Dissertation2015

Einfluss der Zytostatikakombinationen
Epirubicin/Cyclophosphamid + Paclitaxel und
Carboplatin/Paclitaxel auf die in vitro Oxidation von LDL
bei Frauen mit Mammakarzinom
Aus der Frauenklinik
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Markus Habermeyer aus Gunzenhausen
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. R. Dittrich
Gutachter:
Prof. Dr. M. Beckmann
Tag der mündlichen Prüfung:
16. Juni 2015
1. Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
1.2 Methoden
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
1.4 Praktische Schlussfolgerungen
1.5 Abstract
2. Einleitung
2.1. Mammakarzinom
2.1.1 Epidemiologie und Ätiopathogenese
2.1.2 Anatomie der weiblichen Brust
2.1.3 Diagnostik und Früherkennung
2.1.4 Therapie
2.2. Chemotherapie des Mammakarzinoms
2.2.1 Alkylantien
2.2.2 Anthrazykline
2.2.3 Taxane
2.2.4 Platinverbindungen
2.3. Zielsetzung
-1-1-1-1-2-3-
3. Material
3.1. Studienteilnehmer
3.2. Laborhilfsmittel, Spritzen und Kanülen
3.3. Testlösungen und Chemikalien
3.4. Lösungsmittel und Puffer
3.5. Geräte
-14-14-14-15-15-15-
4. Methoden
4.1. Theoretischer Teil
4.1.1 LDL Zusammensetzung
4.1.2 Lipidperoxidation
4.1.3 In-Vitro-Oxidation des LDLs durch die
kupferkatalysierte Oxidation nach
Esterbauer
4.2. Experimenteller Teil
4.2.1 Plasmagewinnung
4.2.2 LDL Isolierung
4.2.3 Reinigung des LDL
4.2.4 Ermittlung der LDL-Konzentration im
Eluat
4.2.5 LDL- Oxidation in vitro
4.2.6 Herstellung der Pufferlösungen
4.3. Statistik
-17-17-17-18-
-5-5-5-6-7-8-10-10-11-11-12-12-
-19-21-21-22-22-23-24-24-25-
5. Ergebnis
5.1. Einfluss von Chemotherapeutika auf die
In-Vitro-Oxidation von LDL
5.1.1 Epirubicin, Cyclophosphamid und
Paclitaxel
5.1.2 Carboplatin und Paclitaxel
-26-26-26-33-
5.2. Vergleich der beiden Chemotherapie-Schemata -40(EC-P vs. CP)
5.3. Zusammenfassung der Ergebnisse
-446. Diskussion
6.1 Oxidativer Stress und seine Folgen
6.2 Interpretation der Studien- Ergebnisse
6.3 Analyse der verwendeten Zytostatika bezüglich
pro-oxidativer Eigenschaften
6.3.1 Epirubicin
6.3.2 Cyclophosphamid
6.3.3 Paclitaxel
6.3.4 Carboplatin
6.4 Bezug der Studie zur aktuellen Forschung
6.4.1 Das Mammakarzinom als Ursache
oxidativen Stresses
6.4.2 Antioxidantien als supportiver
Therapieansatz
-45-45-46-
7. Literaturverzeichnis
8. Abkürzungsverzeichnis
9. Danksagung
10. Lebenslauf
-54-60-62-63-
-48-48-48-49-50-51-51-52-
1 1.Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Der aktuellen Datenlage zu Folge erkrankt in Deutschland jede 11. Frau an
Brustkrebs.
Die
Polychemotherapie
stellt
dabei
einen
grundlegenden
Bestandteil in der Behandlung des Mamma Karzinoms dar. Die Anwendung der
Zytostatika geht sowohl mit einer Reduktion malignen Gewebes als auch einer
Schädigung gesunder Zellen und daraus resultierender Nebenwirkungen
einher. In etlichen Studien stehen die antineoplastischen Stoffe im Verdacht,
freie Radikale zu bilden.
Ziel dieser Arbeit war es, zwei der häufig angewendeten PolychemotherapieSchemata (Epirubicin, Cyclophosphamid und Paclitaxel sowie Carboplatin und
Paclitaxel) bezüglich ihres pro-oxidativen Potentials und der etwaigen
Veränderung im Verlauf der Therapie zu untersuchen und herauszufinden, ob
ein Unterschied bezüglich ihres Oxidativen Status besteht.
1.2 Methoden
Zur Bestimmung der Menge an Antioxidantien im Blut der brustkrebserkrankten
Probandinnen
wurde
die
Lipoproteinen
(LDL)
nach
kupferkatalysierte
Esterbauer
Oxidation
verwendet.
von
Nach
low-density-
Isolation
des
Lipoproteins erfolgt hierbei der Angriff freier Sauerstoffradikale auf mehrfach
ungesättigte Fettsäuren. Die dabei entstehenden Diene können aufgrund ihres
Absorptionsmaximums bei 234nm photometrisch erfasst werden.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Die durchgeführten Messungen zeigen, dass es weder im Verlauf der beiden
Polychemotherapien noch im Vergleich des EC-P Schemas mit der CP
Therapie zu signifikanten Veränderungen in der Dauer der Lag- Phase und
somit der Oxidierbarkeit von LDL gekommen ist.
EC-P Schema: Z.v. Chemo 44,2±4,4min; 1.Zyklus 57,7±19,9min; 2.Zyklus
51,9±15,0min; n=8; Z.v. Chemo vs. 1.Zyklus p=0,066; Z.v. Chemo vs. 2.Zyklus
p=0,126; 1.Zyklus vs. 2.Zyklus p=0,335
2 CP Schema: Z.v. Chemo 53,4±16,5min; 1.Zyklus 61,1±19,5min; 2.Zyklus
62,9±11,9min; n=8, Z.v. Chemo vs. 1.Zyklus p=0,360; Z.v. Chemo vs. 2.Zyklus
p=0,053; 1.Zyklus vs. 2.Zyklus p=0,803
EC-P Schema vs. CP Schema:
Z.v. Chemo p=0,139; 1.Zyklus p=0,716; 2.Zyklus p=0,104
1.4 Praktische Schlussfolgerung
Zytostatika und ihre vielfältigen Reaktionen bleiben Gegenstand intensivster
Forschungsbemühungen. Etliche Studien schreiben die Wirkungsweise von
Chemotherapeutika und deren Nebenwirkungsspektrum der Bildung freier
Radikale zu. Im Rahmen der Studie konnte weder dem EC-P noch dem CP
Kombinationsschema ein signifikanter Einfluss auf die Konzentration an
Radikalen nachgewiesen werden. Es gilt jedoch die oxidativen Eigenschaften
des
Tumorgewebes
selbst,
sowie
autoregulatorische
Vorgänge
des
menschlichen Körpers zu beachten. Eine therapiebegleitende Gabe von
Antioxidantien scheint somit wenig sinnvoll.
3 1.5 Abstract
Background:
In Germany one out of eleven women suffers from breast cancer.
Chemotherapy is a fundamental treatment to this disease. Cytostatic drugs are
known to reduce neoplasm but can also damage healthy cells and come with a
variety of side effects. According to several studies many of these
antineoplastic substances are suspected to form free radicals. The aim of this
study was to compare two frequently used chemotherapy schemata (Epirubicin,
Cyclophosphamid and Paclitaxel vs. Carboplatin and Paclitaxel) according to
their pro- oxidative potential and its possible change during bout of
chemotherapy. Differences between the two combinations were also examined.
Materials and Methods:
Differences in low-density lipoprotein (LDL) susceptibility to oxidation were
measured by using the Esterbauer method in blood from patients suffering of
breast cancer. Measuring the lag phase of LDL oxidation makes it possible to
study antioxidative effects.
Result:
According to our data there is neither a significant difference in the duration of
the lag phase during either bout of chemotherapy nor in LDL oxidation between
the two schemata.
EC-P schemata: before application 44,2±4,4min; 1.bout 57,7±19,9min; 2.bout
51,9±15,0min; n=8; Z.v. chemo vs. 1.bout p=0,066; Z.v. chemo vs. 2.bout
p=0,126; 1.bout vs. 2.bout p=0,335
CP schemata: before application 53,4±16,5min; 1.bout 61,1±19,5min; 2.bout
62,9±11,9min; n=8, Z.v. chemo vs. 1.bout p=0,360; Z.v. chemo vs. 2.bout
p=0,053; 1.bout vs. 2.bout p=0,803
EC-P schemata vs. CP schemata:
Z.v. chemo p=0,139; 1.bout p=0,716; 2.bout p=0,104
4 Conclusion:
Cytostatic drugs in treatment of breast cancer are objects of current researches.
Numerous studies claim that outcome and side effects of chemotherapy depend
on free radicals. According to our study neither EC- P nor CP schemata had a
significant influence on the concentration of free radicals in blood samples.
Nevertheless the oxidative power off the tumor itself, as well as the adjustments
made by the body need to be considered as an impact on oxidability of LDL.
Therefore an additive application of antioxidants seems not reasonable.
5 2. Einleitung
2.1. Mammakarzinom
2.1.1 Epidemiologie und Ätiopathogenese
Unter dem Begriff Mammakarzinom wird ein heterogenes Krankheitsfeld
zusammengefasst. Es besteht aus verschiedenen Arten von Malignomen, die
sich anhand ihrer Morphologie, der Aggressivität und des Ausbreitungsmusters
unterscheiden lassen [85].
Entsprechend dem Robert Koch Institut zählt Brustkrebs heutzutage weiterhin
zu den weltweit häufigsten malignen Neubildungen der Frau. Besonders
betroffen ist die weiße Bevölkerung der Industrienationen. Das Risiko in
Deutschland an Brustkrebs zu erkranken liegt bei 9,2 % und betrifft somit
beinahe jede 11. Frau [90]. Auch wenn diese Erkrankung nicht zwangsläufig
tödlich endet, führt sie doch die Sterblichkeitsstatistik mit 13,7 % an [20]. Drei
viertel aller Erkrankungen werden bei Frauen über dem 50. Lebensjahr
diagnostiziert, aber auch jüngere Frauen sind vermehrt betroffen [29]. Im
Vergleich dazu erkranken Männer mit einem Anteil von weniger als 1 % aller
Brustkrebsfälle deutlich seltener [102].
Die Ursachen und Risikofaktoren der Entstehung von Mammakarzinomen
wurden bereits in etlichen großen Studien untersucht. So konnte eine positive
Korrelation zwischen einer Brustkrebserkrankung und früher Menarche, später
Menopause, hohem Alter bei der ersten Schwangerschaft und Kinderlosigkeit
nachgewiesen werden [29]. Ein weiterer wesentlicher Risikofaktor ist die
familiäre Belastung. Etwa 5 % der Brustkrebserkrankungen sind erblich bedingt,
wobei eine Genmutation im BRCA 1 oder BRCA 2 Gen nachgewiesen werden
kann [54]. Des Weiteren besitzen auch Frauen mit positiver Familienanamnese
ohne genetisch messbare Prädisposition ein erhöhtes Erkrankungsrisiko.
Etliche
Mammakarzinome
werden
in
ihrem
Wachstum
durch
die
Sexualhormone Östrogen und Gestagen beeinflusst. Dies gilt es insbesondere
bei der postmenopausalen Hormonersatztherapie zu bedenken. Ethnische
Faktoren sind von geringerer Bedeutung, ätiopathologisch bedeutsamer
hingegen der sogenannte Life-Style wie z.B. regelmäßiger Alkoholkonsum,
Vitaminmangel, fettreiche Ernährung sowie Adipositas. Wichtigster Risikofaktor
jedoch ist das fortgeschrittene Alter. Das relative Risiko an Brustkrebs zu
6 erkranken, ist in der Altersgruppe zwischen 65 und 69 Jahren etwa 17-mal
größer als in der Altersgruppe zwischen 30 und 34 Jahren [29]. Da die meisten
Frauen ein oder mehrere der meist unbeeinflussbaren Risikofaktoren besitzen,
wird es jedoch trotz des Wissens um die Ursachen in den einzelnen Fällen
kaum gelingen das Erkrankungsrisiko zu mindern.
2.1.2 Anatomie der weiblichen Brust
Betrachtet man die weibliche Brust von außen, dann erkennt man eine
halbkugelförmige Erhebung auf Höhe der 3-7 Rippe, in deren Zentrum die
Brustwarze liegt [37]. Hier münden die Ausführungsgänge der 15-20
tubuloalveolären Drüsen, aus denen es bei der laktierenden Mamma zur
Milchejektion kommt. Durch Bindegewebe und Septen, lässt sich die Mamma in
Lappen und Läppchen unterteilen. Die Tumorzellen breiten sich lokalsegmental
in
den
Milchgängen
und
Bindegewebssepten
aus,
das
Mammakarzinom entsteht vorwiegend einseitig im oberen äußeren Quadranten
[29]. Die dorsale Begrenzung bildet die Faszie des Musculus pectoralis, auf der
die Brust im gesunden Zustand frei beweglich ist [88].
Von
besonderer
Bedeutung
für
die
Metastasierungswege
des
Mammakarzinoms sind Lymphabfluss und venöser Abstrom. Die Lymphbahnen
lassen
sich
in
ein
oberflächliches,
hautnahes
Netz
und
ein
tiefes,
parenchymnahes Netz unterteilen. Außerdem wird zwischen dem lateralen und
medialen Drainageweg unterschieden. Lymphflüssigkeit aus dem lateralen
Brustbereich fließt zu den axillären Lymphknoten, während der mediale Anteil in
die intercostale Abflussbahn mündet und zu den parasternalen Lymphknoten
drainiert. Da ein Großteil der Lymphflüssigkeit in die Axilla abgeleitet wird,
zeigen sich hier meist die ersten Metastasen [100]. Im Verlauf können dann
indirekt über die axillären Lymphknoten auch die Supraclaviculären und
Infraclaviculären befallen werden [29]. Die hämatogene Metastasierung erfolgt
frühzeitig und hptsl. über die Vv. thoracicae internae et laterales und
manifestiert sich dann in 15 % der Fälle in der Lunge und in 70 % in den
Knochen [88].
7 2.1.3 Diagnostik und Früherkennung
Stellt die Frau oder der Gynäkologe einen suspekten Befund der Mamma fest,
erfolgt nach ausführlicher Anamnese und Inspektion zunächst die gründliche
Palpation von Brust und Lymphabflusswegen. Es folgt die Bildgebung mittels
Sonographie, wodurch Zysten und Fibroadenome mit hoher Sicherheit gegen
Karzinome abgegrenzt werden können. Im Rahmen der komplementären
Mammadiagnostik werden die klinische Untersuchung und der Ultraschall durch
die Mammographie ergänzt, mit der die Darstellung von Mikrokalk gelingt.
Zeigen sich hierbei verdächtige Veränderungen, wird die Diagnose durch die
Gewinnung einer Gewebeprobe gesichert. Dies geschieht meist durch eine
Stanzbiopsie. Das so gewonnen Präparat wird histopathologisch aufgearbeitet
und
im
Falle
eines
Karzinoms
der
Hormonrezeptorstatus,
der
Differenzierungstyp und der histologische Typ bestimmt [94]. Histopathologisch
lassen sich die Mammakarzinome nach der WHO Klassifikation in nichtinvasive und invasive Typen einteilen, wobei das Pagetkarzinom der Brustdrüse
eine Sonderstellung einnimmt [29].
Nicht-invasive Karzinome
Invasive Karzinome
Duktales Carcinoma in situ (DCIS)
Invasives duktales Karzinom
Lobuläres Carcinoma in situ (LCIS)
Invasives duktales Karzinom mit dominanter
intraduktaler Komponente
Invasives lobuläres Karzinom
Muzinöses Karzinom
Papilläres Karzinom
Tubuläres Karzinom
Adenoid-zystisches Karzinom
Sekretorisches (juveniles) Karzinom
Apokrines Karzinom
Karzinome mit Metaplasie
Andere Typen
Tabelle 1: WHO-Klassifikation der Mammakarzinome
Mit einem Anteil von 65 % stellt das invasiv duktale Karzinom die Mehrheit aller
Mammakarzinome dar, gefolgt vom duktalen Carcinoma in situ (DCIS) mit 1020 % und dem invasiven lobulären Karzinom mit 5-15 %. Die restlichen
Tumorarten treten weitaus seltener auf [57].
8 In ausgewählten Fällen kommen die Kernspintomographie, sowie die Zytologie
bei
Mamillensekretion
diagnostisch
zum
Einsatz.
Zu
den
Staging-
Untersuchungen, die spätestens nach der Histologiegewinnung durchgeführt
werden sollten, zählen der Röntgen- Thorax, die Sonographie der Leber, sowie
die Durchführung eines Skelettszintigramms.
Etwa 80 bis 90 % aller Geschwulste der weiblichen Brust wurden bisher von
den Frauen selbst zufällig entdeckt. Bestimmte Veränderungen der Mamma wie
z.B. neu aufgetretene Knoten, persistierende Hautrötungen, Einziehungen,
sowie Ausfluss aus der Mamille können auf eine maligne Entartung hinweisen
[89]. Da das Mammakarzinom jedoch in der Regel erst spät symptomatisch
wird, ist das Tumorstadium bei Erstuntersuchung der tast- und sichtbaren
Tumoren
meist
weit
fortgeschritten
und
dementsprechend
mit
einer
schlechteren Prognose verbunden. Um pathologische Auffälligkeiten frühzeitig
zu erkennen haben sich in Deutschland Screening Untersuchungen etabliert.
So steht entsprechend der gesetzlichen Krebsvorsorge jeder Frau neben der
systematischen Schulung zur Selbstabtastung ab dem 30sten Lebensalter eine
jährliche Tastuntersuchung zu. Vom 50 bis 69 Lebensjahr wird alle zwei Jahre
ein Mammographiescreening empfohlen [18]. Durch einen flächendeckenden
Einsatz konnte die Mortalität des Mammakarzinoms dadurch bereits um über 30
% gesenkt werden [33].
2.1.4 Therapie
Die Therapie des Mammakarzinoms ist individuell, d.h. sie erfolgt in
Abhängigkeit
vom
Allgemeinzustandes
Tumorstadium
und
der
unter
Berücksichtigung
Begleiterkrankungen
der
Patientin.
des
Das
Mammakarzinom ohne Fernmetastasierung ist per definitionem kurabel,
wohingegen das Mammakarzinom mit manifester hämatogener Aussaat in der
Regel palliativ zu behandeln ist [29]. In diesen Fällen stehen die Verlängerung
der Lebenszeit sowie die Verbesserung der Lebensqualität im Vordergrund. Die
Strategie
zur
Tumorkonferenz
Behandlung
durch
wird
im
Rahmen
Gynäkologen,
einer
interdisziplinären
Radiologen,
Onkologen,
Strahlentherapeuten und Pathologen erarbeitet und nach Einbindung der
Patientin, festgelegt. Prinzipiell besteht die Möglichkeit zur neoadjuvanten
Therapie, der Operation sowie der adjuvanten Therapie, wobei meist eine
9 Kombination der Therapieformen angewendet wird.
Bei inflammatorischen Mamma Karzinomen oder zunächst inoperablen
Tumoren empfiehlt sich eine primäre, sogenannte neoadjuvante Therapie zur
Verkleinerung der Tumorgröße. Meist kommen Chemotherapeutika oder
antihormonelle Therapien zum Einsatz, deren Anwendung die Operation bzw.
brusterhaltende Operation ermöglichen. Zugleich kann eine Aussage zum
Ansprechen des Karzinoms auf die jeweilige Therapie getroffen werden.
Eine brusterhaltende Therapie (BET) ist heute bei bis zu 60 % der Erkrankten
möglich [84]. Dabei muss das Karzinom im Gesunden, mit mind. 1 cm
Sicherheitsabstand reseziert werden. Gegen eine brusterhaltende OP sprechen
eine
ungünstige
Brust-Tumor-Größenrelation,
Infiltration
in
umliegendes
Gewebe, multizentrische Herde sowie ausgedehnte Einbrüche in Blut- oder
Lymphgefäße [43]. In diesen Fällen ist die Mastektomie Mittel der Wahl, wobei
neben dem gesamten Brustdrüsenkörper die Pectoralisfaszie sowie die
axillären Lymphknoten entfernt werden [43]. Prinzipiell sollte wenn möglich aber
immer brusterhaltend operiert werden, da der Krankheitsverarbeitungsprozess
für die Frau so erleichtert werden kann. Je nach Wunsch und Situation ist auch
ein Brustaufbau nach Mastektomie möglich. Die Operation dient zum einen der
Verhinderung
eines
Lokalrezidives,
zum
anderen
soll
eine
mögliche
Metastasierung durch vollständige Entfernung des Tumors verhindert werden.
Die Entfernung der Lymphknoten hat sowohl diagnostische als auch
therapeutische Bedeutung. Da meist die axillären Lymphknoten zuerst befallen
sind,
hat
sich
heutzutage
die
selektive
Entfernung
des
Sentinel
(Wächterlymphknoten) durchgesetzt. Dieser wird mit Farbstoff oder Radionuklid
markiert und intraoperativ mittels Schnellschnitt histologisch untersucht. Im
Falle einer Tumorinfiltration erfolgt dann ggf. die Axilladissektion mit ihren
unerwünschten
Nebenwirkungen,
wie
Lymphödem,
Bewegungs-
und
Empfindungsstörungen [43, 95].
Nach einer brusterhaltenden Therapie muss die verbleibende Brust bestrahlt
werden, um das Risiko eines Lokalrezidivs zu senken [101]. Zur Zerstörung
möglicher Mikrometastasten schließt sich in etlichen Fällen eine adjuvante,
systemische
Therapie
Lymphknotenbefall
an.
erfolgt
Je
eine
nach
Alter,
hormonelle
Hormonrezeptorstatus
Behandlung
und
/
und
oder
Polychemotherapie. GnRH-Analoga, Antiöstrogene wie Tamoxifen sowie
Aromatasehemmer kommen zum Einsatz. Ebenso wird die Immuntherapie bei
10 Tumoren mit Überexpression von HER2 durch spezifische Antikörpergabe (z.B.
Trastuzumab) angewandt [43, 101].
2.2. Chemotherapie des Mammakarzinom
Im Rahmen der adjuvanten Chemotherapie steht den Patientinnen in
Abhängigkeit von TNM-Klassifikation, Grading und histologischem Subtyp, ein
breites Spektrum an Zytostatika zur Verfügung. Vor allem Epirubicin, Taxane,
Cylclophosphamid, Methotrexat, 5-Flurouracil und Doxorubicin kommen bei der
Behandlung des Mammakarzinoms zum Einsatz. In der Praxis werden meist
mehrere Zytostatika im Rahmen einer Polychemotherapie kombiniert, um
möglichst lange Überlebenszeiten und bessere Remissionsraten zu erreichen.
Durch aktive Forschung und dem permanenten Erlangen neuer Erkenntnisse ist
die Therapieform jedoch einem ständigen Wandel unterworfen. Aus diesem
Grund
wird
im
Folgenden
nur
auf
die
in
der
Arbeit angewandten
Chemotherapeutika eingegangen.
Betrachtet man die Eigenschaften der Zytostatika finden sich einige
Gemeinsamkeiten. Bis auf wenige Ausnahmen wirken diese Medikamente nicht
lokal begrenzt sondern systemisch. Dies bietet die Möglichkeit auch Streuherde
des Primärtumors zu erreichen, birgt allerdings den Nachteil, dass auch
körpereigene Zellen Ziel der Zytostatika Wirkung werden können. Insbesondere
sich rasch teilende Zellen sind davon betroffen. Wird die Zelle durch das
Therapeutikum irreparabel geschädigt, begibt sie sich in den programmierten
Zelltod (Apoptose). In seltenen Fällen führen Zytostatika induzierte Mutationen
zum Entarten einer ursprünglich gesunden Zelle, sodass nach gewisser
Latenzzeit eine zweite Tumorerkrankung entstehen kann.
Nicht zu vernachlässigen sind die zahlreichen Nebenwirkungen wie z.B.
Emesis, Knochenmarksdepression u.v.m. mit denen die ChemotherapiePatientinnen zu kämpfen haben. Ebenso muss an eine mögliche tumoreigene
Resistenzentwicklung gegen das jeweilige Zytostatikum gedacht werden.
2.2.1 Alkylantien
Alkylantien sind Stoffe mit hochreaktiven Alkylresten. Sie gehen mit
Nukleinsäuren und Proteinen kovalente Bindungen ein, die zu Störungen in der
RNA- und DNA- Synthese führen. Ohne die Möglichkeit der Zelle ihre
Erbinformationen fehlerfrei zu replizieren stirbt sie letztendlich ab. Betroffen sind
11 besonders Zellen mit einer hohen Teilungsrate, wie man sie beispielweise in
Tumorgewebe
aber
auch
in
der
Darmschleimhaut
findet
[81,
105].
Cyclophosphamid stellt einen Vertreter dieser Gruppe dar und wird in
Kombination mit Epirubicin und Paclitaxel häufig in der Therapie des malignen
Mammakarzinoms
eingesetzt.
Zu
den
häufigsten
Nebenwirkungen der
Alkylantien gehören Alopezie (91 %), Müdigkeit (89 %) und Gewichtszunahme
(68 %) [93].
2.2.2 Anthrazykline
Anthrazykline wie Epirubicin gehören zur Gruppe der Topoisomerase II
Inhibitoren. Sie sind aus Streptomyces-Arten isolierte Antibiotika, die die
Zellteilung blockieren, indem sie in der Interphase die Kondensation der DNADoppelstränge zu Chromosomen hemmen. Im Detail induziert das Enzym
Topoisomerase II Doppelstrangbrüche und ermöglicht so die Passage von
benachbarten DNA-Doppelsträngen durch die Bruchstelle. Im Anschluss daran
werden die Enden wieder aneinander geführt und der Bruch verschlossen.
Anthrazykline hemmen diesen letzten Schritt, was zu einer Anhäufung von
Doppelstrangbrüchen führt. Die Tumorzelle kann sich nicht weiter teilen und
geht unter [34].
Eine gravierende Nebenwirkung dieser Pharmaka ist die Kardiotoxizität. In
Studien konnte gezeigt werden, dass neben der akuten Schädigung des
Myokards,
kongestive
Kardiomyopathien
vermehrt
auftreten.
Dies
ist
insbesondere der Fall, sobald eine kumulative Dosis von 900 mg/m2 Epirubicin
erreicht wird. Dieser Wert sollte nicht überschritten werden, da es folglich zu
einem signifikanten Anstieg tödlicher Herzfehler kommt [61, 73]. Aufgrund der
unselektiven Wirkungsweise der Anthrazykline treten darüber hinaus noch
weiter Nebenwirkungen auf, die für die Patienten zum Teil zu extremen
Belastungen
führen.
Insbesondere
sind
Knochenmarkssupression
mit
Leukopenie, Mukositis und Gastrointestinale Beschwerden, wie z.B. Übelkeit
und Erbrechen beschrieben [55].
2.2.3 Taxane
Die ursprünglich aus der Rinde der pazifischen Eibe gewonnenen Taxane
interagieren mit dem mikrotubulären System der Zelle. Die Zytostatika weisen
dabei eine besondere Affinität zur ß-Untereinheit des Tubulins auf. Durch ihre
12 Bindung fördern sie die Polymerisation der Mikrotubuli und hemmen gleichzeitig
deren Abbau. Bei der Zellteilung kann das Zytoskelett nicht umgebaut und der
Spindelfaserapparat nicht aufgebaut werden. In der Zelle wird daraufhin die
Apoptose eingeleitet. Zu den wichtigsten Vertretern gehören Paclitaxel und
Docetaxel, wobei Docetaxel eine stärkere antineoplastische Wirkung zu haben
scheint [17]. Wie die meisten zytostatischen Medikamente wirken Taxane nicht
ausschließlich auf malignes Gewebe, sondern auch auf Körpereigenes. Davon
betroffen sind insbesondere Zellen mit hoher Mitoserate. Am häufigsten kommt
es während der Therapie zum Hand-Fuß Syndrom (62 %), Diarrhö (58 %),
Übelkeit (55 %), Erbrechen (37 %) und Stomatitis (34 %) [14].
2.2.4 Platinverbindungen
Schwermetallkomplexverbindungen wie Cisplatin oder Carboplatin haben einen
ähnlichen Wirkmechanismus, wie die Alkylantien und werden teilweise auch zu
ihnen gezählt. Im Körper entstehen positiv geladene Aqua-komplexe, die zu
Quervernetzungen im DNA-Molekül führen. Cisplatin hemmt zusätzlich die
DNA-Reparatur und die Telomeraseaktivität.
Ein Nachteil in der Behandlung mit Platinverbindungen ist ihre stark erhöhte
Toxizität gegenüber nicht malignen transformierten Zellen und eine mögliche
Resistenzbildung im Verlauf der Therapie. Ein weiterer Punkt sind die
zahlreichen Nebenwirkungen, wie Nephro- und Ototoxizität, aber auch
zerebrale Beschwerden und Übelkeit werden beobachtet [46, 47].
2.4 Zielsetzung
Die Möglichkeiten Krebserkrankungen frühzeitig zu diagnostizieren und zu
therapieren haben sich in den Vergangenen Jahren stetig verbessert. Dennoch
ist eine vollständige Heilung, insbesondere bei fortgeschritten Tumorstadien
selten. Ebenso wird angenommen, dass die Wahrscheinlichkeit an einem
Malignom zu versterben, aufgrund des demographischen Wandels innerhalb
der EU im Jahr 2013 leicht zunehmen wird [67].
Um diesem Trend entgegen zu wirken, setzt die Wissenschaft auch im Rahmen
des Mammakarzinoms auf neue Wirkstoffe wie z.B. speziell designte
Antikörper, die Wachstum und Metastasierung hemmen. Dennoch bleiben
etablierte Therapien, wie Chemotherapeutika ein essentieller Bestandteil in der
13 Behandlung und unterliegen somit der permanenten Weiterentwicklung.
Zahlreiche
unerwünschte
Nebenwirkungen
der
Zytostatika
nehmen
gravierenden Einfluss auf die Lebensqualität der Patientinnen. Insbesondere
der Zytostatika induzierte Oxidative Stress und seine Folgen sind Gegenstand
aktueller Forschung.
In
der
folgenden
Arbeit
soll
der
Einfluss
chemotherapeutischer
Substanzgruppen, bzw. des Epirubicin / Cyclophosphamid und Paclitaxel
Schemas sowie des Carboplatin / Paclitaxel Schemas auf das antioxidative
Potential von LDL, in brustkrebserkrankten Frauen näher betrachtet werden.
14 3. Material
3.1. Studienteilnehmer
Aus dem Patientenpool der Frauenklinik der Universität Erlangen-Nürnberg
wurden 18 Frauen ausgewählt, die aufgrund eines diagnostizierten MammaKarzinoms in Behandlung waren. Entsprechend ihres Chemotherapie-Schemas
wurden die Patientinnen zwei Gruppen zugeordnet. Die Hälfte der Frauen
wurde nach dem Epirubicin, Cyclophosphamid gefolgt von Paclitaxel (EC-P
Schema) behandelt, die Übrigen erhielten Carboplatin und Paclitaxel (CP
Schema).
Als Kontrollreihe diente präpariertes LDL aus dem Plasma eines gesunden
Mannes,
dessen
BMI
sowie
Plasmaspiegel
im
Normbereich
lagen,
Medikamente wurden dabei nicht eingenommen.
Die
Durchführung
der
Studie
wurde
von
der
Ethik-Kommission
der
Medizinischen Fakultät der Friedrich - Alexander - Universität ErlangenNürnberg genehmigt.
3.2. Laborhilfsmittel, Spritzen und Kanülen
Einmalspritze 5 ml
Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Einmalspritze 10 ml
Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Einmalkanüle
Fa. Erhardt - Söhne GmbH, Gelslingen
(1 x 60 mm)
Eppendorf-Cups
Fa. Eppendorf, Hamburg
3,2 ml Monovette® KE
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
Monovetten®-Kanüle Nr. 2
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
(0,8 x 38mm)
PP-Test tubes 10 ml
Fa. Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
15 3.3. Testlösungen und Chemikalien
Ethylendiamintetraacetat (EDTA)
Fa. Sigma, Deisenhofen
KBr
Fa. Sigma, Deisenhofen
Natriumhydroxid
Fa. Sigma, Deisenhofen
NaCl
Fa. Sigma, Deisenhofen
O2
Fa. Linde Gas, München
3.4. Lösungsmittel und Puffer
Aqua dest.
Zentrallaboratorium der Universitätskliniken
Erlangen
CuSO4-Lösung
Endokrinologisches Labor der Frauenklinik
Erlangen-Nürnberg
PBS-Puffer
Endokrinologisches Labor der Frauenklinik
Erlangen-Nürnberg.
Zentrifugationspuffer
Endokrinologisches Labor der Frauenklinik
Erlangen-Nürnberg.
3.5. Geräte
Drucker für UV/VIS-
Fa. Epson, Epson France
Spektrometer: Epson LQ 200
Gelbettsäulen, Econo-Pac 10 Fa. BIO RAD GmbH, München
DG
Heat Sink
Fa. Beckmann Instruments, München
Kühlschrank: Liebherr
Fa. Liebherr, Ochsenhausen
Premium
Modell Optima LE-80 K
Fa. Beckmann Instruments, München
Multipipetten
Fa. Renner, Dannstadt
Quarzküvetten
Fa. Sigma, Deisenhofen
Quick-Seal® Tubes
Fa. Beckmann Instruments, München
Rotor: Ti 75 Beckmann®
Fa. Beckmann Instruments, München
16 Spectrometer: Perkin-Elmer
Fa. Perkin-Elmer, Überlingen
Lambda 2
Tube TopperTM
Fa. Beckmann Instruments, München
Ultrazentrifuge: Beckmann®
Fa. Beckmann Instruments, München
Wasserbad
Fa. Colora, München
Zentrifuge: Hettich Universal Fa. Hettich, Tuttlingen
30F
17 4. Methoden
4.1. Theoretischer Teil
4.1.1 LDL Zusammensetzung
Low-Density-Lipoprotein
(LDL)
zählt
zu
den
vier
wichtigsten
Lipoproteinfraktionen. Der Größe nach absteigend ergibt sich folgende
Reihenfolge: Chylomikron, VLDL, IDL, LDL und HDL [5]. Diese lassen sich
durch
präparative
voneinander
Ultrazentrifugation
trennen
und
beziehungsweise
anhand
ihre
Elektrophorese
Lipid-
und
Apolipoproteinzusammensetzung unterscheiden [63].
Die Apolipoproteine, also die Proteinanteile, fungieren dabei als Stabilisatoren
des eigentlichen Moleküls und als Mediatoren für den weiteren Metabolismus
im Stoffwechsel [66]. Sie umhüllen den wasserunlöslichen Kern aus
Fettmolekülen, Triglyceriden und Cholesterinestern und gewährleisten so den
Transport dieser Substanzen innerhalb unseres Körpers [63].
Betrachtet man das humane LDL im Speziellen, so handelt es sich dabei um
einen sphärischen Partikel mit einem Durchmesser von 15-25 nm, einem
Molekulargewicht von 2500 kD und einer Dichte von 1,019 – 1,063 g/ml. Im
Inneren befindet sich ein stark hydrophober Kern aus vornehmlich Cholesterin,
welches mit langkettigen, meist mehrfach ungesättigten Fettsäuren verestert ist.
Die Hülle wiederum besteht aus Phospholipiden, nicht verestertem Cholesterin
und dem Apoprotein B-100 (Apo-B), einem wie oben bereits erwähntem
Apolipoprotein, mit einem Molekulargewicht von 500 kD und einer Affinität zum
LDL-Rezeptor [72]. Über diesen Rezeptor kann Lipoprotein per Endozytose
aufgenommen werden und dadurch Cholesterin in der Körperperipherie
bereitgestellt werden [15]. Zum Schutz vor Radikalen besitzt das LDL
lipidlösliche
Antioxidantien,
Coenzym Q [13, 27].
wie
alpha-Tocopherol,
Beta-Carotin
oder
18 Relative elektrophoretische
Dichte (g/l)
Größe (Å)
Proteinanteil (%)
1,019-1,063
150-290
20-25
Mobilität
B (Beta)
Cholesterin-
Phospholipidanteil
Triglyceridanteil
anteil (%)
(%)
(%)
50-60
18-24
4-8
Apolipoproteine (%)
B (Hauptbestandteil)
E (Nebenbestandteil)
Tabelle 2: Zusammensetzung des LDL Partikels [32]
4.1.2 Lipidperoxidation
Täglich kommt der menschliche Körper mit einer Vielzahl an Radikalen in
Kontakt. Manche stellt der Organismus selbst her, andere werden ihm von
außen
zugeführt.
So
besitzt
zum
Beispiel
jeder
Mensch
Regulationsmechanismen und Enzyme, wie die NADPH- Oxidase, die im
Rahmen
von
Entzündungsreaktionen
Sauerstoffradikale
erzeugt [42].
für
Treffen
Krankheitserreger
solche
Radikale
toxische
auf
zelluläre
Membranen führt dies zum Verlust von Funktion und Aufbau bis hin zum Zelltod
[44]. Um ein unkontrolliertes Ablaufen und somit eine Schädigung des Körpers
zu
vermeiden
besitzen
Zellmembranbestandteile
wie
die
die
meisten
Zellen
Superoxiddismutase
und
antioxidative
Glutathion-
peroxidase [21, 49].
Die eigentliche Lipidperoxidation wird durch das ungepaarte Elektron eines
Radikals initiiert. Dieses reagiert dabei mit den Doppelbindungen ungesättigter
Fettsäuren, darunter insbesondere Linolen- und Arachnidonsäure, deren
Konzentration
im
LDL
Partikel
dabei
signifikant
abnimmt.
Die
dabei
entstehenden Fettsäureradikale können nun wiederum an molekularem
Sauerstoff angreifen, wobei es zur Umlagerung zum Peroxylradikal kommt.
Dieses reaktionsfreudige Molekül ist in der Lage einer weiteren ungesättigten
Fettsäure ein Elektron zu entziehen, was zur Bildung eines Fettsäurehyperoxids
führt und über das neu entstandene Fettsäureradikal, die Kettenreaktion
aufrechterhält [91].
Esterbauer hat in seinen Versuchen gezeigt, dass durch die Doppelbindungen
der Fettsäurehydroperoxide, die Veränderung der Absorption bei einer
Wellenlänge von 234 nm kontinuierlich photometrisch nachweisbar ist [35]. Das
19 dabei entwickelte Verfahren stellt die Basis für die später durchgeführten
Messungen
der
Lag-Phase
am
präpariert
LDL
der
Mammakarzinom
Patientinnen dar.
Bild 1: Lipidperoxidation bei LDL [28, 78]
4.1.3 In-Vitro-Oxidation des LDLs durch die kupferkatalysierte Oxidation
nach Esterbauer
Im Lauf der Zeit etablierten sich verschiedene Möglichkeiten, die In-VitroOxidation von LDL zu belegen. In einigen Studien erfolgte dabei die Inkubation
mit Fibroblasten [36], Endothelzellen [45], Makrophagen [52] und glatten
Muskelzellen [70]. Meist geschieht dies Zellvermittelt. Eine weitere Möglichkeit,
bei der kein Kontakt zwischen Zellen notwendig ist, besteht in der Verwendung
von Kupferionen oder Eisenionen [71].
Die In-Vitro-Oxidation von LDL durch die kupferkatalysierte Oxidation nach
Esterbauer ist ein vielfach durchgeführtes Verfahren [79, 108] und kam auch in
den folgenden Versuchen zum Einsatz. Dabei entstehen Lipidhyperoxide, die
die gleiche Löslichkeit besitzen wie LDL und ein Absorptionsmaximum bei 234
nm aufweisen. Dadurch sind sie im flüssigen Milieu photometrisch nachweisbar
[35]. Je größer der Gehalt an Antioxidantien im LDL Molekül ist, desto länger
dauert die Peroxidationsreaktion von mehrfach ungesättigten Fettsäuren zu
20 Dienen.
Im Verlauf der Reaktion können drei Phasen unterschieden werden:
Lag-Phase: In dieser Phase steigt die Konzentration an Hydroperoxiden
nur sehr langsam an. Dementsprechend findet sich auch nur ein geringer
Anstieg der im Photometer gemessenen Extinktion. Der Grund ist ein
Verbrauch von im Lipoprotein endogen vorhandenen Antioxidantien, wie
Vitamin E, β-Carotin, Ubichinon u.a., die die LDL-Partikel vor radikalischen
Angriffen schützen. Die Lag- Phase lässt sich dementsprechend künstlich
verlängern, indem man antioxidativ wirkende Substanzen, wie zum
Beispiel Vitamin C zum Versuchsansatz hinzugibt. Die Lag-Phase endet,
sobald die Antioxidantien weitgehend aufgebraucht sind.
Propagations-Phase: Diese zweite Phase zeichnet sich durch einen
raschen Extinktionsanstieg aus. Die pro-oxidativ wirkenden Cu2+ Ionen
können nun direkt an den Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren
angreifen und überführen diese in Lipidhydroperoxide, deren Extinktion bei
234 nm messbar ist.
Decompositions-Phase: Die letzte Phase beginnt mit dem Erreichen der
maximalen Extinktion. Zu diesem Zeitpunkt ist der größtmögliche Teil der
Fettsäuren in Hydroperoxide umgewandelt. Es handelt sich dabei
allerdings um instabile Verbindungen, die u.a. zu stabileren Aldehyden,
Malondialdehyd, Hexanal und 4-Hydroxynonenal zerfallen können. In
diesem Fall zeigt die Extinktion einen leichten Abfall für die Dauer von ca.
zwei Stunden. Reagieren diese Produkte weiter so kann es wiederum zu
einem weiteren Anstieg der Extinktion kommen, da manche dieser
komplexen Verbindungen UV-Licht in einem Bereich von 210-240 nm
absorbieren [28, 30, 35, 108].
21 Bild 2: Graphische Darstellung der drei Phasen der LDL-Oxidation[35]
Zusätzlich kann aus der Kurve das Extinktionsmaximum abgelesen werden. Es
entspricht der Menge an Dienen (= Fettsäurehydroperoxide), die aus den
mehrfach ungesättigten Fettsäuren entstehen und ist abhängig von deren
ursprünglicher Konzentration. Ein weiteres Merkmal ist die Steigung der Kurve,
sie stellt die Geschwindigkeit der Reaktion dar [28].
Im weiteren Verlauf der Studie war die Dauer der Lag- Phase von besonderem
Interesse. Als Maß für das antioxidative Potenzial des gewonnenen LDLs kann
sie, wie in der obigen Abbildung dargestellt, graphisch ermittelt werden. Dabei
ist das Ende der Lag Phase definiert als der Schnittpunkt der Tangente der
Kurve der Prolongationsphase mit einer Parallelen der Abszisse auf Höhe des
Ausgangswertes.
4.2 Experimenteller Teil
4.2.1 Plasmagewinnung
Zu Beginn der Studie wurden alle Teilnehmer ausführlich über die
Blutentnahmen
aufgeklärt
und
bestätigten
ihr
Einverständnis
mittels
Unterschrift. Die Einteilung der Patientinnen erfolgte in drei Gruppen, wobei die
erste der Kontrollperson vorbehalten blieb. Die Zweite und Dritte beinhaltete je
neun Frauen. Hierbei galt als Einschlusskriterium ein diagnostiziertes
Mammakarzinom, das im Folgenden entweder mit dem EC – P Schema
22 (Gruppe 1; Epirubicin / Cyclophosphamid gefolgt von Paclitaxel) oder dem CP
Schema (Gruppe 2; Carboplatin und Paclitaxel) behandelt wurde. Den
nüchternen Probandinnen wurde venöses Blut entnommen, welches in jeweils
zwei 3,2 ml Kalium-EDTA Monovetten mit einer Kalium-EDTA-Konzentration
von 1,6 mg/ml Blut aufgefangen wurde. Es wurde darauf geachtet, dass zu
dieser Zeit Entzündungsparameter und Temperatur im Normbereich lagen. Das
so gewonnene Vollblut wurde im Anschluss bei 3000 Umdrehungen pro Minute
zentrifugiert. Die festen Blutbestandteile setzten sich daraufhin am Boden ab,
woraufhin das Plasma in ein Eppendorfgefäß abpippetiert werden konnte. Bis
zur Weiterverarbeitung wurde das Plasma lichtgeschützt bei 4°C aufbewahrt.
4.2.2 LDL Isolierung
Der nächste Schritt erfolgte mittels der Gradienten Ultrazentrifugation bei
präselektierter Dichte nach Abbey. Das isolierte Plasma wurde dabei zeitnah
durch Zugabe von 0,2 g Kaliumbromid pro Milliliter auf eine Plasmadichte von
1,2 g/ml eingestellt [7]. Anschließend wurden je zwei Quick-Seal® Tubes mit
PBS-Puffer gefüllt. Der Puffer bestand dabei aus Kochsalzlösung mit einem
EDTA- Gehalt von 0,1 % und wies eine Dichte von 1,006 g/ml auf. Auf dem
Boden der mit PBS- Puffer gefüllten Quick-Seal® Tubes wurden 2 ml des mit
KBr versetzten Plasmas eingebracht. Im Anschluss wurden diese durch Zugabe
weiterer Pufferlösung vollständig aufgefüllt und mithilfe von Tube TopperTM,
Seal Guide, Seal Former und Heat Sink luftdicht verschlossen [12, 22, 30].
Die so gewonnenen Röhrchen wurden bei 4° in einem Ti 75 Rotor und einer
Beckman
Ultrazentrifuge
Modell
Optima
Typ
LE-80
K
bei
6500
Umdrehungen/min, für die Dauer von 6 Stunden zentrifugiert, wodurch das LDL
als gelbliche Bande sichtbar wurde. Um den Unterdruck zu beseitigen wurde
ein Loch im oberen Teil des Tubes gestochen. Auf diese Weise konnte das LDL
mithilfe einer Spritze und einer Kanüle durch die Wand des Röhrchens
abgezogen werden. Bis zur weiteren Verarbeitung wurde das präparierte LDL
bei 4° für bis zu zwei Wochen im Kühlschrank gelagert.
4.2.3 Reinigung des LDL
Bei dem so gewonnenen LDL handelte es sich allerdings noch nicht um die
benötigte
Reinform.
Es
enthielt
immer
noch
Reste
des
in
den
Monovettenröhrchen enthaltenen Oxidationsschutzes EDTA und des für die
23 Zentrifugation benötigten Kaliumbromids. Um diese Substanzen zu entfernen
wurde auf die Möglichkeit der Gelfiltration (Gelbettsäulen: Econo-Pac 10 DG)
zurückgegriffen. Dieses Reinigungsverfahren ist einfacher und schneller
durchführbar als die früher verwendete Aufarbeitung mittels Dialyse. Vor jeder
Filtration wurden die Gelbettsäulen zweimal mit PBS-Puffer gespült und dann
mit bis zu maximal 1,6 ml des noch verunreinigten LDLs befüllt. Nachdem sich
das LDL zwischen den Gelpartikeln vollständig verteilt hatte, wurde der Rest
der Säulen bis zum Rand mit PBS Puffer aufgefüllt. Das reine LDL konnte nun
an der Spitze anhand seiner gelblichen Färbung deutlich identifiziert und mit
einer
Glasküvette
aufgefangen
werden.
Ein
Teil
wurde
für
die
Konzentrationsbestimmung ins Zentrallabor des Universitätsklinikums Erlangen
gebracht, der restliche Teil bis zur weiteren Messung in einem verschlossenen
Glasröhrchen
aufbewahrt.
Am
Ende
jedes
Durchgangs
wurden
die
Gelbettsäulen zweimal mit PBS Puffer gespült und konnten so mehrmals,
allerdings nicht länger als zwei Wochen benutzt werden [23, 30].
4.2.4 Ermittlung der LDL-Konzentration im Eluat
Nachdem
die
LDL
Konzentration
im
Zentrallaboratorium
des
Universitätsklinikums bestimmt worden waren, mussten die durch Zentrifugation
und Gelfiltration entstandenen Schwankungen im isolierten LDL durch Zugabe
von Eluat ausgeglichen werden. Anderenfalls hätte nicht sichergestellt werden
können, dass bei jedem Oxidationsansatz die gleiche Menge an LDL eingesetzt
wurde. Die dafür benötigte Menge an Eluat konnte anhand folgender Formeln
berechnet werden.
Berechnung des LDL-Cholesteringehalts des Eluats:
c(Probe)
E(Probe)
=
c(Standard)
E(Standard)
C = Konzentration; E = Extinktion
Berechnung der einzusetzenden Menge des Eluats:
c(Probe) x X ml = 80 mg/dl x 0,1 ml
24 Die einzusetzende Zielmenge an LDL-Cholesterin waren 0,08mg, das
entsprach bei 1ml Reaktionsvolumen einer Endkonzentration von 0,08mg/ml
[31].
4.2.5 LDL- Oxidation in vitro
Wie Esterbauer in seinen Arbeiten feststellte, entstehen bei der Cu
2+
katalysierten LDL Oxidation Diene, die ein definiertes Absorptionsmaximum bei
234 nm aufweisen. Dies lässt sich photometrische messen und grafisch
darstellen [35].
Die in der Studie verwendete Testsubstanz setzte sich aus folgenden
Bestandteilen zusammen
O2 gesättigter PBS-Puffer
978 µl – x µl Eluat
Eluat
x µl
CuSO4- Lösung (0,68 mmol/L)
17 µl
Zu Beginn wurde O2 gesättigter PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 in acht
Eppendorf Cups gegeben und die errechnete Menge des Eluats dazu pipettiert.
Um die eigentliche Reaktion zu starten, folgte die Zugabe des katalytisch
wirkenden CuSO4. Vor dem luftfreien Pipettieren in die Quarzküvetten wurden
die Ansätze mittels eines Rotors gründlich gemischt. Von den gleichzeitig
maximal 8 Reaktionsansätzen dienten jeweils zwei als Kontrolle, enthielten also
Eluat aus dem LDL der Kontrollperson. In den übrigen sechs Küvetten
befanden sich jeweils in zweifacher Ausführung Eluatzusätze der zu testenden
Patienten mit Mammakarzinom.
Über einem Zeitraum von 6-8 Stunden, bei einer Temperatur von 37°C, erfolgte
in fünfminütigen Abständen die photometrische Messung der Absorption bei
234 nm, bis kein weiterer Anstieg der konjugierten Diene mehr messbar war
[30].
4.2.6 Herstellung der Pufferlösungen
Puffer zur Zentrifugation:
Der zur Zentrifugation benötigte Puffer wurde durch Zugabe von 6g NaCl und
1g EDTA zu 1l H2O (dest.) im Endokrinologischen Labor der Frauenklinik
25 hergestellt. Bei einem erwünschten pH von 7,4 sind alle Teilchen in Lösung,
sodass eine klare Flüssigkeit vorlag.
PBS-Puffer zur Oxidation:
Der zur Oxidation benötigte Puffer wurde durch Zugabe von 0,7g NaH2PO4,
0,7g Na2HPO4 sowie 8,7g NaCl zu 1l H2O (dest.) erstellt. Die bei einem pH von
7,4 klare Flüssigkeit wurde zur vollständigen Lösung in ein Wasserbad von
37°C gestellt.
Kupfersulfatlösung zur Oxidation
Die bei der Oxidation als Katalysator benötigte Kupfersulfatlösung Nr.2 wurde
durch Verdünnung der Kupfersulfatlösung Nr. 1 hergestellt.
Lösung 1:
68mM
Lösung 2: 0,68mM
1,71 g CuSO4/100 ml Aqua dest.
1,1 ml Lösung1/99 ml H2O
4.3 Statistik
Die erhobenen Daten wurden mittels SPSS (Statistical Package for the Social
Sciences, Version 20 für Macintosh; SPSS, Inc., Chicago, Illinois, USA)
analysiert.
Anhand der photometrisch gemessenen Werte erfolgte die graphische
Umsetzung und Auswertung mittels Excel (Microsoft).
Die Dauer der Lag-Phase wurde wie zuvor beschrieben nach Esterbauer
bestimmt. Die Prolongationsfaktoren wurden ermittelt und Mittelwert sowie
Standardabweichung für die jeweilige Gruppe errechnet und die Werte durch
den Kolmogorov-Smirnov Tests auf Normalverteilung getestet.
Mit Hilfe des Student t-Tests wurde die Signifikanz der Ergebnisse beurteilt, die
sich durch den so genannten p-Level definiert. Bei einem p-Level < 0,05 gelten
die Ergebnisse als signifikant (s+), bei einem p-Level <0,01 als hochsignifikant
(s++). Bei Werten > 0,05 spricht man von einem nicht signifikanten Ergebnis
(s-).
26 5. Ergebnis
5.1. Einfluss von Chemotherapeutika auf die In-Vitro-Oxidation
von LDL
Ziel der Studie war es, den Einfluss verschiedener Chemotherapie-Schemata
auf den Oxidativen Stress an Brustkrebs erkrankter Frauen zu ermitteln und
untereinander zu vergleichen.
Im Rahmen der Studie erhielt jede Patientin drei Blutentnahmen: vor Beginn der
Chemotherapie, sowie nach dem ersten und zweiten Zyklus. Die LDLKonzentration der jeweiligen Proben wurde bestimmt und anschließend die
Dauer der Lag Phase mittels des bereits erläuterten Esterbauer-Verfahrens
photometrisch ermittelt. Um mögliche Messfehler möglichst frühzeitig zu
erkennen, erfolgte die Messung der Oxidationsansätze stets in zweifacher
Ausführung
zusammen
mit
einer
Kontrollprobe.
Die
Ergebnisse
des
Photometers wurden alle 5 Minuten erfasst, tabellarisch ausgewertet und
mittels Excel in Diagramme konvertiert. Die gewonnenen Werte wurden
zunächst innerhalb der Gruppe bzgl. der jeweiligen Entnahme-Zeitpunkte
verglichen und anschließend das Epirubicin, Cyclophosphamid und Paclitaxel
Schema dem Carboplatin - Paclitaxel Schema gegenüber gestellt.
Im Folgenden werden die Ergebnisse zunächst für jedes ChemotherapieSchemata einzeln dargestellt und anschließend miteinander verglichen.
5.1.1 Epirubicin, Cyclophosphamid und Paclitaxel (EC-P Schema)
Bei der folgenden Versuchsreihe waren 9 Patientinnen beteiligt, bei denen das
EC-P Schema zur Therapie des Mamma Karzinoms angewendet wurde. Das
Durchschnittsalter der Probandengruppe betrug 48 Jahre.
Tabelle 3 zeigt die Dauer der Lag Phase vor der Chemotherapie, nach dem
Ersten und nach dem zweiten Zyklus. Die Dauer der Lag-Phase ist
entscheidend, da diese äquivalent zur Menge der Antioxidantien in der
untersuchten Substanz ist.
27 Personenkennziffer
Vor
Chemotherapie
Lag-Phase
1.Zyklus
Lag-Phase
2.Zyklus
Lag-Phase
1
44,00
44,00
50,00
2
67,00
67,00
72,00
3
44,00
69,00
61,00
4
50,00
92,00
47,00
5
67,00
67,00
77,00
6
47,00
42,00
64,00
7
56,00
28,00
53,00
8
81,00
74,00
81,00
9
25,00
67,00
61,00
Tabelle 3: Dauer der Lag-Phase (min) zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt (EC-P
Schema)
Im Anschluss wurde der Mittelwert sowie die Standardabweichung der Dauer
der Lag-Phase zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt für die gesamte Gruppe
berechnet. Die Werte sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Vor
Chemotherapie
1.Zyklus
2.Zyklus
Summe
481
550
566
Mittelwert [min]
53,4
61,1
62,9
Standardabweichung [min]
16,5
19,5
11,9
Faktor
1
1,14
1,18
Tabelle 4: Analyse der Lag-Phase der EC-P Schema Gruppe
28 Anhand der in Tabelle 4 aufgetragenen Faktoren ist zu erkennen, dass der
Mittelwert der Dauer der Lag-Phase im ersten Zyklus um 14 % und im zweiten
Zyklus um 18 % im Vergleich zum Ausgangswert zunimmt. Diese Verlängerung
könnte auf eine Zunahme des antioxidativen Potentials im Verlauf der
Chemotherapie hinweisen.
Die folgende Graphik wurde aus den photometrisch erfassten Extinktionswerten
der EC-P Gruppe basierend auf deren Mittelwerten errechnet. Zur graphischen
Bestimmung der Lag-Phasen kann wie in Graphik 2 beschrieben, mittels
Tangente die Zeit abgelesen werden. Die Mittelwerte der Dauer der LagPhasen können aus Tabelle 4 entnommen werden und betragen 53,4 min vor
der Chemotherapie, 61,1 min im ersten Zyklus und 62,9 min im zweiten Zyklus.
Graphik 3: Dauer der Lag-Phasen der EC-P Gruppe im Vergleich
Anhand der Graphik ist eine Zunahme der Lag-Phase im Ersten sowie zweiten
Zyklus im Vergleich zum Ausgangswert erkennbar, die auf eine Zunahme des
antioxidativen Potentials im Verlauf der Chemotherapie hinweisen kann. Ob es
sich dabei um signifikante Unterschiede handelt, wurde mittels des t-Tests
überprüft.
29 Vor der Durchführung des Signifikanztestes wurde die Dauer der Lag-Phase zu
allen drei Blutentnahme Zeitpunkten mit Hilfe des Kolmogorov- Smirnov Test
auf
Normalverteilung
geprüft.
Dieser
Test
kann
bei
einer
kleinen
Stichprobenanzahl angewandt werden und gibt an, ob das Versuchsergebnis
mit hoher Wahrscheinlichkeit von der Normalverteilung abweicht. Bei p ≥ 0,05
gelten die Werte als signifikant.
30 Graphik 4 sowie Tabelle 5: Kolmogorov- Smirnov Test vor Chemotherapie:
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min,
p = 0,517
31 Graphik 5 sowie Tabelle 6: Kolmogorov- Smirnov Test des 1. Zyklus;
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min;
p = 0,856
32 Graphik 6 sowie Tabelle 7: Kolmogorov- Smirnov Test des 2. Zyklus;
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min;
p = 0,390
33 In allen drei Fällen konnte die Annahme der Normalverteilung bestätigt werden.
Die Voraussetzung zur Durchführung des t-Tests war somit erfüllt.
Mit Hilfe von Excel wurde ein zweiseitiger t-Test zweier gepaarter Stichproben
ungleicher Varianz durchgeführt und im Folgenden exemplarisch am Bsp. des
Vergleiches der Dauer der Lag-Phase vor Chemotherapie und nach dem 1
Zyklus analysiert. Für diesen Fall lautet die Nullhypothese bzw. entsprechend
die Alternativhypothese wie folgt:
H0: Die Dauer der Lag-Phase zwischen Z.v. Chemotherapie und erstem
Zyklus zeigt keine signifikante Verlängerung oder Verkürzung.
H1: Die Dauer der Lag-Phase zwischen Z.v. Chemotherapie und erstem
Zyklus unterscheidet sich signifikant.
Das Signifikanzniveau wurde bei 5 % festgelegt. Bei einem p- Level von 0,360
muss die Alternativhypothese verworfen werden, die Nullhypothese bleibt
erhalten. Entsprechendes gilt für den Vergleich der Dauer der Lag-Phase
zwischen Z.v. Chemotherapie und zweitem Zyklus bzw. zwischen erstem und
zweitem Zyklus. Bei einem p Level von 0,053 bzw. 0,803 muss ebenfalls die
Nullhypothese beibehalten werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es im Vergleich zum Anfang, aber
auch während der Applikation der Chemotherapie zu keinen signifikanten
Veränderungen in der Dauer der Lag-Phase gekommen ist.
Die Ergebnisse des t-Test sind in unten stehender Tabelle aufgeführt.
Student t-Test
p-Level
Signifikanz
Z.v. Chemo vs. 1. Zyklus
0,360
s-
Z.v. Chemo vs. 2. Zyklus
0,053
s-
1. Zyklus vs. 2. Zyklus
0,803
s-
Tabelle 8: Student t-Test
5.1.2 Carboplatin und Paclitaxel (CP Schema)
An dieser Messreihe nahmen ebenfalls neun weibliche Probandinnen teil. Ihnen
gemeinsam
war
ein
diagnostiziertes
Mammakarzinom,
das
chemotherapeutisches mittels Carboplatin und Paclitaxel behandelt wurde. Das
Durchschnittsalter
zum
Zeitpunkt
Probandengruppe auf 56 Jahre.
der
Studie
belief
sich
in
dieser
34 Tabelle 9 zeigt die Dauer der Lag Phasen vor der Chemotherapie, nach dem
Ersten und nach dem zweiten Zyklus der Patientinnen, die mit dem CP Schema
behandelt wurden.
Personenkennziffer
Vor Chemotherapie
Lag-Phase
1.Zyklus
Lag-Phase
2.Zyklus
Lag-Phase
1
47,00
47,00
44,00
2
44,00
39,00
25,00
3
47,00
92,00
67,00
4
47,00
75,00
72,00
5
36,00
47,00
47,00
6
44,00
83,00
48,00
7
39,00
42,00
48,00
8
50,00
47,00
69,00
9
44,00
47,00
47,00
Tabelle 9: Dauer der Lag-Phase (min) zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt (CP
Schema)
Im Anschluss wurde der Mittelwert sowie die Standardabweichung der Dauer
der Lag-Phase zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt für die gesamte Gruppe
die entsprechend dem CP Schema behandelt wurde berechnet. Die Werte sind
in Tabelle 10 zusammengefasst.
Vor
Chemotherapie
1.Zyklus
2.Zyklus
Summe
398
519
467
Mittelwert [min]
44,2
57,7
51,9
35 Standardabweichung [min]
4,4
19,9
15,0
Faktor
1
1,31
1,17
Tabelle 10: Analyse der Lag-Phase der CP Schema Gruppe
Für die Graphik 7 wurden die Mittelwerte der Extinktionsparameter der
Carboplatin-Paclitaxel Gruppe verwendet. Die daraus resultierende Dauer der
Lag-Phase kann der Tabelle 10 entnommen werden und beträgt im Mittel für
den Zustand vor Chemotherapie 44,2 min, für den ersten Zyklus 57,7 min und
für den zweiten Zyklus 51,9 min.
Graphik 7: Dauer der Lag-Phasen der CP Gruppe im Vergleich
Anhand der Graphik ist eine Zunahme der Lag-Phase nach dem ersten Zyklus
im Vergleich zum Ausganswert vor der Chemotherapie erkennbar. Es gilt
jedoch zu beachten, dass die Dauer der Lag-Phase nach dem zweiten Zyklus
im Vergleich zum Ersten abnimmt, jedoch in Bezug auf den Ausgangswert
erhöht bleibt. Da sich die Dauer der Lag Phase insgesamt verlängert, könnte
dies auf eine antioxidative Wirkung der Chemotherapeutika hindeuten; die
Konzentration an Radikalen sinkt insgesamt.
36 Auch in dieser Versuchsreihe wurden vor Durchführung des t-Tests zur Prüfung
auf Signifikanz, die ermittelten Mittelwerte der Dauer der Lag-Phase auf
Normalverteilung getestet. Dies erfolgte wie zuvor mittels des KolmogorovSmirnov Tests. Das Signifikanz-Niveau beträgt p ≥ 0,05.
37 Graphik 8 sowie Tabelle 11: Kolmogorov- Smirnov Test vor Beginn der Chemotherapie;
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min;
p = 0,772
Graphik 9 sowie Tabelle 12: Kolmogorov- Smirnov Test des 1. Zyklus;
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min;
p = 1,112
38 Graphik 10 sowie Tabelle 13: Kolmogorov- Smirnov Test des 2. Zyklus;
Ordinate = Häufigkeit,
Abszisse = Dauer der Lag-Phase in min;
p = 0,808
39 Die Annahme einer Normalverteilung kann für alle 3 Stichproben beibehalten
werden, die Voraussetzung zur Anwendung des t-Tests war somit erfüllt.
Es wurde ein zweiseitiger t-Test zweier gepaarter Stichproben ungleicher
Varianz durchgeführt und analog der Vorgehensweise zur Gruppe der mittels
des EC-P Schema behandelten Patientinnen ausgewertet.
Das Signifikanzniveau wurde bei 5 % festgelegt. Bei einem p-Level von 0,066
für den Vergleich der Dauer der Lag-Phase zwischen Z.v. Chemotherapie und
dem ersten Zyklus muss die Alternativhypothese verworfen werden. Die
Nullhypothese bleibt für den Vergleich der Dauer der Lag-Phase zwischen Z.v.
Chemotherapie und zweitem Zyklus bei einem p-Level von 0,126 erhalten.
Ebenso beim Vergleich zwischen Erstem und zweitem Zyklus mit einem p-Level
von 0,335.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es auch in der Gruppe der
Patientinnen die aufgrund ihres Mammakarzinoms mit dem PC Schema
behandelt wurden im Vergleich zum Anfang, aber auch während der Applikation
der Chemotherapie zu keinen signifikanten Veränderungen in der Dauer LagPhase gekommen ist. Somit kann für die Gruppe als Ganzes, ebenfalls ein
unverändertes antioxidatives Potential postuliert werden.
Die Ergebnisse des t-Test sind in unten stehender Tabelle aufgeführt.
Student t-Test
p-Level
Signifikanz
Z.v. Chemo vs. 1. Zyklus
0,066
s-
Z.v. Chemo vs. 2. Zyklus
0,126
s-
1. Zyklus vs. 2. Zyklus
0,335
s-
Tabelle 14: Student t-Test
40 5.2 Vergleich der beiden Chemotherapie-Schemata
(EC-P vs. CP)
Im Folgenden wurden die Auswirkungen des EC-P bzw. CP ChemotherapieSchemas auf den Oxidativen Stress der Mammakarzinom Patientinnen direkt
verglichen.
Zunächst wurde die Dauer der Lag-Phase der beiden PolychemotherapieSchemata zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt gegenübergestellt. Mittels
des t-Tests für unabhängige Stichproben wurden die Mittelwerte der Lag-Phase
des EC-P bzw. CP Schemas zum Zeitpunkt vor der Chemotherapie, nach dem
Ersten sowie zweiten Zyklus miteinander verglichen. Die Ermittlung des p-Werts
ist in untenstehenden Tabellen aufgeführt.
Tabelle 15: p-Wert vor Chemotherapie (EC-P vs. CP Schema)
Tabelle 16: p-Wert nach dem 1. Zyklus (EC-P vs. CP Schema)
41 Tabelle 17: p-Wert nach dem 2. Zyklus (EC-P vs. CP Schema)
Exemplarisch für den Blutentnahme Zeitpunkt vor Beginn der Chemotherapie
lautet die Nullhypothese bzw. entsprechend die Alternativhypothese wie folgt:
H0: Die Dauer der Lag-Phase zum Zeitpunkt Z.v. Chemotherapie beim
EC-P Schema zeigt keine signifikante Verlängerung oder Verkürzung
gegenüber dem PC Schema.
H1: Die Dauer der Lag-Phase zum Zeitpunkt Z.v. Chemotherapie
unterscheidet sich signifikant zwischen dem EC-P und PC Schema.
Das Signifikanzniveau wurde bei 5 % festgelegt.
Die Ergebnisse des t-Test unabhängiger Stichproben zum direkten Vergleich
der Auswirkung der beiden Polychemotherapie-Schemata auf den Oxidativen
Status der Mammakarzinom Patientinnen sind in untenstehender Tabelle
zusammengefasst.
EC-P Schema
CP Schema
(Mittelwert)
(Mittelwert)
Z.v. Chemotherapie
53,4
44,2
0,139
1. Zyklus
61,1
57,7
0,716
2. Zyklus
62,9
51,9
0,104
Tabelle 18: p-Werte bzgl. der Mittelwerte der Lag-Phasen im Vergleich (min)
p-Wert
42 Bei einem p- Wert von 0,139 muss die Alternativhypothese verworfen werden,
die Nullhypothese bleibt erhalten. Entsprechendes gilt für den Vergleich zum
Zeitpunkt nach dem ersten bzw. zweiten Zyklus. Bei einem p- Wert von 0,716
bzw. 0,104 muss ebenfalls die Nullhypothese beibehalten werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es im Vergleich zum Anfang, aber
auch während der Applikation der Chemotherapie bei beiden TherapieSchemata zu keinen signifikanten Veränderungen in der Dauer Lag-Phase
gekommen ist. Ebenso wurde kein signifikanter Unterschied im Vergleich der
Dauer der Lag-Phasen der unterschiedlichen Chemotherapie-Schemata
gefunden. Der Zeitabschnitt in dem sich das LDL Molekül vor pro-oxidativen
Substanzen schützen kann, ist somit an den gemessenen Zeitpunkten in etwa
gleich
und
wird
mit
hoher
Wahrscheinlichkeit
nicht
durch
die
Chemotherapeutika beeinflusst.
In den folgenden beiden Tabellen wurden jeweils die Mittelwerte der Dauer der
Lag-Phase des EC-P bzw. CP Schemas mit der mitlaufenden Kontrolle
verglichen um die prozentuale Verlängerung oder Verkürzung der Lag-Phase
im Verlauf der Chemotherapie im Vergleich zur Kontrolle zu ermitteln.
Epirubicin, Cyclophosphamid - Paclitaxel
Kontrolle
Z.v. Chemo
1. Zyklus
2. Zyklus
Mittelwert
58,8
53,4
61,1
62,9
Faktor
1
0,91
1,04
1,07
Tabelle 19 Zunahme der Lag-Phase (EC-P Schema)
Carboplatin-Paclitaxel
Kontrolle
Z.v. Chemo
1. Zyklus
2. Zyklus
Mittelwert
58,8
44,2
57,7
51,9
Faktor
1
0,75
0,98
0,88
Tabelle 20 Zunahme der Lag-Phase (CP Schema)
43 In der kommenden Graphik wurden die beiden Polychemotherapie-Schemata
bzgl. der Dauer der Lag-Phase zum jeweiligen Blutentnahme Zeitpunkt direkt
gegenüber gestellt um die unterschiedliche Zunahme des antioxidativen
Potentials im Verlauf der Chemotherapie darzustellen. Es zeigt sich eine
kontinuierliche Verlängerung der Lag-Phase im Verlauf bei Anwendung des
EC-P Schemas, die Anzahl freier Radikale scheint zu sinken, was auf eine
antioxidative Wirkung der Polychemotherapie hinweisen könnte.
Im Vergleich dazu steigt die Lag-Phase bei Patientinnen die aufgrund ihres
Mammakarzinoms mit dem PC Schema therapiert wurden innerhalb des ersten
Zyklus an, sinkt jedoch nach dem zweiten Zyklus wieder ab.
Dies Unterschiede sind allerdings nicht signifikant und werden deshalb als
Schwankungen im Rahmen der Messungen gewertet.
Graphik 11: Mittelwerte der Lag-Phasen im Vergleich
44 5.3 Zusammenfassung der Ergebnisse
Während
der
Chemotherapie
Gabe
kam
es
zu
keinen
signifikanten
Veränderungen in der Oxidierbarkeit der LDL Moleküle. Weder unter der Gabe
von EC-P (Epirubicin, Cyclophosphamid und Paclitaxel) noch unter der Gabe
von CP (Carboplatin und Paclitaxel) konnte eine signifikante Verlängerung der
Lag-Phase im Verlauf der Therapie registriert werden.
Dennoch
zeigten
die
durchgeführten
Messungen
eine
kontinuierliche
Verlängerung der Lag-Phasen-Dauer nach dem ersten sowie zweiten Zyklus
bei Patientinnen, die mit dem EC-P Schema behandelt wurden. Diese
Verlängerung könnte auf eine Zunahme des antioxidativen Potentials im Verlauf
der Chemotherapie hinweisen.
Ebenso sank die Konzentration an Radikalen im Verlauf der Therapie mittels
CP insgesamt. Trotz eines Konzentrationsanstieges nach dem zweiten Zyklus
blieb die Dauer der Lag Phase über dem Ausgangswert.
Insgesamt zeigt die Anwendung der EC-P Therapie ein höheres, wenn auch
nicht signifikantes antioxidatives Potential.
45 6. Diskussion
6.1 Oxidativer Stress und seine Folgen
Im Laufe des Lebens ist der menschliche Organismus einer Vielzahl
hochreaktiver Substanzen ausgesetzt. Die Konzentration und Toxizität variiert
je nach induzierendem Agens und bewirkt zum Teil schwerwiegende und
irreparable Schäden.
Dies hat zur Folge, dass freie Radikale im Entstehungsprozess vieler
Krankheiten beteiligt sind. Bisher konnte dies beispielsweise bei der Entstehung
von kardiovaskulären Erkrankungen [48, 65], Morbus Alzheimer [80], sowie
beim Katarakt [97] nachgewiesen werden.
Betrachtet man die Vorgänge auf molekularer Ebene, so zeigt sich dies in der
Modifikation von Lipiden und Proteinen, die in diesem Falle ihre ursprünglichen
Aufgaben nur unzureichend erfüllen oder sogar als toxische Zwischenprodukte
akkumulieren können. Im Zellkern bewirken freie Radikale eine Veränderung im
genetischen Code und inhibieren oder induzieren über regulatorische Proteine
bestimmte
Gensequenzen
[3,
10].
Ermöglicht
wird
dies
durch
eine
unzureichende Gegenregulation seitens des Organismus. Dieser Vorgang wir
als oxidativer Stress bezeichnet und ist definiert als ein vermehrtes Auftreten an
hochreaktiven Sauerstoffspezies wie z.B. O2°, H2O2, OH, HOCl, Ferryl, Peroxyl,
und Alkoxyl sowie einer gleichzeitigen Unfähigkeit des Organismus, diese
entweder schnellgenug zu inaktivieren, oder die dabei entstanden Schäden
adäquat zu reparieren [6].
Die Ursachen, die zur Bildung freier Radikale führen, sind vielfältig. Unter
physiologischen Bedingungen stellt der Körper einige dieser Stoffe selbst her.
Sie entstehen vorwiegend bei oxidativen Stoffwechselprozessen oder dienen
der Signaltransduktion [83] und Infektabwehr. Während einige dieser Vorgänge
einer strikten Regulation unterliegen, können äußere Umwelteinflüsse, wie
beispielsweise Zigarettenrauch, ionisierende Strahlung und Nahrungsmittel nur
bedingt
kontrolliert
werden.
Um
eine
übermäßige
Anhäufung
solcher
hochreaktiver Verbindungen zu verhindern, verfügt unser Körper über eine
Reihe von Abwehrmechanismen, die Radikale unschädlich machen. Diese
sogenannten
Antioxidationen
fungieren
als
Elektronendonatoren
und
46 unterbrechen so die Kettenreaktion, anhand derer freie Radikale körpereigenen
Moleküle wie DNA, Lipide und Aminosäuren schädigen [62]. Auf Zellulärer
Ebene erfolgt die Abwehr durch eine Reihe von Enzymen, wie der Katalase, der
Superoxid-
Dismutase,
nichtenzymatischen
oder
der
Antioxidantien,
Gluthationdarunter
Peroxidase,
insbesondere
sowie
Glutathion,
Ascorbinsäuren, α-Tocopherol und Harnsäure [82]. Etliche dieser Stoffe
unterliegen dabei Schwankungen, die im Labor gemessen werden können.
6.2 Interpretation der Studien-Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wurde LDL als solch ein Marker verwendet. Nach der
laborchemischen
Isolierung
des
Lipoproteins
aus
den
Testseren
der
Probandinnen, die aufgrund ihres Mammakarzinoms in chemotherapeutischer
Behandlung waren, konnten durch Anwendung der Esterbauer Methode
photometrische Daten generiert werden. Diese ließen Rückschlüsse auf die
individuellen antioxidativen Reserven der Patientinnen zu. Das zur Bestimmung
der Lag- Phase verwendetet Verfahren wurde maßgeblich durch Esterbauer
geprägt und fand im Verlauf in einer Vielzahl an Studien seine erfolgreiche
Anwendung [1, 56, 59].
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse waren zunächst
überraschend. So kam es weder innerhalb der Patientinnen die eine
Polychemotherapie mit EC-P bekamen
noch bei denen die nach dem CP
Schema behandelt wurden, im Verlauf der Therapie zu einer signifikanten
Veränderung der Lag- Phase und somit zu einer Veränderung wie oxidativem
Stress. Auch im gegenseitigen Vergleich konnte kein signifikanter Unterschied
in der Dauer der Lag- Phase festgestellt werden. Dies wiederspricht zunächst
der Annahme, dass die tumortoxische Wirkung vieler Zytostatika auf der
Induktion von Zellschäden durch freie Radikale fußt [64]. Nach Conklin et al
gehören dazu insbesondere Anthrazykline (Doxorubicin, Epirubicin, und
Daunorubicin), Alkylantien, Platinverbindungen (Cisplatin, Carboplatin, und
Oxaliplatin),
Epipodophyllotoxine
(Etoposide
und
Camptothecinderivate (Topotecan and Irinotecan) [25].
Teniposide),
und
47 Graphik 12: Zellschädigung aufgrund freier Radikal Bildung durch Zytostatika
( nach Conklin [25])
Andererseits ist die tumortoxische Wirkung der Polychemotherapie nicht
pauschal auf den gesamten Körper zutreffend. Die einzelnen Organsysteme
sind mit unterschiedlichen Enzym- Repertoires ausgestattet, die die lokale
Entstehung von Radikalen erst ermöglichen.
So zeichnen sich beispielsweise Anthrazykline durch eine besonders starke
Cardiotoxizität aus. Ursächlich hierfür ist eine spezielle Isoform der NADH
Dehydrogenase, die insbesondere in den Zellen des Herzens exprimiert wird
und dort für die Entstehung von Radikalen verantwortlich ist [50, 75]. In diesem
Falle nimmt der oxidative Stress lokal zu, wohingegen die Radikalkonzentration
im restlichen Körper allenfalls leicht oder gar nicht erhöht ist.
Für unser Ergebnis würde dies bedeuten, dass ohne eine systemische
Auswirkung des oxidativen Stresses keine Abnahme der Lag Phase zu
erwarten ist. Da die LDL Gewinnung aus dem im nahezu gesamten Körper
zirkulierenden Blut stattfand würde sich dort ein örtlich begrenzter Befund nicht
oder nur gering widerspiegeln.
48 6.3 Analyse der verwendeten Zytostatika bezüglich
pro-oxidativer Eigenschaften
Im Folgenden werden die radikalinduzierenden Eigenschaften der einzelnen
Chemotherapeutika zunächst isoliert betrachtet.
6.3.1 Epirubicin
Eine der schwerwiegendsten Nebenwirkungen der Anthrazykline stellt ihre
Kardiotoxizität dar. Im Rahmen einer großen retrospektiven Studie konnte
gezeigt werden, dass das Risiko einer Herzinsuffizienz unter kumulativer Gabe
von Epirubicin über 950 mg/m2 signifikant ansteigt [87]. Vergleicht man diesen
Wirkstoff mit Doxorubicin, einem verwandten Präparat aus der Gruppe der
Anthrazykline,
so
zeigt
sich
bei
gleicher
Wirkstärke
eine
geringere
Kardiotoxizität [51, 69]. Sowohl bei Epirubicin [74] als auch bei Doxorubicin [50]
konnten jedoch erhöhte Konzentrationen an Hydroxidradikalen nachgewiesen
werden. Als Ursache werden freie Radikale diskutiert, die nach ihrer Entstehung
mit der Zellmembran der Myocyten interagieren und diese dadurch schädigen
[39]. Von zentraler Bedeutung ist die Fähigkeit der Anthrazykline in die
Mitochondrien zu gelangen und dort an Cardiolipin zu binden. Nach erfolgter
Bindung überträgt NADH unter Umgehung der Atmungskette ein einzelnes
Elektron auf das Chemotherapeutikum. Dies wird dadurch von seiner
ursprünglichen Chinonform in seine Semichinonform reduziert und gibt das
Elektron wiederum an elementaren Sauerstoff weiter. Letztendlich entsteht ein
Superoxidradikal und das Semiquinon wird in seine ursprüngliche Chinonform
umgewandelt [50, 75]. Im Gengensatz zum Herz, fehlt in anderen Geweben wie
z.B. der Leber, eine NADH Dehydrogenase, die in der Lage ist Anthrazykline zu
reduzieren, was die kardioselektive Toxizität dieser Medikamentengruppe
erklärt [40, 58] und eine entsprechend niedrigere Radikalkonzentration im
restlichen Körper erwarten lässt.
6.3.2 Cyclophosphamid
Das Chemotherapeutikum Cyclophosphamid wirkt in seiner applizierten Form
nicht zelltoxisch, es wird im Körper über das Cytochrom p450 System der Leber
gegiftet [2]. Dadurch entstehen Phosphoramid-Mustard und Acrolein. Ersteres
wirkt zytotoxisch, indem es zu Quervernetzungen an der DNA führt [96],
49 Acrolein hingegen führt zu einer vermehrten Bildung von Radikalen im
Urogenitaltrakt. Dies geschieht folgendermaßen: Acrolein gelangt sehr leicht in
Urothelzellen und führt dort entweder direkt oder über Transkriptionsfaktoren,
wie NF-κB und AP-1, zu einer vermehrten Bildung von ROS und NO Radikalen.
Im Zuge der steigenden Peroxinitride werden Lipide, DNA und Proteine
geschädigt. Können die zelleigenen Reparaturenzyme den Schaden nicht mehr
beheben, geht die Zelle unter und unterhält dadurch eine Entzündungsreaktion,
durch die weitere Radikale gebildet werden [53].
Ähnlich dem Epirubicin zeigt sich bei Cyclophosphamid eine örtliche Präferenz.
Die vermehrte Bildung von ROS äußert sich in diesem Falle in Form der
hämorrhagischen Zystitis. Zur Vorbeugung dieser Nebenwirkung wird eine
weitere Substanz in Form von MESNA (2-Mercaptoethansulfonat-Natrium)
appliziert. Da MESNA ebenfalls antioxidative Eigenschaften aufweist [68],
könnte dies jedoch ebenso zur beschriebenen Verlängerung der Lag- Phase im
ersten und zweiten Zyklus geführt haben.
6.3.3 Pacllitaxel
Zur Gruppe der Taxane zählt neben Paclitaxel auch Docetaxel. Im Gegensatz
zu den ähnlich wirkenden Vinca Alkaloiden führen diese nicht zu einem Abbau
der Mikrotubuli, sondern beschleunigen unkontrolliert deren Aufbau und deren
Stabilität [77]. Während der Zellteilung verhindern Taxane somit das Ausbilden
eines
funktionierenden
Spindelfaserapparates.
Darüber
hinaus
spielen
Mikrotubuli eine Rolle bei der Signalübermittlung, dem intrazellulären Transport,
sowie Form und Motilität einer Zelle, die dadurch ebenfalls gestört werden [86,
104, 106]. Ihr breites Anwendungsspektrum ermöglicht es Krebserkrankungen
zu therapieren, die vorher mit konventionellen Zytostatika nur unzureichend
behandelbar waren [106].
Auch diese pharmakologischen Gruppe scheint die Entstehung hochreaktiver
Sauerstoffspezies zu begünstigen, wenn auch in geringerem Maße als
vergleichbare Zytostatika (Vgl. Graphik 12) [25]. So beschrieb Jérôme
Alexandre et al [8] einen Zusammenhang zwischen der Vermehrten Bildung
von ROS und einer gesteigerten Aktivität der membranständigen NADPOxidase unter Paclitaxel- haltiger Therapie. Die Umwandlung der NADPOxidase in ihre aktive Form werde dabei maßgeblich durch eine Mikrotubuli
assoziierte Translokation von Rac1 an die Zellmembran veranlasst. Die Folge
50 sei eine Akkumulation von Sauerstoffradikalen im Extrazellularraum, welche
spontan oder unter dem Einfluss der Superoxid- Dismutase zu H2O2
weiterreagieren. Währenddessen könnten benachbarte Zellen beschädigt und
in den Zustand der Apoptose übergehen. Dieser Effekt sei nur bis zu einer
bestimmten Konzentration an Paclitaxel steigerbar, darüber hinaus nähere sich
die Anzahl an Zelluntergänge einem konstanten Wert an. Demgegenüber
postulierten Heng-Liang Lin B.S. et al [60] die Hypothese, dass ROS keinen
Einfluss auf die zytostatische Wirkung der Taxole hätten. In ihrer Studie wurde
nach Zugabe des antioxidativ wirkenden Magnolols zu Hepatom Zellen zwar die
Bildung von ROS unterbunden, es zeigte sich jedoch weder eine verstärkte,
noch eine abgeschwächte Wirkung durch die Taxole. In Tierversuchen stieg die
Konzentrationen antioxidativ wirkender Enzyme und Stoffe im Vergleich
zwischen unbehandelten Ratten und derer unter Paclitaxel Therapie sogar an
[76].
Anhand der Studienlage lässt sich bisher keine eindeutige Aussage über eine
pro- oder anti-oxidative Aktivität von Paclitaxel treffen. Da das Zytostatikum in
unseren beiden Versuchsreihen vertreten war und es darunter zu keiner
signifikant schnelleren LDL Oxidation kam, muss von einer eher geringen
radikalinduzierenden Wirkung ausgegangen werden.
6.3.4 Carboplatin
Auch Carboplatin steht im Verdacht an der Entstehung von reaktiven
Sauerstoffradikalen beteiligt zu sein. Im Vergleich zu Cisplatin scheint die
Menge der Nebenwirkungen und somit die der entstehenden Radikale
allerdings deutlich geringer zu sein [41]. Platin- Komplexe, wie die meisten
anderen Alkylantien, entfalten ihre Wirkung durch die Bildung starker
elektrophiler Zwischenprodukte, die wiederum durch nukleophile Substitution zu
Querverbindungen zwischen einzelnen DNA Strängen führen. Zusätzlich
bewirken diese auch die Ausbildung von Verbindungen innerhalb eines DNA
Moleküls. In einigen Versuchen mit Antioxidantien konnte weder eine
signifikante Reduktion der antitumorösen Eigenschaften, noch ein besonders
starker Rückgang der Nebenwirkungen erzielt werden. Daraus kann man
schlussfolgern, dass die Rolle freier Radikale in diesem Fall eher als gering zu
werten ist [24, 26].
51 6.4 Bezug der Studie zur aktuellen Forschung
Neben den individuellen Eigenschaften der Zytostatika auf die oxidativen
Vorgänge im menschlichen Körper, gilt es die Anpassungsvorgänge des Körper
auf oxidativen Stress zu berücksichtigen. Aufgrund einer potentiell schädlichen
Wirkung auf Zellstrukturen durch hochreaktive Stoffe wie ROS werden
antioxidative Enzyme und Stoffe im Bedarfsfall hochreguliert.
So konnte beispielsweise am Mausmodell gezeigt werden, dass Doxorubicin
die RNA Transkription und Stabilität signifikant verlängert. Ebenso konnten
erhöhte Aktivitäten der Katalase und y- Glutamyl- Cystein- Synthetase (y-GCS),
einem Schlüsselenzym in der Glutathion de novo Synthese, nachgewiesen
werden [107].
6.4.1 Das Mammakarzinom als Ursache oxidativen Stresses
Neben den Zytostatika stellt in unserer Studie besonders das Mammakarzinom
an sich einen potentiellen Produzenten freier Radikale dar.
Bei einer Reihe von Malignomen konnte bereits eine vermehrte Produktion von
Wasserstoffperoxid in vitro beobachtet werden [99]. Die Mehrzahl der
Brustkrebsarten zeigte hierbei eine vermehrte Expression des Enzyms
Thymidin Phosphorylase. Dieses katalysiert die Umwandlung von Thymidin zu
Thymin und 2-Desoxy-Dribose-1-Phosphat. Letzteres wirkt stark reduzierend
und setzt im Zuge der Reaktion Sauerstoffradikale frei, sodass laborchemisch
ein erhöhtes oxidatives Stressniveau detektiert werden konnte [16].
Als weitere Ursache kommen Phenoxylradikale infrage. Diese entstehen bei der
Verstoffwechselung von 17β-Östradiol durch die Lactoperoxidase in der
Brustdrüse [92]. Des weiteren begünstigen Hypoxie [98] und die körpereigene
Tumorabwehr durch Makrophagen [38] die Entstehung von ROS.
In wieweit diese Ergebnisse mit der durchgeführten Studie übereinstimmen
muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden, insbesondere da bei dem
hier verwendeten Studiendesign kein Vergleich zwischen Mammakarzinom
Erkrankten und somit potentiellen radikalherstellenden Tumormassen und einer
gesunden weiblichen Kontrollgruppe möglich ist. Am ehesten kann vermutet
werden, dass es durch den zytostatikainduzierten Rückgang der Tumormasse,
zu einer gewissen Balance zwischen dem Rückgang der Radikalproduktion
durch den Tumor und einer Zunahme der ROS- Bildung durch die
52 Chemotherapeutika gekommen ist. Besteht die Tumorerkrankung über einen
längeren Zeitraum, so ist davon auszugehen, dass der Körper als Antwort auf
den
persistierenden
oxidativen
Stress
mit
einer
Up-Regulation
von
radikalabbauenden Enzymen reagiert. ROS beeinflussen dabei direkt oder
indirekt
die
Transkription
bestimmter
Gensequenzen
und
Signaltransduktionswege [9]. Ziel ist es wieder ein ausgeglichenes Verhältnis
von pro-oxidativen und antioxidativen Stoffen zu schaffen.
6.4.2 Antioxidantien als supportiver Therapieansatz
Nicht selten wird die Chemotherapie von Patienten als sehr belastend
empfunden. Die additive Gabe von Antioxidantien zur Verbesserung der
Verträglichkeit von Zytostatika, wurde bereits mehrfach untersucht. In den
aktuellen S3 Leitlinien zur Behandlung des Mamma Karzinoms wird jedoch
keine Empfehlung diesbezüglich gegeben [4], insbesondere aufgrund einer
geringen Studiendichte und der daraus resultierenden kaum einschätzbaren
Auswirkung auf die eigentliche antitumoröse Therapie.
Anhand der hier vorliegenden Daten scheint eine additive Gabe von
Antioxidantien wenig sinnvoll, da die beiden im Rahmen der Studie
untersuchten Polychemotherapie- Schemata die Lag- Phasen und somit das
Niveau des oxidativen Stresses nicht signifikant veränderten.
Bezüglich konkreter Aussagen bedarf es jedoch weiterer Studien mit
ausgewählten Antioxidantien, wie beispielsweise Vitamin C, Vitamin E,
Betacarotin oder Folsäure.
Camphauen et al sowie Bairati et al beschrieben bereits die negative
Auswirkung
supportiver
Antioxidantien
auf
den
Therapieerfolg
der
Strahlentherapie. Die Anwendung antioxidativ wirkender Substanzen hätte zwar
zum Rückgang therapiebedingter Nebenwirkungen wie beispielsweise der
Mukositis
geführt,
wurde
aber
mit
einer
geringeren
Effektivität
der
Strahlentherapie erkauft [11, 19]. Zudem kann nicht davon ausgegangen
werden,
dass
Antioxidantien
das
Radikalniveau
zwangsläufig
senken.
Hochdosiertes Vitamin C ab Konzentrationen von 100 µg/ml wirkte in
Mammakarzinomzellen antiproliferativ, indem es zu einem Anstieg an
Sauerstoffradikalen führte [103].
Unter diesen Gesichtspunkten ist davon auszugehen, dass eine zusätzliche
Applikation von Antioxidantien nicht mit einem Vorteil in der zytostatischen
53 Behandlung einhergeht und in bestimmten Fällen sogar kontraproduktiv wirkt.
Von einer additiven Gabe an Antioxidantien ist daher abzusehen, auf eine
ausgewogene Zufuhr durch die Nahrung sollte allerding keinesfalls verzichtet
werden.
Die Ergebnisse der hier vorgestellten Studie ergaben, dass es während der
angewendeten
Polychemotherapie-
Schemata
zu
keiner
signifikanten
Veränderung in der Oxidierbarkeit der LDL Moleküle kommt. Weder unter der
Gabe der Kombination aus Epirubicin, Cyclophosphamid und Paclitaxel, noch
unter der Therapie mit Carboplatin und Paclitaxel konnte eine Verlängerung der
Lag-Phase zu den verschiedenen Blutentnahme Zeitpunkten registriert werden.
Dies ist umso bemerkenswerter, da viele Studien die Wirkungsweise von
Zytostatika und deren Nebenwirkungsspektrum, einer Bildung freier Radikale
zuschreiben. Der genaue Mechanismus, der zu diesem aktuellen Ergebnis führt
ist bisher ungeklärt. Am ehesten wäre die Ursache in der Kombination der
einzelnen Substanzen zu suchen. Komplexe regulatorische Vorgänge könne
aber auch nicht ausgeschlossen werden.
54 7. Literaturverzeichnis
[1] (1989) Continuous Monitoring of in Vztro Oxidation of Human Low Density Lipoprotein. Free Radic Res. 6(1):67-­‐75. [2] Cyclophosphamid. Wikipedia 2013. [3] Free radicals induce gene expression of NGF and bFGF in rat... : NeuroReport. 2013/06/22/10:06:25 [cited; Available from: http://journals.lww.com/neuroreport/Fulltext/1992/06000/Free_radicals
_induce_gene_expression_of_NGF_and.3.aspx files/303/Free_radicals_induce_gene_expression_of_NGF_and.3.html [4] Interdisziplinäre S3-­‐Leitlinie für die Diagnostik, Therapie und Nachsorge des Mammakarzinoms 07/2012 [cited; Available from: http://www.awmf.org/uploads/tx_szleitlinien/032-­‐
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AP-1
BET
BMI
BRCA 1/2 °C
c
ca.
cm
CP Schema
Cu2+
CuSO4
DCIS
dest.
d.h.
dl
DNA
E
EC-P Schema
EDTA
Erl.
Fa.
g
H2 O
H2O2
HDL
hptsl.
HOCl
H0
H1
IDL
KBr
LCIS
LDL
mg
min
ml
mm
µl
nm
n
NaCl
NADH Oxidase
NADPH Oxidase
Nbg.
NF-κB
NO
Transkriptionsfaktor
Brust erhaltende Therapie
Body Mass Index
Breast Cancer Tumorsupressorgen
1/2
Grad Celsius
Konzentration
circa
Zentimeter
Carboplatin, Paclitaxel Schema
Kupfer Ion
Kupfersulfat
duktales Carcinoma in situ
destilliert
das heißt
Deziliter
Desoxyribonukleinacid
Extinktion
Epirubicin, Cyclophosphamid,
Paclitaxel Schema
Ethylendiamintetraacetat
Erlangen
Firma
Gramm
Wasser
Wasserstoffperoxid
High density Lipoprotein
hauptsächlich
Hypochlorige Säure
Nullhypothese
Alternativhypothese
Intermediate density Lipoprotein
Kalium Bromid
lobuläres Carcinoma in situ
Low-density Lipoprotein
Milligramm
Minuten
Milliliter
Millimeter
Mikroliter
Nanometer
Anzahl
Natriumchlorid
Nikotinamidadenindinukleotid Oxidase
Nikotinamidadenindinukleotidphosphat
Nürnberg
Transkriptionsfaktor
Stickstoffmonooxid
61 O2
O2°
o.ä.
OH
oxLDL
p
PBS-Puffer
RNA
ROS
Std. Abw.
t
TNM
u.a.
U/min
uvm.
VLDL
Vv.
z.B.
Z.n.
Z.v.
4-HNE
Sauerstoff
Sauerstoff Radikal
oder ähnliches
Hydroxid Ion
Oxidiertes LDL
Wahrscheinlichkeit
Phosphate buffered saline
Ribonukleinacid
Reactive Oxygen Species
Standardabweichung
Zeit
Tumor-nodes-metastasen
Klassifikation
unter anderem
Umdrehungen pro Minute
und vieles mehr
Very low density Lipoprotein
Venae
zum Beispiel
Zustand nach
Zustand vor
4-Hydroxynonenal
62 9. Danksagung
Ich möchte mich hiermit beim Direktor der Frauenklinik, Herrn Prof. Dr. M. W.
Beckmann für die Möglichkeit bedanken, dass ich die Dissertation an seinem
Haus anfertigen durfte.
Bedanken möchte ich mich auch bei meinem Doktorvater Prof. Dr. R. Dittrich,
der mich während der Zeit begleitet hat und stets ein offenes Ohr für schwierige
Fragen hatte.
Ich danke den Kollegen der Frauenklinik, für die vielen Blutabnahmen zur
Materialgewinnung die sie geleistet haben. Insbesondere meiner Betreuerin Dr.
med. Olga Strahl, die mich immer ermuntert hat, auf dem steinigen Weg bis zur
Vollendung der Doktorarbeit weiter zu gehen.
Eine besondere Danksagung geht an Frau I. Hoffmann, die während des
experimentellen Teils der Dissertation, stets ein offenes Ohr für mich hatte und
mir bei Problemen in Rat und Tat zur Seite stand.
Der größte Dank gilt meinen Eltern und meiner Freundin für die Kraft,
Motivation und Unterstützung, ohne die ich das Medizinstudium und die
Fertigstellung meiner Dissertation niemals geschafft hätte.
63 10.Lebenslauf
Markus Habermeyer
Angerweidestr. 6a
82319 Starnberg
Tel.: 08151 / 9973349
E-mail: [email protected]
geb.: 25.03.1986 in Gunzenhausen
Familienstand: ledig
Ausbildung
09/1992 – 07/1996
06/2003 – 06/2005
04/2006 – 11/2012
Zivildienst
09/2005 – 05/2006
Famulaturen
02/2009 – 03/2009
02/2010 – 03/2010
09/2010 – 10/2010
03/2011 – 04/2011
Praktisches Jahr
08/2011 – 12/2011
12/2011 – 03/2012
03/2012 – 07/2012
Berufserfahrung
07/2008 – 09/2008
10/2008 – 07/2009
02/2011 – 12/2012
Seit 05/2013
Grundschule, Frickenfelden
Simon - Marius - Gymnasium, Gunzenhausen
Studium der Humanmedizin,
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
09/2008 Erfolgreiches Bestehen des ersten
Abschnittes der ärztlichen Prüfung
11/2012 Erfolgreiches Bestehen des zweiten
Abschnittes der ärztlichen Prüfung
Klinikum Hallerwiese, Nürnberg
Allgemeinmedizinische Arztpraxis
Dr. med. U. Schaaf
Innere Medizin am Kreiskrankenhaus Gunzenhausen
Kinder und Jungenabteilung für Psychische
Gesundheit des Universitätsklinikums Erlangen
Urologische Arztpraxis Dr. med. A. Ostertag
Chirurgie; Kantonspital Winterthur, Lehrkrankenhaus
der Universität Zürich, Schweiz
Innere; Klinikum Ansbach
Allgemeinmedizin; Allgemeinarztpraxis
Dr. med. H. Reinfelder – Weninger
Studentische Hilfskraft in der Hämatologie und
internistischen Onkologie – Medizinische Klinik 5 des
Universitätsklinikums Erlangen
Tutor am Lehrstuhl für Anatomie I in Erlangen
Mitarbeiter bei Siemens Healthcare Erlangen im
Bereich Magnetresonanztomographie
Assistenzarzt für Innere Medizin im
Benedictus Krankenhaus Tutzing