Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und

Aus der
Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem
An-Institut der Medizinischen Hochschule Hannover
IPF PharmaCeuticals GmbH
Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im
Tiermodell der ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als
Osteoporose-Modell
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Susanne Stephan
aus Freiburg im Breisgau
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Michael Fehr
Prof. Dr. Dr. Wolf-Georg Forssmann
1. Gutachter:
Prof. Dr. Michael Fehr
2. Gutachter:
Prof. Dr. Hans-Otto Hoppen
Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juni 2004
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung und Zielsetzung
09
2. Literaturübersicht
11
2.1
Allgemeine Grundlagen des Knochengewebes
11
2.1.1
Knochenaufbau
11
2.1.2
Osteozyten
13
2.1.3
Osteoklasten
15
2.1.4
Osteoblasten
16
2.2
Knochenstoffwechsel
17
2.3
Magen und Knochenstoffwechsel
19
2.4
Tiermodelle
21
2.4.1
Die ovarektomierte Ratte
21
2.4.2
Die gastrektomierte Ratte
24
2.5
Substanzen mit osteoanaboler Wirkung
26
2.5.1
Parathyrin (Parathormon, PTH)
26
2.5.2
Östrogen (17-β-Östradiol, E2)
27
B
B
3. Material und Methoden
29
3.1
Präparation und Peptidextraktion aus Schweinemagen
29
3.1.2
Ultrafiltration
30
3.2
Humanes Hämofiltrat
30
3.3
Chromatographische Methoden
31
3.3.1
Kationenaustausch Chromatographie
31
3.3.2
Umkehrphasenchromatographie
32
3.3.3
Aufreinigung
einer
osteoanabolen
Aktivität
aus
dem
Ultrafiltrat
der
Schweinemagenfundusmukosa
32
3.3.4
Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat
33
3.4
Zellkultur
34
3.4.1
Knochenmarkstammzellgewinnung
34
3.4.2
Kultivierung der Knochenmarkstammzellen (BMSC)
34
Proben und Kontrollen
35
U
3.4.3
U
Kultivierung von ROS-17/2.8 Zellen
35
Proben und Kontrollen
37
U
U
3.4.4
Zellvitalität (WST-1)
37
3.4.5
Alkalische Phosphatase von Osteoblasten
37
3.4.6
Hemmung von Aktivitäten mit dem Rezeptorantagonisten Mifepriston
38
3.4.7
Dosisabhängigkeit von Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon auf
B
B
ROS-17/2.8 Zellen
38
3.5
Hydrolyse von Peptiden mit Proteasen (Subtilisin)
39
3.6
Tiermodell der ovarektomierten Ratte
39
3.6.1
Tiermaterial
39
3.6.2
Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere
40
3.6.3
Injektionsmethoden
40
Technik der subkutanen Injektion
U
40
U
Technik der intraperitonealen Injektion
41
3.6.4
Technik der retrobulbären Blutentnahme
41
3.7
Beschreibung der Versuchsdurchführung
42
3.7.1
Gruppeneinteilung
42
3.7.2
Tägliche subkutane Injektion
42
3.7.3
Gewichtsbestimmung
43
3.7.4
Blutentnahme
43
3.7.5
Radiologische Untersuchung der Ratten
43
3.7.6
Intraperitoneale Tetrazyklin- und Kalzein-Injektion
44
3.7.7
Präparation der Knochen
46
Materialentnahme
46
U
U
U
U
Feinpräparation
46
3.7.8
Radiologische Beurteilung der Ossa femori
46
3.7.9
Dichtebestimmung der Ossa femori nach dem Prinzip der Mohr-Waage
47
3.7.10
Transillumination der Calvariae
47
3.7.11
Anfertigung von Dünnschliffen
47
Femurdünnschliffe
48
U
U
U
U
Calvariendünnschliffe
48
Fluoreszensmikroskopie
48
U
3.7.12
U
3.7.13
Messung des Calvariendurchmessers
49
3.7.14
Methoden zur Bestimmung von Serumparametern
49
Gesamtkalziumbestimmung I
49
U
U
Gesamtkalziumbestimmung II
U
50
U
Quantifizierung von Osteokalzin
51
3.8
Tiermodell der gastrektomierten Ratte
51
3.8.1
Tiermaterial
51
3.8.2
Operationsmethode
52
3.8.3
Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere
53
3.8.4
Beschreibung der Versuchsdurchführung
54
3.8.5
Präparation der Knochen
54
3.8.6
Radiologische Untersuchung der Ossa femori und Calvariae
55
3.8.7
Dichtebestimmung nach dem Prinzip der Mohr-Waage
55
3.8.8
Transillumination der fixierten Calvariae
55
3.8.9
Anfertigung von Dünnschliffen der Calvariae
55
3.8.10
Durchmesser der Calvariae
56
3.8.11
Bestimmung von Serumparametern
56
Gesamtkalziumbestimmung
56
U
U
U
3.9
U
Statistische Auswertung
56
4. Ergebnisse
4.1
Identifizierung
59
und
Aufreinigung
osteoanaboler
Aktivitäten
aus
Schweinemagenschleimhaut
4.2
59
Identifizierung und Aufreinigung osteoanaboler Aktivitäten aus humanem
Hämofiltrat
60
4.3
Enzymatische Subtilisinhydrolyse
62
4.4
Hemmung der Aktivitäten mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston
64
4.5
Dosisabhängigkeit von Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon auf
B
B
ROS-17/2.8 Zellen
66
4.6
Auswertung der Ovarektomie-Studie
66
4.6.1
Verlauf der Körpergewichte während der Studie
67
4.6.2
Beschreibung der radiologischen Untersuchung
68
Radiologische Untersuchung der Ratten am 23. Tag der Studie
U
U
68
Radiologische Beurteilung der präparierten Femura
68
4.6.3
Betrachtung der Femurdichte
70
4.6.4
Transillumination der Calvariae
71
4.6.5
Fluoreszenzmikroskopie der Femurdünnschliffe
71
4.6.6
Messung des Calvariendurchmessers
72
4.6.7
Auswertung der Serumparameter
73
U
U
Bestimmung des Gesamtkalziumgehaltes in Rattenserum
U
73
U
Gesamtkalziumwerte an Tag 49 mit der Kalzium II-Methode
75
Bestimmung von Osteokalzin
77
U
U
U
U
4.7
Ergebnisse der Gastrektomie-Studie
79
4.7.1
Gewichtsverlauf und Futteraufnahme
80
4.7.2
Radiologische Untersuchung der präparierten und fixierten Ossa femori und
Calvariae
82
4.7.3
Dichtebestimmung der Femura nach Gastrektomie
84
4.7.4
Transillumination der Calvariae
85
4.7.5
Durchmesser der Calvariae
87
4.7.6
Gesamtkalziumbestimmung
87
5. Diskussion
89
6. Zusammenfassung
105
7. Summary
107
8. Literaturverzeichnis
109
9. Anhang
130
9.1
Abbildungsverzeichnis
130
9.2
Tabellenverzeichnis
134
Abkürzungsverzeichnis
1,25-(OH)2D3
B
B
B
B
1,25-Dihydroxycholekalziferol (Vitamin D3)
B
a.-p.
anterio-posterior
Abb
Abbildung
ACN
Acetonitril
AP
alkalische Phosphatase
BLC
„bone lining cells“
BMSC
„bone marrow stem cells”
BMP
„bone morphogenetic proteins“
Dexa
Dexamethason
E
Extinktion
E2
B
B
B
Östradiol-17-beta
ECL-Zellen
„enterochromaffin-like cells“
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
„enzyme-linked immunosorbant assay“
ESI
„electrospray ionization“
ETOH
Ethanol
Fa
Firma
FSD
„functional secretory domain“
Fr
Fraktion
GLS
Gebrauchslösung
GX
Gastrektomie
HCL
Salzsäure
HF
Hämofiltrat
HFäq
Hämofiltratäquivalent
HPLC
„high-performance-liquid-chromatography”
hPTH
humanes Parathyrin (Parathormon)
IATA
„international air transport association“
IEC
„ion-exchange-chromatography”
IGF
„insulin-like growth factor“
IL
Interleukin
IPF
Institut für Peptid-Forschung
KM
Körpermasse
Mäq
Magenäquivalent
M-CSF
„macrophage colony stimulating factor“
MEM
„minimum essential medium”
MgCl2
B
Magnesiumchlorid
B
MMP
Matrix-Metallo-Proteinase
MS
Massenspektrometrie
Na2HPO4
B
B
Dinatriumhydrogenphosphat
B
B
NaCl
Natriumchlorid
NaH2PO4
B
B
B
B
Natriumdihydrogenphosphat
NMR-Spektroskopie
„nuclear magnetic resonance spectroscopy”
OB
Osteoblast
OD
optische Dichte
OK
Osteoklast
OPG
Osteoprotegerin
OVX
Ovarektomie
OZ
Osteozyt
PNPP
Paranitrophenylphosphat
RANK
„receptor activator of nuclear factor kappa B“
RANKL
„receptor activator of nuclear factor kappa B ligand“
RB
„ruffled border“
RL
Resorptionslakune
ROS-Zellen
Rattenosteosarkoma Zellen
RPC
„reversed-phase-chromatography“
RPMI Medium
„roswell park memorial institute medium“
STD
Standard
STH
somatotropes Hormon
SZ
„sealing zone“
TGF-β
„transforming growth factor beta“
VE-Wasser
vollentsalztes Wasser
WST-1
Tetrazolium Salt (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate)
1. Einleitung und Zielsetzung
Beim Menschen nimmt während des Wachstums die Knochenmasse zu und erreicht ihr Maximum im
Alter von ca. 25 Jahren, um dann ab Ende 30 wieder abzunehmen (RODAN et al., 2002). Frauen
erfahren eine beschleunigte Abnahme der Knochenmasse 5-10 Jahre nach der Menopause, gefolgt von
einem langsamen Knochensubstanzverlust (MELTON 1995; RIGGS u. MELTON 1986; STEPAN et al.,
1987). Diese späte Phase wird auch bei Männern ab dem Alter von 40 Jahren beobachtet. Die
Abnahme der Knochenmasse mit zunehmendem Alter kann zum Krankheitsbild der Typ-I-Osteoporose
(postmenopausale Osteoporose = high-turnover Osteoporose) (RIGGS et al., 2003) führen. Die
Typ-I-Osteoporose ist nicht nur gekennzeichnet durch eine Abnahme der Knochenmasse sondern durch
einen Wandel in der Mikroarchitektur des Knochens, welcher die Zerbrechlichkeit und das Risiko von
Frakturen erhöht (ÅKESSON 2003). Der Knochenmasseverlust beruht auf einem Ungleichgewicht
zwischen Knochenresorption und -aufbau (RODAN et al., 2002). Osteoporose assoziierte Frakturen
entstehen vorwiegend an Hüfte, Wirbel, Oberschenkelhals (JAP et al., 2001) und können schon durch
geringe Traumata verursacht werden (ÅKESSON 2003).
In den letzten 20 Jahren sind viele Medikamente zur Behandlung der Osteoporose auf dem
Arzneimittelmarkt erschienen. Zu den wichtigsten gehören die Östrogene (E2), die direkt antiresorptiven
B
B
Substanzen, zu denen die Bisphosphonate und die selektiven Östrogenrezeptor-Modulatoren gehören,
sowie
Parathyrin
(Parathormon = PTH).
Diese
Stoffgruppen
reduzieren
effektiv
den
Knochensubstanzverlust und senken das Frakturrisiko (ÅKESSON 2003). Sie haben aber auch
unerwünschte Nebenwirkungen, z. B. ein erhöhtes Brustkrebs- oder Gebärmutterkrebsrisiko bei der
Behandlung mit E2 (ROSSOUW et al., 2002). PTH verursacht einen sehr hohen Kostenaufwand bei der
B
B
Therapie (ÅKESSON 2003), und bei täglicher oraler Einnahme von bestimmten Bisphosphonaten
können gastrointestinale Erosionen entstehen (SCHNITZER et al., 2000; BROWN et al., 2002). Es ist
deshalb nach wie vor von großem Interesse, neue Substanzen mit osteoanabolen Eigenschaften zu
isolieren und zu charakterisieren, um sie als mögliche Medikamente weiter zu entwickeln.
Daß der Magen eine wichtige Rolle im Kalziumhaushalt spielt, die unabhängig von Kalzitonin ist, wurde
zuerst von SCHULAK und KAPLAN (1974, 1975) beschrieben. Weitere Versuche von PERSSON et al.
(1989, 1991) und HÅKANSON et al. (1990a) an Ratten und Hühnern bestärkten die Annahme, daß der
säureproduzierende Teil des Magens Bildungsort eines unbekannten Peptides ist, welches als
Gastrokalzin bezeichnet wird. Dieses noch nicht näher charakterisierte Peptidhormon verursacht nach
9
Freisetzung durch den Transport von zirkulierendem Kalzium in den Knochen eine mögliche
Stabilisierung desselben, aber auch eine temporäre Hypokalzämie.
Um Medikamente oder noch präklinisch zu entwickelnde Substanzen auf ihre osteoanabole
Wirksamkeit in vivo zu testen, ist das Tiermodell der ovarektomierten Ratte geeignet, da es ein gutes
Abbild der postmenopausalen Osteoporose beim Menschen darstellt (WRONSKI et al., 1985; YAMAZKI
u. YAMAGUCHI 1989; KALU 1991; THOMPSON et al., 1995). Für diese Arbeit ergaben sich vor dem
Hintergrund der Annahme, daß ein unbekanntes Peptid aus der Magenschleimhaut osteoanabole
Wirkung haben soll, folgende Fragen:
1.
Läßt sich das postulierte Peptidhormon Gastrokalzin in aufgereinigtem Extrakt aus
Schweinemagen, mit Hilfe eines in vitro Testes nachweisen?
2.
Gibt es eine zirkulierende Form des Gastrokalzins in humanem Hämofiltrat?
3. Wenn ja, welche Wirkung haben diese beiden Substanzen auf den Knochenstoffwechsel in dem
Tiermodell der ovarektomierten Ratte?
Die Gastrektomie (GX) einer Ratte führt zur Osteopenie (KLINGE et al., 1995; RÜMENAPF et al., 1997;
LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜLBAUER et al., 1998; GEPP et al., 2000; STENSTRÖM et al., 2000;
SURVE et al., 2001a,b). LEHTO-AXTELIUS et al. (1998) folgern, daß dieses etablierte Tiermodell den
pathologischen Zustand der Gastrektomie-induzierten-Osteoporose beim Menschen widerspiegelt.
Diese Osteopenie unterscheidet sich in einigen Punkten von der durch eine Ovarektomie induzierten
(siehe Abschnitt 2.4.2), weshalb von einem unterschiedlichen Entstehungsmechanismus ausgegangen
wird (SURVE et al., 2001a, b). Für die vorliegende Arbeit stellten sich folgende Fragen:
1. Lassen sich die von KLINGE et al., RÜMENAPF et al., LEHTO-AXTELIUS et al., MÜHLBAUER
et al. und SURVE et al. gezeigten Effekte bei jungen und adulten Tieren reproduzieren ?
2. Ist das Gastrektomie-Modell als Osteoporose-Modell geeignet?
Es wurde ein Gastrektomie-Modell mit verschiedenen Altersgruppen durchgeführt, bei dem die Tiere
keine Testsubstanzen injiziert bekommen haben. Im Vordergrund stand daher nicht die Testung des
Wirkungspotentials von Substanzen, sondern Entstehungsort und Ausprägungsgrad der Osteopenie bei
diesen Tieren.
10
2. Literaturübersicht
2.1 Allgemeine Grundlagen des Knochengewebes
2.1.1 Knochenaufbau
Im engeren Sinn kommen dem Knochengewebe (Textus osseus) zwei Aufgaben zu. Es ist
mechanisches Stütz- und metabolisches Stoffwechselorgan (LIEBICH 1993). Histologisch kann man
zwei Arten von Knochengewebe unterscheiden. Den Geflecht- oder Faserknochen (Os membranaceum
reticulofibrosum) und den Lamellenknochen (Os membranaceum lamellosum). Der Geflecht- oder
Faserknochen bildet eine Vorstufe des Lamellenknochens (NICKEL et al., 1992; LIEBICH 1993;
BUCKWALTER et al., 1996). Er bleibt zeitlebens nur im knöchernen Labyrinth des Ohrs, im äußeren
Gehörgang und an den Ansatzstellen größerer Sehnen erhalten (LIEBICH 1993). Weiter unterscheidet
man bestimmte Knochenformen. Die Röhrenknochen (Ossa longa), zu ihnen gehört der
Oberschenkelknochen (Os femoris, Femur) und das Schienbein (Os tibia, Tibia). Kurze Knochen (Ossa
brevia), zu ihnen gehören die Wirbel (Ossa vertebrae) und platte Knochen (Ossa plana), zu ihnen
gehören zahlreiche Kopfknochen z. B. das Schädeldach (Calvaria) (NICKEL et al., 1992;
BUCKWALTER et al., 1996).
Im Knochengewebe sind vier verschiedene Zelltypen zu unterscheiden. Osteozyten (OZ), Osteoklasten
(OK), Osteoblasten (OB) und Bone Lining Cells (BLC) (BUCKWALTER et al., 1996; SANDY u.
ODGREN 2002). Über die Funktion der BLC ist bisher nicht viel bekannt. Sie sind inaktiv. Sandy und
Odgren (2002) spekulieren, daß es sich um Vorläuferzellen der OB handeln könnte. Auf die Funktion
der anderen Zelltypen des Knochens wird in den nachfolgenden Abschnitten eingegangen. OZ und OB
produzieren und mineralisieren die Knochenmatrix (SANDY u. ODGREN 2002), welche zu ca. einem
Drittel aus organischen Komponenten und zu ca. zwei Dritteln aus anorganischem Material besteht
(NICKEL et al., 1992). Der organische Anteil setzt sich zu 95% aus Kollagenfasern Typ I zusammen.
Die restlichen 5% verteilen sich auf Proteoglykane und kollagenfreie Peptide (SANDY u. ODGREN
2002). Der anorganische Anteil besteht zu 85% aus Kalziumphosphat, welches als Hydroxylapatit
gebunden ist und 10% bestehen aus Kalziumkarbonat. Der Rest verteilt sich auf Magnesiumphosphat
und Kalziumfluorid (NICKEL et al., 1992).
Knochen werden von einer Knochenhaut (Beinhaut, Periosteum) umhüllt. Sie besteht aus zwei Teilen.
Der äußeren derbfibrösen Schicht (Stratum fibrosum) und einer tiefen, lockeren, zellreichen Schicht
11
(Stratum cambium). Das Kambium ist reich an Nervenfasern und Blutgefäßen. Quer zur Längsachse
des Knochens zweigen von den Blutgefäßen des Kambiums sogenannte Volkmann-Kanäle ab, die in
die Havers-Gefäße münden. Die Fibrosa des Periostes ist über Sharpey-Fasern mit dem
Knochenmantel verbunden. Konzentrisch geschichtete Knochenblättchen umgeben als äußere
Generallamellen den gesamten Umfang des Knochens. Innere Generallamellen kleiden die Markhöhle
(Cavum medullare) aus. Dazwischen sind die Osteone (Havers-Systeme) zu finden. Sie bilden die
strukturelle Grundlage des Knochens. Jedes Osteon hat einen Zentralkanal (Havers-Kanal), der
mesenchymales Bindegewebe, ein Blutgefäß (Havers-Gefäß) und Nerven enthält. Um den HaversKanal befinden sich konzentrisch angeordnete Knochenlamellen (Havers-Lamellen, Speziallamellen).
Die Speziallamellen bestehen aus kollagenen Fasern und aus Knochenmatrix, in ihnen sind die
Osteozyten in kleinen Knochenhölen liegend eingebettet. Die Kollagenfasern sind spiralförmig,
gegensinnig angeordnet und verleihen dem gesamten Knochen einen hohen Grad an Elastizität,
Druck- und Zugfestigkeit. Im Inneren des Knochens befindet sich die Markhöhle (Cavum medullare),
welche das Knochenmark (Medulla ossium rubra) beherbergt. Das Mittelstück von Röhrenknochen
(Schaft, Diaphyse) besteht aus einem starken Knochenmantel (Substantia compacta). Die
Knochenenden (Epiphysis proximalis und distalis) bestehen aus einer dünneren Knochenrinde
(Substantia corticalis) mit der darunter liegenden Schwammsubstanz (Substantia spongiosa). Die
Spongiosa kann aus Röhrchen, Blättchen oder Bälkchen bestehen (Spongiosa tubulosa, lamellosa,
trabekulosa). Die kleinen Hohlräume der Spongiosa bilden den sekundären Markraum (Cellulae
medullares), dieser steht mit der großen Markhöhle in Verbindung (NICKEL et al., 1992; LIEBICH 1993;
BUCKWALTER et al., 1996).
12
Abb. 1: Schematische Darstellung eines Ausschnittes aus der Substantia compacta der Diaphyse eines
Röhrenknochens (nach LIEBICH 1993).
2.1.2 Osteozyten
Der OZ ist der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Knochengewebe (PARFITT 1977). Er ist in der
mineralisierten Knochenmatrix lokalisiert und hat sternförmige Gestalt. Der Zellkörper liegt in einer
Knochenlakune. Von ihm strahlen Zytoplasmaausläufer in Knochenkanälchen (Canaliculi ossei) in alle
Richtungen (LIEBICH 1993). Sie gewährleisten den Stofftransport sowie den -austausch und dienen der
Kommunikation sowohl zwischen den OZ selbst als auch zwischen OZ und dem Knochenmark
(KAMIOKA et al., 2001). Das so aufgebaute Osteozytennetzwerk ist an 2 Systeme gekoppelt, ein
intra- und ein extrazelluläres (NIJWEIDE et al., 2002).
Der OZ entwickelt sich aus mesenchymalen Stammzellen über Osteoprogenitorzellen aus OB. Der
Differenzierungsmechanismus ist unklar (AUBIN et al., 1995). MAROTTI (1996) spekulierte, daß OZ
über ein inhibitorisches Signal OB in direkter Nachbarschaft dazu bringen, ihre osteoblastäre Funktion
einzustellen und zu OZ zu differenzieren. IMAI et al. (1998) stellen fest, daß der OZ über einen
13
Osteoblast Stimulating Factor-1 (OSF-1 auch heparin-binding, growth-associated molecule = HB-GAM)
seine Differenzierung steuert. Die Lebensspanne eines Osteozyten ist bestimmt durch den KnochenTurnover. Wird ein OZ durch Resorption freigelegt, unterliegt er der Apoptose (NOBLE et al., 1997).
Auch eine Mangelversorgung an Nährstoffen (BURGER u. KLEIN-NULEND 1999; VERBORGT et al.,
2000), E2-Verlust (TOMKINSON et al., 1998) oder eine chronische Glukokortikoidbehandlung
B
B
(WEINSTEIN et al., 1998) kann zur Osteozytenapoptosis führen.
OZ tragen nicht den Hauptanteil der Knochenmatrixsynthese, da sie nur wenige Organellen besitzen,
die für die Matrixproduktion und -sekretion notwendig sind (NIJWEIDE et al., 2002). MIKUNI-TAKAGAKI
et al. (1995) mutmaßen, daß OZ an der Reifung und Mineralisierung der Matrix, sowie am Umbau von
Matrixmolekülen Anteil nehmen, um eine Mineralisierung in ihrer direkten Umgebung zu verhindern. Sie
produzieren unter anderem Osteokalzin und Osteonektin, welche ebenfalls den Grad der Kalzifizierung
und den Aufbau der Knochenmatrix beeinflussen (AARDEN et al., 1996). Auf ihrer Oberfläche können
OZ PTH- (VAN DER PLAS et al., 1994) und intrazellulär Vitamin D3-Rezeptoren (BOIVIN et al., 1987)
B
B
exprimieren. PTH beeinflußt vor allem die Informationsübertragung zwischen den OZ durch Regulierung
des Konnexin-43-Gens und der Gap-Junctions (SCHILLER et al., 1992; DONAHUE et al., 1995). Dem
Vitamin D3 wird eine ähnliche Funktion zugeschrieben (NIJWEIDE et al., 2002). Weiter können sie E2-,
B
B
B
B
(BRAIDMAN et al., 1995) Androgen-, und Glukokortikoid-Rezeptoren (ABU et al., 1997, 2000)
exprimieren.
Osteozyten werden in jüngster Zeit eine wichtige Rolle als streßempfindliche Mechanosensoren in der
Steuerung und Regulierung des Knochenstoffwechsels zugeschrieben (FORWOOD et al., 1998; TERAI
et al., 1999; HUISKES et al., 2000; SMIT u. BURGER 2000). Streßauslöser ist die Menge an
Flüssigkeit, welche extra- und intrazellulär durch den Knochen fließt. Der Druck des Durchflusses
reguliert die Stärke des Knochens (COWIN et al., 1991), indem eine Erhöhung dieses Druckes zu
einem Knochenauf- und eine Verringerung zu einem Knochenabbau führt (BURGER u. KLEIN-NULEND
1999). Der Durchfluß führt gleichzeitig zur Änderung von Ionenkonzentrationen und damit zu
Potentialänderungen (POLLACK et al., 1984; SALZSTEIN u. POLLACK 1987) an der Zellmembran.
Ionenfluß und Zellberührung (hier durch den Flüssigkeitsdurchfluß) sind starke Modulatoren des
Zellverhaltens (INGBER 1991). OZ sind wichtige Zellen bei der biomechanischen Regulation der
Knochenmasse und -struktur (COWIN et al., 1991; MULLENDER u. HUISKES 1997).
14
2.1.3 Osteoklasten
OK sind multinukleäre Riesenzellen die aus hämatopoetischen Stammzellen hervorgehen (SUDA et al.,
1992, 1999). Eine promyeloische Vorläuferzelle kann sich in OK, Makrophagen oder dendritische Zellen
differenzieren, in Abhängigkeit von vorhandenen stimulierenden Faktoren. Für die Differenzierung in
eine Osteoklastenvorläuferzelle, weiter in einen einzelligen OK, der dann mit anderen fusioniert und
aktiviert wird, sind bestimmte Stimulanzien notwendig. Dazu gehört der Macrophage-Colony Stimulating
Factor (M-CSF), der Rezeptoraktivator des NF-κB Liganden (RANKL auch tumor necrosis factor-related
activation-induced cytokine (TRANCE), Osteoprotegerin Ligand (OPGL) oder Osteoclast Differentiation
Factor (ODF) genannt) und Interleukin-1 (IL-1) (YASUDA et al., 1998; KONG et al., 1999; SUDA et al.,
1999; UDAGAWA et al., 1999). OB produzieren den membrangebundenen oder gelösten
Osteoklastenaktivator RANKL (LANCEY et al., 1998), der mit dem entsprechenden Rezeptor RANK der
OK kommuniziert (YASUDA et al., 1998; TAKAHASHI et al., 2002). SIMONET et al. (1997) postulierte,
daß OB einen osteoklasteninhibierenden Faktor produzieren, der Osteoprotegerin (OPG) genannt wird.
Seine hemmende Wirkung besteht in der Verhinderung der RANK-RANKL Bindung, indem OPG selbst
an RANKL bindet (HSU et al., 1999). Dadurch kontrollieren OB die Differenzierung von OK (siehe
Abschnitt 2.1.4).
Die wichtigste und einzige Aufgabe von OK ist es, Knochen zu resorbieren. Dies ist notwendig während
des Wachstums, des ständig stattfindenden Umbaus und zur Regulierung der Kalziumhomöostase
(VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002). JONES und BOYDE (1976) sagen aus, daß OK die zu resorbierende
Stelle durch Retraktion der BLC und Entfernung des Osteoids über membrangebundene
Matrix-Metallo-Proteinasen (MMPs) der OB (SAKAMOTO u. SAKAMOTO 1982; CHAMBERS et al.,
1985) erkennen. Während eines Resorptionszyklus legt sich der aktivierte OK auf die zu resorbierende
Knochenmatrix, verändert seine Polarität und bildet dadurch verschiedene Membranstrukturen, die für
den Resorptionsprozeß wichtig sind (LAKKAKORPI u. VÄÄNÄNEN 1996; VÄÄNÄNEN et al., 2000). Mit
Hilfe von extrazellulären Integrin-Matrix-Rezeptoren heftet sich der OK an die Resorptionsfläche
(NESBITT et al., 1993). Zu den gebildeten Membranstrukturen gehört die Functional Secretory Domain
(FSD), die sich im Zentrum der Basalmembran auf dem OK befindet (SALO et al., 1996). Der Kontakt
zur Resorptionsfläche wird über die sogenannte Ruffled Border (RB) hergestellt, welche das
„Resorptionsorgan“ des OK bildet (PALOKANGAS et al., 1997). Die RB enthält im äußeren Bereich
Protonenpumpen, die für ein saures Milieu im Resorptionsbereich sorgen. Im Zentrum finden Endo- und
Exozytose statt. Die Sealing Zone (SZ) trennt die RB von der Basalmembran (VÄÄNÄNEN u. ZHAO
2002) und hat gleichzeitig kontrollierende Funktion über die Diffusion von Substanzen aus der
15
entstandenen Resorptionslakune (RL) (STENBECK u. HORTON 2000). Durch das saure Milieu in der
entstehenden RL werden die Hydroxylapatitkristalle aus dem Knochengewebe herausgelöst
(VÄÄNÄNEN et al., 1990). Im Anschluß wird mit Hilfe von Kathepsin-K (INAOKA et al., 1995; DRAKE et
al., 1996) und MMP-9 (TEZUKA et al., 1994; OKADA 1995) das Osteoid enzymatisch abgebaut. Die
Abbauprodukte werden vom OK endozytiert, in Klastosomen (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002) weiter
abgebaut und in Richtung FSD transportiert (SALO et al., 1997; VÄÄNÄNEN et al., 2000). Ein OK kann
mehrere Resorptionszyklen durchlaufen (LAKKAKORPI u. VÄÄNÄNEN 1996) und unterliegt dann der
Apoptose (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002).
2.1.4 Osteoblasten
OB sind kuboidal geformte Zellen mit einem runden Zellkern. Sie liegen in einer einzelligen Schicht auf
Knochenoberflächen (periostal und/oder endostal), an denen Knochenaufbau stattfindet (LIEBICH
1993; MARKS u. ODGREN 2002). Von der mineralisierten Knochenmatrix sind sie durch eine dünne
Schicht unmineralisierter Matrix getrennt (MACKIE 2003).
OB
differenzieren
aus
multipotenten
mesenchymalen
Stammzellen
in
Progenitorzellen,
Präosteoblasten, Osteoblasten und zum Teil weiter in Osteozyten. Für diesen Differenzierungsweg sind
eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Zytokine, antiproliferative
Proteine, Matrixproteine und selbstregulierende Mechanismen der OB notwendig (MAROTTI 1996; IMAI
et al., 1998; AUBIN u. TRIFFT 2002). Zu den Transkriptionsfaktoren gehört Cbfa (core binding factor 1
oder Runx2), welcher die Bildung von Osteokalzin reguliert (SCHINKE u. KARSTENY 2002). PTH
stimuliert z. B. die Differenzierung von Osteoprogenitorzellen (HOCK et al., 2002). Weitere OBDifferenzierungssubstanzen sind IL-11, 1,25(OH)2D3, E2, Glukokortikoide, Prostaglandine, Transforming
B
B
B
B
B
B
Growth Factor-β, oder Leptin (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996; SUDA et al., 1999; LINDBERG et al.,
2002; AUBIN u. TRIFFT 2002). AUBIN et al., (1995) zeigten in vivo, daß Osteoprogenitorzellen in ihrem
Differenzierungsstadium sogenannte Knochenknötchen (bone nodules) bilden. In dieser Phase stoppt
die Proliferation und es werden charakteristische Osteoblastenmarker wie die alkalische Phosphatase
(AP), Bone-Sialoprotein (BSP), Osteokalzin, Kollagen Typ I und Osteopontin expremiert.
OB spielen die zentrale Rolle in der Regulierung der Skelettarchitektur. Ihre wichtigste Aufgabe ist es,
Knochenmatixproteine zu produzieren und zu sezernieren (MARKS u. ODGREN 2002; MACKIE 2003).
Dazu gehört Kollagen Typ I, aber auch nichtkollagene Proteine wie Proteoglykane, Glykoproteine und
γ-carboxylierte Proteine (ROBEY 2002). Nichtkollagene Proteine sind z. B. Dekorin und Biglykan,
welche die Kollagenfibrillengenese regulieren (MACKIE 2003), sowie Fibronektin, Osteonektin und
16
Mitglieder der Thrombospondin Familie, welche die Adhäsion, Migration, Proliferation und/oder
Differenzierung der Knochenzellen regulieren (MACKIE u. RAMSEY 1996; ROBEY 2002). Einfluß auf
die Knochengestaltung nehmen OB auch über die Regulierung der knochenresorbierenden OK,
einerseits durch die Produktion des Rezeptoraktivators des NF-κB Liganden RANKL, welcher an den
RANK-Rezeptor von OK bindet und so die OK-Aktivität steuert (LANCEY et al., 1998; YASUDA et al.,
1998; UDAGAWA et al., 1999; TAKAHASHI et al., 2002) und andererseits durch die Produktion von
OPG und M-CSF (SIMONET et al., 1997; YASUDA et al., 1998). OPG kann an RANKL binden und
verhindert auf diesem Weg die RANK-RANKL Interaktion, die für eine OK-Differenzierung genauso
notwendig ist wie M-CSF (HSU et al., 1999; SUDA et al., 1999). Einige OB werden in die
Knochenmatrix eingebettet und können letztendlich zu Osteozyten werden (MAROTTI 1996; IMAI et al.,
1998). Ihre Osteoidproduktion stellen sie daraufhin ein (MAROTTI 1996 ), oder sie unterliegen der
Apoptose (JILKA et al., 1999).
2.2 Knochenstoffwechsel
Der Knochen unterliegt zeitlebens einer gewissen Dynamik (Knochen-Turnover), da durch exo- und
endogene Einflüsse Ab-, Auf- und Umbauvorgänge stattfinden (NICKEL et al., 1992). Das
Stoffwechselgeschehen wird hauptsächlich durch ein komplexes Zusammenwirken hormoneller und
nutritiver Faktoren gesteuert. Wichtige Hormone, welche die Synthese der Knochenmatrix beeinflussen
sind Somatotropin, Thyroxin, Androgene, E2 und Glukokortikoide. Zu den Hormonen und Vitaminen,
B
B
welche die Mineralisierung beeinflussen gehören PTH, Kalzitonin, Vitamin D3, A und C. Auch
B
B
mechanische Belastungen wie Zug, Druck und Schwerkraft sowie chemische (Sauerstoffspannung,
lokaler pH) und elektrische Einflüsse (bioelektrische Potentiale) regulieren den Turnover (REINACHER
1999)
Somatotropin (STH) ist ein in der Hypophyse gebildetes Wachstumshormon das für die normale
U
U
Ausreifung des Knochens nötig ist. Sein Mangel bewirkt hypophysären Zwergenwuchs und ein
Überschuß Riesenwuchs (ØRTOFT et al., 1999; REINACHER 1999; OLNEY 2003).
Schilddrüsenhormone sind wichtig für eine physiologische Gestaltung des Knochens. Ein Mangel
U
U
verursacht
hypothyreoten
Zwergenwuchs,
ein
Wachstumsbeschleunigung (REINACHER 1999).
17
Überschuß
verursacht
demnach
Androgene und E2 fördern das Knochenwachstum und veranlassen beim noch wachsenden Knochen
U
UB
UB
den Epiphysenfugenschluß. Ein Mangel kann beim Tier in unterschiedlicher Ausprägung zu einem
übermäßigen Wachstum der Röhrenknochen unter Beibehaltung der jugendlichen Beckenproportionen
führen (REINACHER 1999). Ein Wegfall der E2 führt bei Frauen und weiblichen Ratten zur Ausbildung
B
B
einer Osteoporose. E2 sind an der Regulierung einiger Knochenzellen beteiligt (siehe Abschnitt 2.5.2)
B
B
(VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996; ANDERSSON et al., 2002; KAVUNCU et al., 2003; RIGGS et al.,
2003).
Glukokortikoide führen bei länger andauerndem Überschuß, sei er exo- oder endogener Ursache, zur
U
U
Hemmung der Kollagensynthese und zur Ausbildung einer Osteoporose (ØRTOFT u. OXLUND 1988;
TRUNER et al., 1995; ØRTOFT et al., 1999; REINACHER 1999).
PTH aus der Nebenschilddrüse ist das wichtigste Hormon des Knochenstoffwechsels. Im
U
U
physiologischen Ablauf wird es bei einer Hypokalzämie oder niedrigen Vitamin-D3-Spiegeln gebildet und
B
B
ausgeschüttet. Es führt zur Freisetzung von Kalzium aus dem Knochen, das zum Teil gegen Natrium
und Kalium ausgetauscht wird, damit nicht im gleichen Umfang Phosphat abgegeben wird. In der Niere
bewirkt PTH eine Hemmung der Phosphatrückresorption und eine verminderte Kalziumausscheidung
(LANG 1995; REINACHER 1999).
Kalzitonin wird in den parafolikulären Zellen der Schilddrüse gebildet. Die Bildung und Ausschüttung
U
U
erfolgt bei einer Hyperkalzämie und hemmt die Osteoklastenaktivität. Kalzitonin erhöht die Kalzium- und
Phosphatausscheidung der Niere (MOSEKILDE et. al., 1994; REINACHER 1999; WALLACH et al.,
1999; KAVUNCU et al., 2003).
Vitamin D3 ist das wichtigste Vitamin des Knochenstoffwechsels. Es wird als Ergosterin oder
U
UB
UB
7-Dehydrocholesterin im Darm resorbiert und nach mehreren Umwandlungsschritten in Haut und Leber
in der Niere zur biologisch aktivsten Form 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)2D3) oxidiert. Es
B
B
B
B
erhöht die enterale Kalziumresorption und vermindert die renale Kalzium- und Phosphatausscheidung.
Im Knochen führt es zur Mineralisierung des Osteoides. Bei Anwesenheit von PTH unterstützt
Vitamin D3 die Kalziumfreisetzung. Hohe Serumkonzentrationen an PTH, Prolaktin, E2 sowie eine
B
B
B
B
Hypokalzämie oder Hypophosphatämie fördern die Bildung von Vitamin D3 (LINDGREN u. LINDHOLM
B
B
1979; LINDGREN u. DELUCA 1982; FAUGERE et al., 1986; BOIVIN et al., 1987; REINACHER 1999).
18
Vitamin A beeinflußt den Turnover und ist essentiell für die normale Knochengestaltung (REINACHER
U
U
1999; JIMENEZ et al., 2001).
Vitamin C ist für die Synthese des Kollagens der Matrix notwendig (OGAWARA et al., 1997;
U
U
REINACHER 1999).
Transforming Growth Factor-β (TGF-β) beeinflußt die Proliferation und Differenzierung der OB (MARIE
U
U
1997; REINACHER 1999; BLUMENFELD et al., 2002).
Insulin-like Growth Factor (IGF) stimuliert die Knochenbildung unter anderem durch Regulierung von
U
U
OPG und RANKL (MARIE 1997; REINACHER 1999; BLUMENFELD et al., 2002; RUBIN et al., 2002).
Für den Knochenstoffwechsel ist es wichtig, daß alle essentiellen Knochenbestandteile in
ausreichendem und richtigem Mengenverhältnis zur Verfügung stehen (REINACHER 1999).
Letztendlich sind noch nicht alle Wechselbeziehungen der beeinflussenden Faktoren und Wirkungen
bekannt. Auch gibt es viele oben nicht genannte Faktoren und Wirkungen, die Einfluß auf den
Knochenstoffwechsel nehmen (siehe Abschnitt 2.3).
2.3 Magen und Knochenstoffwechsel
Verschiedene Studien dokumentieren, daß durch intravenöse Gaben unterschiedlicher Konzentrationen
von humanem Gastrin, Schweinegastrin, Pentagastrin und Gastrin-17 eine kurzzeitige (30-60 min)
Hypokalzämie in Ratten und Schweinen hervorgerufen wird (CARE et al., 1971 a, b; COOPER et al.,
1971, 1972a, b; SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975; KAPLAN et al., 1977; KLEMENTSCHITSCH et al.,
1979; KRISHNAMRA u. LIMLOMWONGSE 1981; LIMLOMWONGSE u. KRISHNAMRA 1981;
PERSSON et al., 1989, 1991; HÅKANSON et al., 1990). Der hypokalzämische Effekt von humanem
Gastrin läßt sich auch an Ratten demonstrieren, die einer Thyroparathyroektomie unterzogen worden
sind (SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975; KAPLAN et al., 1977; KRISHNAMRA u. LIMLOMWONGSE
1981; LIMLOMWONGSE u. KRISHNAMRA 1981; PERSSON et al., 1989, 1991; HÅKANSON et al.,
1990). SCHULAK und KAPLAN (1974, 1975) stellen Aufgrund dieser Ergebnisse die These auf, daß der
hypokalzämische Effekt von Gastrin kalzitoninunabhängig ist. Er ist ebenfalls unabhängig von Niere,
Nebenniere, Pankreas, Dünn- und Dickdarm und wird nicht von einer Hypophosphatämie begleitet
19
(SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975). Eine Teil- (75%ige) oder Totalgastrektomie hebt den
hypokalzämischen Effekt von Gastrin auf (SCHULAK u. KAPLAN 1975; KAPLAN et al., 1977).
KRISHNAMRA und LIMLOMWONGSE (1981) mutmaßen, daß der hypokalzämische Effekt von Gastrin
nicht durch eine Hemmung der enteralen Kalziumaufnahme entsteht. Er ist auch nicht die Folge eines
verstärkten Abtransportes des Serumkalziums nach enteraler Resorption. Gastrin beeinflußt die
Kalziumhomöostase des Körpers in der Weise, daß es die Kalziumfreisetzung aus einem,
möglicherweise mehreren Geweben unterdrückt. LIMLOMWONGSE und KRISHNAMRA (1981)
postulieren, daß Gastrin direkt die Freisetzung von Kalzium aus Knochengewebe hemmt. Im Gegensatz
dazu zeigen PERSSON et al. (1989, 1991) und HÅKANSON et al. (1990a) an, daß der
hypokalzämische Effekt von Gastrin eine Folge seiner indirekten Wirkung auf den Knochenstoffwechsel
ist. Gastrin stimuliert die Freisetzung eines Peptides aus der säureproduzierenden Magenschleimhaut.
Dieses Peptid wird als Gastrokalzin bezeichnet (PERSSON et al., 1989) und fördert den Einbau von
Kalzium in den Knochen bei Ratten (PERSSON et al., 1989; HÅKANSON et al., 1990a) und Hühnern
(PERSSON et al., 1991).
Die Aufnahme des Kalziums vom Blut in den Knochen bewirkt eine Zunahme des Kalziumgehaltes in
der Knochenasche (HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991) und führt zu einem Anstieg der
Osteoklastenzahl in den Tibiarollhöckern bei der Ratte (HÅKANSON et al., 1990a).
Da endogenes Gastrin dieselbe hypokalzämische Wirkung hat wie exogenes (HÅKANSON et al.,
1990a; PERSSON et al., 1991) folgern HÅKANSON et al. (1990b), daß die Hypokalzämie beider
Wirkstoffe durch denselben Mechanismus entsteht.
Die endokrinen Zellen der Fundusschleimhaut bei der Ratte bestehen zu 65% aus enterochromaffinähnlichen
(ECL)
Zellen
(HÅKANSON
et
al.,
1976).
Ihr
Wachstum
wird
über
die
Serumgastrinkonzentration beeinflußt (TIELEMANS et al., 1989, 1990). LARSSON et al. (2000) stellen
fest, daß Gastrokalzin in den ECL-Zellen produziert wird und daß es sich bei Gastrokalzin auch um das
Peptid Ghrelin handeln könnte. Ghrelin ist ein Peptid aus der Magenschleimhaut, welches durch
Wachstumshormon (Growth-Hormone, GH = STH) gesteuert wird (KOJIMA et al., 1999). Gegen die
Ghrelin-Theorie spricht auch, daß Ghrelin in den chromogranin-A/pankreastatin-immunreaktiven Zellen
(A-like Zellen) der Magenschleimhaut produziert wird und diese Zellen nicht gastringesteuert sind
(DORNONVILLE DE LA COUR et al., 2001).
Eine Gastrektomie oder Fundektomie hebt die indirekte hypokalzämische Wirkung von exogenem
(SCHULAK u. KAPLAN 1975; KAPLAN et al., 1977; HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991)
und endogenem Gastrin auf (HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991). Fundektomierte und
gastrektomierte Ratten haben ein geringeres Knochenaschegewicht (HÅKANSON et al., 1990a;
20
PERSSON et al., 1993) und ein geringeres Trabekelvolumen in der Tibia (PERSSON et al., 1993) als
nichtoperierte Tiere.
Weitere Informationen über die Gastrektomie bei der Ratte und der Entstehung einer Osteopenie sind in
Abschnitt 2.4.2 nachzulesen.
2.4 Tiermodelle
2.4.1 Die ovarektomierte Ratte
KALU (1991) postuliert, daß ein Osteoporose-Tiermodell mit Tieren durchgeführt werden sollte, die
aufgrund eines spontanen oder induzierten Sexualhormonverlustes Knochenmasse verlieren. Die
Charakteristika und Folgeerscheinungen dieses Knochensubstanzverlustes sollen in einem oder
mehreren Punkten mit denen übereinstimmen, die bei der postmenopausalen Osteoporose bei Frauen
zu finden sind.
Das Modell der ovarektomierten Ratte ist als Modell für die postmenopausale Osteoporose im
Menschen anerkannt (BARON et al., 1984; WRONSKI et al., 1985, 1986; YAMAZAKI u. YAMAGUCHI
1989; KIMMEL et al., 1990; KALU 1991; MILLER u. WRONSKI 1993; MOSEKILDE et al., 1993;
THOMPSON et al., 1995; LI et al., 1997 ) und wird angewandt (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989). Die
Ergebnisse verschiedener Studien sind schwer vergleichbar, da in vielen Studien die
Versuchsbedingungen nicht einheitlich gewählt sind, wie z.B. das Alter der Tiere und/oder die Dauer der
Experimente sowie die Meßmethoden (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989). So liegt das Alter der Ratten
verschiedener Studien zwischen 3 Wochen und 2 Jahren. Ratten im Alter von 3 Wochen sind sehr jung,
und Ergebnisse müssen kritisch beurteilt werden aufgrund ihres enormen Wachstums gekoppelt mit
hohen Modeling- und Remodelingraten (KALU 1991). Ratten im Alter von 2 Jahren haben einen
altersbedingten langsameren Knochenstoffwechsel (WRONSKI et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995)
und altersbedingte Krankheiten sind daher zu erwarten (KALU 1991).
Die Ovarektomie verursacht in Ratten eine Osteopenie (SAVILLE 1969; AITKEN et al., 1972;
LINDGREN et al., 1979, 1982; KALU 1984; FAUGERE et al., 1986; MOSEKILDE et al., 1993;
THOMPSON et al., 1995; SURVE et al., 2001a, b). Histomorphologische Untersuchungen von
WRONSKI et al. (1985, 1986, 1987, 1988b, 1989b) zeigen, daß diese Osteopenie mit einem erhöhten
Knochenumsatz einhergeht. In ovarektomierten Ratten wird ein biphasischer Verlauf des
Knochensubstanzverlustes im Femur (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; LI et al., 1997), in der
21
proximalen Tibiametaphyse (WRONSKI et al., 1989b) und in den Wirbeln (WRONSKI et al., 1989a;
MOSEKILDE et al., 1993) beobachtet. An der Tibia ist er gekennzeichnet durch eine schnelle
Anfangsphase mit dem größten Knochenmasseverlust (0,82% pro Tag), sie dauert ca. 3 Monate. Es
folgt eine ca. 5-6 Monate anhaltende Plateauphase der Stabilisierung. Während dieser Zeit bleibt die
Knochenmasse annähernd konstant. Die letzte Phase ist gekennzeichnet durch einen langsamen
Knochensubstanzverlust (0,08% pro Tag), sie dauert ca. 9 Monate (WRONSKI et al., 1989b). Der
Femur erfährt einen ähnlichen Verlauf in Bezug auf sein Längenwachstum (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI
1989) und sein Spongiosavolumen (LI et al., 1997). Frauen erfahren in der ersten Zeit nach der
Menopause ebenfalls eine erste schnelle Phase des Knochensubstanzverlustes, gefolgt von einer
langsameren (RIGGS u. MELTON 1986; STEPAN et al., 1987).
Langzeitstudien an Ratten von WRONSKI et al. (1988b) belegen, daß die erste Phase des
Knochensubstanzverlustes zeitgleich mit der maximalen Erhöhung des Knochen-Turnover abläuft. Bei
der Frau sind nach der Menopause Knochensubstanzverlust und erhöhter Turnover ebenfalls parallel zu
finden (STEPAN et al.,1987).
Die Entwicklung einer Osteopenie bei Ratten ist deutlicher an Knochen mit einem hohen Anteil an
Spongiosa zu beurteilen, z.B. an der Tibia (WRONSKI et al., 1986; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et
al., 2003) oder am Femur (KIMMEL et al., 1990; GEUSENS et al., 1990). Das Spongiosavolumen der
proximalen Tibiametaphyse ist fünf Wochen nach einer Ovarektomie im Vergleich zu Kontrolltieren
halbiert. Histologisch zeigen sich Osteoklasten und Osteoblasten, die in ihrer Anzahl vermehrt und
größer sind als im gesunden Knochengewebe. Daraus resultiert die Annahme, daß Knochenresorption
und –aufbau in stärkerem Umfang stattfinden. Das trotz dieses erhöhten Ab- und Aufbaus von
Knochengewebe das Spongiosavolumen abnimmt, ist ein Hinweis darauf, daß der Knochenumsatz
zugunsten des Abbaus verschoben ist (WRONSKI et al., 1985, 1986; RODEBUSH et al., 1993;
DEMPSTER et al., 1995; THOMPSON et al., 1995).
Ein ähnlicher Mechanismus wird für die Entstehung der postmenopausalen Osteoporose bei der Frau
vermutet (HEANEY et al., 1978). GRUBER et al. (1986) zeigen, daß die Osteoklastenaktivität in
postmenopausalen Patienten höher ist als die der Osteoblasten.
Die letzte, langsame Phase des Knochenabbaus mit einem zeitgleichen Anstieg des
Knochenstoffwechsels wird auch bei erwachsenen Kontrolltieren ab dem Alter von ca. 12 Monaten in
der Tibia beobachtet. Dies wird als physiologischer Alterungsprozess im Knochenstoffwechsel von
Ratten gedeutet (WRONSKI et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995). Ein Vergleich des
Knochenaufbaus von Spongiosagewebe zwischen acht und zwölf Wochen alten Ratten zeigt, daß die
jüngeren Tiere eine 5fach höhere Aufbaurate und eine 1,5fach schnellere Mineralisierungsrate zeigen
22
als die älteren Tiere. Während der normalen Skelettentwicklung in Ratten sinkt der Knochen-Turnover
merklich (BARON et al., 1984) ab. Dieses Phänomen hängt auch mit einer Veränderung des
Knochenmarkes zusammen. Wachsende Ratten zeigen rotes Knochenmark in der Tibia auf, während
ausgewachsene Tiere überwiegend gelbes Fettmark besitzen (WRONSKI et al., 1986). Knochen mit
rotem Knochenmark weisen im Allgemeinen eine größere Turnoverrate an den Trabekeln auf, als
Knochen mit gelbem Fettmark (WRONSKI et al., 1980, 1981). Die höchste Knochenmasse erreichen
Ratten in einem Alter von 10 Monaten (KIMMEL 2002).
Die Ovarektomie von Ratten führt neben der Osteopenie zu einem übermäßigen Anstieg der
Körpermasse (SAVILLE 1969; AITKEN et al., 1972; LINDGREN et al., 1979, 1982; KALU 1984;
WRONSKI et al., 1985, 1986; GEUSENS et al., 1990; THOMPSON et al., 1995). Übergewicht schützt
partiell die langen Röhrenknochen vor einer Abnahme des Spongiosavolumens und der Ausbildung
einer Osteopenie, wie sie in gewichtskontrollierten ovarektomierten Ratten entsteht (WRONSKI et al.,
1987). ROUDEBUSH et al. (1993) folgern daraus, daß dieser Gesichtspunkt die Ergebnisse von
pharmakologischen Studien mit dem Modell der ovarektomierten Ratte manipulierbar macht. In
Berichten
über
fettleibige
postmenopausale
Frauen
konnte
eine
Verminderung
des
Knochensubstanzverlustes und ein verringertes Frakturrisiko beobachtet werden (DANIELL 1976). Dem
Übergewicht wird ein protektiver Stimulus zugeschrieben, in dem der Knochenaufbau an den langen
Röhrenknochen durch den größeren „Druck“ der Körpermasse gefördert wird (WRONSKI et al., 1985,
1987). TAKEDA et al. (2002) beschreiben, daß nicht die Körpermasse sondern freigesetztes Leptin aus
Fettzellen die Knochenmasse kontrolliert.
Die Symptome des Knochenverlustes im Ovarektomie-Modell der Ratte gleichen in vielen Aspekten
denen des postmenopausalen Knochensubstanzverlustes beim Menschen (WRONSKI et al., 1989b;
Kalu et al., 1989, 1991). Dazu gehört z. B. der Spongiosavolumenverlust durch Abnahme der
Trabekelanzahl in den langen Röhrenknochen (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; WRONSKI et al.,
1989b; MILLER u. WRONSKI 1993; LI et al., 1997; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al., 2003) und in
den Wirbeln (WRONSKI et al., 1989a, 1999; MOSEKILDE et al., 1993) sowie der Anstieg des
Knochenstoffwechsels mit Begünstigung der Resorption (WRONSKI et al., 1985, 1986; THOMPSON et
al., 1995). Weitere Parallelen sind der biphasische Verlauf des Knochensubstanzverlustes mit einer
schnellen Anfangsphase (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; WRONSKI et al., 1989a, b; LI et al., 1997)
und die Protektion der langen Röhrenknochen durch Fettleibigkeit (WRONSKI et al., 1985, 1987). Ein
weiterer wichtiger Aspekt ist das positive Ansprechen der Ratte auf diverse Medikamente der
Osteoporosetherapie beim Menschen (KALU 1991; KIMMEL 2002). Dazu gehören die E2 (WRONSKI et
B
B
al., 1988a; SCHMIDT et al., 2000; ANDERSSON et al., 2002; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al.,
23
2003), PTH (WRONSKI et al., 1993; MOSEKILDE et al., 1994; ANDERSSON et al., 2002) oder die
Bisphosphonate (ANDERSSON et al., 2002). Weitere Vorteile des Modells sind, daß es ohne großen
Aufwand unter standardisierten Bedingungen in kurzer Zeit durchgeführt werden kann und daß das
Rattenskelett viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen aufweist (z. B. lamellären Knochenaufbau,
Remodeling in den Spongiosaanteilen). Ratten zeigen jedoch auch Unterschiede zum menschlichen
Knochenstoffwechsel (z. B. geringeres intrakortikales Remodeling) (LI u. MOSEKILDE 1995).
Veränderungen der Serumparameter wie z. B. Gesamtkalzium, ionisiertes Kalzium, Phosphat, PTH,
Osteokalzin oder die alkalische Phosphatase sind bei der Ratte je nach Studie nicht, kaum oder doch zu
sehen. Die Gründe für diese unterschiedlichen Werte sind noch unklar und machen eine
Standardisierung des Tiermodells hinsichtlich dieser Parameter notwendig (KALU 1991). THOMPSON
et al. (1995) empfehlen, wachsende Ratten im Alter von 3 Monaten für dieses Modell zu wählen, da sie
durch
eine
Ovarektomie
schneller
eine
Osteopenie
mit
ausgeprägteren
Symptomen
(Spongiosavolumenverlust, Knochen-Turnover) entwickeln, als ältere Tiere.
2.4.2 Die gastrektomierte Ratte
Die chirurgische Entfernung des Magens (Gastrektomie, GX) führt bei jungen Ratten zu einer
Osteopenie (PERSSON et al., 1993; KLINGE et al., 1995; STENTSTRÖM et al., 1995, 2000;
RÜMENAPF et al., 1997; MÜHLBAUER et al., 1998; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002a; GEPP et
al., 2000; SURVE et al., 2001a, b). Anfänglich mutmaßten verschiedene Autoren, daß eine mangelhafte
Kalziumfreisetzung aus dem Nahrungsbrei, durch den Wegfall der Magensäure, für die Entstehung der
Osteopenie verantwortlich ist (AXELSON et al., 1991; PERSSON et al., 1993). PERSSON et al., (1993)
konnten jedoch durch eine alleinige Hemmung der Magensäuresekretion keine Osteopenie hervorrufen.
Auch
demonstrieren
verschiedene
Arbeiten,
daß
eine
Kalziumsupplemention
den
Knochensubstanzverlust nicht verhindern kann (KLINGE et al., 1995; RÜMENAPF et al., 1997;
WOJTYZKA et al., 1998; LEHTO-AXTELIUS et al., 2002a). Ein auf andere Weise verursachtes
Kalzium-Defizit verursacht eine ähnliche Osteopenie wie sie durch eine GX entsteht
(LEHTO-AXTELIUS et al., 2002a). SURVE et al. (2002) nehmen an, daß durch eine GX der Transport
von Kalzium in das Knochengewebe verschlechtert ist. Äthiologisch ausgeschlossen sind ebenfalls ein
Vitamin-D-Defizit (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998), sekundärer Hyperparathyreodismus (RÜMENAPF et
al., 1997; WOJTYZKA et al., 1998; GEPP et al., 2000), die Operationsmethode zur Wiederherstellung
des
Verdauungstraktes
und
ein
Vitamin-B12-Defizit
B
B
(WOJTYZKA
et
al.,
1998).
Der
Pathoentstehungsmechanismus einer Osteopenie nach einer Gastrektomie ist nach wie vor unklar
24
(RÜMENAPF et al., 1996; SURVE et al., 2001a). Der Magen beeinflußt die Knochenmasse eventuell
durch das hypothetische Hormon Gastrokalzin (PERSSON et al., 1989; RÜMENAPF et al., 1997) aus
den ECL-Zellen der Magenschleimhaut (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002), oder durch eine Störung
im Vitamin D- oder Säure-, Basenhaushalt (WOJTYZKA et al., 1998).
Auf die Heilung eines Knochendefektes hat die Gastrektomie keine Wirkung (ZELLIN et al., 2002). Eine
Teil-(Antrum-, Fundus-) oder Totalgastrektomie hat deutlichen Einfluß auf die Ausprägung der
Osteopenie. Die Totalgastrektomie bewirkt eine starke Ausprägung von Symptomen, im Vergleich zur
Fundektomie, während eine Antrektomie kaum Auswirkungen auf den Knochenaufbau hat (PERSSON
et al., 1993; RÜMENAPF et al., 1997; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998). 10-30% der
Fundusmagenschleinhaut reichen aus, um Knochen vor der Entstehung einer Osteopenie zu schützen
(LEHTO-AXTELIUS et al., 2002b).
An den Calvariae stellt sich der Knochenmasseverlust am deutlichsten dar (KLINGE et al., 1995;
LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002a; SURVE et al., 2001a, b). Er kann begleitet sein von einer
Knochendickenabnahme (KLINGE et al., 1995) oder ohne diese (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998;
SURVE et al., 2001a) auftreten. Histologisch sind große mit Knochenmark gefüllte Sinusoide zu
erkennen, die konfluieren und nicht transparent sind. Die Vaskularisierung des Gewebes ist erhöht
(KLINGE et al., 1995; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; SURVE et al., 2001a).
Eine Gastrektomie hat keinen Effekt auf das Längenwachstum von Knochen (LEHTO AXTELIUS et al.,
1998; MÜHLBAUER et al., 1998). Sie führt zu einer Verminderung des Knochenaschegewichtes,
begleitet von einer Minderung des Kalzium-, Magnesium- und Phosphatgehaltes in den langen
Röhrenknochen (HÅKANSON et al., 1990; PERSSON et al., 1993; RÜMENAPF et al., 1997; GEPP et
al., 2000; STENSTRÖM et al., 2000; SURVE et al., 2001b; ANDERSSON et al., 2002; ZELLIN et al.,
2002) und den Wirbeln (ANDERSSON et al., 2002). Das Knochengewicht (PERSSON et al., 1993;
RÜMENAPF et al., 1997; ZELLIN et al., 2002) und das Spongiosavolumen (PERSSON et al., 1993;
RÜMENAPF et al., 1997; LEHTO-AXTELIU 1998; SURVE et al., 2001 a, b; ANDERSSON et al., 2002)
sind reduziert. Insgesamt ist der osteoporotische Effekt auf die Kortikalis kleiner als auf die trabekulären
Anteile des Knochens (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998; ANDERSSON et al.,
2002). Das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und -abbau hat sich zugunsten der Resorption
verschoben (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998).
Nach
einer
GX
wird
vermehrt
Magnesium
und
Phosphor
enteral
sowie
zyklisches
Adenosinmonophosphat renal ausgeschieden (RÜMENAPF et al., 1996). Im Serum sind die Gehalte
von Gastrin (RÜMENAPF et al., 1997; MÜHLBAUER et al., 1998), 25-Hydroxy Vitamin D3 und von
B
1,25-Dihydroxy Vitamin D3 verringert (RÜMENAPF et al., 1997).
B
B
25
B
Ein Vergleich des Schweregrades der Osteopenie nach einer GX oder Ovarektomie zeigt folgende
Ergebnisse: Die Osteopenie an Femur und Wirbeln ist bei beiden Eingriffen ähnlich ausgeprägt (SURVE
et al., 2001a; ANDERSSON et al., 2002). An den Calvariae und an der Kortikalis der langen
Röhrenknochen sind im Gegensatz zur GX bei der Ovarektomie keine Veränderungen zu sehen
(SURVE et al., 2001a, b).
Die Kombination einer Ovarektomie mit einer GX bewirkt bei der Spongiosaosteopenie geringgradig
additive Effekte (Surve et al., 2001b). Da die Veränderungen an unterschiedlichen Knochen und
Knochenregionen zu finden sind und beide Eingriffe zusammen kaum additive Wirkung zeigen, wird von
einem unterschiedlichen Entstehungsmechanismus ausgegangen (SURVE et al., 2001a, b). Dafür
spricht auch, daß beide Formen der Osteopenie auf PTH, E2 und Alendronat (Bisphosphonat)
B
B
unterschiedlich ansprechen. PTH- und E2-Therapie können den Trabekelverlust nach einer GX nicht
B
B
verhindern, wohl aber nach einer Ovarektomie, während Alendronat bei beiden Eingriffen den Verlust
verhindern kann (ANDERSSON et al., 2002). GEPP et al. (2000) postulieren, daß sich das Tiermodell
der gastrektomierten Ratte eignet, um Knochenkrankheiten zu untersuchen, während SURVE et al.
(2001b) dieses Modell als Alternativmodell zur Erforschung der Osteoporose vorschlagen.
Eine Postgastrektomie-Osteoporose ist auch beim Menschen bekannt, dennoch ist ihr Mechanismus
unklar (TOVEY et al., 1991). Zudem gibt es Studien, die gegenteilige Ergebnisse gezeigt haben
(LIEDMANN et al., 1997). Die Notwendigkeit zur Durchführung einer Gastrektomie beim Menschen ist in
den letzten Jahren deutlich angestiegen (RESCH et al., 1992; ZITTEL et al., 1997).
2.5 Substanzen mit osteoanaboler Wirkung
2.5.1 Parathyrin (Parathormon, PTH)
PTH ist wichtig zur Regulation der Kalziumhomöostase. Bei einer Hypokalzämie sorgt es dafür, daß der
physiologische Zustand schnell wieder hergestellt wird, indem mobiles Kalzium aus den
Knochenspeichern freigesetzt wird. Seine nativ zirkulierende Form besteht aus 84 Aminosäuren. Um
einen metabolischen Effekt zu erzielen, genügen die Fragmente 1-38 (WHITFIELD et al., 2000). Die
biologisch aktive Form hPTH 1-37 wurde 1997 erstmalig von HOCK et al. (1997) aus Hämofiltrat isoliert.
Mitte der 70er Jahre erkannte man, daß PTH mit seiner osteoanabolen Wirkung ein
erfolgversprechendes Medikament gegen die Osteoporose sein könnte (REEVE et al., 1976). Danach
folgten eine Vielzahl von Studien an Tieren und Menschen.
26
Heute ist bekannt, daß intermittierende Gaben von PTH osteoanabole Wirkung, vor allem auf die
Spongiosaanteile des Knochens haben (KIMMEL et al., 1993; SHEN et al., 1993; WRONSKI et al.,
1999; ANDERSSON et al., 2002). Kontinuierliche Infusionen dagegen bewirken katabole Prozesse
(WHITFIELD et al., 2000; ANDERSSON et al., 2002), die sich an der Kortikalis zeigen können
(HODSMAN et al., 2000). Es gibt allerdings auch Studien, die im Bereich der Kortikalis anabole Effekte
beschrieben haben (WRONSKI u. YEN 1994; HODSMAN et al., 2000; SAMNEGÅRD et al., 2001). Bei
intermittierender Anwendung wird PTH eine effektivere osteoanabole Wirkung zugeschrieben als E2
B
B
oder Bisphosphonaten (WRONSKI et al., 1993). Auch die Kombination von PTH 1-34 mit E2 hat additive
B
B
Wirkung in Bezug auf eine osteoanabole Wirkung (SHEN et al., 1993). Kimmel et al. (1993) zeigen
darüber hinaus, daß synthetisches PTH eine potentere Wirkung hat als rekombinantes hPTH 1-84. In
einer großen Anzahl von Studien mit Ratten kann für PTH eine osteoanabole Wirkung nachgewiesen
werden (REEVE et al., 1976; KIMMEL et al., 1993; WRONSKI et al., 1993, 1999; SAMNEGÅRD et al.,
2001; ANDERSSON et al., 2002). Daher wurde synthetisches hPTH 1-37 von der IPF PharmaCeuticals
GmbH als Positivkontrolle in dieser Arbeit verwendet.
2.5.2 Östrogen (17-β-Östradiol, E2)
B
B
E2 ist nicht nur wichtig für einen physiologischen Reproduktionsablauf, seine Wirkung erstreckt sich
B
B
auch auf viele nicht reproduktionsbezogene Prozesse. So spielt es eine wichtige Rolle während des
Knochenwachstums und bei Erwachsenen in der Regulation des Knochenstoffwechsels (VÄÄNÄNEN u.
HÄRKÖNEN 1996). Ein E2-Verlust im Körper, ob er chirurgisch induziert ist oder physiologisch
B
B
auftretend nach der Menopause, kann zum Krankheitsbild der Typ-I-Osteoporose führen (RIGGS et al.,
2003). Da E2 vor allem an der Regulation der trabekulären Knochenmineraldichte beteiligt ist
B
B
(LINDBERG et al., 2002), sind bei der Typ-I-Osteoporose die trabekulären Knochenstrukturen am
meisten betroffen (DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al., 2003). E2 reguliert eine Vielzahl von Genen
B
B
am Knochen, die für den Knochenstoffwechsel von großer Wichtigkeit sind, dazu gehören Zytokin
gesteuerte Gene, Wachstumsfaktor gesteuerte und Knochenmatrix gesteuerte Gene (LINDBERG et al.,
2002). Östrogenrezeptoren sind auf OK (PENSLER et al., 1990) und OB (ERIKSEN et al., 1988)
lokalisiert worden. Eine Inhibierung der Osteoklastendifferenzierung wird über das Absinken der
Interleukin-11 und 6 (IL-11 und IL-6) Spiegel gesteuert, welche E2 reguliert sind. Ob E2 eine direkte oder
B
B
B
B
indirekte Wirkung auf Osteoblasten hat ist nicht geklärt (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996).
Die Unterdrückung des Knochensubstanzverlustes durch 17-β-Östradiol wurde in vielen Studien mit
Hilfe des Tiermodells der ovarektomierten Ratte nachgewiesen (WRONSKI et al., 1988a; SCHMIDT et
27
al., 2000; DA PAZ et al., 2001; ANDERSSON et al., 2002; KAVUNCU et al., 2003). Im Gegensatz dazu
gibt es Studien, die von Teil- oder Mißerfolgen bei der Therapie mit E2 gegen den Knochenverlust bei
B
B
der ovarektomierten Ratte berichten (SIMS et al., 1996; ABE et al., 1993). Da 17-β-Östradiol in einer
Vielzahl von Studien eine osteoanabole Wirkung nachgewiesen werden konnte, wurde es neben PTH
als Positivkontrolle in dieser Arbeit verwendet.
28
3. Material und Methoden
3.1 Präparation und Peptidextraktion aus Schweinemagen
103 entleerte, gewaschene und zentrifugierte Schweinemägen (56 kg Gewebe) wurden über die Firma
Enders aus der Kuttelei des Schlachthofes Gleidingen (Hannover, D) auf Brucheis gekühlt in das IPF
transportiert. Hier wurde mit Fleischermessern und Einmalskalpellen (Cutfix® Surgical Disposable
P
P
Scalpel, Fa. B. Braun, Aesculap®) der Magen in Fundus- und Pylorusbereich getrennt und die
P
P
Schleimhaut vom Fundusanteil für die weitere Aufarbeitung abpräpariert. Der Präparationsbereich ist in
Abb. 2 durch einen quadratisch markierten Bereich dargestellt.
Abb. 2: Präparationsbereich am Schweinemagen (nach NICKEL et al., 1987).
Zusätzlich wurde der Bereich der Pars nonglandularis (Abb. 2, Nr. 2) sauber abgeschnitten. Die
Präparation ergab eine Gewebemasse von 7,66 kg. Diese wurde für 15 min in 95-100 °C heißer 1 M
Essigsäure gekocht (1 kg Gewebe + 1,5 Liter 1 M Essigsäure). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur
wurde der Kochansatz (ca. 1 kg Gewebe + 1,5 Liter Kochlösung) im Waring Blendor auf Stufe 3 für
2 min homogenisiert. Die homogenisierte Lösung wurde mit 1 M Essigsäure auf 35 Liter verdünnt und
der pH Wert mit 25%iger Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Zur Peptidextraktion wurde die pH-korrigierte
29
Lösung über Nacht bei 0 °C schwach gerührt. Das Abtrennen der Zellmasse erfolgte durch eine
15minütige Zentrifugation bei 4 °C mit einer Sigma SK 10 Zentrifuge (Rotor Nr.: 12500, g = 17000,
Sigma Laborzentrifugen). Das Überstandsvolumen (32 Liter) wurde zweimal filtriert, da das Zentrifugat
trübe war und einen hohen Fettanteil aufwies. Die erste Filtration mit wurde mit einem Tiefenfilter
(Seitz-Bio 40, Fa. SeitzSchenk Filtersystems) und 3-4 mm Precoat als Filterhilfsmittel (FH-1500, Fa.
SeitzSchenk Filtersystems) durchgeführt. Die zweite Filtration wurde ohne Precoat sonst identisch der
ersten durchgeführt. Es ergab sich ein Filtrationsvolumen von 31 Litern.
3.1.2 Ultrafiltration
Zur Proteinabreicherung wurde das Filtrat 50 und 10 kDalton ultrafiltriert und diafiltriert. Zum Einsatz
kamen 4 hintereinandergeschaltete 50 kDalton-PS-Ultrasart Platten Module (Sartorius) mit einer Fläche
von 4 x 0,1 m2 und ein 10 kDalton-Ultrasart Platten Modul (Sartorius) mit einer Fläche von 0,1 m2 in
P
P
P
P
einer Sartocon Mini Ultrafiltrations-Anlage (Sartorius). Die Anlage wurde mit einer Zahnradpumpe
(Verder GmbH) auf 75% Leistung (ca. 260 Liter/h) betrieben. Das Permeatvolumen von 39,3 Litern
wurde zur Hälfte für die weitere Aufarbeitung auf eine Vydac C18 Kartusche aufgetragen (siehe
Abschnitt 3.3.3).
3.2 Humanes Hämofiltrat
Zur Isolierung und Aufreinigung neuer osteoanaboler Peptide wurde humanes Hämofiltrat aus dem
Nephrologischen Zentrum Niedersachsens, in Hannoversch–Münden, bezogen. Aus diesem humanen
Nebenprodukt, das bei der Behandlung von niereninsuffizienten Patienten anfällt, isoliert die IPF
PharmaCeuticals GmbH biologisch aktive Formen von Peptiden. Die Aufarbeitung von Hämofiltrat ist in
Abschnitt 3.3.4 beschrieben.
30
3.3 Chromatographische Methoden
Die Aufreinigung und damit die Auftrennung von Peptidgemischen erfolgte mit Hilfe von
Kationenaustausch- (Ion-Exchange-Chromatography, IEC) und Umkehrphasenchromatographie
(Reversed-Phase-Chromatography, RPC) an HPLC-Anlagen.
Der präparative IEC-Lauf wurde an einer Autopilot Anlage von PerSeptive Biosystems durchgeführt. Die
im Durchlauf befindlichen ungebundenen Peptide wurden bis zur weiteren Verwendung in einem
geeigneten Behältnis aufgefangen und gebundene Peptide mit 0,5 M Ammoniumacetatlösung eluiert.
Die Trennung wurde durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm verfolgt.
Die präparativen RPC-Läufe wurden an den HPLC–Anlagen BioCad 60 (PerSeptive Biosystems), und
Septech™ (Merck) durchgeführt. An die Septech™ Anlage ist ein Detektor von Merck/ Hitachi L-4000 A
angeschlossen. Die Fraktionierung erfolgte manuell. Bei Verwendung des BioCad 60 erfolgte eine
automatisierte Fraktionierung mit dem Fraktionssammler Advantec SF-2120 (Advantec Toyo Kaisha).
Die RPC-Aufreinigungen erfolgten generell mit einem steigenden Anteil an Laufmittel B. Die
Trennungen der Peptide wurden detektiert durch Messung der Absorption bei 280 und 214 nm.
3.3.1 Kationenaustausch Chromatographie
Für den IEC-Lauf wurde folgende Säule mit Füllung und folgendes Puffersystem verwendet:
Säule:
Vantage VA 250 (Amicon®, 25 x 8,4 cm; 3,4 L Fa. Millipore)
Säulenfüllung:
KatEx Fractogel TSK SP 650 M (Merck)
Puffer A:
VE-Wasser (vollentsalztes Wasser)
Puffer B:
0,5 M Ammoniumacetat pH ca. 7,0
P
P
Die Herstellung von Puffer B erfolgte mit VE-Wasser.
Auf pH 2,5 korrigiertes Hämofiltrat wurde mit VE-Wasser bis auf eine Leitfähigkeit von ≤ 6 mS/cm
verdünnt. Dieses wurde auf den Kationenaustauscher mit einer Fließrate von 1,80 L/min aufgetragen.
Batcheluiert wurde mit Puffer B, Fluß 1,0 L/min.
31
3.3.2 Umkehrphasenchromatographie
Bei der RPC wurden die Proben direkt oder 1+10 mit Puffer A verdünnt auf die Säule aufgetragen. Bei
der Hämofiltrataufarbeitung wurde die Auftragslösung vorher durch einen 0,45 µm Membranfilter
(Schleicher & Schuell) filtriert. Folgende Säulen wurden für die präparative RPC verwendet:
Tabelle 1: Säulen und –füllmaterialien für die RPC.
Säule & Säulenfüllung
Pharmacia Source FineLine 4,7 L, 20 x 15 cm
15 RPC (1000 Å, 15 µm)
PrepPak® Kartusche 4,7 x 30 cm,
Vydac ™ C18 (300 Å, 10µm)
P
Hersteller
Pharmacia, Freiburg, D
Waters, Milford, MA, USA
P
Zur Herstellung der Puffer wurde VE-Wasser verwendet. Als organisches Lösungsmittel wurde
Acetonitril der Firma Merck eingesetzt. Das Acetonitril entsprach der Reinheitsstufe „isocratic grade“.
Vor seiner Verwendung wurde das Laufmittel B für 10 min im Heliumstrom entgast. Die verwendeten
Puffer waren:
Laufmittel A:
Laufmittel B:
10 mM HCL
80% (v/v) Acetonitril in 10 mM HCL
3.3.3 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus dem Ultrafiltrat der
Schweinemagenfundusmukosa
Zur Isolierung einer osteoanabolen Aktivität aus Schweinemagenfundusmukosa für die in vivo Studie,
wurde ein chromatographischer Aufreinigungsschritt (RPC) mit Fraktionierung durchgeführt (siehe
Tabelle 2). Die Auswahl der aktiven Fraktion erfolgte in vitro mit ROS-17/2.8 Zellen durch den
alkalische-Phosphatase-Test (siehe Abschnitt 3.4.5).
Auf die C18 Säule wurden 19,7 Liter Permeat aufgetragen. Das entspricht einer Äquivalentmenge von
3,85 kg Fundusmukosa = 50 Schweinemagenäquivalent.
32
Tabelle 2: Säulen und –füllmaterialien für die Schweinemagenaufarbeitung.
Säulen &
Säulenfüllung
PrepPak®
Kartusche
4,7 x 30 cm,
Vydac ™ C18
(300 Å, 10µm)
Gradient
Fließrate
Fraktionierung
A: 10 mM HCL
B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
0-40% B in 1500 ml
40-60% B in 400 ml
60-100% B in 150 ml
100% B für 150 ml
100-0% B in 100 ml
0% B für 400ml
40 ml/min
42 x 50 ml
P
P
RPC
Laufmittel
Von Fraktion 33 wurden 120 Aliquots á 0,11 Magenäquivalent in 1,5 ml Eppendorfgefäßen entnommen
und für die Durchführung der in vivo Studie lyophilisiert (Typ LDC-1, Alpha 2-4, Fa. Christ).
3.3.4 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat
Zur Isolierung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat zur Durchführung der in vivo Studie, wurden
drei chromatographische Aufreinigungsschritte durchgeführt. Die Auswahl der Fraktion erfolgte in vitro
mit Knochenmarkstammzellen. Die verwendeten Säulen und -füllmaterialien, Puffersysteme,
Gradienten, Fließraten und die Art der Fraktionierung sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Säulen und –materialien für die Hämofiltrataufarbeitung.
1
IEC
Säulen &
Laufmittel
Säulenfüllung
Vantage VA 250
(Amicon®),
HF und VE-Wasser
Fractogel TSK 3,4
L SP 650 (M) 25 x
8,4 cm
P
P
2
RPC
Pharmacia Source
FineLine 4,7 L 15
RPC, 15 x 20 cm,
(1000 Å, 15 µm)
3
RPC
PrepPak®
Kartusche
4,7 x 30 cm,
Vydac ™ C18
(300 Å, 10 µm))
P
P
A: 10 mM HCL
B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
A: 10 mM HCL
B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
Gradient
Fließrate
Fraktionierung
Batchelution
mit 5-8 L 0,5 M
Ammoniumacetat
1,0 L/min
1350 L
Durchlauf
gesammelt
300 ml/min
48 x 600 ml
40 ml/min
42 x 50 ml
0 % B für 390 ml
0-60% B in 21600 ml
60-95% B in 1590 ml
95-0% B in 990 ml
0% B für 6900 ml
0-40% B in 1500 ml
40-60% B in 400 ml
60-100% B in 150 ml
100% B für 150 ml
100-0% B in 100 ml
0% B für 400ml
Von Fraktion 32 aus dem 3. Aufreinigungsschritt wurden 60 Aliquots á 82,5 ml Hämofiltratäquivalent
und 60 Aliquots mit der zehnfachen Menge in 1,5 ml Eppendorfgefäßen zur Durchführung der in vivo
Studie entnommen und lyophilisiert (Typ LDC-1, Alpha 2-4, Fa. Christ).
33
3.4 Zellkultur
3.4.1 Knochenmarkstammzellgewinnung
Die Knochenmarkstammzellen wurden aus Rattenfemura und –tibiae (weibliche Tiere, ~12 Wochen alt)
durch Ausspülen des Knochenmarks, mit je 2 ml 37 °C warmen Minimum Essential Medium Alpha
(α-MEM, Gibco™ Invitrogen Corporation, Katalog Nr.: 41061-029), gewonnen. Dazu wurde eine 5 ml
Einmalspritze (Omnifix®, Fa. B. Braun) und eine Kanüle 23 G x 1 ¼ (HLZ Logistik) verwendet. Für eine
P
P
48 Loch Platte (Costar® Cell Culture Cluster 48 Well, Fa. Corning Incorporated, Nr.: 3548) wurde das
P
P
Knochenmark einer Ratte gewonnen. Die Zellsuspension wurde unter sterilen Bedingungen an einer
Laminair Flow weiter bearbeitet. Sie wurde nach der Gewinnung durch Auf- und Absaugen mit einer
10 ml Pipette durchmischt. Nicht lösliche Teilchen wie Blutkoagula oder Muskelfaserreste wurden
1-2 min sedimentieren gelassen, dann wurde der trübe Überstand abgenommen und dieser auf das
gewünscht Volumen mit α-MEM aufgefüllt. Die Zellsuspension wurde auf 48 Loch Platten (Costar® Cell
P
P
Culture Cluster 48 Well, Fa. Corning Incorporated, Nr.: 3548) ausgesät (500 µl/Vertiefung) und 24h bei
37 °C und 5% CO2 inkubiert.
B
B
3.4.2 Kultivierung der Knochenmarkstammzellen (BMSC)
Die Kultivierung der primären Knochenmarkstammzellen erfolgte in Anlehnung an Yeh et al. (1999) in
α-MEM (Gibco™ Invitrogen Corporation, Katalog Nr.: 41061-029) auf 48 Loch-Platten (Costar® Cell
P
P
Culture Cluster 48 Well, Fa. Corning Incorporated, Nr.: 3548) bei 37 °C und 5% CO2. Die
B
B
Mediumzusätze und deren Dosierungen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Zum Waschen der Zellen wurde
zusatzfreies α-MEM verwendet.
Tabelle 4: Zusammensetzung der Zellkulturmedien für die BMSC-Kultivierung.
Zusätze
Penicillin, Streptomycin
Glutamin (100x)
Fungizone
Amphotericin B 250 µg/ml
Dosierung
Hersteller
Gibco™ Invitrogen Corporation
Katalog Nr. 10378-016
Gibco™ Invitrogen Corporation
Katalog Nr. 15290-018
Sigma-Aldrich
Katalog Nr. A-4544
BIO WHITTAKER
100 units/ml
0,5 µg/ml
L-Ascorbic Acid
50 µg/ml
Fetal Bovine Serum
10%
34
Proben und Kontrollen
U
Die Proben und Kontrollsubstanzen wurden in VE-Wasser gelöst. Die Zellen wurden mit den Proben
aus der Hämofiltrataufarbeitung (siehe 3.3.4) in einer Konzentration von 200 ml Hämofiltratäquivalent/ml
(HFäq/ml) stimuliert. Als Positivkontrolle wurde Dexamethason (D-2915, Sigma-Aldrich) in einer
Konzentration von 10 nM eingesetzt.
Abb.3: Versuchsdurchführung des BMSC-Testes.
1. Tag
- Zellgewinnung
- Zellkultivierung, in 48 Loch Platten, 500 µl Zellsuspension/Well
- Inkubation bei 5% CO2 und 37 °C
B
B
2. Tag
- nicht adhärente Zellen (z.B. Blutzellvorläufer) durch Schwenken der
Platte resuspendieren
- Zellen waschen (200 µl/Vertiefung) mit 37 °C α-MEM
- neues α-MEM (500 µl/Vertiefung)
- Proben in Doppelwerten pipettieren
- Positivkontrolle in Vierfachwerten pipettieren
- Zellen weiter inkubieren
5. Tag
- Mediumwechsel (500 µl α-MEM/Vertiefung)
- Zellen erneut stimulieren (Proben + Kontrollen)
- Zellen weiter inkubieren
8. Tag
- Testauswertung: WST-1 (3.4.4) und alkalische Phosphatase
(3.4.5)
3.4.3 Kultivierung von ROS-17/2.8 Zellen
Bei den ROS-17/2.8 Zellen handelt es sich um eine weibliche Ratten-Osteosarkomazellinie. Ihre
Morphologie gleicht der von Fibroblasten, sie wächst adhärend. Die Kultivierung erfolgte nach
MAJESKA et al. (1980).
Kultiviert wurden sie in Gewebekulturflaschen (Kulturfläche 75 cm2) mit schrägem Schraubverschluß,
P
P
integriertem 0,2 µm Membranfilter (Sarstedt) bei 37 °C und 5% CO2. Die Kultivierung erfolgte im
B
35
B
RPMI-1640-Medium (RPMI, Gibco™ Invitrogen Corporation, Katalog Nr. 31870-025), die
Differenzierung im Test erfolgte im Differenzierungsmedium (RPMI + Zusätze). Die Zusammensetzung
der Medien und deren Konzentrationen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Zum Waschen der Zellen wurde
Dulbecco`s phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium (Gibco™ Invitrogen
Corporation, Katalog Nr. 14190) verwendet. Zweimal wöchentlich wurden die Zellen gewaschen und
trypsiniert (Trypsin EDTA, Gibco™ Invitrogen Corporation, Katalog Nr.: 25200-075). Die Zellen wurden
bei 4 °C 5 min abzentrifugiert (Zentrifuge Sigma 4K10, Rotor Nr.: 11140, g = 81) und das Zellpellet in
2 ml RPMI resuspendiert. Sie wurden in 15 ml RPMI mit einer Zelldichte von 500000 Zellen/Flasche neu
ausgesät.
Tabelle 5: Zusammensetzung der Zellkulturmedien für die ROS-17/2.8 Kultivierung.
Zusätze
Dosierung
Hersteller
Kultivierungmedium
Penicillin,
Gibco™ Invitrogen Corporation
100 units/ml
Streptomycin,Glutamin
Katalog Nr. 10378-016
(100x)
Fetal Bovine Serum
10%
Biochrom KG
Differenzierungsmedium = Kultivierungsmedium + Ascorbinsäure + β-Glycerophosphat
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
L-Ascorbic Acid
25 µg/ml
Katalog Nr. A-4544
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
β-Glycerophosphate,
10 mM
Katalog Nr.: G-9891
Disodium Salt Hydrate
Abb.4: Versuchsdurchführung des ROS-17/2.8-Testes.
1. Tag
- Zellen auf 96 Loch Platten (Costar®, Cell Culture Cluster 96 Well, Fa.
Corning Incorporated, Nr.: 3599) aussähen
- Medium: Differenzierungsmedium
- Zelldichte: 3000 Zellen/Vertiefung in 100 µl
- Proben in Doppelwerten pipettieren
- Positivkontrolle in Vierfachwerten pipettieren
- Zellen inkubieren, 5% CO2 und 37 °C
P
B
4. Tag
P
B
- Testauswertung: WST-1 (3.4.4) und alkalische Phosphatase
(3.4.5)
36
Proben und Kontrollen
U
Bei den Proben handelte es sich um Fraktionen aus der Schweinemagenaufarbeitung (siehe Abschnitt
3.3.3). Die Proben sind in VE-Wasser gelöst und in den Konzentrationen von 0,1, 0,2 und 0,4
Schweinemagenäquivalent/ml (Mäq/ml) eingesetzt worden. Die Positivkontrolle Dexamethason wurde in
VE-Wasser gelöst und in einer Konzentration von 10 nM eingesetzt. Zusätzlich wurde die Fraktion 32
aus dem letzten Aufreinigungsschritt der Hämofiltrataufarbeitung in einer Menge von 200 ml HFäq/ml
als Positivkontrolle eingesetzt.
3.4.4 Zellvitalität (WST–1)
WST-1 (Roche Diagnostics) ist ein Test zur Überprüfung der Zellproliferation. Das WST-1 Reagenz
enthält ein Tetrazoliumsalz, das in den Mitochondrien lebender Zellen zu Formazan umgewandelt wird.
Der Farbumschlag ist mit einem ELISA-Reader bei 450 nm (Referenzwert 630 nm) messbar.
Für die Auswertung des Zelltestes wurde das WST-1 Reagenz mit dem jeweiligen serumfreien Medium
im Verhältnis 1:10 verdünnt. Auf den Zellrasen wurde nach Entfernung des alten Mediums 100 (96
Loch) oder 200 µl (48 Loch) WST-1 Reagenzmediumgemisch pro Vertiefung pipettiert. Dann wurden
die Platten geschwenkt und 30 min bei 37 °C und 5% CO2 inkubiert. Die Absorption wurde nach 30 min
B
B
mit dem ELISA-Reader (Dynex® Technologies, Typ MRX II) bei 450 nm (Referenzwert 630 nm)
P
P
gemessen. Beim BMSC-Test wurde für die Messung 100 µl von jeder Vertiefung auf eine 96 Loch
Platte (Micro-Platten, Fa. Greiner Bio-One GmbH) übertragen. Im Anschluß wurde die Aktivität der
alkalischen Phosphatase (3.4.5) in den Vertiefungen bestimmt.
3.4.5 Alkalische Phosphatase von Osteoblasten
Das Enzym alkalische Phosphatase ist ein Osteoblastenmarker, der von Osteoblasten gebildet wird,
wenn sich diese im Differenzierungsstadium befinden (AUBIN et al., 1995).
Die Enzymaktivität der membrangebundenen alkalischen Phosphatase kann als Absorption bei 405 nm
gemessen werden. Das 4-Nitrophenyl-phosphat Dinatriumsalz Hexahydrat (PNPP) von Fluka
(Nr.: 71768, Sigma-Aldrich) wird von der alkalischen Phosphatase abgebaut, so daß ein gelber
Farbstoff entsteht. Die Intensität der Absorption wird im ELISA-Reader bei 405 nm gemessen. Alle
folgenden Lösungen wurden mit VE-Wasser hergestellt. Die Durchführung des Testes erfolgte in
Anlehnung an YEH et al. (1999).
37
Lösungsansätze für den alkalische Phosphatase-Test:
U
U
-
95% Ethanol (ETOH)
-
Carbonat-Bicarbonat Puffer (C-3041, Carbonat Bicarbonat Buffer Capsules, Fa. Sigma-Aldrich)
Den Inhalt einer Kapsel in 100 ml VE-Wasser lösen.
-
PNPP-Lösung, Ansatz für 100 ml (im Dunkeln lagern!)
Den Inhalt einer Carbonat-Bicarbonat Puffer Kapsel von Sigma.
50 mg PNPP
100 mg MgCl2
B
B
Die Mengenangaben aus Tabelle 6 beziehen sich auf den ROS-17/2.8-Test. Für den BMSC-Test
wurden die Mengenangaben verdoppelt. Zum Messen der Absorption im ELISA-Reader (Dynex®
P
P
Technologies, Typ MRX II) bei 405 nm wurde bei Durchführung des BMSC-Testes 100µl von jeder
Vertiefung auf eine 96 Loch Platte (Micro-Platten, Fa. Greiner Bio-One) übertragen.
Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurde der jeweilige Zellüberstand abgesaugt.
Tabelle 6: Versuchsdurchführung zur Messung der Enzymaktivität der membrangebundenen alkalischen Phosphatase.
Substanz
95% ETOH
Carbonat Bicarbonat Puffer
PNPP
Menge µl/Well
50
50
100
Inkubationszeit bei Raumtemperatur
5 min
5 min
60 min
3.4.6 Hemmung von Aktivitäten mit dem Rezeptorantagonisten Mifepriston
In einer Konzentration von 100 nM hemmt Mifepriston (M-8086, Sigma-Aldrich) steroidale Aktivitäten an
osteoblastären Zellen. Ist keine Hemmung einer Aktivität mit Mifepriston möglich, ist die
Wahrscheinlichkeit nahe, daß es sich um ein Peptid handelt.
3.4.7 Dosisabhängigkeit von Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon auf
B
B
ROS-17/2.8-Zellen
Von den Substanzen Dexamethason (D-2915, Sigma-Aldrich), E2 (E-4389, Sigma-Aldrich),
B
B
Hydrokortison (H-,0396 Sigma-Aldrich) und Prednisolon (P-6004, Sigma-Aldrich) wurde eine
Dosisabhängigkeit auf ROS-17/2.8 Zellen getestet. Die Zellen wurden entsprechend dem Abschnitt
3.4.3 behandelt und vorbereitet. Der Test wurde nach Abbildung 4 durchgeführt und die Auswertung
erfolgte durch die Messung der alkalischen Phosphatase Aktivität (Abschnitt 3.4.5) und der Zellvitalität
38
mit dem WST-1 Reagenz (Abschnitt 3.4.4). Alle 4 Substanzen wurden in den folgenden
Konzentrationen auf die Zellen pipettiert: 1 µM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM und 0,1 nM.
Tabelle 7: Sonstige Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur.
Sonstige Verbrauchsmaterialien
Anbieter, Bestellnummer
50 ml PP-Röhre, steril
Sarstedt, 62.547.254
15 ml PP-Röhre, steril
Sarstedt, 62.554.502
1,5 ml Reaktionsgefäße aus PP,
Roth, 4182.1
Pipetten, 1 ml, steril
Sarstedt, 86.1251.001
Pipetten, 5 ml, steril
Sarstedt, 86.1253.001
Pipetten, 10 ml, steril
Sarstedt, 86.1254.001
3.5 Hydrolyse von Peptiden mit Proteasen (Subtilisin)
Zur enzymatischen Hydrolyse von Peptiden wurden Aliquots der aktiven Fraktion 33 aus
Schweinemagenschleimhaut und Fraktion 32 aus der Hämofiltrataufarbeitung entnommen, lyophilisiert
(Typ LDC-1, Alpha 2-4, Fa. Christ) und in Tris (Roth)-HCl (Merck)-Puffer (100 mM, pH 7,4)
resuspendiert. Subtilisin (Boehringer Mannheim), eine Protease aus Bacillus subtilis, wurde der Lösung
im Enzym/Peptid-Verhältnis 1:10 zugesetzt. Die Protease spaltet Peptidbindungen unspezifisch.
Die Proben wurden für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Erhitzen
auf 70 °C für 2 min gestoppt (ZUCHT et al., 1995).
3.6 Tiermodell der ovarektomierten Ratte
3.6.1 Tiermaterial
In der vorliegenden Arbeit wurden 40 Ratten (Rattus norwegicus) untersucht. Da es sich bei der Studie
um ein Tiermodell mit einer Dauer von 60 Tagen handelte, bei der jedes Tier täglich eine subkutane
Injektion erhielt, wurde ein entsprechender Antrag zur Durchführung der Studie gestellt. Die
Genehmigung wurde von der Bezirksregierung Hannover, Dezernat 509, Am Waterlooplatz 11,
30169 Hannover am 26.08.2002 erteilt. Die Studie erhielt die Nr.: 509C-42502-02/580 mit dem Titel:
39
„Knochenwachstum von ovarektomierten Ratten (OVX–Ratten) nach 60tägiger Injektion von
Peptiden aus der Magenschleimhaut“.
Die Ratten des Auszuchtstammes Wistar-Hannover stammen von der Firma Harlan-Winkelmann.
Sämtliche Versuchstiere waren weiblichen Geschlechtes und zum Zeitpunkt der Ovarektomie 11-12
Wochen alt. 30 der Tiere sind ovarektomiert worden, 10 wurden sham-operiert. Bei der Lieferung der
Ratten hatte jedes Tier 3 Hautklammern dorsal im Lendenwirbelbereich, die von der Ovarektomie
stammten. Die Tiere hatten eine Adaptionsphase von 14 Tagen bis zum Start der Studie. Bei
Versuchsbeginn hatten sie Gewichte zwischen 225 und 328 g.
3.6.2 Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere
Sämtliche Ratten wurden im Tierstall des Institutes, in Makrolon® Käfigen Typ IV mit
P
P
Überfalledelstahldeckel (Ebeco) untergebracht. Die Einstreu bestand aus Weichholzgranulat und
Heuzugabe. Die Ratten wurden in acht Gruppen zu je 5 Tieren eingeteilt. So ergaben sich zwei
Gruppen mit sham-Tieren und sechs Gruppen mit ovarektomierten Ratten.
Der Tierstall wies eine Temperatur von 20 °C +/- 3 °C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 50%
+/- 10% auf. Gefüttert wurden alle Tiergruppen ad libitum mit pellettiertem „ssniff R+M Haltungsfutter“
der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH. Leitungswasser wurde in Tränkeflaschen ad libitum angeboten.
Der Lichtrhythmus bestand aus einer 12stündigen Hellphase, welche von 07.00 bis 19.00 Uhr dauerte.
Bei den verwendeten Lampen handelte es sich um Lumilux® PlusECO Tageslichtlampen der Firma
P
P
Osram.
3.6.3 Injektionsmethoden
Technik der subkutanen Injektion
U
Zur Durchführung der subkutanen Injektion wird eine Ratte in Bauchlage so auf einer festen Unterlage
fixiert, daß genug Spielraum für eine Injektion im Bereich des Nackens bleibt. Im Nacken wird von
kaudal zugreifend eine Hautfalte zwischen Daumen und Zeigefinger hochgezogen. In dieses
Hautdreieck wird die Kanüle 24 G x 1“ (Sterican®, Fa. B. Braun) von nasal ca. 0,5 cm tief eingestochen.
P
P
Die Hautfalte wird losgelassen, der Sitz der Kanüle durch kurzes hin- und herbewegen kontrolliert. Sie
muß zu fühlen und frei beweglich sein. Anschließend wird kurz aspiriert und das vorgegebene Volumen
injiziert. Die Flüssigkeit sollte leicht zu applizieren sein, wobei sich im Nacken eine sichtbare und
fühlbare Erhebung unter der Haut bildet. Die Kanüle wird schnell herausgezogen.
40
Technik der intraperitonealen Injektion
U
Bei der intraperitonealen Injektion wird eine Ratte mit einer Hand sicher im Nackenfellgriff fixiert, die
andere Hand faßt die hinteren Extremitäten und den Schwanz so, daß das Tier unbeweglich in seiner
Lage ist. Eine zweite Person injiziert intraperitoneal. Die Kanüle 24 G x 1“ (Sterican®, Fa. B. Braun) wird
P
P
seitlich der Linea Alba, fingerbreit unter dem Rippenbogen im Winkel von 30-40° leicht nach lateral
zeigend, durch die Haut gestochen. Es wird zur Kontrolle kurz aspiriert und dann das
Applikationsvolumen injiziert. Die Kanüle wird zügig herausgezogen.
3.6.4 Technik der retrobulbären Blutentnahme
Diese Form der Blutentnahme ist zu vertreten, wenn mehr als 0,15 ml Blut bei Ratten entnommen
werden muß (Bundesamt für Veterinärwesen 1995). Zur retrobulbären Blutentnahme werden
Eppendorfgefäße (1,5 ml), Diethylether, NH4-heparinisierte Mikro-Hämatokritröhrchen (Länge 75mm
B
B
±1mm, Innen-Ø: 1,1-1,2 mm, Außen-Ø: 1,5-1,6 mm, Fa. B. Braun), Pur-Zellin-Tupfer, und ein
Präparierglas mit eingeschliffenem Knopfdeckel (Höhe 300mm, Innen Ø: 240 mm) als Narkosekammer
benötigt. In der Narkosekammer wird mit Papiertüchern und Diethylether eine gesättigte Gasphase
erzeugt, die Hämatokritröhrchen werden in der Mitte durchgebrochen, um eine schärfere Oberfläche zu
erhalten. Die Ratte wird in der Narkosekammer anästhesiert bis der Konjunktivalreflex ausfällt. Sie wird
herausgenommen und mit einem festen Nackenfellgriff fixiert. Das abgebrochene Hämatokritröhrchen
wird im nasalen Augenwinkel mit dem scharfen Ende retrobulbär vorgeschoben, bis ein leichter
Widerstand zu fühlen ist. Dieser Widerstand wird durch leichten Druck, das heißt drehen und
vorschieben des Hämatokritröhrchens zugleich, überwunden. Bei richtigem Sitz des Röhrchens im
Venenplexus fließ nun Blut ab, das im Eppendorfgefäß aufgefangen wird. Bei falschem Sitz des
Röhrchens ist dieses in seiner Position durch vorsichtiges Drehen und Zurückziehen zu korrigieren. Es
dürfen keine Abwehrbewegungen des Tieres auftreten, die Blutentnahme ist in diesem Fall sofort zu
unterbrechen und die Ätherbetäubung zu vertiefen. Während der Blutentnahme bleibt das Tier fixiert in
der Hand. Ist genug Blut entnommen, wird die Kapillare rasch herausgezogen, das Tier auf eine feste
Unterlage gelegt und mit 1-2 Pur-Zellin-Tupfern Druck auf das entsprechende Auge ausgeübt, bis die
Blutung stoppt. In dieser Zeit erwacht die Ratte aus ihrer Narkose und kann zurück in ihre Box gesetzt
werden.
41
3.7 Beschreibung der Versuchsdurchführung
3.7.1 Gruppeneinteilung
Gruppe 1 waren 5 sham-operierte Tiere, die täglich isotone Kochsalzlösung (0,9% NaCl, Lösung zur
U
U
intravenösen Infusion, Fa. B. Braun) erhalten haben.
Gruppe 2 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich isotone Kochsalzlösung (0,9% NaCl, Lösung zur
U
U
intravenösen Infusion, Fa. B. Braun) erhalten haben.
Gruppe 3 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich humanes Parathyrin 1-37 (IPF PharmaCeuticals) in
U
U
einer Dosierung von 40 µg/Tier erhalten haben.
Gruppe 4 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich 17-β-Östradiol (Produkt Nummer: E4389, Fa.
U
U
Sigma-Aldrich) in einer Dosierung von 8 µg/Tier erhalten haben.
Gruppe 5 waren 5 sham-operierte Tiere, die täglich Fraktion 33 (1. Aufreinigungsstufe aus der
U
U
Schweinemagenaufarbeitung) in einer Dosierung von 0,02 Magenäquivalent/Tier erhalten haben.
Gruppe 6 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich Fraktion 33 (1. Aufreinigungsstufe aus der
U
U
Schweinemagenaufarbeitung) in einer Dosierung von 0,02 Magenäquivalent/Tier erhalten haben.
Gruppe 7 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich Fraktion 32 (3. Aufreinigungsstufe aus der
U
U
Hämofiltrataufarbeitung) in einer Dosierung von 15 ml HFäq/Tier erhalten haben.
Gruppe 8 waren 5 ovarektomierte Tiere, die täglich Fraktion 32 (3. Aufreinigungsstufe aus der
U
U
Hämofiltrataufarbeitung) in einer Dosierung von 150 ml HFäq/Tier erhalten haben.
3.7.2 Tägliche subkutane Injektion
Jede Ratte hat täglich zu der möglichst selben Tageszeit eine subkutane Injektion erhalten, wie unter
Abschnitt 3.6.3. beschrieben. Die Proben wurden 30-60 min vor Applikation in isotoner Kochsalzlösung
(0,9% NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, Fa. B. Braun) gelöst. Das Applikationsvolumen betrug
200 µl. Die Dosierungen für die einzelnen Tiere, sowie die Auswahl der Substanzen für jede Gruppe ist
in Abschnitt 3.7.1. beschrieben.
42
3.7.3 Gewichtsbestimmung
Zu Beginn der Studie wurden die Gewichte der Ratten mit einer Haushaltswaage (Wägebereich bis
2000 g) ermittelt. Das Gewicht der Tiere wurde danach alle 7 Tage neu bestimmt, um den
Gewichtsverlauf während der Studie zu verfolgen.
3.7.4 Blutentnahme
Zu Beginn der Studie wurde jeder Ratte wie unter 3.6.4. beschrieben ca. 1 ml Blut entnommen. Im
weiteren Verlauf wurde in regelmäßigen Abständen erneut ca. 1 ml Blut zur Serumgewinnung
abgenommen. Das Blut wurde in 1,5 ml Eppendorfgefäßen aufgefangen und für 30 min bei
Raumtemperatur unter mehrmaligem Umrühren mit einem Hämatokritröhrchen stehengelassen. Damit
das Blut vollständig gerinnt, wurde es für 3-4 Stunden auf Eis gekühlt. Die festen Blutbestandteile
wurden mit einer Sigma Zentrifuge (Typ 201m, Rotor Nr. 12001, Sigma Laborzentrifugen) bei 13000 g
für 15 min abzentrifugiert. Der Serumüberstand wurde abgenommen und bei –20 °C eingefroren.
3.7.5 Radiologische Untersuchung der Ratten
Am 23. Tag der Studie wurde von jedem Tier eine Röntgenaufnahme des Körpers angefertigt, um
eventuelle Veränderungen an den Knochen zwischen den Gruppen bildlich darzustellen. Dazu wurden
die Tiere am Abend zuvor nüchtern gesetzt. Zugang zu Wasser war möglich.
Zur radiologischen Beurteilung mußten die Ratten einer kombinierten Ketamin/Xylazin Injektionsnarkose
unterzogen werden. Die Injektion wurde intraperitoneal (siehe Abschnitt 3.6.3.) gegeben. Zum Einsatz
kamen Kanülen 24 G x 1“ (Gr.17, Sterican®, Fa. B. Braun) und Einmalspritzen (Omnifix®-F 1 ml, Fa. B.
P
P
P
P
Braun). Das Ketamin (Ketavet®) in einer Dosierung von 100mg/ml wurde 1+1 verdünnt mit isotoner
P
P
Kochsalzlösung (0,9% NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, B. Braun). Der verdünnten
Ketaminlösung wurden pro ml 5 Tropfen Xylazin (Rompun® 2%) zugefügt. Dieses Ketamingemisch
P
P
wurde in einer Dosierung von 60 mg/kg intraperitoneal verabreicht.
Für die Röntgenaufnahmen wurde jedes Tier in Bauchlage auf den Röntgentisch gelegt. Kopf und
Schwanz wurden gestreckt, damit die Wirbelsäule gerade lag. Die vorderen Extremitäten wurden
Richtung nasal gestreckt und in dieser Haltung leicht mit Klebestreifen (Tesa®) für die Aufnahme fixiert.
P
P
Die hinteren Extremitäten wurden Richtung kaudal gestreckt und in dieser Haltung leicht mit
Klebestreifen (Tesa®) für die Aufnahme fixiert.
P
P
43
Die Röntgenaufnahmen wurden mittels Philips Röntgengerät (Bucky Diagnostic) bei dorso-ventralen
Strahlengang erstellt. Die Röntgeneinstellungen entsprachen einem Programm zum Röntgen des
Handgelenkes a.-p., das heißt 48 kV, 1,25 mAs und 5,01 ms. Es kam eine Kodak Kassette (X-Omatic
Cassette, KP 68374-A) zum Einsatz, als Film wurde ein Kodak Diagnostik Film (InSight™ Imaging Film
18 x 24) benutzt.
3.7.6 Intraperitoneale Tetrazyklin und Kalzein Injektion
Am 49. Tag der Studie erhielt jedes Tier eine intraperitoneale Tetrazyklininjektion (Produkt Nr. T3383,
Sigma-Aldrich) wie unter 3.6.3 beschrieben. Das Tetrazyklin wurde in isotoner Kochsalzlösung (0,9%
NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, B. Braun) gelöst. Jedes Tier erhielt 7 mg durch die Injektion.
Am 56. Tag der Studie erhielt jedes Tier eine intraperitoneale Kalzein (Produkt Nr. C0875,
Sigma-Aldrich) Injektion wie unter 3.6.3 beschrieben. Das Kalzein wurde in isotoner Kochsalzlösung
(0,9% NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, B. Braun) gelöst. Jedes Tier erhielt 7 mg durch die
Injektion.
Abb. 5: Ablaufplan zur Versuchsdurchführung.
0. Tag
alle Gruppen:
- allgemeine klinische Untersuchung
- entfernen der Hautklammern
1. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtsmessung
- Blutentnahme
7. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- Blutentnahme
14. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- Blutentnahme
21. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- Blutentnahme
44
23. Tag
alle Gruppen:
- radiologische Untersuchung
28. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
35. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- Blutentnahme
42. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
49. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- Blutentnahme
- intraperitoneale Tetrazyklin Injektion
56. Tag
alle Gruppen:
- Gewichtskontrolle
- intraperitoneale Kalzein Injektion
63. Tag
alle Gruppen:
Gruppe 1-4:
- Gewichtskontrolle
- Tötung der Tiere
- Präparation von Calvariae, Femura und
Tibiae
- Verschicken von 24 Ratten
64. Tag
Gruppe 5-8:
- Tötung der Tiere
- Präparation von Calvariae, Femura und
Tibiae
Die Tötung von 15 Ratten erfolgte unter Diethylethernarkose durch Dekapitation.
Nach der Tötung dieser Tiere wurden sofort die Femura, Tibiae und Calvariae jeden Tieres präpariert.
Die anderen Ratten wurden im Auftrag von der Firma Frimorfo Ltd., (Ch. Du Musée 12, CH-1705
Fribourg) mit 4% Paraformaldehyd fixationsperfundiert und die entsprechenden Knochen (Femur, Tibia,
Calvariae) präpariert. Diese Tiere wurden entsprechend dem Deutschen Tierschutzgesetz nach
SCHIWY (2002) und der Leitlinie für den Transport von Labormäusen, -ratten und -meerschweinchen
(Mm/6) vorbereitet. Der Transport erfolgte am 63. Tag entsprechend der IATA – Richtlinien für den
Transport von lebenden Tieren (2001).
45
3.7.7 Präparation der Knochen
Materialentnahme
U
Die Femura, Tibiae und die Calvariae von 15 Ratten wurden sofort nach Tötung der Tiere grob
freipräpariert, wobei das Weichgewebe so gut wie möglich mit chirurgischen Scheren entfernt worden
ist. Das Femur und die Tibia eines Tieres wurden in 9-10 ml, die Calvaria in 5 ml 4%igem
Paraformaldehyd (Bio Rad) für zwei Wochen fixiert. Das Paraformaldehyd wurde in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS 1x, pH 7,2 ± 0,05, Fa. GIBCO™ Invitrogen Corporation) gelöst. Das
Fixationsmittel wurde in diesem Zeitraum alle 3 Tage ausgewechselt.
Die entsprechenden Knochen der anderen 24 Ratten wurden durch die Firma Frimorfo grob präpariert,
und in 0,9% NaCl gelagert wieder an die IPF PharmaCeuticals GmbH übersandt.
Feinpräparation
U
Um die fixierten Knochen morphologisch beurteilen und weiter verwenden zu können, mußte durch eine
Feinpräparation restliches Gewebe wie Muskelfaserreste, Bänder und Knorpelreste entfernt werden.
Dieses wurde mit Einmalskalpellen (Cutfix® Surgical Disposable Scalpel, Fa. B. Braun, Aesculap®) und
P
P
P
P
diversen Pinzetten durchgeführt. Anschließend konnten die Knochen über Nacht im Trockenschrank
(Heraeus–electronic-VT 5042 EK) bei 60 °C trocknen.
3.7.8 Radiologische Beurteilung der Ossa femori
Von jeder Ratte wurde ein Femur (rechts oder links) radiologisch beurteilt. Für die Aufnahmen wurden
die Knochen einer Gruppe nebeneinander auf eine 1 cm dicke Korkplatte gelegt und mit Klebestreifen
(Tesa®) fixiert. Die Knochen der Gruppen 1-4 und 5-8 wurden auf einem Film dargestellt.
P
P
Die Röntgenaufnahmen wurden mittels Philips Röntgengerät (Bucky Diagnostic) bei dorso-plantaren
Strahlengang erstellt. Die Röntgeneinstellungen entsprachen einem Programm zum Röntgen der
Finger, das heißt 44 kV; 0,63 mAs; 3,58 ms. Der Film-Focus-Abstand betrug 35 cm. Es kam eine Kodak
Kassette (X-Omatic Cassette, KP 68374-A) zum Einsatz, als Film wurde ein Kodak Diagnostik Film
(InSight™ Imaging Film) benutzt.
46
3.7.9 Dichtebestimmung der Ossa femori nach dem Prinzip der Mohr-Waage
Mit dem Prinzip der Mohr-Waage kann die Dichte von Festkörpern, die in eine Flüssigkeit eintauchen,
bestimmt werden (SAVILLE u. SMITH 1966). Die Dichte ρ ist definiert als das Verhältnis von Masse zu
Volumen:
ρ20° = ∆m / ∆V
B
B
Nach Ermittlung der Masse wird das verdrängte Flüssigkeitsvolumen des Festkörpers
(Archimedis-Prinzip) bestimmt. Der Quotient aus Masse und Volumen ergibt die gesuchte Dichte in
g/ml. Die Femura wurden für 4 Stunden im Trockenschrank (Memmert GmbH + Co. KG) bei 120 °C bis
zur Gewichtskonstanz getrocknet. Über Nacht wurden sie in einem Exsikkator gelagert. Die
Trockenmassen in g von einem Femur pro Tier wurden auf einer kalibrierten Analysenwaage (Typ
Sartorius analytic A 120S-DI, Fa. Sartorius) ermittelt. Für die Volumenbestimmung des verdrängten
Wassers wurde ein 10 ml fassender Standglaszylinder bis zum obersten Eichstrich mit zweifach
entionisiertem Wasser gefüllt. In diesen Zylinder wurde das Femur vorsichtig und langsam mit einer
feinen Pinzette versenkt, ohne Bildung von Luftblasen. Die Waage mit dem gefüllten Standzylinder
wurde auf 0 tariert. Das verdrängte Flüssigkeitsvolumen wurde bis auf das oben gewählte Volumen
reduziert. Die Waage zeigte die Menge der abgenommenen Flüssigkeit als Gewichtsdifferenz in g an.
Die Dichte der gewogenen Knochen konnte errechnet werden (in der Annahme, daß bei VE-Wasser
und Raumtemperatur 1 g ≅ 1 ml entspricht).
3.7.10 Transillumination der Calvariae
Die fixierten und trockenen Calvariae der Ratten wurden mit ihrer dorsalen Fläche mit Hilfe von
UHU®Alleskleber auf der Platte des Scanners (Duoscan HiD, AGFA) fixiert. Ein Verrutschen während
P
P
des Durchleuchtens konnte so verhindert werden. Die Calvariae wurden im Durchlicht gescannt.
3.7.11 Anfertigung von Dünnschliffen
Sämtliche Dünnschliffe wurden in Anlehnung an KIERDOF (1994) angefertigt. Die Dünnschliffe wurden
von
Femurquerschnitten
angefertigt,
um
den
Abstand
zwischen
Kalzein-
und
Tetrazyklinfluoreszenzbanden zu messen. Der Abstand gibt Auskunft über den Knochen-Turnover.
Von den Calvariae wurden Dünnschliffe angefertigt, um zu sehen, ob bei der Ovarektomie-Osteoporose
die Calvariendicke abnimmt.
47
Femurdünnschliffe
U
Zur Ermittlung der Femurdiaphysenmitte wurde der Bereich distal des Trochanter minor und proximal
der Trochleae ossis femoris an jedem Femur ausgemessen und dessen Mitte bestimmt. In der
Diaphysenmitte wurde das Femur mit einem Minimot Bohrer (Proxxon 100/P) mit Standfuß und
Miniatursägeaufsatz (∅ 20 mm) durchgetrennt. Eine ca. 2 mm starke Knochenscheibe wurde von jeder
Knochenhälfte abgetrennt und mit der mittleren Schnittfläche auf einem angerauhten Giessen
Objekträger 28x48 mm/1.8-2.0 mm (Menzel Gläser) in einer erbsengroßen Menge UHU®plus schnellfest
P
P
2-Komponenten-Epoxid-Harz-Kleber fixiert. Der Klebstoff wurde 24 h bei Raumtemperatur ausgehärtet.
Das Objekt wurde im Folgenden auf angefeuchtetem Schleifpapier mit absteigender Korngröße (P 240,
400, 600 und 1000) zu einem dünnen und planen Präparat abgeschliffen. Das Präparat wurde
getrocknet, 30 sec in Xylol (Merck) getaucht und danach in Entellan®neu (Merck) mit einem 12 mm
P
P
Deckgläschen (Menzel Gläser) fixiert.
Calvariendünnschliffe
U
Die Calariae wurden in der Mittellinie mit einem Minimot Bohrer (Proxxon 100/P) mit Standfuß und
Miniatursägeaufsatz (∅ 20 mm) durchgetrennt. Es wurde ein ca. 3 mm breiter Knochenstreifen von
einer Calvarienhälfte abgetrennt. Die Hinterkopfseite wurde markiert. Der entstandene Knochenstreifen
wurde mit der mittleren Schnittseite auf einem angerauhten Giessen Objekträger 28x48 mm/1.8-2.0 mm
(Menzel Gläser) in einer ca. walnußgroßen Menge UHU®acrylit 2-Komponentenkleber fixiert. Der
P
P
Klebstoff wurde 24 h bei Raumtemperatur ausgehärtet. Das Objekt wurde danach auf angefeuchtetem
Schleifpapier mit absteigender Korngröße (P 180, 240, 400, 600 und 1000) bis zu einem dünnen und
planen Präparat abgeschliffen und getrocknet.
3.7.12 Fluoreszenzmikroskopie
Der Meßbereich lag bei jedem Präparat zwischen den Außenlinien der Tetrazyklin- und
Kalzeinfluoreszenzbanden. An jedem Präparat wurden 6 Bereiche ausgemessen und von diesen
Werten der Mittelwert gebildet.
Die Messungen wurden am Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskop mit einem 63x/1,2 Plan Neofluar
Objektiv, E-PI 10x/20 Meßokular und Immersionsöl 518F (Zeiss) durchgeführt.
48
3.7.13 Messung des Calvariendurchmessers
Der Meßbereich auf jedem Calvariendünnschliff lag 2 mm rostral der Sutura coronalis und 2 mm kaudal
der Sutura parietalis. In diesem Meßbereich wurden in gleichem Abstand zueinander 3 Meßpunkte
festgelegt. Das Ausmessen des Meßbereiches und Festlegen der Meßpunkte wurde am Zeiss
Stereomikroskop W 10x/25+0,8 durchgeführt.
Die Messungen der Calvarienstärke wurden am Zeiss Axiophot Mikroskop mit einem 10x/0,25 PH1 Zeiss
Achroplan Objektiv und E-PI 10x/20 Meßokular (Zeiss) durchgeführt. Der Durchmesser wurde an den
vorher markierten Meßpunkten bestimmt und gemittelt.
3.7.14 Methoden zur Bestimmung von Serumparametern
Gesamtkalziumbestimmung I
U
Bei den Ratten wurde an Tag 1, 7, 14, 21, 35 und 49 ca. 1ml Blut retrobulbär (siehe 3.6.4) entnommen.
Dieses wurde wie unter 3.7.4 beschrieben verarbeitet und gelagert.
Die Kalziumbestimmung ist ein Schnelltest von Sigma-Aldrich (Katalog Nr. 587-A), der zur quantitativen
kolorimetrischen Bestimmung von Gesamtkalzium in Serum, Plasma oder Urin bei 570 nm dient.
Kalzium bildet mit o-Kresolphthalein-Komplexon im alkalischen Medium (pH 10-12) einen roten
Kalzium-Kresolphthalein-Komplexon-Komplex, der 20 min stabil bleibt. Die meßbare Farbintensität ist
zu der Kalziumkonzentration in der Probe direkt proportional. Der Test enthielt das Kalzium-Reagenz
(o-Kresolphthalein-Komplexon 0,024%, 8-Hydroxyquinolin 0,25%) und den Kalzium-Puffer (500 mmol/l
2-Amino-2-Methyl-1,3-Propanediol, nichtreaktive Bestandteile und Stabilisatoren), welche bei
Durchführung im Verhältnis 1+1 gemischt wurden. Weiterhin wurden die Kalzium/Phosphor-Standards
(Fa. Sigma-Aldrich, Katalog Nr. 360-11) mit einer Konzentration von 5, 10 und 15 mg/dl Kalzium
eingesetzt.
Die Bestimmung wurde in 96 Loch-Platten (Cellstar® Tissue Culture Plate, 96 W, Flat Bottom, Fa.
P
P
Greiner Bio-One) durchgeführt. Als Leerwert wurden 10 µl VE-Wasser in vier Vertiefungen, die drei
Standards als Viererwerte (10 µl) und von den Serumproben direkt 10 µl als Doppelwerte pipettiert. Auf
die vorgelegten 10 µl wurden pro Vertiefung 200 µl des Kalzium-Reagenz-Puffer-Gemisches mit einer
Eppendorf Multipette® Plus für Combitips gegeben (Platten schwenken). Die Absorption wurde im
P
P
Anschluß mit dem ELISA-Reader (Dynex® Technologies, Typ MRX II) bei 570 nm gemessen. Die
P
P
Kalziumkonzentrationen in den Proben wurden wie folgt bestimmt:
49
Kalziumkonzentration (mg/dl) = (∆E Probe/ ∆E Standard) x Konzentration des Standards
∆E Probe = E Probe – E Leerwert
∆E Standard = E Standard – E Leerwert
Für die Kalziumberechnung in den Rattenserumproben wurde die Absorption des Standards mit der
Konzentration von 10 mg/dl herangezogen.
Gesamtkalziumbestimmung II
U
Die Messung des Gesamtkalziumgehaltes der Serumproben von Tag 49 wurde mit einem „Calcium
liquicolor“ Schnelltest (Fa. Rolf Greiner, Nr. H 10011) wiederholt. Dieser Test dient zur Bestimmung von
Kalziumionen in Serum oder Heparinplasma bei einer Wellenlänge von 570 nm. Hier bilden die
Kalziumionen mit o-Kresolphthalein-Komplexon in alkalischer Lösung einen violetten Farbkomplex,
dessen Extinktion der Kalziumkonzentration proportional ist. Nach Mischen der Reagenzien und der
Proben soll innerhalb von 5-50 min die Extinktion gemessen werden und ist in einem Bereich bis zu
15 mg/dl linear. Der Test enthielt die Pufferlösung (Lysin-Puffer [pH=11,1] 0,2 mol/l und Natriumazid
0,095%), das Farbreagenz (8-Hydroxychinolin 14 mmol/l, o-Kresolphthalein-Komplexon 0,1 mmol/l und
Salzsäure 0,1 mol/l) und einen Standard (STD) mit 8 mg/dl Kalzium und 0,095% Natruimazid. Puffer
und Farbreagenz wurden im Verhältnis 1+1 10 min vor Gebrauch gemischt (= Gebrauchslösung, GLS).
Gemessen wurde in Einmalküvetten (10x4x45 mm, Ref. Nr. 67742, Fa. Sarstedt) mit dem Photometer
DUO 640 Spectrophotometer (Beckmann) bei 570 nm. Trotz der vom Hersteller angegebenen Linearität
bis 15 mg/dl wurde in dieser Arbeit eine Standardkurve zur Berechnung der Kalziumgehalte in den
Proben erstellt.
Das Pipettierschema der Standardreihe ist in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Pipettierschema der Standardreihe für Gesamtkalzium.
Gehalt des Standards mg/dl
(gegen leere Küvette messen)
12
10
8
6
4
2
Menge der Standardlösung
Bidest
30 µl
25 µl
20 µl
15 µl
10 µl
5 µl
990 µl
995 µl
1000 µl
1005 µl
1010µl
1015 µl
Das Pipettierschema für die Proben, den Reagenzienleerwert und den Probenleerwert ist in Tabelle 9
dargestellt.
50
Tabelle 9: Pipettierschema für die Gesamtkalziummessungen.
In Küvetten pipettieren
Reagenzienleerwert
(gegen leere Küvette
messen)
20 µl
Probenleerwert
(gegen Bidest
messen)
1000 µl
20 µl
Probe
(gegen leere Küvette
messen)
Bidest
Probe
20 µl
GLS
1000 µl
1000 µl
Mischen, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann so schnell wie möglich die Extinktion der Ansätze
messen, da der Farbkomplex nicht lange stabil ist.
U
U
Jede Küvette wurde 2 mal gemessen und für die Berechnung der Konzentration wurde jeweils der
Mittelwert dieser Messungen herangezogen.
Berechnung:
U
U
1.
∆E STD = E STD - E Reagenzienleerwert
2.
∆E Probe = E Probe - E Probenleerwert - E Reagenzienleerwert
Quantifizierung von Osteokalzin
U
Osteokalzin oder Knochen Gla-protein (BGP), ist ein Protein, daß bei Ratten aus 50 Aminosäuren
besteht. Es ist Bestandteil der Knochenmatrix. Osteokalzin wird von Osteoblasten synthetisiert
(SCHINKE u. KARSTENY 2002; AUBIN et al., 1995) und wird sowohl in die Knochenmatrix eingebaut,
als auch in den Körperkreislauf abgegeben. Osteokalzin ist demnach ein Osteoblastenmarker, der in
Serum oder Plasma nachweisbar ist, wenn Osteoblasten im Knochen aktiv sind, das heißt ein indirekter
Indikator des Knochenstoffwechsels und des Knochenumbaus. Der Nachweis von Osteokalzin im
Rattenserum erfolgte durch einen Rat-MID-Osteokalzin-ELISA (Osteometer BioTech A/S). Bei diesem
Test handelt es sich um einen kompetitiven ELISA mit monoklonalem Antikörper gegen humanes
Osteokalzin (Aminosäuren 21-29).
Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Es wurden 20µl Serum von jeder Probe
eingesetzt und im ELISA-Reader (Dynex® Technologies, Typ MRX II) bei 450 nm (Referenzwert
P
P
630 nm) gemessen.
3.8 Tiermodell der gastrektomierten Ratte
3.8.1 Tiermaterial
In der vorliegenden Arbeit wurden 20 Ratten (Rattus norwegicus) untersucht. Vor Beginn der Studie
wurden 10 Tiere einer Gastrektomie unterzogen. Ein Antrag zur Durchführung der Studie wurde gestellt
51
und die Genehmigung erfolgte durch die Bezirksregierung Hannover, Dezernat 509, Am
Waterlooplatz 11, 30169 Hannover am 17.02.2003. Die Studie erhielt die Nr.: 509C-42502-02/634 mit
dem Titel: „Untersuchung des Knochenwachstums von gastrektomierten Ratten nach 60tägiger
Injektion von Peptiden aus menschlichen und tierischen Peptidbibliotheken“.
10 Ratten des Auszuchtstammes Wistar-Hannover stammten von der Firma Harlan-Winkelmann. Diese
Versuchstiere waren weiblichen Geschlechtes und im Alter von ~11 Wochen. 5 der Tiere sind
gastrektomiert worden, 5 wurden als Kontrolltiere eingesetzt. Bei Lieferung der Ratten hatten sie
Gewichte zwischen 211-221 g. Bei Versuchsbeginn lag das Körpergewicht dieser jungen Tiere
zwischen 173-233 g.
10 weitere Ratten des Inzuchtstammes Wistar-Hannover stammten von der IPF PharmaCeuticals
GmbH. Auch diese Tiere waren weiblichen Geschlechts jedoch im Alter von ~25 Wochen. 5 der Tiere
sind gastrektomiert worden, 5 wurden als Kontrolltiere eingesetzt. Bei Versuchsbeginn hatten sie
Körpergewichte zwischen 244-296 g.
3.8.2 Operationsmethode
Gastrektomie, Ösophagoduodenostomie
U
Die Ratten erhielten eine Isofluraninhalationsnarkose (Lilly), die mit 3-4% eingeleitet, und während des
Eingriffs mit 2,5% aufrechterhalten wurde. Der Isofluranverdampfer Vapor 19.1 (Drägerwerk AG) war an
ein Atemgerät von FMI (Föhr Medical Instruments) angeschlossen.
Nach Einleitung der Narkose erfolgte die Rasur des Abdomens von knapp oberhalb des Xiphoides bis
ca. 3 cm unterhalb des Xiphoides mit einem Schergerät. Es folgte die Lagerung des Tieres auf einer
weichen, Flüssigkeiten aufnehmenden Unterlage. Dabei wurden die vorderen Extremitäten durch
Gummibänder leicht zur Seite fixiert.
Eingegangen wurde in der Mittellinie mit Linksumschneidung des Xiphoides unter Schonung der
A. epigastrica. Der Magen wurde am Vormagen luxiert und mit einer Haltenaht versehen (Dexon® 4-0).
P
P
Großkurvaturseitig wurden die Gefäße mit dem Bipolar verschweißt und das Netz komplett bis zum
Duodenum abgelöst. Hierbei erfolgte eine subtile Schonung der A. gastroduodenalis, sowie des
Pankreas. Nach Luxierung des Magens nach oben konnte die A. gastrica sinistra selektiv dargestellt,
unterbunden (Dexon® 4-0) und durchtrennt werden.
P
P
Nach Lösung der bandhaften Strukturen zwischen Magen und Leber wurde der Ösophagus ca. 2 mm
proximal der Absetzungsstelle mit einem Haltefaden versehen (Ethicon® 7-0). Der Ösophagus wurde
P
52
P
dann ca. 2 mm proximal des ösophagogastralen Überganges abgesetzt. Der Magen wurde danach ca.
1-2 mm distal des Pylorus abgesetzt.
Zur Kontinuitätswiederherstellung wurde die Ösophagoduodenostomie mit Ethicon® 7-0 angelegt, hierzu
P
P
wurde die Hinterwand mit zwei invertierenden Stichen versorgt. Die Vorderwandnaht wurde mit zwei bis
drei Stichen angelegt.
Danach erfolgte eine subtile Kontrolle auf Bluttrockenheit, eine Spülung mit isotoner Kochsalzlösung
(0,9% NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, Fa. B. Braun) und eine Instillation von 5 ml isotoner
Kochsalzlösung (0,9% NaCl, Lösung zur intravenösen Infusion, Fa. B. Braun) in den Peritonealraum.
Es wurde ein fortlaufender Bauchdeckenverschluß mit Dexon® 4-0 und ein fortlaufender Hautverschluß
P
P
mit Seralon® 4-0 durchgeführt.
P
P
Seralon® (SERAG)
blau, Polyamid monofil, nicht resorbierbar
EP 1,5
USP 4/0
50 cm
Nahtmaterial:
U
UP
UP
Dexon® II (B. Braun-Dexon)
bicolor, Polyglykolsäure Beschichtung Polycaprolat, geflochten, resorbierbar
1,5 Metric
USP 4/0
75 cm
U
UP
UP
U
Ethicon® PDS II (Manufacturer Johnson+Johnson Intl.)
violett, Polydioxanon monofil, resorbierbar
0,5 Metric
USP 7/0
70 cm
U
UP
UP
3.8.3 Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere
Sämtliche Ratten wurden im Tierstall des Institutes untergebracht. Die zwei Kontrollgruppen zu je
5 Tieren in einem Makrolon® Käfig Typ IV, mit Überfalledelstahldeckel (Ebeco). Die gastrektomierten
P
P
Tiere einzeln in Makrolon® Käfigen Typ III mit Überfalledelstahldeckel (Ebeco). Die Einstreu bestand bei
P
P
allen Tieren aus Weichholzgranulat und Heuzugabe. Die operierten Tiere wurden 24h nach ihrem
Eingriff nüchtern gesetzt. Weitere 3-4 Tage wurde über restriktive Flüssignahrungszufuhr (in Wasser
aufgeweichte Pellets) gewährleistet, daß die Anastomose nicht mechanisch belastet wurde. Wasser
wurde ad libitum angeboten. Der Tierstall hatte eine Temperatur von 20 °C +/- 3 °C und eine relative
Luftfeuchtigkeit von 50% +/- 10%. Gefüttert wurden alle Tiergruppen mit pellettiertem „ssniff R+M
Haltungsfutter“ der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH. Die Kontrolltiere bekamen Futter ad libitum
abgeboten, die anderen Tiere 2-3 Gramm mehr als sie am Vortag gefressen hatten. Leitungswasser
wurde in Tränkeflaschen ad libitum angeboten. Der Lichtrhythmus bestand aus einer 12-stündigen
53
Hellphase, welche von 07.00 bis 19.00 Uhr dauerte. Bei den verwendeten Lampen handelte es sich um
Lumilux® PlusECO Tageslichtlampen der Firma Osram.
P
P
3.8.4 Beschreibung der Versuchsdurchführung
Die Studie wurde eine Woche nach Durchführung der Gastrektomie gestartet und dauerte 42 Tage. Es
gab zwei Kontrollgruppen mit je 5 Tieren im Alter von ~12 Wochen und ~26 Wochen. Weiter gab es
5 gastrektomierte Ratten im Alter von ~26 Wochen und 3 Tiere im Alter von ~12 Wochen.
Von jedem Tiere wurde täglich zur möglichst selben Tageszeit das Gewicht mit einer Haushaltswaage
(Wägebereich bis 2000 g) bestimmt. Mit derselben Waage wurde täglich zur selben Zeit die
aufgenommene Futtermenge der gastrektomierten Ratten bestimmt. Zusätzlich bekamen diese Tiere
14tägig eine subkutane Injektion (Technik siehe Abschnitt 3.6.3) mit 400 mg/kg Vitamin B12
B
B
(Injektopas®, Pascoe Pharmazeutische Präparate) und 20 mg/kg Eisen3+ (Laptovet P.I., Atarost GmbH
P
P
P
P
& Co.) zum Schutz vor der Entstehung einer Mangelanämie (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; 2002;
SURVE et al., 2001a). 10 Tage nach dem Eingriff wurden vorhandene Fäden entfernt. Am letzten Tag
der Studie wurden sämtliche Tiere einer Isofluraninhalationsnarkose (siehe unter 3.8.2) unterzogen zur
retrobulbären Blutentnahme. Von jedem Tier wurden ca. 2 ml Blut entnommen und aufgearbeitet (siehe
Abschnitt 3.6.4 und 3.7.4).
Die Tötung der Ratten erfolgte unter der Isoflurannarkose durch Dekapitation. Nach der Tötung wurden
sofort die Femura und Calvariae jeden Tieres grob freipräpariert und fixiert.
3.8.5 Präparation der Knochen
Materialentnahme
U
Die rechten Femura und Calvariae aller Tiere wurden unmittelbar nach der Tötung entsprechend dem
Abschnitt 3.7.7 entnommen. Die Fixierung des Femur mit der dazugehörigen Calvaria erfolgte in 50 ml
0,2%iger Pikrinsäure-Fixierlösung. In dieser wurden die Knochen bei 4 °C 4 Wochen gelagert und dann
einer weiteren Feinpräparation unterzogen.
54
Zusammensetzung der Fixationslösung (1 Liter Ansatz):
U
•0,2 M NaH2PO4 (Merck)
B
B
B
B
•0,2 M Na2HPO4 (Merck)
B
B
B
B
B
B
•60 ml 25% Paraformaldehyd (Bio Rad)
•60 ml 25% Glutaraldehyd EM Grade (AGAR Scientific LTD)
•0,2% Pikrinsäure (Fluka)
Bei der Feinpräparation wurden größere noch anhaftende Muskelreste und Sehnen mit einer kleinen
Schere unter Schonung der Knochenoberflächen und Gelenkflächen entfernt. Die fertig präparierten
Knochen wurden weiter in der pikrinsäurehaltigen Fixierlösung bei 4 °C gelagert.
3.8.6 Radiologische Untersuchung der Ossa femori und Calvariae
Vor der radiologischen Untersuchung wurden die Knochen 2 Tage in 70% Ethanol bei 4 °C gelagert, um
das Aldehyd herauszuwaschen. Das Röntgen selbst wurde entsprechend der Anleitung 3.7.8
durchgeführt. Die Knochen einer Gruppe wurden nebeneinander auf eine Korkunterlage gelegt. Auf
einem Film wurden die Femura und auf einem zweiten Film die Calvariae der Tiere dargestellt.
3.8.7 Dichtebestimmung nach dem Prinzip der Mohr-Waage
Die Dichte der Femura wurde nach Anleitung 3.7.9 ermittelt und berechnet. Insgesamt wurde die Dichte
4 mal bestimmt.
3.8.8 Transillumination der fixierten Calvariae
Die Durchleuchtung der 18 fixierten und trockenen Calvariae wurde entsprechend der Anleitung 3.7.10
durchgeführt.
3.8.9 Anfertigung von Dünnschliffen der Calvariae
Die Anfertigung der Dünnschliffe dient der Dickenmessung der Calvariae. Die Herstellung der
Knochenpräparate, Fixierung und Bearbeitung erfolgte entsprechend der Anleitung 3.7.11
55
3.8.10 Durchmesser der Calvariae
Die Bestimmung der Messpunkte am Schnitt wurde nach Anleitung 3.7.13 am selben Mikroskop
durchgeführt. Auch die Messung wurde entsprechend der Anleitung an dem selben Mikroskop
durchgeführt wie für die Ovarektomie-Studie.
3.8.11 Bestimmung von Serumparametern
Gesamtkalziumbestimmung
U
Das am letzten Tag der Studie gewonnene Rattenserum wurde entsprechend der Anleitung 3.6.4 und
3.7.4 behandelt und gelagert. Die Kalziumbestimmung ist nach Anleitung 3.7.14 durchgeführt worden.
3.9 Statistische Auswertung
Die Standardkurven zur Berechnung der Kalzium-II-konzentration in beiden Studien wurden mit Excel
2000 für Windows® 98 (Microsoft) erstellt. Sämtliche anderen Abbildungen, Graphiken und statistischen
P
P
Auswertungen wurden mit GraphPad Prism® 3.0 (GraphPad Software) für Windows® 98 (Microsoft)
P
P
P
P
anfertigt.
Bei Auswertung der Ovarektomie-Studie wurde in sämtlichen Balken und allen Liniendiagrammen für
jede
Untersuchungsgruppe
(n = 5;
Ausnahme
PTH-Gruppe
n = 4)der
Mittelwert
mit
Standardabweichung als doppelseitiger T-Balken dargestellt. Wenn die Standardabweichung nicht im
Liniendiagramm dargestellt wurde, so diente das der besseren Übersicht. Im dazugehörigen Text sind
die Werte der Standardabweichung angegeben. Für jeden untersuchten Parameter wurde eine
One-Way-Anova Varianzanalyse mit dem Dunnett`s Test durchgeführt.
Bei Auswertung der Gastrektomie-Studie wurde in sämtlichen Balken- und fast allen Liniendiagrammen
für jede Untersuchungsgruppe (n = 5; Ausnahme GX-II n = 3) der Mittelwert mit Standardabweichung
als doppelseitiger T-Balken angegeben. Wenn die Standardabweichung nicht im Liniendiagramm
dargestellt wurde, so diente das der besseren Übersicht. Im dazugehörigen Text sind die Werte der
Standardabweichung angegeben. Für jeden untersuchten Parameter wurde eine One-Way-Anova
Varianzanalyse mit dem Tukey Test durchgeführt. Die statistische Auswertung der Gewichtsverläufe
erfolgte mit dem Wilcoxon-t-Test.
56
Jede Abweichung in allen statistischen Auswertungen mit einem P < 0,05 wurde als signifikant gewertet
und im Ergebnisteil mit einem Sternchen über der entsprechenden Säule in dem Diagramm
gekennzeichnet. Entsprechend wurde ein P < 0,01 mit zwei und ein P < 0,001 mit drei Sternchen
gekennzeichnet.
In Tabelle 10 sind sämtliche Firmen mit ihren Standorten aufgelistet, von denen die in Kapitel 2
erwähnten und verwendeten Materialien stammten.
Tabelle 10: Firmenliste.
Firma
Aesculap
AGAR Scientific LTD
Atarost GmbH&Co.
B. Braun
Barnstead
Beckmann
Bio Rad
Bio Whittaker
Biochrom
Boehringer Mannheim
Christ GmbH
Corning Incorporated
Drägerwerk AG
Ebeco Becker&Co. GmbH
Fluka BioChemie AG
Föhr Medical Instruments GmbH
Gibco Invitrogen Corporation
Greiner Bio One GmbH
Harlan-Winkelmann GmbH
Heraeus-electronic
HLZ Logistik GmbH
Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica
mbH
IPF Pharmaceuticals GmbH
Johnson + Johnson Intl.
Kodak
Lilly
Memmert GmbH + Co. KG
Menzel Gläser
Merck KG
Millipore Corporation
Osteometer Bio Tech A/S
Pascoe Pharmazeutische Präparate GmbH
PerSeptive Biosystems
Pharmacia
Phillips
Roche Diagnostics GmbH
57
Standort
Tuttingen
Stansted
Twistingen
Melsungen
Bergisch Gladbach
Krefeld
Loughborough
Verviers
Berlin
Mannheim
Osterode
Cambridge
Lübeck
Castrop-Rauxel
Buch
Pohlheim
Karlsruhe
Kremsmünster
Borchen
Hanau
Gallin
Land
D
GB
D
D
D
D
GB
B
D
D
D
USA
D
D
CH
D
D
D
D
D
D
Flacht
D
Hannover
Brüssel
Stuttgart
Giessen
Schwabach
Braunschweig
Darmstadt
Bedford
Herlev Hovedgade
Giessen
Freiburg
Freiburg
Bochum
Mannheim
D
B
D
D
D
D
D
USA
DK
D
D
D
D
D
Rolf Greiner BioChemica
Roth GmbH
Sarstedt
Satorius
Schleicher&Schuell
SeitzSchenk Filtersystems GmbH
Serag
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Sigma Laborzentrifugen
ssniff Spezialdiäten GmbH
Toyo Kaisha
Verder GmbH
Waters
Zeiss
Flacht
Karlsruhe
Nümbrecht
Göttingen
Dassel
Bad Kreuznach
Wiessner
Taufkirchen
Osterode
Soest
Tokyo
Düsseldorf
Milford
Oberkochen
58
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
J
D
USA
D
4. Ergebnisse
Zuerst werden die chromatographischen Aufreinigungsschritte mit der Identifizierung von osteoanabolen
Aktivitäten in vitro dargestellt. Aus Vorversuchen der IPF PharmaCeuticals GmbH, die nicht Inhalt dieser
Arbeit sind, war bekannt, daß osteoanabole Fraktionen im Durchlauf der IEC nachweisbar waren und
bei einem Anteil von ca. 40-50% Puffer B von einer RP-C18-Säule eluierten. Es wurde davon
ausgegangen, daß es sich hierbei um die als Gastrokalzin postulierte Substanz handeln könnte. Eine
nähere Charakterisierung von aktiven Fraktionen erfolgte durch den Subtilisinverdau und durch eine
Hemmung der Aktivität mit den Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston.
Im Anschluß werden die Ergebnisse der Ovarektomie-Studie und zum Schluß die der
Gastrektomie-Studie dargestellt.
4.1 Identifizierung und Aufreinigung osteoanaboler Aktivitäten aus Schweinemagenschleimhaut
Von 103 Schweinemägen wurde die Fundusschleimhaut abpräpariert und aus der gewonnenen
Gewebemasse die Peptide extrahiert (siehe Abschnitt 3.1). Der 50 und 10 kDalton ultrafiltrierte
Fundusschleimhautextrakt wurde auf einer präparativen RPC-Säule (PrepPak® Kartusche, Vydac™
P
P
C18) chromatographisch aufgetrennt.
ROS-17/2.8 Zellen (siehe 3.4.3 bis 3.4.5) wurden mit den Fraktionen (Fr.) 6-38 des RPC-Laufes in einer
Konzentration von 0,1; 0,2 und 0,4 ml Magenäquivalent/ml (Mäq/ml) stimuliert. Als Positivkontrolle
wurden 10 nM Dexamethason eingesetzt. Durch Messung der alkalischen-Phosphatase-Aktivität und
der Zellvitalität (WST-1) wurden osteoanabole Fraktionen identifiziert.
Im Chromatogramm (Abb. 6) wurde die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase bei einer
Konzentration von 0,2 Mäq/ml als Meßwerte der OD bei 405 nm dargestellt.
59
Absorption (280 nm)
100
80
Fr.33
10
40
20
2
0
% Puffer B
60
1
20
30
40
50
1= Positivkontrolle
10 nM Dexamethason
2= Negativkontrolle/Leerwert
0
60
70
Zeit [min]
Abb. 6: Darstellung des Chromatogrammes des ultrafiltrierten Schweinemagenextraktes auf einer präparativen RPC-Säule
(PrepPak® Kartusche, Vydac™ C18) mit dem Aktivitätsprofil der alkalischen Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach
P
P
Stimulierung mit den Fraktion 6-38 in einer Konzentration von 0,2 Mäq/ml.
Der WST-1 Wert von Fraktion 33 (OD: 0,715 ± 0,022 ) zeigte eine 11,4%ige Erniedrigung gegenüber
der Negativkontrolle (OD: 0,807 ± 0,02 ).
Von der Fraktion 33 wurden Aliquots für die Ovarektomie-Studie entnommen (siehe Abschnitt 3.3.3) und
lyophilisiert.
4.2 Identifizierung und Aufreinigung osteoanaboler Aktivitäten aus humanem Hämofiltrat
Die chromatographische Aufreinigung von 420 Litern Hämofiltrat erfolgte in drei aufeinanderfolgenden
Aufreinigungsschritten. Vom ersten präparativen IEC-Lauf (Amicon®, Vantage VA 250) wurde der
P
P
Durchlauf (1350 L) weiter auf einer präparativen FineLine Source 15RPC Säule aufgereinigt (siehe
Abschnitt 3.3.4).
Knochenmarkstammzellen von Ratten (siehe 3.4.2, 3.4.4 und 3.4.5) wurden mit den Fr. 19-41 des
FineLine-Laufes in einer Konzentration von 200 ml HF/ml behandelt. Als Positivkontrolle wurden 10 nM
Dexamethason eingesetzt. Durch Messung der alkalischen-Phosphatase-Aktivität und der Zellvitalität
(WST-1) wurden osteoanabole Fraktionen identifiziert.
60
Im Chromatogramm (Abb. 7) ist erneut die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase bei einer
Konzentration von 200 ml HF/ml als Meßwerte der OD bei 405 nm dargestellt.
80
1
60
*
Fr. 31+32
40
2
% Puffer B
Absorption (280 nm)
100
20
*
*
0
10
20
30
40
50
1= Positivkontrolle
10 nM Dexamethason
2= Negativkontrolle/Leerwert
60
0
70
80
90
Zeit [min]
Abb. 7: Darstellung des 2. chromatographischen Aufreinigungsschrittes von Hämofiltrat mit einer präparativen FineLine
Source 15RPC Säule und dem Aktivitätsprofil der alkalischen Phosphatase von Knochenmarkstammzellen nach Stimulation
mit den Fraktionen 19-41 in einer Konzentration von 200 ml HF/ml.
Der WST-1 Wert von Fr. 31 (OD: 0,168 ± 0,001 ) zeigte gegenüber dem Negativkontrollwert (OD:
0,276 ± 0,062 ) eine Erniedrigung um 39,1%, der von Fr. 32 (0,185 ± 0,015 ) eine Erniedrigung um
33%. Der Bereich von Fraktion 30 bis 40 wurde für die weitere RPC-Aufarbeitung verwendet. Er ist in
Abb.7 durch zwei Sternchen gekennzeichnet.
Der für die Ovarektomie-Studie letzte Chromatographieschritt wurde auf einer präparativen RPC Säule
(PrepPak® Kartusche, Vydac™ C18) durchgeführt. Von diesem Lauf wurden die Fraktionen 10-44 in
P
P
einer Menge von 200 ml HL/ml auf Knochenmarkstammzellen von Ratten (siehe 3.4.2, 3.4.4 und 3.4.5)
getestet. Als Positivkontrolle wurden 10 nM Dexamethason eingesetzt. Durch Messung der
alkalischen-Phosphatase-Aktivität und der Zellvitalität (WST-1) wurden aktive Fraktionen identifiziert. Im
Chromatogramm (Abb. 8) wurden die Meßwerte der OD bei 405 nm repräsentativ für die Enzymaktivität
der alkalischen Phosphatase dargestellt.
61
Absorption (280 nm)
100
80
40
1
Fr.32
2
0
10
% Puffer B
60
20
20
30
40
50
1= Positivkontrolle
10 nM Dexamethason
2= Negativkontrolle/Leerwert
0
60
70
Zeit [min]
Abb. 8: Darstellung des 3. chromatographischen Aufreinigungsschrittes von Hämofiltrat mit einer präparativen C18 Vydac®
P
P
Kartusche und dem Aktivitätsprofil der alkalischen Phosphatase von Knochenmarkstammzellen nach 8tägiger Inkubation mit
den Fraktion 10-44 in einer Konzentration von 200 ml HF/ml.
Der WST-1 Wert der Fraktion 32 (OD: 0,392 ± 0,023 ) zeigte eine Erhöhung gegenüber der
Negativkontrolle (OD: 0,315 ± 0,022 ) um 24,4%. Von der Fraktion 32 wurden Aliquots für die
Ovarektomie-Studie entnommen (siehe 3.3.4) und lyophilisiert.
4.3 Enzymatische Subtilisinhydrolyse
Fraktion 33 aus Fundusschleimhaut und Fraktion 32 aus Hämofiltrat wurden zur näheren
Charakterisierung einer enzymatischen Hydrolyse mit Subtilisin unterzogen (siehe Abschnitt 3.5). Nach
dem „Verdau“ wurden ROS-17/2.8 Zellen mit den Fraktionen erneut stimuliert. Der Nachweis der
Aktivität erfolgte durch Messung der alkalischen Phosphatase und der Zellvitalität (WST-1).
62
3.5
0.8
OD 450-630 nm
OD 405 nm
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.6
0.4
0.2
1
2
3
4
1
2
3
4
Fr. 33 0.1 Mäq/ml
Fr. 33 0.2 Mäq/ml
Fraktion 33 + Verdaupuffer + Subtilisin
Fraktion 33 + Verdaupuffer
Verdaupuffer + Trypsin
Fraktion 33 + Verdaupuffer ohne Inkubation
Blank
10 nM Dexa
Fr. 32 40 ml HFLäq/ml
1=
2=
3=
4=
0.0
1
2
3
4
1
2
3
4
Fr. 33 0.1 Mäq/ml
Fr. 33 0.2 Mäq/ml
0.0
Blank
10 nM Dexa
Fr. 32 40 ml HFLäq/ml
0.5
Abb. 9: Links sieht man die Darstellung des Aktivitätsprofils der alkalischen Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach
4tägiger Inkubation mit der subtilisinverdauten Fraktion 33 aus Fundusschleimhaut. Rechts sieht man die Darstellung der
dazugehörigen Zellvitalität (WST-1) der ROS-17/2.8 Zellen. Als Positivkontrollen wurden 10 nM Dexamethason, 400 ml
HF/ml der Fraktion 32 und 0,1 sowie 0,2 Mäq/ml der Fraktion 33 eingesetzt.
3.5
0.8
OD 450-630 nm
OD 405 nm
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.6
0.4
0.2
1= Fraktion 32 + Verdaupuffer + Subtilisin
2= Fraktion 32 + Verdaupuffer
3= Verdaupuffer + Trypsin
4= Fraktion 32 + Verdaupuffer ohne Inkubation
1
2
3
4
1
2
3
4
Blank
10 nM Dexa
400 ml HF/ml Fr.32
800 ml HF/ml Fr.32
0.0
1
2
3
4
1
2
3
4
0.0
Blank
10 nM Dexa
400 ml HF/ml Fr.32
800 ml HF/ml Fr.32
0.5
Abb. 10: Links sieht man die Darstellung des Aktivitätsprofils der alkalischen Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach
4tägiger Inkubation mit der subtilisinverdauten Fraktion 32 aus Hämofiltrat. Rechts ist die dazugehörige Zellvitalität (WST-1)
der ROS-17/2.8 Zellen dargestellt. Als Positivkontrollen wurden 10 nM Dexamethason und 400 sowie 800 ml HF/ml der
Fraktion 32 eingesetzt.
Keine der beiden Fraktionen ließ sich mit Subtilisin verdauen. Beide zeigten erneut eine stimulierende
Wirkung auf die Differenzierung der ROS-17/2.8 Zellen.
63
4.4 Hemmung der Aktivitäten mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston
Da die Aktivität von Fraktion 32 und 33 sich nicht mit der Protease Subtilisin verdauen ließen, wurde
überprüft, ob sich die stimulierende Wirkung mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston
(siehe Abschnitt 3.4.6) hemmen ließen. Beide Fraktionen zeigten mit Mifepriston keine Aktivität auf
ROS-17/2.8 Zellen mehr.
0.4
OD 450-630 nm
OD 405 nm
1.5
1.0
0.5
0.3
0.2
Mifepriston +Fr.32
400 ml HF/ml Fr.32
10 nM Dexa
Mifepriston + Dexa
0.0
Blank
Mifepriston + Fr.32
400 ml HF/ml Fr.32
10 nM Dexa
Mifepriston + Dexa
0.0
Blank
0.1
Abb. 11: Links ist die Hemmung der Aktivität von Fraktion 32 durch Mifepriston auf ROS-17/2.8 Zellen dargestellt. Rechts
sind die dazugehörigen Werte der Zellvitalität (WST-1) abgebildet.
64
1.0
3.5
3.0
0.8
OD 450-630 nm
OD 405 nm
2.5
2.0
1.5
0.6
0.4
1.0
0.2
Mifepriston + Fr.33
0.2 Mäq/ml Fr. 33
Mifepriston + Dexa
10 nM Dexa
0.0
Blank
Mifepriston + Fr.33
0.2 Mäq/ml Fr. 33
Mifepriston + Dexa
10 nM Dexa
0.0
Blank
0.5
Abb. 12: Links ist die Hemmung der Aktivität von Fraktion 33 durch Mifepriston mit ROS-17/2.8 Zellen dargestellt. Rechts
sind die dazugehörigen Werte der Zellvitalität (WST-1) zu sehen.
Es konnte gezeigt werden, daß die Fraktion 33 aus dem Schweinemagenextrakt kleiner als 10 kDalton
sein mußte, da eine 10 kDalton Ultrafiltration durchgeführt wurde. Weiter ließ sich diese in vitro aktive
Fraktion nicht mit Subtilisin hydrolisieren, aber durch Mifepriston hemmen. Die Fraktion eluierte bei
einem Prozentanteil von 46% Puffer B von der C18-Säule. Ähnlich verhielt sich Fraktion 32 aus
Hämofiltrat. Sie eluierte bei ca. 49 % Puffer B von der C18-Säule, ließ sich nicht mit Subtilisin verdauen,
aber ebenfalls durch Mifepriston hemmen.
Es folgte eine Aufreinigung dieser beiden Fraktionen aus einer Gesamsmasse von 1290 kg
Schweinemagen und 10000 L Hämofiltrat durch die IPF PharmaCeuticals GmbH. In der aufgereingten
Fraktion 33 konnte mittels ESI-Massenspektrometrie eine molekulare Masse von 363,2 Dalton detektiert
werden. Eine weitere Strukturaufklärung durch Fragmentierung mit MS/MS ergab, daß es sich um das
Glukokortikoid Hydrokortison handelte.
Die aufgereinigte Fraktion 32 zeigte im ESI-Massenspektrum zwei molekulare Massen. Eine mit 363,2
und eine mit 361,1 Dalton. Die Strukturaufklärung durch Fragmentierung der 363.2 Dalton-Masse
mittels MS/MS ergab, daß es sich hierbei ebenfalls um Hydrokortison handelte. Die 361,1 Dalton-Masse
wurde mit Hilfe von NMR-Spektrometrie aufgeklärt. Es handelte sich hierbei um das synthetische
Glukokortikoid Prednisolon.
65
4.5 Dosisabhängigkeit von Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon auf ROS-17/2.8
B
B
Zellen
Die Wirkungen von Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon wurde in den Konzentrationen
B
B
1 µM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM und 0,1 nM auf ROS-17/2.8 Zellen getestet. Die Auswertung
erfolgte durch Messung der alkalischen-Phophatase-Aktivität (Abschnitt 3.4.6).
4
OD 405 nm
3
Prednisolon
Hydrokortison
E2
Dexamethason
2
1
0
-1
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
log c (µM/ml)
Abb. 13: Dosisabhängigkeit der Substanzen Dexamethason, E2, Hydrokortison und Prednisolon auf ROS-17/2.8 Zellen.
B
B
Die Stimulation der ROS-17/2.8 Zellen ergab eine dosisabhängige Zunahme der Aktivität der
alkalischen Phosphatase durch Gabe von Dexamethason, Hydrokortison oder Prednisolon. Hierbei
zeigten Hydrokortison und Prednisolon einen fast identischen Verlauf, während Dexamethason schon in
geringerer Konzentration wirksam war. Im Gegensatz zu diesen 3 Substanzen zeigte E2 keine Wirkung
B
B
(Abb. 13).
4.6 Auswertung der Ovarektomie-Studie
Die genaue Gruppeneinteilung und der Versuchsablauf ist dem Abschnitt 3.7.1 zu entnehmen. An ihr
nahmen 8 Gruppen mit je 5 Tieren teil (jede Abbildung n = 5; Ausnahme PTH-Gruppe n = 4), denen
unterschiedliche Substanzen über eine Dauer von 60 Tagen injiziert wurden.
66
4.6.1 Verlauf der Körpergewichte während der Studie
Die Körpergewichte wurden von sämtlichen Ratten im regelmäßigen Abstand von 7 Tagen bestimmt.
400
OVX NaCl
OVX PTH
OVX E2
375
OVX Fr.33
OVX Fr.32
OVX Fr.32+
Gewicht (g)
350
325
300
275
250
Sham NaCl
Sham Fr.33
225
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
Zeit (Tage)
Abb. 14: Körpergewichtsentwicklung während der Ovarektomie-Studie von den Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCl und der mit
PTH, E2, Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei Dosierungen behandelten ovarektomierten und sham-operierten Tieren.
B
B
Sämtliche Gruppen wiesen einen ähnlichen Gewichtsverlauf auf, da sie über den gesamten Zeitraum
des Versuches stetig an Gewicht zugenommen hatten. Es konnte gezeigt werden, daß die Tiere der
ovarektomierten Gruppen signifikant mehr wogen als die sham-operierten Tiere (Abb. 14).
Die beiden Gruppen mit den sham-operierten Tieren unterschieden sich kaum voneinander und hatten
von Beginn (Sham-33: 252 ± 4,3 g; Sham-NaCl: 249,6 ± 7,6 g) bis zum Ende (Sham-33: 282,6 ± 9,5 g;
Sham-NaCl: 278,6 ± 10,6 g) ein ähnliches Gewicht.
Der Vergleich zwischen den beiden NaCl-Gruppen zeigte, daß die Ovarektomie zu einer signifikanten
(P < 0,001) Zunahme des Gewichtes führte. Am letzten Tag der Studie wogen die ovarektomierten
Tiere (329,2 ± 23,7 g) 17,9 % mehr als die sham-operierten (278,6 ± 10,6 g) Ratten.
Die Behandlung mit E2 bewirkte eine signifikante (P < 0,05) Abnahme um 5,2%, (312,2 ± 18,4 g) die
B
B
Behandlung mit PTH eine signifikante (P < 0,001) Zunahme des Gewichtes um 11,3% (366,5 ± 22,2 g)
im Vergleich mit der Kontrollgruppe OVX NaCl (329,2 ± 23,7 g) bis zum 62. Tag. Fraktion 33
(350,4 ± 27,8 g) und Fraktion 32 in den zwei Dosierungen (342 ± 19,9 und 341 ± 25,3 g) konnten eine
nicht-signifikante Zunahme des Gewichtes gegenüber der Kontrollgruppe (329,2 ± 23,7 g) erzielen.
67
4.6.2 Beschreibung der radiologischen Untersuchung
Radiologische Untersuchung der Ratten am 23. Tag der Studie
U
Von vier Tieren jeder Gruppe (ein Tier aus jeder Gruppe ließ sich nicht anästhesieren), wurde eine
Röntgenaufnahme in gestreckter Bauchlage bei dorso-ventralen Strahlengang angefertigt. Die
Beurteilung der Knochenstrukturen hinsichtlich pathologischer Veränderungen zwischen den einzelnen
Gruppen ergab keine besonderen Befunde.
Radiologische Beurteilung der präparierten Femura
U
Zur Auswertung der radiologischen Befunde am Femur, nach Tötung der Tiere und Präparation der
Knochen, wurde die Gruppe Sham-NaCl als physiologische Kontrollgruppe bewertet. Beurteilt wurden
die Röntgendichte der Substantia kompakta im Bereich der Femurdiaphyse (oberer Pfeil in Abb. 15 und
19) und die Röntgendichte im Bereich der Facies poplitea (unterer Pfeil in Abb. 15 und 19). Die Femura
der Sham-Tiere erhielten auf ihre Röntgendichte in den beiden oben genannten Bereichen ++ als
physiologische Bewertung. Des besseren Vergleichs wegen sind sie in Tabelle 11 noch mal mit
aufgeführt.
Tabelle 11: Beurteilung der Röntgendichte im Bereich der Substantia kompakta und der Facies poplitea am Femur unter der
Wirkung von NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und der Fraktion 32 in zwei Dosierungen bei sham-operierten und ovarektomierten
Ratten.
B
B
Gruppen
Röntgendichte Kompakta
Röntgendichte
Facies poplitea
Sham NaCl
++
++
OVX NaCl
++
+
OVX PTH
+++
+++
OVX E2
+
+
Sham Fr. 33
++
++
OVX Fr. 33
++
++
OVX Fr. 32
+++
+++
OVX Fr. 32 +
++
++
B
B
+ = Röntgendichte ist geringer
++
= Röntgendichte ist gleich
+++
= Röntgendichte ist höher
Zwischen den sham-operierten Gruppen waren keine Unterschiede zu erkennen (Abb. 14 und 18).
Der Ovarektomie folgte eine Verminderung der Röntgendichte im Bereich der Facies poplitea im
Vergleich mit der Kontrollgruppe Sham-NaCl (Abb. 15 und 16).
68
Bei den ovarektomierten Ratten bewirkte die Behandlung mit PTH und Fr. 32 in der niedrigen Dosierung
in beiden Bereichen eine Zunahme der Röntgendichte (Abb. 16, 17 und 21). Die Behandlung mit
E2 zeigte in beiden Regionen eine Abnahme der Röntgendichte in Bezug auf die Kontrollgruppe
B
B
OVX-NaCl (Abb. 16 und 18). Der Gabe von Fr. 32 in der hohen Dosis folgte kein Unterschied im
Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 16, und 23).
In den nachfolgenden Abbildungen 15-18 sind zwei Röntgen- und Negativbilder eines Femurs von zwei
Tieren der Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCl, OVX-PTH und OVX-E2 dargestellt.
B
Abb. 15:
Sham-NaCl
Abb. 16:
OVX-NaCl
Abb. 17:
OVX-PTH
B
Abb. 18:
OVX-E2
B
B
In den nachfolgenden Abbildungen 19-22 sind zwei Röntgen- und Negativbilder eines Femurs von zwei
Tieren der Gruppen Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 33, OVX-Fr. 32 und OVX-Fr. 32+ dargestellt.
69
Abb. 19:
Sham-Fr.33
Abb. 20:
OVX-Fr.33
Abb. 22:
OVX-Fr.32+
Abb. 21:
OVX-Fr.32
4.6.3 Betrachtung der Femurdichte
Die Femurdichte ρ20° (g/ml) eines Femur pro Tier wurde nach dem Prinzip der Mohr-Waage ermittelt.
B
B
Die Femura wurden dafür bis zur Gewichtskonstanz bei 120 °C getrocknet (Trockenschrank Memmert
GmbH + Co KG).
Die beiden Sham-Gruppen zeigten kaum einen Unterschied (Sham-33: 1,53 ± 0,04 g/ml;
Sham-NaCl: 1,51 ± 0,05 g/ml) zwischen ihren Femurdichten.
Der Ovarektomie (1,47 ± 0,05 g/ml) folgte eine geringe nicht-signifikante Verminderung (9,5%) der
Femurdichte gegenüber den sham-operierten Ratten (1,51 ± 0,05 g/ml).
Die Behandlung mit PTH (1,67 ± 0,04 g/ml) führte zu einer signifikanten Steigerung der Femurdichte um
13,6% im Gegensatz zur Kontrollgruppe (1,47 ± 0,05 g/ml). Weder E2 (1,43 ± 0,04 g/ml) noch Fr. 33
B
B
(1,41 ± 0,05 g/ml) oder Fr. 32 in unterschiedlichen Konzentrationen (1,39 ± 0,02 g/ml und
1,39 ± 0,02 g/ml) konnten die Femurdichte erhöhen. Die Applikation dieser 3 Substanzen führte zu
einer geringgradigen nicht-signifikanten Erniedrigung der Femurdichte (Abb. 23).
70
**
Dichte (g/ml)
1.75
1.50
Fr
.3
2+
VX
O
O
VX
Fr
.3
2
Fr
.3
3
O
VX
Fr
.3
3
E
Sh
am
O
O
VX
PT
VX
2
H
l
aC
N
VX
O
Sh
am
N
aC
l
1.25
Abb. 23: Einfluß von NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei verschiedenen Dosierungen auf die Femurdichte
B
B
bei ovarektomierten und sham-operierten Ratten.
4.6.4 Transillumination der Calvariae
Bei einer Gastrektomie-Osteopenie werden Veränderungen an den Calvariae als charakteristisches
Merkmal beurteilt (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002a; SURVE et al., 2001a, b). Sie stellen sich bei
der Transillumination als lichtundurchlässige Bereiche dar.
Zwei Tiere der Gruppe, die mit der hohen Dosis von Fr. 32 behandelt wurden zeigten an ihren Calvariae
die charakteristischen lichtundurchlässigen Bereiche.Alle anderen Tiere zeigten an ihren Calvariae
keine besonderen Unterschiede, die auf pathologische Veränderungen schließen ließen.
4.6.5 Fluoreszenzmikroskopie der Femurdünnschliffe
Die
Bewertung
des
Knochen-Turnovers
ist
anhand
von
Tetrazyklin/Kalzein
markierten
Knochenschnitten möglich. Deswegen hatten die Ratten am 49. Tag eine Tetrazyklin- und am 56. Tag
eine Kalzeininjektion erhalten. Die Beurteilung des Knochen-Turnovers in dieser Studie konnte nur den
Zustand zwischen dem 49. und 56. Tag widerspiegeln.
71
Bei den Sham-Gruppen bewirkte die Behandlung mit Fr. 33 eine geringfügige nicht signifikante
Abnahme (Sham-33: 9,5 ± 1,0 µm; Sham-NaCl: 11,7 ± 1,8 µm) des Fluoreszenzbandenabstandes
(Abb. 24).
Der Vergleich zwischen Sham-Eingriff und Ovarektomie zeigte eine geringfügige nicht signifikante
15,4%ige Abnahme (OVX-NaCl: 9,9 ± 1,9 µm; Sham-NaCl: 11,7 ± 1,8 µm) des Abstandes bei den
ovarektomierten Tieren.
Zu einem nicht signifikanten Anstieg führten die Behandlungen mit PTH (12,8 ± 1,8 µm), Fr. 33
(11,4 ± 3,9 µm) und Fr. 32 (10,5 ± 2,5 µm). Die hohe Dosis der Fr. 32 verursachte ebenfalls eine nicht
signifikante Abnahme des Abstandes im Vergleich zur Kontrollgruppe (9,9 ± 1,9 µm). E2 (9,9 ± 1,3 µm)
B
B
zeigte keine Wirkung (Abb. 24).
Fluoreszenzbandenabstand (µm)
16
14
12
10
8
6
4
.3
2+
.3
2
O
VX
Fr
Fr
VX
O
O
VX
Fr
Fr
.3
3
.3
3
2
E
Sh
am
VX
O
PT
H
VX
O
XV
O
Sh
am
N
N
aC
aC
L
l
2
Abb. 24: Darstellung des Abstandes zwischen den Fluoreszenzbanden als Spiegel des Knochen-Turnovers unter Einfluß
von NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei verschiedenen Dosierungen bei ovarektomierten und shamB
B
operierten Ratten.
4.6.6 Messung des Calvariendurchmessers
Der Durchmesser der Calvariae wurde an fixierten Dünnschliff-Präparaten gemessen.
Die Injektion von Fr. 33 bewirkte eine nicht signifikante Zunahme des Durchmessers bei den
sham-operierten Ratten (Sham-33: 480,2 ± 69,35 µm; Sham-NaCl: 395 ± 59 µm, Abb. 25).
Auch die Ovarektomie führte generell nicht zu einer signifikanten Zunahme des Calvariendurchmessers
(Abb. 25; OVX-NaCl: 471,2 ± 69,35 µm; Sham-NaCl: 395 ± 59 µm). Der PTH Applikation folgte eine
72
stärkere nicht signifikante Zunahme (16,5%; 549 ± 36,3 µm) des Durchmessers als bei Fr. 33 (8,4%;
511,2 ± 57,6 µm) im Vergleich zur Kontrollgruppe (471,2 ± 19,5 µm). Die Behandlungen mit Fr. 32 in
zwei Konzentrationen (492,8 ± 81,5 µm und 473 ± 51,9 µm ) hatten kaum Auswirkungen auf die
Knochendicke (Kontrolle 471,2 ± 19,5 µm) und E2 zeigte eine geringe nicht signifikante Abnahme
B
B
(4,2%; 451,4 ± 23,4 µm) der Calvarienstärke (Abb. 25).
Calvariendurchmesser (µm)
700
650
600
550
500
450
400
350
Fr
VX
O
O
VX
Fr
.3
2+
.3
2
.3
3
O
VX
Fr
Fr
.3
3
2
E
Sh
am
VX
O
PT
H
VX
O
N
XV
O
Sh
am
N
aC
aC
l
L
300
Abb. 25: Der Durchmesser der Calvariae in Abhängigkeit von Ovarektomie, sham-Eingriffen und der Behandlung mit NaCl,
PTH, E2, Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei Dosierungen.
B
B
4.6.7 Auswertung der Serumparameter
Bestimmung des Gesamtkalziumgehaltes in Rattenserum
U
Bei jedem Tier wurde in den Serumproben der Geamtkalziumgehalt bestimmt (siehe Abschnitt 3.7.14).
Der physiologische Gesamtkalziumserumgehalt bei Ratten liegt zwischen 9,6 – 11,0 mg/dl (MATSUDA
et al., 2000) und ist in den Abbildungen 26, 27 und 28 durch zwei schwarze Linien gekennzeichnet. Die
initialen Werte von allen Gruppen der Studie lagen im physiologischen Bereich (Abb. 26 und 27). In der
ersten Woche erfuhren fast alle Gruppen (außer Sham-NaCl und OVX-Fr. 32+) einen Anstieg der Werte
innerhalb des Normbereiches. In der zweiten Woche sanken die Werte sämtlicher Gruppen zum Teil bis
unter die Normgrenze (Abb. 26 und 27). Im weiteren Verlauf stiegen erneut alle Werte bis zum 35. Tag
an, und sanken in den letzten 2 Wochen wieder ab (Abb. 26 und 27). Eine Ausnahme bildeten die
Werte der OVX-NaCL-Gruppe am 21. Tag und die der Gruppen Sham-NaCl und OVX-E2 am 35. Tag.
B
73
B
Am 49. Tag der Studie lagen fast alle Werte (Ausnahme Gruppe Sham Fr. 33) im physiologischen
Bereich (siehe Abb. 28).
Gesamtkalzium (mg/dl)
12
Sham NaCl
OVX NaCl
Sham Fr.33
11
10
9
0
7
14
21
28
35
42
49
Zeit (Tage)
Abb. 26: Verlauf des Gesamtkalziums im Serum während der Ovarektomie-Studie der Gruppen Sham und OVX-NaCl und in
der Gruppe Sham-Fr. 33.
Gesamtkalzium (mg/dl)
12
OVX Fr.33
OVX Fr.32
OVX Fr.32+
OVX NaCl
OVX PTH
OVX E2
11
10
9
0
7
14
21
28
35
42
49
Zeit (Tage)
Abb. 27: Verlauf des Gesamtkalziums im Serum während der Ovarektomie-Studie der Gruppen NaCl, PTH, E2, Fraktion 33
B
und Fraktion 32 in zwei Konzentrationen bei ovarektomierten Ratten.
74
B
Gesamtkalzium (mg/dl)
13
12
*
11
10
9
2+
Fr
.3
.3
2
VX
O
O
O
VX
Fr
.3
3
VX
Fr
.3
3
Fr
Sh
am
O
VX
E
2
PT
H
O
VX
VX
O
Sh
am
N
N
aC
aC
l
l
8
Abb. 28: Die Gesamtkalziumspiegel-I im Serum der Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCL, OVX-PTH, OVX-E2, OVX-Fr. 33,
B
B
Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 32 und OVX-Fr. 32+ am 49. Tag der Ovarektomie-Studie.
Unter den sham-operierten Tieren führte die Applikation von Fraktion 33 zu einem nicht signifikanten
Anstieg des Kalziumwertes um 2,7% (Sham-33: 10,1 ± 0,08 mg/dl; Sham-NaCl: 10,9 ± 0,22 mg/dl). So
zeigte die Sham Fr. 33-Gruppe eine geringgradige Hyperkalzämie.
Zwischen den Kontrollgruppen führte die Ovarektomie (10,1 ± 0,08 mg/dl) nach 49 Versuchstagen im
Vergleich zu den sham-operierten Tieren (10,9 ± 0,22 mg/dl) zu einem nicht signifikanten Abfall der
Kalziumwerte im physiologischen Bereich.
Der Behandlung mit PTH (10 ± 0,22 mg/dl) und mit Fr. 32+ (10,2 ± 0,13 mg/dl) folgte kaum eine
Änderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe (10,1 ± 0,08 mg/dl). E2 (10,9 ± 0,21 mg/dl) führte zu einem
B
signifikanten
Anstieg,
Fr. 33
(9,9 ± 0,33 mg/dl)
und
B
Fr. 32
(9,6 ± 0,09 mg/dl)
zu
einem
nicht signifikanten Abfall der Kalziumwerte. Die der Gruppe Fr. 32 lagen geringfügig unterhalb des
Referenzbereiches.
Gesamtkalziumwerte an Tag 49 mit der Kalzium II- Methode
U
Die Messung des Gesamtkalziumgehaltes wurde mit einem anderen Test durchgeführt (siehe Abschnitt
3.7.14 Gesamtkalziumbestimmung II).
75
Standardkurve zur Gesamtkalziumbestimmung
Gesamtkalzium (mg/dl)
14
12
4
3
2
y = -285,74x + 351,77x - 123,63x + 29,539x
10
8
6
4
2
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
OD (570nm)
MW - Reagenzleerwert
Polynomisch (MW - Reagenzleerwert)
Abb. 29: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte der Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCl, OVX-E2 und
B
B
OVX-PTH.
Standardkurve zur Gesamtkalziumbestimmung
Gesamtkalzium (mg/dl)
14
12
3
2
y = -15.532x + 12.398x + 15.123x
10
8
6
4
2
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
OD (570nm)
MW - Reagenzleerwert
Polynomisch (MW - Reagenzleerwert)
Abb. 30: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte der Gruppen Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 33, OVX Fr. 32 und
OVX-Fr. 32+.
76
13
Gesamtkalzium (mg/dl)
12
11
*
**
10
**
9
8
Fr
.3
2+
VX
O
O
VX
Fr
.3
2
Fr
.3
3
O
VX
Fr
.3
3
2
E
VX
O
Sh
am
O
VX
PT
H
N
aC
l
VX
O
Sh
am
N
aC
l
7
Abb. 31: Die Gesamtkalziumspiegel-II im Serum der Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCL, OVX-PTH, OVX-E2, OVX-Fr. 33,
B
B
Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 32 und OVX-Fr. 32+ am 49. Tag der Ovarektomie-Studie.
Mit dieser Methode ergab sich für den 49. Tag der Studie ein etwas anderes Bild der
Serumkalziumspiegel als bei der Methode-I (Abb. 28).
Unter den sham-operierten Tieren folgte der Applikation von Fraktion 33 ein nicht signifikantes Sinken
des Kalziumwertes um 10,4% (Sham-33: 10,3 ± 0,15 mg/dl; Sham-NaCl: 11,5 ± 0,44 mg/dl). Die
Sham-Kontrollgruppe zeigte eine geringgradige Hyperkalzämie.
Auch mit dieser Methode konnte bei der OVX-NaCl-Gruppe (10,9 ± 0,09 mg/dl) im Vergleich zur Sham
NaCl-Gruppe (11,5 ± 0,44 mg/dl) kein auffälliger Abfall der Kalziumwerte nachgewiesen werden. E2
B
B
(11,6 ± 0,08 mg/dl) zeigte auch hier einen Anstieg der Werte, der nicht signifikant war, aber bis über
den Normbereich ging. PTH (10,4 ± 0,5 mg/dl) zeigte ein geringfügiges nicht signifikantes Sinken,
während Fr. 33 (9,5 ± 0,24 mg/dl) und Fr. 32 in beiden Dosierungen (9,8 ± 0,29 mg/dl und
9,6 ± 0,18 mg/dl) einen signifikanten Abfall der Kalziumwerte (Kontrolle 10,9 ± 0,09 mg/dl) bewirkten.
Bestimmung von Osteokalzin
U
Osteokalzin als Marker zur Anzeige der Osteoblastenaktivität wurde mittels Rat-MID-ELISA
(Osteometer Bio Tech A/S) siehe Abschnitt 3.7.14 bestimmt.
77
500
Sham NaCl
OVX NaCl
Sham Fr.33
Osteokalzin (ng/ml)
400
300
200
100
0
0
7
14
30
37
44
Zeit (Tage)
Abb. 32: Verlauf des Serumosteokalzinspiegels während der Ovarektomie-Studie in den Gruppen Sham- und OVX-NaCl
und in der Gruppe Sham Fraktion 33.
700
OVC NaCL
OVX PTH
OVX E2
Osteokalzin (ng/ml)
600
OVX Fr.33
OVX Fr.32
OVX Fr.32+
500
400
300
200
100
0
0
7
14
30
37
44
Zeit (Tage)
Abb.33: Verlauf des Serumosteokalzinspiegels während der Ovarektomie-Studie in den Gruppen NaCl, PTH, E2, Fraktion 33
B
B
und Fraktion 32 in zwei Konzentrationen.
Die Osteokalzinspiegel der beiden Sham-Gruppen unterschieden sich nur unwesentlich. Die initialen
Werte
zeigten
eine
nicht
signifikante
Differenz
78
von
25,1%
(Sham-33: 162 ± 23 mg/dl;
Sham-NaCl: 217 ± 47 mg/dl). Bis zum 49. Tag stiegen die Werte der Sham Fr. 33-Grupppe etwas über
die der Sham-Kontrollguppe (Sham-33: 165 ± 18 mg/dl; Sham-NaCl: 162 ± 28 mg/dl) an (Abb. 32).
Der Ovarektomie folgte ein signifikanter (P < 0,001) Anstieg der Osteokalzinwerte vom Beginn
(333 ± 36 ng/ml) bis zum 35. Tag der Studie gegenüber der Sham-NaCl-Gruppe (217 ± 47 ng/ml). Im
weiteren Verlauf lagen die Werte der OVX-NaCl-Gruppe weiter über denen der Sham Tiere jedoch ohne
statistische Signifikanz. Am 49. Tag zeigte sich noch ein nicht signifikantes Plus von 15,5%
(187 ± 34 ng/ml) gegenüber Sham-NaCl-Gruppe (162 ± 28 ng/ml, Abb. 32).
Bei den ovarektomierten Tieren lagen die initialen Werte zwischen 250 (± 45) und 333 ng/ml (± 36). Es
konnte gezeigt werden, daß PTH einen signifikanten (P < 0,001) Anstieg der Werte über den gesamten
Zeitraum der Studie bewirkte, der an Tag 49 (319,8 ± 82,8 ng/ml) 71,1% gegenüber der Kontrollgruppe
(186,9 ± 33,7 ng/ml) ausmachte. Damit lagen die PTH behandelten Tiere mit ihren Werten über denen
jeder anderen Gruppe (Abb. 33).
E2 zeigte bis zum 14. Tag einen ähnlichen Verlauf wie die Kontrollgruppe. Ab dem 14. Tag blieben die
B
B
Werte stabil und lagen am 49. Tag geringfügig unter denen der Kontrolle (E2: 169 ± 42 ng/ml;
B
B
OVX-NaCl: 333 ± 36 ng/ml). Die Wirkungen von Fraktion 33 und Fraktion 32 unterschieden sich kaum
voneinander. Ab dem 14. Tag glich der Verlauf dem der Kontrollgruppe. Am 49. Tag zeigte Fr. 33
(169 ± 33 ng/ml) etwas niedrigere Werte und Fr. 32 (246 ± 20) einen geringfügigen Anstieg gegenüber
der Kontrolle (333 ± 36 ng/ml). Bei der Behandlung mit erhöhter Dosis von Fraktion 32 war zuerst ein
leichter Anstieg des Osteokalzinspiegels bis zum 7. Tag zu verzeichnen. Im weiteren Verlauf sanken die
Werte kontinuierlich und waren ab dem 35. Tag nicht mehr meßbar (Abb. 33).
4.7 Ergebnisse der Gastrektomie-Studie
Die Gastrektomie-Studie (GX-Studie) hatte eine Dauer von 42 Tagen. Es gab 2 Kontrollgruppen mit je 5
adulten (KO-I) und 5 jungen (KO-II) Tieren und 2 Gruppen mit je 5 adulten (GX-I) und 5 jungen (GX-II)
gastrektomierten Tieren. Nach dem Eingriff betrug die Mortalität bei den adulten Tieren 0% und bei den
jungen Tieren 40%.
79
4.7.1 Gewichtsverlauf und Futteraufnahme
Das Körpergewicht und die aufgenommene Futtermenge wurde bei allen Tieren der GX-Studie täglich
bestimmt.
Die Tiere der Kontrollgruppe-I starteten mit einem Gewicht von 269 g (± 7,3), das während der Studie
relativ stabil blieb. Am letzten Tag wogen sie 287 g (±12,6; Abb. 35). Die gastrektomierten adulten Tiere
(GX-I) hatten ein Initialgewicht von 293 g (± 21). Sie verloren bis zum 17. Tag 21% ihrer Körpermasse.
Bis zum Ende der Studie nahmen sie wieder 11 g zu und hatten ein Endgewicht von 244 g (± 13,8;
Abb. 34). Damit brachten sie 43 g weniger auf die Waage als die Kontrolltiere (287 ±12,6 g) und wogen
am Ende des Versuches 49 g weniger als am Start. Das entspricht einem Verlust von 16,7%. Der
Gewichtsunterschied zwischen den Gruppen war statistisch signifikant.
320
Körpergewicht (g)
300
280
260
240
220
KO-I
GX-I
200
0
7
14
21
28
35
42
Zeit (Tage)
Abb. 34: Körpergewichtsverlauf der Gruppen KO-I und GX-I während der Gastrektomie-Studie.
80
300
280
Körpergewicht (g)
260
240
220
200
180
160
KO-II
GX-II
140
120
0
7
14
21
28
35
42
Zeit (Tage)
Abb. 35: Körpergewichtsverlauf der Gruppen KO-II und GX-II während der Gastrektomie-Studie.
Die Tiere der Kontrollgruppe-II hatte ein initiales Gewicht von 216 g (± 3,1) und nahmen kontinuierlich
bis zum Ende (264 ± 9,6 g) der Studie 22,2% zu (Abb. 35).
Es konnte gezeigt werden, daß die jungen gastrektomierten Tiere in der ersten Studienwoche Gewicht
verloren und im weiteren Verlauf kontinuierlich wieder zunahmen. Sie starteten mit einem geringeren
Gewicht (217 ± 3 g) als die Kontrollgruppe und verloren in der ersten Woche 24% ihrer Masse. Am
Ende der Studie wogen sie 45 g (219 ± 20,6 g) weniger als die Kontrollgruppe (264 ± 9,6 g) und hatten
jedoch 0,9% mehr Gewicht als am Start (Abb.35). Der Gewichtsverlauf dieser beiden Gruppen zeigte
eine statistische Signifikanz. Weiter konnte dargestellt werden, daß die adulten gastrektomierten Ratten
während der Studie einen geringeren Verlust der Körpermasse verzeichneten (GX-I: 21%; GX-II: 24%)
als die jungen Tiere. Zum Ende der Studie nahmen die adulten Tiere aber nur noch 11 g zu und
erreichten ihr Ausgangsgewicht nicht mehr (Abb. 34), während die jungen Tiere bis zum Ende 54 g
zunahmen und 2 g mehr wogen als am Start (Abb. 35).
Der Kurvenverlauf der Futteraufnahme deckt sich mit den Gewichtsverläufen der gastrektomierten
Tiere. Bei den älteren GX-Tieren blieb die Futteraufnahme in den ersten 5 Tagen stabil und nahm bis
Tag 13 ungefähr 50% ab. Im weiteren Verlauf steigerte sich Futteraufnahme und pendelte sich ab der
3. Woche bei 14 g täglich ein (Abb. 36).
81
Bei den jungen gastrektomierten Tieren erreichte die tägliche Futteraufnahme ihren Tiefpunkt am 3. Tag
und steigerte sich im Weiteren bis zum 11. Tag. Auch Sie stellte sich in den letzten 3 Wochen bei 14 g
täglich ein (Abb. 36).
25
Futtermenge (g)
20
15
10
5
GX-II
GX-I
0
0
7
14
21
28
35
42
Zeit (Tage)
Abb. 36: Futteraufnahme der gastrektomierten Tiere während der Gastrektomie-Studie.
4.7.2 Radiologische Untersuchung der präparierten und fixierten Ossa femori und Calvariae
Zur Auswertung der röntgenologischen Befunde an den Femura und den Calvariae wurden die
Kontrollgruppen als physiologischer Maßstab herangezogen. Beurteilt wurde die Röntgendichte der
Substantia kompakta der Femurdiaphyse (mittlerer Pfeil in Abb. 37), die Röntgendichte im Bereich der
Facies poplitea (unterer Pfeil in Abb. 37) und die des Femurkopfes (oberer Pfeil in Abb. 37). Die
Kontrolltiere erhalten auf ihre Röntgendichte in den drei oben genannten Bereichen ++ als
physiologische Bewertung. Zum besseren Vergleich sind sie in Tabelle 12 noch mal mit aufgeführt.
82
Tabelle 12: Radiologische Befunde an den Femura der Ratten der Gastrektomie-Studie.
Gruppe
Röntgendichte
der Kompakta
Röntgendichte der
Facies poplitea
Röntgendichte des
Femurkopfes
Kontrollgruppe (adult)
++
++
++
GX-Tiere (adult)
+/-
-
-
Kontrollgruppe (jung)
++
++
++
GX-Tiere (jung)
-
--
-
-+/-
= Röntgendichte ist geringgradig reduziert
= Röntgendichte ist mittelgradig reduziert
= Röntgendichte ist gleich
Die Gastrektomie führte bei den jungen Tieren zu einer mittelgradigen Reduzierung der Röntgendichte
im Bereich der Facies poplitea und zu einer geringgradigen Reduzierung der Röntgendichte an der
Kompakta und im Bereich des Femurkopfes im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 37).
Die adulten gastrektomierten Ratten zeigten an der Kompakta keine und in den anderen Bereichen nur
eine geringgradige Verminderung der Röntgendichte (Abb. 37).
An den Calvariae zeigten sich durch die Gastrektomie nur Veränderungen bei den jungen Tieren. Sie
wiesen an den Knochennähten im Vergleich zur Kontrollgruppe insgesamt weniger röntgendichte
Strukturen auf (Abb. 38).
Abb. 37: Röntgenbilder der Femura aus der Gastrektomie-Studie. Oben links sind die Femura der jungen Kontrolltiere und
oben rechts die der adulten Kontrolltiere abgebildet. In den unteren Reihen sind die der dazugehörigen gastrektomierten
Ratten dargestellt.
83
Abb. 38: Röntgenbilder der Calvariae der Gastrektomie-Studie. Oben links sind die Schädeldächer der jungen Kontrolltiere
und oben rechts die der adulten Kontrolltiere abgebildet. In den unteren Reihen sind die der dazugehörigen gastrektomierten
Tiere dargestellt.
4.7.3 Dichtebestimmung der Femura nach Gastrektomie
Die Femurdichte wurde nach Trocknung der Knochen bis zur Gewichtskonstanz nach dem Prinzip der
Mohr-Waage bestimmt.
1.6
Dichte (g/ml)
1.5
1.4
***
1.3
1.2
***
1.1
II
G
X-
I
G
X-
KO
-II
KO
-I
1.0
Abb. 39: Die Femurdichte der Gruppen aus der Gastrektomie-Studie.
84
Bei den adulten gastrektomierten Tieren (1,276 ± 0,061 g/ml) war eine signifikante Abnahme der
Femurdichte um 14,1% gegenüber der Kontrollgruppe (1,486 g/ml ± 0,042 g/ml) zu bemerken. Auch bei
den jungen Tieren bewirkte die Gastrektomie (1,131 ± 0,028 g/ml) eine signifikante Abnahme der
Femurdichte um 19,7% gegenüber der Kontrollgruppe (1,409 ± 0,078 g/ml).
4.7.4 Transillumination der Calvariae
Die Abbildungen 40-43 zeigen von sämtlichen Schädeldächern der Tiere einen Ausschnitt des Os
parietale (Scheitelbein). Es konnte gezeigt werden, daß die Gastrektomie bei den adulten Tieren keinen
Einfluß auf die Struktur der Calvariae hatte im Vergleich mit der Kontrollgruppe (Abb.40 und 41).
Bei den jungen gastrektomierten Tieren waren die charakteristischen von Klinge et al. (1995),
Lehto-Axtelius et al. (1998, 2002a) und Surve et al. (2001a, b) beschriebenen lichtundurchlässigen
Bereiche zu sehen. Diese Veränderungen waren zum Teil auch bei den Kontrolltieren zu sehen, aber in
einer geringeren Ausprägung (Abb. 42 und 43). Vergleicht man die Bilder der beiden Kontrollgruppen
(Abb. 40 und 42), so waren deutliche möglicherweise altersabhängige Unterschiede bei den Tieren zu
erkennen.
85
Abb. 40: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der adulten Kontrolltiere der Gastrektomie-Studie.
Abb. 41: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der adulten gastrektomierten Tiere der Gastrektomie-Studie.
Abb. 42: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der jungen Kontrolltiere der Gastrektomie-Studie.
Abb.43: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der jungen gastrektomierten Tiere der Gastrektomie-Studie.
86
4.7.5 Durchmesser der Calvariae
Die Messungen wurden an pikrinsäurefixierten Präparaten durchgeführt.
Calvariendurchmesser (µm)
600
*
500
400
300
XII
G
XI
G
-II
KO
KO
-I
200
Abb. 44: Der Calvariendurchmesser von den fixierten Präparaten der Gruppen aus der Gastrektomie-Studie.
Bei den adulten Ratten zeigte sich nach der Gastrektomie eine signifikante Zunahme des
Calvariendurchmessers um 21,9% (550 ± 28 µm) gegenüber der Kontrollgruppe (451 ± 65,4 µm).
Unter den jungen Tieren bewirkte die Gastrektomie einen gegenteiligen Effekt. Die Stärke der Calvariae
verringerte sich nicht signifikant um 11,6% auf 380 µm (± 17,6) gegenüber der Kontrollgruppe
(430 ± 57,4 µm).
4.7.6 Gesamtkalziumbestimmung
Zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte im Serum am letzten Tage der Studie wurde eine
Standardkurve erstellt. Der physiologische Gesamtkalziumgehalt liegt bei Ratten zwischen 9,6 und
11,0 mg/dl (MATSUDA et al., 2000) und ist in Abb. 46 durch zwei schwarze Linien gekennzeichnet.
87
Standardkurve zur Gesamtkalziumbestimmung
Gesamtkalzium (mg/dl)
14
12
3
2
y = 9.5015x - 8.4222x + 18.87x
10
8
6
4
2
0
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
OD (570nm)
MW - Reagenzleerwert
Polynomisch (MW - Reagenzleerwert)
Abb. 45: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte im Sreum am letzten Tag der Gastrektomie-Studie.
12
Gesamtkalzium (mg/dl)
11
10
9
8
7
6
G
XII
I
XG
KO
-II
KO
-I
5
Abb. 46: Gesamtkalziumspiegel im Serum der Gruppen am letzten Tag der Gastrektomie-Studie.
Die Werte aller Gruppen lagen im unteren physiologischen Bereich (Abb. 46). Die Gastrektomie
(9,6 ± 0,37 mg/dl) bewirkte ein geringes nicht signifikantes Absinken des Kalziumspiegels unter den
adulten Tieren (Kontrolle 9,9 ± 0,44 mg/dl). Bei den jungen Tieren gab es kaum einen Unterschied
zwischen der Kontrollgruppe (10 ± 0,16 mg/dl) und den operierten Tieren (9,9 ± 0,37 mg/dl).
88
5. Diskussion
A. Nachweis von osteoanabolen Aktivitäten aus Schweinemagen und humanem Hämofiltrat
In der Einleitung dieser Promotion wurden für den in vitro Teilabschnitt zwei Aufgabenstellungen
formuliert.
1.
Läßt sich das postulierte Peptidhormon Gastrokalzin in aufgereinigtem Extrakt aus
Schweinemagen mit Hilfe eines in vitro Testes nachweisen?
2.
Im
Gibt es eine zirkulierende Form des Gastrokalzins in humanem Hämofiltrat?
Rahmen
dieser
Arbeit
konnte
nachgewiesen
werden,
daß
sowohl
im
Schweinemagenschleimhautextrakt als auch im Hämofiltrat in vitro osteoanabole Fraktionen identifiziert
und näher charakterisiert werden konnten.
Die Schweinemägen stammten vom Schlachthof in Gleidingen (Hannover, D). Die Präparation und
Herstellung des Schleimhautextraktes erfolgte in Anlehnung an PERSSON et al. (1989, 1991) und
HÅKANSON et al. (1990a). Die sich anschließende chromatographische Aufreinigung für die
Ovarektomie-Studie erfolgte in einem Schritt. Biologisch aktive Fraktionen wurden im Zelltest durch
Stimulierung der membrangebundenen alkalischen Phosphatase und durch Messung der Zellvitalität
(WST-1) identifiziert. Im Elutionsbereich von ca. 46% Puffer B konnte mit dem Zelltest eine
osteoanabole Fraktion identifiziert werden. Aus Vorversuchen war bekannt, daß die gesuchte Aktivität
bei einem Prozentanteil von 40-50% Puffer B von einer C18-Säule eluiert.
Parallel zur Schweinemagenaufarbeitung wurde in drei aufeinanderfolgenden chromatographischen
Schritten die Aufreinigung aus humanem Hämofiltrat durchgeführt. Als Quelle hierfür diente Hämofiltrat
aus dem nephrologischen Zentrum Niedersachsen in Hannoversch-Münden. Aktive Fraktionen wurden
ebenfalls mit Hilfe des Zelltestes durch Stimulierung der alkalischen Phosphatase und durch Messung
der Zellvitalität identifiziert. Auch hier konnte eine biologisch aktive Fraktion für die Ovarektomie-Studie
in einem Elutionsbereich von ca. 49% Puffer B identifiziert werden.
Da der Schweinemagenextrakt ultrafiltriert (10 kDalton Cutoff) wurde und bei der Hämofiltration Filter
mit einer Ausschlußgröße von 20 bis 30 kDalton verwendet wurden, mußten die beiden aktiven
Substanzen eine molekulare Masse kleiner als 10 bzw. 20 kDalton besitzen. Abweichend von
HÅKANSON et al. (1990a) ließen sich die Aktivitäten nicht mit Subtilisin enzymatisch hydrolisieren, aber
mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston hemmen. Da beide Fraktionen in einem ähnlichen
89
Bereich von der C18-Säule eluierten und sie in vitro dieselben Eigenschaften zeigten, wurde davon
ausgegangen, daß es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um dieselbe Substanz handelt.
Im Verlauf der Ovarektomie-Studie wurde aus einer Gesamtmenge von 1290 kg Schweinemagen in
mehren Aufreinigungsschritten und mit Hilfe des Zelltestes das Glukokortikoid Hydrokortison isoliert.
Zeitgleich wurden aus insgesamt 10000 Litern Hämofiltrat die Glukokortikoide Hydrokortison und
Prednisolon isoliert. Das synthetische Glukokortikoid Prednisolon stammt mit großer Wahrscheinlichkeit
hinsichtlich der Herkunft des Ausgangsmaterials von steroidtherapierten Dialysepatienten.
Bezugnehmend auf die beiden Fragen zu Beginn des Abschnittes läßt sich festhalten, daß das als
Gastrokalzin postulierte Peptidhormon aus Schweinemagen nicht isoliert werden konnte. Ob es eine
zirkulierende Form des Gastroklazins in humanem Hämofiltrat gibt, bleibt somit offen.
Im Anschluß an die Isolierung erfolgte der Nachweis einer Dosisabhängigkeit von den Substanzen
Dexamethason, Hydrokortison und Prednisolon durch Stimulierung der membrangebundenen
alkalischen Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen (Abb. 13). Der Wirkungsgrad von Hydrokortison und
Prednisolon war nahezu identisch, während Dexamethason eine deutlich potentere Wirkung auf die
Zellen hatte. MAJESKA et al. (1985) zeigen, daß ROS-17/2.8 Zellen dosisabhängig auf Dexamethason
mit einer Erhöhung der alkalischen Phosphatase reagieren. Auch periostale Explantate von
Hühnerembryos differenzieren unter dem Einfluß von Dexamethason schneller zu Osteoblasten als
unbehandelte Kontrollzellen (MC CULLOCH u. TENENBAUM 1986). Trotz des positiven Effektes
einiger Glukokortikoide auf die Differenzierung von osteoblastären Zelllinien hemmen sie gleichzeitig die
Kollagen Typ I- und Proteinsynthese in Osteoblasten und Rattencalvarienzellen (PECK et al., 1967;
CANALIS 1983). Zusätzlich inhibieren Dexamethason und Hydrokortison das Wachstum von
Osteoklasten dosisabhängig, wobei für Dexamethason eine 30fach stärke Wirkung nachgewiesen
werden kann als für Hydrokortison (TOBIAS u. CHAMBERS 1989).
B. Ovarektomie-Studie
Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der Wirkung neuer osteoanaboler Faktoren im Tiermodell
der ovarektomierten Ratte. In der Einleitung und Zielsetzung wurde speziell die Frage nach der Wirkung
von Gastrokalzin auf den Knochenstoffwechsel formuliert. Da anstelle des Gatrokalzins Glukokortikoide
isoliert wurden, bleibt diese Frage an dieser Stelle unbeantwortet.
Die Ovarektomie-Studie hatte eine Dauer von 60 Tagen. Vor dem Hintergrund der Isolierung kann
festgestellt werden, daß die Gruppen Sham-Fr. 33 und OVX-Fr. 33 über den Zeitraum der Studie eine
tägliche subkutane Hydrokortison-Injektion mit 0,009 µg erhalten haben. Die Gruppe-OVX-Fr. 32 hat
90
über die Dauer des Versuches täglich ca. 15 µg eines Hydrokortison/Prednisolon Gemisches subkutan
appliziert bekommen und die Gruppe-OVX-Fr. 32+ die zehnfache Menge dieser beiden Glukokortikoide.
Als Positivkontrollen wurden hPTH 1-37 und 17-β-Östradiol eingesetzt.
Gewichtsverlauf
U
Es konnte dargestellt werden, daß die Ovarektomie zu einem signifikanten Anstieg des Gewichtes
führte (Abb. 14). Diese Begleiterscheinung nach einer Ovarektomie ist in einer Vielzahl von Studien
belegt worden (SAVILLE 1969; AITKEN et al., 1972; LINDGREN et al., 1979, 1982; KALU 1984;
WRONSKI et al., 1985, 1986; GEUSENS et al., 1990; THOMPSON et al., 1995). WRONSKI et al.
(1985, 1987) folgerten, daß dem Übergewicht ein Schutzmechanismus in Bezug auf die Ausprägung
der Osteopenie zugeschrieben werden kann. Das kann dadurch belegt werden, daß sowohl
übergewichtige Frauen als auch übergewichtige weibliche Ratten an den langen Röhrenknochen einen
geringeren Spongiosavolumenverlust aufweisen als normalgewichtige Frauen und weibliche Ratten. Bei
übergewichtigen Frauen kann zusätzlich ein geringeres Frakturrisiko beobachtet werden (WRONSKI et
al., 1985, 1987; DANIELL 1976). ROUDEBUSCH et al. (1993) kritisieren den Punkt des Übergewichtes
am Tiermodell der ovarektomierten Ratte, da Ergebnisse von pharmakologischen Studien über eine
Beeinflussung des Gewichtes manipuliert werden könnten. In Hinblick auf diesen Kritikpunkt sollten
Daten von pharmakologischen Studien, bei denen der Faktor der Gewichtszunahme nicht berücksichtigt
wurde, kritischer beurteilt werden.
Nach Gabe von Glukokortikoiden konnte nachgewiesen werden, daß sie zu einem Gewichtsverlust
sowohl bei ovarektomierten als auch bei nicht operierten Ratten führen (YASUMURA et al., 1976b;
GOULDING et al., 1988; FERRETTI et al., 1992; KING et al., 1996). Diese beschriebene Wirkung der
Glukokortikoide konnte in der eigenen Studie nicht bestätigt werden (Abb. 14). Die behandelten
ovarektomierten Tiere wogen mehr als die Tiere der ovarektomierten Kontrollgruppe. Allein die
Behandlung mit E2 bewirkte eine signifikante Abnahme des Gewichtes.
B
B
Ovarektomie
U
Die Osteopenie nach einer Ovarektomie zeigt sich symptomatisch bei der Ratte unter anderem durch
eine Verminderung der Knochenmineraldichte an den langen Röhrenknochen (GEUSENS et al., 1990;
KIMMEL u. WRONSKI 1990; ROUDEBUSH et al., 1993; SHEN et al., 1993; KAVUNCU et al., 2003)
und durch einen Verlust der Mikroarchitektur der Spongiosastrukturen in den Röhrenknochen und
Wirbeln (FAUGERE et al., 1986; ABE et al., 1993; MILLER u. WRONSKI 1993; SHEN et al., 1993;
MOSEKILDE et al., 1994; LI et al., 1997; RÜMENAPF et al., 1997). Die Veränderungen der
91
Spongiosastrukturen treten als ein Verlust der Trabekeldicke aber auch als eine Verminderung der
Trabekelanzahl in Erscheinung und werden zusammengefaßt als Spongiosaknochenmasse- oder
Spongiosavolumenverlust. Viele Studien zeigen, daß die Osteopenie bei der ovarektomierten Ratte
einen erhöhten Knochenumsatz bewirkt (WRONSKI et al., 1985, 1986, 1987, 1988b, 1989b). Der
Verlauf des Knochensubstanzverlustes bei der Ratte verhält sich ähnlich wie bei der Frau nach der
Menopause und ist biphasisch. Charakteristisch ist eine 3monatige Anfangsphase, während dieser der
Substanzverlust am größten ist. Anschließend folgt eine Stabilisierungsphase die 5-6 Monate anhalten
kann. Während dieser Zeit bleibt die Knochenmasse fast unverändert. Die letzte Phase ist
gekennzeichnet durch einen langsamen Knochensubstanzverlust (WORONSKI et al., 1989b).
Langzeitstudien von WRONSKI et al. (1988b) zeigen, daß die erste Phase des Knochsubstanzverlustes
zeitgleich mit der maximalen Erhöhung des Knochen-Turnover abläuft. KALU et al. (1984) stellten
folgendes Modell für den Pathomechanismus der Entstehung einer Ovarektomie-Osteoporose bei der
Ratte auf:
Abb. 47: Modell des Pathomechanismus der Osteopenie bei der ovarektomierten Ratte (nach KALU et al., 1984).
KALU et al. (1984) folgern, daß der Östrogenverlust die renale Synthese von 1,25-(OH)2 D3 vermindert
B
B
B
B
und dadurch die enterale Kalziumabsorption verringert ist. Dies führt in Folge dazu, daß der
Serumkalziumspiegel sinkt. Als Antwort auf den hypokalzämischen Zustand produziert die
Nebenschilddrüse PTH, daß die Knochenresorption fördert und somit zu einer negativen
92
Knochenstoffwechselbilanz führt. Die Erhöhung der PTH-Spiegel ist aber nach KALU et al. (1984) nicht
unbedingt Voraussetzung für eine negative Bilanz des Knochenstoffwechsels. Durch die von KALU et
al. (1984) beobachtete verminderte Kalzitoninkonzentration und mangelnde Antwort der C-Zellen der
Schilddrüse auf die Kalziumkonzentration im Blut fehlt der negative Feedback-Mechanismus, welcher
im physiologischen Zustand die Sekretion von PTH hemmt. Dies führt zur weiteren Resorption des
Knochengewebes.
Warum der Östrogenverlust zur mangelnden 1,25-(OH)2 D3 Produktion und zur negativen Beeinflussung
B
B
B
B
der Schilddrüse führt ist noch unklar. Zeitgleich bewirkt der Östrogenmangel direkt die Resorption von
Knochengewebe, da Zytokin gesteuerte, Wachstumsfaktor gesteuerte und Knochenmatrix gesteuerte
Gene von der Östrogenproduktion abhängig sind (LINGBERG et al., 2002). Die Interleukine 11 und 6
fördern z. B. die Osteoklastendifferenzierung, sie sind E2 reguliert (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996).
B
B
Ein Wegfall der Östrogengesteuerten Mechanismen führt zur unkontrollierten Differenzierung der OK
und fördert somit die Resorption des Knochengewebes. Dem Östrogenmangel folgt außerdem, daß
Osteoblasten mehr RANK und weniger OPG produzieren (WHITFIELD et al., 2000). Aus der
Literaturübersicht geht hervor (Abschnitt 2.1.3 und 2.1.4), daß OPG die Osteoklastendifferenzierung
hemmt, weil es an den Rezeptor RANKL der OK bindet (HSU et al., 1999) und dadurch die
RANK-RANKL Interaktion verhindert. Diese Interaktion ist notwendig zur Differenzierung der
Osteoklasten (YASUDA et al., 1998; KONG et al., 1999; SUDA et al., 1999; UDAGAWA et al., 1999).
Somit wird zusätzlich die Resorption des Knochens unterstützt. Ein Östrogenverlust hat auch zur Folge,
daß die Lebensspanne der Osteoblasten verkürzt wird (WHITFIELD et al., 2000).
In dieser Studie konnte unter den ovarektomierten Tieren bei der radiologischen Untersuchung eine
Verminderung der Röntgendichte im Bereich der Facies poplitea nachgewiesen (Abb. 15 u. 16) und in
diesem Zusammenhang eine nicht signifikante Abnahme der Femurdichte gezeigt werden (Abb. 23).
Beides spricht für eine Abnahme der Knochenmasse und der Knochenmineraldichte.
Die Osteokalzinwerte waren nach der Ovarektomie zu Beginn der Studie im Vergleich zur
Kontrollgruppe signifikant erhöht (P < 0,001). Sie spiegeln die Osteoblastenaktivität wider und geben
damit auch indirekt Auskunft über den Knochen-Tunnover. Dieser war im Vergleich zu den
sham-operierten Tieren bis zum 49. Tag erhöht, zeigte jedoch im Verlauf der Studie abnehmende
Tendenz (Abb. 33). Die Messung des Fluoreszenzbandenabstandes nach dem 49. Tag verdeutlichte
weiterhin, daß der Turnover nach dem 49. Tag weiterhin abnahm. Diese Beobachtung deckt sich mit
den Ergebnissen von WRONSKI et al. (1989b) die in ihren Langzeitstudien von einem biphasischen
Verlauf der Knochensubstanzabnahme und des Knochen-Turnover berichten, der zugunsten der
Resorption verschoben ist. Die Gesamtkalziumwerte lagen ab dem 28. Tag unterhalb derer der
93
Sham-Gruppe jedoch im physiologischen Bereich. Sie bestätigen die Ergebnisse von KALU et al.
(1984), die einen Wert von 9,8 ± 0,05 mg/100 ml bei ihren ovarektomierten Ratten im Vergleich zu den
sham-operierten Tieren (10,3 ± 0,08 mg/100 ml) messen konnten. Die Werte der ovarektomierten Tiere
lagen sowohl in dieser Studie als auch bei KALU et al. (1984) unterhalb derer der Kontrollgruppe. Im
klinischen Sinn kann jedoch nicht von einer Hypokalzämie gesprochen werden, da der untere
Referenzwert von Ratten bei 9,6 mg/dl liegt (MATSUDA et al., 2000). Vor diesem Hintergrund erscheint
die PTH-These von KALU et al. (1984) nicht als Hauptfaktor für den Knochensubstanzverlustes
verantwortlich zu sein. Vielmehr scheint die direkte Wirkung des Östrogenverlustes auf die Zunahme
der Knochenresorption ein wesentlicher Grund für die Entwicklung der Osteopenie bei ovarektomierten
Ratte zu sein.
hPTH 1-37
U
PTH ist ein wichtiges Hormon bei der Steuerung der Kalziumhomöostase. Bei einer Hypokalzämie wird
es von der Nebenschilddrüse produziert und bewirkt, daß mobiles Kalzium aus den Knochenspeichern
freigesetzt wird. Insgesamt besteht es aus 84 Aminosäuren, von denen die Fragmente 1-38 ausreichen
um einen metabolischen Effekt zu erzielen (WHITFIELD et al., 2000).
In der vorliegenden Arbeit wurde synthetisches hPTH 1-37 von der IPF PharmaCeuticals GmbH als
Positivkontrolle verwendet, da in einer großen Anzahl von Studien mit Ratten PTH eine osteoanabole
Wirkung nachgewiesen werden konnte (REEVE et al., 1976; KIMMEL et al., 1993; WRONSKI et al.,
1993, 1999; SAMNEGÅRD et al., 2001; ANDERSSON et al., 2002).
Um eine osteoanabole Wirkung bei der Behandlung mit PTH zu erzielen, sollte eine intermittierende
Applikation erfolgen, da kontinuierliche Infusionen vor allem an der Kortikalis katabole Prozesse
verursachen können (HODSMAN et al., 2000; WHITFIELD et al., 2000; ANDERSSON et al., 2002).
WHITFIELD et al. (2000) folgern, daß nach intermittierenden Gaben von PTH zunächst eine Phase der
Osteoklastenaktivierung stattfindet. Das dadurch freigesetzte Kalzium löst einen positiven
Feedback-Mechanismus auf die Osteoblastenfunktion und –differenzierung aus. Es werden die
Botenstoffe
TGF-β,
IGF-I
und
BMP´s
gebildet,
welche
die
Differenzierung
von
Osteoblastenvorläuferzellen unterstützen. Gleichzeitig interagiert das freigesetzte Kalzium mit
Kalziumrezeptoren auf den Osteoblasten und fördert ihre Aktivität. Parallel wirkt PTH aktivierend auf die
PTH-Rezeptoren der Osteoblasten und Präosteoblasten und das fördert ihre Differenzierung. Zusätzlich
wird die Bildung von Proteinen, die den Osteoblasten vor Apoptosis schützen, unterstützt und in Folge
dessen seine Lebensspanne verlängert. Die durch PTH stimulierten Osteoblasten produzieren ein
PTH-Prohormon, daß nochmals additive Wirkung auf die Osteoblastenaktivität zeigt. Das Nettoergebnis
94
dieser gesamten Kaskade ist eine massive Bildung von Osteoblasten und eine Unterstützung der
Osteoblastenaktivität in dem Maße, daß Knochensubstanz verstärkt aufgebaut wird.
Eine Stimulierung der Osteoklastenaktivität können KIMMEL et al. (1993) in ihrer Arbeit mit
ovarektomierten Ratten durch rekombinantes PTH 1-84 sowie synthetisches PTH 1-34 nicht
nachweisen. Ob nun auch eine erste Phase der Osteoklastenaktivierung stattfindet oder nicht, der
Nettoeffekt bleibt die osteoanabole Wirkung. Diese Wirkung konnte in der vorliegenden Studie mit
hPTH 1-37 eindeutig bestätigt werden. Der bildgebende Beweis für eine Zunahme der Knochendichte
an der Femurkompakta und der Facies poplitea (Abb. 17 u. 16) deckt sich mit dem Ergebnis der
signifikanten Zunahme der Femurdichte (Abb. 23). Auch an der Calvaria zeigte sich die osteoanabole
Wirkung durch eine Zunahme des Durchmessers (Abb. 25). Den stärksten Knochen-Turnover zeigte die
PTH-Gruppe nicht nur durch einen erhöhten Fluoreszenzbandenabstand sondern auch durch die
höchsten Osteokalzinwerte über den gesamten Zeitraum der Studie (Abb. 33). Die Serumkalziumwerte
lagen im physiologischen Bereich und scheinen trotz der osteoanabolen Wirkung des PTH´s am
Knochengewebe unbeeinflußt. Die Behandlung mit hPTH 1-37 zeigte eine deutliche Zunahme der
Knochenmasse zum Teil über die Gruppe der sham-operierten Kontrolltiere hinaus.
Die starke Zunahme des Gewichtes der PTH-Gruppe könnte zu einem gewissen Teil mit der Zunahme
der Knochenmasse zusammenhängen.
17-β-Östradiol
U
Östrogene beeinflussen den Knochenstoffwechsel (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996). Ein
Östrogenverlust im Körper kann bei der Frau zum Krankheitsbild der Typ-I-Osteoporose führen (RIGGS
et al., 2003). Die Verhinderung des Knochensubstanzverlustes durch 17-β-Östradiol wurde in
zahlreichen Studien mit dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte nachgewiesen (WRONSKI et al.,
1988a; SCHMIDT et al., 2000; DA PAZ et al., 2001; ANDERSSON et al., 2002; KAVUNCU et al., 2003).
Andererseits liegen Studien vor, die von Teil- oder Mißerfolgen bei der Therapie mit 17-β-Östradiol bei
der ovarektomierten Ratte berichten (ABE et al., 1993; SIMS et al., 1996).
In der eigenen Untersuchung wurde E2 aufgrund der mehrheitlich positiven Studienergebnisse ebenfalls
B
B
als Positivkontrolle angewendet. Die Tiere der entsprechenden Gruppe erhielten eine tägliche Injektion
mit 8 µg. Bei einem durchschnittlichen Gewicht von 300 g entspricht das einer Dosis von
ca. 27 µg/kg KM/Tag.
ABE et al. (1993) folgern aufgrund ihrer Studie, in der ovarektomierte Ratten mit 4 mg/kg KM
17-β-Östradiol subkutan für 56 Tage behandelt worden waren, daß sich das Rattenmodell bestens
eignet für die Erforschung der Östrogenwirkung am Knochen. Da sie keinen osteoanabolen Effekt
95
nachweisen konnten sehen sie Parallelen zu Studien beim Menschen, in denen Östrogen ebenfalls
keine osteoanabolen Effekte nachgewiesen werden konnte. SIMS et al. (1996) applizierten Ratten
subkutan, beginnend nach der Ovarektomie, 8 und 20 µg/kg KM 17-β-Östradiol für maximal 21 Tage
und können ebenfalls keine eindeutige osteoanabole Wirkungen nachweisen.
In der vorliegenden Studie konnte bei den Tieren nach 17-β-Östradiolgabe keine osteoanabolen Effekte
hervorgerufen werden. So erschien der Knochen-Turnover aufgrund des fluoreszenzmarkierten
Knochenschnittes ähnlich dem der Kontrollgruppe. Die verminderten Osteokalzinwerte gelten als
Hinweis für eine niedrige Osteoblastentätigkeit, die ab dem 14. Tag stabil blieb. Diese Ergebnisse
lassen folgern, daß bei diesen Tieren der Knochenstoffwechsel zugunsten der Resorption verschoben
ist, was sich auch in den erhöhten Kalziumwerten zum Schluß der Studie widerspiegelt. Da die
Osteoblastentätigkeit nicht durch die Östrogenapplikation angeregt wurde, Osteoblasten aber
Östrogenrezeptoren besitzen (ERIKSEN et al., 1988), ist es möglich, daß 17-β-Östradiol nicht in
ausreichender Menge am Zielort Knochengewebe angekommen war. Gründe hierfür können in der
Formulierung des Wirkstoffes, in der Applikationsmethode, in der Häufigkeit der Applikation oder in der
Höhe der Dosis beziehungsweise auch in der Summe oder Kombination der aufgeführten Gründe
liegen.
Hydrokortison und Prednisolon
U
Aus 1290 kg Schweinemagen (2231 Stück) wurde etwa 1 mg Hydrokortison isoliert. Da die Ratten
dieser Studie täglich mit 0,02 Mäq behandelt wurden, entspricht dies einer Menge von annähernd
0,009 µg Hydrokortison. Bei einem mittleren Körpergewicht von 330 g während der Studie ergibt sich
daraus eine tägliche Dosis von ca. 0,027 µg/kg KM.
Aus 10000 Litern Hämofiltrat wurden insgesamt 10 mg Hydrokortison und Prednisolon isoliert. Die
Gruppe-OVX-Fr. 32 wurde täglich mit 15 ml HFäq behandelt, das einer Konzentration von 15 µg
Glukokortikoiden entspricht. Bei einem mittleren Körpergewicht von 324 g entsprach das einer Dosis
von etwa 46 µg/kg KM/Tag. Die Gruppe-OVX-Fr. 32+ wurde demnach mit ca. 460 µg/kg KM
Hydrokortison/Prednisolon behandelt.
Zusammenfassend läßt sich darstellen, daß unter den ovarektomierten Tieren eine geringfügige
Zunahme der Röntgendichte nur bei der Gruppe, die mit der geringen Dosis des
Glukokortikoidgemisches behandelt worden war, nachzuweisen war. Die Femurdichte war bei allen
Gruppen nicht signifikant erniedrigt, der Calvariendurchmesser unverändert oder nicht signifikant
erhöht. Der Knochen-Turnover war bei der Gruppe mit der hohen Dosierung leicht erniedrigt, bei den
übrigen Tieren nicht auffällig erhöht. Der Gesamtkalziumgehalt stellte sich bei allen Gruppen signifikant
96
erniedrigt dar (Abb. 31). Die Osteokalzinspiegel aller drei Gruppen lagen bis zum 14. Tag unter dem der
Kontrollgruppe, der von Gruppe-OVX-Fr. 32+ war ab dem 35. Tag nicht mehr meßbar, der anderen zwei
Gruppen lag auf gleicher Höhe wie der Kontrollgruppe (Abb. 33).
Im Vergleich zur Sham-Kontrollgruppe ergab die Behandlung der Sham Tiere dieselben Ergebnisse wie
die Behandlung der ovarektomierten Ratten.
Die Auswertung der Literatur zur Behandlung von nicht operierten und ovarektomierten Ratten mit
Glukokortikoiden ergibt erheblich divergierende Ergebnisse.
Methylprednisolon konnte Wirkungen in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer und der Dosis
nachgewiesen werden. So ruft die Behandlung mit 1 mg/kg KM/Tag erst nach 90 Tagen eine
Reduzierung der Knochenbelastbarkeit ohne Veränderungen der Dichte oder Mineralzusammensetzung
hervor. Auf der anderen Seite kann nach 90 Tagen Behandlung mit verschiedenen Dosierungen (1, 3, 6
und 9 mg/kg KM/Tag) bei 8 Wochen alten Ratten eine Abnahme des Längenwachstums des Femurs
durch eine Abnahme des periostalen Knochenaufbaus an der Kompakta der Femurdiaphyse beobachtet
werden (ØRTOFT et al., 1988, 1999).
Die Monotherapie mit Prednisolon in einer Dosis von 0,5 mg/kg KM/Tag beeinflußt bei 12 Wochen alten
Ratten nach 6 Monaten nicht die Knochenmineralzusammensetzung. In Kombination mit einer
Ovarektomie wird die Mineraldichte jedoch besonders am distalen Femur signifikant vermindert
(GEUSENS et al., 1990). Prednisolon in Kombination mit einer Ovarektomie in einer Dosis von
2 mg/kg KM/Tag verschlimmert bei 3 Monate alten Ratten nach 12 Wochen die Osteopenie und erhöht
die renale Kalziumausscheidung. Da gleichzeitig der Serumproteingehalt fällt liegt ein niedriger
Gesamtkalziumgehalt bei ovarektomierten, mit Prednisolon behandelten, Ratten vor (GOULDING et al.,
1988). Dagegen können SURVE et al. (2001) bei 10 Wochen alten Ratten nach einer 12 Wochen
dauernden Behandlung mit 80 mg/kg KM/Tag Prednisolon keinerlei Veränderungen am Femur
nachweisen. Hydrokortison hat in einer Dosis von 5 mg/Ratte alle 2 Tage ebenfalls keinen Effekt auf
den Gesamtkalziumgehalt der Tiere (YASUMURA et al., 1976b). FERRETTI et al. (1992) beobachten,
daß Kortisol (Hydrokortison) nach 16 Tagen dosisabhängig auf das Femur wirkt: 8 und
16 mg/kg KM/Tag haben keinen Effekt, mittlere Dosen von 32, 48 und 64 mg/kg KM/Tag zeigen positive
Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des Femurs, während eine hohe Dosis von
150 mg/kg KM/Tag sich negativ auswirkt.
YASUMURA (1976a) zeigt auch, daß nach einer 14tägigen Behandlung mit Kortisol bei 24 Tage alten
Ratten eine Abnahme der Knochenresorption auftritt. 20 mg/kg KM Kortison führen nach 31 Tagen bei
30 Tage alten Ratten zu einer Zunahme der diaphysalen Femurmasse (SISSONS u. HADFIELD 1955).
97
KING et al. (1996) können nach der kontinuierlichen Gabe von 16,25 µg Dexamethason-12-phosphat
demonstrieren, daß bei Ratten nach 19 Tagen eine signifikante Zunahme der Knochenmasse
(Gesamtknochenvolumen und Trabekeldicke) nachzuweisen ist. Kalzium- und Phosphorserumspiegel
bleiben dabei unverändert, geringfügig vermindert sind die PTH-, 1,25-(OH)2 D3- und Osteokalzinlevel.
B
B
B
B
Fast allen Studien, die mit Glukokortikoiden einen osteoanabolen Effekt erzielen konnten, ist
gemeinsam, daß sie bei sehr jungen Tieren und über einen kurzen Zeitraum durchgeführt wurden. Ein
Vergleich der zahlreichen Studien fällt aufgrund der unterschiedlichen Versuchszeiten, Alter und
Geschlecht der Ratten, Steroidformulierungen, Dosierungen und Applikationsarten schwer. VOGEL
(1969) postulierte, daß Kurzzeitbehandlungen mit Hydrokortison die Belastbarkeit von Rattenknochen
erhöhen, während Langzeitbehandlungen negative Auswirkungen haben.
Es ist allgemein anerkannt, daß die Wirkung von Glukokortikoiden auf einer direkten Hemmung des
Knochenaufbaus beruht, wobei die Resorption unbeeinflußt bleibt oder erhöht wird. Gleichzeitig wirken
sie auf die PTH Sekretion als Folge einer gestörten Kalziumhomöostase (CANALIS 1983; TOBIAS et
al., 1989; PRUMMEL et al., 1991). Unter Kortikoidwirkung ist die intestinale Kalziumaufnahme reduziert
(AVIOLI 1984), die renale Kalziumausscheidung erhöht und der Proteingehalt des Blutes erniedrigt.
Diese Umstände führen zu einer Abnahme des Gesamtkalziumspiegels (GOULDING et al., 1988). In
der eigenen Untersuchung konnte mit der Meßmethode II gezeigt werden, daß durch eine
Glukokortikoidbehandlung die Gesamtkalziumspiegel am 49. Tag unter denen der Kontrolltiere lagen
(Abb. 31). Daß die Abnahme des Knochenaufbaus sich in einer Abnahme der Osteokalzinspiegel
widerspiegelt (PRUMMEL et al., 1991; KING et al., 1996), wurde in der eigenen Studie bestätigt,
insbesondere durch die Gabe der hohen Dosis von Fr. 32 (Abb. 33). Im Gegensatz dazu konnte anhand
der Röntgenaufnahmen keine Abnahme der Röntgendichte festgestellt werden, obwohl die
Femurdichten im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer waren (Abb. 23).
KING et al. (1996) folgern, daß Dexamethason den Knochen-Turnover ankurbelt und das Gleichgewicht
zugunsten des Knochenaufbaus verschoben wird. Eine Ankurbelung des Knochen-Turnovers war ab
dem 49. Tag in dieser Studie nur bei Fr. 33 und der niedrigen Dosis von Fr. 32 zu beobachten. Mit der
Fr. 32 ergab sich gleichzeitig am 49. Tag eine Erhöhung des Osteokalzingehaltes, was die Zunahme
der Röntgendichte erklären könnte und Kings Theorie damit unterstützt. Bei Fr. 33 konnten jedoch keine
radiologischen Veränderungen dargestellt werden.
In vitro fördern Glukokortikoide die Differenzierung von osteoblastären Zellinien, welches durch den
Nachweis einer Erhöhung der alkalischen Phosphatase auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte
98
(Abb. 13). Gleichzeitig hemmen sie jedoch die Proliferation der Zellen und ihre Proteinsynthese. Die
Hemmung der Kollagen Typ I Synthese ist dosisabhängig, wobei niedrige Dosen hemmen und hohe
Dosen die Synthese fördern. Die Hemmung der Proteinsynthese spiegelt sich in vivo über die
Verminderung der Osteokalzinwerte wider. Gleichzeitig induzieren Glukokortikoide eine dosisabhängige
Hemmung der Osteoklastenresorption und führen letztendlich zur Osteoklastenapoptosis (PECK et al.,
1967; CANALIS 1983; MAJESKA et al., 1985; MCCULLOCH u. TENENBAUM 1986; TOBIAS u.
CHAMBERS 1989; DEMPSTER et al., 1995).
Die gegensätzlichen Ergebnisse in der Literatur spiegeln sich in den unterschiedlichen Ergebnissen der
eigenen Studie wider. Abschließend und Bezug nehmend auf die Frage nach der Wirkung auf den
Knochenstoffwechsel konnte mit 46 µg/kg KM Glukokortikoidgemisch pro Tag röntgenologisch eine
geringe Zunahme der Knochendichte nachgewiesen werden. Mit einer 10-fachen Dosis aus Hämofiltrat
und einer Menge von etwa 0,027µg Glukokortikoid pro kg KM und Tag aus Schweinemagen ergaben
sich Veränderungen der Serumparameter, jedoch keine radiologisch nachweisbaren Befunde. Zukünftig
könnten weiter führende Untersuchungen, wie eine Bestimmung des Knochenaschegewichtes oder die
Anfertigung von histologischen Schnittbildern, zusätzliche Informationen und damit ein exakteres Bild
über stattfindende oder einsetzende Veränderungen geben.
C. Das Gastrektomie-Tiermodell
Als Arbeitsziel waren unter anderem zwei Fragen formuliert worden.
1.
Lassen sich die von verschiedenen Autoren (KLINGE et al., 1995; RÜMENAPF et al., 1997;
LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998; SURVE et al., 2001a, b)
gezeigten Effekte, vor allem an den Calvariae, bei jungen und adulten Tieren reproduzieren?
2.
Ist das Gastrektomie-Modell als Osteoporose Modell geeignet?
Gewichtsverlauf und Futteraufnahme
U
Die jungen gastrektomierten Ratten zeigten bereits in der ersten Woche der Studie einen Verlust der
Körpermasse um 24%. Die adulten Tiere hingegen verloren erst in der zweiten Woche im Mittel 21%
ihrer Körpermasse. Vermutlich waren sie waren auf Grund ihres höheren Startgewichtes (GX-I:
291 ± 8,3 g; GX-II: 217 ± 3 g) besser in der Lage, die Entfernung des Magens und die damit
auftretende Adaption des Verdauungstraktes an diesen Umstand zu kompensieren. Über den ganzen
Zeitraum der Studie betrachtet verloren die adulten Tiere insgesamt 15,5% ihrer Masse und blieben
während der letzten 4 Wochen stabil. Der Verlust bei den jungen Tieren war zwar zu Beginn größer, im
99
weiteren Verlauf nahmen sie aber, wie von noch nicht ausgewachsenen Tieren erwartet, kontinuierlich
zu und am Ende der Studie wogen sie 0,9% mehr als am Start (Abb. 34, 35).
Der Verlauf der Futteraufnahme (Abb. 36) zeigte, daß beide Gruppen in den letzten vier Wochen
durchschnittlich gleiche Mengen an Futter aufnahmen. Bezogen auf das Körpergewicht fraßen die
jungen Tiere jedoch anteilig mehr. Dies entspricht der Tatsache, daß ein noch wachsendes Tier neben
dem Erhaltungsbedarf an Energie zusätzliche Energie zum Wachstum benötigt.
Postgastrektomie-Osteopenie
U
Die Ratte hat eine lange Geschichte in Bezug auf Untersuchungen zum allgemeinen
Knochenstoffwechsel und deren Übertragung auf das humane Skelett (KIMMEL 2002).
Die Osteopenie nach einer Gastrektomie zeigt sich bei der Ratte unter anderem durch eine
Verminderung der Knochenmineraldichte und des Knochenaschegewichtes der langen Röhrenknochen.
Gleichzeitig kommt es zu einem Verlust der Mikroarchitektur der Spongiosastrukturen in den
Röhrenknochen und den Wirbeln. Insgesamt betrachtet sind die Symptome an den trabekulären
Strukturen des Knochens stärker ausgeprägt als im Bereich der Kortikalis. Enteral wird vermehrt
Magnesium und Phosphor ausgeschieden, renal vermehrt zyklisches Adenosinmonophosphat. Im
Serum läßt sich eine Verringerung des Gastringehaltes und von Vitamin D3-Vorstufen nachweisen
B
B
(HÅKANSON et al., 1990; PERSSON et al., 1993; RÜMENAPF et al., 1997; LEHTO-AXTELIUS et al.,
1998; MÜHLBAUER et al., 1998; GEPP et al., 2000; STENSTRÖM et al., 2000; SURVE et al., 2000a, b;
ANDERSSON et al., 2002; ZELLIN et al., 2002).
Femura
U
SAVILLE (1969) konnte nachweisen, daß durch eine Kastration der weiblichen oder männlichen Ratte
die Femurdichte, bestimmt nach dem Archimedis-Prinzip, abnimmt. In der vorliegenden Studie wurde
die Femurdichte in g/ml ebenfalls auf physikalischem Weg nach dem Prinzip der Mohr-Waage
bestimmt. Für die Tiere der beiden gastrektomierten Gruppen konnte eine signifikante Dichteabnahme
nachgewiesen werden, bei den jungen Tieren war sie noch deutlicher ausgeprägt als bei den Adulten
(Abb. 39). Wodurch dieser Dichteverlust verursacht wird, kann an dieser Stelle nicht nachgewiesen
werden. Die Abnahme der Dichte kann mit einer Minderung der Knochenmineraldichte und/oder des
Spongiosavolumens zusammenhängen. Auch eine Abnahme des Knochenmanteldurchmessers könnte
eine Abnahme der Knochendichte zur Folge haben. Nachfolgende Untersuchungen insbesondere
bildgebende Verfahren können dazu beitragen dies aufzuklären. Die Ergebnisse der Dichteänderungen
decken sich mit den Befunden der Röntgenaufnahmen. Sie zeigen, daß bei den adulten Tieren eine
100
geringgradige Verminderung der Röntgendichte im Bereich der Facies poplitea und des Femurkopfes
und bei den jungen Tieren eine geringgradige Reduzierung der Röntgendichte an der Substantia
kompakta und am Femurkopf sowie eine mittelgradige Reduzierung im Bereich der Facies poplitea zu
sehen war (Abb. 37).
In der vorliegenden Studie konnte damit gezeigt werden, daß durch eine Gastrektomie am Femur
Symptome einer Osteopenie nachweisbar sind, allerdings waren diese bei adulten Tieren weniger stark
ausgeprägt. Als mögliche Ursache für die unterschiedliche Ausprägung der Symptome kommt der
langsamere Knochen-Turnover der ausgewachsenen Ratten im Vergleich zu den jungen Tieren in
Betracht. Dies zeigt sich auch in der Zusammensetzung des Knochenmarkes, welches bei adulten
Tieren vorwiegend aus gelben Fettmark und bei Jungtieren aus rotem Knochenmark besteht. In
Knochen mit einem höheren Anteil an Fettmark wird im allgemeinen eine langsamere Turnoverrate
nachgewiesen (BARON et al., 1984; WRONSKI et al., 1986, 1989b; THOMPSON et al., 1995).
Calvariae
U
In Bezug auf die Messung des Calvariendurchmessers an fixierten Präparaten liegen differierende
Ergebnisse vor. KLINGE et al. (1995) können eine deutliche und LEHTO-AXTELIUS et al. (1998) eine
nicht signifikante Reduzierung des Durchmessers bei gastrektomierten Ratten nachweisen. Einige
Studien (SURVE et al., 2001a, b; LEHTO-AXTELIUS et al., 2002a) zeigen, daß zwischen
gastrektomierten und sham-operierten Tieren kein Unterschied nachweisbar ist.
Die adulten Ratten in dieser Studie zeigten eine signifikante Zunahme des Calvariendurchmessers und
die jungen Tiere eine nicht signifikante Abnahme. Die Gastrektomie-Studien verschiedener Autoren
wurden mit Ratten verschiedener Altersgruppen (6-12 Wochen) durchgeführt. Unter verschiedenen
Versuchsbedingungen sind keine einheitlichen Ergebnisse zu erwarten, da Ratten in verschiedenen
Altersgruppen einen unterschiedlichen Knochen-Turnover aufweisen (BARON et al., 1984; WRONSKI
et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995).
Aus dem Schrifttum geht hervor, daß sich nach einer Gastrektomie typische Veränderungen an den
Calvariae präsentieren. Dabei handelt es sich um nicht transparente, makroskopisch sichtbare
Bereiche, die sich bei einer Transillumination als „Kriechspuren“ darstellen. Sie werden durch
entstehende Sinusoide, die mit Knochenmark gefüllt sind, verursacht (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998;
2002a, b). An den Calvariae der jungen gastrektomierten Tiere der eigenen Studie war dieses
heterogene Strukturbild bei der Transillumination deutlich zu erkennen (Abb. 43), zusätzlich bestätigen
die Röntgenbilder eine Abnahme der Knochenmasse (Abb. 38). Allerdings zeigten die jungen
Kontrolltiere ebenfalls ein inhomogenes Bild. Bei ihnen stellten sich lichtundurchlässige Bereiche als
101
feines Netz in der Knochenplatte dar (Abb. 42). Der Vergleich mit den Tieren der adulten
Kontrollgruppe, die ein völlig homogenes Bild aufwiesen (Abb. 40) läßt darauf schließen , daß es sich
bei den jüngeren Kontrolltieren um stärker vaskularisiertes Knochengewebe handeln könnte, da sich
diese noch im Wachstum befanden und die Schädeldecken noch nicht vollständig ausgebildet und
verknöchert waren. Ist das Schädeldach wie bei den adulten Tieren vollständig ausgebildet, hat die
Gastrektomie entweder keine Auswirkungen auf die Knochenstruktur, oder die Dauer der Studie war zu
kurz gewählt, um Folgen deutlich werden zu lassen. Immerhin weisen adulte Tiere einen langsameren
Knochen-Turnover als junge Ratten auf. Unter den adulten Tieren beider Gruppen zeigte sich eine
homogene Schädeldachstruktur. Das noch dunklere und homogenere Erscheinungsbild der adulten
gastrektomierten Tiere (Abb. 41) spiegelt die Zunahme des Calvariendurchmessers wider, lies sich
jedoch nicht anhand des Röntgenbildes nachweisen (Abb. 44, 38).
Um einen Vergleich zum Osteoporose-Modell der ovarektomierten Ratte herzustellen, wurden die
Calvariae dieser Tiere ebenfalls transilluminiert abgebildet. Zwei dieser 39 Tiere wiesen ähnliche
Veränderungen auf wie nach einer Gastrektomie. Damit können diese Befunde nicht als charakteristisch
für eine Ovarektomie-Osteoporose eingeschätzt werden, aber als Unterscheidungsmerkmal dieser
verschiedenen
Osteopenien.
Dies
könnte
auch
als
Hinweis
auf
unterschiedliche
Entstehungsmechanismen angesehen werden (SURVE et al., 2001a, b; ANDERSSON et al., 2002).
Gesamtkalzium
U
In der vorliegenden Studie konnte demonstriert werden, daß die Tiere auch nach 49 Tagen
physiologische
Serumkalziumspiegel
aufweisen
(Abb.
46).
Ähnliche
physiologische
Kalziumkonzentrationen können RÜMENAPF et al. (1996) im Serum als auch im Urin nach
Gastrektomie nachweisen was als Hinweis gewertet wird, daß die intestinale Aufnahme von
Spurenelementen wie Kalzium, Magnesium und auch Phosphat nicht beeinträchtigt erscheint. Auch
LEHTO-AXTELIUS et al. (2002a) postulieren in ihrer Studie, daß aufgrund der geringen
Gewichtsabnahme der Tiere nach einer Gastrektomie die Nährstoffaufnahme nicht wesentlich gestört
sein kann. SURVE et al. (2002) zeigen, daß gastrektomierte Ratten auf orale und intravenöse
Kalziumgaben mit einer Hyperkalzämie reagieren, weil das zugeführte Kalzium nicht in den Knochen
eingebaut wird. Die Unfähigkeit des Knochengewebes, Kalzium aufzunehmen und einzubauen, wird
unter anderem als Grund für die Entstehung der Osteopenie diskutiert.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß durch die Gastrektomie bei jungen und adulten Tieren eine
Osteopenie induziert werden kann. Die Ausprägung der Symptome (verminderte Femurdichte,
102
Röntgenbilder und unterschiedliche Calvariendurchmesser) war bei den älteren Tieren weniger deutlich
sichtbar als bei den Jungen. Dies ist auf den altersbedingten langsameren Knochenstoffwechsel
(BARON et al., 1984; WRONSKI et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995) zurückzuführen. Besonders
bei der Darstellung der Strukturveränderungen an den Calvariae konnten in dieser Studie bei den
adulten Tieren keine Veränderungen nachgewiesen werden. Ob die Dauer des Versuches zu kurz
gewählt wurde, oder bei adulten Tieren Strukturänderungen nicht mehr induziert werden können, bleibt
an dieser Stelle offen und bedarf weiterführender Untersuchungen. Der Entstehungsmechanismus der
Osteopenie nach einer Gastrektomie ist nach wie vor unklar. Äthiologisch ausgeschlossen sind eine
mangelhafte Nährstoffaufnahme (RÜMENAPF et al., 1996; LETHO-AXTELIUS et al., 2002a), ein
Vitamin D3-Defizit (LETHO-AXTELIUS et al., 1998), sekundärer Hyperparathyreodismus (RÜMENAPF
B
B
et al., 1996; WOJTYZKA et al., 1998; GEPP et al., 2000) und ein Vitamin B12-Defizit.
B
B
Bezug nehmend auf die Frage, ob sich das Gastrektomie-Modell als Osteoporose-Modell eignet,
erscheint es nach KALU (1991) sinnvoll, ein Tiermodell als Osteoporose-Modell zu wählen, bei dem
aufgrund eines spontanen oder induzierten Sexualhormonverlustes die Knochenmasse abnimmt. Die
Charakteristika und Folgeerscheinungen dieses Knochensubstanzverlustes sollten jedoch in einem oder
mehreren Punkten mit denen übereinstimmen, die bei der postmenopausalen Osteoporose bei Frauen
zu finden sind.
Überträgt man dieses Gedankenmodell von KALU (1991), bei dem es um die Erforschung der
Typ-I-Osteoporose geht, auf das Gastrektomie-Modell der Ratte, so läßt sich feststellen, daß auch beim
Menschen Knochenkrankheiten nach einer Gastrektomie auftreten können. Sie werden als
Osteoporose, Osteomalazie oder als eine Mischung aus beiden beobachtet. Eine Densitometrie zeigt,
daß die Knochendichte bei solchen Patienten vermindert ist. Die Serumkalziumwerte nach einer
Gastrektomie sind bei Patienten mit Symptomen erniedrigt, die Werte von PTH und 1,25-(OH)2
B
B
Vitamin D3 erhöht. Die intestinale Aufnahme von Kalzium ist erniedrigt und die renale
B
B
Kalziumausscheidung erhöht. Zum Teil decken sich diese Ergebnisse mit denen von RÜMENAPF et al.
(1996) und auch mit denen der eigenen Studie. Eine Kalziumsupplemention zeigt keine eindeutige
Verbesserung
des
Zustandes
beim
Menschen.
Das
deutet
auf
einen
ähnlichen
Entstehungsmechanismus der Knochenstoffwechselstörung bei Ratte und Mensch hin, obwohl er bei
beiden Spezies noch nicht genau aufgeklärt ist (TOVEY et al., 1991; LIEDMANN et al., 1997; ZITTEL et
al., 1997).
Da In den letzten Jahren immer häufiger Teil- oder Totalgastrektomien beim Menschen durchgeführt
werden, auch nicht selten vor dem Hintergrund einer Adipositas, ist das Modell der gastrektomierten
Ratte von steigendem Interesse für die Untersuchungen dieser Operationsfolgen. Erhebliche Vorteile
103
bietet das Rattenmodell durch einen geringen Aufwand, standardisierbare Bedingungen und einen
minimalen Zeitaufwand. Das Rattenskelett weist viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen auf, z. B.
den lamellären Knochenaufbau und das Remodeling der Spongiosa, allerdings gibt es auch
Unterschiede wie ein geringeres intrakortikales Remodeling (LI u. MOSEKILDE 1995).
Diese Tatsachen und Gründe und die in dieser Arbeit erhobenen Daten unterstützen die Forderung,
daß Gastrektomie-Modell der Ratte zur Evaluierung neuer Substanzen bei der Behandlung der
Gastrektomie-Osteoporose zu favorisieren. Dabei genügt es allerdings nicht, die Veränderungen an den
Calvariae zu betrachten, da diese Befunde eher alters- als gastrektomieabhängig sein könnten. Aus
diesem Grunde sollte das Alter der Ratten, die an Gastrektomie-Studien teilnehmen, standardisiert
werden, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten und um Manipulationen auszuschließen. Ergebnisse
von Studien, an sehr jungen Ratten, müssen aufgrund des enormen Wachstums der Tiere gekoppelt mit
hohen Modeling- und Remodelingraten grundsätzlich kritisch beurteilt werden (KALU 1991).
104
6. Zusammenfassung
Susanne Stephan
Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im Tiermodell der
ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als Osteoporose-Modell.
Da die postmenopausale Osteoporose mit ihren möglichen Folgefrakturen ein zunehmend wichtiges
Problem darstellt, ist die Entwicklung neuer osteoanabol wirkender Medikamente von erheblicher
Bedeutung. Die Auswertung der Literatur verdeutlicht, daß der säureproduzierende Teil des Magens bei
Ratten und Hühnern als möglicher Bildungsort eines Peptidhormones in Frage kommt, das Einfluß auf
den Knochenaufbau nimmt.
Für die vorliegende Arbeit wurde jeweils ein Extrakt aus 103 Schweinemägen und 420 Liter Hämofiltrat
chromatographisch aufgereinigt, um osteoanabole Substanzen in vitro zu identifizieren und zu
charakterisieren. Die Identifizierung erfolgte durch Stimulierung der membrangebundenen alkalischen
Phosphatase und durch Messung der Zellvitalität (WST-1) von Knochenmarkstamm- und
ROS-17/2.8 Zellen. Die Charakterisierung wurde mittels Subtilisinverdau und durch eine
Aktivitätshemmung mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston durchgeführt. Die anschließende in
vivo Charakterisierung erfolgte mit dem etablierten Osteoporose-Tiermodell der ovarektomierten Ratte.
Dazu wurden 8 Gruppen mit je 5 Tieren zusammengestellt und über eine Dauer von 60 Tagen subkutan
behandelt. 2 Gruppen wurden sham-operiert und eine davon wurde als Kontrollgruppe mit
physiologische NaCl-Lösung, die andere mit einer in vitro aktiven Probe aus Schweinemagen
behandelt. Die restlichen Tiere wurden ovarektomiert und erhielten NaCl als Kontrolle, hPTH 1-37 und
17-β Östradiol als Positivkontrollen, sowie die in vitro aktiven Proben aus Schweinemagen und
Hämofiltrat in zwei Konzentrationen. Nach Tötung der Ratten wurden die Femura und Calvariae
entnommen und röntgenologischen, physikalischen, morphologischen und histomorphometrischen
Untersuchungen unterzogen. Darüber hinaus wurden mit entnommenen Serumproben biochemische
Untersuchungen durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, daß die Ovarektomie zu einer Osteopenie führte. Den
Schweinemagenproben konnte keine und den Hämofiltratproben zum Teil eine osteoanabole Wirkung
105
nachgewiesen werden. Während PTH eine deutliche osteoanabole Wirkung hatte, konnte dies durch die
Behandlung mit 17-β-Östradiol nicht nachgewiesen werden. Eine weitere Aufreinigung der
Schweinemagenprobe und Analyse durch ESI-Spektrometrie und MS/MS Fragmentierung ergab, daß
es sich um das Glukokortikoid Hydrokortison handelte. Die Aufreinigung der Hämofiltratprobe und
folgende Analysen mittels ESI- und NMR-Spektrometrie ergaben, daß es sich hier ebenfalls um
Hydrokortison sowie zusätzlich um das synthetische Glukokortikoid Prednisolon handelte.
In der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin das Gastrektomie-Tiermodell auf seine Eignung als
Osteoporose-Modell beurteilt. Dazu wurden 5 adulte und 5 junge Tiere gastrektomiert, aber keiner
Behandlung unterzogen. Parallel dazu wurden 5 adulte und 5 junge Tiere als Kontrollgruppen gehalten.
Nach 42 Tagen wurden entsprechend der Ovarektomie-Studie die Femura und Calvariae präpariert und
untersucht. An den Calvariae der adulten Ratten konnten im Gegensatz zu den jungen Tieren keine
Veränderungen festgestellt werden. Insgesamt beurteilt war die Osteopenie bei den jüngeren Tieren
stärker ausgeprägt, als bei den ältern Tieren.
Die Eignung des Gastrektomie-Tiermodells für die Erforschung der gastrektomie-Osteoporose und die
Evaluierung eventueller Substanzen zur Behandlung dieser Erkrankung wird durch die Daten dieser
Gastrektomie-Studie unterstützt und bedarf aber einer Standardisierung hinsichtlich Alter, Geschlecht,
Behandlungsdauer und Behandlungsart der Tiere.
106
7. Summary
Susanne Stephan
Characterization of antiosteoporotic activities and factors using the animal model of the
ovariectomized respectively gastrectomized rat as an osteoporosis-model.
The post-menopausal osteoporosis with the potentially following elevated fracture incidence is a
continuously growing problem. Therefore there is a big interest in the development of agents with an
osteoanabolic effect. Literature analysis makes clear that the acid producing part of the stomach of rats
and chicken may be a site producing of a peptide hormone that influences bone turnover and stability.
For the present dissertation work both an extract of 103 pig stomachs and 420 liter hemofiltrate was
used to purify chromatographically and characterize osteoanabolic substances in vitro. The identification
of these osteoanabolic activities was based on measuring the induction of the activity of membrane
bound alkaline phosphatase and the cell viability/number in cells derived from bone marrow as well as
the osteosarcoma cell line ROS-17/2.8. The characterization was completed by a Subtilisin digest and
inhibition of activity by the steroid receptor antagonist mifepristone. The following in vivo
characterization was done using the established osteoporosis animal model of the ovariectomized rat.
Therefore 8 groups with each time 5 animals were arranged and treated subcutaneous for a period of
60 days. 2 groups were sham-operated. One group served as a control and was treated with
physiological salt solution, the other one with an in vitro active fraction derived from porcine stomach.
The remaining animals were ovariectomized treated with physiological salt solution as control,
hPTH 1-37 and 17-β estradiol as positive control as well as the in vitro active fractions derived from
porcine stomach and hemofiltrate in two concentrations. After killing the rats the femura and calvaria
were excised and examined by X-ray as well as physical, morphological and histomorphometrical
methods. Moreover serum samples taken on different days during the experiment were tested for
biochemical parameters like serum calcium and osteocalcin levels.
Data show that ovariectomy resulted in osteopenia. There was no proof for the presence of an
osteoanabolic effect in porcine stomach and partly for the hemofiltrate extracts. While hPTH had a
significant osteoanabolic effect, it could not be proven for the treatment with 17-β-estradiol.
107
An additional purification of the porcine stomach sample and analysis by ESI-spectrometry and MS/MS
fragmentation revealed that the activity is the glucocorticoid hydrocortisone. The purification of the
hemofiltrate sample and following analysis with ESI- and NMR-spectrometry showed that it is likewise
hydrocortisone as well as in addition to that the synthetic glucocorticoid prednisolone.
In this work the gastrectomy animal model was investigated for its suitability as an osteoporosis model.
Therefore 5 adult and 5 young animals were gastrectomized without any further treatment. Parallel
5 adult and 5 young animals were taken as a control group. After 42 days the femura and calvaria were
prepared and examined corresponding to the ovariectomy study. In opposite to the findings in the young
animals there was no change in the calvarial structure of the adult rats. Taken together the osteopenia
is more pronounced in the younger animals than in the older ones. The suitability of the gastrectomy
model to explore the gastrectomy-induced osteoporosis and the evaluation of potential substances for
the treatment of this disease is supported by the data of this study but needs father standardization with
respect to age, sex, duration of treatment and method of treatment from the animals.
108
8. Literaturverzeichnis
AARDEN, E. M., A. M. WASSENAAR,M. J. ALBLAS u. P. J. NIJWEIDE (1996):
Immunocytochemical demonstration of extracellular matrix proteins in isolated osteocytes.
Histochem. Cell Biol. 106, 495-501
U
U
ABE, T., J. W. CHOW, J. M. LEAN u. T. J. CHAMBERS (1993):
Estrogen does not restore bone lost after ovariectomy in the rat.
J. Bone Miner. Res.8, 831-838
U
U
ABU, E. O., A. HORNER, V. KUSEC, J. T. TRIFFITT u. J. E. COMPSTON (1997):
The localization of androgen receptors in humane bone.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3493-3497
U
U
ABU, E. O., A. HORNER, V. KUSEC, J. T. TRIFFITT u. J. E. COMPSTON (2000):
The localization of the functional glucocorticoid receptor-α in humane bone.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, 883-889
U
U
AITKEN, J. M., E. ARMSTRONG u. J. B. ANDERSSON (1972):
Osteoporosis after oophorectomy in the mature female rat and the effect of oestrogen and/or
progestrogen replacement therapy in its prevention.
J. Endocrinol. 55, 79-87
U
U
ÅKESSON, K. (2003)
New approaches to pharmacological treatment of osteoporosis.
Bull. World Health Organ. 81,
U
U
ANDERSSON, N., V. V. SURVE, D. LEHTO-AXTELIUS, C. OHLSSON, R. HÅKANSON, K.
ANDERSSON u. B. RYBERG (2002):
Drug-induced prevention of gastrectomy- and ovariectomy-induced osteopenia in the joung female rat.
J. Endocrinol. 175, 695-703
U
U
AUBIN, J. E., F. LIU, L. MALAVAL u. A. K. GUPTA (1995):
Osteoblast and chondroblast differentiation.
Bone. 17 Suppl., 77S-83S
U
U
AUBIN, J. E., u J. E. TRIFFITT (2002):
Mesenchymal stem cells and osteoblast differentiation.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 59, 63, 70
AVIOLI, L. V. (1984):
Effects of chronic corticosteroid therapy on mineral metabolism and calcium absorption.
Adv. Exp. Med. Biol. 171, 81-9
U
U
109
BARON, R., R. TROSS u. Y. A. VIGNER (1984):
Evidence of sequential remodeling in rat trabecular bone: morphology, dynamic histomorphometry, and
changes during skeletal maturation.
Anat. Rec. 208, 137-145
U
U
BLUMENFELD, I., S. SROUJI, Y. LANIR, D. LAUFER u.E. LIVNE (2002):
Enhancement of bone defect healing in old rats by TGF-beta and IGF-1.
Exp. Gerontol. 37, 553-565
U
U
BOIVIN, G., P. MESGUICH, J. W. PIKE, R. BOUILLON, P. J. MEUNIER, M. R. HAUSSLER, P. M.
DUBOIS u. G. MOREL (1987):
Ultrastructural immunocytochemical localization of endogenous 1, 25-dihydroxyvitamin D3 and its
receptors in osteoblasts and osteocytes from neonatal mouse and rat calvaria.
Bone Miner. 3, 125-136
B
U
B
U
BRAIDMAN, I. P., L. K. DAVENPORT, D. H. CARTER, P. L. SELBY, E. B. MAWER u. A. T.
FREEMONT (1995):
Preliminary in situ identification of estrogen target cells in bone.
J. Bone Miner. Res.10, 74-80
U
U
BROWN, J. P., D. L. KENDLER, M. R. MC CLUNG, R. D. EMKEY, J. D. ADACH, M. A. BOLOGNESE
U. R. LINDSAY (2002):
The efficacy and tolerability of risedronate once a week for the treatment of postmenopausal
osteoporosis.
Calcif. Tissue Int. 71, 103-111
U
U
BUCKWALTER, J. A., M. J. GLIMCHER, R. R. COOPER u. R. RECKER (1996):
Bone biology I: structure, blood supply, cells, matrix, and mineralisation.
Instr. Course Lect. 45, 371-386
U
U
BUNDESAMT FÜR VETERINÄRWESEN (1995):
Blutentnahme bei Labornagetieren und Kaninchen zu Versuchszwecken.
Information Tierschutz 3.02
BURGER, E. H., u. J. KLEIN-NULEND (1999):
Mechanotransduction in bone-role of the lacuno-canalicular network.
FASEB J. 13 Suppl., 101S-102S
U
U
CANALIS, E. (1983):
Effect of glucocorticoids on type I collagen synthesis, alkaline phosphatase activity, and
deoxyribonucleic acid content in cultured rat calvariae.
Endocrinology. 112, 931-939
U
U
CARE, A. D., R. F. L. BATES, R. SWAMINATHAN u. P. C. GANGULI P (1971a):
The role of gastrin as a calcitonin secretagogue.
J. Endocrinol. 51, 735-744
U
U
110
CARE, A. D., J. B. BRUCE, J.BOELKINS, A. D. KENNY, H. CONAWAY u. C. S. ANAST (1971b):
Role of pancerozymin-cholecystokinin and structurally related compounds as calcitonin secretagogues.
J. Endocrinol. 89, 262-271
U
U
CHAMBERS, T. J., J. A. DARBY u. K. FULLER (1985):
Mammalian collagenase predisposes bone surfaces to osteoclastic resorption.
Cell Tissue Res. 241, 671-675
U
U
COOPER, C. W., W. H. SCHWESINGER, A. M. MAHGOUB u. D. A. ONTJES (1971):
Thyrocalcitonin: stimulation of secretion by pentagastrin.
Science. 172, 1238-1240
U
U
COOPER, C. W., W. H. SCHWESINGER, D. A. ONTJES, A. M. MAHGOUB u. P. L. MUNSON (1972a):
Stimulation of secretion to pig thyrocalcitonin by gastrin and related hormonal peptides.
J. Endocrinol. 91, 1079-1089
U
U
COOPER, C. W., C. R. BIBBERSTAFF, C. W. WISEMAN u. M. F. CARLONE (1972b):
Hypocalcemic effect of pentagastrin and related gastrointestinal hormonal peptides in the rat.
J. Endocrinol. 91, 1455-1461
U
U
COWIN, S. C., L. MOSS-SALENTIJN u. M. L. MOSS (1991):
Candidates for the mechanosensory system in bone.
J. Biomech. Eng. 113, 191-197
U
U
DA PAZ, L. H. B. C., V. DE FALCO, N. C. TENG, L. M. DOS REIS, R. M. R. PEREIRA u. V. JORGETTI
(2001):
Effect of 17-β estradiol or alendronate on the bone densitometry, bone histomorphometry and bone
metabolism of ovariectomized rats.
Braz. J. Med. Biol. Res. 34, 1015-1022
U
U
DANIELL, H. W. (1976):
Osteoporosis of the slender smoker.
Arch. Intern. Med. 136, 298-304
U
U
DEMPSTER, D. W., R. BIRCHMAN, R. XU, R. LINDSAY u. V. SHEN (1995):
Temporal changes in cancellous bon structure of rats immediately after ovariectomy.
Bone. 16, 157-161
U
U
DONAUE, H. J., K. J. MCLEOD, C. T. RUBIN, J. ANDERSEN, E. A. GRINE, E. L. HERTZBERG u. P.
R. BRINK (1995):
Cell-to-cell communication in osteoblastic networks: cell line-dependent hormonal regulation of gap
junction function.
J. Bone Miner. Res. 10, 881-889
U
U
DORNONVILLE DE LA COUR, C., M. BJORKQVIST, A. K. SANDVIK, I. BAKKE, C. M. ZHAO, D.
CHEN u. R. HÅKANSON (2001):
A-like cells in the rat stomach contain ghrelin and do not operate under gastrin control.
Regul. Pept. 99,141-150
U
U
111
DRAKE, F. H., R. A. DODDS, I. E. JAMES, J. R. CONNOR, C. DEBOUCK, S. RICHARDSON, E. LEERYKACZEWSKI, L. COLEMAN, D. RIEMAN, R. BARTHLOW, G. HASTINGS u. M. GOWEN (1996):
Cathepsin K, but not cathepsins B, L, or S, is abundantly expressed in human osteoclasts.
J. Biol. Chem. 271, 12511-12516
U
U
ERIKSEN, E. F., D. S. COLVARD, N. J. BERG, M. L. GRAHAM, K. G. MANN, T. C. SPELSBER u. B. L.
RIGGS (1988):
Evidence of estrogen receptors in normal human osteoblast-like cells.
Science. 241, 84-86
U
U
FAUGERE, M. C., S. OKAMOTO, H. F. DELUCA u. H. H. MALLUCHE (1986):
Calcitriol corrects bone loss induced by oophorectomy in rats.
Am. J. Physiol. 250, E 35-38
U
U
FERRETTI, J. L., VÁZQUEZ, C. J. DELGADO, R. CAPOZZA u. G. COINTRY (1992):
Biphasic dose-response curves of cortisol effects on rat diaphyseal bone biomechanics.
Calcif. Tissue Int. 50, 49-54
U
U
FORWOOD, M. R., W. L. KELLY u. N. F. WORTH (1998):
Localisation of prostaglandin endoperoxide H synthase (PGHS)-1 and PGHS-2 in bone following
mechanical loading in vivo.
Anat. Rec. 52, 580-586
U
U
GEPP, H., M. KOCH, P. O. SCHWILLE, R. G. ERBEN, G. RÜMENAPF, A. SCHMIEDL u. W. FRIES
(2000):
Vagus-sparing gastric fundectomy in the rat: development of osteopenia, relationship to urinary
phosphate and net acid excretion, serum gastrin and vitamin D.
J. Exp. Med. 200, 1-16
U
U
GEUSENS, P., J. DEQUEKER, J. NIJS u. E. BRAMM (1990):
Effect of ovariectomy and prednisolone on bone mineral content in rats: evaluation by single photon
absorptiometry and radiogrammetry.
Calcif. Tissue Int. 47, 243-250
U
U
GOULDING, A., u. E. GOLD (1988):
Effects of chronic prednisolone treatment on bone resorption and bone composition in intact and
ovariectomized rats and in ovariectomized rats receiving β-estradiol.
Endocrinology. 122, 482-487
U
U
GRUBER, H. E., J. L. IVEY, E. R. THOMPSON, C. H. CHESTNUT u. D. J. BAYLINK (1986):
Osteoblast and osteoclast cell number and cell activity in postmenopausal osteoporosis.
Miner. Electrolyte Metab. 12, 246-254
U
U
HÅKANSON, R., L. I. LARSSON, G. LIEDBERG, J. OSCARSON, F. SUNDLER u. J. VANG (1976):
Effects of antrectomy or porta-caval shunting on the histamine-storing endocrine-like cells in oxyntic
mucosa of rat stomach. A fluorescence histochemical, electron microscopic and chemical study.
J. Physiol. 259, 785-800
U
U
112
HÅKANSON, R., P. PERSSON, J. AXELSON, O. JONELL u. F. SUNDLER (1990a):
Evidence that Gastrin enhances 45Ca uptake into bone through release of a gastric hormone.
Regul. Pept. 28, 107-118
P
U
P
U
HÅKANSON, R., P. PERSSON u. J. AXELSON (1990b):
Elevated serum gastrin after food intake or acid blockade evokes hypocalcemia.
Regul. Pept. 28, 131-136
U
U
HEANEY, R. P., R. R. RECKER u. P. D. SAVILLE (1978):
Menopausal changes in bone remodeling.
J. Lab. Clin. Med. 92, 964-970
U
U
HOCK, D., M. MÄGERLEIN, G. HEINE, P. P. OCHLICH u. W.-G. FORSSMANN (1997):
Isolation and characterization of the bioactive circulatin human parathyroid hormone, hPTH-1-37.
FEBS Lett. 400, 221-225
U
U
HOCK, J. M., L. A. FITZPATRICK u. BILEZIKIAN J. B. (2002):
Actions of parathyroid hormone.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 463-481
HODSMAN, A. B., M. KISIEL, J. D. ADACHI, L. J. FRAHER u. P. H. WATSON (2000):
Histomorphometric evidence for increased bone turnover without change in cortical thickness or porosity
after 2 years of cyclical hPTH (1-34) therapy in women with serve osteoporosis.
Bone. 27, 311-318
U
U
HSU, H., D. L. LACEY, C. R. DUNSTAN, I. SOLOVYEV, A. COLOMBERO, E. TIMMS, H.-L. TAN, G.
ELLIOTT, M. J. KELLEY, I. SAROSI, L. WANG, X.-Z. XIA, R. ELLIOTT, L. CHIU, T. BLACK, S.
SCULLY, C. CAPPARELLI, S. MORONY, G. SHIMAMOTO, M. B. BASS u. W. J. BOYLE (1999):
Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation
induced by osteoprotegerin ligand.
Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 3540-3545
U
U
HUISKES, R., R. RUIMERMAN, G. H. VAN LENTHE u. J. D. JANSSEN (2000):
Effects of mechanical forces on maintenance and adaption of form in trabecular bone.
Nature. 404, 704-706
U
U
IATA – Richtlinien für den Transport von lebenden Tieren (Juli 2001):
Bekanntmachung der deutschen Übersetzung der 26. Auflage
Kapitel Nr. 200/23, Containerrichtlinie 81
113
IMAI, S., M. KAKSONEN, E. RAULO, T. KINNUNEN, C. FAGES, X. MENG, M. LASKO u. H. RAUVALA
(1998):
Osteoblast recruitment and bone formation enhanced by cell matrix-associated heparin-binding growthassociated molecule (HB-GAM).
J. Cell Biol. 143, 1113-1128
INAOKA, T., G. BILBE, O. ISHIBASHI, K. TEZUKA, M. KUMEGAWA u. T. KOKUBO (1995):
Molecular cloning of human cDNA for cathepsin K: novel cysteine proteinase predominantly expressed
in bone.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 89-96
U
U
U
U
INGBER, D. (1991):
Integrins as mechanochemical transducers.
Curr. Opin. Cell Biol. 3, 841-848
U
U
JAP, D., P. G. OPPELT, P. FASCING, D. NIEDERACHER u. M. W. BECKMANN (2001):
Genetics of osteoporosis.
J. Menopause. 1, 10-16
U
U
JILKA, R. L., R. S. WEINSTEIN, T. BELLIDO, P. ROBERSON, A. M. PARFITT u. S. C. MANOLAGAS
(1999):
Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with parathyroid hormone.
J. Clin. Invest. 104, 371-373
U
U
JIMENEZ, M. J. G., M. BALBIN, J. ALVAREZ, T. KOMORI, P. BIANCO, K. HOLMBECK, H. BIRKEDALHANSEN, J. M. LOPEZ u. C. LOPEZ-OTIN (2001):
A regulatory cascade involving retinoic acid, Cbfa1, and matrix metalloproteinases is coupled to the
development of a process of perichondral invasion and osteogenic differentiation during bone formation.
J. Cell Biol. 155, 1333-1344
U
U
JONES, S. J., u. A. BOYDE (1976):
Experimental study of changes in osteoblastic shape induced by calcitonin und parathyroid extract in an
organ culture system.
Cell Tissue Res. 169, 449-465
U
U
KALU, D. N. (1984):
Evaluation of the pathogenesis of skeletal changes in ovariectomized rats.
Endocrinology. 115, 507-512
U
U
KALU, D. N. (1991):
The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss.
Bone Miner. 15, 175-191
U
U
KAMIOKA, H., T. HONJO u. T. TAKANO-YAMAMOTO (2001):
A three-dimensional distribution of osteocyte processes revealed by the combination of confocal laser
scanning microscopy and differential interference contrast microscopy.
Bone. 28, 145-149
U
U
114
KAPLAN, E. L., P. T. NORTH, H. P. NORBERG, J. A. SCHULAK u. B. J. HILL (1977):
Evidence for a role of the stomach in serum calcium regulation.
J. Surg. Res. 22, 237-241
U
U
KAVUNCU, V., S. SAHIN, G. BAYDAS, N. ILHAN, I. OZERCAN, A. YASAR, I. PEKKUTUCU, N. ILHAN
u. R. OZERCAN (2003):
A comparison of estrogen and two different doses of calcitonin in ovariectomized rats.
Yonsei Med. J. 44, 508-516
U
U
KIERDORF H. (1994)
Knochen- und Zahn-Dünnschliffe für die Lichtmikroskopie.
Mikrokosmos. 83, 31-34
U
U
KIMMEL, D. B., u. T. J. WRONSKI (1990):
Nondestructive measurement of bone mineral in femurs from ovariectomized rats.
Calcif. Tissue Int. 46, 101-110
U
U
KIMMEL, D. B., R. P. BOZZATO, K. A. KRONIS, T. COBLE, D. SINDREY, P. KWONG u. R. R.
RECKER (1993):
The effect of recombinant human (1-84) or synthetic human (1-34) parathyroid hormone on the skeleton
of adult osteopenic ovariectomized rats.
Endocrinology. 132, 1577-1584
U
U
KIMMEL, D. B. (2002):
Animal Models in Osteoporosis Research.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Band II, Academic Press, New York, S. 1641
KING, C. S., E. C. WEIR, C. W. GUNDBERG, J. FOX u. K. L. INSOGNA (1996):
Effects of continuous glucocorticoid infusion on bone metabolism in the rat.
Calcif. Tissue Int. 59, 184-191
U
U
KLEMENTSCHITSCH, P., E. L. KAPLAN, H. HEATH, P. NORTH u. H.-L. LEE (1979):
A gastric factor, calcitonin, and the hypocalcemia induced by gastrointestinal hormones.
Endocrinology. 105, 1243-1247
U
U
KLINGE, B., D. LEHTO-AXTELIUS, M. ÅKERMAN u. R. HÅKANSON (1995):
Structure of calvaria after gastrectomy. An experimental study in the rat.
Scand. J. Gastroenterol. 30, 953-957
U
U
KOJIMA, M., H. HOSODA, Y. DATE, M. NAKAZATO, H. MATSUO u. K. KANGAWA (1999):
Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach.
Nature. 402, 656-660
U
U
115
KONG, Y.-Y., H. YOSHIDA, I. SAROSI, H.-L. TAN, E. TIMMS, C. CAPPARELLI, S. MORONY, A. J.
OLIVIERA-DOS-SANTOS, G. VAN, A. ITIE, W. KHOO, A. WAKEHAM, C. R. DUNSTAN, D. L. LACEY,
T. W. MAK, W. J. BOYLE u. J. M. PENNINGER (1999):
OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node
organogenesis.
Nature. 397, 315-323
U
U
KRISHNAMRA, N., u. L. LIMLOMWONGSE (1981):
Possible role and mode of action of gastrin on calcium homeostasis in the rat.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168, 65-71
U
U
LACEY, D. L., E. TIMMS, H.-L. TAN, M. J. KELLEY, C. R. DUNSTAN, T. BURGESS, R. ELLIOTT, A.
COLOMBERO, G. ELLIOTT, S. SCULLY, H. HSU, J. SULLIVAN, N. HAWKINS, E. DAVY, C.
CAPPARELLI, A. ELI, Y. X. QIAN, S. KAUFMAN, I. SAROSI, V. SHALHOUB, G. SENALDI, J. GUO, J.
DELANY u. W. J. BOYLE (1998):
Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.
Cell. 93, 165-176
U
U
LAKKAKORPI,P. T., u. H. K. VÄÄNÄNEN (1996)
Cytoskeletal changes in osteoclasts during the resorption cycle.
Microsc. Res. Tech. 33, 171-181
U
U
LANG, F. (1995):
Koordination spezieller Organfunktionen
in: P. DEETJEN u. E. J. SPECKMANN (Hrsg.):Physiologie
Verlag Urban und Schwarzenberg, 2. Auflage, S. 555-556
LARSSON, B., A. GRITLI-LINDE, P. NORLEN, E. LINDSTRÖM u. R. HÅKANSON (2000):
Extracts of ECL-cell granules/vesicles and of isolated ECL cells from rat oxyntic mucosa evoke a Ca2+
second messenger response in osteoblastic cells.
Regul. Pept. 97, 153-161
P
U
P
U
LEHTO-AXTELIUS, D., M. STENSTRÖM u. O. JOHNELL (1998):
Osteopenia after gastrectomy, fundectomy or antrectomy: an experimental study in the rat.
Regul. Pept. 78, 41-50
U
U
LEHTO-AXTELIUS, D., V. V. SURVE, O. JOHNELL u. R. HÅKANSON (2002a):
Effects of calcium deficiency and calcium supplementation on gastrectomy-induced osteopenia in the
young male rat.
Scand. J. Gastroenterol. 37, 299-306
U
U
LEHTO-AXTELIUS; D., D. CHEN, V. V. SURVE u. R. HÅKANSON (2002b):
Post-gastrectomy osteopenia in the rat: bone structure is preserved by retaining 10%-30% of the oxyntic
gland area.
Scand. J. Gastroenterol. 37, 437-434
U
U
LI, M., u. L. MOSEKILDE (1995):
Assessing bone quality-animal models in preclinical osteoporosis research.
Bone. 17 Suppl., 343S-352S
U
U
116
LI, M., Y. SHEN u. T. J. WRONSKI (1997):
Time course of femoral neck osteopenia in ovariectomized rats.
Bone. 20, 55-61
U
U
LIEBICH, H.-G. (1993):
Funktionelle Histologie
Verlag Schattauer, Stuttgart-New York, 2. Auflage, S. 64-71
LIEDMAN, B., I. BOSAEUS, D. MELLSTROM u. L. LUNDELL (1997):
Osteoporosis after total gastrectomy. Results of a prospective, clinical study.
Scand. J. Gastroenterol. 32, 1090-2005
U
U
LINDBERG, M. K., S. MOVERARE, A. L. ERIKSSON, S. SKRTIC, H. GAO, K. DAHLMAN-WRIGHT, J.
A. GUSTAFSSON u. C.OHLSSON (2002):
Identification of estrogen-regulated genes of potential importance for the regulation of trabecular bone
mineral density.
J. Bone Miner. Res. 17, 2183-2195
U
U
LINDGREN, U., u. T. S. LINDHOLM (1979):
Effect of 1-alpha-hydroxyvitamin D3 on osteoporosis in rats induced by oophorectomy.
Calcif. Tissue Int. 27, 161-164
U
U
LINDGREN, U., u. H. F. DELUCA (1982):
Role of parathyroid hormone and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in the development of osteopenia in
oophorectomized rats.
Calcif. Tissue Int. 34, 510-514
U
U
LIMLOMWONGSE, L., u. N. KRISHNAMRA (1981):
The mechanism of action and target organ of gastrin-induced hypocalcemia.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168, 72-76
U
U
MACKIE, E. J., u. S. RAMSEY (1996):
Modulation of osteoblast behaviour by tenascin.
J. Cell. Sci. 109, 1597-1604
U
U
MACKIE, E. J. (2003):
Osteoblasts: novel roles in ochestration of skeletal architecture.
Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 1301-1305
U
U
MAJESKA, R. J., S. B. RODAN u. G. A. RODAN (1980):
Parathyroid hormone-responsive clonal cell lines from rat osteosarcoma.
Endocrinology. 107, 1494-1503
MAJESKA, R. J.; B. C. NAIR u. G. A. RODAN (1985):
Glucocorticoid regulation of alkaline phosphatse in the osteoblastic osteosarcoma cell line ROS 17/2.8.
Endocrinology. 116,170-179
U
U
117
MARIE, P. (1997):
Growth factors and bone formation in osteoporosis: roles for IGF-1 and TGF-beta.
Rev. Rhum. 64, 44-53
U
U
MARKS, S. C., u. P. R. ODGREN (2002):
Structure and development of the skeleton.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ, u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Band I, Academic Press, New York, S. 3-13
MAROTTI, G. (1996):
The structure of bone tissues and the cellular control of their desposition.
Ital., J. Anat. Embryol. 101, 25-79
U
U
MATSUDA, H., A. TANAKA u. A. ITAKURA (2000):
Immunology and Hematology.
in: G. J. KRINKE (Hrsg.): The Laboratory Rat.
Academic Press, New York, S. 442
MC CULLOCH, C. A. G. u. H. C. TENENBAUM (1986):
Dexamethasone induces proliferation and terminal differentiation of osteogenic cells in tissue culture.
Anat. Rec. 215, 397-402
U
U
MELTON, L. J.(1995):
Perspectives: How many women have osteoporosis now?
J. Bone Miner. Res.10, 175-176
U
U
MIKUNI-TAKAGAKI, Y., Y. KAKAI, M. SATOYOSHI, E. KAWANO, Y. SUZUKI, T. KAWASE u. S.
SAITO (1995):
Matrix mineralization and the differentiation of osteocyte-like cells in culture.
J. Bone Miner. Res.10, 231-242
U
U
MILLER, S. C., u. T. J. WRONSKI (1993):
Long-term osteopenic changes in cancellous bone structure in ovariectomized rats.
Anat. Rec. 236, 433-441
U
U
MOSEKILDE, L., C. C. DANIELSEN u. U. B. KNUDSEN (1993):
The effect of aging and ovariectomy on the vertebral bone mass and biomechanical properties of
mature rats.
Bone. 14, 1-6
U
U
MOSEKILDE, L., C. C. DANIELSEN u. J. GASSER (1994):
The effect on vertebral bone mass and strength of long term treatment with antiresorptive agents
(estrogen and calcitonin), human parathyroid hormone-(1-38), and combination therapy, assessed in
aged ovariectomized rats.
J. Endocrinol. 134, 2126-2134
U
U
118
MULLENDER, M. G., u. R. HUISKES (1997):
Osteocytes and bone lining cells: which are the best candidates for mechano-sensors in cancellous
bone?
Bone. 20, 527-532
U
U
MÜHLBAUER, R. C., R. K. SCHENK, D. CHEN, D. LEHTO-AXTELIUS u. R. HÅKANSON (1998):
Morphometric analysis of gastrectomy-evoked osteopenia.
Calcif. Tissue Int. 62, 323-326
U
U
NESBITT, S., A. NESBIT, M. HELFRICH u. M. HORTON (1993):
Biochemical characterization of human osteoclast integrins.
J. Biol. Chem. 268, 16737-16745
U
U
NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (1987):
Lehrbuch der Anatomie der Haustiere.
6. Aufl., Bd. II, Eingeweide.
Verlag Paul Parey, S. 148
NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (1992):
Lehrbuch der Anatomie der Haustiere.
6. Aufl., Bd. I, Bewegungsapparat.
Verlag Paul Parey, S. 15-27
NIJWEIDE, P. J., E. H. BURGER u. J. KLEIN-NULEND (2002):
The Osteocyte.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ, u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 94
NOBLE, B. S., H. STEVENS, N. LOVERIDGE u. J. REEVE (1997):
Identification of apoptotic changes in osteocytes in normal and pathological human bone.
Bone. 20, 273-282
U
U
OGAWARA, M., K. AOKI, T. OKIJI u. H. SUDA (1997):
Effect of ascorbic acid deficiency on primary and reparative dentinogenesis in nonascorbate-synthesizing ODS rats.
Arch. Oral Biol. 42, 695-704
U
U
OKADA, Y., K. NAKA, K. KAWAMURA, T. MATSUMOTO, I. NAKANISHI, N. FUJIMOTO, H. SATO u.
M. SEIKI (1995):
Localization of matrix metalloproteinase 9 (92-kilodalton gelatinase/type IV collagenase = gelatinase B)
in osteoclasts: Implications for bone resorption.
Lab. Invest. 72, 311-322
U
U
OLNEY, R. C. (2003):
Regulation of bone mass by growth hormone.
Med. Pediatr. Oncol. 41, 228-234
U
U
119
ØRTOFT, G., u. H. OXLUND (1988):
Reduced strength of rat cortical bone after glucocorticoid treatment.
Calcif. Tissue Int. 43, 376-382
U
U
ØRTOFT, G., T. T. ANDREASSEN u. H. OXLUND (1999):
Growth hormone increases cortical and cancellous bone mass in young growing rats with
glucocorticoid-induced osteopenia.
J. Bone Miner. Res. 14, 710-721
U
U
PALOKANGAS, H., M. MULARI u. K. H. VÄÄNÄNEN (1997):
Endocytic pathway from the basal plasma membrane to the ruffled border membrane in bone-resorbing
osteoclasts.
J. Cell. Sci. 110, 1767-1780
U
U
PARFITT, A. M. (1977):
The cellular basis of bone turnover and bone loss: a rebuttal of the osteocytic resorption-bone flow
theory.
Clin. Orthop. 127, 236-247
U
U
PECK, W. A., J. BRANDT u. I. MILLER (1967):
Hydrocortisone-induced inhibition of protein synthesis and uridine incorporation in isolated bone cells in
vitro.
Proc. Natl. Acad. Sci. 57, 1599-1606
U
U
PENSLER, J. M., J. A. RADOSEVICH, R. HIGBEE u. C. B. LANGMAN (1990):
Osteoclasts isolated from membranous bone in chlidren exhibit nuclear estrogen and progesterone
receptors.
J. Bone Miner. Res. 5, 797-802
U
U
PERSSON, P., R. HÅKANSON, J. AXELSON u. F. SUNDLER (1989):
Gastrin releases a blood calcium-lowering peptide from the acid producing part of the stomach.
Medical Sciences. 86, 2834-2838
U
U
PERSSON, P., R. GAGNEMO-PERSSON, J. ÖRBERG, D. CHEN u. R. HÅKANSON (1991):
Effects of Gastrin on Calcium Homeostasis in Chickens.
Endocrinology. 129, 1162-1166
U
U
PERSSON, P., R. GAGNEMO-PERSSON, D. CHEN, J. AXELSON, A. G. NYLANDER, O. JOHNELL u.
R. HÅKANSON (1993):
Gastrectomy causes bone loss in the rat: is lack of gastric acid responsible?
Scand. J. Gastroenterol. 28, 301-306
U
U
POLLACK, S. R., R. SALZSTEIN u. D. PIENKOWSKI (1984):
The electric double layer in bone and its influence on stress-generated potentials.
Calcif. Tissue Int. 36 Suppl., 77S-81S
U
U
PRUMMEL, M. F., W. M. WIERSINGA, P. LIPS, G. T. B. SANDERS u. H. P. SAUERWEIN (1991):
The course of biochemical parameters of bone turnover during treatment with corticosteroids.
J. Clin. Endo. Meta. 72,382-386
U
U
120
REEVE, J., R. HESP, D. WILLIAMS, P. HULME, L. KLENERMAN, J. M. ZANELLI, A. J. DARBY, G. W.
TREGEAR u. J. A. PARSONS (1976):
Anabolic effect of low doses of a fragment of human parathyroid hormone on the skeleton in
postmenopausal osteoporosis.
Lancet. 15, 1035-1038
U
U
REINACHER, M. (1999):
Stütz- und Bewegungsapparat
in: E. DAHME u. E. WEISS (Hrsg.): Grundriß der speziellen patologischen Anatomie der Haustiere.
Verlag Enke, 5. Auflage, S. 320-326
RESCH, H., P. PIETSCHMANN, B. PERNECKER, E. KREXNER u. R. WILLVONSEDER (1992):
The influence of partial gastrectomy on biochemical parameters of bone metabolism and bone density.
Clin. Investig. 70, 426-429
U
U
RIGGS, B. L., u. L. J. MELTON (1986):
Involutional osteoporosis.
N. Engl. J. Med. 314, 1676-1686
U
U
RIGGS, B. L., S. KHOSLA, E. J. ATKINSON, C. R. DUNSTAN u. L. J. MELTON 3rd (2003):
Evidence that type I osteoporosis results from enhanced responsiveness of bone to estrogen deficiency.
Osteoporosis. Int. 14, 728-733
U
U
ROBEY, G. P. (2002):
Bone matrix proteoglycans and glycoproteins.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAIS u. G. A. RODAN: Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 225-237
RODAN, G. A., R. G. LAWRENCE u. BILEZIKIAN J. P. (2002):
Pathophysiology of Osteoporosis.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band II, S. 1275, 1277
ROSSOUW, J. E., G. L. ANDERSON, R. L. PRENTICE, A. Z. LACROIX, C. KOOPERBERG, M. L.
STEFANICK, R. D. JACKSON, S. A. BERESFORD, B. V. HOWARD, K. C. JOHNSON, J. M. KOTCHEN
u. J. OCKENE (2002):
Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results from
the Women`s Health Initiative randomized controlled trial.,
JAMA 288, 321-233
U
U
ROUDEBUSH, R. E., D. E. MAGEE, D. N. BENSLAY, A. M. BENDELE u. H. U. BRYANT (1993):
Effect of weight manipulation on bone loss due to ovariectomy and the protective effects of estrogen in
the rat.
Calcif. Tissue Int. 53, 61-64
U
U
121
RUBIN, J., C. L. ACHERT-BICKNELL, L ZHU, X. FAN, T. C. MURPHY, M. S. NANES, R. MARCUS, L.
HOLLOWAY, W. G. BEAMER u. C. J. ROSEN (2002):
IGF-I regulates osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand in vitro
and OPG in vivo.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 4273-4279
U
U
RÜMENAPF, G., P. O. SCHWILLE, R. G. ERBEN, M SCHREIBER, W. FRIES, A. SCHMIEDL u. W.
HOHENBERGER (1997):
Osteopenia following total gastrectomy in the rat – state of mineral metabolism and bone
histomorphometry.
Eur. Surg. Res. 29, 209-221
U
U
SAKAMOTO, S u. M. SAKAMOTO (1982):
Biochemical and immunohistochemical studies on collagenase in resorbing bone in tissue culture. A
novel hypothesis for the mechanism of bone resorption.
J. Periodont. Res. 17, 523-526
U
U
SALO, J., K. METSIKKÖ, H. PALOKANGAS, P. LEHENKARI u. K. H. VÄÄNÄNEN (1996):
Bone-resorbing osteoclasts reveal a dynamic division of basal plasma membrane into two different
domains.
J. Cell. Sci. 109, 301-307
U
U
SALO, J., P. LEHENKARI, M. MULARI, K. METSIKKÖ u. K. H. VÄÄNÄNEN (1997):
Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.
Science. 276, 270-273
U
U
SALZSTEIN, R. A., u. S. R. POLLACK (1987):
Electromechanical potentials in cortical bone-II. Experimental analysis.
J. Biomech. 20, 271-280
U
U
SAMNEGÅRD, E., U. T. IWANIEC, D. M. CULLEN, D. B. KIMMEL u. R. R. RECKER (2001):
Maintenance of cortical bone in human parathyroid hormone (1-84)-treated ovariectomized rats.
Bone. 28, 251-260
U
U
SAVILLE, P. D., U. R. SMITH (1966):
Bone density, breaking force and leg muscle mass as function of weight in bipedal rats.
Am. J. Phys. Anthropol. 25, 35-39
U
U
SAVILLE, P. D. (1969):
Changes in skeletal mass and fragility with castration in the rat: A model of osteoporosis.
J. Am. Geriatr. Soc. 17, 155-166
U
U
SCHINKE, T., u. G. KARSENTY (2002):
Transcriptional Control of Osteoblast Differentiation and Function.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAIS u. G. A. RODAN: Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 83
122
SCHILLER, P. C., P. P. MEHTA, B. A. ROOS u. G. A: HOWARD (1992):
Hormonal regulation of intercellular communication: parathyroid hormone increases connexin 43 gene
expression and gap-junctional communication in osteoblastic cells.
Mol. Endocrinol. 6, 1433-1440
U
U
SCHIWY, P. (2002):
Bekanntmachung der deutschen Übersetzung der CITES – Leitlinien für den Transport und die
entsprechende Vorbereitung freilebender Tiere und wildwachsender Pflanzen vom 02. Dez. 1996.
im: Deutschen Tierschutzgesetz
Band III, Kapitel Nr. 200/22
R. S. Schulz Verlag
SCHMIDT, I. U., G. K. WAKLEY u. R. T. TURNER (2000):
Effects of estrogen and progesterone on tibia histomorphometry in growing rats.
Calcif. Tissue Int. 67, 47-52
U
U
SCHNITZER, T., H. G. BONE, G. CREPALDI, S. ADAMI, M MCCLUNG, D. KIEL, D. FELSENBERG, R.
R. RECKER, R. P. TONINO, C. ROUX, A. PINCHERA, A. J. FOLDES, S. L. GREENSPAN, M. A.
LEVINE, R. EMKEY, A. C. SANTORA, A. KAUR, D. E. THOMPSON, J. YATES u. J. J. ORLOFF (2000):
Therapeutic equivalence of alendronate 70 mg once-weekly and alendronate 10 mg daily in the
treatment of osteoporosis.
Aging. 12,1-12
U
U
SCHULAK, J. A., u. E. L. KAPLAN (1974):
Gastrin-induced hypocalcemia in thyroparathyroidectomized rats.
Metab. Clin. Exp. 23, 1103-1106
U
U
SCHULAK, J. A., u. E. L. KAPLAN (1975):
The importance of the stomach in gastrin-induced hypocalcemia in the rat.
Endocrinology. 96, 1217-1220
U
U
SHEN, V., D. W. DEMPSTER, R. BIRCHMAN, R. XU u. R. LINDSAY (1993):
Loss of cancellous bone mass and connectivity in ovariectomized rats can be restored by combined
treatment with parathyroid hormone and estradiol.
J. Clin. Invest. 91, 2479-2487
U
U
SIMONET, W. S., D. L. LACEY, C. R. DUNSTAN, M. KELLEY, M.-S. CHANG, R. LÜTHY, H. Q.
NGUYEN, S. WOODEN, L. BENNETT, T. BOONE, G. SHIMAMOTO, M. DEROOSE, R. ELLIOTT, A.
COLOMBERO, H.-L. TAN, G. TRAIL, J. SULLIVAN, E. DAVY, N. BUCAY, L. RENSHAW-GEGG, T. M.
HUGHES, D. HILL, W. PATTISON, P. CAMPBELL, S. SANDER, G. VAN, J. TARPLEY, P. DERBY, R.
LEE u. W. J. BOYLE (1997):
Osteoprotegerin: A novel secreted protein involved in the regulation of bone density.
Cell. 89, 309-319
U
U
SIMS, N. A., H. A. MORRIS, R. J. MOORE u. T. C. DURBRIDGE (1996):
Estradiol treatment transiently increases trabecular bone volume in ovariectomized rats.
Bone. 19, 455-461
U
U
123
SISSONS, H. A., u. G. J. HADFIELD (1955):
The influence of cortisone on the structure and growth of bone.
J. Anat. 89, 69-78
U
U
SMIT, T. H., u. E. H. BURGER (2000):
Is BMU-coupling a strain-regulated phenomenon? A finite element analysis.
J. Bone Miner. Res. 15, 301-307
U
U
STENBECK, G., u. M. A. HORTON (2000):
A new specialized cell-matrix interaction in activley resorbing osteoclasts.
J. Cell. Sci. 113, 1577-1587
U
U
STENSTRÖM, M., B. OLANDER, C. A. CARLSSON, G. A. CARLSSON u. R. HÅKANSON (1995):
Methodologic aspects of computed microtomography to monitor the development of osteoporosis in
gastrectomized rats.
Acad. Radiol. 2, 785-791
U
U
STENSTRÖM, M., B. OLANDER, D. LEHTO-AXTELIUS, J. E. MADSEN, L. NORDSLETTEN u. G. A.
CARLSSON (2000):
Bone mineral density and bone structure parameters as predictors of bone strength: an analysis using
computerized microtomography and gastrectomy-induced osteopenia in the rat.
J. Biomech. 33, 289-297
U
U
STEPAN, J. J., J. POSPICHAL, J. PRESI u. V. PACOVSKY (1987):
Bone loss and biochemical indices of bone remodelling in surgically induced postmenopausal woman.
Bone. 8, 279-284
U
U
SUDA, T., N. TAKAHASHI u. T. J. MARTIN (1992):
Modulation of osteoclast differentiation.
Endocr. Rev. 13, 66-80
U
U
SUDA, T., N. TAKAHASHI, N. UDAGAWA, E. JIMI, M. T. GILLESPIE u. T. J. MARTIN (1999):
Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor
receptor and ligand families.
Endocr. Rev. 20, 345-357
U
U
SURVE, V. V., N. ANDERSSON, D. LEHTO-AXTELIUS u. R. HÅKANSON (2001a):
Comparison of osteopenia after gastrectomy, ovariectomy and prednisolone treatment in the young
female rat.
Acta. Orthop. Scand. 72, 525-532
U
U
SURVE, V. V., N. ANDERSSON, S. ALATALO, D. LEHTO-AXTELIUS, J. HALLEEN, K. H. VÄÄNÄNEN
u. R. HÅKANSON (2001b):
Does combined gastrectomy and ovariectomy induce greater osteopenia in young female rats than
gastrectomy alone?
Calcif. Tissue Int. 69, 274-280
U
U
124
SURVE, V. V., P. HOGLUND u. R. HÅKANSON (2002):
Gastrectomized rats respond with exaggerated hypercalcemia to oral and intravenous calcium loads
because of impaired ability of bone to take up Ca2+.
Scand. J. Gastroenterol. 37, 523-530
P
U
P
U
TAKAHASHI, N., N. UDAGAWA, M. TAKAMI u. T. SUDA (2002):
Cells of Bone.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ u. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 109
TAKEDA, S., F. ELEFTERIOU, R. LEVASSEUR, X. LIU, L. ZHAO, K. L. PARKER, D. ARMSTRONG, P.
DUCY u. G. KARSTENY (2002):
Leptin reuglates bone formation via the sympathetic nervous system.
Cell. 111, 305-317
U
U
TERAI, K., T. TAKANO-YAMAMOTO, Y. OHBA, K. HIURA, M. SUGIMOTO, M. SATO, H. KAWAHATA,
N. INAGUMA, Y. KITAMURA u. S. NOMURA (1999):
Role of osteopontin in bone remodeling caused by mechanical stress.
J. Bone Miner. Res. 14, 839-849
U
U
TEZUKA, K., K. NEMOTO, Y. TEZUKA, T. SATO, Y. IKEDA, M. KOBORI, H. KAWASHIMA, H.
EGUCHI, Y. HAKEDA u. M. KUMEGAWA (1994):
Identification of matrix metalloproteinase 9 in rabbit osteoclasts.
J. Biol. Chem. 269, 15006-15009
U
U
THOMPSON, D. D., H. A. SIMMONS, C. M. PIRIE u. H. Z. KE (1995):
FDA guidelines and animal models for osteoporosis.
Bone. 17, 125S-133S
U
U
TIELEMANS, Y., R. HÅKANSON, F. SUNDLER u. G. WILLEMS (1989):
Proliferation of enterochromaffin-like cells in omeprazole-treated hypergastrinemic rats.
Gastroenterology. 96, 723-729
U
U
TIELEMANS, Y., J. AXELSON, F. SUNDLER, G. WILLEMS u. R. HÅKANSON (1990):
Serum gastrin concentration affects the self replication rate of the enterochromaffin-like cells in the rat
stomach.
Gut. 31, 274-278
U
U
TOBIAS, J., u. T. J. CHAMBERS (1989):
Glucocorticoids impair bone resorptive activity and viability of osteoclasts disaggregated from neonatal
rat long bones.
Endocrinology. 125, 1290-1295
U
U
TOMKINSON, A., E. F. GEVERS, J. M. WIT, J. REEVE u. B. S. NOBLE (1998):
The role of estrogen in the control of rat osteocyte apoptosis.
J. Bone Miner. Res. 13, 1243-1250
U
U
125
TOVEY, F. I., M. L. HALL, P. J. ELL, M. HOBSLEY (1991):
Postgastrectomy osteoporosis.
Br. J. Surg. 78, 1335-1337
U
U
UDAGAWA, N., N. TAKAHASHI, E. JIMI, K. MATSUZAKI, T. TSURUKAI, K. ITOH, N. NAKAGAWA, H.
YASUDA, M. GOTO, E. TSUDA, K. HIGASHIO, M. T. GILLESDIE, T. J. MARTIN u. T. SUDA (1999):
Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation
factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor.
Bone. 25, 517-523
U
U
VAN DER PLAS, A., E. M. AARDEN, J. H. FEIJEN, A. H. DE BOER, A. WILTINK, M. J. ALBLAS, L. DE
LEIJ u. P. J. NIJWEIDE (1994):
Characteristics and properties of osteocytes in culture.
J. Bone Miner. Res. 9, 697-704
U
U
VÄÄNÄNEN, K. H., E.-K. KARHUKORPI, K. SUNDQUIST, B. WALLMARK, I. ROININEN, T.
HENTUNEN, J. TUUKKANEN u. P. LAKKAKORPI (1990):
Evidence for the presence of a proton pump of the vacuolar H+-ATPase Type in the ruffled borders of
osteoclasts.
J. of Cell Biolog. 111, 1305-1311
P
U
P
U
VÄÄNÄNEN, K. H., u. P. L. HÄRKÖNEN (1996):
Estrogen and bone metabolism.
Maturitas. 23 Suppl., 65S-69S
U
U
VÄÄNÄNEN, K. H., H. ZHAO, M. MULARI u. J. M. HALLEEN (2000):
The cell biology of osteoclast function.
J. Cell. Sci. 113, 377-381
U
U
VÄÄNÄNEN, K. H., u. H. ZHAO (2002):
Osteoclast Function.
in: P. BILEZIKIAN, L. G. RAISZ U. G. A. RODAN (Hrsg.): Principles of Bone Biology.
Academic Press, New York, Band I, S. 127, 130, 136
VERBORGT, O., G. J. GIBSON u. M. B. SCHAFFLER (2000):
Loss of osteocyte integrity in association with microdamage and bone remodeling after fatigue in vivo.
J. Bone Miner. Res.15, 60-67
U
U
VOGEL, G. (1969a):
Effect of hormones on physical and chemical properties of connective- and supportive tissue. III
Arzneimittelforschung. 19, 1790-1801
U
U
VOGEL, G. (1969b):
Effect of hormones on physical and chemical properties of connective- and supportive tissue. III
Arzneimittelforschung. 19, 1981-1996
U
U
WALLACH, S., G. ROUSSEAU, L. MARTIN u. M. AZRIA (1999):
Effects of calcitonin on animal and in vitro models of skeletal metabolism.
Bone. 25, 509-516
U
U
126
WEINSTEIN, R. S., R. L. JILKA, M. A. PARFITT u. S. C. MANOLAGAS (1998):
Inhibition of osteoblastogenesis and promotion of apoptosis of osteoblasts and osteocytes by
glucocorticoids.
J. Clin. Invest. 102, 274-282
U
U
WHITFIELD, F. J., P. MORLEY u. E. G. WILLICK (2000):
The parathyroid hormones: bone-forming agents for treatment of osteoporosis.
Medscape Womens Health. 5, 1-32
U
U
WOJTYCZKA, A., B. BERGE, G. RÜMENAPF, P. O. SCHWILLE, P. BALLANTI, M. SCHREIBER, W.
FRIES u. W. HOHENBERGER (1998):
Gastrectomy osteopenia in the rat: the role of vitamin B12 deficiency and the type of reconstruction of
the digestive tract.
Clin. Sci. 95, 735-744
U
U
WRONSKI, T. J., J. M. SMITH u. W. S. S. JEE (1980):
The microdistribution and retention of 239Pu on trabecular bone surfaces of the beagle: Implications for
the induction of osteosarcoma.
Radiat. Res. 83, 74-89
P
U
P
U
WRONSKI, T. J., J. M. SMITH u. W. S. S. JEE (1981):
Variations in the mineral apposition rate of trabecular bone within the beagle skeleton.
Calcif. Tissue Int. 33, 583-586
U
U
WRONSKI, T. J., P. L. LOWRY, C. C. WALSH u. L. A. IGNASZEWSKI (1985):
Skeletal alterations in ovariectomized rats.
Calcif. Tissue Int. 37, 324-328
U
U
WRONSKI, T. J., C. C. WALSH u. L A. IGNASEZEWSKI (1986):
Histologic evidence for osteopenia and increased bone turnover in ovariectomized rats.
Bone. 7, 119-123
U
U
WRONSKI, T. J., P. A. SCHENK, M. CINTRON u. C. C. WALSH (1987):
Effect of body weight on osteopenia in ovariectomized rats.
Calcif. Tissue Int. 40, 155-159
U
U
WRONSKI, T. J., M. CINTRON, A. L. DOHERTY u. L. M. DANN (1988a):
Estrogen treatment prevents osteopenia and depresses bone turnover in ovariectomized rats.
J. Endocrinol. 123, 681-686
U
U
WRONSKI, T. J., M. CINTRON u. L. M. DANN (1988b):
Temporal relationship between bone loss and increased bone turnover in ovariectomized rats.
Calcif. Tissue Int. 43, 179-183
U
U
WRONSKI, T. J., L. M. DANN u. S. L. HORNER (1989a):
Time course of vertebral osteopenia in ovariectomized rats.
Bone. 10, 295-301
U
U
127
WRONSKI, T. J., L. M. DANN, K. S. SCOTT u. M. CINTRON (1989b):
Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.
Calcif. Tissue Int. 45, 360-366
U
U
WRONSKI, T. J., C. F. YEN u. L. M. DANN (1993):
Parathyroid hormone is more effective than estrogen or bisphosphonates for restoration of lost bone
mass in ovariectomized rats.
J. Endocrinol. 132, 823-831
U
U
WRONSKI, T. J., u. C. F. YEN (1994):
Anabolic effects of parathyroid hormone on cortical bone in ovariectomized rats.
Bone. 15, 51-58
U
U
WRONSKI, T. J., S. PUN S u. H. LIANG (1999):
Effects of age, estrogen depletion, and parathyroid hormone treatment on vertebral cancellous wall
width in female rats.
Bone. 25, 465-468
U
U
YAMAZAKI, I., u. H. YAMAGUCHI (1989):
Characteristics of an ovariectomized osteopenic rat model.
J. Bone Miner. Res. 4, 13-22
U
U
YASUDA, H., N. SHIMA, N. NAKAGAWA, K. YAMAGUCHI, M. KINOSAKI, S. MOCHIZUKI, A.
TOMOYASU, K. YANO, M. GOTO, A. MURAKAMI, E. TSUDA, T. MORINAGA, K. HIGASHIO, N.
UDAGAWA, N. TAKAHASHI N u. T. SUDA (1998):
Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesisinhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 3597-3602
U
U
YASUMURA, S. (1976a):
Effect of adrenal steroids on bone resorption in rats.
Am. J. Physiol. 230, 90-93
U
U
YASUMURA, S., K. J. ELLIS u. S. H. COHN (1976b):
Effect of hydrocortisone on total body calcium in rats.
J. Lab. Clin. Med. 88, 834-840
U
U
YEH, J. K., J. F. EVANS, M.-M. CHEN u. J. F. ALOIA (1999):
Effect of hypophysectomy on the proliferation and differentiation of rat bone marrow stromal cells.
Am. J. Physiol. 276, E34-E42
U
U
ZELLIN, G., R. HÅKANSON u. A. LINDE (2002):
Gastrectomy has no effect on bone regeneration in rats despite a decrease in bone mass.
Scand. J. Gastroenterol. 37, 1149-1155
U
U
ZITTEL, T. T., B. ZEEB, G. W. MAIER, G. W. KAISER, M. ZWIRNER, H. LIEBICH, M. STARLINGER u.
H. D. BECKER (1997):
High prevalence of bone disorders after gastrectomy.
Am. J. Surg. 174, 431-438
U
U
128
ZUCHT, H. D., M. RAIDER, K. ADERMANN, H. J. MÄGERT u. W. G. FORSSMANN (1995):
Casocidin-I: a casein-alphas2 derived peptide exhibits antibacterial activity.
FEBS Lett. 372, 185-188
U
B
B
U
129
9. Anhang
9.1
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Schematische Darstellung eines Ausschnittes aus der
Substantia compacta der Diaphyse eines Röhrenknochens
(nach LIEBICH 1993).
S. 13
Abbildung 2:
Präparationsbereich am Schweinemagen (nach NICKEL et al., 1987)
S. 29
Abbildung 3:
Versuchsdurchführung des BMSC-Testes.
S. 35
Abbildung 4:
Versuchsdurchführung des ROS-17/2.8-Testes.
S. 36
Abbildung 5:
Ablaufplan zur Versuchsdurchführung.
S. 44
Abbildung 6:
Darstellung
des
Chromatogrammes
des
ultrafiltrierten
Schweinemagenextraktes auf einer präparativen RPC-Säule
(PrepPak® Kartusche, Vydac™ C18) mit dem Aktivitätsprofil der
alkalischen Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach Stimulierung mit
den Fraktion 6-38 in einer Konzentration von 0,2 Mäq/ml.
S. 60
P
Abbildung 7:
Abbildung 8:
P
Darstellung des 2. chromatographischen Aufreinigungsschrittes
Hämofiltrat mit einer präparativen FineLine Source 15RPC Säule
dem
Aktivitätsprofil
der
alkalischen
Phosphatase
Knochenmarkstammzellen nach 8tägiger Stimulation mit
Fraktionen 19-41 in einer Konzentration von 200 ml HF/ml.
von
und
von
den
Darstellung des 3. chromatographischen Aufreinigungsschrittes
Hämofiltrat mit einer präparativen C18 Vydac® Kartusche und
Aktivitätsprofil
der
alkalischen
Phosphatase
Knochenmarkstammzellen nach 8tägiger Inkubation mit
Fraktion 10-44 in einer Konzentration von 200 ml HF/ml.
von
dem
von
den
P
Abbildung 9:
P
S. 61
S. 62
Links sieht man die Darstellung des Aktivitätsprofils der alkalischen
Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach 3-tägiger Inkubation mit der
subtilisinverdauten Fraktion 33 aus Fundusschleimhaut. Rechts sieht
man die Darstellung der dazugehörigen Zellvitalität (WST-1) der
ROS-17/2.8 Zellen. Als Positivkontrollen wurden 10 nM Dexamethason,
400 ml HF/ml der Fraktion 32 und 0,1 sowie 0,2 Mäq/ml der Fraktion 33
eingesetzt.
S. 63
130
Abbildung 10: Links sieht man die Darstellung des Aktivitätsprofils der alkalischen
Phosphatase von ROS-17/2.8 Zellen nach Inkubation mit der
subtilisinverdauten Fraktion 32 aus Hämofiltrat. Rechts ist die
dazugehörige Zellvitalität (WST-1) der ROS-17/2.8 Zellen dargestellt.
Als Positivkontrollen wurden 10 nM Dexamethason und
400 sowie 800 ml HF/ml der Fraktion 32 eingesetzt.
S. 63
Abbildung 11: Links ist die Hemmung der Aktivität von Fraktion 32 durch Mifepriston
mit ROS-17/2.8 Zellen dargestellt. Rechts sind die dazugehörigen
Werte der Zellvitalität (WST-1) abgebildet.
S. 64
Abbildung 12: Links ist die Hemmung der Aktivität von Fraktion 33 durch Mifepriston
auf ROS-17/2.8 Zellen dargestellt. Rechts sind die dazugehörigen
Werte der Zellvitalität (WST-1) zu sehen.
S.65
Abbildung 13: Dosisabhängigkeit der Substanzen Dexamethason, E2, Hydrokortison
und Prednisolon auf ROS-17/2.8 Zellen.
S. 66
B
B
Abbildung 14: Körpergewichtsentwicklung während der Ovarektomie-Studie von den
Gruppen Sham-NaCl, OVX-NaCl und der mit PTH, E2, Fraktion 33 und
Fraktion 32 in zwei Dosierungen behandelten ovarektomierten und
sham-operierten Tieren.
S. 67
B
B
Abbildung 15: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-Sham-NaCl
S. 69
Abbildung 16: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-NaCl
S. 69
Abbildung 17: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-PTH
S. 69
Abbildung 18: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-E2
S. 69
B
B
Abbildung 19: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-Sham-Fr. 33
S. 70
Abbildung 20: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-Fr. 33
S. 70
Abbildung 21: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-Fr. 32
S. 70
Abbildung 22: Femurröntgen- und Negativbild Gruppe-OVX-Fr. 32+
S. 70
Abbildung 23: Einfluß von NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei
verschiedenen Dosierungen auf die Femurdichte bei ovarektomierten
und sham-operierten Ratten.
S. 71
B
B
Abbildung 24: Darstellung des Abstandes zwischen den Fluoreszenzbanden als
Spiegel des Knochen-Turnovers unter Einfluß von NaCl, PTH, E2,
Fraktion 33 und Fraktion 32 in zwei verschiedenen Dosierungen bei
ovarektomierten und sham-operierten Ratten.
S. 72
B
131
B
Abbildung 25: Der Durchmesser der Calvariae in Abhängigkeit von Ovarektomie,
sham-Eingriffen und der Behandlung mit NaCl, PTH, E2, Fraktion 33
und Fraktion 32 in zwei Dosierungen.
S. 73
B
B
Abbildung 26: Verlauf des Gesamtkalziums im Serum während der
Ovarektomie-Studie der Gruppen Sham und OVX-NaCl und in der
Gruppe Sham Fraktion 33.
S. 74
Abbildung 27: Verlauf des Gesamtkalziums im Serum während der
Ovarektomie-Studie der Gruppen NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und
Fraktion 32 in zwei Konzentrationen bei ovarektomierten Ratten.
S. 74
B
B
Abbildung 28: Die Gesamtkalziumspiegel-I im Serum der Gruppen Sham-NaCl,
OVX-NaCL, OVX-PTH, OVX-E2, OVX-Fr. 33, Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 32
und OVX-Fr. 32+ am 49. Tag der Ovarektomie-Studie.
S. 75
B
B
Abbildung 29: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte der Gruppen
Sham-NaCl, OVX-NaCl, OVX-E2 und OVX-PTH.
S. 76
B
B
Abbildung 30: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte der Gruppen
Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 33, OVX-Fr. 32 und OVX-Fr. 32+.
S. 76
Abbildung 31: Die Gesamtkalziumspiegel-II im Serum der Gruppen Sham-NaCl,
OVX-NaCL, OVX-PTH, OVX-E2, OVX-Fr. 33, Sham-Fr. 33, OVX-Fr. 32
und OVX-Fr. 32+ am 49. Tag der Ovarektomie-Studie.
S. 77
B
B
Abbildung 32: Verlauf
des
Serumosteokalzinspiegels
während
der
Ovarektomie-Studie in den Gruppen Sham und OVX-NaCl und in der
Gruppe Sham Fraktion 33.
S. 78
Abbildung 33: Verlauf
des
Serumosteokalzinspiegels
während
der
Ovarektomie-Studie in den Gruppen NaCl, PTH, E2, Fraktion 33 und
Fraktion 32 in zwei Konzentrationen.
S. 78
B
B
Abbildung 34: Körpergewichtsverlauf der Gruppen KO-I und GX-I während der
Gastrektomie-Studie.
S. 80
Abbildung 35: Körpergewichtsverlauf der Gruppen KO-II und GX-II während der
Gastrektomie-Studie.
S. 81
Abbildung 36: Futteraufnahme der gastrektomierten Tiere während der GastrektomieStudie.
S. 82
Abbildung 37: Röntgenbilder der Femura aus der Gastrektomie-Studie. Oben links
sind die Femura der jungen Kontrolltiere und oben rechts die der
adulten Kontrolltiere abgebildet. In den unteren Reihen sind die der
dazugehörigen gastrektomierten Ratten dargestellt.
S. 83
132
Abbildung 38: Röntgenbilder der Calvariae der Gastrektomie-Studie. Oben links sind
die Schädeldächer der jungen Kontrolltiere und oben rechts die der
adulten Kontrolltiere abgebildet. In den unteren Reihen sind die der
dazugehörigen gastrektomierten Tiere dargestellt.
S. 84
Abbildung 39: Die Femurdichte der Gruppen aus der Gastrektomie-Studie.
S. 84
Abbildung 40: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der adulten Kontrolltiere
der Gastrektomie-Studie.
S. 86
Abbildung 41: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der adulten
gastrektomierten Tiere der Gastrektomie-Studie.
S. 86
Abbildung 42: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der jungen Kontrolltiere
der Gastrektomie-Studie.
S. 86
Abbildung 43: Ausschnitt aus dem Os parietale der Calvariae der jungen
gastrektomierten Tiere der Gastrektomie-Studie.
Abbildung 44: Der Calvariendurchmesser von den fixierten Präparaten der Gruppen
aus der Gastrektomie-Studie.
Abbildung 45: Standardkurve zur Berechnung der Gesamtkalziumwerte im Serum am
letzten Tag der Gastrektomie-Studie.
S. 86
S. 87
S. 88
Abbildung 46: Gesamtkalziumspiegel der Gruppen am letzten Tag der GastrektomieStudie.
S. 88
Abbildung 47: Modell des Pathomechanismus der Osteopenie
ovarektomierten Ratte (nach KALU et al., 1984).
133
bei
der
S. 92
9.2
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Säulen und –füllmaterialien für die RPC.
S. 32
Tabelle 2:
Säulen und –füllmaterialien für die Schweinemagenaufarbeitung.
S. 33
Tabelle 3:
Säulen und –materialien für die Hämofiltrataufarbeitung.
S. 33
Tabelle 4:
Zusammensetzung der Zellkulturmedien für die BMSC-Kultivierung.
S. 34
Tabelle 5:
Zusammensetzung
Kultivierung.
S. 36
der
Zellkulturmedien
für
die
ROS-17/2.8
Tabelle 6:
Versuchsdurchführung zur Messung der Enzymaktivität
membrangebundenen alkalischen Phosphatase.
Tabelle 7:
Sonstige Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur.
S. 39
Tabelle 8:
Pipettierschema der Standardreihe für Gesamtkalzium.
S. 50
Tabelle 9:
Pipettierschema für die Gesamtkalziummessungen.
S. 51
Tabelle 10:
Firmenliste.
S. 57
Tabelle 11:
Beurteilung der Röntgendichte im Bereich der Substantia kompakta
und der Facies poplitea am Femur unter der Wirkung von NaCl, PTH,
E2, Fraktion 33 und der Fraktion 32 in zwei Dosierungen bei
sham-operierten und ovarektomierten Ratten.
S.68
B
Tabelle 12:
der
S. 38
B
Radiologische Befunde
Gastrektomie-Studie.
an
den
Femura
der
Ratten
der
S. 83
134
Erklärung
Hiermit erkläre ich, daß ich die Dissertation
„Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im Tiermodell der
ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als Osteoporose-Modell.“
selbstständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurde keine Hilfe Dritter in Anspruch genommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder
anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation am folgenden Institut angefertigt:
An-Institut der Medizinischen Hochschule Hannover
IPF PharmaCeuticals GmbH
Feodor-Lynen-Straße 31
in 30625 Hannover.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur
Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, daß ich die vorstehenden Angaben vollständig nach bestem Wissen und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
Danksagung
Mein Dank gilt allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Abteilung für Präparative Peptid-Chemie der
IPF PharmaCeuticals GmbH für die Hilfe und Unterstützung während meiner Arbeit
Mein besonderer Dank in der oben genannten Abteilung gilt Frau Ute Block für ihren täglichen
tatkräftigen Einsatz und ihre Geduld während der Aufarbeitung. Frau Susann Busch danke ich speziell
für die tägliche Unterstützung im Laboralltag.
Besonders möchte ich mich für die Zusammenarbeit mit der Tierpflegerin Frau Gabriele Walkling und
dem Tierpfleger Herrn Roland Sperling von der IPF PharmaCeuticals GmbH bedanken, die im Umgang
mit den Ratten wertvolle Hilfestellungen geleistet haben.
Herrn Wolfgang Posselt möchte ich für die Beratung und Unterstützung während der Anfertigung der
Knochendünnschliffe danken.
Mein Dank gilt auch Herrn PD Dr. Erik Maronde der Abteilung Funktionsanalyse der IPF
PharmaCeuticals GmbH für seine bespielhafte Betreuung, seine überaus motivierenden Worte und
besonders für sein großes Vertrauen in meine selbstständige Arbeit.
Ebenso möchte ich Herrn Prof. Dr. Michael Fehr für seine Betreuung und Unterstüzung an der
Tierärztlchen Hochschule danken.
Nicht zuletzt gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. Dr. Wolf-Georg Forssmann für die
Zusammenarbeit und die Überlassung des Themas.