NA+/K+·ATPASE: ASSOZIATION DER - ETH E

DISS. ETH NI. 12833
NA+/K+·ATPASE:
ASSOZIATION DER UNTEREINHEITEN UND
REGULATION DURCH NO UND cGMP
Abhandlung zur Erlangung des Titels von
Doktor der Naturwissenschaften
der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich
vorgelegt von
Luca Pontiggia
Dipl. Natw. ETH Zürich
geboren am 16. Juli 1968
von Ligometto, Tessin
Angenommen auf Antrag von:
Prof. Dr. K. Winterhalter, Referent
Prof. Dr. Heini Murer, Korreferent
PD Dr. Sergio Gloor, Korreferent
1998
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Die Na+/K+-ATPase besteht aus zwei nicht kovalent verbundenen Untereinheiten. Die
katalytische a-Untereinheit ist ein 110 kDa Membranprotein, das die Plasmamembran
zehnmal durchspannt. Es besitzt die Bindungstellen für Natrium, Kalium, ATP und den
spezifischen Inhibitor Ouabain. Die ß-Untereinheit ist ein Glykoprotein von ca. 50 kDa
mit einer einzigen Transmembrandomäne. Die Masse des Kernproteins beträgt 32 bis 35
kDa. Die ß-Untereinheit induziert die konformationelle Stabilität der a-Untereinheit im
endoplasmatischen Retikulum und ist essentiell für den Transport des funktionell aktiven
Enzyms zur Plasmamembran. Es sind heute drei a und drei ß Isoformen bekannt, sodass
theoretisch 9 verschiedene Isoenzyme gebildet werden können. Die Isoformen sind durch
verschiedene Gene kodiert.
Um herauszufinden, ob ß-Untereinheiten selektiv mit a-Isoformen assoziieren können, habe ich Wildtyp- und chimäre ß-Untereinheiten in L929-Zellen exprimiert und die
Assoziation mit der endogenen o.l als Funktion der Resistenz gegenüber durch Detergenzien verursachter Dissoziation analysiert. Das Ziel war, die o/ß-Interaktionsstellen zu lokalisieren und aufzuklären, ob die Assoziation verschiedener Isoformen äquivalent ist.
Um zu beurteilen, ob alle Chimären mit der endogenen al assoziieren können, habe ich
Koimmunpräzipitationsexperimente in Anwesenheit von 1% Digitonin oder 0.5% Triton
X-100 als Detergens durchgeführt. Mit Digitonin war jede ß-Chimäre in der Lage, wie die
Wildtyp-Proteine mit al zu assoziieren. In Anwesenheit von Triton X-IOO waren nur die
native ß1 und die Chimäre A (mit der extrazellulären Domäne von ß1) in der Lage, a1 in
gleichen Mengen zu binden wie in Anwesenheit von Digitonin. Die Interaktion der extrazellulären Domäne von ß2 mit a1 ist in Anwesenheit von 1% Triton X-IOO nicht mehr
stabil. Dieses Ergebnis zeigt, dass a1ßl-Komplexe durch stärkere Kräfte als a1ß2Komplexe zusammengehalten werden und dass die Stärke der Interaktion durch die extrazelluläre Domäne von ß bestimmt wird.
Ich habe mir dann die Frage gestellt, ob diese ß-Proteine einen Unterschied in der
Na+JK+-ATPase-Aktivität in L929-Zellen verursachen. Die ouabainsensitive, Na+/K+ATPase-spezifische ATP-Hydrolyseaktivität wurde in allen Klonen bestimmt und mit der
Aktivität in nicht-transfektierten L929-Zellen verglichen. Die Expression der Wildtyp-ßIsoformen und die Expression der Chimären erhöhten die Nat/K'-A'I'Pase-Aktivität um
30- bis 70%. Dieses Resultat bestätigt die funktionelle Aktivität aller chimären ß-Untereinheiten.
NO und cGMP haben eine grosse Bedeutung in der Regulation der neuronalen Aktivität. Die Na+/K+-ATPase der Bluthimschranke und der Gliazellen spielt ihrerseits eine
Rolle in der Aufrechterhaltung der ionalen Umgebung, in der sich die Hirnfunktionen abspielen. Die Regulation der Na+/K+-ATPase durch NO und cGMP wurde bis jetzt sehr
wenig untersucht: Gemäss Literatur bewirken NO und cGMP eine Aktivierung oder
Hemmung der Na+/K+-ATPase. Ich habe diesen Regulationsmechanismus in Himendothelzellen (bEND4) und Gliazellen (C6) untersucht, indem ich die 86Rb+-Aufnahme (als
Mass für die Na+/K+-ATPase-Aktivität) nach Inkubation mit NO, cGMP und PKG-Inhibitoren gemessen habe: cGMP und NO haben die Na+/K+-ATPase innerhalb von 15 min
in bEND4 um ca. 40% und in C6 um ca. 20% gehemmt. Rp-cGMP (ein PKG-Inhibitor)
VIll
ZUSAMMENFASSUNG
hat eine tendenzielle Aktivierungswirkung in C6-Zellen gezeigt, was für eine direkte oder
indirekte Rolle von PKG in der Na/Kt-A'I'Pase-Regulation spricht. Diese Daten erlauben
nicht zu entscheiden, ob die Senkung der Na+/K+-ATPase-Aktivität durch NO und cGMP
direkt durch die Phosphorylierung des Enzymes oder indirekt durch Aktivierung anderer
Effektorproteine erfolgt.
Die Experimente mit C6-Astrozyten haben gezeigt, dass die Na+/K+-ATPase durch
cAMP aktiviert und durch KT5720 gehemmt wird. In bEND4-Zellen hat cAMP keinen
Effekt gezeigt, KT5720 hat hingegen die Na+/K+-ATPase gehemmt, wobei cAMP diese
Wirkung nicht verhindern konnte.
Durch die PCR-Untersuchung der Isoformexpression habe ich sowohl in bEND4- als
auch in C6-Zellen grosse Mengen rx l-, ßl- und ß3 gefunden. a2- und ß2- waren auch
exprimiert, die a3-mRNA aber kaum: Ich erwarte deshalb, dass die Zellen neben o.lß l
grosse Mengen an alß3 und kleinere Mengen an a2ß2-Isoenzymen exprimieren. Die
Messung der Na/Kt-A'I'Pase-Aktivität als Funktion der Ouabainkonzentration hat die
Anwesenheit eines grossen Anteils an ouabainresitenten Enzymen (a 1) und eines kleinen
Anteils an ouabainsensitiven Enzyme (a2 oder (3) bestätigt. Diese Zellinen, eignen sich
deshalb für das Studium der isoformspezifischen Regulation: cGMP hat die al-bedingte
Aktivität vermindert und die a2-assoziierte Aktivität nicht beeinflusst. Dies weist darauf
hin, dass die cGMP-Hemmung der Na+/K+-ATPase Aktivität in bEND4-Zellen isoformspezifisch ist.
IX
SUMMARY
Summary
The Na+/K+-ATPase is composed oftwo non covalently linked subunits. The catalytic
a subunit, a 110 kDa transmembrane protein traversing the plasma membrane ten times,
carries the binding sites for sodium, potassium, ATP and the specific inhibitor ouabain.
The ß subunit is a glycoprotein with a single transmembrane spanning segment and a core
protein weight of 32 to 35 kDa. The ß subunit induces conforrnational stability of the a
subunit in the endoplasrnic reticulum and is needed for transport of the functionally active
enzyme to the plasma membrane. 3 a and 3 ß isoforrns are known so far. They are encoded by different genes giving rise to nine isoenzymes.
To exarnine whether ß isoforrns assemble with a in a selective manner, I have overexpressed wild-type and chimeric ß subunits in L929 cells and exarnined assembly with the
endogenous al as a function of resistance towards detergent-mediated dissociation. The
purpose of this study was to further map interacting sites and to exarnine whether assembly between all isoforrns is equivalent. To assess whether all chimeras assemble with the
endogenous al isoform, I perforrned coirnrnunoprecipitation experiments, in the presence
of 1% digitonin or 0.5% Triton X-IOO as a detergent. With digitonin each ß chimera was
able to assemble with al, sirnilar to the wild-type ß subunits. With Triton X-IOO only the
native ßl isoforrn as weIl as chirnera ß2/ßl with the extracellular domain of ßl coprecipitated with al in quantities sirnilar to those obtained in the presence of digitonin. The
interaction of the extracellular domain of ß2 wiht al becomes unstable in the presence of
1% Triton X-IOO. This indicates that allßl complexes are held together by stronger interactions than allß2 complexes and that the strength of the interaction with al is deterrnined by the extracellular domain of the ß isoforrn. I then asked, whether these ß subunit
proteins caused any difference in the Na,K-ATPase activity in L929 cells. Ouabain-sensitive sodium pump-specific hydrolysis of ATP was deterrnined in all clones and compared
to control cells. The expression of wild-type ß isoforrns as weIl as all chimeras elevated
Na,K-ATPase activity between 30 and 70%. These data demonstrate the functional activity of all chimeric ß subunits.
NO and cGMP play an important role in the regulation of neuronal activity. The
Na+/K+-ATPase of the blood-brain-barrier and of glial cells plays an essential role in the
maintenance of the ionic environment where brain functions take place. The regulation of
the Na+/K+-ATPase by NO and cGMP is still poorly understood: according to the Iiterature both NO and cGMP can activate or inhibit the pump. I studied this regulation mechanism in mouse brain endothelial cells (bEND4) and rat glial cells (C6) by measuring the
86Rb+ uptake (for the Na+JK+-ATPase activity) after incubation with NO, cGMP and PKG
inhibitors.
cGMP and NO reduced the pump activity within 15 rnin by about 40% in bEND4 and
about 20% in C6. Rp-cGMP (a PKG inhibitor) mainly activated the pump in C6. This
suggests a direct or indirect role ofPKG in the Na+JK+-ATPase regulation. These data do
not allow to discrirninate whether the inhibition of the pump is achieved by a direct phosphorylation of the enzyme or indirectly by the activation of other effector proteins.
x
SUMMARY
The experiments with C6 show that the Na+/K+-ATPase is activated by cAMP and inhibited by KT5720 (a PKA inhibitor) whereas in bEND4 cAMP had no effect, KT5720
also inhibited the pump.
By RT-PCR analysis of the isoform expression I found in both bEND4 and C6 strong
expression of al, ßl and ß3 and weak expression of a2 and ß2. a3 was hardly detectable. It is therefore likely that the cells preponderantly generate up to six different isoenzymes: mainly alßl and alß3 with few a2-isoenzymes. The measurements of the
ouabain-dependent Na+/K+-ATPase activity confirmed the presence of about 80%
ouabain-resistent enzymes (al) and about 20% ouabain-sensitive enzymes (a2 or (3).
Therefore these celllines provide a system to investigate the isoform-specific regulation of
the Na+/K+-ATPase activity: cGMP inhibits mainly the o.l subunit but hardly affects a2.
These data suggest that inhibition of Na+/K+-ATPase activity by cGMP occurs in an isoform-selective manner in brain endothelial cells.
XI