HPV 16Onkogenen E6 und E7 immortalisierten zervikalen und Vorhaut-Keratinozyten auf mRNAEbene inhibiert, so dass eine auf E6 und E7 zurückzuführende MCP-1-Suppression
angenommen wurde (Kleine-Lowinski et al., 2003).
Chemokine sind über den Transkriptionsfaktor NF-B induzierbar (Moriuchi et al., 1997;
Ohmori und Hamilton, 1995). Synergistisch mit NF-B kann AP-1 die Promotoren der
Chemokin-Prototypen IL-8 und MCP-1 und von Zytokinen wie IL-6 und GM-CSF
transaktivieren (Dokter, Koopmans und Vellenga, 1996; Thomas et al., 1997).
Auf der anderen Seite induzierten HPV16- und 18-positive Karzinomzellinien (CaSki, C4-I,
HeLa, SW756) und HPK1a in kokultivierten CD14-positiven Monozyten STAT3 und die
Matrix-Metalloprotease MMP-9. In-vitro führte die STAT3-Aktivierung in den kokultivierten
Monozyten zu einer starken MCP-1-Produktion und über die autokrine Stimulation von CCR2
zu der von NF-ĸB-unabhängigen MMP-9-Induktion (Schröer et al., 2011). Tumorinfiltrierende
Makrophagen stellen eine wichtige Quelle für MMP-9 dar, dessen Expression und Aktivität in
CIN-III-Läsionen und Zervixkarzinomen mit einer schlechten Prognose korreliert (Sheu et al.,
2003).
2.1.3. Interleukin-6 und GM-CSF
Interleukin-6 besitzt ein breites Aktivitätsspektrum. Es ist z.B. an der Induzierung von AkutePhase-Proteinen in der Leber und an der Proliferation, Differenzierung und Aktivierung von Bund von T-Zellen beteiligt (Ramsay et al., 1994; Lotz et al. 1988; Takai et al., 1988; Kopf et
al., 1994). IL-6 kann in verschiedenen Zelltypen inflammatorische und angiogenetische
Zytokine wie MCP-1, GM-CSF und VEGF induzieren (Coletta et al., 2000; Marino et al.,
2008; Lederle et al., 2011). Allerdings werden auch immunsuppressive Eigenschaften von IL-6
diskutiert: IL-6 inhibiert in dendritischen Zellen die NF-κB-Bindungsaktivität und die
10
Expression von CCR7 auf transkriptioneller Ebene als auch die Produktion von TNF-α und IP10 (Hegde, Pahne und Smola-Hess, 2004). In Makrophagen induziert IL-6 IL-1Rezeptorantagonisten und löslichen TNFR-I (Tilg, Dinarello und Mier, 1997). Gegenüber
unterschiedlichen Tumortypen zeigt IL-6 entweder wachstumsinhibierende oder wachstumsfördernde Eigenschaften. Ein wachstumsfördernder Effekt wurde bei normalen oder
Papillomvirus-immortalisierten zervikalen Fibroblasten und bei verschiedenen Papillomviruspositiven Zervixkarzinomzelllinien beobachtet (Eustace et al., 1993; Iglesias, Plowman und
Woodworth, 1995). Der IL-6-Rezeptor gehört zur Zytokin-Rezeptor-Superfamilie und besitzt
eine -Untereinheit (gp80), welche das Zytokin mit geringer Affinität bindet. Gemeinsam
assoziieren die - und die -Untereinheit (gp130) zu einem Bindekomplex mit hoher Affinität
für IL-6. Die intrazellulären Domänen der -Ketten lagern sich als Homodimer zusammen und
induzieren daraufhin die rasche Phosphorylierung von Tyrosin-Kinasen der JAK-(JanusKinase)-Familie, JAK1, JAK2 und Tyk2. JAK1 und JAK2 sind ebenfalls essentiell für die über
den IFN--Rezeptor vermittelte Signaltransduktion. Des Weiteren sind der Transkriptionsfaktor
STAT3- („signal transducer and activator of transcription 3“) und das STAT1-Protein
involviert (Hibi, Nakajima und Hirano, 1996; Heß et al., 2000).
GM-CSF induziert die Proliferation und Aktivierung von erythroiden und myeloischen Zellen,
so auch von Granulozyten, Makrophagen, Eosinophilen und Megakaryozyten (Metcalf 1992).
Das Wachstum der meisten Zervixkarzinomzelllinien wird durch GM-CSF kaum beeinflusst
(Herzog et al., 1996). GM-CSF bewirkt in Synergismus mit IFN- die Differenzierung von
mononukleären Zellen zu tumoriziden Makrophagen. Die Lebensdauer solcher Makrophagen
und von Granulozyten mit tumorizidem Potential wird durch GM-CSF verlängert (Chokri et al.
1992; Colotta et al. 1992). Außerdem regt die Kombination von GM-CSF und IL-4 die
Entstehung von professionellen antigenpräsentierenden Zellen aus monozytären Blutzellen
entscheidend an. Die Rekrutierung von dendritischen Langerhanszellen in HPV-assoziierte
Läsionen der Cervix uteri scheint wesentlich von der GM-CSF-Produktion der Keratinozyten
abhängig zu sein. Hubert und Mitarbeiter (1999) konnten in vitro zeigen, dass die - im
Vergleich zur GM-CSF-Sekretion normaler zervikaler Keratinozyten - äußerst niedrige GMCSF-Sekretion von mit HPV in-vitro-transformierten Keratinozyten für die Einwanderung von
Langerhanszellen in präneoplastisches Epithelium von Bedeutung ist. GM-CSF induziert die
Expression von CD40 neben MHC-Klasse I, II und weiteren kostimulierenden Molekülen auf
Monozyten (Kiertscher und Roth, 1996; Laupeze et al., 1999; Alderson et al., 1993). Im Falle
einer Patientin mit zellulärer Immundefizienz und einer über Jahre bestehenden generalisierten
11
durch HPV2 verursachten Verrucosis führte eine Kombinationstherapie mit IFN- und GMCSF zu einer Regression der Warzen (Gaspari et al. 1997). Anhand des Transfers der
Zytokingene für IL-2, IL-4, GM-CSF oder TNF- in Tumorzellen hergestellte therapeutische
Tumorvakzinen wurden in Mausmodellen bereits erprobt. Chang et al. (1997) konnten im
Mausmodell zeigen, dass eine allogene Tumorzellvakzine, bestehend aus mit GM-CSF und mit
dem Tumorantigen HPV16-E7 transduzierten Melanomzellen, die Entstehung eines HPV16-E7
positiven Tumors unter Beteiligung von CD4+- und CD8+-T-Zellen verhindert.
3. Die immunmodulatorische Funktion von CD40
CD40, ein 45-50kDa Typ I-Transmembranprotein, zählt zu einer Rezeptorfamilie, deren
Prototypen die beiden TNF--Rezeptoren (TNFRSF1A und B, p55 und p75) sind. Neben
CD40, TNFRSF1A (TNFR-I) und TNFRSF1B (TNFR-II)
gehören unter anderem CD27,
CD30, RANK, TRANCE, 4-1BB, OX40, BCMA, TACI; BAFFR, CD95 (Fas) und NGFR der
TNFR-Familie an (Smith, Farrah und Goodwin, 1994; Anderson et al., 1997; Hanada, Hanada
und Penninger, 2010; Wong, Josien und Choi, 1999; Pelekanou et al., 2011). CD40 wird auf
professionell
antigenrepräsentierenden
Zellen,
wie
B-Lymphozyten,
Monozyten,
Langerhanszellen, dendritischen und follikulären dendritischen Zellen, exprimiert (Stout und
Suttles, 1996; Peguet-Navarro et al., 1995). Der Rezeptor lässt sich in sehr unterschiedlichem
Maße ebenso auf Endothelzellen, Thymusepithel- und tubulären Nierenepithelzellen,
epidermalen Basalzellen, Fibroblasten, T-Zellen und basophilen Granulozyten finden (Van
Kooten und Bancherau, 2000; Deckers et al., 1998; Hollenbaugh et al., 1995; Galy und Spits,
1992; Young et al., 1989; Fanslow et al., 1994; Dangari et al, 1997). Auch Zellen, die sich von
soliden malignen Tumoren ableiten, haben sich in einigen Fällen als CD40 positiv erwiesen
(siehe Tabelle 2). Auf der Zervixkarzinomzelllinie HeLa ließ sich CD40 nicht nachweisen
(Hess et al., 1995b).
Tabelle 2:
Maligne solide Tumoren mit deutlich erhöhter CD40 Expression
Tumor
malignes Melanom
epitheliales Harnblasenkarzinom
Nasopharyngealkarzinom*
12
Literatur
Thomas et al., 1996; Van den Oord et al., 1996
Jakobsen et al., 1998
Sbih-Lammali et al., 1999
Tumor
Mammakarzinom
Prostatakarzinom
kleinzelliges Bronchialkarzinom
hepatozelluläres Karzinom
Nierenzellkarzinom
Kaposi-Sarkom
Osteosarkom
Ewingsarkom
Burkitt-Lymphom*
Plattenepithelkarzinom der Haut
Literatur
Wingett et al., 1998
Rokhlin et al., 1997
Ledbetter et al., 1987
Sugimoto et al., 1999
Kluth et al., 1997
Pammer et al., 1996
Lollini et al., 1998
Lollini et al., 1998
Khanna et al., 1997
Jang et al., 2002
* Epstein-Barr-Virus assoziierte Tumoren
Zunächst wurde in der Literatur die CD40 Funktion auf B-Zellen charakterisiert, welche zur
klonalen Expansion von B-Zellen und zu ihrer Differenzierung zu antikörperproduzierenden
Plasmazellen führt. Hierbei wird der sogenannte Isotypenwechsel der beiden bereits von naiven
B-Zellen sezernierten Immunglobulinklassen IgM und IgD nach IgG, IgA und IgE via CD40 in
Kombination mit den Zytokinen IL-4 bzw. IL-2 oder IL-10 eingeleitet (Clark und Ledbetter,
1986; Rousset, Garcia und Bancherau, 1991). CD40L (CD154, gp35), der Ligand für CD40, ist
ein Typ II-Transmembranglykoprotein und ist als Homotrimer hauptsächlich auf aktivierten
CD4+-T-Zellen sowie auch auf NK-Zellen, Monozyten, Basophilen, aktivierten Eosinophilen,
Mastzellen und Thrombozyten zu finden (Vogel und Noelle, 1998). Die CD40L-CD40Interaktion ist nicht nur wichtig für die humorale Immunität. In einem zweischrittigen Modell
der CD40/CD40L-abhängigen Aktivierung von CD4+-T-Zellen wird CD40L auf T-Zellen
transient exprimiert, nachdem der naiven T-Zelle über den T-Zell-Rezeptor (TCR) ein Antigensignal in Form eines MHC-Peptid-Komplexes auf einer professionellen antigenpräsentierenden
Zelle angezeigt worden ist. Im zweiten Schritt induziert CD40L kostimulierende Moleküle, z.B.
CD80 oder CD86, auf der antigenpräsentierenden Zelle (APC). Die so „geprimte“ Zelle
übermittelt die kostimulierenden Signale wiederum den T-Zellen. Zusammen mit dem
Antigensignal von Schritt eins, dem CD40-Signal und Interleukin-12 werden die CD4+-TZellen aktiviert, so dass sie in den Zellzyklus eintreten, Zytokine produzieren und
Effektorfunktionen ausüben (Grewall und Flawell, 1996; Clarke 2000). Studien, in denen
gezeigt wurde, dass die Induktion des CD40-Liganden auf naiven T-Zellen in erster Linie via
TCR reguliert wird, und dass eine CD40-Stimulation die Expression kostimulierender
Moleküle auf APCs, d.h. Makrophagen, B-Zellen und dendritischen Zellen, heraufreguliert,
13
untermauern diese Vorstellung (Floros-Romo et al., 1997; Behrens et al., 2004). Neben der
Th1-Differenzierung hängen die Th17- und die CTL-Differenzierung von der CD40-CD40LInteraktion ab (Behrens et al., 2004; Iezzi et al., 2009). Weiterhin werden nach CD40Stimulation auf Hautkeratinozyten, Fibroblasten, Thymusepithel- und Endothelzellen
Leukozytenadhäsionsmoleküle heraufreguliert (Denfeld et al., 1996; Yellin et al., 1995; Galy
und Spits, 1992; Karmann et al., 1995). Bei Makrophagen und dendritischen Zellen induziert
die CD40-Stimulation die Produktion proinflammatorischer Zytokine, wie TNF-, IL-8 und IL12. Über CD40 kann auch die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität mediiert werden (MartinFontecha et al., 1999). Das „Crosslinking“ des CD40-Rezeptors führte aber auch in SV-40transformierten Nierenepithelzellen zu einer gesteigerten Produktion der Chemokine IL-8,
MCP-1 und RANTES oder bei Fibroblasten zur Induktion von IL-6 (Van Kooten et al., 1997;
Hess et al., 1995b).
Als ein zentraler Signalmechanismus induziert CD40 die Translokation von NF-B, einem
Transkriptionsfaktor, der viele an inflammatorischen Antworten beteiligte Gene, darunter IL-1,
IL-6, TNF, MCP-1, IL-8, GM-CSF sowie MHC-Klasse I und II, kontrolliert (Heß et al., 1995b;
Van Kooten und Banchereau, 2000). NF-B ist auch in die Regulation der Chemokinsynthese
und -expression im Falle von MCP-1, RANTES, IL-8 und IP-10 involviert (Martin et al., 1997;
Moriuchi et al., 1997; Duque et al., 1997; Wu et al., 1994; Varney et al., 2002; Thompson und
van Eldik, 2009).
Die Signaltransduktion wird über die intrazellulären Proteine TRAF
(„TNFR-assosiated factor“) 2, TRAF 3 und TRAF 6, die mit der zytoplasmatischen Domäne
von CD40 assoziieren, mediiert (Lee et al., 1999; Ishida et al., 1996; Elmetwali et al., 2010).
Danach bestimmen unterschiedliche Signalwege und Transkriptionsfaktoren wie z.B. STAT,
AP-1, NF-B und PIK3 die pleiotropen, vom Zelltyp abhängigen CD40-Effekte. Die
zytoplasmatische Domäne von CD40 weist Homologien zum zentralen Anteil der
Todesdomänen von TNFR und Fas auf. Hess und Engelmann konnten 1996 erstmals zeigen,
dass CD40L in nicht-hämatopoetischen Zellen, d.h. in mit CD40-transfizierten HeLa-Zellen
und in der humanen Fibroblastenzellinie SV80, jeweils unter Blockierung der Proteinsynthese
mit Cycloheximid, apoptotischen Zelltod auslöst. Der zytotoxische Effekt von CD40L ließ sich
durch Zugabe von TNF-α oder FasL sowie durch Vorstimulation mit IFN- γ erhöhen. Nicht nur
die Kombination von Cycloheximid und CD40L, sondern auch eine kombinierte Stimulation
von HeLaCD40-Zellen mit den Chemotherapeutica 5-Fluorouracil, Etoposid oder Quercetin und
die anschließende CD40L-Stimulation führten zum deutlichen Apoptoseanstieg (Hill et al.,
2005). Im Mausmodell konnten Grossmann, Brown und Brenner (1997) zeigen, dass durch
14
Transduktion des CD40L-Gens in ansonsten schwach immunogenen Neuroblastomzellen deren
Tumorigenität in erheblichen Maße abgeschwächt wird. In weiteren Studien konnten mit Hilfe
des CD40-Liganden immunologische Gentherapien gegen Tumoren, darunter Kolonkarzinome
und Melanome, in Mäusen realisiert werden (Kikuchi und Crystal, 1999; Gurunathan et al.,
1998). Für deren Wirksamkeit wurden vor allem CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten
verantwortlich gemacht. Diese Effektorzellen können auch in Abwesenheit von T-Helfer-Zellen
über die CD40L-CD40-Interaktion „geprimt“ werden (Toes et al., 1998). Bei mit Arena- bzw.
Rhabdoviren infizierten CD40L-knockout-Mäusen wurde von Borrow et al. (1996) eine
Reduktion virusspezifischer CD8+-Gedächtniszellen und ein stark verminderter Antikörpertiter
beobachtet. 1995 wurde erstmalig eine direkte antivirale Potenz des CD40-Liganden, der
offenbar die Replikation von Vacciniaviren und HSV-1 hemmt, von Ruby und Mitarbeitern
beschrieben.
4. Ziel der Arbeit
Zunächst sollte der Expressionsgrad von CD40 auf einer repräsentativen Anzahl HPV positiver
Karzinomzelllinien
und
HPV-transformierter
Keratinozytenzelllinien
mit
Hilfe
der
Durchflusszytometrie und mittels mikroskopischer Kontrolle analysiert werden.
Die Relevanz dieser In-vitro-Ergebnisse für die In-vivo-Situation sollte zunächst extern durch
immunhistochemische
Untersuchungen
an
dysplastischem
Zervixgewebe
und
an
Plattenepithelkarzinomen der Cervix uteri, durchgeführt von Herrn Prof. Dr. Stephan E. Baldus,
Institut für Pathologie, bestätigt werden (s. Anhang).
Im Folgenden sollten immunmodulatorische Funktionen von CD40 an Zervixkarzinomzellen
untersucht werden und darüber hinaus der Frage nachgegangen werden, ob die CD40Stimulation zur HPV-Genregulation in Zervixkarzinomzellen führt. Auf der Grundlage dass
CD40 in nicht-hämatopoetischen Zellen IL-6 induziert und NF-B mobilisiert, sollte getestet
werden, ob CD40 in Zervixkarzinomzelllinien nicht nur IL-6, sondern auch verschiedene βChemokine (MCP-1, MCP-3 und RANTES) und α-Chemokine (IL-8, IP-10) sowie GM-CSF
zu induzieren vermag. Die Auswirkungen von Stimulationen mit TNF- sowie mit dem CD40Ligand-verwandten Fas-Liganden sollten dabei der CD40-Stimulation gegenübergestellt
werden. Weiterhin sollte der kombinierte Einfluss des CD40-Liganden und von IFN-, einem
Zytokin, das in erster Linie von aktivierten T-Lymphozyten sezerniert wird, beleuchtet werden.
Eine TNF--Stimulation sollte parallel bei allen Versuchen mitgefüht und mit den Ergebnissen
der CD40-Stimualtion verglichen werden.
15
II. MATERIAL
1. Zellen
1.1. Eukaryote Zellen
1.1.1. humane Zelllinien
Tabelle 3A: Zervixkarzinomzelllinien
Bezeichnung
(ATCC-Nr.)*
C33A
(HTB 31)
C4-I
(CRL-1595)
CaSki
(CRL-1550)
HeLa
(CCL-2)
HeLaCD40
ME-180
(HTB-33)
SiHa
(HTB-35)
SW756
Gewebe /
Herkunft
persistierende
virale DNA
Undifferenziertes
—
Zervixkarzinom einer
66-jährigen
Kaukasierin
zervikales PlatteneHPV18-DNA
pithelkarzinom, Stage (1 Kopie/Zelle)
II, Grad IV, einer 41jährigen Kaukasierin
Bemerkungen
Mutationen des p53und des pRB-Gens,
aneuploid,
tumorigen
hypodiploid,
invasives Wachstum
nach subkutaner
Injektion in Nacktmäuse
epidermoides Zervix- HPV16
hypertriploid,
karzinom einer 40(bis zu 600
induziert in Nacktjährigen Kaukasierin, Kopien/Zelle) mäusen Tumore mit
Omentummetastase
Anzeichen für Differenzierung
zervikales Adenokar- HPV18
aneuploid,
zinom einer 31(10-50 Kopien/ tumorigen
jährigen Patientin
Zelle)
HeLa-Klon,
HPV18
CD40-Rezeptortransfiziert mit dem
Expression
Vektor BOS-CD40,
Neomycin-resistent
zervikales PlattenSubtyp von
hyperdiploide bis hyepithelkarzinom einer HPV68
pohexaploide Zell66-jährigen kaukasi- (HPV68b)
linie, bildet in Nacktschen Patientin,
mäusen gut differenOmentummetastase
zierte epidermoide
Karzinome (Grad I)
undifferenziertes zer- HPV16
hypertriploid,
vikales Plattenepithel- (1-2 Kopien/
in Nacktmäusen
karzinom einer 55Zelle)
schlecht differenzierte
jährigen Japanerin,
epidermoide
Grad II
Karzinome (Grad III)
schlecht
HPV18
tetraploid, in Nacktdifferenziertes
(10-50 Kopien/ mäusen Tumoren
zervikales PlattenZelle)
ähnlich der Originalepithelkarzinom einer
biopsie mit
46-jährigen
vereinzelter
Kaukasierin
Zytokeratinisierung
Literatur
Auersperg, 1964;
Crook et al., 1991;
Scheffner et al.,
1991
Auersperg und
Hawryluk, 1962;
Schneider-Gädicke
und Schwarz, 1986
Pattillo et al., 1977;
Dürst et al., 1991
Gey et al., 1952;
Schwarz et al.,
1985
CD40-cDNAKlonierung und
Transfektion s. Heß
et al., 1995b
Sykes et al., 1970;
Rutgers et al., 1988
Chen et al., 1989;
Longuet,
Beaudenon und
Orth, 1996
Friedel et al., 1970
Freedman et al.,
1982;
Popescu et al.,
1987
*American Type Culture Collection (ATCC): Catalogue of cell lines and hybridomas. 7th ed. Rockville 1992
16
Tabelle 3B: in-vitro-transformierte Zelllinien
Bezeichnung
HPKIa
K51, K64
und 156
Gewebe /
Herkunft
persistierende
virale DNA
In-vitroimmortalisierte
juvenile VorhautKeratinozyten
HPV16
(2-3 Kopien/
Zelle)
In-vitroimmortalisierte
VorhautKeratinozyten
HPV18
Bemerkungen
Literatur
HPKIa bildet in
Dürst et al., 1987,
Nackt-Mäusen Zysten 1991
mit differenziertem,
epithelartigem Aufbau
aus - Regressionen
nach etwa vier
Wochen.
Korrespondenz mit
—
L.A. Laimins
Tabelle 3C: weitere verwendete Zelllinien
HaCaT
SKv
Epidermis, abgeleitet
von spontan
immortalisierten
Zellen
aneuploid,
Boukamp et al.,
Differenzie1988
rungsmarker: Keratin
1 u.10, Involucrin u.a.,
differenzierungsfähig /
nicht tumorigen in
Nacktmäusen
Vulva-Keratinozyten, HPV16
geringe Tumorigenität Malejczyk et al.,
Bowenoide Papulose (10-20 Kopien/
1994
mit präkanzerösen
Zelle)
Merkmalen
—
C4-I-, ME-180- und SW756-Zellen wurden freundlicherweise von Herrn Professor Dr. M.
von Knebel-Doeberitz, Heidelberg, die HPV18-E6/7 in-vitro-transformierten Zelllinien K51,
K64 und I56 von Herrn Dr. L. A. Laimins, Chicago, bereitgestellt. CaSki-, SiHa- und SkvZellen wurden von Herrn Professor Dr. P.G. Fuchs, Köln, zur Verfügung gestellt, die
HeLaCD40-Transfektanten waren von Frau Prof. Dr. Smola, Homburg, hergestellt worden.
1.1.2. Säugetierzellen
BHK-Zellen (baby hamster kidney), Cricetus cricetus
Boehringer Mannheim
BHKCD40L, transfiziert mit CD40L cDNA
Literatur: Hess et al., 1995a
BHKFasL, transfiziert mit FasL cDNA
hergestellt von Frau Prof.
Dr. Smola, Homburg
1.2 Bakterien
Epicurian Coli SURE 2 Supercompetent Cells
Stratagene, Heidelberg
17
2. Nukleinsäuren
2.1. Plasmide
4321-Luc, von pALuc abgeleiteter Vektor, der die komplette HPV18-LCR (Positionen 6929 bis
120) sowie das Luciferase-Gen von P. pyralis enthält. In den promoterlosen pALuc-Vektor
wurde
die HPV18-LCR
als
HindIII-BamHI-Fragment aus
einem Chloramphenicol-
Acetyltransferase-(CAT)-Plasmid von F. Thierry und C. Demeret, Pasteur Institute, Paris,
kloniert (Steger und Corbach, 1997; Demeret et al., 1994). Das 4321-luc Plasmid stammt von
Frau Dr. G. Steger, Köln.
pCMV--Gal, Reporter-Vektor mit dem -Galaktosidase-Gen von E. coli unter der Kontrolle
des frühen Zytomegalie-Virus Promotors bzw. Enhancers.
2.2. Längenstandard
1kb-DNA-Ladder
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
3. Enzyme
Trypsin-EDTA
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
4. Medien
4.1. Medien für die Zellkultur
Einfriermedium
10% DMSO in FKS, sterilfiltriert
„Standard“-Kulturmedium für alle verwendeten
Zelllinien (mit Ausnahme von HeLaCD40,
BHKCD40L, BHKFasL, K51, K64 und I56)
Medium für HeLaCD40
DMEM (Dulbeco’s minimal essential medium)
zzgl. 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin,
1% Pyruvat (alles von Gibco BRL)
Medium für BHKCD40L
„Standard“-Kulturmedium (s.o.)
zzgl. 100g/ml Geneticin, 200nM
Methotrexat
„Standard“-Kulturmedium (s.o.)
zzgl. 200g/ml Geneticin
Medium für BHKFasL
Medium für K51, K64 und I56
18
„Standard“-Kulturmedium (s.o.)
zzgl. 300g/ml Geneticin
75% DMEM, 25% Ham’s F12 Medium (Gibco)
zzgl. 10% FKS, 350g/ml L-Glutamin, 50g/ml
Gentamycin, 0,4g/ml Hydrokortison, 10-10M
Cholera Toxin, 10ng/ml EGF, 5g/ml Transferrin,
2  10-11M Triiodthyronin, 1,8 x 10-4 M Adenin,
5g/ml Insulin
4.2. Medien für die Bakterienkultur
LB (Luria-Bertani-)Medium; autoklaviert
20g LB Broth Base
ad 1000ml dH2O
Medium für die Transformation von Bakterien
pH 6,1; sterilfiltriert; aufbewahrt bei 4°C
10% Polyethylenglucol, 5% Dimethysulfoxid,
10mM MgCl2, 10mM MgSO4, in LB Medium
5. Humane rekombinante Zytokine
GM-CSF, IL-6, IL-8, MCP-1, RANTES
Tebu, Frankfurt am Main
MCP-3, TGF-1
RD, Wiesbaden
Interferon-
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
6. Antikörper
6.1. Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen
monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes CD40Antigen, IgG1,
PharMingen, Hamburg
G28-5, monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes CD40- ATCC
Antigen, aus Hybridomüberstand
Sigma, Deisenhofen
MOPC 21, Maus IgG1,
Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugiertes polyklonales
Ziegen-anti-Maus-Immunglobulin G; F(ab’)2-spezifisch
Dianova, Hamburg
6.2. ELISA-Antikörper
monoklonaler Kaninchen-Antikörper, IgG, gegen humanes
GM-CSF (als Primär-/Coating-Antikörper)
PharMingen, Hamburg
monoklonaler Ratten-Antikörper, IgG, gegen humanes IL-6
(als Primär-/Coating-Antikörper)
PharMingen, Hamburg
monoklonale Maus-Antikörper, IgG, (als Primär-/CoatingAntikörper) gegen die humanen Zytokine:
IL-8
IP-10
Sigma, Deisenhofen
RD, Wiesbaden
19
MCP-1, MCP-3
PharMingen, Hamburg
TGF-1
Biotrend Chemikalien, Köln
Biosource, Fleurus, Belgien
RANTES
polyklonale Kaninchen-Antikörper (als Detektions-Antikörper)
gegen die humanen Zytokine:
GM-CSF, IL-6, IL-8, MCP-1, RANTES
Tebu, Frankfurt am Main
polyklonaler Maus-Antikörper (biotinylierter SekundärAntikörper) gegen humanes MCP-3
PharMingen, Hamburg
polyklonaler Hühner-Antikörper, IgY, gegen humanes TGF- 1 RD, Wiesbaden
(als Sekundär-Antikörper)
polyklonaler Ziegen-Antikörper, IgG, gegen humanes IP-10
(biotinylierter Sekundär-Antikörper)
derivatisierte/markierte Immunkomponenten:
goat anti-chicken, biotinyliertes IgG
Peroxidase-konjugiertes goat anti-rabbit F(ab’)2
Peroxidase-konjugiertes Streptavidin
RD, Wiesbaden
Vector, Burlingame, USA
Dianova, Hamburg
Dianova, Hamburg
7. Reagenzien
Agarose
BIOzym diagnostik, Hess. Oldendorf
Ampicillin
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
rATP (Adenosintriphosphat)
Sigma, Deisenhofen
Borsäure
ICN Biomedicals, Meckenheim
DTT (Dithiothreitol)
Promega, Mannheim
EtOH (Ethanol)
Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid
Boehringer, Mannheim
FKS (fötales Kälberserum)
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
FuGene™6 Transfektions-Reagenz
Boehringer, Mannheim
Geneticin (G418-Sulfat)
Gibco BRL, Eggenstein
Gentamycin
Gibco – Life Technologies, Eggenstein
Isopropanol (2-Propanol)
Roth, Karlsruhe
LB Agar
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
LB Broth Base
Gibco BRL - Life Technologies, Eggenstein
D-Luciferin (Photinus pyralis Luciferin)
Boehringer, Mannheim
[D-(–)-2-6’-Hydroxy-benzothiazolyl)-2Thiazolin-4-Carboxylsäure]
20
ONPG (O-Nitrophenyl--D-Galactosidase)
Bachem, Heidelberg
Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories, Linz, Österreich
Tween
Serva, Heidelberg
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indollyl--DGalactopyranosid)
Promega, Mannheim
Alle hier nicht aufgeführten Reagenzien wurden entweder von Merck, Darmstadt, oder von
Sigma, Deisenhofen, bezogen.
8. Fertige Reagenziensysteme (Kits)
Plasmidisolierung
Qiagen, Hilden
9. Lösungen und Puffer
PBS
DNA-Probenauftragspuffer
(bei –20 °C aufbewahrt)
Sörensens Zitratpuffer
80,7g Na2HPO4, 24,34g KH2PO4, 43,84g
NaCl, ad 10 Liter H2O
0,25% Bromphenolblau, 0,25%
Xylenecyanol; 30,0% Glycerol
0,1M Di-Natriumcitrat, 0,1M HCl;
1:1 mit 95% EtOh verdünnt
10 x TBE (Tris-Borat-EDTA)
20mM Tris ; 1mM EDTA ; 1,5M NaCl
TE-Puffer
10mM Tris-Cl (pH 7,5), 1mM EDTA (pH 8,0)
ELISA:
Blockierungspuffer (aufbewahrt bei 4°C)
Blockierungspuffer für den RANTESELISA
0,5% BSA, 0,05% Tween, 0,02% NaN3; in PBS
5,0% Magermilchpulver, 0,05% Tween, 0,02%
NaN3; in PBS
Citratpuffer; pH ca. 5,1; sterilfiltriert
6,5ml 1M Na-Citrat (pH 7,8), 3,5ml 1M
Zitronensäure (pH 2); ad 100ml H2O
-Gal-Färbung und -Gal-Essay:
Färbelösung für -Gal-Färbungen
-Gal-Puffer
0,4mg/ml X-Gal, 2mM MgCl2, 4mM K3Fe(CN)6,
4mM K4Fe(CN)6, 3,9l 100mM Spermidin auf 50
ml; in PBS
1% Mg (1mM MgCl2, 45mM -Mercapto-ethanol
in H2O) in PBS
Luciferase-Essay:
Luciferase-Essay-Puffer
1ml 1M K-PO4 (pH 7,8), 150l 1M MgSO4,
500l rATP-Stock, 8,35ml H2O
(Vor den Messungen mit dem Biolumat LB9500
21
Luciferase-Extraktionspuffer
Luciferin-Stock (ca. 35,6 mM D-Luciferin)
rATP-Stock
wurde Luciferin-Stocklösung in einer
Arbeitskonzentration von 1:100 zugesetzt.)
100mM KH2PO4/K2HPO4 (pH 7,8), 1mM DTT
10mg D-Luciferin, 714l Luciferase-Essay-Puffer
200mg rATP, 2,5ml H2O, 600ml 1M Tris Base,
pH 7 einstellen mit 1M Tris-Base; ad 3,3 ml H2O
10. Geräte und Laborhilfsmittel
Analysenwaage FA-210-4
Faust, Köln
Brutschrank Steri-Cult 200 Incubator
Labotect-Technik, Göttingen
Dia Filme
Fuji Professional (800-1600 Asa)
Kodak Ektachrome 400 und 160T
Durchflusszytometer (FACScan™)
Becton Dickinson, Heidelberg
ELISA-Reader
SLT-Labinstrumente, Hannover
Einfrierampullen
Nunc, Wiesbaden
Einmalspritzen 20 ml
AMEFA, Kriftel
Elektroporationsgerät Equibio Easyject
Eurogentec, Darmstadt
Fotometer:
Pharmacia Gene Quant RNA/DNA Calculator
UVIKON 9x2 Spectrophotometer
Pharmacia Biotech, Freiburg
Kontron Instruments, Neufahrn
Gefriertruhe
Heraeus sepatech, Osterode
Gelkammern
MWG Biotec, Ebersberg (Oberbay)
Biorad, Ispringen
Kamera (UV-Licht-Anlage)
Herolab, Wiesloch
Luminometer: Lumat LB9501
Berthold, Wildbad
Magnetrührer und Magnetheizrührer
IKA-Labortechnik, Staufen
Mikroskop Axiovert 135 (mit UV-Licht)
Carl Zeiss Jena
Mikrotiterplatten:
PS-Microplatte 96K F-Form
PS-Microplatte 96K U-Form
(PS-Abdeckplatte 127,0/85/11 mm
Nunc-ImmunoPlate Maxisorp™
Greiner, Frickenhausen
Greiner, Vertrieb: Fastnacht, Bonn
Greiner)
Nunc, Wiesbaden
pH-Indikatorstäbchen, pH 0-14
Merck, Darmstadt
pH-Meter Sen Tix 97 T
WTW (Wissenschaftlich-Technische
Werkstätten GmbH), Weilheim
Pipettierhilfen:
Multikanalpipette
0,5 - 10 l, 10 - 100 l, 20 – 200 l und
100 - 1000 l
Multipette 4780
22
Nichiryo Modell 7000
SLG Nichiryo SL-Petten,
Vertrieb: Südlaborbedarf, Gauting
Eppendorf, Hamburg
Pipetus-Akku
Pipetboy acu
Faust, Köln
Integra Biosciences, Aachen
Pipettenzubehör:
Glaspipetten 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml
Pipettenspitzen 10 l
Pipettenspitzen 100 l, 1000 l
Ritips 2,5 ml, 5 ml, 12,5 ml
(Einsätze für Multipette)
Faust/Merck, Köln
Sarstedt, Nümbrecht
Greiner, Vertrieb: Fastnacht, Bonn
Ritter, Schwabmünchen
Plastikröhrchen Nr.55.476 für Luminometer
Sarstedt, Nümbrecht
Vakuum-Pumpe
Neuberger, Freiburg
Reaktionsgefäße:
Safe Lock 0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml
Eppendorf, Hamburg
Schüttelinkubator:
Gyrotory Water Bath Shaker Model G76
Spannungsgeber PHERO-stab. 300
New Brunswick Scientific Edison,
Nürtingen
Biotec-Fischer, Reiskirchen
Spiegelreflexkamera
Olympus OM-2N, Japan
Sterilbank Laminair HB 2448
Heraeus, Düsseldorf
Sterilfilter 0,2 m
Gelman Sciences, Lappersdorf (Oberpfalz)
Thermoblöcke:
Thermomixer 5436
Thermostat 5320
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf, Hamburg
Umkehrmikroskop Labovert FS
Leitz, Bensheim
Vortexer VF2
IKA-Labortechnik, Staufen
Waage
Sartorius, Göttingen
Wasserbäder:
Typ SB D50-1 BIO
Julabo 12B
Hetolab Equipment, Allered, Dänemark
Julabo, Seelbach
Zellkulturplastikflaschen:
25 cm2
75 cm2, 150 cm2
Becton Dickinson (Falcon), Heidelberg,
Vertrieb: Renner, Dannstadt
Greiner, Vertrieb: Fastnacht, Bonn
Zellkulturplastikschalen:
30 x 15 mm, 60 x 15 mm, 150 x 20 mm
Renner, Dannstadt
Zellkulturplatten mit 6 bzw. 24
Vertiefungen, Flachboden
Becton Dickinson (Falcon), Heidelberg,
Vertrieb: Renner, Dannstadt
(Einweg-)Zellschaber
Sarstedt, Nümbrecht
Zentrifugen:
5417 R, Kühlzentrifuge
Labofuge M
Sigma 2K15, Kühlzentrifuge
Eppendorf, Hamburg
Heraeus, Düsseldorf
Sigma, Osterode
23
Sorvall RC-5, Kühlzentrifuge
Varifuge 3.2 RS
Varifuge 3.OR, Kühlzentrifuge
Zentrifugenröhrchen 50 ml
Du Pont de Nemours, Bad Homburg
Heraeus sepatech, Düsseldorf
Heraeus, Hanau
Renner, Dannstadt
11. Software
Cell Quest
Becton Dickinson, Heidelberg
SLT Programm für ELISA-Reader
SLT Computer, Leverkusen
SPSS 6.1.1S PMAC BASE SITE LIC
SPSS inc., Regionales Rechenzentrum Köln
(Landeslizenz Nordrhein-Westfalen)
24
III. METHODEN
1.Zellkultur
1.1. Kultivierung
Die verwendeten Zelllinien wurden bei 37°C und einer fünfprozentigen CO2-Atmosphäre in
den entsprechenden Medien, deren Zusammensetzungen in Kapitel II.4.2. aufgelistet sind,
gehalten. Fötales Kälberserum wurde bei -20°C gelagert, nachdem es für 30 Minuten auf 56°C
im Wasserbad erhitzt worden war. Die Hitzeinaktivierung diente zur Inaktivierung von
Komplement und zur Denaturierung von Immunglobulinen sowie zur Zerstörung des
Fibrinogens. Die Medien der Monolayerkulturen wurden ca. dreimal in der Woche gewechselt,
wobei die Menge des eingesetzten Mediums 0,2 bis 0,3ml pro cm2 Wachstumsfläche betrug.
Waren die Zellen konfluent, wurden sie folgendermaßen passagiert:
– Absaugen des Mediums mit der Pasteurpipette
– Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, ohne Calcium und Magnesium)
– Inkubation mit Trypsin-EDTA-Lösung (0,05ml/cm2); Einwirkzeit zwischen 3 und 10
Minuten
bei
37°C;
Kontrolle
des
Trypsinierungsprozesses
unter
dem
Phasenkontrastmikroskop.
– Abgelöste Zellen wurden in ein Zentrifugengefäß mit vorgelegtem frischem Medium
(Verhältnis 1:1) pipettiert. Der Serumzusatz des Mediums bewirkt eine Inaktivierung des
Trypsins und komplexiert auch EDTA.
– Im Falle von I56, K5I, K64, HPKIa und SW756 wurden die Zellen zunächst niedrigtourig
pelletiert (250xg; 6 Minuten; RT) und in frischem Medium resuspendiert. Die anderen
Zelllinien wurden direkt in einem Verhältnis von beispielsweise 1:6 in neue Kulturgefäße
gegeben und das Volumen mit neuem Medium aufgefüllt.
1.2. Langzeitlagerung
Über einige Monate nicht benötige Zellen wurden auf folgende Weise eingefroren und bei 80°C aufbewahrt:
– Aufnahme frisch trypsinierter Zellen in Medium und Zentrifugation (250xg; 6 Minuten; RT)
– Resuspension der Zellpellets in kaltem Einfriermedium (FKS mit 10% DMSO-Zusatz als
Gefrierschutz)
– Überführung der Zellsuspension auf Kryoröhrchen, die sofort auf Eis bzw. in die
25
Tiefgefriertruhe gestellt wurden
Auftauen von Zellen:
– Einfrierampulle kurzzeitig in den Brutschrank bei 37°C stellen.
– Das Röhrchen danach kurz mit 70%igen Ethanol desinfizieren und den Inhalt in ein
Zentrifugengefäß mit vorgelegtem 37°C warmen Medium pipettieren.
– Zentrifugation bei 250xg; 6 Minuten lang bei RT
– Überstand komplett absaugen und die Zellen in neuem Medium resuspendieren.
– Überführung in zunächst kleine Kulturflaschen (25cm2).
1.3. Zellzählung
Die Zellkonzentration wurde mittels Hämozytometer (Neubauer-Kammer) bestimmt.
1.4. Herstellung Paraformaldehyd-fixierter BHK-Zellen
Für
die
transienten
Transfektions-Experimente
und
die
Zellkultur-Essays
mit
Neutralrotfärbungen wurden BHK-Zellen, die den membrangebundenen CD40-Liganden ektop
exprimieren (BHKCD40L), und die Wild-Typ Variante (BHKwt) zuvor in dreiprozentigem
Paraformaldehyd fixiert. Diese Methode verhindert eine Anheftung von BHK-Zellen an den
Böden der Vielfachschalen oder Mikrotestplatten, welche mit dem Wachstum der zu
untersuchenden Zelllinien und mit der Ermittlung das Überleben von HeLaCD40-Zellen in
Zytotoxizitätsassays (vgl. I.1.5.) interferieren könnte. Die Intaktheit des zellgebundenen CD40Liganden bleibt bei dieser Methode erhalten, dagegen unterbleibt seine ansonsten massive
Sekretion in den Kulturüberstand. Heß und Engelmann (1996) beobachteten unter anderem,
dass der membrangebundene Ligand auf fixierten Zellen eine höhere Aktivität als
konzentrierter löslicher Ligand zeigt.
Mehrere Schritte waren zur Fixierung notwendig:
– Subkonfluente BHK-Monolayerkulturen wurden zweimal mit PBS (ohne Calcium und
Magnesium) gewaschen und mit 5mM EDTA abgelöst. Trypsinierung wurde wegen einer
Internalisierung von Membranmolekülen als möglicher Folge vermieden.
– Aufnahme in PBS (ohne Calcium und Magnesium) im Verhältnis 1:1.
– Zentrifugation bei 250 x g; 6 Minuten lang bei RT
– Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 6 bis 10ml 3% Paraformaldehyd in PBS
(ohne Kalzium und Magnesium) über eine Dauer von genau 9 Minuten resuspendiert bzw.
26
durchmischt.
– Danach Zugabe von ca. 20ml DMEM mit 10% FKS.
– Zentrifugieren über 16 Minuten bei 1080xg.
– Nach Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 20ml PBS resuspendiert und wieder
abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde fünfmal wiederholt.
– Um eventuell noch vorhandenes Paraformaldehyd gänzlich herausdiffundieren zu lassen,
wurde die Suspension noch über 30 Minuten in DMEM zzgl. 10% FKS bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden danach zum Teil eingefroren, wie es unter
“Langzeitlagerung” beschrieben ist; in diesem Falle wurden die Zellen nach dem Auftauen
noch zweimal in PBS gewaschen und abzentrifugiert, um das DMSO des Einfriermediums
zu eliminieren.
1.5. Zytotoxizitätstest
Paraformaldehyd-fixierte BHKCD40L-Zellen wurden mit Hilfe eines Zytotoxizitätstestes auf die
Aktivität ihres CD40-Liganden hin überprüft:
– In Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen wurden 2,7 · 104 HeLaCD40-Zellen/Vertiefung in
Kulturmedium (ohne Geneticin) ausgesät und im Brutschrank über 24 Stunden inkubiert.
– Stimulation mit Paraformaldehyd-fixierten BHKCD40L- bzw. BHKwt-Zellen in vier
Konzentrationen (6,6 · 103; 2,0 · 104; 6,0 · 104; 1,8 · 105 BHK-Zellen/Loch) und jeweils im
Doppelansatz. Das Stimulationsmedium enthielt 50g/ml Cycloheximid (in DMEM mit
10% FKS, 100U/ml Penicillin, 0,1mg/ml Streptomycin, 1mM Pyruvat und 2mM L-AlanylL-Glutamin). BHK-Zell-Verdünnungsreihen wurden zuerst in „Masterplatten“ vorpipettiert.
Die Stimulationsvolumina (100l/Well) wurden mit Hilfe einer Multikanalpipette nach
Abkippen des vorherigen Mediums auf die Testplatten übertragen. Zum Schutz gegen
Verdunstung wurden Deckel und Platten in Klarsichtfolie eingewickelt.
– HeLaCD40-Zellen wurden auch mit TNF- in vier Konzentrationen (1000U/ml, 200U/ml,
40U/ml und 8U/ml) im Doppelansatz stimuliert.
– Außerdem wurde jeweils ein paralleler Test mit analogem Aufbau aber in Abwesenheit von
Cycloheximid durchgeführt.
– Nach 18 Stunden wurde das Medium ausgeschlagen und die Mikrotiterplatten über eine
Dauer von zwei Stunden mit Neutralrot (1:100 verdünnt in DMEM + 10% FKS, 100U/ml
27
Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin, 1mM Pyruvat, 2mM L-Alanyl-L-Glutamin) im
Brutschrank inkubiert.
– Danach wurden 150l PBS pro Well zugegeben und nochmals mit PBS gewaschen.
Schließlich wurden 100l/Well Sörensens Citrat-Puffer aufpipettiert.
– Nach 30 Minuten erfolgte die Messung der Extinktionen mit einem SLT-ELISA-Reader
(Messfilter 550nm, Referenzfilter 492nm).
1.6. Transiente Transfektion
1.6.1. Elektroporation
1.6.1.1. Optimierung der Tansfektionseffizienz
Die Elektroporation ermöglicht den transienten oder stabilen Transfer fremder DNA in eine
Wirtszelle mittels elektrischer Impulse, welche eine Zellmembrandestabilisierung mit
vorübergehender Porenbildung bewirken. Hierdurch wird der Eintritt von Makromolekülen wie
DNA in das Zytoplasma bzw. das Nukleoplasma ermöglicht. Die Einstellung variabler
Parameter wie die elektrische Feldstärke und das Zellvolumen wurden für HeLa-Zellen mit
Hilfe des pCMV--Gal-Vektors und der -Gal-Färbemethode (vgl. III.4.2.) optimiert.
Die Feldstärke E ist definiert durch die Formel E = V/d. V beschreibt die Spannung (Einheit
Volt [V]) und d die Distanz, welche die Spannung zwischen den Elektroden durch den
Küvettenspalt (hier 0,4cm) zurücklegt. Die Pulslänge ist definiert als R · C, wobei R den
Widerstand (Einheit Ohm []), und C die Kapazität (Einheit Faraday [F]), darstellt. Der
Widerstand wird hierbei von Faktoren wie der Ionenstärke des Elektroporationspuffers und der
Zelldichte bestimmt (Putirka und Iacobelli, 1993). Als Puffer erwies sich DMEM mit 10% FKS
geeigneter als PBS. Die Zellsuspension enthielt ca. 1,2 · 106 Zellen in 0,8ml pro Küvette und
wurde vor Anlegen des elektrischen Impulses 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
In Schritten von jeweils 10 Volt wurde die Spannung zwischen 220 und 350 Volt im
Doppelansatz variiert. Ein exzessiver Zelltod stellte sich bei Versuchsbedingungen mit hohen
Voltzahlen (z.B. 1200V) ein. Für die Kapazität wurden jeweils drei verschiedene Einstellungen
getestet, und zwar 900F, 1050F und 1500F. Eine optimale Effizienz der elektrischen
Transfektion wurde schließlich bei 300V und 1050F erreicht.
28
1.6.1.2. Reportergen-Assays
– Subkonfluente HeLaCD40-Monolayerkulturen wurden zweimal mit PBS gewaschen,
trypsiniert und mit 250xg abzentrifugiert.
– Nach Resuspension der Zellen mit DMEM (zzgl. 10% FKS, 100U/ml Penicillin und
0,1mg/ml Streptomycin) Einstellung auf eine Zellkonzentration von ca. 8 bis 9 · 106
Zellen/ml.
– Zu 0,8ml der Zellsuspension pro Küvette wurden jeweils 10g 4321-luc DNA (oder 10g
pCMV--Gal-Vektor) zugegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
– Anlegen des Impulses (300V, 1050F).
– Danach Aufnahme in einem Röhrchen mit vorpipettiertem, frischem Medium (DMEM mit
10% FKS, 0,1mg/ml Streptomycin und 100U/ml Penicillin), worin die Zellen der 10
Elektroporationsküvetten gesammelt wurden. Anschließend Zentrifugation, Resuspension
in 40ml Medium und Aussaat in 20 Vertiefungen zu gleichgroßen Anteilen, d.h. in
2ml/Loch, so dass eine gleiche Zellverteilung gewährleistet war (siehe hierzu auch II.4.3).
Die Wachstumsfläche einer Vertiefung betrug 9,62cm2.
– Nach 24 Stunden wurden die transient transfizierten HeLaCD40-Zellen in folgender Weise
stimuliert: vier Vertiefungen mit 2,5ml Medium allein (DMEM, 10% FKS, 0,1mg/ml
Streptomycin und 100U/ml Penicillin), sechs Vertiefungen mit je 2 · 106 Paraformaldehydfixierten BHKCD40L-Zellen (entspricht 8 · 105 BHK-Zellen/ml), sechs Vertiefungen mit je 2
· 106 Paraformaldehyd-fixierten BHKwt-Zellen und vier Vertiefungen mit 1000U/ml TNF*. Die Stimulation erfolgte in jeweils 2,5ml Medium über eine Dauer von ca. 43 Stunden
im Brutschrank (37°C).
– Zur Entfernung von BHK-Zellen wurden die HeLaCD40-Zellen vor dem Abschaben unter
mikroskopischer Kontrolle schonend mit 37°C warmem DMEM gewaschen.
– Für das sich anschließende Luciferase-Assay
wurden die Zellen aus zwei identisch
stimulierten Vertiefungen zu jeweils einem Ansatz zusammengefasst, so dass letztlich im
Falle von Medium und TNF- Doppelansätze, im Falle von BHKCD40L und BHKwt
Dreifachansätze resultierten. Auf diese Weise wurden RLU-Werte in einer Größenordnung
von ca. 10000 pro Ansatz im Schnitt erreicht. Die Hintergrundintensität betrug dagegen ca.
120 RLUs. Der gesamte Versuch wurde dreimal reproduziert.
 1 Unit TNF- entspricht der Aktivität des Zytokins, die 50% von L292 Zellen abtötet.
29
1.7. Induktion der Zytokinproduktion in Zelllinien
1.7.1. Stimulation mit BHKCD40L-Zellen, BHKwt-Zellen und TNF-
– Subkonfluent gewachsene Kulturen von Zervixkarzinom- und in-vitro-transformierten
Zelllinien wurden im Brutschrank 24 Stunden lang mit 1000U/ml humanem Interferon-
bzw. parallel ohne Interferon- in DMEM (zzgl. 10% FKS, 100U/ml Penicillin und
0,1mg/ml Streptomycin) vorinkubiert.
– Danach erfolgte die Aussaat von 1,5  105 Zellen/Loch Kulturplatten mit 24 Vertiefungen.
Solche Zellen, welche zuvor mit IFN- behandelt worden waren, wurden für weitere 24
Stunden mit 1000U/ml IFN- inkubiert, so dass die Gesamtdauer der IFN--Stimulation
zwei Tage betrug.
– Die Keratinozyten wurden daraufhin in Doppelansätzen mit lebendigen BHKCD40L- oder
BHKwt-Zellen in drei Konzentrationen (2,0 104 BHK/Loch; 6,0  104 BHK/Loch; 1,8  105
BHK/Loch) im Brutschrank stimuliert.
– Die verwendeten embryonalen Hamsterzellen (BHK) wurden vor dem Ablösen mit 5mM
EDTA in PBS in den entsprechenden Medien (vgl. II.4.1.) bis zum Erreichen von
Subkonfluenz kultiviert. Die als Stimulus einzusetzende Menge wurde mit Hilfe eines
„Vortests” ermittelt, bei welchem 1,8  106 ausgesäte BHK-Zellen innerhalb des Stimulationszeitraumes von 16 Stunden (s.u.) die Wachstumsfläche einer Vertiefung (2,41 cm2)
in Form eines konfluenten Zellrasens bedeckten.
– Parallelstimulationen wurden mit löslichem TNF- in drei Verdünnungen (10U/ml;
100U/ml; 1000U/ml) sowie mit Medium allein durchgeführt.
– Das Stimulationsvolumen betrug bei allen Ansätzen 300l DMEM (mit 10% FKS, 100U/ml
Penicillin und 0,1mg/ml Streptomycin) pro Loch. Altes Medium wurde zuvor abgesaugt.
– Nach 16-stündiger Stimulation wurde das Medium abgenommen und dreimal bei 1200rpm
bei 4°C 5 Minuten lang zentrifugiert (Plattenzentrifuge), um alle in den Überständen
zurückgebliebenen Zellen zu entfernen. Es folgte ein Kontrolle des Zellwachstums mit Hilfe
der Kristallviolettmethode als Vitalfärbung (s. III.1.7.4.).
1.7.2. Stimulation mit BHKFasL-Zellen
Parallel zur CD40- und TNF--Stimulation (vgl. III.1.7.1.) wurde die Zytokinproduktion
humaner Keratinozytenzelllinien infolge der Stimulation mit dem Fas-Liganden als einem
weiteren von aktivierten T-Zellen exprimierten Liganden untersucht. Die Stimulation mit
30
lebendigen BHKFasL-Zellen und die anschließende Ernte der Überstände erfolgten auf dieselbe
Weise wie zuvor für BHKCD40L und BHKwt beschrieben.
1.7.3. Vergleichsstimulation mit Paraformaldfehyd-fixierten und nicht fixierten
BHKCD40L-Zellen
SiHa-Zellen wurden wie unter III.1.7.1. beschrieben zunächst 24 Stunden lang in
Kulturflaschen und nach Aussaat in 24-Well-Kulturplatten für weitere 24 Stunden mit Medium,
das 1000U/ml IFN- oder kein IFN- enthielt, vorbehandelt. Die Stimulationen wurden mit
Paraformaldehyd-fixierten
BHKCD40L-
und
BHKwt-Zellen
(vgl.
IV.1.4.)
in
drei
Konzentrationen (1,9  105 BHK/Loch, 3,8  105 BHK/Loch und 7,6  105 BHK/Loch) jeweils in
Doppelansätzen
ausgeführt.
Analog
zum
Stimulationsexperiment
mit
lebendigen,
teilungsfähigen BHK-Zellen (vgl. III.1.7.1.) erfolgten alle Stimulationen in 300l DMEM (mit
10% FKS, 0,1mg/ml Streptomycin und 100U/ml Penicillin) über 16 Stunden. Darüberhinaus
wurden Parallelstimulationen mit 1000U/ml TNF- sowie nur mit Medium ohne TNF-
durchgeführt. Zur Kontrolle wurden Stimulationsansätze mit lebendigen BHK-Zellen
mitgeführt. Die Überstände wurden vor dem Wegfrieren (-20°C) dreimal abzentrifugiert. Mit
Hilfe von ABTS-ELISAs wurde die MCP-1-Induktion infolge der CD40L- und TNF-Stimulation gemessen und mit Hilfe des t-Tests (s. Kapitel III.8.) auf ihre statistische
Signifikanz hin überprüft. Außerdem wurden die entsprechenden Versuche mit HPKIa ohne
vorherige Inkubation mit IFN- durchgeführt.
1.7.4. Kontrolle des Zellwachstums mit Kristallviolett
Nach Beendigung der Stimulation und Abnahme der Überstände (vgl. III.1.7.1.) wurde das
Zellwachstum auf die folgende Weise überprüft:
– Zugabe von jeweils 150l 0,1%igem Kristallviolett pro Loch.
– Nach ca. 45 Minuten wurden die Kulturplatten vorsichtig in H2O geschwenkt und
anschließend weitere 45 Minuten lang getrocknet.
– Herauslösen des Farbstoffs mit 150l Sörensens Citrat-Puffer pro Well.
– Verdünnung durch Zugabe jeweils desselben Volumens (ca. 1ml) ddH2O in jede
Vertiefung mit der Multipette.
– Jeweils 100l wurden für die Messung der Absorption im SLT-ELISA-Reader
(Messfilter 550nm, Referenzfilter 492nm) in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte übertragen.
31
Mit Hilfe dieser Methode wurden sowohl das Zellwachstum der Keratinozyten als auch das der
BHK-Zellen kontrolliert. Eine Interferon-bedingte Wachstumsinhibition wurde in Prozent vom
Basalwert ohne IFN- für jede Stimulation berechnet (s. Tabelle 4).
1.7.5. Kurz- und Langzeitinkubation von HPKIa mit Interleukin-6
HPKIa-Zellen wurden 8 Tage lang mit 5ng/ml Interleukin-6 inkubiert. Während dieses
Zeitraumes wurde eine einmalige Passagierung, bei der das Medium (DMEM mit 10% FKS,
100U/ml Penicillin und 0,1mg/ml Streptomycin) und das bioaktive IL-6 gewechselt wurden,
durchgeführt. Parallel wurden Zellen ohne Zytokin-Zusatz kultiviert. Am siebten Tag erfolgte
die Aussaat in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (1,5  105 HPKIa/Vertiefung). 24 Stunden
später wurde in Doppelansätzen mit BHKCD40L- bzw. BHKwt-Zellen in drei Konzentrationen
(2,0  104 BHK/Loch; 6,0  104 BHK/Loch; 1,8  105 BHK/Loch) sowie mit TNF- (10U/ml,
100U/ml, 1000U/ml) 16 Stunden lang stimuliert. Dem Medium (300 l/Well DMEM zzgl. 10%
FKS, 100U/ml Penicillin und 0,1mg/ml Streptomycin) wurden analog zum ersten Schritt
entweder kein oder 5ng/ml Interleukin-6 beigefügt. Darüberhinaus wurden HPKIa-Zellen
erstmalig, d.h. ohne vorherige Stimulation, mit Interleukin-6 in drei Verdünnungen (0,5ng/ml,
5ng/ml oder 50ng/ml) über 16 Stunden als “Kurzzeitinkubation” im Doppelansatz behandelt.
Schließlich wurden die Überstände wie oben beschrieben abgenommen (vgl. III.1.7.1.), und die
MCP-1-Konzentrationen mittels ELISA bestimmt. Mit Hilfe der Kristallviolettfärbemethode
wurde das Zellwachstum überprüft. Letzteres wies keinen Unterschied der Ansätze mit IL-6
gegenüber denen ohne IL-6-Zusatz auf.
1.7.6. Aufbewahrung der Zellkulturüberstände
Die Überstände wurden in Mikrotiterplatten, die mit Abdeckplatten versehen und mit Parafilm
abgedichtet waren, bei -20°C weggefroren und danach maximal viermal bei Raumtemperatur
wieder aufgetaut.
32
2. Bakterienkultur
2.1. Transformation kompetenter Bakterien
100l Suspension kompetenter Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und mit einem Mikroliter
des Ligationsansatzes, der einer DNA-Menge im Nanogramm-Bereich entsprach, in einem
sterilen, vorgekühlten Safe-Lock-Reaktionsgefäß vermischt. Der Ansatz wurde zuerst 10
Minuten auf Eis, dann 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Küvette wurde zunächst auf Eis
und nach Zugabe von 900l TSB-Puffer einschließlich 1mM Glucose für 45 Minuten in den
Bakterienschüttler (37°C) gestellt. Nach Zentrifugation (2000rpm, 4°C, 5 Minuten) wurden ca.
20l des Transformationsansatzes auf ampicillinhaltigen Agar-Nährböden ausgestrichen und
über Nacht bei 37°C bebrütet. Die Klone wurden anschließend mit Hilfe von „Minipreps“ (vgl.
III.3.1.) auf DNA untersucht.
2.2. Kulturen für Plasmidisolierungen
Als Vorkultur wurden 2ml LB-Medium (einschließlich 100g/ml Ampicillin) mit Bakterien entnommen von einer ampicillinhaltigen Agarplatte oder aus einer Glycerinkultur - beimpft und
über Nacht bei 37°C im Bakterienroller inkubiert. Jeweils 500l Vorkultur wurden auf ein
Volumen von 200ml LB-Medium mit 100g/ml Ampicillinzusatz übertragen und 24 Stunden
lang bei 37°C in einem 1-Liter-Erlenmeyerkkolben geschüttelt. Zur langfristigen Aufbewahrung
von Bakterien wurden Glycerinstocks aus der Flüssigkultur mit 15%igem Glycerinzusatz
hergestellt und bei -80°C tiefgefroren.
3. DNA-Methoden
3.1. Präparative Gewinnung von Plasmid-DNA aus Bakterien
Die präparative Plasmidisolierung erfolgte mit dem “QIAGEN Maxi Plasmid Kit” (QIAGENtip 500) in Anlehnung an die Instruktionen des “QIAGEN Plasmid Handbook Protocol”
(02/95). Des Weiteren kamen der “QIAGEN Midi Plasmid Kit” und “Qiaprep-spin Miniprep”
nach den Anleitungen der Hersteller zur Anwendung.
3.2. Ethanol-Fällung von DNA
Zur Konzentrierung von DNA wurde die Standardmethode nach Maniatis, Fritsch und
Sambrook (1982) angewendet: In einem Eppendorf-Hütchen wurden zu der in TE-Puffer
33
gelösten DNA 10Vol% einer 3M Na-Acetat-Lösung (pH 5,2) und das 2,5fache des Volumens
an eisgekühltem Ethanol (96% p.A.) zugegeben. Der Inhalt des Röhrchens wurde geschüttelt
und anschließend 30 Minuten lang bei -80°C aufbewahrt. Anschließend wurde mit 14000xg bei
4°C 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und 70%iges Ethanol
zugegeben, woraufhin erneut zentrifugiert und anschließend das Ethanol abgenommen wurde.
Nach Lufttrocknung wurde die DNA im gewünschtem Volumen TE-Puffers aufgenommen und
ihre Konzentration fotometrisch gemessen.
3.3. DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde über die Messung der optischen Dichte bei
den Wellenlängen 260nm (OD260) und 280nm (OD280) mittels eines Spektralfotometers
bestimmt. Über die Formel OD260 · Verdünnungsfaktor · 50 = g/ml wurde die Konzentration
berechnet.
4. Transiente Expressionstests
4.1. Luciferase-Assay
Der “Luciferase-Expressionstest” stellt ein Reportersystem zur Analyse regulatorischer DNASequenzen dar (DeWet et al., 1987). Bei der von der exprimierten Luciferase katalysierten
Umsetzung von D-Luciferin kommt es zu einer Emission von grünem Licht, welche
luminometrisch gemessen wird.
Die zuvor mit Luciferase-Reporterplasmiden (vgl. II.2.1.) transfizierten, als Monolayer
wachsenden Zellen (vgl. III.1.6.1.2. und III.1.6.2.) wurden mit kaltem PBS (ohne Mg2+ und
Ca2+) gewaschen, in 1,5ml PBS vom Boden der Vertiefungen oder der Kulturschale mit einem
Gummischaber abgelöst und in 2ml-Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Nach Zentrifugation
(250xg; 4°C; 7min) wurden die Zellen in 50l Extraktionspuffer resuspendiert und
anschließend in vier Gefrier-Auftau-Zyklen (jeweils zwei Minuten in flüssigem Stickstoff bei
ca. -196°C und zwei Minuten im Wasserbad bei 37°C) lysiert. Nach Abzentrifugieren der
Zelltrümmer (1400xg; 5 Minuten lang bei 4°C) wurden die Extrakte abgenommen und auf Eis
gestellt. Die zuvor gemischten Reagenzien des Test-Puffers - noch ohne Zugabe von rATP wurden bei Raumtemperatur vorinkubiert. Für die Messung der Luciferase-Aktivität wurden
jeweils 15l Extrakt und 100l Luciferase-Assay-Puffer (mit rATP) in Sarstedt-PlastikRöhrchen pipettiert. Die RLUs wurden in einem LB9501 Luminometer nach Injektion von
34
300l Substratlösung (0,356mM D-Luciferin in Luciferase-Puffer gelöst) bei einer Messzeit
von 10,0 Sekunden - ohne Verzögerungsintervall zwischen Injektion und Messung - bestimmt.
4.2. „In-situ”--Galakosidase-Färbung
Analog zum Luciferase-Expressionstest lässt sich mit der -Galaktosidase-Färbung die
Aktivität von Promotorsequenzen analysieren. Das bakterielle Enzym -Galaktosidase, welches
normalerweise nicht in eukaryotischen Zellen vorkommt, spaltet die farblose Verbindung XGal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl--D-Galaktosid), wobei das tiefblaue 5-Brom-4-Chlor-Indigo
entsteht (Knippers, 1995). Mittels Elektroporation wurden HeLaCD40-Zellen mit dem pCMV-Gal-Plasmid (vgl. II.2.1) transient transfiziert. Die folgendermaßen durchgeführten In-situNachweise der -Galaktosidase-Aktivität dienten als ‚Vorversuche’ zur Optimierung von
Elektroporationsparametern (vgl. IV.3.):
– 48 h nach der transienten Transfektion wurden HelaCD40-Zellen zweimal mit PBS
gewaschen und mit dreiprozentigem Paraformaldehyd (in PBS) 10 Minuten lang auf Eis
fixiert, danach dreimal gewaschen und für 30 Minuten in das Kühlfach (4°C) gestellt.
– Anschließend wurde das PBS abgesaugt und die Färbelösung (0,4mg/ml X-Gal, 2mM
MgCl2, 4mM K3Fe(CN)6, 4mM K4(CN)6, 7,8M Spermidin) aufpipettiert.
– Nach 24-stündiger Inkubationszeit im Brutschrank konnten die Transfektionseffizienzen der
parallel durchgeführten Ansätze optisch miteinander verglichen werden. Hierzu wurden die
blau gefärbten Zellen ausgezählt und die Farbreaktionen mit dem Fotoapparat dokumentiert.
4.3. -Galaktosidase-Assay
HeLaCD40-Zellen wurden, wie unter III.1.6.1.2. beschrieben, mittels Elektroporation mit dem
pCMV--Gal-Vektor transient transfiziert, gepoolt und in zwei Vertiefungen ausgesät. Im
Einfachansatz wurden 24 Stunden später ein Loch der transfizierten HeLaCD40-Zellen mit
Paraformaldehyd-fixierten BHKCD40L- und ein Loch mit Paraformaldehyd-fixierten BHKwtZellen (2  106 BHK/Well) über ca. 43 Stunden stimuliert. Die Zellernte und Herstellung der
Extrakte erfolgte wie für das Luciferase-Assay geschildert (vgl. III.4.1.). Dieser parallel
während der Transfektion mit dem p4321-luc-Vektor durchgeführte Versuchsablauf sollte den
Nachweis erbringen, dass die Viabilität von HeLaCD40-Zellen nach Stimulation mit dem CD40Liganden unbeeinträchtigt blieb und damit Resultate von Hess und Engelmann (1996)
bestätigen, nach welchen HeLaCD40-Zellen via CD40 nur bei experimentell herbeigeführter
35
Blockierung der Proteinsynthese, z.B. mittels Cycloheximid, unter normalen Bedingungen aber
nicht abgetötet werden. Die CMV-Promotoraktivität diente in diesem Falle als Äquivalent für
die Zellzahl nach erfolgter CD40-Stimulation. Die Reaktionsansätze für die fotometrische
Messung, bestehend aus jeweils 470l -Galaktosidase-Puffer, 100l ONPG-Lösung (4mg/ml
O-Nitrophenol--D-Galaktosidase in 0,1M Na2HPO4-Puffer, pH 7,0) und 30l Zellextrakt,
wurden bis zur Gelbfärbung bei 37°C inkubiert. Ein Kontrollansatz zur Leerwerteinstellung,
bestehend aus -Gal-Puffer und ONPG-Lösung, wurde mitgeführt. Die Reaktionen wurden
schließlich mit 250l 1M Na2CO3 gestoppt und die Extinktionen bei einer Wellenlänge von
420nm gemessen. Aufgrund gleichmäßiger Zellaussaat und der Vereinigung von HeLaCD40Ansätzen nach der Elektroporation (vgl. III.1.6.1.2.) sollte erwartungsgemäß die gemessene
CMV-Promotoraktivität der Stimulationsansätze gleich sein. Tatsächlich ergaben sich gleiche
Extinktionen: im Falle der BHKwt-Stimulation 0,411 und im Falle der BHKCD40L-Stimulation
0,415.
5. Proteinmessung
Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt. In einer 96Well-Flachbodenplatte wurde zunächst eine Eichkurve mit fünf Konzentrationen RinderserumAlbumins sowie zwei Leerwerten ohne Protein erstellt. 4 bzw. 5l der zu messenden Extrakte
wurden als Doppelansätze aufgetragen. Zuletzt erfolgte die Zugabe von jeweils 150l BradfordReagenz, das zuvor 1:5 in H2O verdünnt worden war. Die Absorption wurde nach 10 Minuten
mit einem SLT-ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 620nm und einem 405nm
Referenzfilter gemessen.
6. Bestimmung der Zytokinkonzentrationen mittels ABTS-ELISA
6.1. IL-6, MCP-1, IL-8 und GM-CSF
– Nunc-Maxisorp-Platten wurden mit monoklonalen Anti-IL-6-, Anti-MCP-1- oder Anti-IL6-Coating-Antikörpern (1g/ml Antikörper in PBS zzgl. 0,02% NaN3) über Nacht inkubiert.
– Zur Verhinderung unspezifischer Bindungen wurde eine Stunde lang mit 0,05% Tween,
0,02% NaN3 und 0,5% BSA in PBS blockiert.
– Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,02% Tween wurden ein quantitativer Standard mit
zehn 1:2 Verdünnungen des jeweiligen rekombinanten humanen Zytokins von 5ng bis 9,8pg
36
pro ml in Blockierungspuffer einschließlich zweier Leerwerte und die Proben aufpipettiert.
– Sechs Stunden später wurde dreimal mit PBS/0,02% Tween gewaschen und der jeweilige
polyklonale Kaninchen-Zweit-Antikörper in einer Konzentration von 0,5g/ml
(bzw.
1g/ml im Falle des GM-CSF-ELISAs) in Blockierungspuffer über Nacht aufgetragen.
– Nach dreimaligem Waschen erfolgte eine zweistündige Inkubation mit einem Peroxidasegekoppelten Ziegen-anti-Kaninchen-F(ab’)2-Fragment (1:2000 in PBS zzgl. 0,05% Tween
und 0,5% BSA).
– Nach einem weiteren Waschzyklus wurde mit der Substratlösung (2mg/ml ABTS in
Citratpuffer unter Hinzufügung von 0,2l 30%igem H2O2 pro ml) die Farbreaktion
ausgelöst und die Extinktion in einem SLT-ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von
405nm (Referenzfilter 620nm) gemessen.
Alle Inkubationen erfolgten bei Raumtemperatur in Volumina von jeweils 50l
Ausnahme des Coatings (60l/Well) und des Blockierens (100l/Well). Überstände
- mit
mit
Zytokinkonzentrationen über 5ng/ml wurden in Blockierungspuffer 1:2 verdünnt, um
Messwerte im linearen Bereich zu erhalten. Die Titerplatten wurden nach jedem Schritt
versiegelt. Verwendete Antikörper und Zytokine wurden nach den Angaben der Hersteller in
PBS oder H2O (zzgl. 0,02% NaN3) bei 4°C aufbewahrt. Die unteren Nachweisgrenzen der
Zytokine befanden sich bei 8 bis 20pg/ml.
6.2. MCP-3, IP-10 und TGF-1
Quantitative Bestimmungen dieser Zytokine erfolgten unter Verwendung von Peroxidasegekoppeltem Streptavidin, einem Protein aus Streptomyces avidinii mit einer hohen Affinität
und Spezifität für Biotin.
– Vertiefungen von Maxisorp-Mikrotiterplatten wurden mit den primären Anti-ZytokinImmunglobulinen in folgenden Konzentrationen beschichtet: 5g/ml beim MCP-3-, 2g/ml
beim IP-10- und 1g/ml beim TGF-1-Zytokin-ELISA.
– Auf die Auftragung der Proben und der Standardkurve (vgl. III.6.1.) folgten im Falle des
TGF-1-Tests zunächst ein polyklonaler Hühner-Antikörper gegen humanes TGF-1,
anschließend ein biotinylierter Goat--Chicken-Antikörper (3g/ml).
– Bei den anderen Essays wurden polyklonale biotinylierte Sekundär-Antikörper gegen
humanes MCP-3 (5 g/ml) oder gegen humanes IP-10 (2g/ml) eingesetzt.
– Alle genannten Antikörper wurden jeweils über Nacht in Blockierungspuffer (PBS, 0,5%
37
BSA, 0,02% NaN3, 0,05% Tween) inkubiert.
– Schließlich wurde das Streptavidin-Enzymkonjugat in einer Verdünnung von 1:5000 in
PBS/0,5% BSA/0,05% Tween für 2 Stunden zugegeben.
– Die ABTS-Substratlösung und die Messung der Proben anhand der Standardkurve
entsprachen der unter III.6.1. geschilderten Methode. Die untere Nachweisgrenzen lagen für
IP-10 bei ca. 45pg/ml, für MCP-3 bei ca. 32pg/ml und für TGF-1 niedriger.
6.3. RANTES
RANTES-ELISAs wurden durchgeführt mit 2g/ml Coating-Antikörper (in PBS zzgl. 0,02%
NaN3), 1g/ml polyklonalem Kaninchen-Zweit-Antikörper gegen das humane Chemokin
RANTES in Blockierungspuffer (PBS, 0,05% Tween, 0,02% NaN3, 5% Magermilchpulver)
und dem bivalenten an Peroxidase gebundenen Ziegen-anti-Kaninchen Fab-Fragment in einer
Verdünnung von 1:2000 in PBS mit 0,05% Tween und 5% Magermilchpulver.
Inkubationszeiten und quantitative Messungen erfolgten analog obiger Beschreibung (vgl.
III.6.1.). Die untere Detektionsgrenze des RANTES-ELISAs befand sich bei ca. 40pg/ml.
7. Immunfluoreszenz
7.1. Durchflusszytometrie
Jeweils 1,5  105 in runden Kulturschalen (Durchmesser 6cm) ausgesäte Zellen wurden über
48h mit 1000U/ml humanem Interferon- stimuliert oder blieben unstimuliert. Die Ablösung
erfolgte mit 5mM EDTA in PBS (ohne Ca2+ und Mg2+). Nach der Pelletierung (EppendorfZentrifuge; 200xg; 4°C; 5 Minuten) wurden die Zellen in 200l Blockierungspuffer (2% BSA
in PBS) in eine 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte überführt und 20 Minuten lang auf Eis
gestellt. Nach Zentrifugation der Titerplatte (Plattenfuge; 1200 rpm; 4°C; 5 Minuten) wurden
die Überstände abgekippt und die Zellen mit 5g/ml monoklonalem Maus-anti-huCD40
Antikörper (Ig1, Pharmingen) oder mit MOPC-21, einem Maus-Kontroll-Antikörper desselben
Isotyps, auf Eis ca. eine Stunde lang inkubiert. Nach viermaligem Waschen der Zellen mit
kaltem PBS erfolgte die Markierung mit Fluorescein(FITC)-konjugiertem polyklonalem „goatanti-mouse“ F(ab’)2-Immunglobulin eine Stunde lang unter Lichtausschluss auf Eis. Nach
einmaligem Waschen mit PBS wurden die Ansätze bis zur Messung in jeweils 500l
38
einprozentigem Paraformaldehyd (in PBS) bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt. In dieser Arbeit
wurde ein FACScan™-Gerät der Firma Becton Dickinson (Mountain View, CA) und die
CellQuest
Software
verwendet,
um
die
CD40-Expression
verschiedener
Zervixkarzinomzelllinien und in-vitro-transformierter Zelllinien zu analysieren und zu
vergleichen. Markiert man die Zellen wie in diesem Falle mit einem einzigen
Fluoreszenzfarbstoff, wurden diese hier als ein Histogramm der Fluoreszenzintensität
(Abszisse) gegen die Zellzahl (Ordinate) dargestellt. Die mit CellQuest®-Software ermittelten
Verteilungskurven beinhalten die Analyse von jeweils 5  103 Zellen, wobei die Verschiebung
auf der Abszisse von links nach rechts die zunehmende Fluoreszenzintensität in logarithmischer
Darstellung bzw. im konkreten Falle die quantitative Verteilung von Zellen mit bestimmten
CD40-Expressionsniveaus wiedergibt.
7.2. Fluoreszenz-Mikroskopie
Für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Zelllinien wurden HeLaCD40-, SW756-, HPKIa-,
K5I-, K64- und I56-Zellen in 96-Well-Flachbodenplatten ausgesät (in einer Dichte von 5  103,
1  104 und 1,5  104 Zellen pro Well in jeweils 180l DMEM zzgl. 10% FKS, 100U/ml
Penicillin und 0,1mg/ml Streptomycin). Am folgenden Tag wurde das alte Medium abgesaugt
und die Zellen über 48 Stunden in Medium mit und ohne den Zusatz von 1000U/ml IFN-
kultiviert. Am vierten Tag erfolgte darauf die Antikörpermarkierung analog der Präparierung
von Zellen für die Durchflusszytometrie mit den gleichen Antikörpern (monoklonaler AntiCD40-Antikörper, monoklonaler Maus-Kontroll-Antikörper MOPC-21 und FITC-konjugierter
polyklonaler
„Goat-anti-mouse“-Antikörper)
und
mit
den
entsprechenden
Antikörperkonzentrationen (vgl. 7.1.) in Blockierungspuffer (2% BSA in PBS mit CaCl2 und
MgCl2). Nach den beiden Inkubationsschritten von jeweils einer Stunde wurden die Wells dreibzw. zweimal mit PBS (einschließlich CaCl2 und MgCl2) gewaschen und die Titerplatten sanft
ausgeschlagen. Zuletzt wurden 60l/Well einprozentiges Paraformaldehyd (in PBS)
aufpipettiert, wobei das Paraformaldehyd unter anderem der Fixierung der Antikörper an die
Zelle dienen sollte.
39
8. Statistische Berechnungen
Der t-Test für unverbundene Stichproben (“independent samples t-test”) wird angewandt, um
zwei Stichproben vom Umfang n1 und n2 , mit den Mittelwerten x1 und x 2 und den
Standardabweichungen s1 und s2 miteinander zu vergleichen (Renner, 1995).
Die Prüfgröße wird nach folgender Formel berechnet:
x x
t
1
s
[1,2 ]
1
2

1
n n
1
mit
s
[1,2]

n  n  s  n  1 s
1
2
2
1
2
2
2
n 1 n 1
1
2
2
Unter Verwendung von SPSS6.1-Software sollte mit Hilfe dieses Tests analysiert werden, ob
sich die Zytokinkonzentrationen infolge der Stimulation mit BHKCD40L statistisch vom
Parallelansatz mit BHKwt unterscheiden. Hierzu wurde ein Konfidenzintervall von 95% ( =
0,05) gewählt und p-Werte als zweiseitiges Signifikanzniveau ermittelt.
40
IV. ERGEBNISSE
1. Die CD40-Expression auf HPV positiven Zelllinien in vitro
Zunächst wurde die CD40-Expression auf humanen HPV positiven Keratinozytenzelllinien
mittels Durchflusszytometrie analysiert. Bei diesen Experimenten wurden verschiedene
HPV16- oder HPV18-DNA positive maligne Zervixkarzinomzelllinien (C4-I, SiHa, SW756
und
CaSki)
sowie
nicht
maligne
in
vitro
mit
HPV16
oder
18
transformierte
Vorhautkeratinozyten (156p, K51, K64 und HPKIa) erstmals auf die Expression von CD40 hin
untersucht. Außerdem wurden die Zervixkarzinomzelllinie ME-180 mit DNA-Homologien zu
HPV68, die HPV16 positive Vulva-Keratinozytenzelllinie SKv, und die HPV negative
Zervixkarzinomzelllinie C33A getestet. Die Hautzelllinie HaCaT, welche ebenfalls HPV
negativ ist, wurde als einzige Zelllinie nicht genitalen Ursprungs mitgeführt. Die Zellen wurden
mit dem monoklonalen Anti-CD40-Antikörper G28-5 inkubiert und anschließend mit FITCkonjugiertem F(ab‘)2 Antikörperfragment gefärbt.
Im Rahmen dieser Studie exprimierten die tumorigenen Zervixkarzinomzellen C4-I, SiHa,
SW756 und CaSki hochgradig CD40, wobei sich die stärkste Expression bei CaSki, gefolgt von
SW756 finden ließ (s. Abb. 1A).
Dagegen zeigten die nicht tumorigenen mit HPV16 oder 18 in-vitro-transformierten Keratinozyten (HPKIa, 156, K51 und K64) lediglich ein sehr niedriges konstitutives CD40Expressionsniveau (s. Abb. 1B).
Von Hess und Engelmann (1996) ist bereits beschrieben worden, dass die Zelllinie HeLa
praktisch keine CD40-Membranrezeptoren aufweist. In dieser Studie bildete HeLa aufgrund des
Fehlens
von
CD40
(s.
Abb.
1C)
die
Ausnahme
unter
den
HPV
positiven
Zervixkarzinomzelllinien. CD40-Transfektanten dieser Zelllinie (HeLaCD40) wurden zur
Kontrolle mitgeführt. Auch die HPV negative Zervixkarzinomzelllinie C33A besaß kein CD40.
Dem basalen CD40-Expressionsgrad wurde eine CD40-Regulation nach 48stündiger
Stimulation mit Interferon- gegenübergestellt.
ME-180 zeigte wie SKv eine signifikante CD40-Expression erst nach IFN--Exposition (s.
Abb. 1C). Infolge einer Stimulation mit 1000U/ml IFN- konnte bei nahezu allen so
behandelten Zelllinien die Anzahl der CD40-Rezeptoren deutlich heraufreguliert werden; bei
HPKIa lag der ausgeprägteste Effekt infolge der IFN--Behandlung vor. Schließlich besaß auch
41
die nicht tumorigene und HPV negative Hautzelllinie HaCat CD40 (s. Abb. 1C). Eine
vermehrte Expression des Membranrezeptors CD40 im Rahmen dieser Testung von
Laborzelllinien war somit nicht ausschließlich auf tumorigene und HPV positive Zellen
beschränkt, erreichte im Vergleich dort aber ihr bei weitem höchstes Niveau.
Zu den Abb. 1A-1C:
Die Zervixkarzinomzellen wurden mit dem monoklonalen CD40-Antikörper G28-5 ( , ) oder
mit MOPC-21, einem unspezifischen monoklonalen Kontroll-Antikörper des entsprechenden
Isotyps ( ), und anschließend mit FITC-konjugiertem F(ab’)2 -Fragment inkubiert. Die Zellen
blieben entweder unstimuliert (
,
) oder wurden vorher mit 1000U/ml IFN- über 48h ( )
behandelt. Die CD40-Expression wurde mittels Zytofluorimetrie bestimmt. In den Diagrammen
wurden jeweils drei Kurven derselben Zelllinie, die aus unterschiedlichen Ansätzen resultieren,
zusammengestellt: Die dunkelgraue Kurve gibt die CD40-Expression nach 48stündiger
Interferon--Stimulation wieder, die hellgraue Kurve das CD40-Expressionsniveau nach
Kultivierung ohne IFN- und die Leerkurve die „Hintergrundfluoreszenz” von Zellen, welche mit
MOPC-21 und anschließend mit dem FITC-konjugierten Antikörper markiert wurden, nachdem
sie zuvor ohne IFN- kultiviert worden waren (wie unter III.7.1. beschrieben). Ein vierter FACSAnsatz mit Zellen, die 48 Stunden lang mit 1000U/ml IFN- vorbehandelt und dann gleichfalls
mit MOPC-21 und dem Fluorescein-konjugierten Antikörper inkubiert wurden, wurde aus
Gründen der Übersichtlichkeit in den graphischen Darstellungen des Ergebnisteils nicht
berücksichtigt. In allen Fällen stimmte dieser ausgesparte vierte Graph mit der dargestellten
Kontrollkurve mit MOPC-21 ohne IFN- Vorbehandlung weitgehend überein.
42
Abbildung 1A:
CD40-Expression der HPV positiven Zervixkarzinomzelllinien C4-1, SiHa, SW756 und CaSki
C4-I
SiHa
SW756
CaSki
43
Abbildung 1B:
CD40-Expression in vitro mit HPV 16 oder HPV18 transformierter Keratinozyten
156
K5
I
44
K6
HPKI
4
a
Abbildung 1C:
CD40-Expression verschiedener epithelialer Zelllinien
ME-180
SKv
HeLa
HeLaCD40
C33A
HaCaT
45
2. Funktionalität des CD40-Liganden auf Paraformaldehyd-
fixierten BHK-Zellen
Paraformaldehyd-fixierte BHKCD40L-Zellen wurden auf die Aktivität des CD40-Liganden
mittels eines Zytotoxizitätstestes überprüft, in welchem sich ein konzentrationsabhängiger
Zelltod von HeLaCD40-Zellen
im Medium mit 50g/ml Cycloheximid nach 18 Stunden
einstellte (Abb. 2A). Parallel wurden HeLaCD40-Zellen mit TNF- und Cycloheximid stimuliert
(Abb. 2B). Die hier und für die in Kapitel IV.4. dargestellten Experimente verwenden
Paraformaldehyd-fixierten BHK-Zellen töteten dosisabhängig HeLaCD40-Zellen, wie es bereits
für den löslichen CD40-Liganden zuvor beschrieben worden war, wenn gleichzeitig die
Proteinsynthese durch Cycloheximid gehemmt wurde (Hess und Engelmann, 1996). In
Abwesenheit von Cycloheximid beeinflussten BHKCD40L-Zellen dagegen die Überlebensrate
von HeLaCD40-Zellen nicht (nicht dargestellt). Auch im Falle von TNF- zeigte sich ohne den
Zusatz von 50g/ml Cycloheximid keine Auswirkung auf die Viabilität von HeLaCD40-Zellen
(nicht dargestellt).
Abbildung 2A:
CD40L/CHX-vermittelter Zelltod von HeLaCD40
46
Zur Abb. 2A (vorherige Seite):
Induktion
von
Zelltod
in
HeLaCD40-Transfektanten
durch
Paraformaldehyd-fixierte
BHKCD40L-Zellen im Vergleich zur Kontrollstimulation mit BHKwt- unter CycloheximidBedingungen. Als Vitalfärbemethode wurde die Neutralrotmethode (Finter, 1969) angewendet,
bei welcher der Farbstoff von gesunden Zellen in höherem Maße aufgenommen wird als von
geschädigten.
Abbildung 2B:
TNF-/CHX-vermittelter Zelltod von HeLaCD40 während Inkubation mit Cycloheximid
Zytotoxizität unterschiedlicher Konzentrationen von TNF- unter Cycloheximid-Bedingungen
(50g/ml Cycloheximid). Jeder Ansatz enthielt initial 2,7  104 HeLaCD40-Zellen.
47
3. Optimierung der Transfektionseffizienz mittels Elektroporation bei
HeLaCD40-Zellen
Eine optimale Effizienz der elektronischen Transfektion mit dem pCMV--Gal-Vektor wurde
nach verschiedenen Einstellungen der Spannung (220 bis 350 Volt) und der Kapazität (900,
1050 und 1500F) bei 300V und 1050F erreicht (Abb. 3A u. 3B).
Abbildungen 3A und 3B:
Nachweis der  -Galaktosidase-Aktivität nach Elektro-Transfektion von HeLaCD40Zellen (mit pCMV- -Gal)
Abildung 3A: Elektroporationsbedingungen: 240V, 1050F
48
Abbildung 3B: Elektroporationsbedingungen: 300V, 1050F
4. Die Interaktion zwischen CD40L und CD40 reduziert die HPV18-P105Promotoraktivität
In dieser Versuchsreihe wurde die Möglichkeit untersucht, ob der membranständige Ligand für
CD40 einen regulatorischen Effekt auf die HPV18-Kontrollregion ausübt. Die Transkription
der frühen HPV-Gene, einschließlich E6 und E7, wird über die LCR aufwärts des E6 Gens
reguliert. Um die Effekte des CD40-Liganden und des inflammatorischen Zytokins TNF- auf
die transkriptionelle Aktivität der HPV18-LCR zu untersuchen, wurde ein Reportergen (4321Luc), in welchem die gesamte LCR sowie der P105 Promotor an das Luciferase-Gen gekoppelt
sind, in HeLaCD40-Zellen transfiziert. Nach der transienten Transfektion mit 4321-Luc mittels
Elektroporation wurden die suspendierten HeLaCD40-Zellen in einem Gefäß gesammelt und zu
gleichen Teilen in Multischalen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die HeLaCD40-Zellen über
weitere 43 Stunden mit Medium allein, mit TNF-, Paraformaldehyd-fixierten BHKCD40LZellen und mit Paraformaldehyd-fixierten BHKwt-Zellen als Kontrolle stimuliert.
49
Abbildung 4A zeigt die relativen Luciferase-Aktivitäten aus einem exemplarischen von
insgesamt vier Experimenten, welche aus Dreifachansätzen im Falle von BHKCD40L und
BHKwt bzw. Doppelansätzen im Falle von Medium und TNF- bestanden. Die Aktivität des
HPV18 P105 Promotors wurde aufgrund der Stimulation mit BHKCD40L bei diesen vier
Experimenten im Mittel um 56,0% (±10,2%) gegenüber den BHKwt-Ansätzen gesenkt, parallel
wurde mit löslichem TNF- in einer Konzentration von 1000U/ml stimuliert. Mit Hilfe von
CAT-Expressionsvektoren haben Kyo et al. (1994) bereits zeigen können, dass TNF- die
HPV16-Genexpression über die LCR negativ reguliert. In dieser Arbeit wurde die HPV18-P105Promotoraktivität durch TNF- im Mittel aller Versuche um 64,9% (± 9,1%) gegenüber der
Mediumskontrolle reprimiert. Standardabweichungen von Mehrfachansätzen innerhalb
einzelner Experimente lagen zwischen 1,9 und 10,1%. Einen sehr sensitiven Parameter für die
CD40- und TNF-Rezeptoraktivierung stellt der Nachweis von IL-6 dar. Deshalb wurden von
mir, bevor das der Abbildung 4A zugrundeliegende Luciferase-Assay durchgeführt wurde, die
zugehörigen Kulturüberstände nach abgeschlossener Stimulationsphase abgenommen und auf
ihren IL-6-Gehalt mittels ELISA überprüft: In Abbildung 4B ist die deutliche IL-6-Induktion
um das 2,7fache (BHKCD40L) bzw. das 5,2fache (TNF-) dargestellt. Dies spricht für eine
effiziente Stimulation mit funktionell aktivem CD40-Liganden bzw. mit TNF-. Von der
Arbeitsgruppe wurde bereits zuvor mit Hilfe des Neutralrot-Verfahrens (Finter, 1969)
festgestellt, dass eine 48-stündige Stimulation mit Paraformaldehyd-fixierten BHKCD40L oder
TNF- die Überlebensrate von HeLaCD40 Zellen nicht beeinflusst. Von mir wurden im Rahmen
eines der vier oben genannten Experimente HeLaCD40-Zellen mit dem pCMV--Gal-Vektor
mittels Elektroporation transient transfiziert und mit Paraformaldehyd-fixierten BHKCD40Loder BHKwt-Zellen im Doppelansatz stimuliert. Die Auswertung mittels -GalaktosidaseAssays ergab gleiche CMV-Promotoraktivität bei allen Ansätzen. Die Messdaten hierzu sowie
eine detaillierte Versuchsbeschreibung befinden sich in Kapitel III.4.3.
50
Abbildungen 4A und 4B:
Effekt vonCD40L und TNF- auf die
transkriptionelle Aktivität der HPV18-LCR
Abb. 4A: Ergebnisse von Luciferase-Assays: Die Luciferase-Aktivität wurde
anhand der Mediumskontrolle (100%) normiert. Dargestellt ist ein
exemplarisches von vier Experimenten. Stimuliert wurde mit 1000U TNF-
bzw. mit 2  106 paraformaldehydfixierten BHK-Zellen über 43 Stunden.
Abb. 4B: Interleukin-6 in den Zellüberständen nach der Stimulationsphase.
51
5. Die CD40L-CD40-Interaktion induziert Chemokine in HPV positiven
Zervixkarzinomzelllinien in Synergismus mit Interferon-
5.1. Differenzielle Induktion von MCP-1 und IL-6
5.1.1. MCP-1-Produktion in HPV positiven Zelllinien
HPKIa-Zellen wurden als nicht-tumorigene in-vitro-transformierte Keratinozyten mit den
Zervixkarzinomzelllinien SiHa und SW756 hinsichtlich ihrer MCP-1-Produktion verglichen.
Alle drei Zelllinien sezernierten konstitutiv nur geringe Mengen MCP-1 in das Kulturmedium,
d.h. weniger als 120pg/ml (Abbildung 5A). Die niedrige MCP-1 Produktion der
Zervixkarzinomzellen unterscheidet sich zur von Riethdorf und Mitarbeitern (1996) in vivo
beobachteten MCP-1-Induktion in zervikalen Plattenepithelkarzinomen. Diese Diskrepanz
könnte entweder mit supprimierenden Faktoren in der Kultur, die aber in vivo nicht vorhanden
sind, oder mit stimulierenden Faktoren, die in vivo aber nicht in vitro präsent sind, erklärt
werden.
5.1.2. CD40 mediiert die Produktion von MCP-1 und IL-6 in Zervixkarzinomzelllinien und von MCP-1 in der in-vitro-transformierten Zelllinie HPKIA
Da der CD40-Rezeptor in vivo in Zervixkarzinomen in hohem Maße exprimiert wird und der
CD40-Ligand in Tumorinfiltraten nachgewiesen werden konnte (Altenburg et al., 1999; s.
Anhang), wurden funktionelle Experimente durchgeführt, um zu klären, ob die CD40L-CD40Interaktion der MCP-1-Expression in den Karzinomen Rechnung tragen könnte. In
vorausgehenden Arbeiten war bereits aufgezeigt worden, dass der membrangebundene CD40Ligand auf Paraformaldehyd-fixierten BHK-Zellen eine stärkere CD40-Stimulation als der
lösliche, proteolytisch freigesetzte CD40-Ligand zur Folge hatte (Hess et al., 1995a). In diesen
Versuchen wurde der CD40-Rezeptor mit Hilfe von BHKCD40L-Zellen, welche mit keinem der
Zytokin-Essays interferierten, aktiviert. Die 16stündige Stimulation von HPKIa-Zellen mit
CD40L-tragenden Zellen führte zu einer mehr als neunfachen Induktion von MCP-1 (bis zu
920pg/ml). BHKwt-Zellen veränderten die MCP-1-Produktion nicht. In Kap. IV.1. wird gezeigt,
dass SiHa und SW756 ein sehr viel höheres CD40-Expressionsniveau als HPKIa besitzen.
Infolge einer Stimulation mit unfixierten BHKCD40L waren SiHa und SW756 jedoch weitaus
weniger effizient als HPKIa hinsichtlich der Produktion von MCP-1, welche im Falle von SiHa
das 2,1fache (278pg/ml) und im Falle von SW756 das 2,8fache (323pg/ml) der BHKwtKontrolle erreichte (s. Abbildung 5). Eine MCP-1-Induktion konnte auch mit Paraformaldehyd52
fixierten BHKCD40L-Zellen herbeigeführt werden. Ihre Stimulationskapazität war allerdings
schwächer, wie es nach den Ausführungen von Hess et al. (1995a) auch anzunehmen war, und
bewirkte eine 2,3fache MCP-1 Induktion (p0,001) bei der Zelllinie HPKIa (nicht dargestellt).
Interessanterweise ließ sich bei K5I, einer in vitro mit HPV-Onkogenen transformierten
Keratinozytenzelllinie mit noch geringerer CD40-Expression als derjenigen von HPKIa,
immerhin eine MCP-1-Induktion um das 4,5fache (infolge Stimulation mit 6105 BHKCD40LZellen) bis maximal um das 7,6fache (341pg/ml, bei Stimulation mit 1,8106 BHKCD40LZellen) herbeiführen (nicht dargestellt). Bei den Abbildungen 5A, 5B, 9A und 9B ist die
ebenfalls
durchgeführte
Stimulation
mit
der
höchsten BHK-Konzentration (1,8106
Zellen/Vertiefung) ausgelassen, da sich in keinem der Fälle eine wesentliche MCP-1- oder IL6-Erhöhung gegenüber der Stimulation mit 6105 BHK/Well ergab. Als Gegenprobe wurde mit
rekombinanten TNF- in drei Konzentrationen (10, 100 und 1000U/ml) stimuliert. Dass TNF-
MCP-1 in Epithelzellen und Fibroblasten induziert, wurde in der Literatur bereits beschrieben
(zusammengefasst in: Mantovani et al., 1996). Bei den beiden transformierten Zelllinien HPKIa
und K5I erwies sich CD40L im Vergleich zu TNF- als potenterer Stimulus für die MCP-1Produktion. Bei HPKIa wurde durch TNF- eine maximale MCP-1 Induktion um das 4,3fache
(429pg/ml) und bei K5I um das 3,9fache (220pg/ml) gegenüber der Inkubation mit Medium
allein hervorgerufen. Die Induktion der MCP-1-Produktion durch CD40L als auch durch TNF war bei allen vier Zelllinien statistisch signifikant (p<0,05).
CD40L induziert in den Zervixkarzinomzelllinien SiHa und SW756 eine starke NF-BBindungsaktivität, wie es mittels EMSA im Labor Prof. Smola gezeigt werden konnte
(Altenburg et al. 1999). NF-B ist in die MCP-1-Regulation involviert und wird ebenfalls
durch TNF aktiviert. Aufgrund der hohen CD40-Expression von SiHa und SW756 und der
starken Mobilisation von NF-B-Bindekomplexen auf der einen Seite, aber der schwachen
Induktion von MCP-1 nach CD40-Stimulation auf der anderen Seite, könnte man eine selektiv
reduzierte Induzierbarkeit von MCP-1 in diesen Tumorzelllinien vermuten. Um diese
Hypothese zu prüfen, wurde die CD40-mediierte Induktion von Interleukin-6 untersucht. An
der transkriptionellen Regulation des IL-6-Gens sind aber mehrere NF-B-Bindestellen
beteiligt. Bei den mit CD40L stimulierten HPKIa-Zellen war keine IL-6-Produktion messbar
(Abbildung 5A). Es ließ sich daher für HPKIa auch kein Vergleich mit der MCP-1-Induktion
durch CD40 anstellen. SiHa-Zellen produzierten bis zu 9,5ng/ml IL-6 infolge der BHKCD40LStimulation, und die IL-6-Produktion bei SW756 erreichte sogar 23,6ng/ml nach CD40-
53
Aktivierung. Jedoch sezernierten diese beide Zelllinien auch konstitutiv hohe IL-6-Mengen, so
dass die CD40-vermittelte Induktion von IL-6 in Zervixkarzinomzellen sich in ähnlicher
Größenordnung (1,3 bis 2,4fach) bewegte wie die von MCP-1, allerdings auf sehr viel höherem
Niveau.
5.1.3. Konstitutive IL-6-Produktion in Karzinomzelllinien
Verglichen mit nicht-malignen HPV-transformierten Keratinozyten und der HPV negativen
Karzinomzelllinie
C33A
war
die
natürliche
IL-6-Sekretion
der
HPV
positiven
Zervixkarzinomzellen erheblich höher und erreichte mit Ausnahme von CaSki und zwei HeLaSubzelllinien Nanogramm-Bereiche (s. Abb. 6). K5I-Zellen dagegen wiesen nur eine basale IL6-Produktion von unter 80pg/ml auf, die sich auch infolge BHKCD40L-Stimulation kaum
erhöhte (auf maximal 114pg/ml, nicht dargestellt). Bei HPKIa ließ sich überhaupt kein IL-6
nachweisen (Abbildungen 5B und 6).
54
55
Abbildung 6:
IL-6 [pg/ml]
Interleukin-6-Produktion in malignen und nicht-malignen Keratinozytenzelllinien
18000
17000
16000
15000
14000
13000
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
n
Ia Ski 4-I Kv a(H) a Sexto a CD40 iHa
6 A
I
5
K
75 C33
K HP Ca C S eL eL eL
S
H H H
SW
HPV: positiv
in-vitrotransformierte
Keratinozyten
positiv
negativ
Karzinomzelllinien
Abb. 6: Jeweils 1,5  105 Zellen wurden in 300l Medium ausgesät. Nach 24-stündiger
Kultivierung wurde frisches Medium zugegeben und 16 Stunden später die IL-6-Konzentration
der Überstände bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte von Doppelansätzen aus einem von
mehreren Experimenten (Abbildung 6 ).
56
5.1.4. IL-6 induziert MCP-1 und erhöht die CD40L-vermittelte MCP-1-Induktion in
in-vitro-transformierten Zellen
Da in anderen Zelltypen IL-6 in der Lage ist, MCP-1 zu induzieren (Zhu et al. 1994), wurde die
Möglichkeit einer Induktion von MCP-1 in HPKIa-Zellen durch exogen zugefügtes Interleukin6 untersucht. In Hinblick auf die geringe MCP-1-Induzierbarkeit in Zervixkarzinomzellen, die
zugleich aber hohe IL-6-Mengen in den Überstand abgeben, war auch die eventuelle Repression
von MCP-1 durch IL-6 denkbar. Tatsächlich konnte in HPKIa-Zellen IL-6 in Abhängigkeit von
der zugeführten Konzentration MCP-1 induzieren, und zwar um das 2,1fache (315pg/ml MCP1) bei 5ng/ml zugeführtem IL-6 und bis zum 3,5fachen (525pg/ml MCP-1) bei 50ng/ml IL-6 (s.
Abb. 7). Hierbei wurde über 24 Stunden lang mit IL-6 stimuliert. Indem das Zellwachstum wie
bei allen in dieser Arbeit aufgeführten Zytokin-Essays mittels Kristallviolett kontrolliert wurde,
konnte eine abweichende MCP-1-Produktion wegen einer höheren Zellzahl in den mit IL-6
behandelten Ansätzen gegenüber den Parallelansätzen ohne IL-6 ausgeschlossen werden. Das
Wachstum von HPKIa-Zellen wurde innerhalb des Stimulationszeitraumes also nicht erhöht.
Wurden HPKIa-Zellen als „Langzeitinkubation” über acht Tage mit 0,5ng/ml IL-6
vorstimuliert, anschließend neu ausgesät und mit BHKCD40L-Zellen über 16 Stunden in
0,5ng/ml IL-6-haltigem Medium stimuliert, war die MCP-1-Produktion gegenüber der
BHKC40L-Stimulation ganz ohne IL-6-Stimulus in demselben Versuch um den Faktor 1,8
(1277pg/ml MCP-1) erhöht (p<0,05; s. Abb. 8). Somit kann man, was die Induktion von MCP1 anbelangt, von einem eher „additiven” Effekt von CD40L und IL-6 sprechen. Eine
kombinierte Stimulation von HPKIa mit TNF- und IL-6 ließ ein entsprechendes Bild
erkennen, und war gegenüber der alleinigen TNF--Stimulation um das 1,6fache von 388pg/ml
MCP-1 (bei alleiniger Stimulation mit 1000U/ml TNF-) auf 612pg/ml MCP-1 (bei
Stimulation mit 1000U/ml TNF- zuzüglich 5ng/ml IL-6) wirksamer (p<0,05). Auf jeden Fall
schied IL-6 aufgrund dieser Daten als potentieller negativer Regulator der MCP-1-Produktion
in den Zervixkarzinomzellen aus.
57
Abbildung 7: IL-6 induziert MCP-1 in HPKIa-Zellen
600
MCP-1 [pg/ml]
500
400
300
200
100
0
l
l
l
m
m
m
um
/
/
/
i
ng
ng
ed
ng
5
5
0
,
M
5
0
6
6
-6
IL
IL
IL
Stimulus
Jeweils 1,5 · 10 HPKIa-Zellen wurden in 300l Medium 16 Stunden lang mit den angegebenen
5
IL-6-Konzentrationen stimuliert. Dargestellt sind die aus Doppelansätzen resultierenden
Mittelwerte der MCP-1-Produktion (Abbildung 7).
58
Abbildung 8:
IL-6 erhöht die CD40L-vermittelte MCP-1-Induktion in HPKIa-Zellen
1400
1200
MCP-1 [pg/ml]
1000
800
600
400
200
0
t
t
um ium K w K w D40L 40L F-
i
ed ed BH BH K C K CD TN
M M
BH BH
IL-6 5ng/ml: – +
–
+ –
+
–
+
-
F
TN
HPKIa-Zellen wurden 8 Tage lang mit einem Zusatz von 5ng/ml IL-6 kultiviert. Über weitere
16 Stunden wurde mit 5ng/ml IL-6 zuzüglich BHKCD40L-Zellen bzw. BHKwt-Zellen
(
2 · 104 BHK-Zellen/Well; 6 · 104 BHK-Zellen/Well) oder TNF- in drei Konzentrationen
(
10U/ml;
100U/ml;
1000U/ml) stimuliert. Parallel dazu wurden HPKIa-Zellen ohne
IL-6 vorinkubiert und ohne IL-6-Zusatz mit den angegebenen Substanzen über 16 Stunden
stimuliert (Abbildung 8).
59
5.1.5. IFN- induziert MCP-1 in HPV positiven Zelllinien
In vivo ist CD40L nicht der einzige mögliche Stimulus, der für die Induktion von MCP-1 in
Zervixkarzinomen verantwortlich sein könnte. Neben der CD40L-Expression können
tumorinfiltrierende CD4+-T-Zellen Interferon- sezernieren (Terheyden et al., 2000). Dieses
Zytokin ist dafür bekannt, regulatorische Wirkungen auf einige Chemokine, darunter MCP-1,
RANTES und IP-10, auszuüben (Schmouder, Strieter und Kunkel, 1993; Li et al., 1996;
Boorsma et al., 1994). Die IFN--Stimulation von SiHa-Zellen erhöhte deren MCP-1Produktion im Kulturüberstand lediglich um das 4,1fache gegenüber dem Parallelansatz ohne
IFN- auf 324pg/ml, wogegen in der tumorigenen Zelllinie SW756 der größte Anstieg um den
Faktor 12,9 auf 1470pg/ml und bei HPKIa um das 11fache auf 1100pg/ml MCP-1 zu
beobachten war. Auch in SKv-Zellen wurde die MCP-1-Produktion durch Stimulation mit
1000U/ml IFN- um das 11,3fache auf 836pg/ml angehoben (nicht abgebildet). Im Vergleich
hierzu wurde die Interleukin-6-Produktion infolge Interferon--Behandlung bei SiHa in sehr
geringem Maße lediglich um den Faktor 1,3 gesteigert, im Falle von SW756 blieb sie auf
demselben Niveau wie ohne IFN-, und im Falle von HPKIa war auch nach IFN--Exposition
kein IL-6 zu messen - bei einer Nachweisgrenze von ca. 40pg/ml (Abbildung 9B). Eine starke
IL-6-Induktion durch IFN-, eingesetzt in einer Konzentration von 1000U/ml, ließ sich
allerdings im Falle von SKv (12,8ng/ml; Faktor 5,0), CaSki (2,2ng/ml; Faktor 6,8), HeLaCD40
(17,4ng/ml; Faktor 6,0) und geringer bei C4-1 (2,6pg/ml; Faktor 1,5) beobachten.
5.2. IFN- inhibiert das Wachstum von Zervixkarzinomzellen
Im Rahmen einer Vorstimulation von 24 Stunden mit 1000U/ml IFN-, erneuter Aussaat (1,5 
105 Zellen/Vertiefung im Doppelansatz), anschließendender Stimulation von 24 Stunden mit
IFN- 1000U/ml IFN- und danach 16 Stunden mit Zellmedium ohne IFN-, war das
Zellwachstum der Zervixkarzinomzellen je nach Zelltyp zwischen 8,4 und 59,4% bei den IFN-inkubierten Zellen im Gegensatz zu denen ohne jeglichen IFN--Zusatz inhibiert. In Tabelle 4
ist die IFN--bedingte Wachtumsinhibition der einzelnen Zelllinien im Rahmen der jeweiligen
Versuche im Vergleich zum Parallelansatz ohne IFN- aufgelistet. Diese wurde bei den
Angaben des Faktors der Zytokininduktion verrechnet (Kap. 5.1.5).
60
Tabelle 4:
Relatives Wachstum der Keratinozytenzelllinien nach IFN--Inkubation
im Vergleich zum jeweiligen Kontrollwert ohne IFN- (100 %)
Zelllinie
relatives Wachstum in %
nach IFN--Behandlung
C4-I
72,0 ( 0,4); 91,6 ( 5,9) *
CaSki
68,0 ( 1,8); 77,6 ( 3,0) *
HeLaCD40
40,6 ( 1,2)
HPKIa
64,6 ( 5,9); 68,5 ( 7,6)
K5I
68,1 ( 11,6)
SiHa
69,2 ( 4,2); 74,7 ( 5,4) *
SKv
85,4 ( 2,6)
SW756
72,5 ( 4,4); 77,7 ( 9,3) *
* Angabe der Daten zweier unabhängiger Stimulationen
5.3. IFN- sensibilisiert Zervixkarzinomzellen für die CD40-mediierte
MCP-1-Produktion
Die Stimulation IFN--vorinkubierter Zellen mit CD40L-tragenden BHK-Zellen führte nicht
nur in HPKIa-Zellen zu einem starken MCP-1-Anstieg auf 5,4ng/ml, sondern in sehr
beträchtlichem Maße auch in den tumorigenen Zelllinien SiHa und SW756 (Abb. 9A). Im Falle
von SiHa wurden bis zu 2,0ng/ml MCP-1 und im Falle von SW756 3,5ng/ml MCP-1 gemessen.
Im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit Medium resultierte der kombinierte Effekt der IFN-Voraktivierung und der CD40L-Stimulation in einen 54fachen Anstieg des Chemokins bei
HPKIa, einen 26fachen Anstieg bei SiHa und einen 30fachen Anstieg bei SW756. Die CD40Aktivierung bewirkte in IFN--behandelten Zellen bei HPKIa einen 3,3fachen, bei SiHa einen
4,7fachen und bei SW756 einen 2,7fachen Anstieg von MCP-1 im Vergleich zur IFN-präinkubierten BHKwt-Kontrolle (Alle Angaben beziehen sich jeweils auf die Stimulation mit
6105 BHK/Well). Somit konnte CD40L in den mit IFN- vorbehandelten Zellen die absolute
MCP-1-Produktion um 3,8 Nanogramm (HPKIa) bzw. um 1,6 (SiHa) und 2,2 Nanogramm
(SW756) erhöhen (Abb. 9A).
61
62
Die IFN--Stimulation reguliert nicht nur die CD40-Expression der HPKIa-Zellen herauf,
sondern auch in geringerem Umfang die von SiHa und SW756 (vgl. Kap. IV.1.). Um zu
untersuchen, ob IFN--voraktivierte Karzinomzellen generell erheblich sensibler auf den CD40Liganden reagieren, wurde wiederum IL-6 als „Referenz”-Zytokin herangezogen. In mit IFN-
inkubierten HPKIa-Zellen konnte CD40L eine IL-6-Sekretion (72pg/ml) zumindest im
messbaren Bereich induzieren. Im Vergleich zum Chemokin MCP-1 wurde jedoch die Höhe
der IL-6-Produktion von mit CD40L stimulierten SiHa- und SW756-Zellen infolge der IFN-Vorbehandlung in sehr viel geringerem Maße verändert. Bei SiHa zeigte sich ein 3,6facher und
bei SW756 ein 1,8facher Anstieg der IL-6-Konzentration in den Überständen nach IFN-- und
CD40-Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit Medium alleine. Das entspricht einer 7,2
bzw. 16,7 mal schwächeren Induktion als im Falle des Chemokins MCP-1 (s.o.). Noch
ausgeprägter zeigt sich der Unterschied in der Induktion von MCP-1 und IL-6 bei der IFN-Voraktivierung und einer nachfolgenden TNF--Stimulation. Während bei dieser kombinierten
Stimulation MCP-1 um das 39fache (SiHa) bzw. das 51fache (SW756) gegenüber Medium
allein induziert wurde, betrug die IL-6-Induktion lediglich das 2,4fache (SiHa) bzw. das
1,6fache (SW756) - bei der Stimulation mit 1000U/ml IFN- und 1000U/ml TNF-. Die IFN-Vorinkubation bewirkte bei SW756 nur eine relativ geringe Erhöhung der IL-6-Werte infolge
TNF--Stimulation um 5% und reduzierte bei SiHa sogar sichtlich die IL-6-Induzierbarkeit
durch TNF- um 52% (Abbildung 9B).
5.4. Vergleichsstimulation mit Paraformaldfehyd-fixierten und nicht fixierten
BHKCD40L-Zellen
Analog zum Stimulationsexperiment mit lebendigen, teilungsfähigen BHKCD40L-Zellen
erfolgten Stimulationen der Zelllinien HPK1a und SiHa parallel auch mit Paraformaldehydfixierten BHK-Zellen. Darüberhinaus wurden Parallelstimulationen mit 1000U/ml TNF-
sowie nur mit Medium durchgeführt. Die MCP-1-Induktion infolge der CD40L- und TNF-Stimulation wurde mit Hilfe des t-Tests (s. Kapitel IV.8.) auf ihre statistische Signifikanz hin
überprüft. Die Induktion von MCP-1 durch die Stimulation mit Paraformaldehyd-fixierten
BHKCD40L-Zellen war im Falle von beiden untersuchten Zelllinien signifikant (p < 0,001 bzw.
p = 0,007; 6  n  12; KI = 95%).
63
Abbildung 10:
„Kontroll-Stimulation" von SiHa-Zellen mit Paraformaldehyd-fixierten BHK-Zellen
Vergleich der MCP-1-Induktion infolge der Stimulation mit Paraformaldehyd-fixierten bzw.
nicht fixierten BHKCD40L-Zellen sowie TNF- über 16 Stunden innerhalb eines Versuchs am
Beispiel der Zervixkarzinomzelllinie SiHa nach 24-stündiger IFN--Vorbehandlung (Abbildung
10).
5.5. Interferon- sensibilisiert HPV positive Keratinozyten für die CD40Lmediierte Produktion von CC-Chemokinen und IP-10
Um zu untersuchen, ob die Sensibilisierung mit IFN- eine Besonderheit der MCP-1Regulation oder ein eher generelles Phänomen ist und auch für andere Chemokine zutrifft,
wurde die CD40L-vermittelte Induktion von weiteren CC-Chemokinen (RANTES und MCP-3)
und von CXC-Chemokinen (IP-10 und IL-8) gemessen.
64
Die RANTES- und MCP-3-Produktion der Zelllinien HPKIa, SiHa und SW756 war äußerst
niedrig und befand sich an der Nachweisgrenze der ELISAs, die bei etwa 40pg/ml lag. Die
CD40-Stimulation alleine konnte die MCP-3 Produktion bei HPKIa nicht wesentlich (maximal
ca. 70pg/ml) und bei SiHa und SW756 gar nicht steigern. RANTES war bei HPKIa und SW756
durch CD40L immerhin signifikant auf Werte von 187 bzw. 129pg/ml induzierbar.
Die IFN--Exposition konnte indes nicht nur HPKIa, sondern auch SW756 und in geringerem
Grade SiHa deutlich für eine Induktion beider CC-Chemokine durch CD40L empfänglich
machen. Im Falle von MCP-3 zeigte sich bei SW756 der höchste Anstieg auf über 500pg/ml,
gefolgt von HPKIa und SiHa (Abb. 11). Bei C4-I ließ sich dagegen überhaupt keine messbare
MCP-3-Produktion induzieren (nicht dargestellt). Im Falle von RANTES zeigte die
transformierte Zelllinie HPKIa nach IFN--Voraktivierung und anschließender CD40LStimulation wie schon ohne IFN- den höchsten Anstieg (1320 pg/ml). Während RANTES
durch TNF- bei den drei Zelllinien HPKIa, SiHa und SW756 im Vergleich zur CD40Aktivierung geringer induzierbar war, reagierte die Karzinomzelllinie C4-I auch empfindlich
auf die TNF- Stimulation (Abb. 12). Auch in Hinblick auf
andere in dieser Arbeit
gemessenen Zytokine (IL-6, MCP-1, IP-10 und IL-8) sprachen C4-I Zellen generell besser auf
die Stimulation mit TNF- als auf den CD40-Liganden an.
Ein vergleichbarer aber viel stärkerer Effekt konnte für IP-10, ein CXC-Chemokin, das
aktivierte T-Lymphozyten anzieht, beobachtet werden (Abb. 13). Die IP-10-Basalwerte in den
Überständen aller vier getesteten Zelllinien befanden sich am Detektionslimit des IP-10ELISAs (zwischen 0 und 75pg/ml), und die CD40-Stimulation konnte die Produktion dieses
Zytokins nur um geringe Mengen anheben, und zwar auf 164pg/ml bei HPKIa (p=0,002) und
auf 225pg/ml bei Siha (p=0,001), bzw. gar nicht bei SW756 und C4-I. Jedoch waren sehr hohe
Niveaus von IP-10 nach Stimulation mit 1000U/ml IFN- messbar. Die Konzentrationen
reichten von 4ng/ml bei C4-I-Zellen, 5ng/ml bei SiHa und 40ng/ml bei HPKIa bis 47ng/ml bei
SW756. Wenn die mit IFN- sensibilisierten Zellen entweder mit BHKCD40L oder mit TNF-
stimuliert wurden, zeigte sich bei beiden Stimuli jeweils ein starker synergistischer Effekt mit
IFN- für die IP-10-Induktion. Im Falle der CD40-Aktivierung wurden auf diese Weise Werte
bis zu 13ng/ml bei C4-I, 186ng/ml bei HPKIa, 102ng/ml bei SiHa und 94ng/ml bei SW756
erreicht - Angaben jeweils für die Stimulation mit 1,8∙106 BHKCD40L/Well (Abb. 13).
65
250
HPKIa
CD40 induziert MCP-3
in Synergismus mit IFN-
MCP-3 [pg/ml]
200
150
100
50
0
250
SiHa
MCP-3 [pg/ml]
200
150
100
50
0
700
SW756
MCP-3 [pg/ml]
600
500
400
300
200
100
0
0L
m K wt
-
4
u
F
D
i
ed BH HK C TN
M
B
66
Abbildung 11:
Nach einer 48-stündigen
IFN--Vorbehandlung
wurden in gleicher Dichte
ausgesäte Zellen mit Medium
( ), BHKCD40L- oder BHKwtZellen (
2 · 104 Zellen/
Well,
6 · 104 oder
1,8 · 105 Zellen/Well) und mit
TNF- in drei
Konzentrationen (
10U/ml,
100U/ml,
1000U/ml)
stimuliert.
16 Stunden später wurden die
MCP-3-Konzentrationen der
Überstände mittels ELISA
bestimmt. Dargestellt sind die
Mittelwerte und Standardabweichungen von Doppelbestimmungen aus je einem
repräsentativen Experiment.
Abbildung 12: CD40 induziert RANTES in Synergismus mit IFN-
HPKIa
C4-I
RANTES [pg/ml]
1000
800
600
400
200
0
SW756
400
TN
F
TN
F
M
ed
ium
BH
K
BH wt
K
M
ed
ium
BH
K
BH wt
K
0
CD
40
L
200
CD
40
L
RANTES [pg/ml]
SiHa
In Anschluss an eine 48-stündige IFN--Behandlung wurden in gleicher Dichte ausgesäte Zellen mit
Medium ( ), BHKCD40L- oder BHKwt-Zellen (
2 · 104 Zellen/Well,
6 · 104 oder
1,8 · 105
Zellen/Well) und mit TNF- in drei Konzentrationen ( 10U/ml,
100U/ml, 1000U/ml) stimuliert.
16 Stunden später wurden die RANTES-Konzentrationen der Überstände mittels ELISA bestimmt.
Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von Doppelbestimmungen aus einem
jeweils repräsentativen Experiment.
67
Abbildung 13: CD40 induziert IP-10 in Synergismus mit IFN-
180000
20000
HPKIa
C4-I
IP-10 [pg/ml]
160000
15000
140000
120000
100000
10000
80000
60000
5000
40000
20000
100000
80000
80000
60000
60000
40000
40000
20000
20000
0
0
TN
F
M
ed
ium
BH
K
BH wt
K
M
ed
ium
BH
K
BH wt
K
100000
SW756
TN
F
SiHa
CD
40
L
0
120000
CD
40
L
IP-10 [pg/ml]
0
120000
Im Anschluss an eine 48-stündige IFN--Behandlung wurden in gleicher Dichte ausgesäte Zellen mit Medium
( ), BHKCD40L- oder BHKwt-Zellen (
2 · 104 Zellen/Well,
6 · 104 oder
1,8 · 105 Zellen/Well) und
mit TNF- in drei Konzentrationen (
10U/ml,
100U/ml,
1000U/ml) stimuliert. 16 Stunden später
wurden die IP-10-Konzentrationen der Überstände mittels ELISA bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte
und Standardabweichungen von Doppelbestimmungen aus jeweils einem repräsentativen Experiment.
68
6. CD40 induziert IL-8
Ein Regulationsverhalten, welches sich von dem der oben genannten Chemokine unterscheidet,
ließ sich für Interleukin-8 beobachten. Nach CD40-Stimulation wurde IL-8 um mehr als das
4,5fache bei HPKIa und SiHa und um über das zweifache bei den übrigen getesteten
Karzinomzelllinien induziert (Tabelle 5). In allen Fällen konnte auch TNF- die Produktion des
Chemokins anregen, bei SiHa sogar um den 11,3fachen Wert. Im Falle der Mediumskontrollen
und den mit TNF- stimulierten Ansätzen wird deutlich, dass die IFN--Vorinkubation einen
eher negativen als stimulatorischen Effekt bewirkte. Hierbei waren die IL-8-Konzentrationen
der Überstände teils um mehr als die Hälfte vermindert. Nur im Falle von
HeLaCD40
überschritt die IL-8-Freisetzung der mit IFN- inkubierten Zellen durchweg die derjenigen ohne
vorausgehende IFN- Behandlung.
Von allen getesteten Zelllinien - mit Ausnahme von SW756 - wurden leicht erhöhte IL-8Mengen nach IFN-- und anschließender CD40-Stimulation im Vergleich zur alleinigen CD40Stimulation sezerniert (s. Tabelle 5).
Im Vergleich zu der alleinigen CD40-Aktivierung ohne vorherige IFN--Exposition betrug der
IL-8-Anstieg infolge der kombinierten CD40- und IFN--Stimulation bei C4-I das 3,1fache. Im
Falle der anderen Zelllinien lediglich das 1,1 bis 1,7fache. Mittels der kombinierten IFN-- und
BHKCD40L-Stimulation konnte somit in HPKIa- und SiHa-Zellen die IL-8-Produktion
hochgradig um den Faktor 6,3 bzw. 6,7 verglichen mit Medium allein induziert werden.
69
Zelllinie
HPK1a
C4-1
SiHa
SW756
Tabelle 5: CD40 induziert IL-8 in HPKIa- und Zervixkarzinomzellen
3,1
2,9
TNF-
3,4
13,1
406,6
310,8
40,2
2,9
TNF-
449,0
283,3
4,1
1,4
966,1
231,8
TNF-
38,3
15,1
234,5
158,8
2,1
5,1
BHKwt
222,6
170,5
0,8
3,2
550,9
158,4
33,9
53,6
BHKwt
10,1
5,4
84,4
71,0
27,7
4,5
6,7 1048,9
8,1 921,9
21,8
47,9
BHKCD40L
218,3
163,4
8,5
4,4
242,1
79,1
362,3
201,5
22,2
32,6
BHKCD40L
40,2
2,2
72,1
79,1
2,4
3,0
994,6
663,2
23,7
1,3
558,3
649,5
Medium
228,0
164,7
6,5
3,5
80,2
34,3
1,8
7,3
280,6
138,6
19,7
91,8
1000U/ml
IFN- 246,9 46,9 959,6 40,2 1107,1 22,8
+IFN- 177,6 15,4 1076,9 32,3 1557,3 186,6
58,5
51,9
5,0
1,2
877,7
338,6
12,8
0,0
417,0
833,7
100U/ml
3,7
17,7
71,2
30,7
6,2
9,4
149,4
54,3
15,8
56,0
10U/ml
109,0
282,2
38,3
32,5
514,7
266,8
5,4
3,4
564,6
630,8
6 · 104
7,4
4,2
421,8
570,2
7,8
9,3
69,2
46,2
1,6
28,1
2 · 10 4
97,3
204,1
6,5
26,0
502,4
261,6
6,5
0,0
123,0
406,1
6 · 104
2,2
4,6
296,8
356,8
24,0
36,3
65,6
39,8
6,4
48,8
2 · 104
54,0
38,7
8,9
2,8
27,0
23,9
133,5
433,0
789,6 134,0
4,2
452,4
IFN-
+IFN-
85,7
47,3
223,3
288,0
IFN- 495,9 12,8 833,7 115,7 1111,9
+IFN- 210,5 13,2 1184,4 246,7 1000,0
IFN-
+IFN-
5,5
74,0
50,6
9,1
HeLaCD40
CaSki
214,7
366,5
442,7
573,1
5,4
7,3
9,4
14,3
IFN- 105,1
+IFN- 50,0
404,1
567,9
IFN- 186,7 9,1
+IFN- 209,0 13,8
HPKIa- und Zervixkarzinomzellen wurden entweder mit 1000U/ml IFN- 48-stündig vorbehandelt oder blieben unbehandelt. Anschließend
wurden die Zellen über weitere 16 Stunden mit Medium alleine, BHKCD40L- oder BHKwt-Zellen (2  104 oder 6  104 BHK-Zellen/Loch) und mit
TNF- in den angegebenen Konzentrationen stimuliert. Aufgeführt sind IL-8-Mittelwerte (in pg/ml) und Standardabweichungen (in pg/ml) von
Doppelansätzen eines repräsentativen Experiments.
70
7. CD40 induziert den hämatopoetischen Wachstumsfaktor GM-CSF in
Zervixkarzinomzellen
Die im Rahmen dieser Arbeit getesteten Zelllinien C4-I, HeLaCD40, HPKIa, SiHa, SKv und
SW756 sezernierten weder konstitutiv noch nach 24stündiger Inkubation mit 1000U/ml IFN-
messbare Mengen an GM-CSF. Von Woodworth und Simpson (1993) konnte bei den
getesteten Zervixkarzinomzelllinien C4-I, SiHa und SW756 keine konstitutive GM-CSFProduktion detektiert werden.
In CaSki-Zellen war GM-CSF mit bis zu 452pg/ml durch CD40L bei sehr geringer
Basalproduktion (ca. 20pg/ml) deutlich induzierbar. Auch infolge der Stimulation mit TNF-
konnten die Messwerte in Abhängigkeit von der zugeführten TNF--Konzentration auf bis zu
373pg/ml GM-CSF angehoben werden (s. Abbildung 14). Alle GM-CSF-Werte waren nach
einer 24stündigen Vorbehandlung der Zellen mit 1000U/ml IFN- vermindert, und zwar auf
maximal 204pg/ml nach sich anschließender CD40L- bzw. auf 53pg/ml nach TNF-Stimulation. Bei SW756 war GM-CSF lediglich durch CD40L signifikant auf ca. 100pg/ml
induzierbar. Bei HeLaCD40 wurden Konzentration von bis zu 123pg/ml GM-CSF nach
BHKCD40L-Stimulation festgestellt. Im Falle einer vorherigen 24stündigen Inkubation mit
1000U/ml IFN- war die CD40L vermittelte GM-CSF-Induktion bei HeLaCD40 allerdings
reduziert auf maximal 42pg/ml. Unter denselben Bedingungen war bei SW756 kein GM-CSF
mehr nachweisbar (Abb. 14). Alle beschriebenen Induktionen waren statistisch signifikant
(p<0,05; KI=0,5). Bei den ebenfalls überprüften Zelllinien C4-I und SKv ließ sich GM-CSF
weder durch CD40L noch durch TNF-, auch nicht in Kombination mit einer vorausgehenden
IFN--Behandlung, induzieren (nicht dargestellt).
71
500
450
Abbildung 14:
CD40 induziert GM-CSF
CaSki
GM-CSF [pg/ml]
400
In gleicher Dichte ausgesäte
Zervixkarzinomzellen (1,5 ·
105/Well)
wurden
mit
Medium alleine (
),
BHKCD40L- oder BHKwtZellen in jeweils drei
Konzentrationen (
2 · 104
Zellen/ Well,
6 · 104 oder
1,8 · 105 Zellen/Well) und
mit TNF- in drei Konzentrationen (
10U/ml,
100U/ml,
1000U/ml)
stimuliert.
350
300
250
200
150
100
50
0
140
SW756
GM-CSF [pg/ml]
120
100
16 Stunden später wurden die
GM-CSF-Konzentrationen
der
Überstände
mittels
ELISA bestimmt. Dargestellt
sind die
Mittelwerte und Standardabweichungen von Doppelbestimmungen aus je einem
repräsentativen Experiment.
80
60
40
20
0
140
HeLaCD40
GM-CSF [pg/ml]
120
100
80
60
40
20
72
TN
F
M
ed
iu
m
BH
K
BH wt
K
CD
40
L
0
8. Zytokin-Induktion und Zelltodregulation durch den CD40-verwandten
Rezeptor Fas
In dieser Arbeit wurden die Zervixkarzinomzelllinien C4-I, CaSki, SiHa, SW756, weiterhin
SKv und die in-vitro-immortalisierten Zelllinien HPKIa und K5I parallel zur Stimulation mit
BHKCD40L-Zellen mit BHKFasL-Zellen stimuliert (s. III.1.7.2.). Die BHKFasL-Transfektanten
sollten in vitro den Effekt von HPV-spezifischen zytotoxischen T-Zellen, die in vivo in
Patienten mit zervikaler Neoplasie gefunden wurden (Evans et al., 1997), imitieren. Nach der
16stündigen Stimulationphase wurden die Konzentrationen der Zytokine IL-6, IL-8 und MCP-1
in den Überständen bestimmt und Zellüberleben mit Hilfe der Kristallviolettmethode (s.
III.1.7.4.) quantifiziert und fotografisch dokumentiert.
Die Zytokinkonzentrationen der Zellüberstände wurden auf Grund des massiven Zelltodes nicht
mit den unterschiedlichen Zellzahlen zum Zeitpunkt der Messung verrechnet, sondern lediglich
als absolute Messwerte betrachtet. Trotzdem zeigten sich signifikante Erhöhungen aufgrund der
BHKFasL-Stimulation im Vergleich zum BHKwt-Ansatz vor allem bei dem Chemokin IL-8 im
Falle von SiHa (um den Faktor 2,5 von 108 auf 268pg/ml), im Falle von C4-I (um den Faktor
2,1 von 87 auf 183pg/ml) und im Falle von CaSki (um den Faktor 1,6 von 87 auf 139pg/ml).
Für IL-6 ergab sich eine geringere Induktion um das 1,6 bis 1,7fache (von 1115 auf 1926pg/ml
bei C4-I, von 3304 auf 5545pg/ml bei SiHa und bei CaSki - nur nach vorheriger IFN-Inkubation - von 840 auf 1330pg/ml). Lediglich vereinzelt fanden sich geringfügige MCP-1Erhöhungen, z.B. bei SiHa um das 1,5fache auf 137pg/ml.
Im Vordergrund dieser Versuchsreihe stand jedoch die zytotoxische Wirkung des FasLiganden. Die Konzentrationen der untersuchten Zytokine waren zum Zeitpunkt der Messung,
an welchem das größte Teil der Zellen bereits abgestorben war, im Vergleich zur parallelen
Stimulation mit CD40L und TNF- indes gering. Eine ausgeprägte Apoptose stellte sich bei
allen getesteten Karzinomzelllinien und insbesondere bei K5I ein. Bereits bei mittlerer
Konzentration von BHKFasL-Zellen (6  104 Zellen/Well) wurden alle K51-Zellen abgetötet
(Abb. 15E). Anhand der Kristallviolettdaten konnte im Falle von CaSki festgestellt werden,
dass bei der geringsten BHKFasL-Konzentration von 2  104 BHKFasL-Zellen/Well je nach
Stimulation noch ca. 77,5% ( 7,5%) der CaSki-Zellen im Vergleich zu den Ansätzen mit
BHKwt oder BHKCD40L überlebten und dass beim Einsatz von 6  104 BHKFasL-Zellen/Well
noch 51% ( 6,0%) vorhanden waren. Bei der höchsten BHKFasL-Konzentration von 1,8  105
73
Zellen/Well wurden alle CaSki-Zellen abgetötet, so dass nach der Stimulationsphase nur noch
BHKFasL-Zellen auf dem Boden des Wells wuchsen (Abb. 15A). Das Wachstum von SW756Zellen wurde infolge der BHKFasL-Stimulation (1,8  105 Zellen/Well) auf 12% ( 4,9%), das
von C4-I-Zellen auf 46,7% ( 4,3%) (Abb. 15B) und das von SiHa-Zellen auf 61,1% ( 5,2%)
im Vergleich zur jeweiligen BHKwt-Stimulation reduziert. Eine vorausgehende, insgesamt
48stündige IFN--Inkubation in Kombination mit der Fas-Stimulation führte zur weiteren
Reduktion der Karzinomzellen in additiver Weise. Infolgedessen waren schließlich die Anzahl
der SW756-Zellen auf ein Minimum von ca. 7%, die der C4-I-Zellen auf ca. 24% und die der
SiHa-Zellen auf 41% (Abb. 15C) gegenüber der Karzinomzellmenge in den entsprechenden
BHKwt-Kontrollansätzen (1,8  105 BHK/Well) ohne IFN--Inkubation vermindert. Im
Vergleich zu den genannten Zelllinien verhielten sich SKv-Zellen gegenüber der FasLStimulation zunächst weitgehend resistent. In Abhängigkeit von der BHKFasL-Konzentration
betrug ihr Wachstum 88,8% (2  104 BHKFasL/Well), 84,1% (6  104 BHKFasL/Well) und 78,5%
(1,8  105 BHKFasL/Well). Erst nach Sensibilisierung mit IFN verringerte sich die Anzahl
lebendiger SKv-Zellen auf 78,8% bei 2  104 BHKFasL-Zellen/Well , 56,6% bei 6  104
BHKFasL-Zellen/Well und schließlich auf 41,6% bei 1,8  105 BHKFasL-Zellen/Well (Abb.
15D).
Zu den folgenden Seiten (Abbildungen 15 A-E):
Die FasL-Fas-Interaktion induziert Zelltod in Zervixkarzinomzelllinien und in in-vitro-transformierten
Keratinozyten.
Die Zelllinien wurden zunächst 24-stündig mit 1000U/ml IFN- inkubiert oder blieben unbehandelt.
Danach wurden sie in 24-Well-Kulturplatten ausgesät (1,5 · 105 Zellen/Well) und die IFN-Behandlung (mit 1000U/ml) bei den vormals IFN--stimulierten Zellen über 24 Stunden fortgesetzt.
Anschließend erfolgten Stimulationen mit Medium alleine, BHKFasL- BHKwt- oder BHKCD40L-Zellen
(jeweils 2 · 104, 6 · 104 und 1,8 · 105 BHK-Zellen/Well). 16 Stunden später wurden die Überstände, im
Falle der BHKFasL-Stimulation mitsamt zahlreichen abgelösten Zellen und Zelltrümmern,
abgenommen, zentrifugiert und ihre Zytokinkonzentrationen (s.o.) bestimmt. Währenddessen wurden
die in den Wells verbliebenen Zellen fotografiert und mittels der Kristallviolettmethode Vitalfärbungen
durchgeführt. Die exemplarischen Fotos dokumentieren den Zustand direkt im Anschluss an die
jeweiligen Stimulationen gemäß den Beschriftungen (Abbildungen 15A-E).
74
Abbildung 15A: CaSki
CaSki | IFN-
Medium
CaSki | IFN-
1,8 · 105BHKCD40L/Loch
CaSki | IFN-
1,8 · 105BHKFasL/Loch
Abbildung 15B: C4-I
C4-I | +IFN-
Medium
C4-I | +IFN-
1,8 · 105BHKwt/Loch
C4-I | +IFN-
1,8 · 105BHKFasL/Loch
75
Abbildung 15C: SiHa
SiHa | +IFN-
Medium
SiHa | +IFN-
1,8 · 105BHKwt/Loch
SiHa | +IFN-
1,8 · 105BHKFasL/Loch
Abbildung 15D: SKv
SKv | +IFN-
Medium
76
SKv | +IFN-
6 · 104BHKwt/Loch
SKv | +IFN-
6 · 104BHKFasL/Loch
Abbildung 15E: K5I
K5I | IFN-
Medium
K5I | IFN-
6 · 104BHKwt/Loch
K5I | IFN-
6 · 104BHKFasL/Loch
77
V. DISKUSSION
Die Infektion des zervikalen Schleimhautgewebes mit onkogenen HPV-Typen kann jahre- oder
jahrzehntelang persistieren und über die Weiterentwicklung einer prämalignen zervikalen
intraepithelialen Neoplasie zum invasiven Karzinom führen. Der Bewältigung der HPVInfektion liegen vielfältige Wechselwirkungen zwischen den die Virusnukleinsäure
enthaltenden Keratinozyten und dem Immunsystem zugrunde. Den zellgebundenen
Abwehrmechanismen, vermittelt durch spezifische Erkennung und Abwehr durch TLymphozyten, aber auch der Immunität durch das Monozyten-Makrophagen-System und NKZellen, kommen hierbei eine führende Bedeutung zu. Prinzipiell sind Keratinozyten selbst in
der Lage, an der Modulation von Immunantworten, z.B. mittels der Sekretion von Chemokinen,
aktiv teilzunehmen und auf diesem Wege bestimmte Immunzellen zu aktivieren und zum
infizierten Epithel zu führen.
Rösl et al. zeigten 1994, dass in vitro Zervixkarzinomzelllinien (z.B. HeLa, SiHa und SW756)
im Gegensatz zu primären humanen Fibroblasten und nicht-tumorigenen HeLa-Hybridzellen
kein messbares MCP-1 mRNA-Niveau exprimieren. Dieses Chemokin wirkt sowohl auf
Monozyten als auch auf CD4+- und CD8+-T-Gedächtniszellen chemotaktisch. Zervikale
intraepitheliale Läsionen weisen in vivo gelegentlich eine schwache MCP-1-Expression auf.
Dagegen wurde in Zervixkarzinomen mit entzündlicher Reaktion eine mittelgradige bis starke
MCP-1-Expression der Karzinomzellen selbst beobachtet (Riethdorf et al., 1996). Die Reaktion
war von zahlreichen Makrophageninfiltraten insbesondere am epithelial-mesenchymalen
Übergang begleitet. Diese unterschiedlichen Beobachtungen der in vivo und in vitro MCP-1Freisetzung lassen weitere Faktoren, die in vitro abwesend sind, in vivo jedoch zur deutlichen
MCP-1-Heraufregulation führen, vermuten. Eine andere Erklärungsmöglichkeit könnte in der
Anwesenheit MCP-1-reprimierender Faktoren in der In-vitro-Zellkultur bestehen. Das Zytokin
TGF-1 führt beispielsweise zu einer herabgesetzten NF-B-Aktivität in B-Zellen und
unterdrückt die MCP-1-Produktion in Makrophagen (Arsura, Wu und Sonenshein, 1996;
Kitamura, 1997). In der Arbeitsgruppe konnte eine hohe Aktivität des Transkriptionsfaktors SP1, der für eine konstitutive MCP-1-Expression notwendig ist (Ueda et al., 1994), in SiHa-Zellen
und SW756-Zellen und in geringerem Maße in HPKIa-Zellen nachgewiesen werden. Allerdings
führte eine autokrine MCP-1-Stimulation des Rezeptors CCR2 auf aktivierten Monozyten über
intrazelluläre Calcium-Signalwege zu einer vermehrten Expression der Matrixmetalloprotease
MMP-9 (Schröer et al., 2011). Diese Matrixmetalloprotease wird in bis zu 100% der CIN-IIILäsionen und Zervixkarzinomen gefunden und die Expression korreliert mit einer schlechten
78
Prognose (Giraudo, Inoue und Hanahan, 2004; Sheu et al., 2003). Eine MCP-1-Expression
konnte
in
vitro
in
aktivierten
Monozyten
nach
direktem
Zell-Zell-Kontakt
mit
Zervixkarzinomzellen über eine STAT3-Aktivierung induziert werden und führte zu einer
autokrinen MMP-9-Induktion in den Monozyten (Schröer et al., 2011). Hierzu passen in-vivoBeobachtungen von Zijlmans et al., 2006, wonach die CCL-2-mRNA-Expression in
Zervixkarzinomzellen mit der Anzahl tumorinfiltrierender Makrophagen korrelierte und ein
Fehlen von CCL2-mRNA mit einer besseren Prognose der Patienten einherging.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die CD40L-CD40-Interaktion im Synergismus mit
IFN- zur starken Heraufregulation sowohl von MCP-1 als auch verwandter Chemokine in
Zervixkarzinomzelllinien führt. Dieser Mechanismus könnte eventuell auch das in vivo
beobachtete Phänomen erklären, indem CD40 auf zervikalen Plattenepithelkarzinomen stark
exprimiert wird und der CD40-Ligand auf infiltrierenden lymphozytären und monozytären
Zellen gefunden wurde (Altenburg et al., 1999).
Analog zu der In-vivo-Situation exprimierten HPV positive Zervixkarzinomzelllinien,
insbesondere SiHa, SW756 und CaSki, hochgradig CD40 (Altenburg et al., 1999). Nichtmaligne mit HPV16 oder HPV18 in-vitro-transformierte Zelllinien, wie HPKIa, I56, K5I und
K64, die sich von humanen Vorhautepithelzellen ableiten, wiesen dagegen nur ein
geringgradiges CD40-Expressionsniveau auf. Bei allen Zelllinien mit Ausnahme der mit einer
CD40-cDNA transfizierten Zelllinie HeLaCD40 (Hess und Engelmann, 1996) konnte durch den
Einsatz von IFN- die CD40-Expression angehoben werden. IFN- wird von TH1Lymphozyten nach Antigen- bzw. Mitogen-Aktivierung als den Hauptproduzenten sowie von
Natural-Killer(NK)-Zellen und neutrophilen Granulozyten gebildet und stimuliert in den
Zielzellen die Transkription von MHC-Klasse I und II-Genen sowie die Produktion anderer
Zytokine und die Expression von Zytokinrezeptoren wie IL-2-R und TNF-R (Keskinen et al.,
1997; Gosselin et al., 1993; Aggarwal et al., 1985; Holter et al., 1986). Auch CD40, welches
der TNF/NGF-Rezeptorfamilie angehört, wird durch IFN- induziert. Von verschiedenen
Autoren wurde bereits ausgeführt, dass dies im Falle von B-Zellen, Monozyten, epidermalen
Basalzellen, Endothel- und Thymusepithelzellen sowie bei einigen CD40-exprimierenden
Tumorzelllinien, die sich von Melanomen, Hepatoblastomen und Nierenzellkarzinomen
ableiten, relevant ist (Karmann et al., 1995; Alderson et al., 1993; Denfeld et al., 1996; Galy
und Spits, 1992; Stamenkovic et al., 1989). Die eigene Arbeitsgruppe (Heß et al., 1995b)
79
konnte infolge einer Behandlung humaner Vorhautfibroblasten mit 1000U/ml IFN- eine
Hochregulation des mittels Zytofluorimetrie zunächst nicht nachweisbaren CD40-Expressionsgrades beobachten. Die durch IFN- induzierten Transkriptionsfaktoren STAT-1-, P.U1 und
Spi-B, welche die Aktivität des CD40-Promotors erhöhen (Nguyen und Benveniste, 2000),
könnten in den dieser Beobachtung zugrundeliegenden Mechanismus involviert sein.
Da sowohl CD40 als auch der CD40-Ligand im Zervixkarzinomgewebe in vivo gefunden
wurden, wurde die Hypothese eines parakrinen Mechanismus aufgestellt. Die Interaktion der
beiden Moleküle wurde in vitro untersucht. Die Stimulation der Zervixkarzinomzellen SiHa
und SW756 mit CD40L führte zur Induktion von MCP-1. Trotz der sehr viel höheren CD40Expression von SiHa und SW756 war deren MCP-1-Produktion im Vergleich zu den nichttumorigenen HPKIa-Zellen eher gering. Zusätzliche Experimente gaben darüber Aufschluss,
dass die Induktion von MCP-1 durch CD40L in den Karzinomzellen in einer ähnlichen
Größenordnung, nämlich 2,1 bis 2,8fach, wie die Induktion von IL-6 durch CD40L (1,4 bis
2,4fach) lag. Diese Befunde sprechen gegen eine selektive Unempfänglichkeit des MCP-1-Gens
gegenüber dem inflammatorischen Stimulus CD40L und deuten darauf hin, dass zumindest
kein selektiver Defekt innerhalb des MCP-1/JE-Gens selbst vorlag. So wie schon die basale IL6-Produktion der HPV positiven Zervixkarzinomzellen hoch war (s. Abb. 6), wurde IL-6
infolge der CD40-Stimulation sehr stark sezerniert (s. Abb. 9B). Auch Woodworth und
Simpson beobachteten (1993), dass SiHa, C4-I und SW756 spontan mehr IL-6 produzieren als
normale Zervixepithelzellen und HPV-immortalisierte Zervixepithelzellen. Dass HPV16
positive SKv-Zellen, abgeleitet von einer vulvulären bowenoiden Papulose, spontan IL-6
freisetzten, wurde bereits von Malejcyk et al. (1991) beschrieben. Dagegen sezernierte die mit
HPV in-vitro-transformierte Zelllinie HPKIa spontan kein und auch die in-vitro-transformierte
Zelllinie K5I nur äußerst gering IL-6. Um zu klären, ob die hohe IL-6-Produktion der
Karzinomzellen eventuell einen autokrinen inhibierenden Effekt auf die MCP-1-Produktion
ausübt, wurden Kulturen der Zelllinie HPKIa, welche selbst kein IL-6 produzieren, exogen
verschiedene Konzentrationen an IL-6 zugeführt. Hierdurch wurde allerdings die MCP-1Produktion von HPKIa keinesfalls unterdrückt, sondern im Gegenteil in Abhängigkeit von der
zugeführten IL-6-Konzentration erhöht. Auch die CD40L-abhängige MCP-1-Induktion konnte
bei dieser Zelllinie durch die simultane Gabe von IL-6 zusätzlich gesteigert werden. Die hohe
IL-6-Konzentration selbst war somit kein negativer Regulator der MCP-1-Produktion in den
Zervixkarzinomzelllinien. In der Arbeitsgruppe konnte später gezeigt werden, dass die nichtmalignen Keratinozytenzelllinien K5I, I56 und HPKIa die -Kette des IL-6-Rezeptors gp80
80
exprimieren, aber auch dass gp80 in malignen Zellinien sowohl auf der Zelloberfläche als auch
auf mRNA-Ebene nur sehr schwach (CaSki, SiHa) oder gar nicht nachweisbar war (SW756,
HeLa). Die MCP-1-Induzierbarkeit durch IL-6 konnte schließlich in den Karzinomzellen
CaSki, SiHa und SW756 durch Zugabe von löslichem gp80 wiederhergestellt werden (Hess et
al., 2000). MCP-1 war in nicht-entzündlichem Zervixkarzinomgewebe kaum nachweisbar
(Rösl et al., 1994, Altenburg et al., 1999) und in vivo könnte diese autokrine ChemokinInduktion durch das selbst sezernierte IL-6 einen Nachteil für die Tumorprogression bedeuten.
Auf der anderen Seite wurde für IL-6 eine wachstumsfördernde Eigenschaft bei manchen
Zervixkarzinomzelllinien (XH1, EH2, DE3, JE6, SM7, CXT-1 und CaSki) und bei normalen
und Papillomvirus-immortalisierten zervikalen Fibroblasten, begleitet von einem Anstieg der
RNAs für die Wachstumsfaktoren TGF-a und Amphiregulin, beobachtet (Eustace et al., 1993;
Iglesias,
Plowman und Woodworth, 1995). Außerdem zeigt IL-6 teilweise auch
antiinflammatorische Eigenschaften, indem es die IL-1-β- und TNF-α-Produktion in
mononuklerären Zellen und die Degradierung extrazellulärer Matrix in Chondrozyten inhibiert
(Schindler et al., 1990; Shingu et al., 1994). Für die in dieser Arbeit in vitro gesehenen hohe IL6-Sekretionen der Zervixkarzinomzelllinien könnten in vivo somit auch Vorteile für die
Tumorprogression zu vermuten sein. Zur Tumorprogression könnte IL-6 bzw. eine IL-6vermittelte MCP-1-Expression aber auch dadurch beitragen, indem die Stimulation des
Rezeptors CCR2 auf aktivierten Monozyten zur MMP-9-Expression führt (Schröer et al.,
2011).
Als die einzige Zervixkarzinomzelllinie zeigte die HPV-negative und, wie hier gezeigt, auch
CD40-negative Zelllinie C33A weder basal noch nach Stimulation mit TNF- eine messbare
IL-6-Produktion.
Für eine effiziente Gen-Induktion sind oftmals zwei synergistische Signale erforderlich. Im
Falle des IL-6-Gens scheint wenigstens ein wichtiges Signal konstitutiv in HPV positiven
Zervixkarzinomzellen vorhanden zu sein. Die CD40-Aktivierung könnte einen zweiten
Stimulus zur Verfügung stellen über NF-B oder auch über AP-1. NF-B ist sowohl für MCP-1
als auch für IL-6 ein regulatorischer Faktor und ist in Karzinomzellen wie SiHa und SW756
induzierbar (Ueda et al., 1994; Shimizu et al., 1990; Altenburg et al., 1999). Im Falle von
MCP-1 bewirkt CD40L ein stimulierendes Signal via NF-B, welches jedoch alleine kaum
ausreichend für die in vivo beobachtete starke Heraufregulation von MCP-1 sein kann. Als nahe
liegende Hypothese könnten T-Zellen neben CD40L einen zweiten Stimulus, bei welchem ein
81
weiteres Zytokin als Effektor fungiert, bereitstellen. Tatsächlich erhöhte IFN-, ein anderes TZell-Zytokin, das MCP-1 in Endothel- und einigen Epithelzellen induziert (Rollins et al., 1990;
Schmouder, Strieter und Kunkel, 1993), die MCP-1 Produktion in SKv-, SiHa-, SW756- und
HPKIa-Zellen um ein Mehrfaches (zwischen 4,1 und 13fach). Die Aktivierung IFN-vorbehandelter Zellen mit membrangebundenem CD40-Liganden führte schließlich zu einer
starken, synergistischen Antwort und MCP-1 wurde in Nanogramm-Mengen produziert bzw.
freigesetzt. Bei HPKIa wurde so eine 54fache MCP-1-Konzentration, bei SiHa und SW756
Konzentrationsanstiege auf über das 25fache gegenüber der Kontrollstimulation mit Medium
alleine erreicht. Die synergistische Induktion von MCP-1 nach IFN-- und CD40L-Stimulation
konnte nicht nur auf die Heraufregulation von Membranrezeptoren zurückzuführen sein, da die
Induktion anderer Zytokine wie IL-6 dann in ähnlicher Weise beeinflusst würde, sondern
scheint auf Ebene der intrazellulären Signalübermittlung stattzufinden. Es erscheint
naheliegend, dass die NF-B-Aktivierung für die MCP-1-Induktion notwendig sein könnte,
jedoch auch, dass weitere, unter anderem durch IFN- vermittelte Signale für die effiziente
MCP-1-Induktion in Zervixkarzinomzellen erforderlich sind.
Aus den Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die MCP-1-Produktion in Zervixkarzinomzelllinien in vitro nicht irreversibel reprimiert ist. Die kombinierten Signale von CD40L
und IFN- scheinen als adäquate Stimuli die MCP-1-Produktion in diesen Zellen heraufzuregulieren. Entsprechend könnte in vivo IFN-, das von aktivierten infiltrierenden T-Zellen gebildet
wird, die Tumorzellen zur Produktion von MCP-1 nach CD40L-Kontakt anregen. Durch diesen
parakrinen Mechanismus mag auch die hohe Expression von MCP-1 am mesenchymalepithelialen Übergang, welche zur Kontrolle des Krankheitsverlaufs beiträgt, zu erklären sein.
Eventuell könnte in Zervixkarzinomen, die keinerlei intensive entzündliche Reaktion zeigen,
die Applikation von IFN- als starker Sensibilisator für endogene, über CD40L-CD40 mediierte
Abwehrmechanismen erwogen werden.
Ein gleichartiger aber sehr viel stärker ausgeprägter synergistischer Effekt wurde für die
Induktion von IP-10, ein ebenfalls T-Zellen anziehendes Chemokin, in Zervixkarzinomzellen
und HPKIa-Zellen infolge der kombinierten Stimulation mit IFN- und CD40L festgestellt. In
geringerem Ausmaß konnten die Chemokine MCP-3 und RANTES induziert werden. Eine
starke antitumorale Wirkung von MCP-3 infolge der Inokulation von HeLa-Zellen, die zuvor
82
mit einem MCP-3-Vektor transfiziert worden waren, wurde bereits im Nackt-Maus-Modell von
Wetzel et al. (2001) demonstriert.
IL-8, ein Chemokin das hauptsächlich neutrophile Granulozyten rekrutiert, wurde sowohl von
Zervixkarzinomzellen (C4-I, SiHa, SW756, CaSki und HeLaCD40) als auch von von in-vitrotransformierten Zellen (HPKIa) konstitutiv in messbaren Mengen abgegeben. Durch alleinige
Stimulation mit CD40L ließ sich die IL-8-Produktion aller getesteten Zelllinien um ein
Mehrfaches (zwischen 2,0 und 4,9fach) induzieren. Auf einen von den obigen Darstellungen
abweichenden Regulationsmechanismus deutet jedoch die Tatsache hin, dass eine Vorbehandlung mit IFN- bei fast allen Zelllinien eine Erniedrigung der IL-8-Sekretion zur Folge hatte.
Die Interferon-bedingte Wachstumsinhibition wurde dabei berücksichtigt und die Zellzahlen
abgeglichen. In dieser Arbeit war der Unterschied zu dem mit IL-8 direkt verwandten CXCChemokin IP-10 besonders auffällig. Allerdings konnten bei den hier getesteten Zelllinien die
höchsten IL-8-Werte wiederum nach kombinierter Stimulation mit IFN- und CD40L gemessen
werden. Für diese CD40-spezifische Sensibilisierung, welche für TNF- nicht beobachtet
wurde (s. Tabelle 5), mag zumindest zum Teil die durch IFN- vermittelte Erhöhung der CD40Rezeptor-Expression verantwortlich sein, denn von allen getesteten Zelllinien - mit Ausnahme
von SW756 - wurden leicht erhöhte IL-8-Mengen nach IFN-- und anschließender CD40Stimulation im Vergleich zur alleinigen CD40-Stimulation sezerniert (s. Tabelle 5).
In der Primärliteratur wurde bereits beschrieben, dass IFN- sehr unterschiedliche Effekte auf
die IL-8-Expression in Abhängigkeit von der Zellart und von Kostimulanzien hervorrufen kann.
So ist bereits in verschiedenen Publikationen berichtet worden, dass IFN- auch auf die IL-8Sekretion von epidermalen Plattenepithelkarzinomzellen, normalen humanen Keratinozyten,
Nierenepithelzellen und Monozyten keinen oder einen ebenfalls leicht inhibierenden Effekt
ausübt (Maruyama et al., 1995; Boorsma et al. 1994; Gerritsma et al., 1996; Schnyder-Candrian
et al., 1995; Gusella et al., 1993). Ähnlich wie bei den hier getesteten Zervixkarzinomzellen,
übte IFN- auf eine TNF--induzierte IL-8-Sekretion von Melanomzellen, Fibroblasten,
Endothelzellen und Leukozyten einen ebenfalls eher inhibierenden oder zumindest keinen
stimulierenden Effekt aus (Möhler et al., 1996; Takigawa et al., 1994; Sticherling et al., 1993 ;
Brown et al., 1994; Cassatella et al., 1993). Dagegen konnte bei normalen humanen
Keratinozyten durch IFN- in Synergismus mit TNF- die IL-8-Sekretion induziert werden
(Barker et al. 1990; Fujisawa et al. 1997).
83
Der humane GM-CSF-Promotor wird durch die Transkriptionsfaktoren NF-B, AP-1 und SP-1,
welche auch als Signal-Mediatoren von CD40 wirken, aktiviert und die Induktion von GM-CSF
via CD40 wurde bereits in eosinophilen Zellen nachgewiesen (Thomas et al., 1997; Ye, Zhang
und Dong, 1996; Ohkawara et al., 1996). Schließlich konnte durch CD40L auch GM-CSF, ein
Zytokin, das ebenfalls über NF-B reguliert wird, in manchen Zelllinien, vor allem bei CaSki
und geringer bei SW756, induziert werden. Der hämatopoetische Wachstumsfaktor fördert das
tumorizide Potential von Makrophagen, Neutrophilen und T-Zellen und fördert z.B. die
Generierung antigenpräsentierender dendritischer Zellen bei Patienten mit präneoplastischen
Läsionen der Cervix uteri unter experimentellen Bedingungen (Hubert et al., 1998). Als
wesentlicher Bestandteil im Rahmen experimenteller Vakzinierungen gegen HPV16-E7positive Tumoren wurde GM-CSF von Chang et al. (1997) eingesetzt. Eine Behandlung der
Karzinomzellen mit IFN- wirkte sich weder stimulierend auf die GM-CSF-Produktion aus,
noch
war
ein
Synergismus
zwischen
CD40L
und
IFN-
zu
beobachten.
Dass
Zervixkarzinomzelllinien zu einer detektierbaren, endogenen Produktion von GM-CSF
angeregt werden können, ist bislang in Fachliteratur nicht beschrieben worden.
Die Interaktion zwischen den Zervixkarzinomzellen und TNF- ist in vivo ebenfalls
maßgeblich vom Vorhandensein tumorinfiltrierender T-Zellen und Makrophagen abhängig.
TNF- kann über die Aktivierung vieler Gene in das immunologische Geschehen eingreifen,
beispielsweise durch die Induktion von Zytokinen sowie Zytokinrezeptoren oder MajorHistocompatibility-Antigenen. Wie CD40L aktiviert auch TNF- den Transkriptionsfaktor NFB. Eine deutliche Induktion der Chemokine MCP-1 und IL-8 und teilweise auch von
RANTES und IP-10 durch TNF- ergab sich vor allem bei den Zelllinien HPKIa, SiHa und
SW756, und ein starker synergistischer Effekt infolge der kombinierten Stimulation mit INF-
und TNF- insbesondere im Falle der Chemokine MCP-1, RANTES und IP-10 bei HPKIa-,
SiHa-, SW756- und C4-I-Zellen und im Falle von MCP-3 bei SW756-Zellen.
Die hier gezeigte synergistische Induktion von Chemokinen in Zervixkarzinomzellen durch
TNF- und IFN- könnte also in ähnlicher Weise wie der CD40-Ligand zu einer weiteren
Anhäufung immunologischer Effektorzellen in vivo beitragen. Generell war CD40L bei der
nicht-tumorigenen Zelllinie HPKIa ein potenterer Stimulus als TNF- für alle getesteten
Chemokine (MCP-1, RANTES, IL-8 und IP-10), während sich bei den Karzinomzellen ein
unterschiedliches Bild zeigte. Auch bei den in-vitro-immortalisierten K5I-Keratinozyten ließ
sich MCP-1 durch CD40L viel stärker als durch TNF- induzieren, obwohl diese Zellen kaum
84
CD40 exprimierten. Über einen Modellcharakter dieser Beobachtung lässt sich nur mutmaßen.
Aufgrund der guten Responsivität in-vitro-transformierter Zellen könnte man zum Beispiel
vermuten, dass gerade auch am Beginn einer Infektion mit humanen Papillomviren die CD40LCD40-Interaktion eine potente Wirkung bei der Bekämpfung befallener Zellen zeigt, wobei die
MCP-1-Induktion eine Hauptrolle spielen könnte. Auch korreliert die Höhe der CD40Expression nicht zwangsläufig positiv mit der Induzierbarkeit von MCP-1, denn diese war bei
alleiniger Stimulation des CD40-Rezeptors bei HPKIa und K5I am höchsten, nämlich ca.
9,6fach bzw. 6,0fach bei HPKIa und K5I, dagegen bei SiHa und SW756 jeweils nur ca. 3,5fach.
Die hohe CD40-Expression der malignen Zelllinien SiHa und SW756 schien mit einer
geringeren CD40-Empfindlichkeit einherzugehen. Eventuell könnte das auf eine nicht bekannte
Störung innerhalb der Signalübertragung auf „Postrezeptorebene“, die weder NF-B noch SP-1
betrifft, zurückzuführen sein. Erst in der Kombination mit IFN- induzierten CD40L als auch
TNF- bei SiHa und SW756 die hohe MCP-1-Sekretion im Nanogramm-Bereich.
Der IFN--Signalweg beginnt mit der Phosphorylierung von JAK1 und JAK2 und führt über
Phosphorylierung des STAT-1-Transkriptionsfaktors zur Aktivierung von GAS („gammaactivated site“) tragenden Genen wie dem humanen MCP-1-Gen oder IRF-1, dem „IFNregulatory factor-1“, der antionkogenes Potential besitzt (Zhou et al., 1998). Sowohl CD40L als
auch TNF- induzieren ebenfalls GAS-bindende Komplexe, die keinen der bekannten STATFaktoren, aber p50- und p65-Elemente der Rel/NF-B-Familie enthalten (Gupta et al., 1998).
IFN- kann in bestimmten Zelltypen Einfluss auf die TNF- induzierte NF-B-Aktivierung
nehmen und diese potenzieren (Sekine et al., 2000). Für die Zytokinmodulation könnte auch
eine gesteigerte JAK2- und STAT-1--Phosphorylierung infolge der simultanen Stimulation
mit TNF- und IFN- bedeutsam sein (Han, Rogers und Ransohoff, 1999). Eine Kooperation
dieser aber auch anderer, unbekannter Faktoren scheint für den hier beobachteten Synergismus
verantwortlich zu sein. Transkriptionsfaktoren mit wesentlicher Bedeutung für die Induktion
von IP-10 sind beispielsweise sowohl ein p48/STAT-1--Komplex sowie NF-B (Majumder et
al., 1998).
Die von einer bowenoiden Papulose abgeleitete Zelllinie SKv sezernierte nicht nur hochgradig
IL-6, sondern auch IL-8 und in geringerem Maße MCP-1. Die IL-6-Konzentration von SKv
befand sich schon basal im Nanogramm-Bereich und konnte durch IFN- beträchtlich gesteigert
werden (5,0fach). Auch die MCP-1-Produktion ließ sich infolge der IFN--Stimulation in den
Nanogramm-Bereich anheben (nicht dargestellt). SKv-Zellen, welche konstitutiv TNF-
85
sezernieren und sowohl lösliche TNF-Rezeptoren freisetzen als auch in Abhängigkeit von der
jeweiligen SKv-Subzelllinie z.T. eine Reduktion der Anzahl membranständiger TNFRezeptoren zeigen (Malejczyk et al., 1992, 1994 und 1996), ließen sich weder durch TNF-
oder den CD40-Liganden alleine zu einer deutlichen Induktion der Zytokine IL-6, MCP-1 oder
IL-8 anregen, noch wurde ein synergistischer Effekt von CD40L oder TNF- mit IFN-
beobachtet.
Zum Vergleich von CD40 Aktivitäten mit einem verwandten Rezeptor wurde die Interaktion
zwischen dem Fas-Antigen (CD95, Apo-1) und dem zugehörigen Liganden (FasL) untersucht.
Fas löst programmierten Zelltod in humanen Keratinozyten im Rahmen der T-Zell-mediierten
Immunantwort aus. Fas-mRNA kann in Keratinozyten durch Interferon- induziert werden
(Sung et al., 1997; Takahashi et al., 1995). Zudem aktiviert Fas NF-B und induziert IL-6 in
humanen Fibroblasten (Rensing-Ehl et al., 1995). Für eine Verminderung der Fas-Expression in
Zervixkarzinomen im Vergleich zum Normalgewebe sprechen die Befunde von Das et al.
(2000). In vitro wurde allerdings beobachtet, dass HeLa-Zellen in hohem Maße Fas exprimieren
(Yang et al., 1997), sich aber gegenüber einer durch Anti-Fas-Antikörper vermittelten Apoptose
relativ resistent verhalten (Xia, Voellmy und Spector, 2000). Im Rahmen dieser Versuche kam
es zur deutlich gesteigerten Zytokinfreisetzung von IL-8 und IL-6 sowie in geringerem Maße
von MCP-1 in den untersuchten Zervixkarzinomzellinien C4-I, SiHa und CaSki infolge der
Fas-Stimulation. Außerem induzierte Fas in erheblichem Maße Apoptose in den untersuchten
Zellinien.
Nachdem in dieser Arbeit gezeigt wurde, dass Zervixkarzinomzellen ein hohes CD40Expressionsniveau aufweisen und via CD40-CD40L-Interaktion zur Produktion von Zytokinen,
die den Krankheitsverlauf in vivo wesentlich beeinflussen könnten, angeregt werden können,
sollte nun die Wechselwirkung von CD40 mit HPV-Genen untersucht werden. Der Einfluss
von CD40 auf virale Genexpression wurde bislang nur wenig und noch nicht im Falle von HPV
untersucht. Im Verlauf der Karzinogenese bleiben nach Integration in die Wirtszell-DNA die
NCR und die E6/E7-Region im Allgemeinen intakt und die Entwicklung von der Dysplasie
zum Zervixkarzinom ist mit einer Zunahme des Expressionslevels der onkogenen viralen
Proteine assoziiert. Das unterschiedliche Potential zur onkogenen Transformation der einzelnen
HPV-Typen wird zunächst durch biochemische und biologische Charakteristika der E6- und
E7-Proteine bestimmt (Halbert, Demers und Galloway 1991, 1992; Münger et al. 1991).
86
Darüber hinaus können Sequenzunterschiede der jeweiligen „Non-Coding-Regions“ onkogener
HPV-Typen offensichtlich zu einer unterschiedlichen Aktivität des homologen viralen
Promotors in Keratinozyten führen. 1991 ist von Romanczuk und Mitarbeitern beschrieben
worden, dass in vitro die Immortalisierungskapazität der NCR/E6/E7-Region von HPV18
gegenüber derjenigen von HPV16 wesentlich effizienter ist und dass die hauptsächliche
Determinante hierfür in den unterschiedlichen Sequenzen innerhalb der „Non-Coding-Regions“
beider HPV-Typen besteht. In HeLa-Zellen war im Rahmen der vorliegenden Arbeit
beispielsweise die Enhancer-Promotor-Aktivität von HPV18, festgestellt mittels transienter
Transfektion des Vektors 4321-luc, um mehr als das 10fache höher als die Aktivität des
Vektors H16pA-luc, bei welchem sich das Luciferase-Gen unter Kontrolle der EnhancerPromotor-Sequenz von HPV16 befindet (nicht dargestellt). Verschiedene Autoren gingen
davon aus, dass in vivo gerade HPV18 gegenüber den anderen onkogenen HPV-Typen mit einer
rascheren Tumorprogression assoziiert ist (Arends et al., 1993; Lörincz et al., 1992; Walker et
al., 1989; Burger et al. 1996). In dieser Studie wurden HeLaCD40-Zellen mit 4321-luc transient
transfiziert und anschließend mit CD40L stimuliert. Eine 43stündige CD40L-Exposition führte
zur Reduktion der transkriptionellen Aktivität der HPV18-NCR um 56,0%. TNF- führte
ebenfalls zu einer Reduktion der Luciferase-Aktivität um ca. 64,9%. Von Kyo et al. (1994) ist
bereits für TNF- eine Repression der HPV16-NCR in in-vitro-immortalisierten Keratinozyten
um bis zu 48% mittels CAT-Essays ermittelt worden. Für ein drittes in dieser Arbeit zuvor
häufig verwendetes T-Zell-Zytokin, nämlich IFN-, ist zwar keine Herunterregulation der
Aktivität der HPV-NCR mittels CAT-Essays (Kyo et al., 1994), indessen aber eine Reduktion
der E6/E7-mRNA in Zervixkarzinomzellen beobachtet worden (Nawa et al., 1990; Agarwal et
al., 1994). Es ist nicht auszuschließen, dass bei der CD40L-vermittelten Repression der HPV18-NCR und somit der HPV-18-Onkogene pro-inflammatorische Zytokine von Bedeutung sind,
die, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, ebenfalls durch
CD40 induziert werden.
Beispielsweise wird MCP-1 zwar in nicht-tumorigenen HeLa-Fibroblasten-Hybridzellen, aber
nicht oder nur sehr gering in tumorigenen Zervixkarzinomzellen exprimiert (Rösl et al., 1994.;
Soto et al., 1999; Altenburg et al., 1999). Andererseits scheint die p53-Inaktivierung im
Zusammenhang mit der HPV-induzierten Karzinogenese die immunologische Tumorabwehr im
Falle von MCP-1 zu beeinflussen. Hacke et al. (2010) beschrieben die deutliche Abnahme der
MCP-1-Induzierbarkeit durch TNF-α in mit E6- und E6/E7- immortalisierten Keratinozyten in
Korrelation mit der Abnahme von p53, welches eine Bindestelle im MCP-1-Promotor besitzt.
Infolge der Transfektion mit den Onkoproteinen E6/E7 von HPV16 wurde nicht nur die
87
Expression von MCP-1, sondern auch diejenige von IL-8 in Keratinozyten herunterreguliert
(De Andrea et al., 2007).
Verschiedene HeLa-Subzelllinien wiesen im Rahmen eigener Arbeiten sehr unterschiedliche
Basalproduktionen des Chemokins MCP-1 auf. Im Falle von HeLaCD40-Zellen ließ sich
beispielsweise die MCP-1-Sekretion durch CD40L ganz erheblich um den Faktor 52,0 steigern
(in Nanogrammbereichen, nicht dargestellt). Auch Interleukin-6 und Interleukin-8 waren durch
CD40L deutlich um die Faktoren 3,9 bzw. 2,4 induzierbar. Obgleich sich aufgrund exogener
IL-6-Stimulation zumindest im Falle von Zervixkarzinomzelllinien von Bauknecht et al. (1999)
kein Einfluss auf die Aktivität der HPV18-NCR nachweisen ließ, könnten andere durch
CD40L, aber auch durch TNF- oder IFN- induzierte Zytokine wieder sekundär auf die
Expression der HPV-Onkogene in Zervixkarzinomzellen Einfluss nehmen. Wichtige Proteine,
die an die intrazelluläre CD40-Domäne binden und die Signaltransduktion vermitteln, sind
sogenannte TNFR-assoziierte Faktoren (TRAF1, 2, 3, 5 und 6) und die Janus Kinase 3 (Pullen
et al., 1999; Lee et al., 1999). Zumindest TRAF2, TRAF5 und TRAF6 führen über
Kinasekaskaden zur Aktivierung von NF-B, einem Transkriptionsfaktor, der an der Regulation
von Zytokinen wie IL-6, GM-CSF sowie diversen Chemokinen und an einer Vielzahl anderer
inflammatorischer Reaktionen beteiligt ist (Tsukamoto et al., 1999; May und Ghosh, 1997).
Auch TNF- und IFN- konnten in HeLaCD40-Zellen z.B. IL-6, MCP-1 und IL-8 signifikant
induzieren. Zuletzt bleibt die Frage offen, welche intrazellulären Faktoren an die HPV-NCR
binden und die Repression der HPV-Gene via CD40L und TNF- vermitteln. Hierfür könnte
beispielsweise der Transkriptionsfaktor NF-IL6 aufgrund seiner Induzierbarkeit durch TNF-
und seiner reprimierenden Eigenschaften, die nach Kyo et al. (1993) auf der kompetitiven
Verdrängung aktivierender Faktoren wie AP-1 oder NF-I vom viralen Enhancer beruhen, in
Frage kommen.
Hill et al. (2005) konnten zeigen, dass die CD40-Stimulation auf Zervixkarzinomzellinien zur
Heraufregulation von ICAM-1, CD80 und in geringerem Maße von MHC-Klasse-I-Molekülen
führt und dass die Vorstimulation mit CD40L und anschließende Transfektion mit einem
rekombinanten, die HPV16- und HPV18-E6/E7-Proteine exprimierenden Vakziniavirus bei
CaSki- und MS-751-Zellen zur Lyse durch CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten führt.
88
Für die mehrstufige Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs ist einerseits das transformierende
Potential und die Deregulation der Onkogene E6 und E7 der mit hohem Risiko verbundenen
HPV-Typen wie HPV 16 oder 18 von Bedeutung. Andererseits trägt die Fähigkeit der
Tumorzellen,
der
zellvermittelten
Immunabwehr
zu
entgehen,
maßgeblich
zur
Tumorprogression bei. CD40 wird auf Zervixkarzinomzellinien in vitro und Zervixkarzinomen
in vivo exprimiert (Altenburg et al., 1999) und scheint hinsichtlich der Onkogenrepression auf
Transkriptionsebene
sowohl
für
die
frühe
Phase,
im
Rahmen
der
zellulären
Abwehrmechanismen aber auch für die späten Phasen der Tumorprogression von Bedeutung zu
sein. Die CD40-Stimulation induziert in Synergismus mit Interferon-γ die Chemokine MCP-1,
MCP-3, RANTES, IP-10 und IL-8 in Zervixkarzinomzellinien und in der in vitro mit HPV16
transformierten Keratinozytenzellinie HPKIA. Diese Chemokine wurden in ihren antitumoralen
Eigenschaften durch Rekrutierung tumorinfiltrierender Effektorzellen charakterisiert (Wetzel et
al., 2001;
Lapteva und Huang, 2010; Hensbergen et al., 2005, Bauer et al., 2009). Das
pleiotrope
Zytokin
IL-6
ist
bei
sehr
hohem
basalen
Expressionsniveau
in
Zervixkarzinomzellinien durch CD40L in Synergismus mit Interferon-γ in geringerem Maße als
MCP-1 induzierbar. In den nicht-tumorigenen HPKIA-Zellen, die selbst praktisch kein IL-6
produzieren, wurde durch vorangehende Stimulation mit IL-6 die CD40-mediierte MCP-1Produktion erhöht. In der Arbeitsgruppe wurde später demonstriert, dass die autokrine
Stimulation durch IL-6 in Zervixkarzinomzellinien im Gegensatz zu nicht-tumorigenen
Zelllinien wie HPKIA durch die sehr geringe bis nicht detektierbare gp-80-Expression in
Zervixkarzinomzellen limitiert ist (Hess et al., 2000). GM-CSF konnte durch CD40L in dieser
Arbeit in drei Zervixkarzinomzellinien induziert werden. Dieses Zytokin scheint insbesondere
für die Entstehung Zervixkarzinom-assoziierter Makrophagen und Langerhanszellen von
Bedeutung zu sein (Zijlmans et al., 2007). In dieser Arbeit wurde zusammenfassend gezeigt,
dass die CD40-CD40L-Interaktion eine wesentliche Schnittstelle in der Tumorabwehr von
Zervixkarzinomen, sowohl mit Bedeutung für die Repression der viralen Onkogenrepression als
auch im Rahmen der über Zytokine vermittelten zellulären Immunabwehr darstellt.
89
VI. ZUSAMMENFASSUNG
Das 50kDa-Glykoprotein CD40 wurde in seiner Bedeutung vorrangig für antigenpräsentierende
Zellen, und hierunter insbesondere für B-Lymphozyten, charakterisiert. Auch eine verstärkte
CD40-Expression auf einigen maligne entarteten Zellen epithelialen oder mesenchymalen
Ursprungs ist bekannt. In nicht-hämatopoetischen Zellen kann CD40 Interleukin-6 induzieren
und führt zur Mobilisierung des Transkriptionsfaktors NF-B (Hess et al., 1995b). In dieser
Arbeit konnten neben dem Nachweis von CD40 auf HPV-positiven Keratinozytenzelllinien
wesentliche immunmodulatorische CD40 Funktionen aufgezeigt werden. CD40 wurde auf HPV
positiven Zervixkarzinomzellen, insbesondere auf SiHa, SW756 und CaSki, hochgradig
exprimiert, und zwar deutlich stärker als auf nicht-tumorigenen, in vitro mit HPV-Onkogenen
transformierten Keratinozytenzelllinien, wie HPKIa, K51, K64 und I56. HPV positive
Zervixkarzinomzelllinien produzierten im Gegensatz zu den in-vitro-immortalisierten Zellen
konstitutiv hohe Mengen an IL-6, während die Produktion des Monozyten und T-Lymphozyten
anziehenden Chemokins MCP-1 bei allen Zellen gering war.
Rösl et al. (1994) hatten keine Produktion des CC-Chemokins MCP-1 in HPV positiven
Zervixkarzinomzellen nachweisen können, wohingegen MCP-1 in vivo in Tumorzellen
entzündlich infiltrierter Zervixkarzinome exprimiert wird (Riethdorf et al., 1996). Um die
Ursache
dieser
Diskrepanz
zu
analysieren,
wurde
die
regulatorische
Rolle
des
Oberflächenrezeptors CD40 in dieser Arbeit weiter untersucht.
Die CD40-Stimulation führte in HPKIa-Zellen trotz niedriger Rezeptorexpression zur
deutlichen MCP-1-Produktion. In den Karzinomzelllinien SiHa und SW756 war MCP-1 trotz
des höheren CD40-Expressionsgrades geringer induzierbar. Eine Vorbehandlung mit
Interferon-, einem inflammatorischen, von T-Zellen sezernierten Zytokin, sensibilisierte
jedoch die gleichen Zellen außerordentlich stark für die CD40-mediierte Produktion von MCP1 und führte zu einer mehr als 25fachen MCP-1-Induktion. Ähnliche synergistische Effekte von
CD40L und IFN- wurden für die CC-Chemokine RANTES und MCP-3 beobachtet. Die
höchsten Werte wurden auf diese Weise für das Monozyten rekrutierende CXC-Chemokin IP10 erreicht. Derartige Chemokin-Induktionen waren nicht nur auf das durch IFN- erhöhte
CD40-Expressionsniveau der getesteten Zellen zurückzuführen. Die CD40-Induzierbarkeit von
IL-6, das ein sehr breites Aktivitätsspektrum besitzt und das sogar als Wachstumsfaktor für
Zervixkarzinomzellen angesehen wurde (Iglesias, Plowman und Woodworth, 1995), war
dagegen durch IFN- nur unwesentlich erhöht. Im Falle des vorwiegend neutrophile
Granulozyten anziehenden CXC-Chemokins IL-8 wurde eine eher von IFN- unabhängige
90
CD40-vermittelte Induktion bei sämtlichen getesteten Zelllinien beobachtet und CD40 konnte
bei einzelnen Zelllinien auch GM-CSF induzieren.
Schließlich war im Rahmen von transienten Transfektionsexperimenten ein Effekt auf HPVGene nachweisbar: In CD40 überexprimierenden HeLa-Zellen konnte eine Reduktion der
HPV18P105-Promotoraktivität aufgrund der CD40-Stimulation um mehr als 50 Prozent gezeigt
werden.
Die bei sämtlichen Versuchen, d.h. bei den Zytokinassays und Transfektionsexperimenten,
mitgeführte TNF--Stimulation führte oftmals zu gleichgerichteten Ergebnissen wie die CD40Stimulation.
91
VII. LITERATURVERZEICHNIS
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VIII. VORABVERÖFFENTLICHUNG VON ERGEBNISSEN
Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in Einvernehmen mit Herrn Prof. Dr. Dr. hc. H. Pfister,
Frau Prof. Dr. S. Smola und mit schriftlicher Erlaubnis des Dekans Prof. Dr. G. Krueger an
folgender Stelle vorabveröffentlicht:
Altenburg, A., S.E. Baldus, H. Smola, H. Pfister und S. Hess (1999). CD40 ligand-CD40
interaction induces chemokines in cervical carcinoma cells in synergism with IFN-. J.
Immunol. 162: 4140-7
117
IX. ANHANG
Tabelle 6:
Statistiche Signifikanz der Chemokin-Induktion durch BHKCD40L- im Vergleich
mit BHKwt-Zellen (Auswahl)
p-Werte (unabhängiger t-Test {KI = 95 })
Zelllinie
HPKI
SiHa
SW756
Vorstimulation
MCP-1
IL-6
MCP-3
RANTES
IL-8
IP-10
Ø IFN
<0,001
*
0,021
<0,001
<0,001
0,002
+ IFN
<0,001
*
<0,001
<0,001
<0,001
0,002
Ø IFN
<0,001
<0,001
0,980
0,050
0,002
0,001
+ IFN
<0,001
<0,001
0,025
<0,001
<0,001
0,001
Ø IFN
<0,001
<0,001
0,793
0,002
<0,001
**
+ IFN
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
<0,001
* nicht bestimmt,** nicht berechenbar
CD40-Expression auf CIN-Läsionen und Zervixkarzinomen in vivo
Die folgenden Experimente wurden von Herrn Dr. med. Stephan E. Baldus, Institut für
Pathologie der Universität zu Köln, durchgeführt. Zehn Gewebeproben, die sämtliche Stadien
zervikaler
intraepithelialer
Neoplasien
(CIN
I-III)
repräsentierten,
sowie
sechs
Zervixkarzinomproben wurden immunhistochemisch untersucht. Diese waren routinemäßig mit
fünfprozentigem Formalin fixiert und eingebettet in Paraffin. Nach der Deparaffinisierung
wurden die Objekte zur Verbesserung der Antigenerkennung einer Mikrowellenbehandlung (3 ·
5 Minuten, 750 Watt) in 0,1M Zitratpuffer unterzogen. Nachfolgend wurde die ImmunoMaxMethode nach Merz et al. (1995), eine Modifikation der CARD(„catalyzed reporter
deposition“)-Technik von Bobrow et al. (1989), angewandt. Der monoklonale CD40Antikörper G28-5 oder ein monoklonaler CD40L-Antikörper (PharMingen, Hamburg), gelöst
in zehnprozentigem Maus-Serum, wurden als Primär-Antikörper über Nacht aufgetragen (4°C).
Hierauf erfolgte die Inkubation mit einem biotinylierten Kaninchen-Maus-Antikörper (E354,
Dako, Carpinteria, CA), gefolgt von einem Peroxidase-gekoppelten Streptavidin-Biotin-
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Komplex (k355, Dako) für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur. 6,4mg Tyramin (Sigma),
gelöst in 10ml 0,1M Borat-Puffer (pH-Wert 8,0), wurden zunächst 72-stündig bei 4°C mit
20mg N-Hydroxysuccinimido-Sulfo-LC-Biotin (Pierce, Seattle, WA), gelöst in 0,5ml DMSO,
vorinkubiert, danach auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und bei –80°C weggefroren.
Nachdem diese Lösung in einem Verhältnis von 1:50 mit TBS/0,05% H2O2 verdünnt worden
war, wurde sie 10-minütig auf die Proben appliziert (bei RT). Schließlich wurde ein StreptABAlkalische-Phosphatase-Komplex (K391, Dako) über 30 Minuten aufpipettiert (bei RT). Nach
allen Schritten erfolgte ein dreimaliges Waschen mit TBS. Als Farbsubstrate dienten NaphtolAS-Biphosphat und Neu-Fuchsin. Nuclei wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Subpopulationen inflammatorischer Immunzellen, d.h. T-Lymphozyten und myeloische
Monozyten, welche in allen Proben vorhanden waren, wurden mit Hilfe immunhistochemischer
Routinemethoden (ABC alkalische Phophatase) identifiziert. Hierbei kamen monoklonale
Antikörper gegen CD8 (DK25, Dako), CD15 (LeuM1, Becton Dickinson) und CD68 (PG-M1,
Dako) zum Einsatz. Im Falle des monoklonalen Antikörpers gegen CD45R0 (OPD4, Dako),
durch welchen Helfer-T-Zellen nachgewiesen werden, wurde die ImmunoMax-Technik
verwendet.
Normales Zervixepithel wies CD40 lediglich in vereinzelten Zellen des Stratum basale auf.
CIN-Läsionen zeigten das gleiche Reaktionsmuster, unabhängig vom Grad der Dysplasie. Auch
hier blieb die CD40-Expression auf die nun ausgedehntere Basalzellschicht beschränkt.
Andererseits zeigten
Plattenepithelkarzinome eine sehr ausgeprägte Expression des
Oberflächenrezeptors. Hier konnte eine intensive Membran-assoziierte Reaktivität, begleitet
von einer etwas schwächeren zytoplasmatischen Antigen-Verteilung beobachtet werden.
Schließlich verhielt sich angrenzendes intraepitheliales Dysplasiegewebe wie zuvor für CINLäsionen beschrieben. Fünf der sechs Zervixkarzinome wiesen eine mäßige bis starke
entzündliche Reaktion und der sechste Tumor eine deutliche
Entzündungsreaktion auf.
Innerhalb des Infiltrats wurden zahlreiche Makrophagen mit Hilfe des monoklonalen PG-M1Antikörpers, der an ein Makrophagen-spezifisches Epitop von CD68 bindet, nachgewiesen
(Abbildung 16d). Die Infiltrate der Zervixkarzinome enthielten zudem Granulozyten und
Monozyten, sichtbar gemacht mittels Anfärbung des CD15-Antigens. Auch CD45R0 und CD8
positive Lymphozyten waren in den das Tumorwachstum umgebenden Infiltraten vorhanden
(nicht dargestellt). Der CD40-Ligand wurde auf einer Subpopulation Tumor-infiltrierender
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Lymphozyten sichtbar gemacht (Abbildung 16e), wodurch in vivo die Voraussetzung für einen
parakrinen Stimulationsmechanismus über die CD40L-CD40-Interaktion erfüllt war.
Abbildung 16:
Expression von CD40 und CD40L auf normalem und neoplastischen Zervixepithel
CD40 wurde mit dem monoklonalen CD40-Antikörper G28-5 auf normalem Zervixepithel (a),
CIN III (B) und zervikalem Plattenepithelkarzinom (c) unter Anwendung der ImmunoMaxTechnik nachgewiesen. Die Anfärbung von Makrophagen (d) erfolgte mittels des monoklonalen
Antikörpers PG-M1 gegen CD68 und die des CD40-Liganden (e) mittels monoklonalen
Antikörpers gegen CD40L im Infiltrat eines Zervixkarzinoms.*
*Mit freundlicher Genehmigung von Herrn Prof. Dr. S. E. Baldus, Institut für Pathologie,
Universität Düsseldorf
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X. LEBENSLAUF
Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner
Arbeit nicht vewröffentlicht.
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