Datei - Fachrichtung Biologie

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TECHNISCHE
UNIVERSITÄT
DRESDEN
Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften
Fachrichtung Biologie
Institut für Botanik
Professur für Pflanzenphysiologie
Prof. Dr. Jutta Ludwig-Müller
Studiengang Biologie
-Hauptstudium-
Kurspraktikum
„Entwicklungsphysiologie“
Praktikumsanleitung
Wintersemester 2004/05
Seite 1
Entwicklungsphysiologie – Praktikum (08.11. - 19.11.2004)
Seminar 19.11.2004
Übersicht Zeitplan
Montag
08.11.
Dienstag
09.11.
Mittwoch
10.11.
Donnerstag
11.11.
Freitag
12.11.
Montag
15.11.
Dienstag
16.11.
Mittwoch
17.11.
Donnerstag
18.11.
Freitag
19.11.
9.20-16.20
13.00-16.20
9.20-16.20
13.00-16.20
9.20-16.20
9.20-16.20
13.00-16.20
9.20-16.20
13.00-16.20
9.20-16.20
---
8B
---
9
10B
---
---
1B
3A,B
4A
2A
5A
9
3B
5B1
6B
Seminar
8A1
8A2
4B
2B
7B
6A
Vormittag
1A
Versuch
7A
Buß- und
Bettag
Nachmittag
Versuch
Buß- und
Bettag
5B2
10A
A = Versuchsansatz, B = Versuchsauswertung
Seite
2
Praktikumsversuche
Thema
Raum
Datum
Betreuer
1. Adventivwurzelinduktion
S II, 217
08./19.11.04
Güther
2. Keimung
S II, 217
10./11.11.04
Güther
3. Wachstum
S II, 217
08./15.11.04
Güther
4. Koleoptilzylindertest
S II, 217
09./10.11.04
Ludwig-Müller/Heinze
5. Isolierung von Auxinen
S II, 215/ 207
11./16.11.04
Ludwig-Müller/Heinze
6. Auxinnachweis mittels
Reportergenen
S II, 215/217
16./18.11.04
Güther
7. Betacyaninsynthese
S II, 217
08./15.11.04
Güther
8. Nitratreduktase
S II, 217
08./09./10.11.04
Schuller
9. Lichtabhängige
Genexpression (Peroxidasen)
S II, 215
12.11.04
Güther
10.Alterung von Blättern
S II, 215
08./15.11.04
Güther
Allgemeines
I) Versuchsprotokoll
Es empfiehlt sich sehr, alle für die Versuche notwendigen Daten in einem Primärdatenheft
festzuhalten. Je Praktikumsgruppe ist ein Gruppenprotokoll spätestens zwei Wochen nach
Praktikumsende abzugeben. Es wird (als Übung für die spätere Diplomarbeit) dringend
empfohlen, die Berechnung der Meßergebnisse und die Reinschrift mit Hilfe von modernen
Computerprogrammen abzufassen.
Für die Reinschrift des Protokolls sollte folgende, allg. übliche Gliederung von wiss. Arbeiten
angewendet werden:
1. Einführung: Einstieg in das behandelte Thema mit Fragestellung, Arbeitshypothese,
Literaturüberblick usw. (kann im Versuchsprotokoll knapp gehalten werden).
2. Material und Methoden: Angaben zu den verwendeten Pflanzen, Versuchsbedingungen usw.
(im Versuchsprotokoll reicht i.a. der Verweis auf Änderungen gegenüber der Anleitung im
Manuskript aus).
3. Ergebnisse: Diagramme (z.B. kontinuierliche Kurve, Polygonzug, Histogramm), Tabellen,
Schreiberkurven, Spektren, statistische Auswertung usw. Musterbeispiel für den verwendeten
Rechengang und eine kurze wörtliche Schilderung der erzielten Ergebnisse. Achten Sie bei
der tabellarischen Darstellung auf eine sinnvolle Angabe für die Genauigkeit der Ergebnisse,
i.a. sollten höchstens drei Kennziffern z.B. 0,123 (bzw. 1,23; 12,3 oder 123) angegeben
werden (maßgebend ist der ungenaueste Schritt während eines Experiments).
3. Diskussion: Interpretation (Vergleich mit Literaturangaben) der Ergebnisse,
Fehlerabschätzung und Schlußfolgerungen, (bei wiss. Arbeiten z.B. auch
Bestätigung/Ablehnung der Arbeitshypothese).
4. Literatur: vollständige Zitate der im Text benützten Literaturangaben nach einheitlichem
Muster (hier hat jede wissenschaftliche Zeitschrift - leider - eigene Regeln), z.B. Physiologia
Plantarum: Hinz, H. & Kunz, K. 1895. Über die Blattbewegung von Mimosa pudica. Zeitschrift für Botanik 54: 56-59
5. Zusammenfassung („abstract“): Kurzbericht über den wesentlichen Inhalt der Arbeit
(höchstens 1 DIN A4 Seite) mit Aufgabenstellung, verwendete Methoden, Beurteilung der
erzielten Ergebnisse
BEMERKUNG: Für die Erfassung und Interpretation von Versuchsdaten ist die Wahl von
sinnvollen Bezugsgrößen (z.B. Trocken- und Frischgewicht, Chlorophyll- und Proteingehalt,
Blattfläche oder Zellzahl) ausschlaggebend (siehe auch Versuch 2). Dies beginnt bereits mit
der Berücksichtigung geeigneter Kontrollpflanzen und endet bei der eigentlichen Messung
(Erfassung von Blindwerten, Überprüfung des Ansatzes und der Meßgeräte mit Standards
usw.) von interessanten Parametern.
Daher sollte gerade der exakten Durchführung der Kontrollansätze während eines
Experiments größte Aufmerksamkeit geschenkt werden, da letztlich von dieser Bestimmung
alle weiteren Parameter abhängig sind !
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II) Herstellung von Lösungen:
1. molare Lösungen: 1 M bedeutet 1 mol einer Substanz in 1 l Lösungsmittel gelöst. (1 mol =
6,023 * 10
23
Teilchen)
2. molale Lösungen: 1 M’ bedeutet 1 mol einer Substanz in 1 kg Lösungsmittel gelöst
3. prozentige Lösungen:
(weight/weight): z.B. 20 g NaCl + 80 g H2O = 20% (w/w)
(weight/volume): z.B. 1 g Phloroglucin mit Ethanol auf 100 ml auffüllen = 1% (w/v)
(volume/volume): z.B. 20 ml Ethanol auf 100 ml mit H2O auffüllen = 20% (v/v)
4. Drei häufige Problemstellungen beim Ansetzen von Lösungen:
1. Beispiel: aus zwei Stammlösungen (10 M HCl und 1 M HCl) sollen durch Mischen 50 ml 3 M
HCl hergestellt werden. Welche Volumina sind jeweils zu pipettieren ?
Ergebnis: das Ergebnis ist aus dem Mischungskreuz ableitbar:
es müssen 2 (=3-1) Teile 10 M HCl mit 7 (=10-3) Teilen 1 M HCl gemischt werden.
10 M HCl: (2/(2+7)) x 50 ml = 11,1 ml
1 M HCl : (7/(2+7)) x 50 ml = 38,9 ml
10
2
3
1
7
2. Beispiel: Wieviel Gramm NaCl (MGNaCl = 58,44 g/mol) müssen eingewogen werden um 40
ml einer 50 mM NaCl-Lösung herzustellen ?
Ergebnis: m = V x MG x c = 40 ml x 58,44 (g/mol) x 50 mM = 0,116 g NaCl
(V Volumen, MG Molekulargewicht, c Konzentration)
3. Beispiel: Welche Konzentration (mol/l) hat eine 32% (w/w) HCl-Lösung (MGHCl = 36,5
g/mol; Dichte ρ = 1,16 kg/l) ?
Ergebnis: c = ρ x %-Satz / MG = 1,16 (kg/l) x 32% / (36,5 (g/mol)) = 10,2 M HCl
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III) Zentrifugation:
Im Praktikum wird die Heraeus Labofuge 400 R mit zwei verschiedenen Rotortypen
eingesetzt. Vor Gebrauch muß jeweils die richtige Kennzahl eingegeben werden; eine
Vorkühlung ist nur bei laufendem Rotor möglich.
Rotortyp
Ausschwingrotor
Festwinkelrotor
8172
3765
17,4 cm
7,3 cm
Zentrifugenbecher
25 ml (8 St.)
Reaktionsgefäße 1,5 ml (24 St.)
RPM
300 - 4.500
1.000 - 13.000
3.939 x g
13.791 x g
Kennzahl-Nr.
Radius
max. RZB
Aus der Drehzahl n [in min] und dem Radius r [in cm] läßt sich die rel. Zentrifugalkraft
RZB (Einheit: Vielfaches der Erdbeschleunigung, z.B. 3000 x g) berechnen:
-3
2
RZB = 1,118 * 10 * n * r
[g]
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IV) Laborsicherheit:
Für das pflanzenphysiologische Praktikum gilt die „Allgemeine Laborordnung für das
Botanische Institut“. Allen Praktikumsteilnehmern wird dringend empfohlen, sich darüber
hinaus anhand der in den Laborräumen ausliegenden Exemplare über den Umgang mit
Gefahrstoffen und allg. Laborsicherheit zusätzlich zur Sicherheitsbelehrung zu informieren.
Es gelten folgende Grundregeln:
• Im Kursraum ist das Trinken, Essen und Rauchen verboten !
• Für Praktikumsfremde ist der Aufenthalt in den Praktikumsräumen nicht gestattet.
• Im Labor dürfen keine Kleidung, Sturzhelme, Einkaufstaschen usw. herumliegen
(Kleiderschränke auf dem Flur benutzen!).
• Im Labor ist zweckmäßige Kleidung, z.B. einen Baumwoll-Laborkittel, zu tragen. Die
Kleidung soll den Körper und die Arme ausreichend bedecken. Es darf nur festes,
geschlossenes und trittsicheres Schuhwerk getragen werden.
• Alle Chemikalienflaschen müssen mit einem Klebeetikett eindeutig beschriftet sein
(keine Abkürzungen); die Beschriftung sollte dauerhaft erkenntlich sein. Die Angaben auf
den Etiketten müssen der Gefahrstoffverordnung entsprechen (Name und Gefahrensymbol).
• Glasabfall in den bereitstehenden Behältern sammeln. Kein Glasabfall in den Hausmüll
wegen der damit verbundenen Verletzungsgefahr !
• Zur gefahrlosen Beseitigung von verschütteten, flüssigen Gefahrstoffen sind geeignete
Sorbtionsmittel in den Räumen 202 und 215 unter den Spültischen vorhanden.
• Gefahrstoffe, wie auch andere Lösungen, niemals mit dem Mund pipettieren !
• Sämtliche Glaswaren sind vor Gebrauch auf Unversehrtheit zu überprüfen. Glasflaschen
nicht am Flaschenhals ergreifen und nur in einer geeigneten Wanne, Eimer o.ä.
transportieren.
• Niemals in sich bewegende Geräte (z.B. Zentrifugen oder Rührer) hineingreifen.
• Defekte Geräte dürfen nicht mehr weiterbenutzt werden !
• Im Gefahrfall (insbes. Feuer) Ruhe bewahren, Gebäude umgehend verlassen
(Fluchtwege einprägen) und am Sammelplatz treffen.
Dort vollständige Anwesenheit aller Kursteilnehmer überprüfen und dem Kursleiter melden!
Feuerlöscher
Treppenhaus auf jedem Stockwerk
Notdusche und Augenspülflaschen
Räume 201, 202 und 215
Erste-Hilfe-Kasten
Raum 202
Ersthelferin
Frau Arndt, Raum 211
Sammelplatz
Hinterausgang Zellescher Weg
Seite 7
REGULATIONSMECHANISMEN DER ENTWICKLUNG HÖHERER PFLANZEN
Die Entwicklung höherer Pflanzen wird über ein komplexes Zusammenwirken von Umwelt- und
endogenen Faktoren mit dem Cytoplasma bzw. dem (nukleären/plastidären/mitochondrialen)
Genom gesteuert. Diese Interaktion resultiert in einer regulierten, differentiellen Genexpression,
wobei die pflanzliche Zelle die Expression nukleärer, plastidärer bzw. mitochondrialer Gene
aufeinander abstimmen muss. Sämtliche Teilaspekte der Entwicklung höherer Pflanzen (z.B.
Wurzel- oder Blattentwicklung, Zellteilung, Zellstreckung) setzen eine exakte zeitliche und
räumliche Koordination der Genexpression bzw. eine koordinierte Funktion verschiedener
metabolischer Teilsysteme voraus (multifaktorielle Regulation).
Zu den wichtigsten Faktoren, die die pflanzliche Entwicklung steuern, zählen:
a.
Licht (Qualität, Quantität, Tag-Nacht-Rhythmus)
b.
Schwerkraft
c.
Temperatur
d.
Luftfeuchtigkeit
e.
Nährstoffversorgung (CO2, H2O, Nährsalze)
f.
Phytohormone/Wachstumsregulatoren (Auxine, Cytokinine, Ethylen,
Gibberelline, Abscisinsäure, Jasmonsäure, Brassinosteroide)
g.
Stressoren (Hitze, Dürre, Kälte, Licht, Hunger)
Entwicklungsprozesse können experimentell auf Ebenen unterschiedlicher Komplexität
untersucht werden. Dabei gilt es zu beachten, dass
- einerseits bei zunehmender Komplexität des untersuchten Systems (Zelle →
Gewebe → Organ) die Vergleichbarkeit mit dem natürlichen System, das
heißt der intakten Pflanze, zunimmt.
- andererseits aber erst die Auflösung in funktionale Einzelkomponenten
(=Teil-Systeme, „in vitro“ -Systeme) die Aufklärung von Mechanismen auf
molekularer Ebene ermöglicht.
Seite 8
Ziel
des
Praktikums
ist
die
Untersuchung
von
Entwicklungsvorgängen im Leben einer Pflanze an ganzen Pflanzen,
Pflanzenorganen bzw. Pflanzenextrakten.
Dazu werden Versuche zur Licht- und Hormonwirkung auf verschiedenen Ebenen durchgeführt.
Eine beliebte Versuchspflanze ist der Mais (Zea mays), an dem während des Praktikums viele
Entwicklungsvorgänge demonstriert werden sollen. Daneben werden aber auch bestimmte
Vorgänge bei anderen Pflanzen demonstriert. Aus versuchstechnischen Gründen können die
Versuche während des Praktikums nicht in ihrer logischen zeitlichen Abfolge durchgeführt
werden, da einige Versuche über einen längeren Zeitraum hinweg angesetzt sein müssen.
Bestandteil des Kurses sind Versuche zu:
• Keimung (licht- und hormonabhängig), Versuch 2 (Seite 12)
• Wachstum von Pflanzen (licht- und hormonabhängig), Versuche 3 (Seite 14) und 4 (Seite 17)
• Hormongehalte von Pflanzen, Versuche 5 (Seite 20) und 6 (Seite 23)
• Organinduktion (hormonabhängig), Versuch 1 (Seite 10)
• Stoffwechselaktivitäten (hormonabhängig), Versuche 7 (Seite 28) und 8 (Seite 31)
• differentielle Genexpression (gewebe- und lichtabhängig), Versuche 6 und 9 (Seite 36)
• Alterungsvorgänge (Seneszenz, licht- und hormonabhängig), Versuch 10 (Seite 42)
Seite 9
Versuch 1
Untersuchungen zur Adventivwurzelbildung von Coleus durch
Wuchsstoffapplikation
Literatur:
1. Fischnich, O., Planta 24, 552 (1935)
2. Ruge, U., Pflanzenphysiol. Prakt. IV, 51 (1951)
Objekt:
Junge Topfpflanzen von Coleus blumei
Prinzip:
Der Versuch soll ein Beispiel für die vielfältigen morphogenetischen und korrelativen
Wirkungen
geben,
die
von
Wachstumsregulatoren,
auch
den
vornehmlich
als
Streckungswuchsstoffen bekannten Auxinen ausgelöst werden können.
Geräte und Reagenzien:
Spatel
Abdampfschale
Wasserbad
Wollfett
Filzschreiber
Pipetten
Hormonlösungen:
50 mM Indol-3-essigsäure
20 mM 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
50 mM Indol-3-buttersäure
20 mM Gibberellinsäure
20 mM Abscisinsäure
Aqua dest.
Durchführung:
Seite 10
5g Wollfett (Adeps lanae anhydr, DAB VI) werden in einer Abdampfschale so eingewogen, dass
die Hauptmasse am Rand haftet. In die Abdampfschale werden 5 ml Wuchsstoff-Lösung
gegeben. Die Abdampfschale wird auf dem Wasserbad erhitzt. Beide Phasen werden mit dem
Spatel so lange verrührt, bis das Wollfett erstarrt ist und eine gleichmäßige weiße Farbe
angenommen hat. Die Paste muss sehr gründlich (mindestens 10 Min. lang) verrieben werden bis
„Nivea“-Konsistenz erreicht ist. Die Pasten werden mit Aluminiumfolie abgedeckt und bei 4°C
aufbewahrt. Eine Kontrollpaste wird in gleicher Weise mit Aqua dest. angesetzt. Je 3 ColeusPflanzen werden mit der selben Paste behandelt. Die Wuchsstoffpaste wird mit einem Spatel
ringförmig um jeweils ein unteres und ein oberes Internodium einer jeden Pflanze aufgetragen.
Nach einer Woche werden die Pasten erneuert und nach 14 Tagen werden die aus den verdickten
Internodien hervorbrechenden Adventivwurzeln gezählt und anhand von Querschnitten die
morphogenetischen Veränderungen des Stängels im Mikroskop beobachtet und in einer Skizze
schematisch dargestellt.
Außerdem sollen weitere morphologische Veränderungen oder
Besonderheiten an den behandelten Pflanzen notiert werden.
Seite 11
Versuch 2
Lichtaktivierung der Samenkeimung bei Lactuca sativa und der Einfluss von
Gibberellinsäure
Die Wirkung des Lichtes bei der Aktivierung der Samenkeimung erfolgt über den Photorezeptor
Phytochrom (reversibles Hellrot-Dunkelrot-System). Unabhängig hiervon kann durch exogene
Gabe des Phytohormons Gibberellinsäure (GA3) der Keimungsprozess gefördert werden.
Stichworte für die Vorbereitung und Protokollführung:
Phytochrom-System,
Keimungsprozesses,
Samenkeimung,
Quellung,
Samenruhe,
Reservestoffe,
hormonelle
Aktivierung
von
Steuerung
des
Hydrolasen
durch
Gibberellinsäure, Induktion von Amylase(n).
Praktische Durchführung:
Grüne Photolaborlampe, Petrischalen, Pinzetten, Pipetten, Pinsel, Lupe, 10 mM GA3-Lösung.
Durchführung: In je 4 Petrischalen werden jeweils 50 Achänen (ca. 53 mg) von Lactuca sativa
bei grünem Sicherheitslicht auf mit 2ml Wasser bzw. 2ml 1.0, 0.1, 0.01 mM GA3-Lösung
angefeuchtetem Filterpapier verteilt. Jeder Ansatz wird zwei mal angesetzt. Die eine Hälfte der
Schalen wird mit Parafilm verschlossen und am Fenster hell aufgestellt, die andere Hälfte wird
in Alufolie eingepackt. Es ist essentiell, dass diese Schalen bis zur Auswertung nicht dem Licht
ausgesetzt werden!
Auswertung:
Nach 24 Stunden wird jeweils der prozentuale Anteil der gekeimten Achänen (Keimwurzel
sichtbar) sorgfältig ausgezählt. Die Ergebnisse werden zusammengetragen und gemeinsam
diskutiert.
Seite 12
Seite 13
Versuch 3
Keimlingsentwicklung bei Zea mays: Quantifizierung von
Wachstum, Einfluss von Licht, Bedeutung von Bezugsgrößen
Theoretischer Hintergrund
Der wichtigste exogene Faktor, der die pflanzliche Entwicklung beeinflusst, ist das Licht.
Ziel des ersten Versuches ist daher die Quantifizierung des Wachstums von Keimlingen von
Zea mays im Dunkeln bzw. im Licht-Dunkel-Wechsel. Licht steuert die Entwicklung auf
mehreren Ebenen, abhängig von Qualität, Quantität und zeitlichem Muster. Neben seiner
primären Bedeutung für die energieliefernden Reaktionen der Photosynthese (⇒
siehe Stoffwechselphysiologie) hat es auch andere, morphogenetische Effekte (z.B. bei
Phototropismus, Verhinderung von Etiolement, Blühindikation, Stomatabewegung, Bildung
sekundärer Pflanzenstoffe, Streckungswachstum etc. Besondere Bedeutung kommt hierbei
dem Phytochrom-System zu, über welches morphogentisch wirksames Licht perzipiert wird.
Im Versuch werden 5- bzw. 7-Tage-alte Zea mays-Keimlinge angezogen im Hell-DunkelWechsel (16Std.Hell/8Std.Dunkel) bzw. Dauerdunkel hinsichtlich folgender Merkmale
verglichen:
a)
Länge von Spross (Mesokotyl und Koleoptile getrennt) und Wurzel
b)
Frischgewicht von Spross und Wurzel
c)
Trockengewicht (dito)
d)
Proteingehalt, getrennt für Spross (Mesokotyl und Koleoptile) und Wurzel
Da die in diesem Versuch erhobenen Messdaten (Längenmaße, Frisch-, bzw. Trockengewichte,
Proteingehalt etc.) bei entwicklungsphysiologischen Untersuchungen oft als Bezugsgrößen
dienen, sei an dieser Stelle kurz auf die grundsätzliche Bedeutung von Bezugsgrößen
hingewiesen. Bei der experimentellen Untersuchung eines entwicklungsphysiologischen
Prozesses wird oft die zeitliche Veränderung einer Messgröße (z.B. Enzym-Aktivität, mRNAMenge) unter dem Einfluß eines exogenen Faktors (z.B. Licht, Temperatur) untersucht. Die
Veränderung der interessierenden Variablen wird dabei in Abhängigkeit von einer
Bezugsgröße (z.B. Frischgewicht, Trockengewicht, Gesamtprotein) des sich entwickelnden
Systems dargestellt. Bezugsgrößen zeigen oft selber dramatische, entwicklungsabhängige
Seite 14
Veränderungen. Daher ist die Erfassung möglichst mehrerer Bezugsgrößen für die
Aussagekraft
jeder
Untersuchung
über
entwicklungsabhängige
Veränderungen
einer
spezifischen Messgröße von entscheidender Bedeutung.
Die Ergebnisse dieses Versuches sollen Aufschluss geben über:
a)
die entwicklungsabhängige Veränderung der genannten Bezugsgrößen:
- Längen, Frisch- und Trockengewichte (jeweils pro Keimling)
- Proteingehalte (pro g Frisch- bzw. Trockengewicht)
b)
die Beeinflussung durch den Parameter Licht
Stichworte für die Vorbereitung und Protokollbearbeitung:
Morphologie & Anatomie des Zea mays-Keimlings, Samenkeimung, Reservestoffe,
Streckungs- & Teilungswachstum, Etiolement, Phytochromsystem.
Praktische Durchführung:
Pflanzenmaterial (vom Betreuer angesetzt):
Maiskeimlinge
hell
5 Tage alt
Maiskeimlinge
hell
7 Tage alt
Maiskeimlinge
dunkel
5 Tage alt
Maiskeimlinge
dunkel
7 Tage alt
a) Längen-Bestimmung
Von 10 Keimlingen werden nach Abtrennung von Spross (Mesokotyl & Koleoptile) und Wurzel
(direkt am Samen mit der Rasierklinge abschneiden) deren Längen auf ± 1mm Genauigkeit
(Millimeter-Papier) ermittelt und die Mittelwerte und Standardabweichungen errechnet. Die
Keimlinge werden in einer feuchten (nicht nassen!) Kammer vor dem Austrocknen bewahrt.
b) und c) Frisch- und Trockengewichtsbestimmung
Von den vermessenen Keimlingen werden die Frischgewichte getrennt für Wurzel und Spross
(Mesokotyl & Koleoptile) bestimmt (10 Keimlinge/Anzuchtbedingung). Die Mittelwerte (±
Standardabweichung) werden errechnet. Anschließend werden Proben von 5 Sprossen bzw.
Wurzeln jeweils vereinigt und im Trockenschrank auf markierten Schiffchen aus Alufolie
getrocknet (Gewichtsbestimmung am 2. Versuchstag).
Seite 15
d) Protein-Bestimmung
Jeweils 5 weitere Sprosse bzw. 5 Wurzeln mittlerer Länge werden nach Frischgewichtsbestimmung für die Protein-Bestimmungen eingesetzt. Hierzu wird das Pflanzenmaterial im
Mörser in 10ml/g Frischgewicht 50mM Na-Phosphat-Puffer (pH 7.0) gründlich homogenisiert.
Mit der Pipette (Spitze abschneiden) wird von jedem Extrakt 1 ml in Eppendorf-Gefäße
überführt. Nach Zentrifugation (10 min, 13 000 rpm) werden 3 Proben zur Proteinbestimmung
angesetzt: 2, 5 bzw. 10 µl des unverdünnten Überstands. Alle Proben werden auf 100 µl
aufgefüllt, und nach Zusatz von 1 ml Bradford-Reagenz wird die Absorption bei 595 nm gegen
einen Leerwert (Phosphatpuffer) gemessen.
Zur Ermittlung der Proteinmenge wird mit einem Eichprotein (Serumalbumin, BSA) eine
entsprechende Eichkurve mit Bradford-Reagenz erarbeitet. Dafür werden 0, 5, 10, 25 und 50 µl
der Eichproteinlösung (1 mg BSA in 1 ml) mit Phosphatpuffer auf 100 µl aufgefüllt und wie
oben weiterbehandelt.
Die Protein-Konzentration pro g Frischgewicht (bzw. Trockengewicht; s.o) sowie das
Gesamtprotein/Organ sollen errechnet werden.
Auswertung
Die Ergebnisse der Bestimmungen von Längen, Frisch- und Trockengewichten (bzw. deren
Verhältnis) sowie den Protein-Gehalten (pro g FG, pro g TG, pro Organ [Mesokotyl, Koleoptile,
Wurzel]) sollen in einer Tabelle zusammengefasst werden. Diskutiert werden sollen:
-
die Frisch- bzw. Trockengewichtszunahmen vom 5. zum 7. Tag Vergleich für Lichtund Dunkel-Anzucht
-
die Verhältnisse Frischgewicht/Trockengewicht (angegeben als Prozent
des Frischgewichtes) für die unterschiedlichen Anzuchtbedingungen
-
die Längenzunahmen vom 5. zum 7. Tag im Vergleich für Licht- und DunkelAnzucht
-
die Proteingehalte in Abhängigkeit vom Alter und den unterschiedlichen
Anzuchtbedingungen
Seite 16
Versuch 4
Einfluß von Indol-3-essigsäure und Abscisinsäure auf das
Streckungswachstum von Koleoptil- Mesokotyl- und Wurzelsegmenten
etiolierter Zea mays-Keimlinge
Theoretischer Hintergrund:
Definition eines Wachstumsregulators (Pflanzenhormon). Pflanzliche Wachstumsregulatoren
("Phytohormone") beeinflussen in geringsten Konzentrationen (10-9 - 10-5 M) die
verschiedenen Entwicklungsprozesse höherer (und teilweise auch niederer) Pflanzen . Syntheseund Wirkort können, müssen aber nicht verschieden sein.
Übersicht über die verschiedenen Hormon-Klassen und ihre Biosynthese-Wege. Einige der
bekannten Wachstumsregulatoren sind in ihrer Biosynthese eng an bekannte Wege des GrundStoffwechsels der Zelle angebunden, z.B.:
L-Tryptophan
Adenin
Mevalonsäure
>
>
>
Indol-3-essigsäure
Zeatin
Gibberellinsäure
Nicht in allen Fällen ist die Aufklärung der intermediären Schritte bereits zweifelsfrei gelungen.
Der Grund ist in der Tatsache zu suchen, dass es leichter ist Enzyme nachzuweisen, die unter IN
VITRO Bedingungen eine bestimmte Reaktion katalysieren können (u.Umst. auf Grund
mangelnder Spezifität), als ihre essentielle Funktion in einem bestimmten Biosyntheseweg IN
VIVO zu beweisen.
Makroskopisch sichtbare Hormon-Effekte: Wechselwirkungen zwischen verschiedenen
Hormonen.
Die meisten Entwicklungsprozesse wie z.B. Zellteilung, Zellstreckung, Blühinduktion,
Samenkeimung, Blattfall und Fruchtreifung sind das Resultat einer ganzen Reihe steuernder
Faktoren (Wasser, Nährstoffe, Licht, etc.), zu denen auch Pflanzenhormone (meist mehrere)
zählen. Die Beobachtung, dass ein bestimmter Prozess scheinbar durch ein Hormon ausgelöst
werden kann, sagt nicht mehr als:
Unter den experimentell definierten Bedingungen ist das untersuchte Hormon ein
limitierender Faktor !
Der Einsatz von Mutanten in der Aufklärung von hormonellen Regulationsmechanismen.
Der Einsatz von Mutanten hat z.B. für Pisum sativum und Zea mays die Aufklärung der
einzelnen
Schritte
der
Gibberellin-Biosynthese
ermöglicht.
Kombiniert
mit
Seite 17
molekularbiologischer Methodik lassen sich die Gene für diese essentiellen Biosynthese-Enzyme
isolieren und im Detail untersuchen (gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Expression,
zelluläre Lokalisation, etc.).
Neben den Biosynthese-Mutanten existieren auch eine Reihe von Sensitivitäts-Mutanten.
Letztere weisen meist einen ähnlichen Gehalt der entsprechenden Hormone auf wie die NormalTypen,
sie
reagieren
jedoch
mit
verminderter/erhöhter
Sensitivität
gegenüber
exogenen/endogenen Hormonen. Vermutet wird, dass es sich zumindest in einigen Fällen um
Rezeptor-Mutationen handelt.
Stichworte für die Vorbereitung:
Streckungs- und Teilungswachstum, Morphologie und Anatomie des Zea mays-Keimlings
(Koleoptile,
Mesokotyl,
Wurzel),
Etiolement,
Phytochromsystem,
Biosynthese
von
Pflanzenhormonen, makroskopische Effekte von Pflanzenhormonen, basipetaler IES-Transport,
pH-Gradienten in der Zelle, aktiver & passiver Transport, Hormonsensitivität verschiedener
Gewebe
5 mm
Pflanzen:
Rasierklingen
Zea mays-Keimlinge
Schraube (3 mm)
Geräte:
Rasierklingen, Lineal
Gummistopfen mit Glasscheibe
Versuch
5 mm Koleoptile
3 mm Spitze
Abfall
Praktische Durchführung:
Von im Dunkeln auf H20 angezogenen Zea mays-Keimlingen (5 Tage alt; Anzucht vom
Betreuer!) werden 5 mm lange Koleoptil-, Mesokotyl- bzw. Wurzel-Segmente mit Rasierklingen
(2 Klingen fixiert im Abstand von 5 mm) entnommen und je 10 Segmente im Dunkeln auf je 5
ml folgender Lösungen für 24 Std. inkubiert (das Wachstum wird vom Betreuer nach 24 Std.
durch Zugabe von 1 ml Äthanol gestoppt). Am folgenden Kurstag werden die Längen (in mm,
auf 0.5 mm genau) bestimmt und Mittelwerte sowie Standardabweichungen errechnet. Alternativ
Seite 18
können innerhalb einer Gruppe auch verschiedene Bereiche der Koleoptilen verglichen werden,
um die entwicklungsabhängige Modulation der Sensitivität zu demonstrieren.
Als Antagonist des auuxininduzierten Streckungswachstums wird Abscisinsäure (ABA)
eingesetzt (Stammlösung 10-2M).
Koleoptile:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Nährlösung (s.u.)
1µM IES (in Nährlösung)
10µM IES
(dito)
100µM IES (dito)
1000µM IES (dito)
100µM ABA (dito)
100µM ABA
+ 100µM IES (dito)
Mesokotyl:
(wie 1-7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
Wurzel:
15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
(dito)
1 nM IES (in Nährlösung)
10 nM IES
(dito)
100 nM IES (dito)
1000 nM IES (dito)
10µM ABA (dito)
10µM ABA
+ 1 nM IES (dito)
Zusammensetzung der Nährlösung:
50mM Saccharose
10mM KH2PO4
1mM MgSO4
0.5 mM Ca(NO3)2
0.1 mM FeCl3
pH 6.2
Indol-3-essigsäure
Abscisinsäure
Seite 19
Versuch 5
Nachweis des Syntheseortes von IAA in Maiskoleoptilen
Indol-3-essigsäure (IAA) wird bevorzugt in jungen Geweben gebildet und von dort zu anderen
Orten der Auxinwirkung transportiert.
Transport von Wachstumsregulatoren. Der Transport kann je nach Hormon von Zelle zu
Zelle, im Phloem oder auch im Xylem stattfinden. Der gerichtete Transport des Hormons Indol3-essigsäure (IAA) findet basipetal im Parenchym statt. An diesem IAA-Transport sind auf
zellulärer Ebene Carrier für Influx (Aufnahme in die Zelle) und Efflux (Abgabe aus der Zelle)
beteiligt. Als schwache Säure liegt die IAA (pKs 4.7) in der Zellwand zu ca. 50 % undissoziiert
(R-COOH) vor. Nach Aufnahme in die Zelle (über H+/IAA-Symport) bildet sich das IAA-Anion
(R-COO-), welches über einen basipetal lokalisierten Anionen-Carrier die Zelle verlässt.
In jungen Maiskeimlingen soll im Spross anhand drei verschiedener Gewebestücke die IAAKonzentration bestimmt werden. Dazu wird die Maiskoleoptile, die im Dunkeln angezogen
wurde (Streckungswachstum!), in drei verschiedene Abschnitte zerlegt.
3
Mesokotyl
2
1
Koleoptile + Primärblatt
Von jedem Gewebe werden zwischen 0.3 und 1 g Frischgewicht geerntet, die dann in einem
Mörser homogenisiert werden.
IAA Extraktion:
für 1 g Frischgewicht:
• Gewebe im Mörser mit Homogenisierungspuffer (65% iso-Propanol/35% 200 mM Imidazol
Puffer, pH 7) und wenig Seesand zerreiben, 2 ml Puffer/g Frischgewicht verwenden, den
Mörser mit einem weiteren ml Puffer ausspülen
Seite 20
• Proben 10 Minuten bei 13 000 rpm zentrifugieren
• Überstand abnehmen und den Anteil iso-Propanol eindampfen
• Aufreinigung des Extraktes mittels Ethylacetat-Extraktion:
- Einstellen des pH-Wertes der H2O-Phase auf 7.0
- Zugabe des gleichen Volumens Ethylacetat, vortexen des Extraktes
- Abnehmen der organischen Phase (Æ wird verworfen, weiter mit H2O-Phase)
- Einstellen des pH-Wertes der H2O-Phase auf 3.0
- Zugabe des gleichen Volumens Ethylacetat, vortexen des Extraktes
- Abnehmen der organischen Phase, möglichst quantitativ (H2O-Phase wird verworfen, weiter
mit organischer Phase)
- Trocknen der organischen Phase mittels Na2SO4 (eine Spatelspitze trockenes Na2SO4 zugeben)
- über Faltenfilter filtrieren und die organische Phase in einen Rotationskolben überführen
• Die Proben werden am Rotationsverdampfer bis zur Trockne evaporiert, in 2x 300 µl
Methanol resuspendiert und in einem N2-Strom auf 100 µl eingeengt. Anschließend werden die
Proben kurz zentrifugiert und in die Probengefäße für die HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) gegeben.
• Der gesamte Überstand wird nun mittels HPLC analysiert. Die HPLC-Bedingungen sind:
0.7 ml/min Flussrate, Detektion der Indolderivate bei 280 nm, Laufmittelgradient:
Lösungsmittel A: 1% wässrige Essigsäure
Lösungsmittel B: 100% Methanol
Der Gradient wird wie folgt angelegt:
20 Minuten von 70%A/30%B auf 40%A/60%B
10 Minuten konstant 40%A/60%B
innerhalb von 5 Minuten wird die Ausgangskonzentration wieder erreicht, 70%A/30%B
dann erfolgt noch mal ein Spül- bzw. Equilibirerungsschritt von 5 Minuten 70%A/30%B
Schema des Gradienten: A
,B
100%
Zeit
Seite 21
• Die Auswertung erfolgt anhand der Retentionszeit von Standardsubstanzen, die vorher im
selben Trennsystem analysiert worden sind. Eine weitere Hilfe zur Identifizierung der
Substanzen sind ihre Absorptionsspektren, die mit Hilfe eines Dioden-Array-Detektors
aufgenommen werden. Die Flächen der Substanzpeaks nach Integration stehen in einem
linearen Zusammenhang mit der Konzentration. Daher kann aufgrund der Flächeneinheiten, die
per Computer errechnet werden, direkt die Konzentration ermittelt werden.
Zur Berechnung der endogenen IAA-Konzentration dient die Beziehung:
-
19 Mio. Flächeneinheiten entspricht 1 µg IAA
Die ermittelte IAA-Konzentration wird dann pro Gramm Frischgewicht angegeben.
Alternativ dazu kann eine Parallelprobe mit Diazomethan (Abzug!) methyliert (der Methylester
von IAA ist leichter flüchtig) und mittels Gaschromatographie-Massenspektroskopie (GC-MS)
analysiert werden. Diese Methode bietet den Vorteil einer gleichzeitigen ‚echten’ Identifizierung
der gesuchten Substanz durch das charakteristische Massenspektrum. Dieser Teilversuch kann
durchgeführt werden, wenn genügend Zeit zur Verfügung steht.
Transportversuch:
Um Auxintransport nachzuweisen, werden 20 Koleoptilzylinderstücke, die wie in Versuch 4
präpariert werden, auf Agarblöcke (Wasser-Agar (0.8%) wurde in Petrischalen gegossen, dieser
wird herausgelöst und in Würfel zerschnitten) aufgebracht. Es werden zwei
Versuchsanordnungen gewählt:
1. die Stücke werden mit dem basalen Ende auf die Blöcke gesetzt
2.
die Stücke werden mit dem apikalen Ende auf die Blöcke gesetzt
Die Inkubation findet in einer feuchten Kammer statt, um das Austrocknen der Pflanzenstücke
zu verhindern. Nach 1-2 Stunden Inkubation werden die Agarblöcke wie für das
Pflanzenmaterial beschrieben extrahiert und der erhaltene Extrakt auf das Vorkommen von IAA
analysiert.
Stichworte zur Vorbereitung:
Auxine, Syntheseort/Wirkort, Biosynthese, Wirkungsweise von Auxinen, Keimung und
Wachstum von Maispflanzen (siehe auch Versuch 2 und 3)
Versuch 6
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Reportergene: Nachweis der GUS-Aktivität
Theoretischer Hintergrund:
Die Expression eines Gens erfordert, dass dem Gen in 5’-Position Basensequenzen vorgeschaltet
sind, die als Promotor eine organ- und stoffwechselspezifische Kontrolle der Expression
bewirken. Ein auf gentechnischem Weg in eine Pflanze eingeschleustes Fremdgen muss daher
mit einer Promotorsequenz versehen sein, um exprimiert werden zu können. Die Auswahl des
Promotors bestimmt, wo und unter welchen Bedingungen eine Genexpression erfolgt. Die
Wirkung einer Promotorsequenz lässt sich durch Reportergene überprüfen. Hierbei wird ein
Gen, dessen Produkt sich in einer Pflanze besonders gut nachweisen lässt, mit der
Promotorsequenz verknüpft. Als Reportergen wird häufig das Gen für das Enzym βGlucuronidase (GUS) aus E. coli verwendet, welches in Pflanzen mit anderem pH-Optimum
vorkommt. GUS ist ein Enzym, das eine Reihe von β-Glucuroniden durch Hydrolyse spaltet und
für das eine Reihe von Substraten erhältlich ist, die nach Spaltung spektrophotometrisch,
fluorometrisch oder durch eine Farbreaktion nachgewiesen werden können.
Neben der Extraktion und Messung mittels HPLC und/oder GC-MS (siehe Versuch 5) ist
eine weitere Möglichkeit des Nachweises von endogenen Hormonkonzentrationen mittels
auxininduzierbarer
Promotoren
gegeben.
Im
Praktikum
soll
die
Aktivität
eines
auxininduzierbaren Promotors (IAA2) aus Arabidopsis thaliana, der mit GUS als Reportergen
gekoppelt ist, in planta mit Hilfe einer Farbreaktion nachgewiesen werden. Solche Gene werden
in Arabidopsis thaliana als Aux/IAA-Gene bezeichnet und sind Transkriptionsregulatoren. Die
Aktivierung des spezifischen IAA2 Promotors durch Auxin resultiert in einer Expression des ßGlucuronidase-Gens. Die Farbreaktion durch Spaltung von X-Gluc (ein Indigo-Derivat) kann zur
histochemischen Anfärbung von Pflanzen-Organen (z.B. Blättern, Wurzeln) Geweben und
einzelnen Zellen genutzt werden. Als Kontrolle (natürlich vorkommende Auxinkonzentrationen)
dienen IAA2-Pflanzen, die nur in Nährlösung inkubiert wurden. Die Induktion durch Auxin wird
anhand einer Zeitreihe demonstriert, bei der die Pflanzen über unterschiedliche Zeiten mit 10-4
bis
10-6 M
IAA
inkubiert
wurden.
Mittels
Skizzen
sollen
die
unterschiedlichen
Expressionsmuster des IAA2-Promotors festgehalten werden (Binokular).
Die Aufnahme und Verteilung von IAA im Gewebe ist auch vom Transport abhängig.
Der Transport von IAA verläuft im Spross basipetal und in der Wurzel akropetal. Der gerichtete
Transport (siehe auch V5) ist abhängig von Carrier-Proteinen. Für Auxin sind sogenannte InfluxCarrier als auch Efflux-Carrier bekannt, die asymmetrisch in den Zellen angeordnet sind. Der
Auxin-Efflux-Carrier lässt sich mit sogennanten Phytotropinen inhibieren. Zu den Phytotropinen
Seite 23
gehört Naphthylphthalamsäure (NPA). In einem Teilversuch soll gleichzeitig mit IAA auch mit
NPA (5 µM) inkubiert und der Effekt dokumentiert werden.
A
B
Modell des polaren
Auxintransportes. NPA kann in
dem eingekreiseten Bereich
wirken, wahrscheinlich wird die
korrekte Lokalisierung des
Carriers in der Plasmamembran
unterbunden (A) oder NPA
bindet direkt an den Carrier (B).
Stichworte für die Vorbereitung:
Promotor, Reportergen, Transformation, Nachweis von Auxinen, Auxintransport
Geräte:
Photometer
Pflanzen:
Mutanten von Arabidopsis thaliana (IAA2 Promotor-GUS-Fusionen) im Keimlingsstadium auf
Nährmedium angezogen. Details zum Versuch sind beim Betreuer zu erfragen.
Praktische Durchführung:
Material:
Auf Agarplatten vorgezogene IAA2-Keimlinge
A) Auxinbehandlung:
Die Keimlinge werden vorsichtig (!) ohne sie zu verletzen von den Agarplatten genommen
(Pinzette) und in vorbereitete Vertiefungen von Makrotiterplatten, die Nährlösung + IAA oder
das künstliche Auxin 1-NAA in verschiedenen Konzentrationen enthalten, gegeben. Die
Seite 24
Zusammensetzung des Nährmediums (nach Murashige & Skoog) kann beim Betreuer erfragt
werden. Die Inkubation erfolgt für 2 h bei Raumtemperatur. Eine Kontrolle ohne Auxin wird
ebenfalls angesetzt.
IAA- bzw. 1-NAA-Konzentrationen:
10-4M
10-5M
10-6M
Kontrolle
Die Verdünnungen werden aus einer 10-2M Stammlösung hergestellt.
B) NPA- bzw. Flavonoid-Behandlung
Gleichzeitig zu einer IAA-Konzentration, die eine gut sichtbare Blaufärbung ergibt, werden
während der gesamten Inkubationszeit 5 µM NPA oder das Flavonoid Quercetin zugegeben
(wird aus einer 10-2M Stammlösung verdünnt). Dieser Ansatz wird mit dem Ansatz ohne NPA
verglichen und das Muster der Blaufärbung dokumentiert.
C) Histochemischer Nachweis
Das Substrat X-Gluc (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure-CyclohexylammoniumSalz) wird von den Zellen aufgenommen. In transformierten Zellen wird dieses Substrat von der
β-Glucuronidase, dem Produkt des GUS-Gens, durch Hydrolyse gespalten. Es entsteht ein
Indoxylderivat, das nach Oxidation (siehe dazu unten unter „Inkubations-Puffer“) blau wird und
ausfällt. Transformierte Zellen sind dadurch an ihrer blauen Farbe zu erkennen.
Schema zur ßGlucuronidase-Reaktion.
Im 1 Schritt erfolgt die
enzymatische Spaltung.
Das Produkt wird
unspezifisch oxidiert. Der
entstandene IndigoFarbstoff fällt am Ende
aus. Eine Diffusion ist
dann nicht mehr möglich.
Seite 25
Durchführung:
Nach der Behandlung (siehe A und B) werden die mit IAA2-Promotor/GUS-Konstrukten
transformierten Arabidopsis thaliana Pflanzen in der Inkubationslösung getränkt und 1h bei
37°C inkubiert. Eine kurze Vakuum-Behandlung (Exsikator/Pumpe) zur Entlüftung und damit
zur besseren Infiltration des Substrates kann von Vorteil sein. Die Inkubation wird durch das
Überführen der Pflanzen in Phosphat-Puffer beendet. Anschließend wird die Färbung der
Keimlinge skizziert. Bei grünem Gewebe ist es erforderlich, mittels einer Ethanol-Inkubation das
Chlorophyll zu entfernen, damit die Blaufärbung deutlicher sichtbar ist.
Inkubations-Puffer: In der Literatur werden unterschiedliche Puffer beschrieben, fast alle
basieren auf einem 0.1 M Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,4 (Puffer A). Die Verwendung eines
solchen Puffers ist deshalb notwendig, weil pflanzliche Zellen durchaus endogene
Glucuronidasen besitzen, deren pH-Optimum allerdings im sauren Bereich liegen. Oberhalb von
pH 7 sind diese endogenen Glucuronidasen jedoch meistens inaktiv. Puffer A ist in der Regel
ausreichend. Da allerdings die Blaufärbung des Substrates neben der Spaltung des Moleküls
durch die Glucuronidase außerdem noch eine Oxidation der Spaltprodukte voraussetzt, wird
noch ein Oxidationsmittel wie Kaliumferro/ ferricyanid dazu gegeben, außerdem noch
Na2EDTA zum Komplexieren unerwünschter Ionen und Triton zum besseren Eindringen des
Substrates in die Zellen.
Puffer A: 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.4.:
3.1
g NaH2PO4(x1H2O)
13.7 g Na2HPO4(x2H2O)
in
1l H2O, steril filtrieren.
Inkubations-Puffer
500 ml 0.1M Phosphatpuffer (= Puffer A) +
1.86 g Na2EDTA (10mM)
82 mg K3 [Fe(CN)6] (0.5 mM)
105 mg K4[Fe(CN) 6] (0.5mM)
0.5% Triton X-100
steril filtrieren
X-Gluc Stammlsg: 100 mg X-Gluc in 1 ml DMSO (Dimethylsulfoxid). Nur frisches DMSO
verwenden!
Seite 26
Es wird zuerst der Puffer A angesetzt und anschließend 500 ml dieses Puffers mit den
angeführten Zusätzen versehen (= Inkubations-Puffer). Unter dem Abzug arbeiten.
Zum Inkubieren werden 50 µl X-Gluc Stammlsg. in 10 ml Puffer (entspr. 0.5mg/ml) gelöst. Die
Inkubation wird gestoppt durch Überführung des Gewebes in Puffer oder in 70% Ethanol (s.
oben).
D) Photometrischer Nachweis der Blaufärbung
Die angefärbten Pflanzen werden mittels Dimethylsulfoxid (DMSO) homogenisiert, kurz
zentrifugiert und die Absorption bei 634 nm gemessen. Dieser semiquantitative Nachweis
erlaubt eine Aussage über die Reportergenaktivität in der ganzen Pflanze.
Seite 27
Versuch 7
Cytokinin-induzierte Synthese des Vakuolenfarbstoffs Betacyanin bei
Amaranthus caudatus ss. viridis
Hormonelle Regulation der Betacyanin-Synthese. In diesem Versuch wird demonstriert, wie
ein
synthetisches
Cytokinin
(Benzylaminopurin,
BAP)
die
Synthese
eines
roten
Vakuolenfarbstoffs, des Betacyanins in etiolierten Amaranthus-Keimlingen induziert.
Die Wirkung beruht auf einer Stimulation der Genexpression der beteiligten BiosyntheseEnzyme. Das im Nährmedium angebotene Tyrosin ist eine Vorstufe des Betacyanins. Im
Versuch wird die Konzentrationsabhängigkeit der Cytokinin-Wirkung quantitativ über die
photometrische Bestimmung des gebildeten Betacyanins erfasst.
(Spezialliteratur zu diesem Test: K.H. Köhler & K. Conrad, Biol. Rundschau 4 (1966) 3637; N.L. Biddington & T.H. Thomas, Planta 111 (1973) 183-186; Richter; Biochemie der
Pflanzen, Stuttgart 1966)
Stichworte für die Vorbereitung und Protokollbearbeitung:
Biosynthese und Grundstruktur von Anthocyanen & Betacyanin, Regulation der Genexpression
in Eukaryonten, Cytokinine (Struktur und Funktion).
Praktische Durchführung:
Versuchsansatz:
Pro Gruppe werden 7 Eppendorfröhrchen mit den Nummern 1-7 markiert und mit 250 µl der
unten angegebenen Induktionslösung beschickt. Von den Betreuern werden 2 Petrischalen mit je
etwa 70 zwei Tage alten, im Dunkeln bei 25oC angezogenen Amaranthus-Keimlingen zur
Verfügung gestellt. Mit einem scharfen Skalpell werden die oberen Teile der Keimlinge
(Keimblätter plus etwa 0,5 cm des Hypokotyls) abgeschnitten und je 10 Keimlingsspitzen in
jedes Röhrchen gelegt. Es muss zügig und im Dämmerlicht gearbeitet werden, damit die Spitzen
nicht austrocknen und nicht zuviel Licht bekommen. Die Keimlinge werden nach der
Präparation für etwa 20 Minuten durch Zusatz von 250 µl der unten angegebenen
Hormonlösungen induziert. Nach 20 Minuten wird die hormonhaltige Nährlösung abgezogen
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und die Eppendorfröhrchen gut verschlossen im Dunkeln 24 Stunden inkubiert. Sie werden dann
von den Betreuern bis zum nächsten Kurs eingefroren.
Hormonlösungen (je 1 ml in Induktionslösung)
1.
minus BAP (Kontrolle)
2.
2x 10-9 M BAP
3.
2x 10-8 M BAP
4.
2x 10-7 M BAP
5.
2x 10-6 M BAP
6.
2x 10-5 M BAP
7.
2x 10-4 M BAP
Achtung: Bei allen Schritten nach Zusatz der Hormonlösungen ist stets darauf zu achten,
dass es keine Verunreinigungen zwischen den Proben gibt: Stets die Proben in der
vorgegebenen Reihenfolge mit ansteigenden Hormonkonzentrationen bearbeiten!!!
Induktionslösung (zur Verdünnung der Hormonstammlösung):
10mM KH2PO4
2mM L-Tyrosin
ad pH 6.3
Benzylaminopurin (BAP) Stammlösung
2x
10-4 M
BAP in Induktionslösung
2. Auswertung:
Extraktion der Betacyanine:
Die Keimlingsspitzen werden aufgetaut und direkt in den Eppendorfröhrchen mit einem
passenden Pistill zerquetscht. Der resultierende Brei wird mit 700 µl einer Kochsalzlösung (200
mM NaCl plus 0,5% Triton) weiterverarbeitet. Das Homogenat wird mit 200 µl Chloroform
versetzt. Nach gründlichem Schütteln (Chloroform entfernt Fette) wird für 3 min in der Biofuge
A bei 13000 rpm zentrifugiert. Von der wässrigen (roten) Oberphase werden 300 µl entnommen
und in frischen Eppendorf-Gefäßen mit 700 µl H2O-bidest versetzt. Die Absorption der Proben
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wird bei 542 nm bestimmt. Als Referenz dient H2O-bidest. Die Absorptionswerte (A542) werden
halblogarithmisch gegen die BAP-Konzentrationen aufgetragen.
Benzylaminopurin (BAP)
Biosynthese von Betalainen (z.B. Amaranthin):
L-Tyrosin
DOPA
Betalaninsäure
Betaxanthine (gelb)
+
Cyclo-DOPA
Betanidin
Betanin
Amaranthin
Seite 30
Versuch 8
Induktion der Nitratreduktase in Agrostemma-Embryonen:
Über die hormonale Steuerung von Enzymaktivitäten bei Tieren existiert bereits eine
umfangreiche Literatur. In vielen Fällen konnte der Mechanismus weitgehend aufgeklärt werden
und bis in die Ebene der genetischen Informationsübermittlung verfolgt werden.
Unsere Kenntnisse über den Einfluss von Phytohormonen auf Synthese und Aktivität von
Enzymen in den Geweben höherer Pflanzen sind demgegenüber vergleichweise gering.
Für Gibberellinsäure konnte die Induktion der α-Amylasesynthese in Gerstendosperm
nachgewiesen werden. Auch für Auxin gibt es einige Beispiele; für die Gruppe der Cytokinine
liegen jedoch nur wenige Angaben vor. Cytokinine gelten allgemein als Zellteilungshormone.
Sie bewirken allerdings neben Zellteilung auch Zellververgrößerung.
Sie bringen eine Vielfalt von morphologischen Veränderungen hervor und verhindern vor allem
das Altern pflanzlicher Gewebe. Eines der wenigen bekannten Beispiele für eine Förderung von
Enzymaktivitäten ist die Induktion der Nitratreduktase in Embryonen durch Cytokinine (z.B.
Benzylaminopurin, BAP).
Die Nitratreduktase reduziert Nitrat zu Nitrit. Sie ist das erste Enzym einer Reaktionsfolge, in
welcher das von der Pflanze aus dem Boden aufgenommene Nitrat zu NH4+ reduziert wird.
Spezifischer H-Donator ist dabei NADH. Die Nitratreduktase ist in den Pflanzengeweben meist
nicht konstitutiv, sondern wird durch ihr Substrat induziert, wenn die Pflanze NO3-
im
umgebenden Medium vorfindet. Bei Agrostemma kann das Enzym statt durch Nitrat auch durch
ein Cytokinin induziert werden.
Bei der Induktion der Nitratreduktase handelt es sich um eine de novo-Synthese, was
durch Anwendung von Hemmstoffen der Proteinsynthese wahrscheinlich gemacht wurde.
Der endgültige Beweis wurde durch Dichtemarkierung des Enzymmoleküls (Deuterium;
18oC erbracht.
In den durchzuführenden Versuchen soll das Enzym durch sein Substrat (KNO3) und
durch das Cytokinin Benzylaminopurin (BAP) induziert werden. Ferner soll die Einwirkung
eines Hemmstoffs (Cycloheximid) auf die de novo-Synthese untersucht werden.
Die Bestimmung der Aktivität der Nitratreduktase erfolgt dabei nach zwei verschiedenen
Methoden: einmal im zellfreien Gewebeaufschluß (in vitro-Test), zum zweiten mit intaktem
Gewebe (in vivo-Test). Bei dem zweiten Verfahren macht man sich die Tatsache zunutze, dass
unter anaeroben Bedingungen (N2) und in Gegenwart eines Alkohols (Propanol) pflanzliches
Seite 31
Gewebe Nitrat aufnimmt und zu Nitrit reduziert, während die weitere Reduktion des Nitrits
blockiert ist. Das gebildete Nitrit wird ausgeschieden, so dass die im Medium bestimmte
Nitritmenge als Maß für die Aktivität der Nitratreduktase dienen kann.
Reagenzien:
Benzylaminopurin (BAP) 1mM Æ auf 0,1 mM verdünnen (50 ml)
(BAP in wenig 0,1 N NaOH lösen, mit verd. HCL auf pH 8,0)
einstellen und mit H2O bidest. auffüllen).
Cycloheximid 100µg/ml (100 ml)
KNO3
0,1 M
(100ml)
NaNO2
0,1 mM
(50 ml)
n-Propanol
Kaliumphosphatpuffer 1 M, pH 7,5
(100 ml)
Aufschlußpuffer: 0,1 M Tris-HCL pH 8,0
(500 ml), vor Gebrauch pro 50 ml 6 mg Cystein
frisch zusetzen
NADH
1mM (20 ml)
Zinkacetat
1 M (100 ml)
Sulfanilamidreagenz: 1g Sulfanilamid in 75 ml H2O und 25 ml konz. HCL
Naphthyl-Reagenz: 0,02 % wässr. Lösung von N-1-Naphtylethylendiamin
Material:
Samen von Agrostemma githago (Kornrade)
25 Petrischalen, Filtrierpapier, Karton mit Deckel
2 Teesiebe
Pinzetten, Präpariernadeln
je 10 Pipetten 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ml;
2 verstellbare automatische Pipetten
Reagenzgläser, 30 Glaszentrifugengläser
10 Erlenmeyerkolben mit Gummistopfen (25 ml Vol.)
Mörser, Seesand, Eisbad
Tischzentrifuge Piccolo (Heraeus)
thermostatisiertes Wasserbad 25o und 100oC.
Wasserbadschüttler mit Plattform für 25 ml Erlenmeyerkolben
Stickstoff-Flasche mit Reduzierventil
Photometer, Plastikküvetten
Seite 32
Versuchsdurchführung:
A. Präparation des Pflanzenmaterial
Agrostemma-Samen über Nacht (16 Std.) im Dunkeln in einer großen Petrischale auf feuchtem
Filterpapier bei Zimmertemperatur quellen lassen.
Für jede Probe (vgl. B.) 10 Embryonen (für in vivo-Test), bzw. 25 Embryonen (für in
vitro-Test) mit einer Pinzette aus dem Samen unverletzt herauspräparieren.
B. Vorbehandlung der Embryonen
Petrischalen (9 cm Ø) mit 2 Lagen Filtrierpapier auslegen und je 2 Petrischalen mit je 3 ml
von einer der folgenden Versuchslösung (a-k) tränken (je 1 Petrischale für in vivo- und
1 Petrischale für in vitro-Test):
a) H2O
h) Cycloheximid 20 µg/ml + BAP 10 µM
b) KNO3 50 mM
i) Cycloheximid 2 µg/ml + BAP 10 µM
c)
„
5 mM
k) Cycloheximid 0,2 µg/ml + BAP 10 µM
d)
„
0,5 mM
e) BAP 10 µM
f)
„
1 µM
g) „
0,1 µM
In jede Schale 10 bzw. 25 Embryonen legen und 24 Std. bei Zimmertemperatur im Dunkeln
stehen lassen. Danach die unter C. 2. und C. 3. beschriebenen Enzymtests durchführen.
C. Analytische Bestimmungen
1. Nitrit-Eichkurve:
In Reagenzgläsern werden0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8 ml 0,1 mM
Nitritlösung einpipettiert. Zum Ausschalten von Pipettenfehlern nur eine einzige Pipette
(0,5 oder 1,0 ml) verwenden!
Proben mit Aqua bidest. auf 1,0 ml ergänzen.
Zu den Proben je 1,0 ml Sulfanilamid- und Naphthylreagenz einpipettieren, mischen.
Nach 10 min die Extinktion bei 540 nm messen; als Blindwert dient eine Probe, die anstelle
von Nitrit nur Wasser enthält. Die gefundenen Werte in ein Diagramm eintragen
(Abscisse: Nitrit in nM; Ordinate: Extinktion) = Eichkurve.
2. In vivo-Enzymtest:
Seite 33
Die 10 Embryonen aus einer Petrischale auf ein Sieb geben und mit dest. Wasser abspülen.
Embryonen in einen eisgekühlten 25 ml Erlenmeyerkolben überführen, der 2 ml der folgenden
Inkubationslösung enthält: 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, 20 mM KNO3,
1 Vol.% n-Propanol (Endkonzentrationen). Als Blindprobe 1 Erlenmeyerkolben mit Inkubationslösung ohne Embryonen beschicken.
Eine Minute lang Stickstoff durch das Medium blubbern und Kolben sofort fest
mit
Gummistopfen verschließen; Proben im Wasserbadschüttler 30 min bei 30o inkubieren.
Sitz der Stopfen prüfen.
Reaktion abstoppen, indem der Kolben 10 sec in ein siedendes Wasserbad gehalten wird
(vorher Gummistopfen abnehmen); anschließend sofort im Eisbad abkühlen.
1,0 ml des Mediums mit je 1,0 ml Sulfanilamid- und Naphthylreagenz versetzen.
Nach 10 min Extinktion bei 540 nm messen. Als Blindprobe dient ein entsprechender
Ansatz mit 1,0 ml der Inkubationslösung.
Zur Auswertung an Hand der Eichkurve die in jedem Ansatz in 30 min gebildete Nitritmenge in
nMol/Embryo berechnen.
3. In vitro-Enzymtest:
Einsätze der Zentrifuge kalt stellen.
a) Herstellen des Enzym-Rohextraktes.
Die 25 Embryonen aus einer Petrischale auf ein Teesieb geben und mit dest. Wasser
abspülen. Embryonen in einem gekühlten Mörser im Eisbad mit 3 Spatelspitzen Seesand
und 5 ml gekühltem Aufschlusspuffer zerreiben und den Mörser mit 2 ml Puffer nachspülen.
Den entstandenen Brei in ein Glasröhrchen überführen und gleichmäßig auf 2 x 2 ml
Eppendorfgefäße verteilen.
Homogenat 15 min bei Einstellung 4 zentrifugieren).
Die klaren Überstände im Eisbad aufbewahren.
b) Enzymtest:
Folgende Lösungen in 20 Eppendorfgefäße im Eisbad in der angegebenen Reihenfolge
einpipettieren (für jeden Extrakt a)-k) 2 identische Ansätze):
0,4 ml Kaliumphosphatpuffer, 0,1 M (1M Stammlösung; 1:10 verdünnen)
0,1 ml KN03, 0,1 M
0,4 ml Extrakt
0,1 ml NADH 1 mM
Seite 34
Für jeden Extrakt wird je 1 Ansatz als Blindprobe (ao-ko) sofort mit 0,2 ml 1 M Zinkacetatlösung abgestoppt und im Eisbad belassen.
Ansätze im Wasserbad 1 Std. bei 25°C inkubieren. Abstoppen der Reaktion mit 0,2 ml Zinkacetatlösung; denaturiertes Protein in der Tischzentrifuge abzentrifugieren. (Einstellung 4).
1,0 ml klaren Überstand (bei weniger Überstand Volumen bestimmen und auch die Mengen an
Nachweisreagenz entsprechend einsetzen! Auf Küventtenvolumen achten!) mit einer
automatischen Pipette in ein Reagenzglas überführen, mit je 1,0 ml Sulfanilamid- und
Naphthylreagenz versetzen; nach 10 min Extinktion bei 540 mm
messen. Nach Korrektur um den Blindwert in jedem Ansatz die in 1 Std. gebildete Nitritmenge in nMol/Embryo berechnen. Vergleichen Sie die im in vitro-Test mit den im in vivo- Test
gebildeten Nitritmengen.
Literatur:
E.J. Hewitt: Assimilatory nitrate-nitrite reduction. Ann. Rev. Plant Physiol. 26 (1975) 73-100
P. Filner, J.L. Wray and J.E. Varner: Enzyme induction in higher plants. Science 165 (1969)
358-367.
H. Kende, H. Hahn and S. E. Kays: Enhancement of nitrate reductase activity benzyladenine in
Agrostemma githago. Plant Physiol. 48 /1971) 702-706.
H. Kende and T.C. Shen: Nitrate reductase in Agrostemma githago. Comparison of the
inductive effects of nitrate and cytokinin. Biochim. Biophys. Acta 286 (1972) 118-125.
Seite 35
Versuch 9
Entwicklungs- und organabhängige Regulation der Genexpression am
Beispiel von Peroxidase-Isoenzymen
Theoretischer Hintergrund:
Pflanzliche Peroxidasen. Im Genom höherer Pflanzen sind die Peroxidasen als Genfamilie
kodiert, deren Expression während der Entwicklung der Pflanze differentiell reguliert wird. Die
Gruppe der Peroxidasen setzt sich aus einer Reihe basischer und saurer Isoformen zusammen,
von denen einige über den normalen sekretorischen Weg in den Zellwand-Raum abgegeben
werden (Peroxidasen sind Glycoproteine). Hier katalysieren sie unter anderem folgende wichtige
Reaktionen:
1)
Kopplung von Extensin-Molekülen über Tyrosin-Reste
2)
Polymerisierung von Phenylpropan-Einheiten bei der Lignin-Synthese
3)
Oxidation von Indol-3-essigsäure
Verschiedene Isoformen haben unterschiedliche Substrat-Spezifitäten. Da die verschiedenen
Isoformen in ihrer Expression entwicklungsabhängig, teilweise wund-induziert und auch
hormon-reguliert
sind
(s.o.),
werden
sie
hier
zur
Darstellung
entwicklungs-
bzw.
organspezifischer Expression von Isoenzym-Mustern herangezogen.
Gelelektrophoretische Auftrennung enzymatisch aktiver Peroxidasen in Gegenwart von
Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Durchführung der Elektrophorese in Gegenwart von 1% SDS
führt zur Beladung aller basischen und sauren Proteine mit SDS (anionisches Detergenz !) und
damit zu einer negativen Gesamtladung (die eigenen Ladungen (basische/saure Aminosäuren)
sind zu vernachlässigen). Die Bindung von SDS verursacht eine partielle oder vollständige
Denaturierung vieler Proteine, doch macht man sich im vorliegenden Falle die Tatsache zu
Nutze, dass saure und basische Peroxidasen zwar SDS binden, hierdurch jedoch nicht in ihrer
Aktivität gehemmt werden. Die Aufrennung der Proteine bzw. Peroxidasen erfolgt über eine
sogenannte diskontinuierliche Gelelektrophorese: Hierbei werden die Proteine zunächst in einem
Sammelgel auf eine schmale Zone fokussiert (Ursache: hoher Spannungsabfall im Sammelgel
wegen Mangel an beweglichen Ionen, da das Glycin des Reservoirpuffers bei pH 6.8 als
Zwitterion vorliegt und der Reservoirpuffer keine Chlorid-Ionen enthält), so daß sie alle zum
Seite 36
gleichen Zeitpunkt in das Trenngel eintreten (man beachte, dass Sammelgel und Trenngel
unterschiedliche pH-Werte und Acrylamid-Konzentrationen haben !).
Stichworte zur Vorbereitung:
Hormonelle Regulation der Genexpression, pflanzliche Peroxidasen, Zellwand-Struktur,
Extensine, Lignin-Biosynthese, IES-Oxidasen, Isoformen, Multigenfamilien, Glycoproteine, der
sekretorische Weg (ER->Golgi->Zellwand), Gelelektrophorese
Pflanzen:
Zea mays-Keimlinge , 5 Tage alt.
Geräte:
Zentrifuge, Gelelektrophorese-Apparatur, Sephadex-Säulen
Praktische Durchführung:
a)
1.Halbtag:
Herstellung der entsalzten Protein-Extrakte
Die Zea mays-Keimlinge werden 5 Tage vor Kursbeginn vom Betreuer in Petrischalen ausgelegt
und im Dunklen sowie einem 16h/8h Tag-Nacht-Rhythmus gehalten.
Als Versuchsmaterial dienen:
a)
Wurzel (2cm-lange Segmente, von der Wurzelspitze)
b)
Mesokotyl (1cm-lange Segmente, unterhalb der Koleoptile)
c)
Primärblatt (Koleoptile bei Dunkelanzucht entfernen)
WU
MS
PB
Gewebeaufarbeitung:
1 g Frischgewicht Gewebe mit 1 ml Extraktionspuffer im Mörser
(auf Eis !!) homogenisiert (bei mehr oder weniger Frischgewicht auch auf eine veränderte
Puffermenge achten!)
pro Gruppe werden 3 Extrakte hergestellt (WU, MS, PB)
Extraktionspuffer:
50 mM MES, 1 M NaCl, mit Tris auf pH 6.5 einstellen
MES = 2-(N-Morpholino) - ethansulfonsäure
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a)
Die Homogenate werden in Eppendorf-Gefäße überführt und nach 15 minütigem
Schütteln bei 4 oC für 5 min zentrifugiert (13000 rpm, Biofuge A)
b)
200 µl der Überstände (Rohextrakte) werden in Sephadex G 25 Minisäulen
(Säulenvolumen 800 µl) entsalzt (pro Gruppe 3 Säulen); Elutionspuffer ist identisch mit
dem Extraktionspuffer, aber ohne NaCl, pH mit HCl einstellen.
Hestellen der Säulen:
2 g grobes Sephadex G 25 werden mit viel Elutionspuffer überschichtet und über Nacht quellen
lassen (in Schnappdeckelglas).
Für Säulenaufbau: in blaue abgeschnittene Spitze 800 µl Wasser aufziehen, eine Markierung
machen zur Fixierung des Volumens, Wasser verwerfen. Spitze mit wenig Watte füllen (dient
zum Auffangen des Sephadexes, nur ganz locker stopfen), an abgeschnittenes Ende den dünnen
Gummischlauch aufstecken und mit Klemme verschließen. Spitze in Stativ einstellen. Langsam
Sephadex einfüllen und dabei die Klemme soweit öffnen, dass sich das Sephadex langsam als
Säule aufbaut bis der Markierungsschritt erreicht ist. Säulenlänge 800 µl. Bis zum Einsatz der
Säule diese mit Elutionspuffer überschichtet stehen lassen.
d)
Proteinfraktionen entsalzen. Hierzu werden 200µl Rohextrakt mit 100 µl Dextranblau
gemischt und diese Mischung auf die Säule aufgetragen. Durch langsames Öffnen der
Klemme Probe in die Säule einziehen lassen bis kein Puffer über dem Säulenmaterial
steht. Dann mit Elutionspuffer überschichten und blaugefärbte Probe abfangen. Proben
auf Eis lagern.
e)
Aceton-Fällung (zur Konzentrierung der Proteine):
200 µl entsalzten Extrakts mit 800 µl Aceton (vorgekühlt bei -20°C)
mischen und anschließend bis zum Beginn des 2. Versuchsteils (mindestens 30 min) bei
-20°C lagern.
b)
2.Halbtag:
a)
Gefällte Proben für 10 min bei 13000 rpm zentrifugieren
b)
Nach Dekantierung des Überstandes wird erneut kurz anzentrifugiert und mit der 200
µl-Pipette alle Flüssigkeit quantitativ (!) entnommen
c)
Die Proben werden für 5 min bei 37°C "getrocknet"
(zur Entfernung des restlichen Acetons)
d)
Präzipitate direkt in je 40 µl Probenpuffer (s.u.) für die Gelelektrophorese
aufnehmen (lösen sich nicht komplett, evtl. noch mal kurz zentrifugieren Æ im
Überstand
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ist dann genug Protein gelöst)
e)
Durchführung der Gelelektrophorese (s.u.)
Gelelektrophorese in Gegenwart von 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) zum nativen
Nachweis von sauren und basischen Peroxidase-Isoenzymen
Vorbereitung des Gels: Es werden Minigele (Apparatur BioRad) gegossen.
10%iges Trenngel: 3.1 ml H20
2.5 ml Lösung 1
1.9 ml Lösung 2
30 µl Lösung 3
8 µl TEMED
Lösungen mischen und Trenngel sofort gießen. Das Gel polymerisiert in ca. 30 min, dann
Sammelgel gießen.
Sammelgel:
1.5 ml H20
375 µl Lösung 1
625 µl Lösung 4
10 µl Lösung 3
6 µl TEMED
Nach Polymerisation des Sammelgels den Proben-Kamm und die Gummidichtung (!) entfernen
und die Gel-Kasette einspannen. Elektroden-Puffer auffüllen (Luftblasen am unteren Gel-Rand
entfernen) und Proben auftragen
Durchführung der Gelelektrophorese:
Proben in 15 µl-Aliquots pro Gel-Tasche aufgetragen. Zusätzlich werden Marker-Proteine
definierter Größe vom Betreuer zur Verfügung gestellt. Die Elektrophorese bei 100 V starten,
wenn der Farbstoff das Sammelgel erreicht hat auf 200 V erhöhen. Elektrophorese abbrechen,
wenn der Farbstoff das Gelende erreicht hat (Gesamt-Laufzeit ca. 70 min).
Schema der Probenaufgabe:
Probe 0
1
15µl
MA
Probenpuffer
2
WU
3
MS
4
PB
5
PB
6
MS
7
WU
8
15 µl
Probenpuffer
Proben 1-5: Für Coomassie-Färbung
Proben 6-8
MA:
WU:
MS:
PB:
Für Peroxidase-Färbung
Marker-Proteine
Wurzelprobe
Mesoktylprobe
Primärblattprobe
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Lösungen für die Gelelektrophorese:
Lösung 1:
43.8 g Acrylamid
1.2 g bis-Acrylamid
ad 150 ml mit H20 bidest
Lösung 2:
18.2 g Tris (Base) in 80 ml H2O bidest lösen
mit 6 N HCl auf pH 8.8 einstellen
ad 100 ml mit H20 bidest
Lösung 3:
0.1 g Ammoniumperoxodisulfat (APS)
in 1 ml H20 bidest täglich frisch ansetzen
Lösung 4:
3.0 g Tris (Base) in 40 ml H2O bidest lösen
mit 6 N HCl auf pH 6.8 einstellen
ad 50 ml mit H20 bidest
Lösungen 1-4 nach Zubereitung filtrieren und bei 4 oC aufbewahren.
Lösung 5 (Reservoir-Puffer, 5fach konzentriert):
72 g Glycin
15 g Tris (Base)
5 g SDS
ad 1 L mit H20 bidest
Vor Gebrauch mit H20 1:5 verdünnen
(pH sollte zwischen 8.6 und 8.8 liegen, überprüfen).
Lösung 6 (Probenpuffer):
0.3 g Tris (Base)
2.0 ml Bromphenolblau-Lösung(Konz.: 1 mg/ml H20 bidest)
in 15 ml H2O bidest lösen
pH mit HCl auf 6.8 einstellen
mit 3.2 ml Glycerin mischen und mit H2O bidest auf 20 ml auffüllen
Färbung des Gels mit Coomassie R 250 : Proteinfärbung:
Nach Entnahme des Gels aus der Kasette nur (!) den zu färbenden Gelteil in Färbelösung für 30
min inkubieren. Anschließend in Entfärbelösung (mehrfach wechseln) inkubieren bis der GelHintergrund farblos ist (Dauer mindestens 2-3 Stunden).
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Färbelösung:
227 ml Methanol
46 ml Essigsäure
1.25 g Coomassie R 250
ad 500 ml mit H20 bidest
Entfärbelösung:
200 ml Äthanol
75 ml Essigsäure
ad 1 L mit H20 bidest
Nachweis der Peroxidase-Isoenzyme im Gel:
Den entsprechenden Teil des Gels mit Handschuhen in Färbelösung überführen (Vorsicht: dieser
Schritt ist vom Betreuer durchzuführen, unter dem Abzug !!!) und entwickeln bis PeroxidaseBanden sichtbar, anschließend mit Wasser gründlich spülen und mit Polaroid-Kamera Foto
anfertigen.
Färbelösung zum Peroxidase-Nachweis (immer frisch ansetzen):
a)
b)
c)
40 ml 0.2 M Na-Acetat
4 ml 5 mM MnSO4
4 ml 0.35% H202
Lösungen a-c in Färbeschale geben. Anschließend Gel einlegen und Lösung d) langsam am
Rand einfließen lassen. Nicht genau auf das Gel geben und sehr vorsichtig unter dem
Abzug arbeiten. Durch leichtes Schwenken der Färbeschale die Lösungen mischen.
d)
10 ml Benzidin-Guajakol-Lösung (Achtung: giftig!!)
(20 mg Benzidin + 10 ml 10%ige Essigsäure + 54 µl Guajakol)
Guajakol = Brenzkatechinmonomethyleter
Benzidin = 4,4´-Diamino-biphenyl sehr giftig!
Auswertung:
Die Gesamtprotein-Muster (Coomassie-Färbung) und die Peroxidase-Isoenzymmuster der
verschiedenen Proben (Wurzel, Mesokotyl, Primärblatt) werden miteinander verglichen. Die
Größe der Proteine/Peroxidasen ist durch Vergleich mit den Markerproteinen abzuschätzen
(Einschränkung: kein ß-Mercaptoäthanol im Probenpuffer !). Die gefärbten Gele werden mit der
Geldokumentationseinrichtung fotografiert. Für die Diskussion tauschen die Gruppen ihre
Ergebnisse aus.
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Versuch 10
Cytokinin- und Jasmonatwirkung auf den Alterungsprozeß (Seneszenz) von
grünen Blättern
Literatur:
1. Libbert, Lehrbuch der Pflanzenphysiologie, Gustav Fischer Verlag, Jena, 1987
2. Dörfling, Das Hormonsystem der Pflanzen, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1982
3. Mothes, Über das Altern von Blättern, Naturwissenschaften 47, S. 337-351 v. 1960
Objekt:
Blätter von jungen Bohnenpflanzen (Phaseolus vulgaris)
Blätter von jungen Maispflanzen (Zea mays)
Prinzip:
Cytokinine haben eine besondere Bedeutung für die Alterungsprozesse in Pflanzen. Blätter, die
nach dem Abschneiden bei hoher Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden, zeigen nach wenigen
Tagen Gelbfärbung, bedingt durch Chlorophyllabbau, sowie andere Seneszenzerscheinungen
wie Proteinabbau und Rückgang des RNA-Gehaltes. Besprühen der Blätter mit einer
Kinetinlösung verzögert diese Prozesse bzw. kehrt sie um: Der Chlorophyllabbau wird gestoppt,
die RNA- und Proteinsynthese wird wieder gesteigert. Umgekehrt wird die Seneszenz durch
Jasmonsäure gefördert.
COOH
O
Kinetin
Jasmonsäure
In diesem Versuch soll die Wirkung unterschiedlicher Cytokinin- und JasmonsäureKonzentrationen
auf
die
Seneszenz
isolierter
Bohnenblattstückchen
anhand
des
Chlorophyllgehaltes untersucht werden. Verwendet wird das künstliche Cytokinin Kinetin
(6-Furfurylaminopurin).
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Geräte und Reagenzien:
36 sterile Glaspetrischalen ∅ 10 cm mit je einem
Ansatz:
Filterpapier bestückt
5 Messkolben 50 ml
10 Messpipetten 5 ml
3 Bechergläser 600 ml
1 Korkbohrer Nr. 9
1 Brettchen
1 Pinzette
Filzschreiber
Natriumhypochloritlösung 0,2%
dest. Wasser
Extraktion:
3 Mörser und Pistill
Seesand
80 % Aceton
36 Zentrifugenröhrchen
1 Messzylinder 10 ml
1 Messpipette 5 ml
36 Reagenzgläser
Glasküvetten O.S.
Spektralphotometer
Citronensäure-Phosphat-Puffer 0,1 M pH 4,7
Lsg. I
0,1 M Citronensäure
Lsg. II 0,2 M Na2HPO4 48 Vol. % (ergibt pH 4,7)
Kinetin-Stammlösung 10-3 M
21,5 mg in 0,1 N KOH vorlösen und mit H2O ad 100 ml auffüllen
Jasmonsäure-Stammlösung 10-3 M
in Alkohol vorlösen, dann mit Citratpuffer auffüllen
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Durchführung:
Blätter zuerst mit 0,2 % Natriumhypochloridlösung oberflächensterilisieren, dann 2 x mit dest.
Wasser waschen. Mit Hilfe eines Korkbohrers werden Blattstücke von 1,5 cm Durchmesser
ausgestanzt. Dabei ist darauf zu achten, dass die Mittelrippe nicht ausgestanzt wird.
Die Hormonstammlösungen von Kinetin und JA (10-3 M) werden sukzessive mit 0,1 M
Citronensäure-Phosphat-Puffer pH 4,7 im Verhältnis 1 : 10 verdünnt, so dass folgende
Konzentrationen entstehen:
10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M und 10-8 M
Von jeder Konzentrationsstufe werden 5 ml in eine mit Filterpapier ausgelegte, sterile
Petrischale (3 Parallelansätze) pipettiert. Jede Petrischale wird mit 10 Blattstücken versehen.
Es werden Parallelversuche mit hell und dunkel gestellten Schalen durchgeführt. Die Kontrolle
enthält nur Citratpuffer.
Auswertung:
Nach 4-8 Tagen werden die Blattstücke bis zur Extraktion eingefroren. Die Extraktion der
Blattstücke (es wird jede Petrischale einzeln extrahiert) erfolgt im Mörser mit Seesand und 80%
Aceton (ca. 5 ml). Der Extrakt wird kurz abzentrifugiert (Tischzentrifuge, Stufe 4), der
Überstand wird dekantiert und auf ein bestimmtes Volumen (10 ml) aufgefüllt. Die Bestimmung
des Chlorophyllgehaltes erfolgt am Spektralphotometer. Jede Probe wird bei den Wellenlängen
663 nm und 645 nm geg 80% Aceton gemessen.
Der Chlorophyllgehalt berechnet sich nach folgenden Formeln:
(Ergebnis = Pigmentkonzentrationen in µg/ml bzw. mg/l)
Chlorophyll a = 9,78 x E663 - 0,99 x E645
Chlorophyll b = 21,4 x E645 - 4,65 x E663
Chlorophyll a + b = 20,2 x E645 + 8,02 x E663
Es sollen Chlorophyll a, b und Gesamtchlorophyllgehalt gegen die Kinetin- und JAKonzentration aufgetragen werden.
Fragen zur Auswertung:
1. Welche Wirkungen von Cytokininen sind Ihnen bekannt?
2. Beschreiben Sie den Vorgang der Seneszenz
3. Interpretieren und diskutieren Sie Ihre Versuchsergebnisse
Seite 44
Weitere Literatur:
Braune W. et al. Pflanzenanatomisches Praktikum I und II. Fischer-Verlag
Brauner L. & Bukatsch F. Das kleine pflanzenphysiologische Praktikum. Fischer-Verlag
Brunold C. et al. Streß bei Pflanzen. UTB-Verlag
Dörffling, K. Das Hormonsystem der Pflanzen. Georg Thieme Verlag
Eschrich W. Funktionelle Pflanzenanatomie. Spinger-Verlag
Flindt R. (1995) Biologie in Zahlen. Fischer-Verlag
Heldt H.W. Pflanzenbiochemie. Springer-Verlag
Heß D. Pflanzenphysiologie. UTB-Verlag
Inskeep W.P., Bloom P.R. (1985). Extinction coefficients of chlorophyll a and b in N,Ndimethylformamide and 80% acetone. Plant Physiol. 77: 483-485
Kindl H. Biochemie der Pflanzen. Springer-Verlag
Kutschera U. (1998) Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie. UTB-Verlag
Kutschera U. Kurzes Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. UTB-Verlag
Libbert E. Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. Fischer-Verlag
Marschner H. Mineral nutrition of higher plants. Academic Press.
Matile P., Kräutler B. (1995) Wie und warum bauen Pflanzen das Chlorophyll ab ? Chemie in unserer
Zeit 29: 298-306
Metzner H. Pflanzenphysiologische Versuche. Fischer-Verlag
Mohr H., Schopfer P. (1992) Pflanzenphysiologie, 4. Auflage, Springer-Verlag
Richter G. Biochemie der Pflanzen. Thieme-Verlag
Scheibe R. (1996) Die Regulation der Photosynthese durch das Licht. Biologie in unserer Zeit 26: 27-34
Schopfer P. (1986). Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Methoden. Springer -Verlag
Schopfer P. (1989). Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Anwendungen. Springer Verlag
Sitte P. et al. Strasburger - Lehrbuch der Botanik. Fischer-Verlag
Wyler H. (1969). Die Betalaine. Chemie in unserer Zeit 3: 146-151
Seite 45
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