Tierärztliche Hochschule Hannover Experimentelle Untersuchungen
Werbung
Tierärztliche Hochschule Hannover Experimentelle Untersuchungen zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin am isolierten Kaninchenherzen INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) vorgelegt von Magdalena Sterneberg aus Heidelberg Hannover 2016 Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Michael Fehr Klinik für Kleintiere Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Prof. Dr. Peter Milberg Abteilung für Rhythmologie, Department für Kardiologie und Angiologie, Universitätsklinikum, Münster 1. Gutachter: - Prof. Dr. Michael Fehr 2. Gutachter: - Prof. Dr. Sabine Kästner Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2016 Für meine Familie Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung………………………………………………………………………………...1 2. Literaturübersicht………………………………………………………………………..3 2.1. • • • Anatomische und Physiologische Grundlagen………………………………..3 Anatomischer Aufbau des Kaninchenherzens Physiologie des ventrikulären Aktionspotentiales Physiologie des atrialen Aktionspotentiales 2.2 Pathophysiologie…………………………………………………………………9 2.2.1 Grundlagen ventrikulärer Arrhythmien……….........................................9 • • • • Störungen der Repolarisation als Grundlage für Herzrhythmusstörungen Das lange QT- Syndrom Frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarizations, EADs) Torsades de Pointes 2.2.2 Vorhofflimmern…………………………………………………………......14 • Entstehung von Vorhofflimmern • Beteiligte Ionenkanäle und therapeutische Ansätze 2.3. Antazolin……………………………………………………………………….....20 3. Material und Methode……………………………………………………………….... 22 3.1. Versuchstiere………………………………………………………………………22 3.2. Präparation des Kaninchenherzens……………………………………………..22 3.3. Langendorff- Versuch am isolierten Kaninchenherzen………………………..23 3.3.1. Versuchsapparatur……………………………………………………......24 • Wärmebad und Perfusionslösung • Elektrokardiogramm • Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) • Intraventrikuläre Druckmessung 3.3.2. Versuchsprotokoll der ventrikulären Versuchsreihen……………………29 • AV- Block und Stimulation • Frequenztreppe • Refraktärzeitbestimmung • Hochfrequenz- Stimulation • • • • Hypokaliämische Phase und Registrierung der Herzrhythmusstörungen Dosis- Wirkungs- Versuche mit Antazolin Provokationsversuche zur Simulation des LQT2 Provokationsversuche zur Simulation des LQT3 3.4. Auswertung…………………………………………………………………………..32 • • Bestimmung der Repolarisationszeiten Messung der QT- Zeiten 3.5 Statistik……………………………………………………………………………….33 3.6. Vorhofversuche……………………………………………………………………..34 3.6.1. Versuchsaufbau……………………………………………………………....34 3.6.2. Versuchsablauf………………………………………………………………..36 • • • • • • Stimulation und Stimulationsschwelle Frequenztreppe Effektive Refraktärzeit (aERP) Hochfrequenz- Stimulation Infusion von Acetylcholin und Isoproterenol Infusion von Antazolin, Ivabradin, Vernakalant und Flecainid 3.6.3. Auswertung……………………………………………………………………39 • • • • Bestimmung der Repolarisationszeiten der atrialen APD90 Registrierung von Vorhofflimmern Berechnung der Post- Repolarisations- Refraktärität (aPRR) Ermittlung der Leitungszeit 3.6.4. Statistik………………………………………………………………………..40 4. Ergebnisse………………………………………………………………………………41 4.1. Untersuchungen zu ventrikulären Arrhythmien……………………………….. 41 4.1.1 Einfluss von Antazolin auf die Aktionspotentialdauer, das QT- Intervall, die Refraktärzeit und die Dispersion der Repolarisation……………….41 4.1.2 Die antiarrhythmische Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT2Syndroms……………………………………………………………..43 • • • APD90 und QT- Intervall Refraktärzeit und Dispersion Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes 4.1.3 Die Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT3-Syndroms…...53 • APD90 und QT- Intervall • Refraktärzeit und Dispersion • Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes 4.2 Untersuchungen zu Vorhofflimmern- Provokationsversuche mit Acetylcholin und Isoproterenol…………………………………………………………………58 4.2.1 Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin……………..58 • Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit • Auftreten von Vorhofflimmern 4.2.2 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Ivabradin…………………………………………………………………………...62 • Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit • Auftreten von Vorhofflimmern 4.2.3 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Vernakalant………………………………………………………………………..67 • • Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Auftreten von Vorhofflimmern 4.2.4 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Flecainid……………………………………………………………………………72 • • Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Auftreten von Vorhofflimmern 5. Diskussion……………………………………………………………………………...76 5.1 Arrhythmogenese durch QT- Verlängerung……………………………………77 5.2 Einfluss von Antazolin auf die Arrhythmogenese durch QT- Verlängerung...79 5.3 Entstehungsmechanismus von Vorhofflimmern- Provokation mit Acetylcholin und Isoproterenol………………………………………………………………….81 5.4 Atriale antiarrhythmische Effekte von Antazolin……………………………….82 5.5 Vergleich der atrialen antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin mit Vernakalant, Flecainid und Ivabradin…………………………………………...84 • • • Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Vernakalant Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Flecainid Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Ivabradin 5.6 Limitationen der Studie…………………………………………………………..88 5.7 Ausblick……………………………………………………………………………89 6. Zusammenfassung…………………………………………………………………….92 7. Summary………………………………………………………………………………..94 8. Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………...96 9. Tabellenverzeichnis……………………………………………………………………99 10. Literaturverzeichnis…………………………………………………………………..100 11. Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………120 12. Danksagung…………………………………………………………………………..122 1 1. Einleitung Die kardiologische Forschung ist sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin von großer Bedeutung. In der Tiermedizin spielt insbesondere die stark zunehmende Anzahl an Tierhaltern mit einer tiefen emotionalen Bindung zu ihren Haustieren eine entscheidende Rolle. Viele Tierbesitzer sind mittlerweile dazu bereit, umfangreiche Behandlungs- und Untersuchungskosten für das Wohl des Tieres zu übernehmen. Darüber hinaus fördern viele Zuchtverbände die Verbesserung der genetischen Gesundheit der Tiere und fordern ihre Mitglieder zu teilweise umfangreichen regelmäßigen Untersuchungen auf, um dies zu gewährleisten. Dies führt dazu, dass Forschungsarbeiten mit kardiologischem Schwerpunkt immer weiter vorangetrieben werden. Diese Arbeit kann einen entscheidenden Beitrag zur veterinärmedizinischen und humanmedizinischen antiarrhythmischen Forschung leisten. Gerade im Zusammenhang mit plötzlichen Todesfällen werden beim Menschen lebensgefährliche Arrhythmien als häufige Ursache gesehen [1]. Dabei stehen nicht nur genetische Dispositionen, sondern auch medikamentöse Therapien im Vordergrund in deren Folge es zu ventrikulären polymorphen Tachykardien kommen kann. Da die Dokumentation von plötzlichen Todesfällen in der Veterinärmedizin weitaus weniger erfolgt, ist auch dort von einer großen Dunkelziffer auszugehen, sowohl spontan, als auch unter der eventuellen Behandlung mit unterschiedlichen Substanzen mit proarrhythmischem Potenzial. Auch die Behandlung von bereits bestehenden Arrhythmien stellen Ärzte und Tierärzte immer wieder vor Probleme. So steigt die Inzidenz von Vorhofflimmern im Tierreich [2] als auch beim Menschen [3] immer weiter an und es werden neue Substanzen gesucht, die diese Rhythmusstörung zuverlässig hemmen können. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die mögliche antiarrhythmische Wirkung von Antazolin, einem Antihistaminikum der ersten Generation aufzuzeigen, um damit eine mögliche Therapieoption zur Behandlung lebensgefährlicher Arrhythmien sowie die Reduktion der proarrhythmischer Wirkungen durch andere Medikamente zu ermöglichen. Dabei wurden aus klinisch unauffälligen Kaninchen die Herzen entnommen und mit Hilfe der Langendorff- Apparatur retrograd perfundiert. Durch die Zugabe verschiedener Substanzen konnten Rhythmusstörungen wie Torsardes de Pointes oder Vorhofflimmern provoziert werden und die Wirkung von Antazolin sowohl auf ventrikulärer als auch auf atrialer Ebene elektrophysiologisch untersucht werden. Dieses Modell wurde in der Abteilung für experimentelle Rhythmologie am Universitätsklinikum Münster schon vielfach genutzt und ist etabliert. Das Kaninchenherz eignet sich dafür besonders, da die Ionenströme in den Herzmuskelzellen des Kaninchens mit denen des Menschen vergleichbar sind [4]. Somit sind die 2 Ergebnisse sowohl für die Veterinärmedizin als auch für die Humanmedizin von Bedeutung und wurden als Kooperation zwischen der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und der Abteilung für Rhythmologie des Departments für Kardiologie und Angiologie des Untiversitätsklinikums Münster durchgeführt. 3 2. Literaturübersicht 2.1. Anatomische und Physiologische Grundlagen Anatomischer Aufbau des Kaninchenherzens Das Kaninchenherz befindet sich zwischen dem dritten und sechsten Interkostalraum, kranial im Thorax [5] und schlägt mit einer Herzfrequenz zwischen 150- 300 Schlägen pro Minute. Das Herzgewicht beträgt dabei 0,3% des Körpergewichtes [6]. Das sauerstoffarme Blut wird beim Kaninchen während der Diastole über die rechte und linke V. cava cranialis [5,7,8], die in den Koronarsinus münden, und der V. cava caudalis dem rechten Atrium des Herzens zugeführt. Wenn der Druck im rechten Vorhof den intraventrikulären Druck übersteigt, öffnet sich die Valva tricuspidalis und das Blut kann in den rechten Ventrikel einströmen [9]. Die Trikuspidalklappe ist beim Kaninchen im Gegensatz zum Menschen zweizipflig [5,10] und über die sogenannten Chordae tendineae mit dem Endokard verbunden, sodass die Klappen nicht während der Systole in die Vorhöfe gedrückt werden können. Nachdem sich die rechte Hauptkammer des Herzens gefüllt hat, strömt in der Systole das Blut über die Pulmonalklappe in die beim Kaninchen stark muskuläre Pulmonalarterie [5,10,11]. So wird das sauerstoffarme Blut in die Lunge weitergeleitet und mit Sauerstoff wieder angereichert. Dieses sauerstoffreiche Blut gelangt nun wiederum während der Diastole in den linken Vorhof und wird über die zweizipflige Mitralklappe in den linken Ventrikel weitergeleitet und erreicht von dort aus während der Systole über die Aortenklappe die Aorta [10]. Die Versorgung des Herzens selbst erfolgt über die Koronararterien, dabei wird das Kaninchenherz vorallem über die linke Koronararterie versorgt, sodass es anfälliger für Myokardischämien ist [8,12]. Physiologie des ventrikulären Aktionspotentiales Das Herz ist im Gegensatz zum Skelettmuskel fähig, selbständig ohne äußere Reize zu kontrahieren und dieses selbst außerhalb des Organismus. Grundlage dafür sind die verschiedenen Ionenströme in den Herzmuskelzellen, die durch Kanalproteine und Transporter, welche die undurchlässige Lipiddoppelschicht der Zellwand durchziehen, ermöglicht werden [13,14,15,16]. Besonders in den Bereichen zwischen den einzelnen Herzmuskelfasern befinden sich in den sogenannten Glanzstreifen, Gebiete mit erhöhter Leitfähigkeit, welche die einzelnen Zellen zu einem funktionellen Synzytium verbinden. So ist eine Herzmuskelfaser nicht isoliert wie im Skelettmuskel [17]. Doch dies allein führt noch nicht zur vollständigen Autonomie des Herzens. Erst durch die verschiedenen Eigenschaften der Herzmuskelzellen kann dies erfüllt werden. So lassen sich Zellen des erregungsbildenden Systems im Herzen von denen des Arbeitsmyokardes unterscheiden [18], wobei die Zellen des Arbeitsmyokardes noch 4 weiter in endokardiale, epikardiale und sogenannte midmyokardiale (M-Zellen) unterteilt werden müssen. Die genannten Zelltypen unterscheiden sich hinsichtlich der Verteilung der Ionenkanäle [19,20]. Das Aktionspotential von Myokardzellen des Herzens lässt sich nach Kreating und Sanguinetti in fünf Phasen (0-4) unterteilen [13]. Die Phase 0 beinhaltet die schnelle Depolarisation der Muskelzelle durch einen raschen spannungs- und zeitgesteuerten Natriumeinstrom (INa) in die Zelle [14]. Dieser erfolgt aufgrund einer erhöhten extrazellulären Natriumkonzentration und der hohen negativen Ladung im Zellinneren entlang des elektrochemischen Gradienten [16,21]. Nahezu gleichzeitig erfolgt ebenfalls potential- und zeitgesteuert die Aktivierung von einem Kalziumkanal ICa-L (long-lasting), der zu einem Kalziumeinstrom führt, der wiederum Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Reticulum über Ryanodinrezeptoren freisetzt und so die Depolarisation weiter verstärkt [15,22]. Ein Natrium- KalziumAustauscher (NCX) unterstützt die Freisetzung von Kalzium in den intrazellulären Raum zusätzlich [23]. Mit der rasch einsetzenden Öffnung des Kaliumkanales Ito tritt die Phase 1 ein [21]. Es kommt zum Kaliumausstrom und damit zur kurzen und schnellen Repolarisation. Da der Kaliumkanal Ito endokardial seltener vorkommt [24], gibt es beim endokardialen Aktionspotential keine ausgeprägte Phase 1 im Gegensatz zum Aktionspotential der M- Zellen und der epikardialen Herzmuskelzellen [19]. Während der Phase 2 erfolgen so gut wie keine Nettoladungsverschiebungen [13,25], es besteht ein Gleichgewicht zwischen einem langsamen Kalziumeinstrom ICa-L [15,22] und einem spannungsabhängigen Kaliumausstrom. Dieser erfolgt zum Großteil durch IKr(rapid=r) und IKs(slow=s) [26,27]. Diese Kanäle sind bei den verschiedenen Spezies und Individuen unterschiedlich häufig und inhomogen verteilt [14], somit eignet sich nicht jede Spezies als Modell für das humane Herz. Das Kaninchen stellt jedoch aufgrund vergleichbarer Ionenkanäle und vergleichbarer geschlechtsabhängiger Eigenschaften der Herzmuskelzellen ein geeignetes Modell dar [28]. Eine Mutation im HERG-Gen (human-ether-a-go-go related gene), mittlerweile als KCNH2-Gen bezeichnet [28,20], welches für die α- Untereinheit von IKr kodiert [15], führt so beispielsweise zu einer Form des Langen- QT- Syndromes (LQT2) [28,29]. Es wurden bereits genveränderte Kaninchen gezüchtet, die ebenfalls die Mutation im HERG-Gen oder im KVLQT1 aufweisen und so als Modell für das LQT1 und LQT2 dienen [30]. Darüber hinaus greifen viele Antiarrhythmika und andere Medikamente an diesem Kanal an und blockieren ihn [31,32], was gerade in der Plateauphase des Aktionspotentiales zu erheblichen Ladungsschwankungen und Herzrhythmusstörungen führen kann, da in dieser Phase kleine Veränderungen der Ladungsverteilung große Auswirkungen haben können [13]. 5 Die Kaliumkanäle IKr und IKs führen in der Phase 3 zur weiteren Repolarisation [33]. Diese wird durch einen weiteren potenzialgesteuerten Kaliumausstrom IK1 noch verstärkt [14,22]. Dieser Kaliumausstrom IK1 hält auch das Ruhemembranpotential der Myokardzelle bei -80 bis -90mV [16,22] aufrecht. Das Ruhepotential entspricht damit einem Kaliumgleichgewichtspotential [21]. Mit Hilfe des Natrium-Kalzium-Austauschers (NCX) werden während der Diastole, im Austausch drei Natriumionen ins Zellinnere und ein Kalziumion nach außen, beziehungsweise zurück ins sarkoplasmatische Retikulum transportiert [34]. Darüber hinaus werden durch eine Natrium/Kalium Pumpe drei Natriumionen nach außen und zwei Kaliumionen ins Zellinnere transportiert [21] und somit die ursprünglichen Ladungsverhältnisse wieder hergestellt. Das Aktionspotential und die Refraktärzeit der Herzmuskelzelle dauert durch die lange Plateauphase 200-400ms an und ist damit deutlich länger als das einer normalen Muskelzelle mit 2-4ms, was eine grundlegende Schutzfunktion gegen eine tetanische Erregung darstellt [16]. Abbildung 1: Ventrikuläres Aktionspotential 6 Das erregungsbildende System des Herzens besteht aus dem Sinusknoten, dem AVKnoten, dem His-Bündel, der Tawara- Schenkel und den Purkinjefasern [12]. Dabei ist der Sinusknoten der primäre Rhythmusgeber; erst wenn dieser ausfällt, entsteht ein neuer Ersatzrhythmus von untergeordneter Stelle mit niedrigerer Schlagfrequenz [35]. Abbildung 2: Schrittmacherpotential Das Aktionspotential der erregungsbildenden Zelle ist gekennzeichnet durch einen langsam depolarisierenden, hauptsächlich aus Natrium- und Kaliumionen bestehenden [36] Kationeneinstrom If (funny channel) [37], der durch eine Hyperpolarisation unter -40/-45 mV aktiviert wird [38] und einer starken Regulation durch das autonome Nervensystem unterliegt [36,39]. Dieser führt zu einem rhythmisch wiederkehrenden Präpotential, insbesondere weil in den Schrittmacherzellen ein stabilisierender Kaliumstrom IK1 im Gegensatz zu den kontrahierenden Herzmuskelzellen nicht vorhanden ist [35]. Wenn das Präpotential die spezifischen Schwellenwerte erreicht, öffnen sich ein schnell inaktivierbarer (transienter) Kalziumkanal ICa-T und ein länger fortdauernder Kalziumkanal ICa-L, die zum Einstrom von Kalziumionen und dadurch zur raschen weiteren Depolarisation der Zellmembran führen [40]. Dies entspricht der Phase 0 des Aktionspotentiales. Eine schnelle Repolarisation und eine Plateauphase gibt es bei den Zellen des erregungsbildenden Systems nicht, sondern es folgt direkt die Phase 3 durch einen Kaliumausstrom über IKr und IKs, wobei die Verteilung zwischen den Spezies und entlang des erregungsbildenden Systems variiert. So werden beispielsweise beim Kaninchen im Sinusknoten und AV- Knoten hauptsächlich IKr und in den Purkinjezellen beide Kaliumkanäle exprimiert [41]. 7 Das Präpotential nimmt ausgehend vom Sinusknoten über die restlichen Anteile des erregungsbildenden Systems an Steilheit ab, somit wird eine Ordnung der Erregungsbildung erreicht [42]. Physiologie des atrialen Aktionspotentiales Abbildung 3: Atriales Aktionspotential Die Phase 0 wird in den atrialen Myozyten durch den Einstrom von Natriumionen über INa und den Einstrom von Kalziumionen über ICa-L ausgelöst [43]. ICa-L stellt auch den wichtigsten Kationeneinstrom während der Plateauphase des Aktionspotentials dar und wird im Gegensatz zum Ventrikel über second messenger wie Serotonin [44] und in Abwesenheit von ß-adrenerger Stimulation, von Phosphodiesterasen reguliert [45,46]. Während Phasen von Vorhofflimmern [47] bzw. durch eine Dilatation der Vorhöfe [48] wird der Kalziumeinstrom über ICa-L reduziert und somit sowohl die atriale Aktionspotentialdauer (aAPD) als auch die Refraktärzeit verkürzt und die Schaffung von Reentry- Mechanismen begünstigt [49]. Die Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, welche in den Vorhofmyozyten deutlich weniger ausgeprägt ist als in ventrikulären Herzmuskelzellen, wird ebenfalls durch den Einstrom von Kalzium über ICa-L getriggert [50]. Die Repolarisation während der Phase 1 findet überwiegend über den kalziumabhängigen Chlorideinstrom Ito2 statt [51]. Die 8 weitere Repolarisation erfolgt über einen vorhofspezifischen, frequenzabhängigen Kaliumausstrom IKur (ultra- rapid) [52], Ito1 [41] und beim Menschen auch über IKr und IKs [53] statt. Während der Phase 2 halten sich der Kalziumeinstrom und Kaliumausstrom die Waage. Wie auch im Ventrikel ist das Ruhepotential von -80mV [43] ein Kaliumgleichgewichtspotential, welches über einen Kaliumausstrom durch IKAcH, IK1, welcher sich von dem ventrikulären IK1 in mehreren Eigenschaften unterscheidet [54], sowie durch IKATP aufrecht erhalten wird [55]. 9 2. 2 Pathophysiologie 2.2.1 Grundlagen ventrikulärer Arrhythmien Jedes Jahr sterben circa 300‘000 Amerikaner am plötzlichen Herztod, der durch ventrikuläre Tachyarrhythmien verursacht wird. Viele Betroffene haben im Vorfeld kardiale Grunderkrankungen, aber es sterben auch immer wieder Personen ohne vorhergehende Symptomatik [1]. Da es bisher nicht möglich ist diese Arrhythmien vorherzusagen und vorzubeugen, laufen viele experimentelle Untersuchungen zur Aufklärung von Faktoren und Grundlagen, die zu diesen Herzrhythmusstörungen führen. Der plötzliche Herztod aufgrund von Herzrhythmusstörungen betrifft jedoch nicht nur die Humanmedizin, sondern ist auch in der Veterinärmedizin von großem Interesse [56,57]. Insbesondere trifft dies auf die dilatative Kardiomyopathie zu, in deren Folge es immer wieder zu tödlichen Arrhythmien kommen kann. Störungen der Repolarisation als Grundlage für Herzrhythmusstörungen Die Repolarisationsphase stellt die vulnerable Phase des Aktionspotentials dar. So können schon geringe Veränderungen der Ionenvorgänge zu großen Potentialschwankungen führen, die nach Beendigung der absoluten Refraktärzeit zu neuen Erregungen führen können [20]. Eine Blockierung der für die Repolarisation erforderlichen Kaliumkanäle IKr und IKs (loss of function), beziehungsweise ein fehlendes Schließen der Natriumkanäle INa (gain of function) [13] führt zur Verlängerung der Repolarisation und somit zu einer Verlängerung des Aktionspotentiales und der QT-Zeit im EKG [29]. Da IKr und IKs in der Ventrikelmuskulatur inhomogen verteilt sind [58], kommt es bei Blockaden dieser Kanäle eventuell zu einer Dispersion der Repolarisation in der Ventrikelwand. So ist beispielsweise IKs midmyokardial weniger häufig vertreten als epi- und endokardial, wohingegen IKr in den bisherigen Studien gleichmäßiger verteilt ist; dies führt dazu dass sogenannte M-Zellen besonders anfällig für APDVerlängerungen sind [59]. Dieses kann die Entstehung von ventrikulären Arrhythmien fördern, indem ein Reentry der Erregung möglich wird. Wenn beispielsweise die Erregung unidirektional auf nicht erregbares Gebiet trifft, kann die Erregung andere Wege nehmen, da Bereiche daneben beziehungsweise dahinter schon wieder erregbar sein können aufgrund unterschiedlicher Repolarisationszeiten [13]. Das Intervall vom Scheitelpunkt der T-Welle bis zu deren Ende kann als Maß für die Dispersion der Repolarisation im EKG verwendet werden [60]. Normalerweise wird diese Gefahr noch durch die sogenannte Repolarisationsreserve gesenkt, indem die nötigen Ionenkanäle im Überfluss exprimiert werden, beziehungsweise bei der Blockade eines essentiellen Ionenkanales wie beispielsweise IKr eine vermehrte Expression von Ersatzkanälen [61] stattfindet. 10 Bestehen jedoch weitere Faktoren wie beispielsweise Hypokaliämie [62,63], Bradykardie [64] und das weibliche Geschlecht [28], die zu einer Verlängerung der QTZeit und zu einer Verringerung der Repolarisationsreserve führen, so kann die Entstehung von Reentry-Mechanismen zusätzlich gefördert werden [29]. Allerdings führen nicht alle Medikamente, die eine Verlängerung der QT- Zeit bewirken, wie beispielsweise Amiodaron [65,66], zu schwerwiegenden Arrhythmien. Erst wenn zusätzlich eine Dispersion der Repolarisation durch eine unterschiedliche Verteilung der blockierten Kanäle und eine Verringerung der Repolarisationsreserve stattfindet, kann dies als prädiktiver Faktor für lebensbedrohliche Herzrhythmusstörungen gewertet werden [67]. Schließlich führt eine gleichmäßige Verlängerung der Repolarisation und damit der absoluten Refraktärzeit über das gesamte Myokard zu einem Schutz vor abnormalen Erregungen, worin auch die Berechtigung für den jahrelangen Einsatz von Antiarrhythmika der Klasse ǀǀǀ begründet liegt. Das lange QT- Syndrom Als QT-Zeit bezeichnet man im EKG die Strecke zwischen dem Beginn des QRSKomplexes und dem Ende der T-Welle. Am Besten eignet sich zum Ablesen der QTZeit die 2. Ableitung nach Einthoven [68]. Da die QT-Zeit von der Herzfrequenz abhängig ist, wird sie frequenzkorrigiert und dann als QTc bezeichnet [69]. Eine QT-Zeit von mehr als 500ms ist beim Menschen als pathologisch anzusehen und ist häufig mit lebensbedrohlichen Arrhythmien verbunden [70]. Das lange QT-Syndrom (LQTS) kann sowohl hereditär als auch erworben sein. Beim angeborenen LQTS bestehen Genmutationen, die zu fehlerhaften Expressionen der Ionenkanäle führen, die für die Repolarisation während des Aktionspotentials nötig sind. So kommt es zur Verlängerung der Aktionspotentiale und in der Summe auch zur Verlängerung der QT-Zeit [71]. Aufgrund der bestehenden Dispersion der Repolarisation durch die inhomogene Verteilung der Ionenkanäle im Herzen [58] kann es zu lebensgefährlichen Arrhythmien vom Torsade de Pointes-Typ kommen, insbesondere bei bestehenden Risikofaktoren wie Hypokaliämie [62,63] oder medikamenteller Therapie mit Substanzen, die ebenfalls die QT-Zeit verlängern [72]. Es lassen sich mittlerweile 15 Syndrome vom autosomal-dominanten Romano-Ward Typ und zwei Syndrome vom selteneren, mit Innenohrschwerhörigkeit einhergehenden Jervell and Lange-Nielsen Typ unterscheiden, die auf verschiedenen Mutationen beruhen [70]. Die Unterformen LQT1-3 sind jedoch am häufigsten [73]. 11 Abbildung 4: Einteilung der kongenitalen QT Syndrome aus: Genetic and Clinical Advances in Congenital Long QT Syndrome [74] Das LQT1 beruht auf einer Mutation im KCNQ1 Gen, welches für den Kaliumkanal Kv7.1 codiert, den einwärtsgerichteten Ionenstrom IKs bewirkt und häufig zu Arrhythmien während körperlicher Belastung oder emotionalem Stress führt. Die Rhythmusstörungen treten hier typischerweise während des Schwimmens auf [75]. Das LQT2 wird durch eine Mutation im KCNH2 (HERG) Gen, welches für den einwärtsgerichteten Gleichrichterstrom IKr codiert, ausgelöst und kann sowohl in Ruhe als auch unter Belastung und postpartal Synkopen hervorrufen [75]. Das LQT3 entsteht durch eine Mutation im SCN5A Gen [76] und führt im Gegensatz zu den LQT1 und LQT2 zu einer Verstärkung der Expression des Natriumkanales (gain of function) und somit zu einem verstärkten Natriumausstrom und so folglich zur Verlängerung der Repolarisation [71]. Synkopen treten bei diesem Typ vor allem in Ruhe und in der Nacht auf [75]. Die Häufigkeit von lebensgefährlichen Arrhythmien ist bei Frauen mit dem LQT1 und LQT2 deutlich häufiger als bei Männern mit den gleichen genetischen Defiziten, während beim LQT3 häufiger männliche Personen betroffen sind [70]. Das erworbene LQTS kann durch den Einsatz von Medikamenten, welche die Kaliumkanäle IKr und/ oder IKs blockieren, beziehungsweise die Aktivität von INa steigern, hervorgerufen werden. Insbesondere IKr ist ein Kanal, der von vielen 12 Medikamenten aufgrund seiner Struktur mit aromatischen Aminosäuren und deren Seitenketten sowie zwei Prolinresiduen in der Helix blockiert wird [77]. So bewirken viele Antiarrhyhthmika der Klasse ǀa und ǀǀǀ, Antihistaminika und Antibiotika eine Verlängerung der QT-Zeit [72]. Eine Verlängerung der Repolarisation reicht jedoch nicht aus, um gefährliche Arrhythmien auszulösen. Dafür müssen zusätzliche Faktoren vorhanden sein, die eine Dispersion der Repolarisation [58] und eine Verringerung der Repolarisationsreserve [29] bewirken. In dieser Arbeit wurde das LQT2 durch die Gabe von Sotalol, einem Antiarrhythmikum der Klasse ǀǀǀ, welches den Ionenstrom durch IKr blockiert [78] und Erythromycin, einem Makrolidantibiotikum, welches ebenfalls IKr hemmt, simuliert [79,80]. Die Gabe von Veratridine, einem Alkaloid, führt über die Hemmung der Inaktivierung von I Na zur QTVerlängerung und entspricht damit dem LQT3 [81]. Frühe Nachdepolarisationen (early afterdepolarizations, EADs) Cranefield nutzte im Jahre 1977 erstmals den Begriff der early afterdepolarizations (EADs) für neue Depolarisationen während der Repolarisationsphase des Aktionspotentiales [82]. Abzugrenzen sind diese von den späten Nachdepolarisationen (delayed afterdepolarizations, DADs), die erst nach der vollständigen Repolarisation, also während der Phase 4 des Aktionspotentials stattfinden [83]. EADs führen häufig zu Arrhythmien vom Torsade de Pointes Typ im Zusammenhang mit dem erworbenen und kongenitalen QT Syndrom [13,84], insbesondere wenn weitere Faktoren wie Hypokaliämie [84], Hypomagnesämie [85] und Bradykardie [64] bestehen, welche die Entwicklung von Herzrhythmusstörungen begünstigen. Grundlage für das Entstehen von EADs sind oszillierende Potentialschwankungen während der Plateauphase bzw. der 3. Phase des Aktionspotentials [86] und eine Hemmung des Ausstromes von Kationen bzw. eine Förderung von positiven einwärtsgerichteten Ionenströmen, welche die positive Ladung im Zellinneren fördern und damit die APD verlängern [87]. Wenn unter diesen Voraussetzungen eine zusätzliche Reaktivierung von Kationenkanälen erfolgt, beispielsweise durch eine Reaktivierung von I Ca-L [88,89] oder INa [20] bzw. durch die vermehrte Aktivität des Natrium-Kalzium-Austauschers (NCX) [90] und damit der Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, kann es zur erneuten Depolarisation kommen, bevor die vorhergehende Erregung beendet war. 13 Abbildung 5: Repräsentatives Beispiel früher Nachdepolarisationen am isolierten Kaninchenherzen Torsades de Pointes Dessertenne definierte 1966 erstmals den Begriff Torsades de Pointes (TdP) [91] um die polymorphen ventrikulären Tachyarrhythmien zu beschreiben, bei denen die Kammerkomplexe um die isoelektrische Linie rotieren und eine typische Spitzenumkehr der QRS-Komplexe auftritt [92]. Damals wurden die beschriebenen Arrhythmien noch nicht mit einem verlängerten QT-Intervall in Verbindung gebracht. Erst um 1970 wurde die Verlängerung der QT-Zeit durch verschiedene Medikationen als Ursache für das Auftreten von TdP als sicher angesehen [29]. Grundvoraussetzung für das Auftreten von TdP ist eine Dispersion der Repolarisation [58], eine Reduktion der Repolaristionsreserve [29] und das Auftreten von EADs als Auslöser [20]. Dabei reicht eine QT-Verlängerung durch Medikamente wie beispielsweise Antiarrhythmika der Klasse ǀa und ǀǀǀ, Antibiotika wie Erythromycin, beziehungsweise Antihistaminika wie Terfenadine oder Psychopharmaka [72] nicht aus, sondern es müssen weitere Faktoren vorhanden sein, die die repolarisierende Kanäle beeinträchtigen [85,93-95]. So wurde zum Beispiel bei einigen Afroamerikanern und einer kaukasischen Familie eine Mutation festgestellt, welche zu einer Veränderung der Aktivierung des Natriumkanales führt, womit es häufiger zu Arrhyhthmien bei diesen Personen im Zusammenhang mit einer Blockierung des I KrKanales kommt [29]. 14 Viele Medikamente werden darüber hinaus über das Enzymsystem P450 verstoffwechselt. Kommt es zu einer Blockade oder kompetitiven Hemmung mit einem anderen Stoff um dieses System, steigt der Plasmaspiegel des Medikamentes im Blut und dies kann in vielen Fällen zu einem erhöhten Risiko für das Auftreten von TdP führen [96]. So steigt die Anzahl von TdPs unter der Anwendung von Sotalol mit steigenden Wirkstoffspiegeln [97,98]. Ebenso kann es zu einer Erhöhung der Plasmaspiegel bestimmter Stoffe kommen, wenn die Leber- bzw. Nierenfunktion beeinträchtigt ist [99]. Abbildung 6: Repräsentatives Beispiel einer Torsades de Pointes- Episode am isolierten Kaninchenherzen 2.2.2 Vorhofflimmern Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung beim Menschen und die Prävalenz steigt laut epidemiologischer Studien immer weiter an [3]. Die Ursache für die zunehmende Häufigkeit liegt wohl im demographischen Wandel der Gesellschaft, da das Auftreten von Vorhofflimmern mit zunehmendem Alter ansteigt [100]. Die Pathogenese ist noch immer nicht vollständig aufgeklärt, Risikofaktoren stellen jedoch Bluthochdruck, das männliche Geschlecht, Diabetes mellitus Typ 2, bestimmte 15 genetische Faktoren, Klappenerkrankungen des Herzens sowie andere chronische Herzerkrankungen und ein erhöhtes Lebensalter dar [101]. Abbildung 7: Repräsentatives Beispiel einer induzierten Vorhofflimmerepisode am isolierten Kaninchenherzen Entstehung von Vorhofflimmern Vorhoffimmern ist eine sehr komplexe Herzrhythmusstörung und es sind diverse Mechanismen an der Entstehung beteiligt. Als grundlegender Mechanismus wird heute die Entstehung sogenannter Rotoren angesehen, indem eine Erregungswelle auf ein Hindernis, beispielsweise durch die Heterogenität oder Fibrose des Gewebes, trifft. Dabei entstehen durch den Rotor neue Erregungswellen, die ebenfalls zur Entstehung neuer Rotoren führen können [102]. Bereits 1962 wurde von Gordon Moe die „multiple wavelet“ Hypothese aufgestellt, in der die Entstehung von Vorhofflimmern in Rotoren und vielen gleichzeitig auftretenden Wellen begründet liegt [103]. Diese Hypothese wurde 1977 von Allessie durch die „leading circle“ Theorie zunächst abgelöst, die im Gegensatz zu den Ergebnissen von Moe nicht auf Computersimulationen beruhte, sondern anhand von Experimenten am Kaninchenherzen aufgestellt wurde [104]. Ein wesentlicher Unterschied zwischen 16 beiden Hypothesen ist, dass bei der „leading circle“ Hypothese das Zentrum des Erregungsringes refraktär ist, da sich die Erregung zentripetal ausbreitet, während bei der Rotorhypothese von einem erregbaren Zentrum ausgegangen wird und damit die Rotoren nicht lokal fixiert sind, sondern beweglich [105]. Außerdem ist bei der Theorie von Rotoren die Kurvatur der Spirale von Bedeutung hinsichtlich der Geschwindigkeit der Erregungsausbreitung. So breiten sich die Wellen um so schneller aus, je konkaver die Struktur des Rotors ist, während die Gesamtgeschwindigkeit mit zunehmender Kurvatur abnimmt, sodass die Depolarisationswelle im Rotorenkern die umliegenden Zellen nicht mehr erregen kann [106]. Dadurch entsteht ein elektrisches Potential zwischen dem Kern und dem umliegenden Gewebe, welches zu einer APD Verkürzung der kernnahen Myozyten führt und damit zur Stabilisierung des Rotors [107]. Durch Allessie selbst wurde schließlich im Jahre 1985 der experimentelle Nachweis für die „ multiple wavelet“ Hypothese erbracht [108]. Die Entstehung eines Rotors kann experimentell beispielsweise durch das S1- S2 Protokoll erreicht werden [109]. Dabei wird kurz nach dem ersten Stimulus (S1) ein zweiter Stimulus (S2) gesetzt, dessen Erregungsfront senkrecht zu der von S2 gerichtet ist. Durch die teilweise blockierte Erregungsfortleitung von S2 am Kreuzungspunkt kommt es zur Ausbildung einer rotierenden Erregungsspirale [110]. Dieser Vorgang ist in Abbildung 9 veranschaulicht. Im ersten Bild ist die Erregungswelle von S1 links im Bild als weißer Streifen erkennbar. Die Erregungsfront von S2 befindet sich bei 185ms als weißer Balken am unteren Bildrand. Die Ausbildung des Rotors beginnt bei 260ms. Rotoren wurden mittlerweile nicht nur in Tiermodellen dargestellt [111,112], sondern auch in menschlichem Gewebe als wichtiger pathogenetischer Faktor in der Entstehung von Vorhofflimmern und Kammerflimmern erkannt [113]. Es ist jedoch immer noch umstritten, ob ein einzelner Rotor wie in der „mother rotor“ Hypothese [112] ausreicht, um eine fibrillatorische Erregungsausbreitung hervorzurufen, oder ob mehrere Wellen wie in der „multiple wavelet“ Hypothese dafür notwendig sind [114]. Mittlerweile wird davon ausgegangen, dass beide Hypothesen ihre Berechtigung haben und an der Entwicklung von Vorhofflimmern beteiligt sind [102]. 17 Abbildung 8: Schematische Darstellung der „Leading circle Hypothese“ nach Pandit und Jalife (2013) [105] Abbildung 9: Schematische Darstellung der Entstehung von Rotoren (modifiziert aus [115]) Abbildung 10: Schematische Darstellung eines Rotors (modifiziert aus [105]) 18 Beteiligte Ionenkanäle und therapeutische Ansätze Die multifaktorielle Entstehung von anfallsartigem und chronischem Vorhofflimmern lässt auf eine unterschiedliche Bedeutung und Beteiligung vieler verschiedener Ionenkanäle schließen, welche noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Bereits nachgewiesen ist ein Anstieg von IK1 bei Patienten mit chronischem Vorhofflimmern, welches zu einer Hyperpolarisation und im Zusammenhang mit der gesteigerten Aktivität von INa zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer führt [116,117,118]. Dieser Zusammenhang zwischen der Überexpression von IK1 und Vorhofflimmern wurde durch die Entwicklung von transgenen Mäusen mit einer verstärkten Expression von IK1, die in experimentellen Versuchen ein häufigeres und länger bestehendes Vorhofflimmern im Gegensatz zu Wildtyp- Mäusen zeigten, noch weiter belegt [119]. Die Blockade von IK1, beispielsweise mit Chloroquin führt zu einer Terminierung des Vorhofflimmerns [120]. Die Ergebnisse bezüglich des Klasse ǀAntiarrhythmikums Flecainid, welches INa hemmt, sind widersprüchlich. Laut Filgueiras-Rama et al. führt Flecainid in zwei von fünf Fällen zu einem Übergang des Vorhofflimmerns in eine Tachykardie der Vorhöfe und nicht zum Beenden des Vorhofflimmerns [120]. Jedoch wird in diesen Versuchen die atriale Fibrillation durch eine vermehrte Dehnung der Vorhöfe provoziert. In anderen Studien führt Flecainid zu einer deutlichen Hemmung des Vorhofflimmerns [121] und wird bei herzgesunden Patienten von der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie zur medikamentösen Therapie ausdrücklich empfohlen [122]. Dies zeigt, dass die Blockade verschiedener Ionenkanäle einen wesentlichen Aspekt der medikamentösen Therapie des Vorhofflimmerns darstellt. Bisher werden überwiegend Natriumkanalblocker wie das auch hier verwendete Flecainid, Kaliumkanalblocker wie Sotalol und Substanzen, die gleichzeitig mehrere verschiedene Ionenkanäle hemmen, wie beispielsweise Amiodaron eingesetzt. Diese sind zwar effektiv hinsichtlich der Behandlung von Vorhofflimmern, wirken sich jedoch auch auf die ventrikuläre Repolarisation aus und können ventrikuläre Herzrhythmusstörungen begünstigen [123]. So sind Substanzen, welche Natriumkanäle blockieren, im Falle von Koronarerkrankungen und strukturellen Herzerkrankungen kontrainduziert, da sie die Erregungsleitung erheblich verlangsamen. Kaliumkanalblocker verlängern die QT-Zeit und fördern so die Entwicklung von TdP und die multifokal wirkenden Substanzen sind assoziiert mit einer toxischen Wirkung an verschiedenen Organsystemen [124]. So gewinnen Substanzen, die spezifisch an atrialen Ionenkanälen wie beispielsweise IKur, IK-ACh oder If wirken, zunehmend an Bedeutung. Auch INa- Blocker, die überwiegend in den Atrien wirken, wie zum Beispiel Ranolazin, stehen im Mittelpunkt der antiarrhythmischen Forschung. So führt Ranolazin zu einer Verlängerung der Aktionspotentialdauer und zu einer Verlängerung der Post-RepolarisationsRefraktärität [125] und könnte somit als ein vorhofspezifisches Klasse ǀ Anti- 19 arrhythmikum bezeichnet werden. Ranolazin wirkt jedoch nicht nur auf INa, sondern blockiert auch IKr und führt so zu einer Verlängerung der APD90. Die Effektivität Vorhofflimmern zu stoppen, ist mit dieser zweiten Eigenschaft IKr zu blockieren gekoppelt, da alleinige INa Blocker wie Lidocain nicht effektiv wirken [124]. Ähnliche Eigenschaften ließen sich jedoch auch am ventrikulären Myokard nachweisen [126]. Die Gesamtmenge des Ionenstromes IK-ACh kann bei Patienten mit chronischem Vorhofflimmern sowohl erhöht [127] als auch erniedrigt [128] sein. Betrachtet man jedoch nur den IK-ACh, der nicht muskarinerg bzw. vagal aktiviert wird, ist dieser im Falle von chronischem Vorhofflimmern sowohl beim Menschen [129] als auch beim Hund [130] erhöht. Obwohl die selektive Blockade von IK-ACh experimentell zu einer APDVerlängerung führt und Vorhofflimmern unterdrückt [131], sind derzeit keine selektiven IK-ACh Blocker klinisch verfügbar [124]. Die experimentellen Ergebnisse hinsichtlich IKur sind sehr unterschiedlich. So führt eine Reduktion von IKur an klinisch unauffälligen Vorhöfen lediglich zu einer Verkürzung der frühen Repolarisationsphase aber nicht der späten (APD70 und APD90). Im Gegensatz dazu führt eine Blockierung bei krankhaft veränderten Atrien zu einer Verlängerung der APD70 und APD90 [132]. Viele Medikamente die IKur blockieren wie beispielsweise das neue Antiarrhythmikum Vernakalant, bewirken jedoch eine Verlängerung der Refraktärzeit insbesondere der Post-Repolarisations-Refraktärität, sowohl bei gesunden als auch bei erkrankten Atrien. Die Ursache hierfür liegt darin, dass viele Substanzen wie Vernakalant nicht nur IKur, sondern auch INa und IKr im Vorhof hemmen [133]. Dabei ist die spezifisch atriale Wirkung der Blockierung von IKr frequenzabhängig. Bei niedrigen Frequenzen besteht eine überwiegend ventrikuläre Wirkung, währenddessen bei höheren Frequenzen die Wirkung zunehmend selektiv die Vorhöfe betrifft [124]. Vernakalant wird auch hier verwendet, um dessen Wirkungsweise mit der von Antazolin vergleichen zu können. Ein weiterer Ionenkanal, der im Fokus der antiarrhyhtmischen Vorhoftherapie steht, ist der sogenannte funny-channel If. Dieser nicht selektive Ioneneinstrom, der überwiegend im Sinusknoten, im AV- Knoten und im Myokard der Pulmonalvenen vorkommt [134], spielt eine ebenfalls entscheidende Rolle in der Genese von Vorhofflimmern, welches häufig seinen Ursprung in den Pulmonalvenen hat [135], und mit einer erhöhten Aktivität des If in Verbindung steht [134]. Insbesondere im Falle von Herzinsuffizienz [136] und vermehrtem linksatrialen Füllungsdruck kommt es zu einem verstärkten Ionenstrom If [137] sowie unter starker sympathischer Aktivität über cAMP zur direkten Förderung von If [138]. In dieser Arbeit wird Ivabradin, ein selektiver If-Inhibitor, eingesetzt, um den hemmenden Effekt von Ivabradin auf Vorhofflimmern und dessen Wirkungsweise im Langendorff- perfundierten Kaninchenherzen darzustellen und mit der Wirkung von Antazolin zu vergleichen. 20 2.3 Antazolin Abbildung 11: Strukturformel von Antazolin Antazolin ist ein Antihistaminikum der ersten Generation mit chinidin-ähnlichen antiarrhythmischen Eigenschaften [139-141] und einer zusätzlichen anticholinergischen Wirkung [142,143]. Dutta stellte erstmals 1948 im tierexperimentellen Modell die antiarrhythmischen Eigenschaften von Antazolin fest [143] und es folgten weitere experimentelle Nachweise und Patientendaten, die eine Hemmung von verschiedenen Arrhythmieformen durch Antazolin bestätigten [144-147]. So unterdrückt Antazolin sowohl ventrikuläre als auch atriale Extrasystolen und Tachykardien, hemmt Arrhythmien aufgrund von Digitalisintoxikationen und verhindert Kammerflimmern während hypothermischer Phasen [148]. Zu erklären ist dies durch eine Verlängerung des Aktionspotentiales, einer Hemmung der Kontraktilität des Myokardes, einer Verringerung der Leitungsgeschwindigkeit im Atrium und durch eine Erhöhung der atrialen Refraktärzeit, wohingegen die atrioventrikuläre Überleitung verbessert wird [142,149]. Die überwiegend mehr als 40 Jahre alten Veröffentlichungen basieren dabei größtenteils auf Erfahrungsdaten und weniger auf fundierten wissenschaftlichen Studien. Hinsichtlich der antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin in Phasen von Vorhofflimmern sind die bisherigen Ergebnisse widersprüchlich. So sprachen viele Ergebnisse klar gegen eine derartige Wirkungsweise [145], wohingegen andere diese These unterstützten [150-152]. In Polen wird Antazolin-hydrochlorid bereits seit vielen Jahren zur Behandlung von Vorhofflimmern eingesetzt [142,153]. Dabei stellt es insbesondere aufgrund seiner schnellen Wirkungsweise, der kurzen Halbwertszeit von drei Stunden [140,149] und den selten vorkommenden Nebenwirkungen wie Hypotonie, Benommenheit, Übelkeit und Erbrechen [145], ein geeignetes Medikament dar. Durch die zuletzt initiierte 21 AnPAF Studie [142] sollen nun schließlich die fehlenden klinischen Daten in Form einer randomisierten, doppelblinden Studie mit einer Kontrollgruppe erbracht werden. Nach dem erfolgreichen Abschluss der AnPAF Studie könnte dies eine Erweiterung der Leitlinien zur Behandlung von Vorhofflimmern bedeuten, da die bisherigen Antiarrhythmika aus der Klasse ǀA,ǀC und ǀǀǀ wie beispielsweise Flecainid und Amiodarone sowie der neuere Wirkstoff Vernakalant, die derzeit eingesetzt werden [154,155], auch zum Teil erhebliche Nachteile mit sich bringen. Diese sind einerseits das ebenfalls häufig bestehende proarrhythmische Potential, die zum Teil geringe Effizienz oder die hohen Kosten wie im Falle von Vernakalant [142]. Im Gegensatz dazu stellt Antazolin ein sehr kostengünstiges, mit wenigen Nebenwirkungen einhergehendes Medikament dar, wenngleich es nicht für Patienten, die an Hypotonie, chronischer Herzinsuffizienz mit einem verringerten Auswurfvolumen oder koronaren Herzerkrankungen leiden, geeignet ist, da Antazolin das Schlag- und Auswurfvolumen reduziert und zu Hypotonien führen kann [152]. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die antiarrhythmische ventrikuläre und atriale Wirkungsweise von Antazolin in experimentellen Untersuchungen auf Organebene aufzuzeigen, da diese grundlegenden Untersuchungen bisher nicht durchgeführt worden sind. Dadurch wird ein weiterer Grundstein auf dem Weg zum therapeutischen Einsatz von Antazolin zur Behandlung lebensgefährlicher Arrhythmien, sowie zur Reduktion der proarrhythmischen Wirkungen durch andere Medikamente gelegt. Auch wird es in dieser Arbeit möglich, die Wirkung von Antazolin direkt mit anderen antiarrhythmisch wirkenden Substanzen zu vergleichen und Vor- beziehungsweise Nachteile aufzuzeigen. 22 3. Material und Methode 3.1 Versuchstiere Für die Versuchsreihen wurden insgesamt 116 weibliche Kaninchen der Rasse "Weiße Neuseeländer“ verwendet. Die Tiere hatten ein durchschnittliches Gewicht von 3,8 Kilogramm. Weibliche Tiere wurden verwendet, da sich bereits gezeigt hat, dass elektrophysiologische Geschlechtsunterschiede bestehen. So haben Frauen postpubertär ein längeres QTc-Intervall als Männer [28,156] und eine höhere Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von medikamenteninduzierten Torsades de Pointes [157]. Somit konnte mit einem häufigeren Auftreten von Arryhthmien unter der Verwendung von ausschließlich weiblichen Tieren gerrechnet werden. Die Kaninchen waren in der Zentralen Tierexperimentellen Einrichtung des Universitätsklinikums Münster unter standardisierten Bedingungen untergebracht. Die Tiere befanden sich einzeln in Kunststoffkäfigen, die Raumtemperatur betrug 20°C, die Luftfeuchte 60% und der Tag-Nacht-Zyklus betrug 12h:12h. Wasser und Futter stand ad libitum zur Verfügung. Die Betreuung der Versuchstiere erfolgte durch ausgebildete Pflegekräfte. Diese waren für die Fütterung, Pflege und tägliche Kontrolle der Kaninchen zuständig. Vor den Versuchen wurde eine klinische Allgemeinuntersuchung der Kaninchen durchgeführt, um einen guten Gesundheitszustand bei allen verwendeten Kaninchen zu gewährleisten. 3.2 Präparation des Kaninchenherzens Den Kaninchen wurde nach der klinischen Untersuchung über die V. auricularis superficialis, die sich am lateralen Ohrrand befindet, ein venöser Zugang mit einem Butterfly gelegt. Darüber erfolgte eine Prämedikation mit 1000IE/kg Heparin (HeparinNatrium 25000 ratiopharm GmbH, Ulm) um eine Thrombosebildung im Herzen zu verhindern. Danach wurden 5ml Thiopental (Thiopental-Natrium 0,5g, Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg) langsam intravenös injiziert, bis eine Erschlaffung der Muskulatur und der Ausfall des Kornealreflexes eintrat. Nachdem so die vollständige, tiefe Narkose festgestellt wurde, durchtrennte man die V. jugularis um das Tier zu entbluten und dadurch den Tod herbei zu führen. Die Kaninchen wurden dann in Rückenlage fixiert und die Bauchdecke durch eine Hilfsperson auf Spannung gehalten. So konnte mit einer Geflügelschere der Peritonealraum direkt kaudal des Arcus costae eröffnet werden. Nun erfolgte die Eröffnung des Brustraumes. Mit einer Metzenbaumschere wurde das Zwerchfell entlang des Rippenbogens abgeschnitten, die Rippen mittels der Geflügelschere senkrecht durchtrennt und der ventrale Anteil des Thorax zurück- 23 geklappt, sodass man mit freier Sicht auf das Kaninchenherz blicken konnte. Das Perikard wurde eingeschnitten und entfernt und der Aortenbogen aufgesucht. Dieser wurde kranial durchtrennt und das Herz durch einen kraniokaudalen Schnitt entlang der Luftröhre aus der Körperhöhle präpariert. Das Herz wurde sogleich danach in ein Becherglas mit körperwarmer Nährlösung überführt, um möglichst schnell ein körperähnliches Milieu zu schaffen und das Herz zu entbluten. Durchschnittlich wurden für die Präparation der Herzen circa 90 Sekunden benötigt. 3.3 Langendorff- Versuch am isolierten Kaninchenherzen Der Aufbau des Langendorff-Versuches am isolierten Kaninchenherzen ist bereits mehrfach beschrieben worden [4,158,159]. Verwendet wurde hierfür die LangendorffApparatur der Firma Hugo Sachs Elektronik (Medical Research Instrumentation, March- Hugstetten, Typ843/1 Size 5). So konnte das Kaninchenherz retrograd über die Aorta ascendens unter kontrolliertem Perfusionsdruck, konstanter Temperatur und Lösung perfundiert werden und eine Messung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) und die elektrokardiographische Ableitung unter standardisierten Bedingungen erfolgen. 24 3.3.1 Versuchsapparatur Abbildung 12: Schema der Langendorff- Versuchsapparatur 25 Wärmebad und Perfusionslösung Die Zusammensetzung der Krebs- Henseleit-Lösung (KHB), die das Herz während des Versuches mit ausreichend Sauerstoff, Elektrolyten und Nährstoffen versorgt, ist in Tabelle 1 beschrieben. Die nötigen Inhaltsstoffe werden mit einer elektrischen Waage (Sartorius BP 210 S, Göttingen) abgewogen und in 10 Liter deionisiertes Wasser gegeben. In einem weiteren Lösungsansatz wird die hypokaliämische KrebsHenseleit-Lösung hergestellt. Nachdem die Chemikalien gelöst sind, wird die gesamte Lösung noch mit Faltenfiltern (Whatman GE Healthcare, Buckinghamshire UK) gefiltert. Tabelle 1: Zusammensetzung der verwendeten Krebs-Henseleit-Lösung Substanz C [mmol/l] NaCl NaHCO3 Glucose×H2O Na- Pyruvat MgSO4×7 H2O CaCl2×2 H2O KH2PO4 KCl (5,8mmol) KCl (1,5mmol) 118,00 24,88 5,55 2,00 0,83 1,80 1,18 4,70 0,33 Die Perfusionslösung wird durch eine Kreiselpumpe ( Ecoline VC-MS/CA 8-6; Ismatec SA Labortechnik- Analytik, Glattbrugg-Zürich, Schweiz) mit 52ml/min und einem konstanten Perfusionsdruck von 90mmHg durch die Versuchsapparatur befördert, dabei durchläuft das Perfusat einen Wärmeaustauscher, der die Lösung auf 37°C erwärmt. Die Perfusionsgeschwindigkeit wird vor dem Versuch mit einem Messzylinder überprüft. Um eine Luftembolie im Myokard durch Luftblasen in der Lösung zu verhindern, wird die Nährlösung in eine Glaskammer gepumpt, die als Gasfalle funktioniert und so die eventuellen Luftblasen entfernt. Das Kaninchenherz wird mit der Aorta an einer Glaskapillare mit chirurgischem Nahtmaterial (Ethicon Vicryl 3,5 Ph.Eur.0, Norderstedt) befestigt und Bindegewebsreste werden entfernt. 26 Über diese Glaskanüle läuft die Lösung retrograd durch die Aorta ascendens weiter in die Koronargefäße und versorgt so das Myokard mit allen wichtigen Nährstoffen, Elektrolyten und Sauerstoff. Dieser wird der Lösung in Form von Cabogen 5, einem Gemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlenstoffdioxid, bereits im Vorratsbehälter zugesetzt und so die Lösung damit gesättigt. Nachdem die Krebs-Henseleit-Lösung das Myokard durchflossen hat, sammelt sich diese im rechten Ventrikel und wird über die Arteria pulmonalis in das Wärmebad entlassen. Darin eingetaucht befindet sich das Herz. Das doppelwandige Wärmebad wird ebenfalls auf 37°C erwärmt und die Temperatur vor und während des Versuches mittels eines digitalen Thermometers überprüft. Das Wärmebad beinhaltet einen Ablauf, über den die verbrauchte Lösung ablaufen kann. Abbildung 13: An der Langendorff- Apparatur befestigtes, isoliertes und retrograd perfundiertes Kaninchenherz Über Perfusoren (Perfusor® Secura, Braun Melsungen AG) können der KrebsHenseleit-Lösung schon zu Beginn Medikamente zugesetzt werden, die dann mit der Nährlösung das Herz durchfließen. Dies wird über Dreiwegehähne gesteuert. Ebenso kann die normale Krebs-Henseleit-Lösung durch eine hypokaliämische Lösung ersetzt werden, um Arrhythmien zu induzieren. 27 Elektrokardiogramm Während des gesamten Versuches erfolgte eine elektrokardiographische Ableitung mittels einer dafür entwickelten Elektrodenplattform der Firma Hugo Sachs. Diese beinhaltet eine Vielpol-EKG-Ableitung aus Silber/Silberchlorid, welche die Extremitätenableitung nach Einthoven und Goldberger sowie sechs Brustwandableitungen am isolierten Kaninchenherzen simuliert. Die Elektroden sind über ein Kugellager mit der Plattform verbunden, welche so im Wasserbad positioniert werden, dass sich die Elektroden mit den Gummihalterungen dicht um das Herz befinden, ohne dieses direkt zu berühren. Es werden also lediglich die elektrischen Ströme in der Krebs-Henseleit-Lösung gemessen. Die Signale werden über einen Standardverstärker mit einem 0,1-300 Hz- Filter verstärkt und über eine elektrophysiologische Anlage der Firma Bard (Lab System Pro EP Recording System Version 2.4.47.0 C.R. Bard, Inc. 1986-1996, Salt Lake City, USA) aufgezeichnet. Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale Abbildung 14: Ableitungsstellen der monophasischen Aktionspotentiale 28 Die Ableitung der monophasischen Aktionspotentiale (MAPs) erfolgte standardisiert mittels vier epikardialen Ableitungskathetern (EP Technologies, Mountain View, CA, USA) auf der linken Herzseite sowie weiteren drei Kathetern auf der rechten Herzseite (Abbildung 14). Diese wurden senkrecht auf dem Myokard platziert und deren Position nur geringfügig zur Optimierung der Signale verändert. Nur selten musste deren Stellung aufgrund lokaler Myokardischämien großzügiger verändert werden. Die Katheter waren mit Metallröhrchen stabilisiert und über einen Federmechanismus mit der Langendorff-Anlage verbunden, so konnten sie mit konstantem Druck den Herzbewegungen folgen [160,161]. Ein weiterer beweglicher Ableitungskatheter wurde über den linken Vorhof vorsichtig über die Mitralklappe in die linke Hauptkammer bis zur Herzspitze vorgeführt und leitete somit endokardiale Signale ab. Folglich konnten so die Depolarisation und Repolarisation sowie die regionalen Unterschiede der Monophasischen Aktionspotentiale abgeleitet und ausgewertet werden. Dafür wurden die Signale verstärkt und gefiltert (0,1-300 Hz) und mit Hilfe der Bard-Anlage mit einer Rate von 1kHz und einer 12 bit-Auflösung gespeichert. Die Stimulation (Universal Heart Stimulator UHS 20S, Biotronik Berlin) des Myokards erfolgte über den epikardialen Katheter, der sich mittig auf dem rechten Ventrikel befand (MAP2). Die Erfassung der monophasischen Aktionspotentiale wird bereits vielfach zur Erfassung von Veränderungen der Repolarisation am Herzen, sowohl in vitro [160,162,163], als auch in vivo in Tiermodellen [164] und beim Menschen [165] verwendet. Intraventrikuläre Druckmessung Um kontinuierlich den linksventrikulären Druck zu messen, wurde ein an einer Glaskanüle befestigter Latexballon vorsichtig über ein kleines Loch im linken Atrium in den linken Ventrikel gebracht und mit destilliertem Wasser gefüllt. Die Glaskanüle wurde mit Klebestreifen an der Langendorff- Apparatur befestigt, sodass das Herz dadurch zusätzlich im Wasserbad stabilisiert wurde. Der Latexballon befand sich in einem geschlossenen System mit einem integrierten Druckaufnehmer, welcher vor dem Versuch geeicht wurde. 29 3.3.2 Versuchsprotokoll der ventrikulären Versuchsreihen Abbildung 15: Schema zum zeitlichen Ablauf der Ventrikelversuche AV- Block und Stimulation Um das Herz in bestimmten Frequenzen stimulieren zu können, musste die Überleitung über den AV-Knoten geblockt werden und ein junktionaler Ersatzrhythmus eintreten. Dafür wurde ein weiteres kleines Loch in das rechte Atrium geschnitten, um mit einer chirurgischen Pinzette das Septum in der Gegend des AV-Knotens, der sich in der Ventilebene des Herzens befindet, zu komprimieren. Dies erfolgte unter EKG Kontrolle, bis die Zykluslänge konstant auch ohne Kompression mehr als 900ms betrug. Frequenztreppe Das Kaninchenherz wurde nun für jeweils eine Minute mit sieben verschiedenen Frequenzen und einer Impulslänge von 2ms stimuliert. Begonnen wurde mit 900ms, dann wurde die Frequenz in Schritten von 100ms reduziert, bis zu einer Zykluslänge von 300ms. Da das Kaninchenmyokard sich erst an die einzelnen Frequenzstufen anpassen musste, wurden lediglich die Signale der letzten 10s der aufgezeichneten Minute markiert und für die folgende Auswertung verwendet. Danach schlug das Herz wieder in seinem eigenen Ersatzrhythmus ohne Stimulation. Refraktärzeitbestimmung Die effektive Refraktärzeit wurde ebenfalls auf allen sieben Frequenzstufen bestimmt, indem nach jedem fünften Impuls (S1) in der vorgegebenen Zykluslänge ein weiterer 30 Impuls (S2) kurz danach erfolgte. Die Stimulation für diesen Impuls wurde in Schritten von 10ms immer näher an den vorangegangen gesetzt, bis das Kammermyokard dem Impuls nicht mehr mit einer Erregung folgte. Dann befand sich das Herz in der Refraktärzeit, welche für jede stimulierte Herzfrequenz notiert wurde. Wenn Kammerflimmern während der Refraktärzeitbestimmung auftrat, wurde nach der notwendigen Defibrillation die Stimulation für fünf Minuten pausiert, um dem Herz eine Erholungszeit zu gewähren. Hochfrequenz- Stimulation Nach der Bestimmung der Refraktärzeiten erfolgte für fünf Sekunden eine Stimulation mit 1000 Impulsen pro Minute. Danach wurde eine Minute zur Regeneration abgewartet und dieser Vorgang noch zweimal wiederholt. Diese Vorgehensweise erhöhte die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Flimmerepisoden. Trat Kammerflimmern nach einem "Burst“ auf, so wurde die Regenerationszeit nach der Defibrillation, auf fünf Minuten verlängert. Hypokaliämische Phase und Registrierung der Herzrhythmusstörungen Für fünf Minuten wurde die bisherige KHB- Lösung mit 5,8mM K+ über einen Dreiwegehahn durch die hypokaliämische KHB- Lösung mit 1,5mM K+ ersetzt. Dadurch kam es vermehrt zum Auftreten von frühen Nachdepolarisationen (EADs) und Herzrhythmusstörungen, wie beispielsweise Torsades de Pointes [166]. Diese wurden qualitativ und quantitativ erfasst. Dabei wurden Nachdepolarisationen, welche die Repolarisation der vorhergehenden Erregung durchbrechen, als EADs verzeichnet [167] und polymorphe Kammertachykardien mit mehr als fünf Schlägen, die um die Nullinie rotieren und selbstlimitierend sind, als Torsades de Pointes [168,169]. Darüber hinaus wurden Episoden mit Kammerflimmern verzeichnet. Wenn dieses nicht selbstterminierend war, wurde es mit Hilfe eines Defibrillators (Cardial Pacemaker Inc. VENTAK ECD Cpi Model 2815; St. Paul, USA) gestoppt. Danach wurde dem Herz wieder eine fünfminütige Regenerationszeit gewährt. Nach der Phase mit der kaliumarmen KHB-Lösung wurde der Dreiwegehahn wieder umgelegt und für fünf Minuten wieder normale Nährlösung eingeleitet, ohne dass eine weitere Stimulation des Herzens erfolgte. 31 Dosis- Wirkungsversuche mit Antazolin Nachdem das Versuchsprotokoll zunächst unter Ausgangsbedingungen erfolgte, wurde nun dieses mit steigenden Wirkstoffkonzentrationen von Antazolin wiederholt. Dafür musste zunächst je eine Lösung mit 10μM, 20μM und 30µM Antazolin hydrochloride (Antazoline hydrochloride SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt werden. Das Antazolin wurde zunächst aufgrund der schlechten Löslichkeit in Dimethylsulfoxid gelöst und dann mit deionisiertem Wasser weiter verdünnt, bis die gewünschten Konzentrationen erreicht wurden. Über einen seitlichen Zugang wurde schließlich das Antazolin in das Perfusat geleitet und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten das Versuchsprotokoll erneut durchgeführt. Diese Vorgehensweise wiederholte sich für alle Konzentrationsstufen. Ziel dieser ersten Vorversuche war es, eine geeignete Antazolinkonzentration für die weiteren Kombinationsversuche zu finden. Insbesondere sollte die gewählte Konzentrationsstufe zu deutlichen Veränderungen der Aktionspotentiallänge, Refraktärzeiten und QT-Länge führen, bei einer stabilen weiteren Herzkontraktion über den gesamten Versuchsablauf. Provokationsversuche zur Simulation des LQT2 Es wurde jeweils eine Versuchsreihe mit Sotalol und eine mit Erythromycin durchgeführt um das LQT2, durch eine Blockade von IKr, zu simulieren und eine antiarrhythmische Wirkung für Antazolin nachzuweisen. Dabei wird durch eine Verlängerung der Repolarisation und einer Verringerung der Repolarisationsreserve ein häufigeres Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs provoziert. Dafür wurde eine 100 micromolare Sotalollösung (Sotalolhydrochlorid Carinopharm GmbH, Elze) beziehungsweise eine 300 micromolare Erythromycinlösung (Erythromycinlactobionat Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg) hergestellt. Nach der Durchführung des Versuchsprotokolles unter Ausgangsbedingungen wurde entweder die Sotalollösung oder die Erythromycinlösung über einen seitlichen Zugang dem Perfusat zugegeben. Die Einlaufzeit betrug 15 Minuten, danach wurde das Versuchsprotokoll erneut wiederholt. Durch die fünfminütige hypokaliämische Phase wurde die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Arrhythmien wie Torsades de Pointes oder EADs noch weiter gesteigert [170]. Schließlich wurde eine 20 micromolare Antazolinlösung zusätzlich zu Sotalol beziehungsweise Erythromycin infundiert. Die Einlaufzeit betrug auch hier erneut 15 Minuten und das Versuchsprotokoll wurde ein drittes Mal durchgeführt. 32 Provokationsversuche zur Simulation des LQT3 Es wurde eine 0,5 micromolare Veratridinlösung (SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) hergestellt, indem das Veratridin zunächst in Dimethylsulfoxid gelöst und schließlich mit deionisiertem Wasser auf die passende Konzentration weiter verdünnt wurde. Der Versuchsablauf bestand auch bei diesen Versuchen aus drei Teilen. Zunächst wurde das Versuchsprotokoll unter Ausgangsbedingungen durchgeführt. Danach erfolgte eine 15-minütige Einlaufzeit der Veratridinlösung, um durch eine Blockierung der Hemmung des Ionenstromes INa, das LQT3 zu simulieren [81] und Arrhythmien zu provozieren. Schließlich wurde zusätzlich zur Veratridinlösung eine 20 micromolare Antazolinlösung infundiert und nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten auch hier das Versuchsprotokoll durchgeführt. So konnte die Wirkung von Antazolin im Zusammenhang mit dem LQT3 festgestellt werden. 3.4. Auswertung Bestimmung der Repolarisationszeiten Aus den letzten 10 Sekunden der Aufnahmezeiten wurden jeweils für eine Frequenzstufe 16 MAP Signale ausgeschnitten und in das Programm Rabbit Pulse V7,2 (Patrick Schwienteck, Universtität Bielefeld) übertragen. Das Programm erkennt in der Regel die einzelnen MAP Signale, diese Erkennung von Anfang und Ende der Aktionspotentiale wurde überprüft und gegebenenfalls korrigiert. Wenn die Signale die nötigen Anforderungen erfüllten, indem sich die Amplitude und die Aktionspotentialdauer nicht mehr als 20% unterschieden und die Nullinie stabil war, wurde vom Programm die APD90 und die APD50 bestimmt. Dabei handelt es sich, wie in Abbildung 16 dargestellt, um die Zeit, die von der maximalen Depolarisation bis zur 50-prozentigen bzw. 90-prozentigen Repolarisation vergeht. Die Werte wurden in Exceltabellen konvertiert und die Mittelwerte bestimmt. Außerdem wurden ebenfalls die Zeiten für die maximalen und minimalen MAPs und die dazugehörigen Standardabweichungen bestimmt, um ein Maß für die Dispersion der Repolarisation zu haben. 33 Abbildung 16: Schematische Darstellung der Messung von APD50 und APD90 Messung der QT- Zeiten Die Messung der QT- Zeiten erfolgte manuell an der Anlage. Die Werte wurden dann in Exceltabellen übertragen und die Mittelwerte bestimmt. 3.5. Statistik Die gewonnen Daten wurden zunächst in einem Datenprogramm (Microsoft Excel) zusammengefasst und mit dem statistischen Auswertungsprogramm SSPS 22.0 für Windows ausgewertet. Es wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung durchgeführt. Die Testung auf Signifikanz der nicht- parametrischen Variablen wie die Aktionspotentialdauer, die Dispersion der Repolarisation und die QT-Dauer wurden mittels des Wilcoxon-Testes durchgeführt. Das Auftreten von frühen Nachdepolarisationen und Torsade de Pointes wurden mit dem Fisher-Test und dem Chi-QuadratTest analysiert und mit deskriptiven Statistiken übersichtlich dargestellt. Ein Wert von p< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. 34 3.6. Vorhofversuche Die Grundlagen zu den Versuchstieren, zur Präparation und der LangendorffApparatur unterscheiden sich kaum von den Ventrikelversuchen (siehe Kapitel 3.13.3), sodass im Folgenden nur auf die Unterschiede eingegangen wird. 3.6.1. Versuchsaufbau Während für die Ventrikelversuche insgesamt sieben epikardiale und ein endokardialer Ableitungskatheter verwendet wurden, befand sich während der Vorhofversuche lediglich jeweils ein bipolarer Kontaktelektroden-Katheter epikardial mittig auf der rechten und linken Ventrikelseite, um die Ventrikelerregung kontinuierlich überprüfen zu können. Darüber hinaus befand sich jedoch eine Ableitungsklemme mit zwei Ableitungselektroden auf dem rechten und eine auf dem linken Vorhof. Damit konnten vier atriale MAP-Ableitungen aufgezeichnet werden. Ein weiterer flexibler Katheter, der sich während der Ventrikelversuche endokardial befand, wurde lediglich auf den linken Vorhof aufgesetzt und als Stimulationskatheter verwendet. Es erfolgten wie bei den Ventrikelversuchen lediglich feine Justierungen der Elektroden zur Signaloptimierung und nur größere Neupositionierungen bei auftretender Myokardschädigung. 35 Abbildung 17: Katheterplatzierung Vorhofversuche Abbildung 18: Kaninchenherz an der Langendorff-Anlage nach der Katheterplatzierung 36 3.6.2. Versuchsablauf Abbildung 19: Schema zum zeitlichen Ablauf der Vorhofversuche Stimulation und Stimulationsschwelle Das Herz schlägt während der Versuche im eigenen Sinusrhythmus weiter. Die Stimulation wurde über das Win LTP Computerprogramm (Win LTP Ver.1.01, Win LTP Ltd University of Bristol, England) gesteuert. Die 2ms langen Impulse wurden über einen Stimulator, der mit Amplituden von 0-50mA stimulieren kann, generiert und an die Stimulationselektrode, auf dem linken Vorhof, weitergeleitet. Die Signale wurden verstärkt und gefiltert (0,1-300 Hz) und mit der Aufzeichnungsanlage (Bard Electrophysiology Lab System) aufgezeichnet und mit einer Rate von 1kHz und 12 bit gespeichert. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Stimulationsschwelle bei einer Frequenz von 250ms. Dabei wurde die Energie des Stimulators immer weiter erhöht, bis die Vorhöfe dem Stimulationsimpuls folgten. Diese Schwelle wurde notiert und verdoppelt. Mit dieser Amplitude wurde für den weiteren Versuch fortgefahren. Frequenztreppe Ähnlich wie bei den Ventrikelversuchen wurde zu Beginn der Versuche die Stimulation mit verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Es wurde absteigend mit 350ms-, 250ms- und 150ms- Zykluslänge stimuliert. Die Aufzeichnung erfolgte jeweils über 30 Sekunden. Die letzten 16 Schläge einer Frequenz wurden markiert, ausgeschnitten und später ausgewertet. 37 Effektive Refraktärzeit (aERP) Die Refraktärzeit wurde bestimmt, indem nach acht Schlägen (S1-S1) in der vorgegebenen Frequenz von 250ms ein zusätzlicher Impuls (S2) generiert wurde. Dieser wurde in 10ms- Schritten dichter an den vorhergehenden Impuls herangesetzt, bis diesem keine Vorhoferregung mehr folgte. Dieser Zeitrahmen wurde dann als effektive Refraktärzeit bezeichnet und manuell notiert. High-Rate Stimulation Um Vorhofflimmern zu provozieren wurde eine Burst-Stimulation durchgeführt. Diese erfolgte nach acht Schlägen mit einer Zykluslänge von 250ms, über eine Länge von 850ms mit 50Hz. Zwischen dem letzten stimulierten Schlag und dem Burst lagen zu Beginn 250ms. Dieser Abstand wurde jedoch in Schritten von 10ms bis zu 150ms reduziert. Zunächst wurde diese Frequenztreppe mit der vierfachen Energie der Stimulationsschwelle durchgeführt, schließlich noch einmal mit der achtfachen und der zwölffachen Energiehöhe. Das Auftreten von Vorhofflimmern wurde erfasst und quantitativ in zwei Gruppen unterteilt, einmal in fortdauerndes Vorhofflimmern (≥1 s) und in kurzes Vorhofflimmern (≤1 s). Abbildung 20: Burststimulation ohne Induktion von Vorhofflimmern 38 Abbildung 21: Burststimulation mit konsekutiver Induktion von Vorhofflimmern Infusion von Acetylcholin und Isoproterenol Nachdem das Versuchsprotokoll unter Ausgangsbedingungen durchgeführt wurde, erfolgte ein Anfluten über 15 Minuten mit Acetylcholin (Acetylcholinechloride, SIGMAAldrich Chemie GmbH, Steinheim) und Isoproterenol (Isoproterenol- Hydrochloride, SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim). Dafür wurde eine Kombinationslösung hergestellt, in welcher beide Wirkstoffe in einer Konzentration von 1μM vorlagen und über einen seitlichen Zugang dem Perfusat zugeführt wurden. Nach der vergangenen Einlaufzeit wurde das Versuchsprotokoll erneut durchgeführt. Durch diese Wirkstoffe alleine und diese Wirkstoffkombination kann das Auftreten von Vorhofflimmern gesteigert werden [172,172], wodurch die antiarrhythmischen Eigenschaften von weiteren Substanzen besser dargestellt werden können. Infusion von Antazolin, Ivabradin, Vernakalant und Flecainid Im dritten Teil des Versuchsablaufes wurde dem Perfusat ein weiterer Wirkstoff hinzugefügt, dessen antiarrhythmische Eigenschaften und Wirkungsweise getestet werden sollte. Nach einer Einlaufzeit von 15 Minuten wurde das Versuchsprotokoll ein drittes Mal durchgeführt. Es erfolgte zunächst eine Versuchsreihe mit der 20 39 micromolaren Antazolinlösung, die auch für die bisherigen Versuche genutzt worden war. Um die Ergebnisse der Antazolinreihe mit anderen Wirkstoffen, die antiarrhythmische Eigenschaften bezüglich Vorhofflimmern besitzen, vergleichen zu können und eventuelle Rückschlüsse auf die Wirkung von Antazolin auf Ionenkanäle zu gewinnen, wurden weitere Versuchsreihen durchgeführt. Die erste Versuchsreihe wurde mit Ivabradin (Ivabradine hydrochloride SIGMA- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim), einem selektiven If -Kanal-Inhibitor, der zunächst unter dem Namen S16257 beschrieben wurde [173], durchgeführt. Dieser wurde in einer Konzentration von 3μM eingesetzt. Eine dritte Versuchsreihe wurde mit 10μM Vernakalant (Brinavess® 20mg/ml Vernakalanthydrochloride, Cardiome UK Limited, Sherborne House, London) durchgeführt, einem Inhibitor von IKur, INa und IKr [133], der erfolgreich Vorhofflimmern unterdrückt. Und schließlich wurde die antiarrhythmische Wirkungsweise von Flecainid (Tambocor® 10mg/ml Flecainidacetat, MEDA Pharma GmbH+Co KG, Bad Homburg), einem Klasse ǀ Antiarrhythmikum welches INa hemmt, in einer Konzentration von 2μM untersucht. 3.6.3. Auswertung Bestimmung der Repolarisationszeiten der atrialen APD90 Aus den letzten 10 Sekunden der Aufnahmezeiten wurden jeweils für eine Frequenzstufe 16 MAP Signale ausgeschnitten und in das Programm Rabbit Pulse V7.2 (Patrick Schwienteck, Universtität Bielefeld) übertragen. Es erfolgte eine manuelle Optimierung der Signalerkennung durch das Programm. Die Auswertungen der Signale und die Bestimmung der aAPD90 und deren Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardabweichungen erfolgten wie bei den Ventrikelversuchen mit dem Rabbit Pulse Programm V7.2 und der Konvertierung der Zahlenwerte in Exceltabellen. Registrierung von Vorhofflimmern Die quantitative Erfassung der Flimmerepisoden erfolgte manuell und wurde in Exceltabellen überführt. Ereignisse wurden in anhaltendes Vorhofflimmern (≥1 s), und nicht anhaltendes Vorhofflimmern (≤1 s) unterteilt. Dabei musste eine Flimmerepisode mindestens 500ms andauern um registriert zu werden. Berechnung der atrialen Post-Repolarisations-Refraktärität Die Post-Repolarisations-Refraktärität (aPRR) wurde aus der Differenz zwischen effektiver Refraktärzeit und aAPD90 berrechnet. Grundlage dafür waren frühere Studien in denen die aPRR am ventrikulären Myokard berrechnet wurde [174]. 40 Ermittlung der Leitungszeit Als Maß für die Leitungsgeschwindigkeit wurden die Leitungszeiten zwischen den Vorhöfen gemessen, dafür wurden die MAPs im Rabbit Pulse Programm 7,2 verwendet. Die Zeitintervalle vom Stimulussignal bis zum jeweiligen MAP der entsprechenden Elektroden der beiden Vorhöfe wurden voneinander subtrahiert und gemittelt, dadurch ergab sich der Laufzeitunterschied zwischen den beiden Vorhöfen. 3.6.4. Statistik Die gewonnenen Daten wurden wie bei den Ventrikelversuchen zunächst in einem Datenprogramm (Microsoft Excel) zusammengefasst und mit dem statistischen Auswertungsprogramm SSPS 22.0 für Windows ausgewertet. Es wurde auch hier zunächst der Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung durchgeführt. Die Testung auf Signifikanz der nicht- parametrischen Variablen wie die atriale Aktionspotentialdauer, die atriale effektive Refraktärzeit, die Post-RepolarisationsRefraktärität, und die atriale Überleitungszeit wurden mittels des Wilcoxon-Testes durchgeführt. Das Auftreten von Vorhofflimmern wurde mit dem Fisher- Test und dem Chi-Quadrat-Test analysiert und mit deskriptiven Statistiken übersichtlich dargestellt. Ein Wert von p< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. 41 4. Ergebnisse 4.1. Untersuchungen zu ventrikulären Arrhythmien 4.1.1 Einfluss von Antazolin auf die Aktionspotentialdauer, das QT-Intervall, die Refraktärzeit und die Dispersion der Repolarisation Es wurden insgesamt neun Versuche durchgeführt, in denen lediglich Antazolin in steigender Konzentration (10μM, 20μM, 30μM) eingesetzt wurde. Damit sollten die elektrophysiologischen Eigenschaften von Antazolin und die nötige Konzentration für die weiteren geplanten Versuchsreihen festgestellt werden. Antazolin führte statistisch signifikant (p< 0,005), mit steigender Konzentration, zu einer Verlängerung der Aktionspotentialdauer bis zur 90-prozentigen Repolarisation (APD90). Unter Ausgangsbedingungen betrug die mittlere APD90 130 ± 20ms, unter 10μM Antazolin 150± 24ms und unter 20μM schließlich 157± 17ms. Bei einer Konzentration von 30μM kam es zu keiner weiteren Verlängerung der Aktionspotentialdauer bis zur 90-prozentigen Repolarisation, sodass die APD90 weiterhin 156±24ms betrug. (Abb.22 oben) Die QT-Dauer verlängerte sich ebenfalls statistisch signifikant (p< 0,001) mit steigender Konzentration. Unter Ausgangsbedingungen betrug die QT-Zeit 233± 23ms, diese stieg unter 20μM Antazolin auf 286± 20ms an. Hier kam es auch noch unter 30μM Antazolin zu einer signifikanten Steigerung auf 327±33ms. (Abb.22 unten) Hinsichtlich der Refraktärzeiten und der interventrikulären Dispersion sowie der Dispersion zwischen der endokardialen und epikardialen linksventrikulären Ableitung kam es zu keiner signifikanten Veränderung mit steigenden Antazolinwirkstoffspiegeln im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen. 42 200 Ausgangsbedingungen 10µM Antazolin 180 20µM Antazolin 30µM Antazolin APD90 (ms) 160 140 120 100 80 300 400 500 600 700 800 900 Zykluslänge (ms) 400 Ausgangsbedingungen 10µM Antazolin 20µM Antazolin QT- Intervall (ms) 350 30µM Antazolin 300 250 200 150 300 400 500 600 700 800 900 Zykluslänge (ms) Abbildung 22: Dosisabhängiger Effekt von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) 43 4.1.2. Die antiarrhythmische Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT2-Syndroms APD90 und QT-Intervall Zur Simulation des LQT2-Syndroms, wurden je 18 Versuche mit dem Klasse װιAntiarrhythmikum Sotalol und 18 Versuche mit dem Makrolidantibiotikum Erythromycin durchgeführt. Wie erwartet kam es unter der Infusion der Sotalollösung zu einer statistisch signifikanten (p< 0,001) APD90-Verlängerung und QT-Zeit-Verlängerung (Abb.23). Diese Verlängerung der APD90 verteilte sich jedoch nicht gleichmäßig auf alle Stimulationsfrequenzen, sondern stieg mit zunehmender Zykluslänge an. So betrug der Anstieg bei einer Stimulationsfrequenz von 300ms lediglich 8% und bei einer Zykluslänge von 900ms 12%. Dieser Effekt, der häufig durch IKr-Blocker bewirkt wird [175], bezeichnet man als „reverse-use-dependence“. Im Zusammenhang mit der Verlängerung des QT- Intervalls wirkt diese proarrhythmisch, sodass die Entstehung von TdP gefördert wird. Die „reverse-use-dependence“ konnte auch unter Erythromycin festgestellt werden. So kam es auch hier zu einer signifikanten Verlängerung (p< 0,001) der QT-Zeit sowie der APD90 (Abb.24), wobei der Anstieg bei einer Zykluslänge von 300ms 10% und bei einer Stimulationsfrequenz von 900ms 15% betrug. Im weiteren Verlauf der Versuche kam es unter dem zusätzlichen Einleiten des Antihistaminikums Antazolin in einer Konzentration von 20µM in den Kombinationsversuchen mit Sotalol zu einer weiteren signifikanten APD 90Verlängerung (p< 0,05) und einer hochsignifikanten QT-Intervall Verlängerung (p< 0,001). (Abb.23) In den Erythromycinversuchen hingegen führte die zusätzliche Infusion von Antazolin lediglich zu einer signifikanten QT-Zeit-Verlängerung (p< 0,001), jedoch nicht zu einer signifikanten APD90-Verlängerung im Vergleich zur reinen Erythromycinwirkung. (Abb.24) 44 300 Ausgangsbedingungen 280 100µM Sotalol 260 plus 20µM Antazolin 240 APD90 (ms) 220 200 180 160 140 120 100 80 300 400 500 600 700 800 900 Zykluslänge (ms) 500 Ausgangsbedingungen 100µM Sotalol 450 plus 20µM Antazolin QT- Intervall (ms) 400 350 300 250 200 150 300 400 500 600 700 Zykluslänge (ms) 800 900 Abbildung 23: Zykluslängenabhängiger Effekt von alleiniger Sotalolgabe sowie zusätzlicher Zugabe von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) 45 Ausgangsbedingungen 220 300µM Erythromycin 200 APD90 (ms) plus 20µM Antazolin 180 160 140 120 100 300 400 500 600 700 800 900 Zykluslänge (ms) 400 Ausgangsbedingungen 300µM Erythromycin QT- Intervall (ms) 350 plus 20µM Antazolin 300 250 200 150 300 400 500 600 700 Zykluslänge (ms) 800 900 Abbildung 24: Zyklusabhängiger Effekt von alleiniger Erythromycingabe sowie zusätzlicher Infusion von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) 46 Tabelle 2: Einfluss von Antazolin auf die APD90 und das QT-Intervall nach der Behandlung mit Sotalol oder Erythromycin (*p<0,005 gegenüber Ausgangsbedingungen;**p<0,05 gegenüber Sotalol bzw Erythromycin) Sotalolversuche QT- Intervall in ms APD90 in ms Baseline 266±62 152±39 Sotalol 100μM 297±78* 172±55* +20μM Antazolin 331±91** 184±55** Baseline 251±37 143±25 Erythromycin 300μM 272±59* 162±40* +20μM Antazolin 312±53** 170±32 Erythromycinversuche 47 Refraktärzeit und Dispersion Die Refraktärzeit verlängerte sich hochsignifikant (p< 0,001) unter der Wirkung von Sotalol und Erythromycin im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen. Auch die gesamte Dispersion, die sich aus der interventrikulären Dispersion und der Dispersion zwischen links-endokardial und links-epikardial zusammensetzt, nahm bei beiden Substanzen signifikant zu (p< 0,05). (Abb. 25 und 26) Nach der zusätzlichen Infusion von Antazolin kam es zwar zu einer signifikanten, weiteren Verlängerung der Refraktärzeit in Bezug auf Sotalol beziehungsweise Erythromycin, jedoch zu einer signifikanten (p<0,05) Verringerung der Dispersion. Im Falle von Sotalol sank diese unter Antazolineinfluss von 75±6ms auf 53±5ms (Abb.25), im Falle von Erythromycin von 80±4ms auf 54±2ms (Abb.26). 48 350 Effektive Refraktärzeiten (ms) 300 p<0,001 250 p<0,001 200 150 100 50 0 Ausgangsbedingungen 100µM Sotalol plus 20µM Antazolin 90 Räumliche Dispersion (ms) 80 70 p<0,05 p<0,05 60 50 40 30 20 10 0 Ausgangsbedingungen 100µM Sotalol plus 20µM Antazolin Abbildung 25: Sotalolversuche: Effektive Refraktärzeiten (oben) und räumliche Dispersion der Repolarisation (unten) 49 400 Effektive Refraktärzeit (ms) 350 300 p<0,001 250 p<0,001 200 150 100 50 0 Ausgangsbedingungen 300µM Erythromycin plus 20µM Antazolin 100 90 Räumliche Dispersion (ms) 80 70 p<0,05 p<0,05 60 50 40 30 20 10 0 Ausgangsbedingungen 300µM Erythromycin plus 20µM Antazolin Abbildung 26: Erythromycinversuche: Effektive Refraktärzeiten (oben) und die räumliche Dispersion (unten) 50 Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes Während der Provokationsversuche mit Sotalol bzw. Erythromycin kam es insbesondere in der hypokaliämischen Phase, in der der Kaliumgehalt von 5,88mM/L auf 1,5mM/L reduziert wurde, zum Auftreten von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes. Unter Sotalolwirkung kam es bei 10 von 18 Herzen zum Auftreten von EADs und in 6 von 18 Herzen zu Torsades de Pointes (Abb. 27 und Abb.28). Erythromycin führte bei 11 von 18 Organen zu frühen Nachdepolarisationen und bei 8 von 18 zu Arrhythmien vom Torsades de Pointes Typ (Abb.29 und Abb. 30). Die 20 micromolare Antazolinlösung zeigte einen starken antiarrhythmischen Effekt. So unterdrückte es die frühen Nachdepolarisationen (p< 0,001) und Torsaden (p<0,05) in allen Herzen, bei denen unter Sotaloleinwirkung diese Ereignisse eintraten (Abb.28). In den Versuchen mit Erythromycin konnten in 10 von 11 Herzen mit frühen Nachdepolarisationen diese durch Antazolin verhindert werden (p<0,001), das Auftreten von Torsaden wurde komplett unterdrückt (p<0,005) (Abb.29). Abbildung 27: EADs und Torsade de Pointes während der hypokaliämischen Phase unter Sotaloleinfluss 51 Inzidenzen von EAD und TdP in % 60 55,6 50 40 p<0,005 33,3 30 20 10 0 0 0 0 0 Ausgangsbedingungen 100µM Sotalol EAD plus 20µM Antazolin TdP Abbildung 28: Inzidenzen früher Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes während der Versuche mit Sotalol und Antazolin 70 Inzidenzen von EAD und TdP in % 61,1 60 50 44,4 p<0,05 40 30 20 10 5,6 0 0 0 0 Ausgangsbedingungen 100µM Erythromycin EAD plus 20µM Antazolin TDP Abbildung 29: Inzidenzen früher Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes in den Versuchen mit Erythromycin und Antazolin 52 Abbildung 30: EADs und TdPs während der hypokaliämischen Phase unter Erythromycineinfluss 53 4.1.3 Die Wirkung von Antazolin an einem Modell des LQT3Syndromes APD90 und QT-Intervall Es wurde das Versuchsprotokoll mit dem Alkaloid Veratridin an insgesamt 17 Kaninchenherzen zur Simulation des LQT3-Syndromes durchgeführt. Dabei kam es wie erwartet zu einer hochsignifikanten (p< 0,001) Verlängerung der APD90 von 155± 38ms auf 180±48ms und der QT- Zeit von 269±57ms auf 328±74ms (Tabelle 3 und Abb. 31). Auch hier konnte, obwohl es sich nicht um einen IKr- Blocker handelt, eine ausgeprägte „reverse-use-dependence“ nachgewiesen werden, also eine Steigerung der APD90 mit steigender Zykluslänge. Während bei einer Zykluslänge von 300ms noch keine Verlängerung der Repolarisation im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen festgestellt werden konnte, war bei einer Stimulationsfrequenz von 900ms eine ausgeprägte Erhöhung der APD90 von 175±50ms auf 231±49ms festzustellen. (Abb.31) Antazolin führte auch in diesen Simulationsversuchen in Kombination mit Veratridin zu einer weiteren Verlängerung der Zeit bis zur 90-prozentigen Repolarisation von 180±48ms auf 234±54ms (p< 0,001) und des QT-Intervalles von 328±74ms auf 404±65ms (p<0,001) im Vergleich zur reinen Veratridinwirkung. (Tabelle 3 und Abb.31) Tabelle 3: Einfluss von Antazolin auf die APD90 und das QT- Intervall unter der Behandlung mit Veratridin (*p<0,005 gegenüber Ausgangsbedingungen;**p<0,005 gegenüber Veratridin) APD90 (ms) QT- Zeit (ms) Ausgangsbedingungen 155±38 269±57 0,5 µM Veratridin 180±48* 328±74* plus 20µM Antazolin 234±54** 404±65** 54 360 Ausgangsbedingungen 0,5µM Veratridin 320 plus 20µM Antazolin APD90 (ms) 280 240 200 160 120 80 300 400 500 600 700 800 900 QT- Intervall (ms) Zykluslänge (ms) 550 Ausgangsbedingungen 500 0,5µM Veratridin 450 plus 20µM Antazolin 400 350 300 250 200 150 300 400 500 600 700 Zykluslänge (ms) 800 900 Abbildung 31: Zyklusabhängiger Effekt unter alleiniger Veratridingabe und unter zusätzlicher Antazolinwirkung auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) 55 Refraktärzeit und Dispersion Veratridin führte zu einer Verlängerung der Refraktärzeit (p<0,001) von 187±47ms auf 242± 77ms. Durch die zusätzliche Infusion von 20µM Antazolin kam es zu einer weiteren signifikanten (p<0,001) Verlängerung der Refraktärzeit auf 326± 79ms. (Abb.32) Die totale Dispersion unter der alleinigen Veratridinwirkung wurde signifikant von 45±3ms auf 82±10ms (p<0,05) verlängert, wodurch das Auftreten von Arrhythmien gefördert wurde. Antazolin hingegen führte jedoch zu einer Absenkung der gesamten Dispersion auf 59±13ms (p<0,05). (Abb.33) 450 Effektive Refraktärzeiten (ms) 400 350 p<0,001 300 250 p<0,001 200 150 100 50 0 Ausgangsbedingungen 0,5µM Veratridin plus 20µM Antazolin Abbildung 32: Effektive Refraktärzeit nach Gabe von Veratridin und Antazolin 56 100 90 Räumliche Dispersion (ms) 80 p<0,05 p<0,05 70 60 50 40 30 20 10 0 Ausgangsbedingungen 0,5µM Veratridine plus 20µM Antazolin Abbildung 33: Veratridinversuche: Mittelwerte der Dispersion Frühe Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes Während der Infusion mit 0,5µM Veratridin kam es wie bei Sotalol und Erythromycin bei erniedrigtem Kaliumgehalt des Krebs-Henseleit-Puffers (K+1,5mM/L) zum Auftreten von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes. Dabei konnten bei 13 von 17 Herzen EADs und bei 10 von17 Herzen Torsades de Pointes ausgelöst werden. (Abb.34 und Abb.35) Antazolin führte zu einer deutlichen Reduktion dieser Ereignisse (p<0,05). So kam es während der Zugabe der 20 micromolaren Antazolinlösung zum Perfusat nur noch in 4 von 13 Herzen, in denen Veratridin zu frühen Nachdepolarisationen geführt hatte, zu diesen Arrhythmien. Die Torsades de Pointes wurden in 7 von 10 Kaninchenherzen unterdrückt. (Abb.34) 57 90 Inzidenzen von EAD und TdP in % 80 76,5 70 58,8 60 p<0,05 50 40 30 23,5 17,6 20 10 0 0 0 Ausgangsbedingungen 0,5µM Veratridin EAD plus 20µM Antazolin TdP Abbildung 34: Inzidenzen von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes Abbildung 35: Repräsentatives Beispiel für Torsades de Pointes unter Veratridineinfluss. Monophasische Aktionspotentiale (links) und EKG (rechts) 58 4.2. Untersuchungen zu Vorhofflimmern- Provokationsversuche mit Acetylcholin und Isoproterenol 4.2.1 Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin Diese Versuchsreihe, in der 20µM Antazolin in Kombination mit der Acetylcholin/ Isoproterenol- Mischlösung eingesetzt wurde, umfasste 20 Kaninchenherzen. Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Durch die Infusion von Acetylcholin in Kombination mit Isoproterenol kam es wie erwartet zu einer signifikanten Verkürzung (p<0,001) der atrialen Aktionspotentialdauer bis zur 90-prozentigen Repolarisation (aAPD90) von 79±15ms unter Ausgangsbedingungen auf 54±10ms (Abb.36 oben), zu einer Verkürzung der atrialen effektiven Refraktärzeit von 117±27ms auf 65±23ms (p<0,001) (Abb.36 unten) und zu einer Verminderung der atrialen Post- Repolarisations-Refraktärität (aPRR) von 32±26ms auf 7±20ms (p<0,01) (Abb.37). Die Überleitungszeit wurde durch die AcetylcholinIsoproterenol-Kombination nicht beeinflusst. Diese Veränderungen wurden durch die weitere Zugabe der 20micromolaren Antazolinlösung zum Perfusat im weiteren Versuchsablauf wieder aufgehoben. Zum Teil ging dies über die basalen Ausgangswerte hinaus. So stieg die aAPD90 wieder von 54±10ms auf 99±17ms hochsignifikant (p<0,001) an (Abb.36 oben), die aERP verlängerte sich von 65±23ms auf 139±32ms (p<0,01) (Abb.36 unten) und die aPRR erhöhte sich von 7±20 auf 38±42 (p<0,05) (Abb.37). Die zusätzliche Applikation von Antazolin führte außerdem zu einer signifikanten Verlängerung (p<0,005) der interatrialen Überleitungszeit von 6±4ms unter reinem Acetylcholin/ Isoproterenol-Einfluss auf 12±9ms. 59 140 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol 120 aAPD90 (ms) plus 20µM Antazolin 100 80 60 40 150 250 350 Zykluslänge (ms) 180 160 140 p<0,01 aERP (ms) 120 p<0,001 100 80 60 40 20 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 20µM Antazolin Abbildung 36: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolin auf die aAPD90 (oben) und die aERP (unten) 60 90 80 70 p<0,001 p<0,05 aPRR (ms) 60 50 40 30 20 10 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 20µM Antazolin Abbildung 37: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolin auf die aPRR Auftreten von Vorhofflimmern Durch die ausschließliche Infusion von Acetylcholin und Isoproterenol konnte die Häufigkeit von durch Burststimulation provozierten atrialen Episoden von Vorhofflimmern, die länger als eine Sekunde andauerten, gesteigert werden. Während lediglich 5 von 20 Herzen unter Ausgangsbedingungen diese Ereignisse zeigten, so flimmerten 14 von 20 Organen nach Gabe der Acetylcholin-Isoprotenerol-Mischlösung (p<0,01). (Abb.38 und Abb.39) Die zusätzliche Gabe von Antazolin führte zu einer kompletten Unterdrückung des Vorhofflimmerns (p< 0,001) bei allen Kaninchenherzen. (Abb.38 und Abb.39) 61 160 145 Gesamtanzahl AF > 1000ms 140 120 100 80 p<0,001 p<0,001 60 40 20 7 0 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 20µM Antazolin Abbildung 38: Gesamtanzahl der Episoden anhaltenden Vorhofflimmerns unter Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolineinwirkung Abbildung 39: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, AcetylcholinIsoproterenol- Wirkung und zusätzlicher Antazolingabe (AF= Vorhofflimmern) 62 4.2.2 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Ivabradin Es wurden für diese Versuchsreihe 12 Versuche mit Ivabradin in einer Konzentration von 3µM in Kombination mit der Acetylcholin/Isproterenol-Mischung durchgeführt. Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Wie in der Versuchsreihe mit Antazolin konnte die Acetylcholin-Isoproterenol Mischlösung die aAPD90, von 95±15ms, unter Ausgangsbedingungen, auf 58±6ms (p<0,001) senken und darüber hinaus die Refraktärzeit von 108±23ms auf 69±17ms signifikant (p<0,01) reduzieren. (Abb.40) Eine signifikante Verkürzung der atrialen Post-Repolarisations-Refraktärität (aPRR) oder der interatrialen Überleitungszeit konnte in diesen Versuchen durch die Kombination aus Acetylcholin und Isoproterenol nicht nachgewiesen werden. Die zusätzliche Applikation von Ivabradin führte wie Antazolin zu einer signifikanten Verlängerung der Zeit bis zur 90-prozentigen Repolarisation auf 65±9ms (p<0,005) und zu einer Verlängerung der Refraktärzeit auf 94±22ms (p<0,01) im Vergleich zur reinen Acetylcholin/Isoproterenol-Wirkung. (Abb.40) Die aPRR wurde durch Ivabradin im Vergleich zur Ausgangssituation signifikant verlängert (p<0,05), in Bezug auf die alleinige Applikation von Acetylcholin und Isoprotenerol konnte das Signifikanzniveau jedoch knapp nicht erreicht werden (p=0,05). (Abb.41) Die Überleitungszeit wurde durch Ivabradin nicht nachweislich verändert. 63 120 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol 100 aAPD90 (ms) plus 3µM Ivabradin 80 60 40 150 250 350 Zykluslänge (ms) 140 120 aERP (ms) 100 p<0,01 p<0,01 80 60 40 20 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 3µM Ivabradin Abbildung 40: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradin auf die aAPD 90 (oben) und die aERP (unten) 64 60 50 p<0,05 aPRR (ms) 40 30 20 10 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 3µM Ivabradin Abbildung 41: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradin auf die aPRR Auftreten von Vorhofflimmern Die Zugabe von Acetylcholin in Kombination mit Isoproterenol zum Perfusat führte zu einer signifikanten Steigerung der Gesamtanzahl von auftretenden Flimmerepisoden im Vergleich zur Ausgangssituation (p<0,01). (Abb.42 und Abb.44) Die zusätzliche Infusion von Ivabradin führte in dieser Versuchsreihe zu einer Reduktion des induzierten Vorhofflimmerns (Abb.42 und Abb.43). Das Signifikanzniveau wurde jedoch hinsichtlich der Gesamtanzahl des auftretenden Vorhofflimmerns, welche sowohl Ereignisse, die länger als eine Sekunde andauerten, als auch Ereignisse, die geringer als eine Sekunde andauerten, zusammenfasst, mit p=0,057 nur knapp überschritten. Damit wird deutlich, dass Antazolin in diesem Versuchsaufbau effektiver Vorhofflimmern unterdrücken kann als Ivabradin. 65 120 111 Gesamtanzahl AF > 1000ms 100 80 71 60 p<0,01 40 20 13 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 3µM Ivabradin Abbildung 42: Gesamtanzahl anhaltender Episoden von Vorhofflimmern unter Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradineinwirkung 66 180 154 160 Gesamtanzahl AF 140 120 112 100 p<0,01 80 60 45 40 20 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 3µM Ivabradin Abbildung 43: Gesamtanzahl von Flimmerepisoden unter Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradineinwirkung Abbildung 44: Beispielhafte Darstellung einer anhaltenden Flimmerepisode unter Acetylcholin- und Isoproterenoleinwirkung 67 4.2.3 Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Vernakalant Es wurden insgesamt 15 Versuche durchgeführt, um die antiarrhythmische Wirkung der 10-micromolaren Vernakalantlösung in Kombination mit Acetylcholin und Isoproterenol zu überprüfen. Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Wie bei den bisherigen Vorhofversuchen kam es unter dem alleinigen Einfluss der Acetylcholin-Isoproterenol-Mischlösung zu einer Verringerung der APD90 von 87±11ms unter Ausgangsbedingungen auf 60±9ms (p<0,001) (Abb.45) und der effektiven Refraktärzeit von 101±11ms auf 65±11ms (p<0,005) (Abb.46 oben) nach der Infusion der Kombinationslösung. Die zusätzliche Gabe von Vernakalant verlängerte die aAPD90 signifikant auf 71±12ms (p<0,001) (Abb.45) und die Refraktärzeit stieg unter Vernakalantinfusion wieder auf 81±10ms (p<0,005) an (Abb.46 oben). Acetylcholin und Isoprotenerol führten zu keiner signifikanten Veränderung der atrialen Post-Repolarisations-Refraktarität und Überleitungszeit im Vergleich zur basalen Stimulation, jedoch kam es zu einer signifikanten Verlängerung der aPRR von 4±14ms während der Applikation der Acetylcholin-Isoproterenol-Kombinationslösung auf 11±13ms (p<0,005) unter der Anwendung von Vernakalant im weiteren Versuchsablauf. (Abb.46 unten) Die Überleitungszeit zwischen den beiden Vorhöfen verlängerte sich ebenfalls von 4±2ms auf 6±4ms (p<0,05). Auftreten von Vorhofflimmern Unter der Einwirkung von Acetylcholin und Isoproterenol kam es auch in dieser Versuchsreihe zu einer erwarteten Steigerung der Gesamtzahl an Flimmerepisoden. (Abb.47 und Abb.48) Diese war sowohl hinsichtlich der kurz andauernden (<1s) als auch in Bezug auf die länger andauernden (>1s) Ereignisse signifikant (p<0,005). Es konnte bei allen Herzen durch die angewendete Kombinationslösung Vorhofflimmern ausgelöst werden. (Tabelle 4) Die Gabe von Vernakalant resultierte in einer signifikanten Reduktion des Vorhofflimmerns. Es konnte nur noch bei 8 von 15 Herzen Vorhofflimmern durch die Burststimulationen provoziert werden. (Tabelle 4, Abb.47 und Abb.48) 68 Tabelle 4: Übersicht über die Inzidenz von Vorhofflimmern unter Ausgangsbedingungen, Acetylcholin/Isoproterenol- und zusätzlicher Vernakalantinfusion (*p<0,005 gegenüber Ausgangsbedingungen;**p<0,05 gegenüber Acetylcholin und Isoproterenol) Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol 10 150* Einzelereignisse >1s Einzelereignisse 43 insgesamt Anzahl von 7 von 15 Herzen, bei denen Vorhofflimmern> 1 s auslösbar war 66** 213* 75** 15 von 15* 8 von 15** 120 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 10µM Vernakalant 100 aAPD90 in ms 10µM Vernakalant 80 60 40 150 250 350 Zykluslänge in ms Abbildung 45: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalant auf die aAPD90 69 120 100 p<0,005 aERP (ms) 80 p<0,005 60 40 20 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 10µM Vernakalant 30 25 * aPRR (ms) 20 p<0,01 15 10 5 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 10µM Vernakalant Abbildung 46: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalant auf die aERP und aPRR 70 160 150 Gesamtanzahl AF > 1000ms 140 120 p<0,05 100 80 p<0,001 66 60 40 20 10 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 10µM Vernakalant 250 213 Gesamtanzahl AF 200 p<0,005 150 p<0,001 100 75 50 43 0 Ausgangsbedingungen 1µM Acetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 10µM Vernakalant Abbildung 47: Gesamtanzahl anhaltender Phasen von Vorhofflimmern (oben) und Gesamtanzahl der Flimmerepisoden (unten) unter Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalantwirkung 71 Abbildung 48: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, AcetylcholinIsoproterenol-Wirkung und zusätzlicher Vernakalantgabe 72 4.2.4. Vergleichende Versuche zur antiarrhythmischen Wirkung von Flecainid Diese Versuchsreihe, in der 2µM Flecainid in Kombination mit der Acetylcholin/ Isoproterenol-Mischlösung eingesetzt wurde, umfasste sieben Kaninchenherzen. Repolarisationsverlauf und Überleitungszeit Die zusätzliche Infusion der Flecainidlösung führte, nach einer signifikanten Verkürzung der aAPD90 durch die Acetylcholin- Isoproterenol- Kombinationslösung (p<0,005) (Abb.49), nicht zu einer signifikanten Verlängerung der Repolarisation, wohl aber zu einer Verlängerung der Refraktärzeit von 58±17ms unter Acetylcholin und Isoproterenol auf 105±27ms (p<0,05) (Abb.50). Die atriale Post-RepolarisationsRefraktärität vergrößerte sich dementsprechend unter Flecainid zwar im Vergleich zur Acetylcholin- und Isoproterenolwirkung, das Signifikanzniveau wurde jedoch mit p=0,069 knapp überschritten. Die Überleitungszeit war nach der Zugabe von Flecainid mit 8±3ms im Vergleich zum reinen Acetylcholin-Isoproterenol-Einfluss mit 4±2ms (p<0,01) und im Vergleich zur Ausgangssituation mit 3±1ms (p<0,001) signifikant verlängert. Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol 120 plus 2µM Flecainid 100 aAPD90 (ms) 80 60 40 20 0 150 250 350 Zykluslänge (ms) Abbildung 49: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainid auf die aAPD90 73 140 120 p<0,05 aERP (ms) 100 p<0,05 80 60 40 20 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 2µM Flecainid Abbildung 50: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainid auf die aERP Auftreten von Vorhofflimmern Auch in der Flecainid-Versuchsreihe führte Acetylcholin in Kombination mit Isoproterenol zu einer signifikanten Erhöhung (p<0,05) der auftretenden Episoden von Vorhofflimmern. (Abb.51 und Abb.52) Die zusätzliche Zugabe von Flecainid zum Perfusat verringerte zwar das provozierte Auftreten von Vorhofflimmern durch die Acetylcholin-Isoproterenol-Lösung (Abb.52) jedoch wurde auch hier ähnlich wie in den Ivabradinversuchen das Signifikanzniveau von p<0,05 nicht erreicht (Abb.51). So zeigt sich auch im Vergleich mit Flecainid, dass Antazolin eine effektivere Hemmung des Vorhofflimmerns bewirkt. 74 80 68 Gesamtanzahl AF > 1000ms 70 60 50 50 40 p<0,05 30 20 12 10 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 2µM Flecainid 120 * 102 Gesamtanzahl AF 100 80 60 40 57 p<0,05 31 20 0 Ausgangsbedingungen 1µMAcetylcholin/ 1µM Isoproterenol plus 2µM Flecainid Abbildung 51: Gesamtanzahl anhaltender Phasen von Vorhofflimmern (oben) und Gesamtanzahl der Flimmerepisoden (unten) unter Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainideinwirkung 75 Abbildung 52: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, AcetylcholinIsoproterenol-Wirkung und zusätzlicher Flecainidgabe 76 5. Diskussion In dieser Arbeit wurde die antiarrhythmische Wirkung von Antazolin am isolierten retrograd perfundierten Kaninchenherzen unter Verwendung der LangendorffApparatur untersucht. Die Organe stammten dabei von gesunden Tieren ohne Hinweise auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Durch die durchgeführten ventrikulären und atrialen Provokationsversuche konnte eine zuverlässige Hemmung von Herzrhythmusstörungen wie Torsades de Pointes durch die Unterdrückung von frühen Nachdepolarisationen sowie das Auftreten von Flimmerepisoden während der Vorhofversuche deutlich reduziert werden. Am Modell ventrikulärer Arrhythmien stellten die durch Antazolin verlängerte Aktionspotentialdauer, die Verlängerung der Refraktärzeit und die Reduktion der Dispersion der Repolarisation die entscheidenden elektrophysiologischen Mechanismen dar. Am Vorhofflimmermodell konnte Antazolin ebenso eine Verlängerung der aAPD90, aERP sowie eine Zunahme der interatrialen Leitungszeit und der Post-Repolarisations-Refraktarität und damit eine Hemmung des durch Acetylcholin und Isoproterenol induzierten anhaltenden Vorhofflimmerns bewirken. Da trotz langjähriger Forschungen ventrikuläre Tachyarrhythmien noch immer eine häufige Mortalitätsursache [1] darstellen, sowohl durch medikamentöse Induktion des langen QT- Syndromes [72,78,81] als auch die angeborenen Formen der verlängerten QT- Dauer [70,71], werden noch immer neue Antiarrhythmika ohne proarrhythmisches Potential und mit wenigen Nebenwirkungen gesucht. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das wesentliche proarrhythmische Potential von Medikamenten wie Sotalol, Erythromycin und Veratridin durch Antazolin aufgehoben werden kann. Ebenso stellt das Auftreten von Vorhofflimmern als häufigste Herzrhythmusstörung beim Mensch mit steigender Prävalenz [3] eine Herausforderung für die therapeutische Intervention dar. Viele Medikamente haben vielfache Nebenwirkungen an anderen Organsystemen, sind teuer oder haben eine unbefriedigende Wirkung [124,142]. Auch hier konnte diese Arbeit eine weitere Therapiemöglichkeit mit dem Antihistaminikum Antazolin aufzeigen, mit dem eine zuverlässige Hemmung des Vorhofflimmerns gezeigt werden konnte. Obwohl die antiarrhythmische Wirkung von Antazolin schon seit mehr als 40 Jahren bekannt ist und es in Polen vielfach als Antiarrhythmikum eingesetzt wird [153], mangelt es an fundierten wissenschaftlichen Untersuchungen hinsichtlich der elektrophysiologischen Wirkungsweise und ebenso an klinischen Studien mit einem hohen Evidenzlevel. Diese Arbeit konnte die elektrophysiologische Wirkungsweise von Antazolin darstellen und so die Grundlage für weitere Forschungen auf diesem Gebiet schaffen, um 77 eventuell eine international akzeptierte Grundlage für den Einsatz von Antazolin als Antiarrhythmikum zu bewirken. 5.1. Arrhythmogenese durch QT-Verlängerung Obwohl die Ursachen für Tachyarrhythmien, die zum plötzlichen Herztod führen können, vielfältig sind, stellen die lebensgefährlichen Torsades de Pointes einen nicht unwesentlichen Anteil dar. Da die Untersuchung spontaner Tachyarrhythmien schwierig ist, weil es sich meist um spontane Ereignisse handelt, die kaum vorhersehbar sind, wurden in dieser Arbeit Provokationsversuche durchgeführt, die schon in bisherigen Studien zu einem häufigen Auftreten von lebensgefährlichen Arrhythmien vom Torsade de Pointes-Typ geführt haben [96,176]. Grundlage hierfür ist eine durch Sotalol, Erythromycin und Veratridin hervorgerufene Verlängerung der QT-Dauer [72,78,81], die auch in den vorliegenden Versuchsreihen durch diese Substanzen hervorgerufen werden konnte (p<0,001). Dabei liegen den Wirkstoffen unterschiedliche Mechanismen zugrunde. Sotalol und Erythromycin führen über eine Blockade des Ionenausstromes IKr (loss of function) zu einer Verlängerung der Repolarisation. Damit können diese Substanzen zur Simulation des angeborenen LQT2 dienen, welches durch eine Mutation im KCNH2-Gen zu einem Funktionsverlust von IKr führt und dadurch die Repolarisation verlängert [178]. Wie Hondeghem zeigen konnte, ist das Kaninchenherz prädisponiert für Veränderungen der QT-Dauer durch eine Blockade von IKr. Dies wird durch den hohen Anteil von IKr im Kaninchenmyokard begründet [175]. Veratridin hingegen führt zu einer Inaktivierung der Blockade von INa und damit zu einem Funktionszugewinn dieses Ionenstromes und bewirkt dadurch wiederum, dass sich die Repolarisationsdauer verlängert [90]. Veratridin kann somit als Model für das LQT3 dienen, welches durch eine Mutation im SCN5A-Gen entsteht und zu einer längeren Aktivierung und Reaktivierung von INa führt. Diese Vorgehensweise wurde von unserer Arbeitsgruppe bereits mehrfach erfolgreich zur Simulation des angeborenen LQT2 und LQT3 durchgeführt [78,81]. Doch eine reine Verlängerung der QT- Dauer reicht nicht aus, um Torsades de Pointes auszulösen. Ein weiterer wichtiger Faktor neben der Verlängerung der Aktionspotentialdauer, der QT-Zeit und der Refraktärzeit, stellt die Dispersion der Repolarisation dar [58,81,176]. Diese setzt sich aus der zeitlichen und räumlichen Dispersion der Erregungsrückbildung zusammen, welche in einer inhomogenen Verteilung der beteiligten Ionenkanäle begründet liegt. So ist IKs midmyokardial weniger häufig vertreten als epi- und endokardial, wohingegen IKr in den bisherigen Studien gleichmäßiger verteilt ist [58]. Dies führt dazu, dass sogenannte M-Zellen besonders anfällig für APD-Verlängerungen sind [59] und eine Blockade einzelner Kanäle die Dispersion verstärken kann und somit die Grundlage für ReentryMechanismen schafft, da erregbare und nicht erregbare Zellen nebeneinander liegen 78 können und kreisende Erregungen möglich werden. In klinischen Untersuchungen konnten Shimizu et al. 1995 nachweisen, dass auch beim Menschen die gesteigerte Dispersion eine wesentliche Grundlage für die Entstehung von Tachyarrhythmien ist [179]. Dass sowohl Sotalol [78] und Erythromycin [180] als auch Veratridin [81] zu einer deutlichen Zunahme der Dispersion führen, ist bereits aus vorhergehenden Studien bekannt. Diese signifikante Zunahme der Dispersion im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen konnte auch hier unter der Wirkung von Sotalol, Erythromycin und Veratridin bestätigt werden. Torsades de Pointes und frühe Nachdepolarisationen traten jedoch überwiegend während hypokaliämischer Bedingungen auf, was in der vorhandenen Repolarisationsreserve im Herzen begründet liegt. So werden die für die Repolarisation nötigen Ionenkanäle im Überschuss exprimiert, beziehungsweise bei der Blockade eines essentiellen Kanales ein anderer rekrutiert, um lebensgefährliche Arrhythmien zu verhindern [61,67]. Der 1998 von Roden eingeführte Begriff der Repolarisationsreserve [32] bezeichnet die Tatsache, dass eine verlängerte Repolarisation und Dispersion nur das Substrat für Tachyarrhythmien schaffen kann, aber weitere Faktoren wie beispielsweise eine Hypokaliämie [62,63], Bradykardie [64] oder genetische Disposition [70] vorhanden sein müssen, um frühe Nachdepolarisationen auszulösen, die als Trigger für Torsades de Pointes fungieren. EADs sind zwingend erforderlich für die Entstehung von Torsade de Pointes und entstehen dabei durch einen erneuten Kationeneinstrom [87], insbesondere über ICa-L während der Phase 3 des Aktionspotentials [88,89]. Es traten bei allen Herzen, in denen durch Sotalol, Erythromycin und Veratridin Torsades de Pointes ausgelöst werden konnten, auch frühe Nachdepolarisationen auf. Somit kann zusammengefasst werden, dass die hier gemessenen elektrophysiologischen Parameter, wie eine Verlängerung der Repolarisation, der QT-Zeit und der Dispersion der Repolarisation die Grundlage für die Entstehung von Arrhythmien wie EADs und Torsades de Pointes liefern. Die zusätzliche hypokaliämische Phase während der Versuche und die geringen Stimulationsfrequenzen senken die Repolarisationsreserve zusätzlich und es findet somit eine Provokation von frühen Nachdepolarisationen als Trigger für das Auftreten von Torsade de Pointes statt. 79 5.2. Einfluss von Antazolin auf die Arrhythmogenese durch QT- Verlängerung Schon 1948 konnte Dutta im tierexperimentellen Modell erstmals eine antiarrhythmische Wirkung des Antihistaminikums Antazolin feststellen [143]. Es folgten weitere überwiegend klinische Nachweise, beispielsweise durch Shah et al [145], Dreifus et al [146] und Herbst [147] in den siebziger und achtziger Jahren. Grundlegende molekulare Studien oder Arbeiten an isolierten Organen erfolgten bislang nicht. Auch wenn Antazolin bis heute hinsichtlich der Behandlung ventrikulärer tachykarder Arrhythmien ein wenig in Vergessenheit geraten ist, stellt es aufgrund seiner geringen Nebenwirkungen wie milder Hypotonie, Benommenheit und vorübergehender Übelkeit und Erbrechen [145] eine vielversprechende Alternative in der Therapie des angeborenen und erworbenen langen QT- Syndromes dar, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte. So konnte Antazolin das Auftreten der, durch Sotalol, Erythromycin und Veratridin, ausgelösten Torsades de Pointes und frühen Nachdepolarisationen während hypokaliämischer Versuchsphasen, in allen Fällen signifikant reduzieren. Dabei kam es, unter der zusätzlichen Applikation der 20 micromolaren Antazolinlösung, nicht zu einer Verkürzung der durch die vorhergehenden Substanzen verlängerten APD90, Refraktärzeit und QT-Zeit, sondern im Falle von Sotalol zu einer weiteren signifikanten Verlängerung der Refraktärzeit, QT-Zeit und APD90. In den Versuchen mit Erythromycin kam es sowohl zu einer Verlängerung der QT-Zeit als auch der Refraktärzeit und im Falle von Veratridin zu einer Verlängerung des QTIntervalles, der Refraktärzeit und der APD90 unter der zusätzlichen Antazolininfusion. Da dies sowohl im Modell für das LQT2 mit Erythromycin und Sotalol als auch unter dem vorhergehenden Einsatz von Veratridin erfolgte, konnte folglich die Blockade von IKr, beziehungsweise die fehlende Inaktivierung von INa durch Antazolin nicht nachweislich gestoppt oder aufgehoben werden. Im Gegenteil, die Repolarisation und Refraktärität wurde durch Antazolin noch weiter verzögert. Dies konnte insbesondere durch die Dosis-Wirkungsversuche zu Beginn dieser Studie gezeigt werden, in denen es, mit steigenden Antazolinkonzentrationen ebenfalls zu einer Zunahme der APD90, der Refraktärzeit als auch der QT-Zeit gekommen ist, ohne den zusätzlichen Einfluss von Sotalol, Erythromycin oder Veratridin. Trotz dieser QT-Verlängerung durch Antazolin kam es zu einer deutlichen Reduktion von EADs und Torsades de Pointes, womit die alleinige Verlängerung der QT-Zeit kein guter prädiktiver Faktor für das Auftreten dieser lebensgefährlichen Tachyarrhythmien ist. Diesen Effekt zeigten bereits auch andere Medikamente, wie zum Beispiel Amiodaron oder Ranolazin in weiteren Versuchen dieser Arbeitsgruppe. So führten diese Substanzen ebenfalls zu einer QT-Verlängerung, allerdings nicht zu einer Erhöhung der Dispersion und dem Auftreten von frühen Nachdepolarisationen oder Torsaden [66,126,181]. Ranolazin konnte in Kombinationsversuchen mit dem Klasse ǀǀǀ Anti- 80 arrhythmikum Sotalol ebenso wie Antazolin die negative proarrhythmische Wirkung von Sotalol aufheben [182]. Ein weiterer Faktor, der zur Erklärung dieser antiarrhythmischen Wirkung vieler Substanzen betrachtet werden muss, ist die Dispersion. Die gesamte Dispersion setzt sich aus der spatialen und temporalen Dispersion zusammen und konnte hier durch die Verteilung der MAP- Ableitungskatheter bestimmt werden, indem sowohl mehrere epikardiale auf der linken und rechten Herzseite, als auch eine endokardiale Ableitung erfolgte. Eine erhöhte Dispersion der Repolarisation bedeutet, dass die Erregungsrückbildung in den Herzmuskelzellen zeitlich und regional zunehmend unterschiedlich verläuft und nicht mehr geordnet erfolgt [183]. Insbesondere wenn die Refrakärzeit verlängert ist, führt eine zusätzliche Dispersionszunahme dazu, dass kreisende Erregungen und somit Reentry- Mechanismen entstehen können. Eine Zunahme der Dispersion wird folglich mittlerweile als viel wichtigerer Faktor zur Einschätzung des proarrythmischen Potentials von neuen Medikamenten gesehen, als eine alleinige Verlängerung der QT-Dauer [184]. Betrachtet man nun die Werte für die Dispersion in dieser Arbeit, so zeigt sich, dass die zusätzliche Infusion von Antazolin sowohl in der Sotalol- und Erythromycin-Versuchsreihe, als auch in der Veratridinversuchsreihe zu einer signifikanten Verringerung dieses Faktors führte (p<0,05) und so eine elektrophysiologische Erklärung für die antiarrhythmischen Effekte von Antazolin gegeben werden kann. Da es an molekularen Studien zu Antazolin mangelt, können hier nur Vermutungen zur Wirkung von Antazolin an verschiedenen Ionenkanälen aufgestellt werden, indem man die Wirkung mit anderen Medikamenten, von denen bereits mehr über die molekularen Wirkmechanismen bekannt ist, vergleicht. Da eine deutliche repolarisationsverlängernde Wirkung von Antazolin ausgeht, ist von einer Hemmung des Kationenausstromes während der Phase 2-3 des Aktionspotentiales auszugehen. Da dieser Ionenstrom überwiegend über IKr und IKs erfolgt [26,27], liegt der Verdacht nahe, dass Antazolin eine hemmende Wirkung auf einen oder beide Kanäle ausübt (loss of function). Außerdem wäre ein Funktionszugewinn eines Kationeneinstromes denkbar, beispielsweise von ICa- L oder INa wie im Falle von Veratridine [90]. Allerdings muss Antazolin zusätzlich die Reaktivierung von Kationenkanälen hemmen, die während der Refraktärzeit zu einer erneuten verfrühten Depolarisation führen können und somit möglicherweise Arrhythmien provozieren. Ranolazin beispielsweise hemmt den späten Natriumkanal INa- Late und unterdrückt dadurch frühe Nachdepolarisationen. Da Ranolazin jedoch auch den Ionenstrom IKr während der Repolarisation hemmt, kommt es trotzdem zu einer verlängerten QT-Zeit [185]. Dies wäre auch für Antazolin denkbar, ebenso wie eine Hemmung von ICa-L, wodurch EADs ebenfalls gehemmt werden könnten [88,89] und so nicht als Trigger für Torsades- de Pointes fungieren können. Sicher ist jedoch von einer multifokalen Wirkungsweise des Antihistaminikums Antazolin auszugehen, da es sowohl das Aktionspotential verlängert, als auch, wie in dieser Arbeit nachgewiesen, deutlich antiarrhythmisch wirkt. Zur genauen Differenzierung der molekularen Wirkungsweise müssen weitere Studien erfolgen. 81 5.3. Entstehungsmechanismus von Vorhofflimmern Provokation mit Acetylcholin und Isoproterenol Wie bereits erwähnt, stellt das Vorhofflimmern die häufigste Herzrhythmusstörung dar [3], welche sowohl beim herzgesunden Menschen als auch insbesondere bei chronischer Herzinfuffizienz infolge des Remodelings auftreten kann. Die Prävalenz steigt mit zunehmendem Lebensalter an [101]. Auch beim Hund, insbesondere dem Irischen Wolfshund, ist das Auftreten von Vorhofflimmern ein häufiges Problem [186]. Die genaue Entstehung von Vorhofflimmern ist insbesondere aufgrund des multifaktoriellen Geschehens noch nicht vollständig aufgeklärt. Dabei spielen sowohl genetische Prädispositionen als auch die Verteilung und Aktivierung verschiedener Ionenströme, als auch der Herzaufbau mit eventuellem Remodeling und Fibrosierung eine Rolle [187]. Eine nicht unwesentliche Beteiligung an der Entstehung von Vorhofflimmern kommt außerdem dem ICANS (intrinsisches, cardiales, autonomes Nervensystem) zu, besonders bei dem Auftreten von paroxysmalen Flimmerepisoden [187]. Da dieser Teil des autonomen Nervensystems vor allem im Bereich des linken Atriums und der Pulmonalvenen lokalisiert ist [188], stellt dies eine mögliche Erklärung dafür dar, warum paroxysmales Flimmern in 90% der Fälle seinen Ursprung im Bereich der Pulmonalvenen hat [189]. So konnte sowohl bei Schweinen [190] als auch beim Hund [191] durch eine Ablation von Teilen des vegetativen Nervensystems schon das Auftreten von Vorhofflimmern verhindert werden. Die Provokation von Flimmerepisoden mit der Acetylcholin-Isoproterenol-Kombinationslösung erfolgt dabei über die Rezeptoren des autonomen Nervensystems. Acetylcholin wirkt über muscarinerge M2- und M3-Rezeptoren, die über G-Protein gekoppelte Mechanismen überwiegend zu einem Anstieg von I K-ACh führen und damit die Repolarisation beschleunigen [187]. Dies ist anhand einer geringeren Aktionspotentialdauer und effektiven Refraktärzeit erkennbar und konnte auch in dieser Arbeit unter Acetylcholin- und Isoproterenolwirkung in allen Versuchsreihen signifikant bestätigt werden. Da die Refraktärzeit regional unterschiedlich beeinflusst wird, entstehen Inhomogenitäten, die als Substrat für die Entstehung von Rotoren dienen können [192]. Dabei stellt sowohl bei der von Gorden Moe 1962 [103] aufgestellten multiple wavelet Hypothese als auch bei der von Allessie et al. [104] stammenden leading circle Hypothese die Wellenlänge einen entscheidenden Faktor dar. Diese ist das Produkt aus der Refraktärzeit und der Leitungsgeschwindigkeit [193]. Sinkt also die Refraktärzeit wie unter Acetylcholin- und Isoproterenoleinwirkung, so sinkt auch die Wellenlänge und damit bleibt mehr Raum für viele Rotoren, die zu einer stabilen Arrhythmie führen können. Die Kombination von Acetylcholin und Isoproterenol wurde bereits mehrfach erfolgreich zur Provokation von Vorhofflimmern eingesetzt [171, 194]. Isoproterenol führt als β-Agonist zu einer Steigerung der Calciumfreisetzung ins Sarkoplasma [195] und somit zur Förderung von Vorhofflimmern. Auch in dieser Arbeit konnte durch den 82 Einfluss der beiden Substanzen die Prävalenz von Vorhofflimmern in allen Versuchsreihen signifikant (p<0,05) gesteigert werden. Durch das vermehrte Auftreten von Vorhofflimmern wurden die für die Versuchsreihen nötigen Tiere gering gehalten. Trotzdem wurden gute neue Erkenntnisse zur Wirkungsweise von Antazolin auf Vorhofebene erzielt. 5.4. Atriale antiarrhythmische Effekte von Antazolin Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Antazolin nicht nur eine antiarrhyhtmische Wirkung auf ventrikulärer Ebene hat, sondern auch sehr erfolgreich die Inzidenz von Vorhoffimmern senken kann. So konnte das Auftreten von Flimmerepisoden nach Provokation durch Acetylcholin und Isoproterenol durch die zusätzliche Antazolinapplikation komplett unterdrückt werden. Die bisherigen Studien zur Wirkung von Antazolin in der Behandlung von Vorhofflimmern sind widersprüchlich; während viele Ergebnisse klar gegen eine derartige Wirkungsweise [145] sprechen, unterstützen andere Arbeiten die Ergebnisse dieser Arbeit [150-152]. Es handelt sich bei diesen Veröffentlichungen jedoch lediglich um Fallberichte mit niedrigem Evidenzlevel. Außerdem spricht der jahrelange erfolgreiche Einsatz dieses Antihistaminikums zur antiarrhythmischen Therapie in Polen für eine zuverlässige Hemmung von Vorhofflimmern durch Antazolin. Ausgiebige Studien mit hohem Evidenzlevel stehen jedoch noch weitestgehend aus. Piotrowski et al [149] konnten jedoch in einer neuen Studie aus Polen zeigen, dass Antazolin insbesondere Vorhofflimmern während Katheterablationen sehr gut hemmen kann. Dabei stellt insbesondere die kurze Anflutungs-und Halbwertszeit von circa 3 Stunden und die wenigen Nebenwirkungen einen Vorteil von Antazolin dar. Eine weitere Studie mit hohem Evidenzlevel (AnPAF= antazoline in rapid cardioversion of paroxysmal atrial fibrillation study) zur Beurteilung der antifibrillatorischen Wirkung von Antazolin bei paroxysmalem Vorhofflimmern ist momentan in der Entwicklung [142]. Die Ergebnisse dieser Studie könnten auch in anderen Ländern zur Erneuerung der Leitlinien zur Behandlung von Vorhofflimmern führen. Die elektrophysiologischen Grundlagen für die Wirkung des Antihistaminikums Antazolin konnte diese Arbeit aufzeigen. So bewirkte Antazolin eine Verlängerung der effektiven atrialen Repolarisationszeit, der atrialen Repolarisations-Refraktarität, der atrialen Aktionspotentialdauer und eine Verlängerung der interatrialen Leitungszeit. Betrachtet man Rotoren als Grundlage für Reentry- Erregungen, in deren Folge es zu Vorhofflimmern kommen kann, so muss man die Wellenlänge dieser Impulse als wichtigen Faktor in die Erklärung von antiarrhyhtmischen Wirkungsweisen von Substanzen einbeziehen. Da sich, wie bereits erwähnt, die Wellenlänge als Produkt aus der Refraktärzeit und Leitungsgeschwindigkeit zusammensetzt, bewirkt eine Erhöhung der effektiven atrialen Refraktärzeit eine Vergrößerung der möglichen Wellenlänge und limitiert damit die Anzahl der Rotoren, die gleichzeitig in den Vorhöfen 83 auftreten können. So kam es in dieser Studie unter der Einwirkung von Acetylcholin und Isoproterenol zu einer signifikanten Verkürzung der aERP und dadurch zu einer erhöhten Anzahl von möglichen Rotoren in den Vorhöfen. Die zusätzliche Infusion von Antazolin konnte diese Wirkung wieder rückgängig machen und eine Erhöhung der aERP bewirken und somit die Wellenlänge erhöhen und mögliche Arrhythmien verhindern. Wie bereits in Studien auf ventrikulärer Ebene [196,197] und auf Vorhofebene [125] gezeigt wurde, führt eine Verlängerung der Refraktärzeit über das Ende der Repolarisation hinaus, ebenfalls zu einem Verhindern von irregulären Erregungen und wird als post-Repolarisations-Refraktarität bezeichnet. Diese errechnet sich aus der Differenz von APD90 und Refraktärzeit. Physiologischerweise ist eine PostRepolarisations-Refraktarität vorhanden, die insbesondere durch die Wirkung von IKr und IKs zustande kommt [198]. Diese Ionenströme wirken nicht nur während der Repolarisationsphase, sondern auch noch während dem Beginn der Diastole und verhindern so durch einen Efflux von Kationen die erneute Depolarisation der Herzmuskelzelle. Eine Blockade oder Funktionsstörung dieser Kanäle kann auch in den Vorhöfen wie im Ventrikel zu inhomogenen Repolarisationsverläufen führen und Arrhythmien fördern. Durch die Kombination von Acetylcholin und Isoproterenol wurde die natürliche aPRR gesenkt, Antazolin verlängerte im weiteren Versuchsablauf die aPRR jedoch wieder. So kann auch hier die verlängerte aPRR im Zusammenhang mit der antiarrhyhtmischen Wirkung von Antazolin gesehen werden. Die signifikante Verlängerung der interatrialen Leitungszeit unter zusätzlicher Antazolininfusion müsste eher proarrhythmisch wirken, wenn man die mögliche Beeinflussung der Wellenlänge der Rotoren betrachtet. So entspricht eine verlängerte Leitungszeit einer verminderten Leitungsgeschwindigkeit und resultiert in einer kleineren Wellenlänge und damit in einer erhöhten Anzahl von möglichen kreisenden Erregungen in den Vorhöfen. Steigt jedoch die Refraktärzeitlänge überproportional im Vergleich zur Verringerung der Leitungsgeschwindigkeit, könnte dies nichtsdestotrotz eine Vergrößerung der Wellenlänge bedeuten und damit die antiarrhyhtmische Wirkung von Antazolin erklären. Darüber hinaus kann der negativen Dromotropie durch eine Verminderung der Leitungszeit auch eine antiarrhythmische Bedeutung zukommen, wenn Blockaden entstehen, die den Reentryfortlauf verhindern [199]. Nach der Applikation von Acetylcholin und Isoproterenol kam es auch zu einer Verkürzung der Aktionspotentialdauer, wodurch das Auftreten von Vorhofflimmern weiter gefördert wurde, da durch die kurze Aktionspotentialdauer die Herzmuskelzellen schneller wieder erregbar sind, insbesondere wenn sich die Refraktärzeit ebenfalls verkürzt. Antazolin bewirkte auch hier einen Wiederanstieg der APD 90, trotz weiterer Infusion von Acetylcholin und Isoproterenol. 84 5.5 Vergleich der atrialen antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin mit Vernakalant, Flecainid und Ivabradin Um die Effektivität der antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin und deren elektrophysiologischen Grundlagen beurteilen zu können, wurden Versuchsreihen unter den gleichen Versuchsbedingungen mit weiteren bekannten Substanzen durchgeführt. Diese werden wie im Fall von Vernakalant und Flecainid in der Therapie von Vorhofflimmern bereits vielfach eingesetzt oder werden zukünftig in der Therapie von Vorhofflimmern von Bedeutung sein, wie im Fall von Ivabradin. Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Vernakalant Vernakalant kann aufgrund seiner Wirkung auf mehrere Kalium- und Natriumkanäle zu der Klasse ǀ und ǀǀǀ der Antiarrhyhtmika gezählt werden [200,201] und führt zu einer schnellen Konversion von paroxysmalen Vorhofflimmern in den Sinusrhythmus [202204]. Dies konnte bereits durch mehrere Studien gezeigt werden [205,206]. Vernakalant wird deswegen von der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie empfohlen, wenn keine strukturellen Herzerkrankungen bestehen [204,207]. Während man zunächst von einer überwiegend vorhofselektiven Wirkung durch die Blockade von IKur [133] und INa-Peak [208] ausgegangen ist, konnte durch unsere Arbeitsgruppe bereits in einer anderen Arbeit die ventrikuläre Wirkung am Langendorff-perfundierten isolierten Kaninchenherz gezeigt werden [177]. Dabei kam es zwar zu einer Verlängerung der QT-Zeit, APD90 und der ERP, es konnte jedoch kein proarrhythmisches Potential nachgewiesen werden [177]. Die Begründung dafür kann in der stabilen Dispersion der Repolarisation und der gesteigerten Post- RepolarisationsRefraktarität liegen. So konnte gezeigt werden, dass Vernakalant zwar nicht vorhofselektiv wirkt, jedoch trotzdem nicht das Auftreten ventrikulärer Arrhythmien begünstigt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Vernakalant die Gesamtanzahl an Ereignissen signifikant reduziert. Elektrophysiologisch kam es unter der zusätzlichen Anwendung von Vernakalant zu einer Steigerung der aAPD 90 und der effektiven atrialen Refraktärzeit, außerdem verlängerte sich die Refraktärzeit nach der vollständigen Repolarisation und die interatriale Überleitungszeit nahm signifikant zu, im Vergleich zu den Werten unter Acetylcholin und Isoproterenol. Diese Veränderungen durch Vernakalant konnten auch in anderen Studien bereits dargestellt werden [208,209]. Im Vergleich lagen also der antiarrhythmischen Wirkung von Vernakalant und Antazolin diegleichen elektrophysiologischen Wirkmechanismen zugrunde, da Antazolin in dieser Arbeit ebenfalls zu einer Erhöhung der aAPD 90, aERP, aPRR und der Überleitungszeit führte. Allerdings ist der antiarrhythmische Effekt durch das Antihistaminikum Antazolin deutlich ausgeprägter. So konnte das Vorhofflimmern durch die Infusion von Antazolin komplett unterdückt werden, während Vernakalant 85 diese lediglich reduzierte. Dies kann durch die Stärke der Veränderungen, insbesondere hinsichtlich der aPRR und der effektiven Refraktärzeit erklärt werden, die unter Antazolin wesentlich ausgeprägter waren als unter Vernakalant. Durch die verlängerte Refraktärzeit vergrößert sich die Wellenlänge entstehender Rotoren und damit sinkt die Anzahl möglicher Erregungen in den Vorhöfen, welches zu einer Hemmung von Vorhofflimmern führt. Außerdem hemmt die Verlängerung der Refraktärzeit über die Repolarisation hinaus ein Auftreten von verfrühten Depolarisationen. So kann von vergleichbaren Wirkmechanismen von Antazolin und Vernakalant auf verschiedene Ionenkanäle ausgegangen werden, wobei keine atriumselektive Wirkung besteht. Die Effektivität ist jedoch im Fall von Antazolin in diesem Modell wesentlich ausgeprägter. Um die genaue Wirkungsweise von Antazolin an den Ionenbewegungen zu klären, sind jedoch weitere molekulare Studien nötig. Ein weiterer Vorteil von Antazolin im Vergleich zu Vernakalant ist der niedrige Preis, da Vernakalant einen wesentlich höheren Kostenfaktor darstellt [142]. Hinsichtlich des Einsatzes von Antazolin beim Bestehen von Herz-KreislaufErkrankungen müssen weitere Untersuchungen, beispielsweise an Herzinsuffizienzmodellen, erfolgen, um festzustellen, ob der Einsatz von Antazolin unter bestimmten Bedingungen möglich ist und einen weiteren Vorteil gegenüber Vernakalant darstellt. Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Flecainid Flecainid ist ein Antiarrhythmikum der Klasse ǀC und blockiert damit INa [210], welches zu einer Verlangsamung der Depolarisation und zu einer Verlängerung der Überleitungszeiten führt [211]. Es kommt zu einer Erhöhung der QRS-Zeit und damit auch zu einer leichten Verlängerung der QT-Zeit, die Repolarisationsgeschwindigkeit wird jedoch nicht verändert [211]. Aufgrund der langsamen Erholungszeiten der Natriumkanäle kommt es außerdem zu einer Verlängerung der Refraktärzeiten [212,213]. Da Flecainid sowohl in den Vorhöfen als auch in den Ventrikeln des Herzens wirkt und es im Verlauf der CAST-Studie zu gehäuften Todesfällen und Arrhythmien unter der Behandlung mit Flecainid kam [214], wird der Einsatz nur bei herzgesunden Patienten empfohlen [122]. Da die Eliminierung überwiegend über die Nieren erfolgt, ist bei Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion der Einsatz bedenklich. Auch wenn die Effektivität von Flecainid zur Behandlung von Vorhofflimmern vielfach gezeigt wurde [215-217] und es zu einem Antiarrhyhtmikum erster Wahl hinsichtlich dieser Indikation gehört, so gab es doch immer wieder Studien, die widersprüchliche Ergebnisse lieferten [120], beziehungsweise einen klaren Vorteil von anderen Medikamenten wie beispielsweise Vernakalant aufzeigen konnten [218]. In dieser Arbeit veränderte sich die APD90 unter Flecainideinfluss nicht signifikant. In anderen Studien wurde bereits eine Verlängerung der APD unter Flecainid im atrialen Muskel gezeigt [219], jedoch im erregungsbildenden System eine Verringerung [220]. Eine mögliche Erklärung für die Ergebnisse in dieser Arbeit könnte sein, dass sich die 86 verlängernden und verkürzenden Effekte auf die Aktionspotentialdauer aufgehoben haben und es dadurch nicht zu einer signifikanten Veränderung kam oder die verkürzende Wirkung durch Acetylcholin und Isoproterenol die verlängernde Wirkung von Flecainid überwiegt. Hinsichtlich der effektiven atrialen Refraktärzeit konnten jedoch die bisherigen Ergebnisse bestätigt werden. Es fand eine signifikante Verlängerung der atrialen effektiven Refraktärzeit statt. Diese Verlängerung der Refraktärzeit wurde in anderen Arbeiten als Ursache für die Hemmung von Vorhofflimmern aufgrund der dadurch vergrößerten Wellenlänge auftretender Rotoren gesehen [213], in dieser Arbeit war jedoch die Reduktion der auftretenden Flimmerepisoden nicht signifikant. Eine Ursache könnte hierfür in dem verwendeten Versuchsmodell liegen.Vergleicht man die Wirkung von Flecainid mit der von Antazolin in diesem Versuchsmodell, so zeigt sich insbesondere auch, dass Flecainid im Gegensatz zum Antihistaminikum Antazolin nicht zu einer ausgeprägten Erhöhung der Post-Repolarisations-Refraktarität führte, worin die mangelnde Effektivität von Flecainid begründet liegen könnte. Die interatriale Überleitungszeit wurde durch Flecainid ebenso wie unter Antazolinwirkung signifikant erhöht, welches aufgrund der langsamen Depolarisation durch die Blockade von INa erklärt werden kann. Abschließend lässt sich sagen, das Flecainid im Gegensatz zum Wirkstoff Antazolin in dieser Arbeit das Auftreten von Vorhofflimmern im Provokationsversuch mit Acetylcholin und Isoproterenol nicht ausreichend hemmen konnte. Da durch die Applikation von Acetylcholin und Isoproterenol insbesondere paroxysmale Arrhythmien aus dem intrinsischen autonomen Nervensystem des Herzens simuliert werden, konnte gezeigt werden, dass in diesem Fall die Effektivität von Antazolin gegenüber Flecainid überwiegt. Vergleichende Analyse zwischen Antazolin und Ivabradin Die hauptsächliche Wirkung von Ivabradin ist die Blockade des nicht-selektiven Kationeneinstromes If. Da dieser durch Hyperpolarisation aktivierte sogenannte funny channel, der sowohl Kalium- als auch Natriumionen während der Phase 4 des Aktionspotentiales einströmen lässt [138], zunächst nur im erregungsbildenden System des Herzens nachgewiesen wurde, ging man von einer selektiven Wirkung von Ivabradin insbesondere am Sinusknoten aus [173]. Dabei führt Ivabradin zu einer Verminderung der Herzfrequenz ohne die Kontraktilität des Herzens einzuschränken [221,222] und ist insbesondere hinsichtlich der Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen von Bedeutung [223]. Dies führt dazu, dass Ivabradin einen entscheidenden Vorteil gegenüber alternativ eingesetzten β- Blockern mit sich bringt, da diese die Kontraktilität herabsetzen und zu einer reduzierten Auswurfleistung des Herzens führen [221,222]. Mittlerweile konnten die, hauptsächlich durch die Gene HCN2- und HCN4 codierten, If-Kanäle jedoch auch in atrialen Myocyten [224], ventrikulären Herzmuskelzellen [225] und zu größeren Teilen in den Pulmonalvenen nachgewiesen werden [226]. Dabei könnte diesen Ionenbewegungen als Trigger zur Entstehung von ektopischen Erreg- 87 ungen eine grundlegende Rolle zukommen [227]. Es wurde bereits gezeigt, dass insbesondere unter der Entstehung von Vergrößerungen des Vorhofes, eines vermehrten interatrialen Füllungsdruckes sowie unter atrialen Flimmerepisoden die Aktivität von If stark ansteigt [137]. Somit stellt der Wirkstoff Ivabradin eventuell eine neue Möglichkeit der selektiven Behandlung von Arrhyhtmien dar. Wie bereits erwähnt, sind die proximalen Pulmonalvenen ein häufiger Ursprung für die Entstehung von Vorhofflimmern; da auch dort eine vermehrte Expression von If stattfindet, kann Ivabradin als Inhibitor dieses Kanals eine Behandlungsmöglichkeit liefern. Die zusätzliche Rekrutierung von If-Strömen unterliegt dabei auch dem vegetativen Nervensystem. So kommt es durch eine vermehrte sympathische Aktivität über βAdrenorezeptoren zu einer Erhöhung von cAMP und dadurch zu einer gesteigerten Aktivität von If und damit zu einer positven chronotropen Wirkung [138], die durch Ivabradin unterdrückt werden kann. Andererseits führen parasympathische Transmitter wie Acetylcholin zu einer verminderten Aktivierung von If. Durch eine Verschiebung des nötigen Schwellenpotentiales in den negativeren Bereich wird dieses schwerer erreicht und die Kanäle seltener aktiviert [138]. Der starke Einfluss des intrinsischen kardialen Nervensystems könnte eine Erklärung dafür sein, warum Ivabradin nicht zu einer ausgeprägten Verringerung des Auftretens von Vorhofflimmern geführt hat. Da in diesem Modell sowohl Acetylcholin, ein Parasympathomimetikum, als auch Isoproterenol, ein Sympathomimetikum eingesetzt wurde, könnte sich die aktivierende und hemmende Wirkung beider Substanzen am Ionenstrom If zum Teil aufgehoben haben. Außerdem handelte es sich in dieser Arbeit nicht um kardial erkrankte Tiere, sodass eine Erhöhung der Aktivität von If beispielweise durch eine Vorhofvergrößerung oder einen erhöhten intraatrialen Füllungsdruckes nicht provoziert wurde. Nichtsdestotrotz kam es durch Ivabradin zu zum Teil deutlichen Veränderungen der elektrophysiologischen Parameter und auch zu einer Tendenz zur Reduktion von Vorhofflimmern. Eine Ursache könnte in der Wirkung von Ivabradin an anderen Ionenkanälen sein. Es ist bereits eine Hemmung des Ionenstromes I Kr und ICa-L beschrieben [38,228]. Dies könnte auch hier zu einer signifikanten Verlängerung der aAPD90 geführt haben, was konträr zu bisherigen Ergebnissen zur Ivabradinwirkung ist, in der es zu keiner Veränderung der APD kam [38,224]. Ebenso bewirkte Ivabradin eine Verlängerung der Refraktärzeit und die aPRR erhöhte sich im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen signifikant. Dass sich die Überleitungszeit unter Ivabradineinfluss nicht verlängert [221,222], konnte hier bestätigt werden. Obwohl die Verlängerung der Refraktärzeit zu einer Vergrößerung der Wellenlänge möglicher Rotoren führt und die vergrößerte Refraktärzeit über die Repolarisation hinaus antiarrhythmisch wirkt, wurde die Gesamtanzahl von Flimmerepisoden, die länger als eine Sekunde andauerten, reduziert. 88 Damit konnte gezeigt werden, dass Antazolin in diesem Modell eine größere antiarrhythmische Wirkung bezüglich atrialer Flimmerepisoden aufweist als Ivabradin. Hier spielt vermutlich das Provokationsmodell mit Acetylcholin und Isoproterenol eine große Rolle, die gegensätzliche Einflüsse auf If ausüben und sich damit die mögliche Einflusshöhe von Ivabradin reduziert. Damit treten eventuell andere Wirkmechanismen von Ivabradin auf verschiedene Ionenkanäle in den Vordergrund, auch wenn diese Wirkungen in früheren Studien überwiegend erst in Konzentrationen von mehr als 3μM eintraten [228]. Es konnten jedoch auch hier grundlegende antiarrhythmische Wirkungsweisen wie eine Verlängerung der Refraktärzeit und der aPRR nachgewiesen werden, wie sie auch unter Antazolin entstehen. Während es jedoch durch die Antazolininfusion zu einer Erhöhung der aAPD90 um 83 % im Vegleich zur reinen Acetylcholin- und Isoproterenol-Wirkung kam, stieg die aAPD90 durch Ivabradin nur um 12%. Ähnliche Unterschiede zeigen sich auch hinsichtlich der effektiven Refraktärzeit. Unter Antazolin stieg diese um 114%, unter Ivabradin nur um 36%. 5.6 Limitationen der Studie Diese experimentelle Studie beinhaltet sowohl Untersuchungen auf Vorhofebene als auch auf ventrikulärer Ebene, die an isolierten Kaninchenherzen durchgeführt wurden. Dieses Modell wurde gewählt, da das Aktionspotential der Herzmuskelzellen vom Kaninchen gut vergleichbar mit dem des Menschen ist. Dies ist vor allem durch die ausgeprägte Plateauphase in beiden Spezies gekennzeichnet [4], welche beispielsweise bei Mäusen in dieser Weise nicht vorkommt. Unterschiede bestehen jedoch in der Verteilung der an der Repolarisation beteiligten Ionenströme. Während beim Kaninchen überwiegend IKr-Ströme von Bedeutung sind, überwiegen beim Mensch Ladungsverschiebungen durch IKs [175]. In den Vorhöfen hat darüber hinaus der Ionenstrom Ito beim Kaninchen eine andere Kinetik als beim Menschen und dem humanen Ionenkanal IKur steht ISus beim Kaninchen gegenüber [229]. Des Weiteren wurden lediglich junge Tiere verwendet, die im Rahmen einer durchgeführten Allgemeinuntersuchung keine Hinweise auf vorliegende Herz-Kreislauf-Erkrankungen zeigten, was einen weiteren limitierenden Faktor darstellt. Viele Arrhythmien, insbesondere Vorhofflimmern, entstehen gehäuft nach strukturellen Umbauprozessen im Herzen und treten mit steigender Prävalenz im höheren Lebensalter auf. Ob Antazolin in diesem Zusammenhang eine effektive und sichere antiarrhyhtmische Wirkung hat, war nicht Gegenstand dieser Studie und muss in weiteren Arbeiten getestet werden. Darüber hinaus konnten aufgrund der Größenverhältnisse am Kaninchenherzen lediglich acht Ableitungen platziert werden, davon sieben epikardial und nur eine endokardial, somit muss insbesondere die Beurteilung der transmuralen Dispersion kritisch bewertet werden. 89 Weiterhin wurde die QT-Zeit der ventrikulären Versuchsreihen manuell bestimmt, was ein großes Fehlerpotential verursacht. Die Messung wurde jedoch ausschließlich von mir selbst vorgenommen, sodass sich diese Fehlerquelle auf ein Minimum reduzieren ließ. In den Versuchen auf Vorhofebene wurden Acetylcholin und Isoproterenol zusammen mit hochfrequenten Burstsstimulationen verwendet, um Vorhofflimmern zu provozieren. Da es möglich ist, dass diese Substanzen in Wechselwirkung mit den getesteten Wirkstoffen treten und so die elektrophysiologischen Parameter verändert werden, müssen weitere Studien zur Beurteilung von Antazolin in anderen Modellen folgen, beispielsweise in Herzinsuffizienzmodellen oder Modellen, in denen Flimmerepisoden durch Dehnungsreize der Vorhöfe induziert werden. Gerade im Hinblick auf die Versuche mit Vernakalant, Flecainid und Ivabradin wurden die Versuchszahlen gering gehalten, da keine grundlegenden neuen Erkenntnisse zu den Eigenschaften dieser Wirkstoffe erlangt werden sollten, sondern diese lediglich zu Vergleichen mit der Wirkung unter Antazolin herangezogen wurden. Die statistische Aussagekraft dieser Versuche muss also als eingeschränkt betrachtet werden. Es können durch diese Studie nur Aussagen zu den gemessenen Parametern wie APD90, ERP, aPRR, Überleitungszeiten und zu den Häufigkeiten von Arrhythmieereignissen gemacht werden, nicht jedoch zu den grundlegenden molekularen Mechanismen. Dies muss Bestandteil weiterer experimenteller molekularbiologischen Arbeiten sein. Ob Antazolin eine mögliche antiarrhythmische Therapie im Falle von Vorhofflimmern beim Hund, welches vor allem beim Irischen Wolfshund und im Zusammenhang mit der dilatativen Kardiomyopahtie vorkommt, kann mit dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden. Die in diesem Modell verwendeten Kaninchenherzen unterscheiden sich in den zugrunde liegenden Ionenbewegungen und den daraus resultierenden Ergebnissen vom Hundeherz. 5.7 Ausblick In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das Antihistaminikum Antazolin einen ausgeprägten antiarrhyhtmischen Effekt sowohl auf ventrikulärer als auch auf Vorhofebene hat. So wurde die Entstehung von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes im Zusammenhang mit erworbenen langen QT-Syndrom, durch Antazolin signifikant gehemmt. Dies kann auch auf Vorgänge im Verlauf von angeborenen QT-Verlängerungen im Zusammenhang mit dem LQT2 und LQT3 übertragen werden. Ausstehend sind noch weitere Untersuchungen hinsichtlich angeborener genetischer Veränderungen, die zu einer Repolarisationsverlängerung führen können. Durch diese Studien wäre zu erfahren, ob auch in diesen Modellen Antazolin antiarrhythmisch wirkt. Außerdem sind weitere Kombinationsversuche mit proarrhythmisch wirkenden Substanzen nötig, um auch in diesen Fällen 90 herauszufinden, ob eine eventuelle begleitende Therapie mit Antazolin die möglichen Nebenwirkungen anderer Medikamente, wie lebensgefährliche Tachyarrhythmien, senken kann. Darüber hinaus sollten weitere Versuche mit Antazolin in Herzinsuffizienzmodellen erfolgen, um zu entscheiden, ob Antazolin eine Therapieoption darstellt, wenn strukturelle Herzerkrankungen vorliegen. Dies könnte insbesondere im Hinblick auf die Therapieoptionen von Vorhofflimmern von entscheidender Bedeutung sein, da viele häufig eingesetzte Substanzen nicht im Falle von strukturellen Herzerkrankungen geeignet sind. Mit großer Spannung können die Ergebnisse der gerade in Polen laufenden AnPAFStudie erwartet werden, in der die klinische Effizienz von Antazolin im Falle von paroxysmalem Vorhofflimmern gezeigt werden soll. Positive Ergebnisse würden einen weiteren Fortschritt in der Akzeptanz von Antazolin als Antiarrythmikum bedeuten und den bisherigen jahrelangen Einsatz in Polen rechtfertigen. Dabei kommt Antazolin nicht nur für die Behandlung von spontan auftretenden Vorhofflimmerepisoden in Betracht, sondern auch zur Behandlung von während Katheterablationen auftretendem Vorhofflimmern. Aufgrund der schnellen Anflutung, der kurzen Wirkungsdauer und geringen Nebenwirkungen, könnte eine bisherig zum Teil nötige Kurznarkose zur Durchführung einer Elektrokardioversion nicht mehr nötig sein. Diese Studie sollte auch für die Veterinärmedizin einen Beitrag leisten. Insbesondere bezogen auf die Problematik der dilatativen Kardiomyopathie, die häufig mit dem Auftreten von schlecht therapierbarem Vorhofflimmern einhergeht, kann Antazolin ein mögliches Medikament sein, welches im Stande ist dies zuverlässig zu minimieren. Momentan wird das Vorhofflimmern in der Kleintiermedizin kaum spezifisch behandelt, da die Ergebnisse unbefriedigend sind. Es wird vielmehr versucht die dadurch entstehenden hohen Herzfrequenzen mit Digoxin, Atenolol, Esmolol oder Sotalol sowie Diltiazem zu senken, was zu lebensbedrohlichen AV- Blöcken und Arrhythmien insbesondere durch Sotalol führen kann. Es müssen jedoch weitere experimentelle Untersuchungen am Kleintiermodell erfolgen, um die Ergebnisse dieser Arbeit für Hund und Katze eventuell bestätigen zu können. Im Gegensatz zum Kleintier wird in der Pferdemedizin Vorhofflimmern zwar spezifisch mit dem Alkaloid Chinidinsulfat behandelt. Allerdings sind die Erfolgsraten verbesserungswürdig und die Anwendung zum Teil mit großen Nebenwirkungen, wie beispielsweise der Entstehung von Torsaden und ventrikulären Tachykardien verbunden [230]. Auch in diesem Bereich stellt die Anwendung von Antazolin eventuell eine wesentlich erfolgreichere Therapieoption dar und sollte weiter untersucht werden. Wenngleich in der Veterinärmedizin keine genetischen Erkenntnisse hinsichtlich des angeborenen QT- Syndromes im Gegensatz zum Menschen bestehen, so lässt sich doch aufgrund der hohen Raten von plötzlichen Todesfällen, die momentan noch als 91 idiopathisch gelten, eine genetische Beteiligung von Veränderungen Repolarisation durch Mutationen in den nötigen Ionenkanälen vermuten. der Beispielsweise konnte in den USA ein Bestand von deutschen Schäferhunden aufgebaut werden, die im Vergleich zur Kontrollgruppe unter der Behandlung von Sotalol zur vermehrten Entstehung von Tachyarrhythmien neigen. In zellulären Untersuchungen zeigten sich Veränderungen, die mit dem angeborenen LQTSyndrom aufgrund von Veränderungen des Ionenstromes IKs mit denen des Menschen vergleichbar sind [231]. Somit können solche angeborenen Veränderungen eine grundlegende Ursache für das Auftreten von lebensbedrohlichen Arrhythmien, in deren Folge es zum plötzlichen Herztod kommt auch in der Veterinärmedizin sein. Wenn die Forschung hinsichtlich dieser Veränderungen auch in der Tiermedizin weiter fortgeschritten ist, kann auch hier Antazolin zukünftig eine Behandlungsmöglichkeit darstellen. Auch der Einsatz von Antazolin als Begleitmedikation während der Anwendung von Sotalol in der Kardiologie oder von Erythromycin zur Behandlung bakterieller Infektionen könnte zukünftig in der Veterinärmedizin eine Rolle spielen, insbesondere wenn zeitgleich Elektrolytveränderungen wie eine Hypokaliämie vorliegen. 92 6. Zusammenfassung Sterneberg, Magdalena: Experimentelle Untersuchungen zur antiarrhythmischen Wirkung von Antazolin am isolierten Kaninchenherzen Hintergrund und Ziel der Arbeit: Das Auftreten lebensgefährlicher Arrhythmien kann sowohl im Tierreich als auch in der Humanmedizin zu plötzlichen Todesfällen führen. Eine besondere Bedeutung hierbei kommt polymorphen Tachyarrhythmien vom Torsade de Pointes-Typ zu, welche infolge einer Verlängerung der QT-Zeit aufgrund verschiedener Medikationen auftreten können. Ebenso stellt die Therapie des Vorhofflimmerns als häufigste Arrhythmieform mit zunehmender Tendenz noch immer ein Problem dar. Das Antihistaminikum Antazolin zeigte in klinischen humanmedizinischen Arbeiten bereits eine starke antiarrhythmische Wirkung bei unterschiedlichen Arrhythmien, allerdings fehlen bisher grundlegende experimentelle elektrophysiologische Studien. Ziel dieser Arbeit ist es, die ventrikuläre und atriale antiarrhythmische Wirkung von Antazolin aufzuzeigen, insbesondere im Zusammenhang mit proarrhythmisch wirkenden Substanzen und die grundlegenden elektrophysiologischen Mechanismen darzulegen. Methoden und Ergebnisse: Untersuchungen auf ventrikulärer Ebene: Es wurden herzgesunden weiblichen Neuseelandkaninchen die Herzen entnommen und in der Langendorff-Apparatur retrograd perfundiert. Die ventrikulären monophasischen Aktionspotentiale wurden über acht epi- und endokardiale Katheter abgeleitet und anschließend ausgewertet. Dafür wurde nach der Herstellung des AVBlockes in Zykluslängen zwischen 900ms und 300ms stimuliert. Die Applikation der IKr-Blocker Sotalol (100µM) und Erythromycin (300µM) sowie Veratridin (0,5µM) als Inhibitor der Natriumkanal-Inaktivierung führten zu einer signifikanten Verlängerung der APD90, der QT-Zeit und zu einer erhöhten Dispersion der Repolarisation. Diese provozierte während der hypokaliämischen Versuchsphase das Auftreten früher Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes. Durch die zusätzliche Infusion von Antazolin (20µM) konnten diese jedoch deutlich unterdrückt werden. Ausschlaggebend dafür war die signifikante Reduktion der Dispersion, wohingegen die APD90 und die QT-Zeit durch Antazolin weiter verlängert wurden. Untersuchungen auf Vorhofebene: Auch in den atrialen Versuchsreihen wurden die Herzen von gesunden weiblichen Neuseelandkaninchen in der Langendorff-Apparatur verwendet. Die atrialen monophasischen Aktionspotentiale wurden an jeweils zwei Stellen des linken und rechten 93 Vorhofes abgeleitet. Es erfolgten Stimulationen bei einer Zykluslänge von 350ms, 250ms und 150ms. Durch die Zugabe einer Acetylcholin-Isoproterenol-Kombinationslösung (1µM/1µM) zum Perfusat wurde die aAPD90, aERP und die aPRR signifikant verkürzt und das Auftreten von atrialen Flimmerepisoden deutlich gesteigert. Die zusätzliche Infusion von Antazolin (20µM) im weiteren Versuchsablauf konnte das Auftreten von Vorhofflimmern wieder deutlich reduzieren. Die elektrophysiologischen Grundlagen dafür waren eine Umkehr der Wirkung durch Acetylcholin und Isoproterenol. So wurden die aAPD90, aERP, aPRR und die Überleitungszeit durch Antazolin wieder signifikant verlängert. In weiteren Versuchsreihen wurde das Versuchsprotokoll mit weiteren antiarrhythmisch wirkenden Substanzen wie Vernakalant (10µM), Flecainid (2µM) und Ivabradin (3µM) anstelle von Antazolin wiederholt. Keiner der genannten Antiarrhythmika konnte jedoch die Inzidenz von Vorhofflimmern unter Acetylcholin und Isoproterenol so stark hemmen wie Antazolin. Als Ursachen können die unter Antazolin ausgeprägteren Veränderungen der elektrophysiologischen Parameter gesehen werden. Schlussfolgerung: Antazolin hemmt sowohl im Modell des LQT2-Syndromes, ausgelöst durch Sotalol und Erythromycin, als auch im Modell des LQT3-Syndromes, ausgelöst durch Veratridin, effektiv die Entstehung von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes. Ursächlich dafür kann die starke Verringerung der totalen Dispersion der Repolarisation gesehen werden. Darüber hinaus ist Antazolin in der Lage, die mit Acetylcholin und Isoproterenol gesteigerte Prävalenz von Vorhofflimmern effektiv zu verringern. Im Vergleich mit anderen wirksamen Substanzen, die zur Therapie von atrialem Flimmern eingesetzt werden, wie Vernakalant, Flecainid und Ivabradin, zeigt Antazolin eine deutlich stärkere Effektivität. Dabei spielt insbesondere eine Verlängerung der aAPD 90, der aERP, der Überleitungszeit und der aPRR eine entscheidende Rolle. 94 7. Summary Sterneberg, Magdalena: Experimental analysis of the antiarrhythmic properties of antazoline in isolated rabbit hearts Background and Aim of the study: The incidence of life-threatening arrhythmias can result in sudden cardiac death, both in veterinary and human medicine. Polymorphic ventricular tachyarrhythmias of the torsades de pointes-type, which can appear because of different medications leading to a prolongation of the QT-interval, represent an important proarrhythmic mechanism. Pharmacologic therapy of atrial fibrillation, the most common arrhythmia, remains a challenge. The antihistamine antazoline already indicated strong antiarrhythmic properties in different clinical studies, but basic experimental and electrophysiological studies are not available. The aim of this study was to show the atrial and ventricular antiarrhythmic effects of antazoline particulary in relation to proarrhythmic medications and to present the fundamental electrophysiological mechanisms. Methods and Results: Model of ventricular arrhythmias: Hearts of female New Zealand-rabbits were retrogradely perfused using the Langendorff-apparatus. Ventricular monophasic action potentials were recorded by eight endo- and epicardial catheters and analyzed afterwards. Hearts were stimulated in cycle lengths between 900 and 300ms after mechanical induction of atrioventricular block. The application of the IKr-inhibitors sotalol (100µM) and erythromycin (300µM) as well as veratridine (0,5µM), an inhibitor of sodium channel inactivation, resulted in a significant prolongation of APD90, QT- interval and spatial dispersion of repolarization. This resulted in occurence of early afterdepolarizations and torsades de pointes after lowering of potassium concentration. These arrhythmias were significantly reduced by the additional use of antazoline (20µM). The underlying electrophysiological mechanisms for this, were the significant reduction of the total dispersion whereas the APD90 and the QT-interval increased further with antazoline. Model of atrial fibrillation: Again, hearts of healthy female New Zealand-rabbits were retrogradely perfused in the Langendorff-apparatus. Atrial monophasic action potential was recorded at two areas both at the left and the right atrium. We stimulated in cylce lengths of 350ms, 250ms and 150ms. The addition of acetylcholine and isoproterenol (1µM/1µM) resulted in a significant reduction of aAPD90, aERP and of aPRR and in an increased occurrence of atrial fibrillation. The further infusion of antazoline (20µM) resulted in a complete 95 elimination of atrial fibrillation. The underlying electrophysiological mechanisms were the reversal of the effect of acetylcholine and isoproterenol. Thus, Antazoline significantly prolonged aAPD90, aERP, aPRR and interatrial conduction time. In further test series, the study protocol was repeated with other antiarrhythmic agents like vernakalant (10µM), flecainide (2µM) and ivabradine (3µM) instead of antazoline. None of the mentioned antiarrhythmics was able to reduce the incidence of atrial fibrillation, with acetylcholine and isoproterenol, as effectively as antazoline. The underlying mechanisms were the more pronounced changes of the electrophysiological parameters with the use of antazoline. Conclusion: Antazoline inhibits the development of ealy afterdepolarizations and torsades de pointes both in the model of the LQT2-syndrome and in the model of the LQT3syndrome. The causal connection for this is the significant reduction of spatial dispersion of repolarization. Moreover, antazoline is able to decrease the incidence of atrial fibrillation, induced by acetylcholine and isoproterenol. In comparison with other antiarrhythmic agents like vernakalant, flecainide and ivabradine, antazoline was more effective. The prolongation of aAPD90, aERP, conduction time and of aPRR play a decisive role in this case. 96 8. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Ventrikuläres Aktionspotential.............................................................. 5 Abbildung 2: Schrittmacherpotential ......................................................................... 6 Abbildung 3: Atriales Aktionspotential ...................................................................... 7 Abbildung 4: Einteilung der kongenitalen QT Syndrome aus: Genetic and Clinical Advances in Congenital Long QT Syndrome ............................................................ 11 Abbildung 5: Repräsentatives Beispiel früher Nachdepolarisationen am isolierten Kaninchenherzen ...................................................................................................... 13 Abbildung 6: Repräsentatives Beispiel einer Torsades de Pointes- Episode am isolierten Kaninchenherzen ...................................................................................... 14 Abbildung 7: Repräsentatives Beispiel einer induzierten Vorhofflimmerepisode am isolierten Kaninchenherzen ...................................................................................... 15 Abbildung 8: Schematische Darstellung der „Leading circle Hypothese“ nach Pandit und Jalife (2013) ....................................................................................................... 17 Abbildung 9: Schematische Darstellung der Entstehung von Rotoren ................... 17 Abbildung 10: Schematische Darstellung eines Rotors (modifiziert aus [105]) ....... 17 Abbildung 11: Strukturformel von Antazolin ............................................................ 20 Abbildung 12: Schema der Langendorff- Versuchsapparatur ................................. 24 Abbildung 13: An der Langendorff- Apparatur befestigtes, isoliertes und retrograd perfundiertes Kaninchenherz .................................................................................... 26 Abbildung 14: Ableitungsstellen der monophasischen Aktionspotentiale ............... 27 Abbildung 15: Schema zum zeitlichen Ablauf der Ventrikelversuche ..................... 29 Abbildung 16: Schematische Darstellung der Messung von APD50 und APD90 ... 33 Abbildung 17: Katheterplatzierung Vorhofversuche ............................................... 35 Abbildung 18: Kaninchenherz an der Langendorff-Anlage nach der Katheterplatzierung .................................................................................................. 35 Abbildung 19: Schema zum zeitlichen Ablauf der Vorhofversuche......................... 36 Abbildung 20: Burststimulation ohne Induktion von Vorhofflimmern ....................... 37 Abbildung 21: Burststimulation mit konsekutiver Induktion von Vorhofflimmern ..... 38 Abbildung 22: Dosisabhängiger Effekt von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) .................................................................................................. 42 Abbildung 23: Zykluslängenabhängiger Effekt von alleiniger Sotalolgabe sowie zusätzlicher Zugabe von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) ................................................................................................................................. 44 Abbildung 24: Zyklusabhängiger Effekt von alleiniger Erythromycingabe sowie zusätzlicher Infusion von Antazolin auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) ...................................................................................................................... 45 Abbildung 25: Sotalolversuche: Effektive Refraktärzeiten (oben) und räumliche Dispersion der Repolarisation (unten) ...................................................................... 48 Abbildung 26: Erythromycinversuche: Effektive Refraktärzeiten (oben) und die räumliche Dispersion (unten) .................................................................................... 49 97 Abbildung 27: EADs und Torsade de Pointes während der hypokaliämischen Phase unter Sotaloleinfluss ................................................................................................. 50 Abbildung 28: Inzidenzen früher Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes während der Versuche mit Sotalol und Antazolin ..................................................... 51 Abbildung 29: Inzidenzen früher Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes in den Versuchen mit Erythromycin und Antazolin ....................................................... 51 Abbildung 30: EADs und TdPs während der hypokaliämischen Phase unter Erythromycineinfluss ................................................................................................ 52 Abbildung 31: Zyklusabhängiger Effekt unter alleiniger Veratridingabe und unter zusätzlicher Antazolinwirkung auf die APD90 (oben) und das QT-Intervall (unten) ... 54 Abbildung 32: Effektive Refraktärzeit nach Gabe von Veratridin und Antazolin..... 55 Abbildung 33: Veratridinversuche: Mittelwerte der Dispersion................................ 56 Abbildung 34: Inzidenzen von frühen Nachdepolarisationen und Torsades de Pointes ..................................................................................................................... 57 Abbildung 35: Repräsentatives Beispiel für Torsades de Pointes unter Veratridineinfluss. Monophasische Aktionspotentiale (links) und EKG (rechts) ....... 57 Abbildung 36: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolin auf die aAPD90 (oben) und die aERP (unten) ....................................................................... 59 Abbildung 37: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolin auf die aPRR ........................................................................................................................ 60 Abbildung 38: Gesamtanzahl der Episoden anhaltenden Vorhofflimmerns unter Acetylcholin, Isoproterenol und Antazolineinwirkung ................................................ 61 Abbildung 39: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, Acetylcholin- Isoproterenol- Wirkung und zusätzlicher Antazolingabe ........................................................................................................... 61 Abbildung 40: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradin auf die aAPD90 (oben) und die aERP (unten) ....................................................................... 63 Abbildung 41: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradin auf die aPRR ........................................................................................................................ 64 Abbildung 42: Gesamtanzahl anhaltender Episoden von Vorhofflimmern unter Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradineinwirkung ................................................ 65 Abbildung 43: Gesamtanzahl von Flimmerepisoden unter Acetylcholin, Isoproterenol und Ivabradineinwirkung ..................................................................... 66 Abbildung 44: Beispielhafte Darstellung einer anhaltenden Flimmerepisode unter Acetylcholin- und Isoproterenoleinwirkung ............................................................... 66 Abbildung 45: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalant auf die aAPD90 ..................................................................................................................... 68 Abbildung 46: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalant auf die aERP und aPRR....................................................................................................... 69 Abbildung 47: Gesamtanzahl anhaltender Phasen von Vorhofflimmern (oben) und Gesamtanzahl der Flimmerepisoden (unten) unter Acetylcholin, Isoproterenol und Vernakalantwirkung .................................................................................................. 70 98 Abbildung 48: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, Acetylcholin-Isoproterenol-Wirkung und zusätzlicher Vernakalantgabe ...................................................................................................... 71 Abbildung 49: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainid auf die aAPD90 ..................................................................................................................... 72 Abbildung 50: Auswirkung von Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainid auf die aERP ........................................................................................................................ 73 Abbildung 51: Gesamtanzahl anhaltender Phasen von Vorhofflimmern (oben) und Gesamtanzahl der Flimmerepisoden (unten) unter Acetylcholin, Isoproterenol und Flecainideinwirkung .................................................................................................. 74 Abbildung 52: Beispielhafte Darstellung der Ableitungen unter Ausgangsbedinungungen, Acetylcholin-Isoproterenol-Wirkung und zusätzlicher Flecainidgabe ........................................................................................................... 75 99 9. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Zusammensetzung der verwendeten Krebs-Henseleit-Lösung ............... 25 Tabelle 2: Einfluss von Antazolin auf die APD90 und das QT-Intervall nach der Behandlung mit Sotalol oder Erythromycin ............................................................... 46 Tabelle 3: Einfluss von Antazolin auf die APD90 und das QT- Intervall unter der Behandlung mit Veratridin ........................................................................................ 53 Tabelle 4: Übersicht über die Inzidenz von Vorhofflimmern unter Ausgangsbedingungen, Acetylcholin/Isoproterenol- und zusätzlicher Vernakalantinfusion ................................................................................................................................. 68 100 10. Literaturverzeichnis [1] Zipes DP, Wellens HJJ.: Sudden cardiac death. In: Circulation 98 (1998) S. 23342351 [2] Westling J, Westling W, Pyle RL: Epidemiology of Atrial Fibrillation in the Dog. In: Intern J Appl Res Vet Med 6(3) (2008), S.151-154 [3] Chugh SS, Roth GA, Gillum RF, Mensah GA: Global Burden of Atrial Fibrillation in Developed and Developing Nations (2014). In: Glob Heart 9(1) (2014), S.113-119 [4] Eckardt L, Haverkamp W, Borggrefe M, u.a.: Experimental models of torsade de pointes. In: Cardiovasc Res 39 (1998), S.178-193 [5] Vella D, Donnelly TM: Cardiovascular System In: Ferrets, Rabbits and Rodents Clinical Medicine and Surgery (2012). ELSEVIER, Kapitel 12 [6] Ewringmann A: Leitsymptome beim Kaninchen 2. Auflage (2010), Enke Verlag; S.10 [7] Pariaut, R: Cardiovascular physiology and diseases of the rabbit. In: Vet. Clin. Exot. Anim. 12 (2009), S.135-144 [8] Suckow A, Stevens KA, Ronald PW: The Laboratory Rabbit, Guinea Pig, Hamster and Other Rodents (2012), ELSEVIER S. 207 [9] Harmeyer J: Herzmechanik In: v. Engelhardt W., Breves G. Physiologie der Haustiere (2000). Enke Verlag, S. 139 [10] Fraser M, Girling SJ: Rabbit Medicine and Surgery for Veterinary Nurses (2009) WILEY- BLACKWELL Verlag, S. 22-23 [11] Cruise LJ, Brewer NR: Anatomy In: v. Manning PJ, Ringler DH, Newcomer CE: The Biology of the Laboratory Rabbit (1994), S. 56-57 [12] James T: Anatomy of the Cardiac Conduction System in the Rabbit. In: Circ. Res. 20, S. 638-648 [13] Keating MT, Sanguinetti MC: Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiac Arrythmias. In: Cell 104 (2001), S. 569-580 [14] Brown AM: Cardiac Potassium Channels in Health and Disease. In: Elsevier Science Inc. Vol 7 No 4 (1997), S. 1050-1738 [15] Roden DM, Balser JR, George Jr AL, u.a.: Cardiac Ion Channels. In: Annu Rev Physiol 64 (2002), S. 431-475 101 [16] Wahler GM: Cardiac Action Potentials In: v. Kurachi Y, Terzic A, Cohen MV: Heart Physiology and Pathophysiology (2000). Academic Press, S. 3-7 [17] Harmeyer J: Bau und Funktion des Herzens. In: v. Engelhardt W, Breves G, Physiologie der Haustiere (2000). Enke Verlag, S.138 [18] Harmeyer J: Elektrische Vorgänge im Herzmuskel. In: v. Engelhardt W, Breves G, Physiologie der Haustiere (2000). Enke Verlag, S.144-145 [19] Antzelevitch C: Electrical heterogeneity, cardiac arrhythmias, and the sodium channel. In: Circ. Res. 87 (2000), S. 964-65 [20] Kannankeril PJ, Roden DM: Drug- induced long QT and torsade de pointes: recent advances. In: Curr. Opin. Cardiol. 22 (2007), S. 39-43 [21] Monsuez JJ: Cardiac potassium currents and channels- Part ι: Basic science aspects. In: Int. J. Cardiol. 67 (1997), S. 209-219 [22] Boyett MR, Harrison SM, Janvier NC u.a.: A list of vertebrate cardiac ionic currents- Nomenclature, properties, function and cloned equivalents. In: Cardiovasc. Res. 32 (1996), S. 455-481 [23] Bers DM: Cardiac excitation-contraction coupling. In: Nature 415 (2002), S. 198– 205 [24] Fedida D, Giles WR: Regional variations in action potentials and transient outward current in myocytes isolated from rabbit left ventricle. In: J Physiol (Lond) 442 (1991), S. 191-209 [25] Shih HT: Anatomy of the Action Potential in the Heart. In: Texas Heart Institute Journal 21 (1994), S. 30-41 [26] Sanguinetti MC, and Jurkiewicz NK: Two components of cardiac delayed rectifier K+ current: differential sensitivity to block by class-III antiarrhythmic agents. In: J. Gen. Physiol. 96 (1990), S. 195-215 [27] Gintant GA: Two components of delayed rectifier current in canine atrium and ventricle: does IKs play a role in the reverse rate dependence of class 3 agents? In: Circ. Res. 78 (1996), S. 26-37 [28] Salama G, Brett GCL: Sex differences in the mechanisms underlying long QT syndrome. In: Physiol. Heart Circ. Physiol. 307 (2014), S. H640- H648 [29] Roden DM: Long QT syndrome: reduced repolarization reserve and the genetic link. In: J Intern Med 259 (2006), S. 59-69 [30] Brunner u.a.: Mechanisms of cardiac arrhythmias and sudden death in transgenic rabbits with long QT syndrome. In: J. Clin. Invest. 118(6) (2008), S. 2246-2259 102 [31] Sanguinetti MC, Tristani-Firouzi M: hERG potassium channels and cardiac arrhythmia. In: Nature 440 (2006), S. 463–469 [32] Roden DM: Mechanisms and management of proarrhythmia. In: Am. J. Cardiol. 82 (1998), S. 491–571 [33] Riera ARP, Uchida AH u.a.: Relationship among amiodarone, new class 3 antiarrhythmics, miscellaneous agents and acquired long QT syndrome. In: Cardiology Journal 15 (3) (2008), S. 209-219 [34] Philipsen KD, Nicoll DA, Ottolia M, u.a.: The Na+/Ca2+ exchange molecule: an overview. In: Ann. N. Y. Acad. Sci. 976 (2002), S. 1-10 [35] Boyett MR: ´And the beat goes on` The cardiac conduction system: the wiring system of the heart. In: Experimental Physiology 94.10 (2009), S. 1035-1049 [36] DiFrancesco D: A study of the ionic nature of the pace- maker current in calf Purkinje fibres. In: J. Physiol. 314 (1981), S. 377-393 [37] Brown HF, DiFrancesco D, Noble SJ: How does adrenaline accelerate the heart? In: Nature 280 (1979), S. 235-236 [38] DiFrancesco D: The Role of the Funny Current in Pacemaker Activity. In: Circ. Res. 106 (2010), S. 434-446 [39] Bucchi A, Baruscotti M, Robinson RB, DiFrancesco D: Modulation of rate by autonomic agonists in SAN cells involves changes in diastolic depolarization and the pacemaker current. In: J. Mol. Cell. Cardiol. 43 (2007), S. 39-48 [40] Hagiwara N, Irisawa H, Kameyama M: Contribution of two types of calcium currents to the pacemaker potentials of rabbit sino-atrial node cells. In: J. Physiol. 395 (1988) S. 233-253 [41] Nerbonne JM, Kass RS: Molecular Physiology of Cardiac Repolarization. In: Physiol. Rev. 85 (2005), S. 1213 [42] Harmeyer J: Elektrische Vorgänge im Herzmuskel. In: v. Engelhardt W, Breves G: Physiologie der Haustiere (2000), Enke Verlag, S. 143 [43] Hatem SN, Coulombe A, Balse E: Specifities of atrial electrophysiology: Clues to a better understanding of cardiac function and the mechanisms of arrhythmias. In: Journal of Molecular and Cellular Cardiology 48 (2010), S. 90-95 [44] Ouadid H, Seguin J, Dumuis A, Brockaert J, Nargeot J: Serotonin increases calcium current in human atrial myocytes via the newly described 5hydroxytryptamine4 receptors. In: Mol Pharmacol 41(2) (1992), S. 346-351 103 [45] Rivet- Bastide M, Vandecasteele G, Hatem S, Verde I, Bernadeau A, Mercadier JJ, u.a.: cGMP- stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase regulates the basal calcium current in human atrial myocytes. In: J Clin Invest 99(11) (1997) S. 2710-2718 [46] Vandecasteele G, Verde I, Rucker- Martin C, Donzeau- Gouge P, Fischmeister R: Cyclic GMP regulation of the L- type Ca2+ channel current in human atrial myocytes. In: J Physiol 533 (Pt2) (2001), S. 329-340 [47] Van Wagonor DR, Pond AL, Lamorgese M, Rossie SS, McCarthy PM, Nerbonne JM: Atrial L- type Ca2+ currents in human atrial fibrillation. In: Circ Res 85(5) (1999), S. 428-436 [48] Le Grand BL, Hatem S, Deroubaix E, Couetil JP, Coraboeuf E: Depressed transient outward and calcium currents in dilated human atria. In: Cardiovasc Res 28(4) (1994), S. 548-556 [49] Boutjdir M, Le Heuzey JY, Lavergne T, Chauvaud S, Guize L, Carpentier A, u.a.: Inhomogenity of cellular refracoriness in human atrium: factor of arrhythmia? In: Pacing Clin Electrophysiol 6(2) (1986), S. 1095-1100 [50] Hüser J, Wang YG, Sheehan KA, Cifuentes F, Lipsius SL, Blatter LA: Functional coupling between glycolysis and excitation- contaction coupling underlies alternans in cat heart cells. In: J Physiol 524.3 (2000), S. 795-806 [51] Zygmunt AC, Gibbons WR: Properties of the calcium-activated chloride current in heart. In: J Gen Physiol 99 (1992), S. 391-414 [52] Feng J, Xu D, Wang Z, Nattel S: Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences. In: Am J Physiol 275(5) (1998), S. H1717-H1725 [53] Wang Z, Fermini B, Nattel S: Rapid and slow components of delayed rectifier current in human atrial myocytes. In: Cardiovasc Res 28 (1994), S. 1540-1546 [54] Wible BA, De Biasi M, Majumder K, Taglialatela M, Brown AM: Cloning and functional expression of an inwardly rectifying K+ channel from human atrium. In: Circ Res 76(3) (1995), S. 343-350 [55] Heidbuchel H, Vereecke J, Carmeliet E: Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance. In: Circ Res 66(5) (1990), S.1277-1286 [56] Moise NS u.a.: Inherited ventricular arrhythmias and sudden death in german shepherd dogs. In: J. Am. Coll. Cardiol. 24 (1994), S. 233-243 104 [57] Hyun C, Filippich LJ: Molecular genetics of sudden cardiac death in small animalsa review. In: The Veterinary Journal 171 (2006), S. 39-50 [58] Antzelevitch C: Role of transmural dispersion of repolarization in the genesis of drug-induced torsades de pointes. In: Heart Rhythm 2 (2005), S. 9-15 [59] Antzelevitch C: Role of spatial dispersion of repolarization in inherited and acquired sudden cardiac death syndromes. In: Am J Physiol Heart Circ Physiol 293 (2007), S. H2024-H2038 [60] Xia Y, Liang Y, Kongstad O, u.a.: In vivo validation of the coincidence of the peak and end of the T wave with full repolarization of the epicardium and endocardium in swine. In: Heart Rhythm 2 (2005), S. 162-169 [61] Xiao L, Xiao J, u.a.: Feedback Remodeling of Cardiac Potassium Current Expression: A Novel Potential Mechanism for Control of Repolarization Reserve. In: Circ. Res. 118 (2008), S. 983-992 [62] Numaguchi H, Johnson JP Jr, Petersen Cl, Balser JR: A sensitive mechanism for cation modulation of potassium current. In: Nat. Neurosci. 3 (2000), S. 429-430 [63] Yang T, Synders DJ, Roden DM: Rapid inactivation determines the rectification and K+ dependence of the rapid component of the delayed rectifier K+ current in cardiac cells. In: Circ. Res. 80 (1997), S. 782-789 [64] Roden DM: Taking the “idio” out of “idiosyncratic”: predicting torsades de pointes. In: Pacing Clin Electrophysiol 21 (1998), S. 1029-1034 [65] Lazzara R: Amiodarone and torsades de pointes. In: Ann. Int. Med. 111 (1989), S. 549-551 [66] Frommeyer G, Milberg P: A new mechanism preventing proarrhythmia in chronic heart failure: rapid phase-III repolarization explains the low proarrhythmic potential of amiodarone in contrast to sotalol in a model of pacing-induced heart failure. In: European Journal of Heart Failure 13.10 (2011), S. 1060-1069 [67] Yamaguchi M, Shimizu M, Ino H, u.a.: T wave peak-to-end interval and QT dispersion in acquired long QT syndrome: a new index for arrhythmogenicity. In: Clin Sci (Lond) 105 (2003), S. 671-676 [68] Mönnig G, Eckardt L, Wedekind H, u.a.: Electrocardiographic risk stratification in families with congenital long qt syndrome. In: Eur Heart J 27 (2006), S. 2074-2080 [69] Bazett HC: An analysis of the time- relation of electrocardiograms. In: Heart 7 (1920), S. 353-370 105 [70] Priori SG, Schwartz PJ, Napolitano C, Bloise R, Rochetti E, Grillo M, Vincentini A, Spazzolini C, Nastoli J, Bottelli G, Folli R, Cappelletti D: Risk stratification in the long QT syndrome. In: N Engl J Med 348 (2003), S. 1866- 1874 [71] Tester DJ, Ackerman MJ: Genetics of Long QT syndrome. In: Methodist Debakey Cardiovasc J 10 (2014), S. 29-33 [72] Arizona Center for Education and Research on Therapeutics: QT Drug Lists. Available at: www.qtdrugs.org. Accessed: March 25, (2012) [73] Goldenberg I, Zareba W, Moss AJ: Long QT syndrome. In: Curr Probl Cardiol 33 (2008), S. 629-694 [74] Mizusawa Y, Horie M, Wilde AM: Genetic and Clinical Advances in Congenital Long QT Syndrome. In: Circulation Journal 78 (2014), S. 2827-2833 [75] Schwartz PJ, Priori SG, Spazzolini C, Moss AJ, Vincent GM, Napolitano C, u.a.: Genotype- phenotype correlation in the long- QT syndrome: Gene- specific triggers for life- threatening arrythmias. In: Circulation 1033 (2001), S. 89-95 [76] Wang Q, Shen J, Splawski I, Atkinson D, Li Z, Robinson JL, Moss AJ, Towbin JA, Keating MT: SCN5A mutations associated with an inherited cardiac arrhythmia, long QT syndrome. In: Cell 80 (1995), S. 805–811 [77] Fernandez D, Ghanta A, Kauffman GW, Sanguinetti MC: Physicochemical features of the HERG channel drug binding site. In: J Biol Chem 279 (2004), S. 10120– 10127 [78] Milberg P, Ramtin S, Mönnig G, u.a.: Comparison of the in vitro electrophysiologic and proarrhythmic effects of amiodarone and sotalol in a rabbit model of acute atrioventricular block. In: J Cardiocasc Pharmacol 44 (2004), S. 278-286 [79] McComb JM, Campbell NP, Cleland J: Recurrent ventricular tachycardia associated with QT prolongation after mitral valve replacement and association with intravenous administration of erythromycin. In: Am J Cardiol 54 (1984), S. 922-923 [80] Stanat SJ, Carlton CG, Crumb WJ Jr., Agrawat KC, Clarkson CW: Characterization of the inhibitory effects of erythromycin and carithromycin on the HERG potassium channel. In: Moll Cell Biochem 254 (2003), S. 1-7 [81] Milberg P, Reinsch N, Wasmer K, u.a.: Transmural dispersion of repolarization as a key factor of arrhythmogenicity in a novel intact heart model of LQT3. In: Cardiovasc Res 65 (2005), S. 397-404 [82] Cranefield PF: Action potentials, afterpotentials, and arrhythmias. In: Circ Res 41 (1977), S. 415-423 106 [83] Volders PGA, Vos MA, Szabo B, u.a.: Progress in the understanding of cardiac early afterdepolarizations and torsades de pointes: time to revise current concepts. In: Cardiovasc Res 46 (2000), S. 376-392 [84] Liu GX, Choi BR, Ziv O, LiW, de Lange E, Qu Z u.a.: Differential conditions for early after-depolarizations and triggered activity in cardiomyocytes derived from transgenic LQT1 and LQT2 rabbits. In: J Physiol 590 (2012), S. 1171-1180 [85] Kay GN, Plumb VJ, Arciniegas JG, u.a.: Torsade de pointes: the long-short initiating sequence and other clinical features: observations in 32 patients. In: J Am Coll Cardiol 2 (1983), S. 806-817 [86] Qu Zhilin u.a.:Early afterdepolarizations in cardiac myocytes: beyond reduced repolarization reserve. In: Cardiovasc Res 99 (2013), S. 6-15 [87] Damiano BP, Rosen MR: Effects of pacing on triggered activity induced by early afterdepolarizations. In: Circulation 69 (1984), S. 1013-1025 [88] Zeng J, Rudy Y: Early afterdepolarizations in cardiac myocytes: mechanism and rate dependence. In: Biophys J 68 (1995), S. 949-964 [89] Viswanathan PC, Rudy Y: Pause induced early afterdepolarizations in the long QT syndrome: a simulation study. In: Cardiovasc Res 42 (1999), S. 530-542 [90] Milberg P, Pott C, Fink M, Frommeyer G, Matsuda T, Baba A, Osada N, Breithardt G, Noble D, Eckardt L: Inhibition of the Na_/Ca2_ exchanger suppresses torsades de pointes in an intact heart model of long QT syndrome-2 and long QT syndrome-3. In: Heart Rhythm 5 (2008), S. 1444-1452 [91] Dessertenne F: La tachycardie ventriculaire à deux foyers, opposés variables. In: Arch Mal Coer 59 (1966), S. 263-272 [92] Lazzara R: Twisting of the points. In: J. Am. Coll. Cardiol. 29 (1997), S. 843-845 [93] Sclarovsky S. Strasberg B, Lewin RF, Agmon J: Polymorphous ventricular tachycardia: clinical features and treatment. In: Am J Cardiol 44 (1979), S. 339-345 [94] Keren A, Tzivoni D, Gavish D u.a.: Etiology, warning signs and therapy of torsade de pointes. In: Circulation 64 (1981), S. 1167-1174 [95] Bauman JL, Bauernfeind RA, Hoff JV, Strasberg B, Swiryn S, Rosen KM: Torsades de pointes due to quinidine: observations in 31 patients. In: Am Heart J 107 (1984), S. 425-430 [96] Milberg P, Pott C, Frommeyer G, Fink M, Ruhe M, Matsuda T, Baba A, Klocke R, Quang TH, Nikol S, Stypmann J, Osada N, Müller FU, Breithardt G, Noble D, Eckardt 107 L: Acute inhibition of the Na_/Ca2_ exchanger reduces proarrhythmia in an experimental model of chronic heart failure. In: Heart Rhythm 9(4) (2012), S. 570-578 [97] Soyka LF, Wirtz C, Spangenberg RB: Clinical safety profile of sotalol in patients with arrhythmias. In: Am J Cardiol 65 (1990), S. 74A- 81A [98] Stefan H, Hohnloser MD: Proarrhythmia with Class 3 Antiarrhythmic Drugs: Types, Risks, and Management. In: Am J Cardiol 80 (1997), S. 82G- 89G [99] Haverkamp W, Breithardt G, Camm AJ, u.a.: The potential for qt prolongation and proarrhythmia by non-anti-arrhythmic drugs: clinical and regulatory implications. Report on a policy conference of the european society of cardiology. In: Cardiovasc Res 47 (2000), S. 219-233 [100] Rao MP, Pokorney SD, Granger CB: Atrial fibrillation: a review of recent studies with a focus on those from the duke clinical research institute. In: Scientifica (2014), ID901586 [101] Balouch MA, Kolek MJ, Darbar D: Improved understanding of the pathophysiology of atrial fibrillation through the lens of discrete pathological pathways. In: Global Cardiology Science and Practice 5 (2014), S. 24-36 [102] Weiss JN, Qu Z, Chen PS, Lin SF, Karagueuzian HS, Hayashi H, Garfinkel A, Karma A: The Dynamics of Cardiac Fibrillation. In: Circulation 112 (2005), S. 12321240 [103] Moe G: On the multiple wavelet hypothesis of atrial fibrillation. In: Arch Int Pharmacodyn Ther. 140 (1962), S. 183-188 [104] Allessie MA, Bonke FI, Schopman FJ: Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism of tachycardia. III. The “leading circle” concept: a new model of circus movement in cardiac tissue without the involvement of an anatomical obstacle. In: Circ Res. 41(1) (1977), S. 9-18 [105] Pandit SF, Jalife J: Rotors and the Dynamics of Cardiac Fibrillation. In: Circ Res 112(5) (2013), S. 849-862 [106] Fast VG, Kleber AG: Role of wavefront curvature in propagation of cardiac impulse. In: Cardiovasc Res 33(2) (1997), S. 258-271 [107] Beaumont J, Davidenko N, Davidenko JM, Jalife J: Spiral waves in twodimensional models of ventricular muscle: formation of a stationary core. In: Biophys. J. 75(1) (1998), S. 1-14 [108] Allessie MA, Lammers WJEP, Bonke FIM, Hollen J: Experimental evaluation of Moe’s multiple wavelet hypothesis of atrial fibrillation. In: v. Zipes DP, Jalife J: Cardiac Electrophysiology and Arrhythmias (1985), Grune & Stratton, S. 265-275 108 [109] Pertsov AM, Davidenko JM, Salomonsz R, Baxter WT, Jalife J: Spiral waves of excitation underlie reentrant activity in isolated cardiac muscle. In: Circ Res 72(3) (1993), S. 634-50 [110] Keldermann RH, ten Tusscher KHWJ, Nash MP, Bradley CP, Hren R, Taggart P, Panfilov AV: A computational study of mother rotor VF in the human ventricles. In: Am J Physiol Heart Circ Physiol 296(2) (2009), S. H370-379 [111] Davidenko JM, Kent PF, Chialvo DR, Michaels DC, Jalife J: Sustained vortexlike waves in normal isolated ventricular muscle. In: Proc Natl Acad Sci 87 (1990), S. 8785-8789 [112] Zaitsev AV, Berenfeld O, Mironov SF, Jalife J, Pertsov AM: Distribution of excitation frequencies on the epicardial and endocardial surfaces of fibrillating ventricular wall of the sheep heart. In: Circ Res 86 (2000), S. 408-417 [113] Narayan SM, Krummen DE, Rappel WJ: Clinical mapping approach to diagnose electrical rotors and focal impulse sources for human atrial fibrillation. In: J Cardiovasc Electrophysiol 23(5) (2012), S. 447-454 [114] Jalife J, Berenfeld O, Skanes A, Mandapati R: Mechanisms of atrial fibrillation: mother rotors or multiple daughter wavelets, or both? In: J Cardiovasc Electrophysiol. 9(8) (1998), S. 2-12 [115] Wilhelms M, Hettmann H, Maleckar MM, Koivumäki JT, Dössel O, Seemann G: Benchmarking electrophysiological models of human atrial myocytes. In: Front. Physiol. 3 (2012) S. 487 [116] Van Wagonor DR, Pond AL, McCarthy PM, Trimmer JS, Nerbonne JM: Outward K+ current densities and Kv1.5 expression are reduced in chronic human atrial fibrillation. In: Circ Res 80(6) (1997), S. 772-781 [117] Dobrev D, Wettwer E, Himmel HM, Kortner A, Kuhlisch E, Schüler S, Siffert W, Ravens U: G- Protein beta(3)- subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents. In: Circulation 102(6) (2000), S. 692-697 [118] Voigt N, Trausch A, Knaut M, Matschke K, Varro A, Van Wagonor DR, Nattel S, Ravens U, Dobrev D: Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation. In: Circ Arrhythm Electrophysiol 3(5) (2010), S. 472-480 [119] Noujaim SF, Pandit SV, Berenfeld O, Vikstrom K, Cerrone M, Mironov S, Zugermayr M, Lopatin AN, Jalife J: Upregulation of the inward rectifier K+ current (IK1) in the mouse heart accelerates and stabilizes rotors. In: J Physiol 578 (2007), S. 315326 109 [120] Filgueiras-Rama D, Martins RP, Mironov S, Yamazaki M, Calvo CJ, Ennis SR, Bandaru K, Noujaim SF, Kalifa J, Berenfeld O, Jalife J: Chloroquine terminates stretchinduced atrial fibrillation more effectively than flecainide in the sheep heart. In: Circ Arrhythm Electrophysiol 5(3) (2012), S. 561-570 [121] Donovan KD, Power BM, Hockings BE, Dobb GJ, Lee KY: Intravenous flecainide versus amiodarone for recent-onset atrial fibrillation. In: Am J Cardiol 75 (1995), S. 693-697 [122] Camm AJ, Kirchhof P, Lip GY, Schotten U, Savelieva I, Ernst S, Van Gelder IC, Al-Attar N, Hindricks G, Prendergast B, Heidbuchel H, Alfieri O, Angelini A, Atar D, Colonna P, De Caterina R, De Sutter J, Goette A, Gorenek B, Heldal M, Hohloser SH, Kolh P, Le Heuzey JY, Ponikowski P, Rutten FH, Vahanian A, Auricchio A, Bax J, Ceconi C, Dean V, Filippatos G, Funck-Brentano C, Hobbs R, Kearney P, McDonagh T, Popescu BA, Reiner Z, Sechtem U, Sirnes PA, Tendera M, Vardas PE, Widimsky P, Agladze V, Aliot E, Balabanski T, Blomstrom-Lundqvist C, Capucci A, Crijns H, Dahlof B, Folliguet T, Glikson M, Goethals M, Gulba DC, Ho SY, Klautz RJ, Kose S, McMurray J, Perrone Filardi P, Raatikainen P, Salvador MJ, Schalij MJ, Shpektor A, Sousa J, Stepinska J, Uuetoa H, Zamorano JL, Zupan I: Guidelines for the management of atrial fibrillation: The task force for the management of atrial fibrillation of the european society of cardiology (esc). In: Europace 12 (2010), S. 1360-1420 [123] Fuster V, Ryden LE u.a.: Guidelines for the management of patients with atrial fibrillation-executive summary: a report of the American College of Cardiology/ American Heart Association Task Force on Practice Guidelindes and the European Society of Cardiology Committee for Practice Guidelines. In: J Am Coll Cardiol 48 (2006), S. 854-906 [124] Burashnikov A, Antzelevitch C: How Do Atrial-Selective Drugs Differ From Antiarrhythmic Drugs Currently Used in the Treatment of Atrial Fibrillation? In: J Atr Fibrillation 1(2) (2008), S. 98-107 [125] Burashnikov A, Di Diego JM, Zygmunt AC, Belardinelli L, Antzelevitch C: Atriumselective sodium channel block as a strategy for suppression of atrial fibrillation: differences in sodium channel inactivation between atria and ventricles and the role of ranolazine. In: Circulation 116 (2007), S. 1449-1457 [126] Frommeyer G, Rajamani S, Grundmann F, Stypmann J, Osada N, Breithardt G, Belardinelli L, Eckardt L, Milberg P: New insights into the Beneficial Electrophysiologic Profile of Ranolazine in Heart Failure: Prevention of Ventricular Fibrillation with Increased Postrepolarization Refractoriness and Without Drug-induced Proarrhythmia. In: Journal of Cardiac Failure 18(12) (2012), S. 940-949 110 [127] Bosch RF, Zeng X, Grammer JB, Popovic K, Mewis, Kuhlkamp V: Ionic mechanisms of electrical remodeling in human atrial fibrillation. In: Cardiovasc Res 44 (1999), S. 121-131 [128] Dobrev D, Graf E, Wettwer E, Himmel HM, Hala O, Doerfel C, Christ T, Schuler S, Ravens U: Molecular basis of downregulation of G-protein- coupled inward rectifying K(+) current I(K, Ach) in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced I(K, Ach) and muscarinic receptor- mediated shortening of action potentials. In: Circulation 104 (2001), S. 2551-2557 [129] Dobrev D, Friedrich A, Voigt N, Jost N, Wettwer E, Christ T, Knaut M, Ravens U: The G Protein- Gated Potassium Current IK- Ach Is Constitutively Active in Patients With Chronic Atrial Fibrillation. In: Circulation 112 (2005), S. 3697-3706 [130] Cha TJ, Ehrlich JR, Chartier D, Qi XY, Xiao L, Nattel S: Kir3-based inward rectifier potassium current: potential role in atrial tachycardia remodeling effects on atrial repolarization and arrhythmias. In: Circulation 113 (2006), S. 1730-1737 [131] Hashimoto N, Yamashita T, Tsuruzoe N: Tertiapin, a selective I KAcH blocker, terminates atrial fibrillation with selective atrial effective refractory period prolongation. In: Pharmacol Res 54 (2006), S. 136-141 [132] Wettwer E, Hala O, Christ T, Heubach JF, Dobrev D, Knaut M, Varro A, Ravens U: Role of IKur in controlling action potential shape and contracitility in human atrium: influence of chronic atrial fibrillation. In: Circulation 110 (2004), S. 2299-2306 [133] Fedida D: Vernakalant: a novel, atrial- selective antifibrillatory agent. In: Expert Opin Investig Drugs 16 (2007), S. 519-532 [134] Murray KT: It’s a Funny Thing…. In: J Cardiovasc Electrophysiol 24 (2013), S. 1401-1402 [135] Haissaguerre M, Jais P, Shah DC, Takahashi A, Hocini M, Quiniou G, Garrigue S, Le Mouroux A, LeM´etayer P, Clementy J: Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. In: N Engl J Med 339 (1998), S. 659-666 [136] Stillitano F, Lonardo G, Zicha S, Varro A, Cerbai E, Mugelli A, Nattel S: Molecular basis of funny current (If) in normal and failing human heart. In: J Mol Cell Cardiol 45 (2008), S. 289-299 [137] Lai LP, Su MJ, Lin JL, Tsai CH, Lin FY, Chen YS, Hwang JJ, Huang SK, Tseng YZ, Lien WP: Measurement of funny current I(f) channel mRNA in human atrial tissue: Correlation with left atrial filling pressure and atrial fibrillation. In: J Cardiovasc Electrophysiol 10 (1999), S. 947-953 111 [138] Xue X, Yan GX: The funny Current (If): Is it a Novel Antiarrhythmic Target to Treat Atrial Fibrillation? In: J Cardiovasc Electrophysiol 23 (2012), S. 207-208 [139] Dreifus L, McGarry T, Watanabe Y: Clinical and physiologic effects of antazoline a new antiarrhythmic agent. In: Heart J 65 (1963), S. 607 [140] Kline RS, Dreifus LS, Watanabe Y u.a.: Evaluation of the antiarrhythmic properties of antazoline. In: Am J Cardiol 9 (1962), S. 564-567 [141] Reynolds EW, Baird WM, Clifford ME: A clinical trial of antazoline in the treatment of arrhythmias. In: Am J Cardiol 14 (1964), S. 513-521 [142] Farkowski MM, Maciag A, Dabrowski R, Pytkowski M, Kowalik I, Szwed H: Clinical efficacy of antazoline in rapid cardioversion of paroxysmal atrial fibrillation- a protocol of a single center, randomized, double- blind, placebo- controlled study (the AnPAF Study). In: Trials 13 (2012), S. 162 [143] Dutta NK: The action of substances which antagonize acetylcholine on the body temperature of mice before and after adrenalectomy. In: Brit J Pharmacol 3 (1948), S. 354 [144] Dutta NK: Some pharmacological properties common to antihistamine compounds. In: Brit J Pharmacol 4 (1949), S. 28 [145] Shah SS, Doshi HV, Vaidya CH: Antazoline in the treatment of cardiac arrhythmias. In: Postgraduate Medical Journal 48 (1972), S. 304-307 [146] Dreifus LS, Rabbino MD, Watanabe Y: Newer agents in the treatment of cardiac arrhythmias. In: Medical Clinics of America 48 (1964), S. 371 [147] Herbst R: Zur Behandlung paroxysmaler Herzrhythmusstörungen. In: Medical Clinic 60 (1965), S. 27 [148] Brown LW: Surgery of the Chest 1962 (Ed. by J. Gibbon). WB Saunders, Philadelphia [149] Piotrowski R, Krynski T, Baran J, Futyma P, Stec S, Kulakowski P: Antazoline for rapid termination of atrial fibrillation during ablation of accessory pathways. In: Cardiology Journal 21(3) (2014), S. 299-303 [150] Kiger RG: An evaluation of antazoline as an antiarrhythmic agent. In: Journal of the South Carolina Medical Association 60 (1964), S. 41 [151] Herrmann GR, Secrest CR, Vilbig GJ, Quint RA, Herrmann AW: Antiarrhythmic and Antifibrillary Antazoline: A Clinical Study. In: Journal of the Louisiana State Medical Society 60 (1964), S. 41 112 [152] Srinivas HV, Antani JA: Experience in conversion of cardiac arrhythmia with antazoline. In: Journal of Association of Physicians of India 19 (1971), S. 363 [153] Gehring DA, Kehler JG: Conversion of atrial fibrillation with antazoline hydrochloride. In: Angiology 21 (1970), S. 11-17 [154] Camm AJ, Kirchhof P, Lip GY, Schotten U, Savelieva I, Ernst S, Van Gelder I, Al-Attar N, Hindricks G, Prendergast B, Heidbuchel H, Alfieri O, Angelini A, Atar D, Colonna P, De Caterina R, De Sutter J, Goette A, Gorenek B, Heldal M, Hohloser SH, Kolh P, Le Heuzey JY, Ponikowski P, Rutten FH: Guidelines for the management of atrial fibrillation: the Task Force for the Management of Atrial Fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). In: Eur Heart J 31 (2010), S. 2369-2429 [155] Fuster V, Ryden LE, Cannom DS, Crijns HJ, Curtis AB, Ellenbogen KA, Halperin JL, Kay GN, Le-Huezey JY, Lowe JE, Olsson SB, Prystowsky EN, Tamargo JL, Wann LS, Smith SC Jr, Priori SG, Estes NA 3rd, Ezekowitz MD, Jackman WM, January CT, Lowe JE, Page RL, Slotwiner DJ, Stevenson WG, Tracy CM, Jacobs AK, Anderson JL, Albert N, Buller CE, Creager MA, u.a.: 2011 ACCF/AHA/HRS focused updates incorporated into the ACC/AHA/ ESC 2006 guidelines for the management of patients with atrial fibrillation: a report of the American College of Cardiology Foundation/ American Heart association task force on practice guidelines. In: Circulation 123 (2011), S. e269–e367 [156] Larsen JA, Kadish AH, Effects of gender on cardiac arrhythmias. In: J cardiovasc Electrophysiol 9 (1998), S. 655-664 [157] Ebert SN, Liu XK, Woosley RL: Female gender as a risk factor for drug induced cardiac arrhythmias: evaluation of clinical and experimental evidence. In: J Womens Health 7 (1998), S. 547-557 [158] Eckardt L, Breithardt G, Haverkamp W: Electrophysiologic characterization of the antipsychotic drug sertindole in a rabbit heart model of torsade de pointes: low torsadogenic potential despite qt prolongation. In: J Pharmacol Exp Ther 300 (2002), S. 64-71 [159] Döring HJ: The Isolated perfused heart according to Langendorff-technique. In: Physiolgia Bohemosiovaca 39 (1990), S. 481-504 [160] Eckardt L, Haverkamp W, Göttker U, u.a.: Divergent effect of acute ventricular dilatation on the electrophysiologic characteristics of d,l-sotalol and flecainide in the isolated rabbit heart. In: J Cardiovasc Electrophysiol 9 (1998), S. 366-383 [161] Eckardt L, Kirchhof P, Mönnig G, u.a.: Modification of stretch-induced shortening of repolarization by streptomycin in the isolated rabbit heart. In: J Cardiovasc Pharmacol 36 (2000), S. 711-721 113 [162] Stypmann J, Engelen MA, Breithardt AK, u.a.: Doppler echocardiography and tissue doppler imaging in the healthy rabbit: differences of cardiac function during awake and anaesthetised examination. In: Int J Cardiol 115 (2007), S.164-170 [163] Franz MR, Burkhoff D, Spurgeon H, Weisfeldt ML, Lakatta EG: In vitro validation of new cardiac catheter technique for recording monophasic action potentials. In: Eur Heart J 7(1) (1986) S. 34-41 [164] Eckardt L, Meissner A, Kirchhof P, u.a.: In vivo recording of monophasic action potentials in awake dogs-new applications for experimental electrophysiology. In: Basic Res Cardiol 96 (2001), S. 169-174 [165] Kirchhof P, Eckardt L, Mönnig G, u.a.: A patient with „Atrial Torsades de Pointes“. In: J Cardiovasc Electrophysiol 11 (2000), S. 806-811 [166] Zabel M, Hohnloser SH, Behrens S, u.a.: Electrophysiologic features of torsades de pointes: Insights from a new rabbit heart model. In: J Cardiovasc Electrophysiol 8 (1997), S. 1666-1678 [167] Rubart M, Pressler ML, Pride HP, u.a.: Electrophysiological mechanisms in a canine model of erythromycin- associated long qt syndrome. In: Circulation 88 (1993), S. 1832-1844 [168] Dessertenne F: La tachycardie ventriculaire à deux foyers opposés variables. In: Arch Mal Coeur Vaiss 59 (1966), S. 263-272 [169] Eckardt L, Haverkamp W, Borggrefe M, u.a.: Experimental models of torsade de pointes. In: Cardiovasc Res 39 (1998), S. 178-193 [170] Yang T, Roden DM: Extracellular potassium modulation of drug block of I Kr: implications for torsades de Pointes and reverse use- dependence. In: Circulation 93 (1996), S. 407-411 [171] Sicouri S, Gianetti B, Zygmunt AC, Cordeiro JM, Antzelevitch C: Antiarrhythmic effects of simvastatin in canine pulmonary vein sleeve preparations. In: J Am Coll Cardiol 57 (2011), S. 986–993. [172] Burashnikov A, Antzelevitch C: Reinduction of atrial fibrillation immediately after termination of the arrhythmia is mediated by late phase 3 early afterdepolarizationinduced triggered activity. In: Circulation 107 (2003), S. 2355-2360 [173] Thollon C, Cambarrat C, Vian J, Prost JF, Peglion JL, Vilaine JP: Electrophysiological effects of S 16257, a novel sino-atrial node modulator, on rabbit and guinea-pig cardiac preparations: Comparisonwith UL-FS 49. In: Br J Pharmacol 112 (1994), S. 37-42 [174] Kirchhof PF, Fabritz CL, Franz MR: Postrepolarization refractoriness versus conduction slowing caused by class | antiarrhythmic drugs: antiarrhythmic and proarrhythmic effects. In: Circulation 97 (1998), S. 2567-2574 114 [175] Hondeghem LM, Snyders DJ: Class ι װantiarrhythmic agents have a lot of potential but a long way to go. Reduced effectiveness and dangers of reverse use dependence. In: Circulation 81 (1990), S. 686-690 [176] Milberg P, Frommeyer G, Kleideiter A, Fischer A, Osada N, Breithardt G, Fehr M, Eckardt L: Antiarrhythmic effects of free polyunsaturated fatty acids in an experimental model of LQT2 and LQT3 due to suppression of early afterdepolarizations and reduction of spatial and temporal dispersion of repolarization. In: Heart Rhythm 8 (2011), S. 1492-1500 [177] Frommeyer G, Milberg P, Clauß C, Schmidt M, Ramtin S, Kaese S, Grundmann F, Schulze Grotthoff G, Pott C, Eckardt L: Electrophysiological profile of vernakalant in an experimental whole- heart model; the absence of proarrhythmia despite significant effect on myocardial repolarization. In: Europace (2014) [178] Dumaine R, Antzelevitch C: Molecular mechanisms underlying the long QT syndrome. In: Curr Opin Cardiol 17 (2002), S. 36-42 [179] Shimzu W, Ohe T, Kurita T, u.a.: Effects of verapamil and propranolol on early afterdepolarizations and ventricular arrhythmias induced by epinephrine in congenital long qt syndrome. In: J Am Coll Cardiol 26 (1995), S. 1299-1309 [180] Milberg P, Klocke R, Frommeyer G, Quang TH, Dieks K, Stypmann J, Osada N, Kuhlmann M, Fehr M, Milting H, Nikol S, Waltenberger J, Breithardt G, Eckardt L: G-CSF therapy reduces myocardial repolarization reserve in the presence of increased arteriogenesis, angiogenesis and connexin 43 expression in an experimental model of pacing-induced heart failure. In: Basic Res Cardiol 106 (2011), S. 995-1008 [181] Milberg P, Frommeyer G, Uphaus T, Kaiser D, Osada N, Breithardt G, Eckardt L: Electrophysiologic Profile of Dronedarone on the Ventricular Level: Beneficial Effect on Postrepolarization Refractoriness in the Presence of Rapid Phase 3 Repolarization. J Cardiovasc Pharmacol 59 (2012), S. 92-100 [182] Frommeyer G, Kaiser D, Uphaus T, Kaese S, Osada N, Rajamani S, Belardinelli L, Breithardt G, Eckardt L, Milberg P: Effect of ranolazine on ventricular repolarization in class ǀǀǀ antiarrhythmic drug- treated rabbits. In: Heart Rhythm 9(12) (2012), S. 20532058 [183] Akar FG, Rosenbaum DS: Transmural electrophysiological heterogenities underlying arrhythmogenesis in heart failure. In: Circ Res 93 (2003), S. 638-645 [184] Verduyn SC, Vos MA, Van der Zande J, Van der Hulst FF, Wellens HJ: Role of interventricular dispersion of repolarization in acquired torsade-de-pointes arrhythmias: reversal by magnesium. In: Cardiovasc Res 34 (1997), S. 453-463 115 [185] Fredj S, Sampson KJ, Liu H, Kass RS: Molecular basis of ranolazine block of LQT-3 mutant sodium channels: evidence for site of action. In: Br J Pharmacol 148 (2006), S. 16-24 [186] Vollmar AC: Use of echocardiography in the diagnosis of dilated cardiomyopathy in Irish wolfhounds. Journal of the American Animal Hospital Association 35(4) (1999), S. 279-283 [187] Jones DL, Tuomi JM, Chidiac P: Role of cholinergic innervation and RGS2 in atrial arrhythmia. In: Frontiers in Physiology 3 (2012), Art 239 [188] Arora RC, Waldmann M, Hopkins DA, and Armour JA: Porcine intrinsic cardiac ganglia. In: Anat Rec 271A (2003), S. 249-258 [189] Haissaguerre M, Shah DC, Jais P, Hocini M, Yamane T, Deisenhofer I, Garrigue S, Clementy J: Mapping-guided ablation of pulmonary vein stocure atrial fibril- lation. In: Am J Cardiol 86 (2000), S. 9K–19K [190] Jones DL, Tuomi J, Ramsay D, Guiraudon CM, Cardinal R, Page P, Guiraudon GM: Left atrial neuroablation for atrial fibrillation therapy: a feasibility study. In: J Interv Card Electro Physiol 21 (2008), S. 171-172 [191] Nishida K, Maguy A, Sakabe M, Comtois P, Inoue H, Nattel S: The role of pulmonary veins vs.autonomic ganglia indifferent experimental substrates of canine atrial fibrillation. In: Cardiovasc Res 89 (2011), S. 825-833 [192] Liang L, Pan Q, Liu Y, Chen H, Li J, Brugada R, Brugada P, Hong K, Perez GJ, Zhao C, Qi J, Zhang L, Peng L, Li L, Chen YH: High sensitivity of the sheep pulmonary vein antrum to acetylcholine stimulation. In: Appl Physiol 105(1) (2008), S. 293-298 [193] Allessie MA, Boyden PA, Camm AJ, Kleber AG, Lab MJ, Legato MJ, Rosen MR, Schwartz PJ, Spooner PM, Van Wagoner DR, Waldo AL: Pathophysiology and prevention of atrial fibrillation. In: Circulation 103 (2001), S. 769 -777 [194] Frommeyer G, Schmidt M, Clauß C, Kaese S, Stypmann J, Pott C, Eckardt L, Milberg P: Further insights into the underlying electrophysiological mechanisms for reduction of atrial fibrillation by ranolazine in an experimental model of chronic heart failure. In: European Journal of Heart Failure 14 (2012), S. 1322-1331 [195] Farrell SR, Howlett SE: The effects of isoproterenol on abnormal electrical and contractile activity and diastolic calcium are attenuated in myocytes from aged Fischer 344 rats. In: Mech Ageing Dev 128(10) (2007), S. 566-573 [196] Milberg P, Tegelkamp N, Osada R, Schimpf R, Wolpert C, Breithardt G, Borggrefe M, Eckardt L: Reduction of dispersion of repolarization and prolongation of 116 postrepolarization refractoriness explain the antiarrhythmic effects of quinidine in a model of short QT syndrome. In: J Cardiovasc Electrophysiol 18(6) (2007), S. 658-664 [197] Kirchhof P, Degen H, Franz MR, Eckardt L, Fabritz L, Milberg P, Läer S, Neumann J, Breithardt G, Haverkamp W: Amiodarone- induced postrepolarization refractoriness suppresses induction of ventricular fibrillation. In: J Pharmacol Exp Ther 305(1) (2003), S. 257-263 [198] Cerrone M, Noujaim S, Jalife J: The short QT syndrome as a paradigm to understand the role of potassium channels in ventricular fibrillation. In: J Intern Med 259(1) (2006), S. 24-38 [199] Bonow RO, Mann DL, Zipes DP, Libby P: Therapy for Cardiac Arrhythmias. In: Braunwald’s Heart Disease 9 (2012) [200] Sicouri S, Pourrier M, Gibson JK, Lynch JJ, Antzelevitch C: Comparison of electrophysiological and antiarrhythmic effects of vernakalant, ranolazine, and sotalol in canine pulmonary vein sleeve preparations. In: Heart Rhythm 9 (2012), S. 422-429 [201] Fedida D, Orth PM, Chen JY, Lin S, Plouvier B, Jung G u.a.: The mechanism of atrial antiarrhythmic action of RSD1235. In: J Cardiovasc Electrophysiol 16 (2005), S. 1227-1238 [202] Stiell IG, Roos JS, Kavanagh KM, Dickinson G: A multicenter, open-label study of vernakalant for the conversion of atrial fibrillation to sinus rhythm. In: Am Heart J 159 (2010), S. 1095-1101 [203] Stiell IG, Dickinson G, Butterfield NN, Clement CM, Perry JJ, Vaillancourt C, u.a.: Vernakalant hydrochloride: a novel atrial-selective agent for the cardioversion of recent-onset atrial fibrillation in the emergency department. In: Acad Emerg Med 17 (2010), S. 1175-1182 [204] Savelieva I, Graydon R, Camm AJ: Pharmacological cardioversion of atrial fibrillation with vernakalant: evidence in support of the ESC Guidelines. In: Europace 16 (2014), S. 162-173 [205] Pratt CM, Roy D, Torp-Pedersen C, Wyse DG, Toft E, Juul-Moller S u.a.: Usefulness of vernakalant hydrochloride injection for rapid conversion of atrial fibrillation. In: Am J Cardiol 106 (2010), S. 1277-1283 [206] Roy D, Pratt CM, Torp-Pedersen C, Wyse DG, Toft E, Juul-Moller S u.a.: Vernakalant hydrochloride for rapid conversion of atrial fibrillation: a phase 3, randomized, placebo-controlled trial. In: Circulation 117 (2008), S. 1518-1525 [207] Camm AJ, Lip GY, De Caterina R, Savelieva I, Atar D, Hohnloser SH u.a.: 2012 focused update of the ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation: an update of the 2010 ESC Guidelines for the management of atrial fibrillation- 117 developed with the special contribution of the European Heart Rhythm Association. In: Europace 14 (2012), S. 1385-1413 [208] Burashnikov A, Pourrier M, Gibson JK, Lynch JJ, Antzelevitch C: Rate-dependent effects of vernakalant in the isolated non-remodeled canine left atria are primarily due to block of the sodium channel: comparison with ranolazine and dl-sotalol. In: Circ Arrhythm Electrophysiol 5 (2012), S. 400-408 [209] Dorian P, Pinter A, Mangat I, Korley V, Cvitkovic SS, Beatch GN: The effect of vernakalant (RSD1235), an investigational antiarrhythmic agent, on atrial electrophysiology in humans. In: J Cardiovasc Pharmacol 50 (2007), S. 35-40 [210] Andrikopoulos GK, Pastromas S, Tzeis S: Flecainide: Current status and perspectives in arrhythmia management. In: World J Cardiol 7(2) (2015), S. 76-85 [211] Hellestrand KJ, Bexton RS, Nathan AW, Spurrell RA, Camm AJ: Acute electrophysiological effects of flecainide acetate on cardiac conduction and refractoriness in man. In: Br Heart J 48 (1982), S. 140-148 [212] Holmes B, Heel RC: Flecainide. A preliminary review of its pharmacodynamic properties and therapeutic efficacy. In: Drugs 29 (1985), S. 1-33 [213] Wang Z, Pagé P, Nattel S: Mechanism of flecainide’s antiarrhythmic action in experimental atrial fibrillation. In: Circ Res 71 (1992), S. 271-287 [214] Echt DS, Liebson PR, Mitchell LB, Peters RW, Obias-Manno D, Barker AH, Arensberg D, Baker A, Friedman L, Greene HL. Mortality and morbidity in patients receiving encainide, flecainide, or placebo. The Cardiac Arrhythmia Suppression Trial. In: N Engl J Med 324 (1991), S. 781-788 [215] Somani P: Antiarrhythmic effects of flecainide. In: Clin Pharmacol Ther 27 (1980), S. 464-470 [216] Borgeat A, Goy JJ, Maendly R, Kaufmann U, Grbic M, Sigwart U: Flecainide versus quinidine for conversion of atrial fibrillation to sinus rhythm. In: Am J Cardiol 58 (1986), S. 496-498 [217] Crijns HJ, van Wijk LM, van Gilst WH, Kingma JH, van Gelder IC, Lie KI: Acute conversion of atrial fibrillation to sinus rhythm: clinical efficacy of flecainide acetate. Comparison of two regimens. In: Eur Heart J 9 (1988), S. 634-638 [218] Conde D, Costabel JP, Caro M, Ferro A, Lambardi F, Corrales Barboza A u.a.: Flecainide versus vernakalant for conversion of recent-onset atrial fibrillation. In: Int J Cardiol 168 (2013), S. 2423-2425 118 [219] Campbell CJ. Vaughan Williams EM: Characterization of a new oral antiarrhythmic drug, flecainide (R-818). In: Eur J Pharmacol 73 (1981), S. 333342 [220] Kvam DC, Banitt EH, Schmid JR: Antiarrhythmic and electrophysiologic actions of flecainide in animal models. In: Am J Cardiol 53 (1984), S. 22B-25B [221] Manz M, Reuter M, Lauck G, Omran H, Jung W: A single intravenous dose of ivabradine, a novel i(f) inhibitor, lowers heart rate but does not depress left ventricular function in patients with left ventricular dysfunction. In: Cardiology 100 (2003), S. 149-155 [222] Joannides R, Moore N, Iacob M, Compagnon P, Lerebours G, Menard JF, Thuillez C: Comparative effects of ivabradine, a selective heart rate lowering agent, and propranolol on systemic and cardiac haemodynamics at rest and during exercise. In: Br J Clin Pharmacol 61 (2006), S. 127-137 [223] Ceconi C, Cargnoni A, Francolini G, Parinello G, Ferrari R: Heart rate reduction with ivabradine improves energy metabolism and mechanical function of isolated ischaemic rabbit heart. In: Cardiovascular Research 84 (2009), S.72-82 [224] Chemaly AE, Magaud C, Patri S, Jayle C, Guinamard R, Bois P: The Heart RateLowering Agent Ivabradine Inhibits the Pacemaker Current I f in Human Atrial Myocytes. In: J Cardiovasc Electrophysiol 18 (2007), S. 1190-1196 [225] Fernandez-Velasco M, Goren N, Benito G, Blanco-Rivero J, Bosca L, Delgado C: Regional distribution of hyperpolarization-activated current (If) and hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel mRNA expression in ventricular cells from control and hypertrophied rat hearts. In: J Physiol 553 (2003), S. 395-405 [226] Morel E, Meyronet D, Thivolet-Bejuy F, Chevalier P: Identification and distribution of interstitial Cajal cells in human pulmonary veins. In: Heart Rhythm 5 (2008), S. 1063-1067 [227] Lim PB, Malcolme-Lawes LC, Stuber T, Wright I, Francis DP, Davies DW, Peters NS, Kanagaratnam P: Intrinsic cardiac autonomic stimulation induces pulmonary vein ectopy and triggers atrial fibrillation in humans. In: J Cardiovasc Electrophysiol 22 (2011), S. 638-646 [228] Bois P, Bescond J, Renaudon B, Lenfant J: Mode of action of bradycardic agent, S 16257, on ionic currents of rabbit sinoatrial node cells. In: Br J Pharmacol 118 (1996), S. 1051-1057 [229] Courtemanche M, Ramirez RJ, Nattel S: Ionic mechanisms underlying human atrial action potential properties: insights from a mathematical model. In: Am J Physiol 275(1) (1998), S. H301- H321 119 [230] Schwarzwald CC, Hamlin RL, Bonagura JD, Nishijima Y, Meadows C, Carnes CA: Atrial, SA Nodal, and AV Nodal Electrophysiology in Standing Horses: Normal Findings and Electrophysiologic Effects of Quinidine and Diltiazem. In: J Vet Intern Med 21 (2007), S. 166-175 [231] Mérot J, Probst V, Debailleul M, Gerlach U, Moise NS, Le Marec H, Charpentier F: Electropharmacological Characterization of Cardiac Repolarization in German Shepherd Dogs With an Inherited Syndrome of Sudden Death: Abnormal Response to Potassium Channel Blockers. In: Journal of American College of Cardiology 36(3) (2000), S. 939-947 120 11. Abkürzungsverzeichnis APD aAPD cAMP AnPAF-Studie AV-Knoten bzw. C ca. cm DAD DMSO EAD EKG aERP et al g h HERG Hg HR Hz IE ICANS ICa-L INa Ito JNL IKr IKs i.v. KCl KHB Kg L Aktionspotentialdauer atriale Aktionspotentialdauer zyklisches Adenosinmonophosphat Antazoline in rapid cardioversion of paroxysmal atrial fibrillation study Atrioventrikulärer Knoten beziehungsweise Celsius circa Zentimeter Delayed afterdepolarizations- späte Nachdepolarisationen Dimethylsulfoxid Early afterdepolarizations- frühe Nachdepolarisationen Elektrokardiogramm atriale effektive Refraktärzeit et alii Gramm Stunde Human-ether-a-go-go related gene Quecksilber High Rate Hertz Internationale Einheiten Intrinsisches, cardiales, autonomes Nervensystem Calciumströme durch Kanäle vom L-Typ Natriumstrom transienter Auswärtsstrom Jervell und Lange-Nielsen schnelle (rapid) Komponente des einwärtsgleichrichtenden K+-Stromes langsame (slow) Komponente des einwärtsgleichrichtenden K+-Stromes intravenös Kaliumchlorid Krebs-Henseleit-Puffer Kilogramm Liter 121 LQTS MAP min ml mmol ms M-Zellen aPRR s TdP µM V. VT z.B. Langes QT-Syndrom Monophasisches Aktionspotential Minute Milliliter Millimol Millisekunde Midmyokardiale Zellen Atriale Post-Repolarisations-Refraktärität Sekunde Torsade de Pointes Mikromol Vena Ventrikuläre Tachykardie zum Beispiel 122 12. Danksagung Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med Peter Milberg für die Möglichkeit zur Bearbeitung dieses spannenden Themas und die umfassende Betreuung und Unterstützung bedanken. Ich danke Herrn Prof. Dr. vet. med Michael Fehr für die Bereitschaft zur veterinärmedizinischen Betreuung dieser Arbeit. Insbesondere für die sofortige und unkomplizierte Kommunikation in jeglichen Fragestellungen. Die Zusammenarbeit zwischen der Tieräztlichen Hochschule Hannover und dem Universitätsklinikum Münster verlief durchgehend problemlos. Ein ganz spezieller Dank geht an Priv.-Doz. Dr. med. Gerrit Frommeyer der mir jederzeit seine Hilfe und Unterstützung anbot und immer ein offenes Ohr für Probleme hatte und mit zügigen Ratschlägen und Problemlösungen weiterhalf. Außerdem möchte ich allen aus der AG Milberg danken, insbesondere Dr. med. vet. Christina Fischer, für die intensive Einarbeitungsphase und die stets freundliche und unterstützende Zusammenarbeit im Labor und in Dissertationsfragen darüber hinaus. Frau Dr. vet. med. Wilma Lindhaus möchte ich danken, die als Arbeitgeberin in der tierärztlichen Praxis diese Dissertation zu jeder Zeit unterstützt hat. Meiner ganzen Familie und meinen engen Freunden Julia Matena und Sandra Ullrich möchte ich besonders für die stetige Unterstützung und aufmunternden Worte auf meinem Lebensweg danken. Ein besonderer Dank gilt meinem Ehemann und unserer kleinen Familie, die mich immer wieder zum Weitermachen animiert hat und mir Liebe und Kraft geschenkt hat für Vergangenes und weiterhin Liebe und Kraft gibt für Zukünftiges.
