5 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es, Gene zu identifizieren, deren Expression durch die Induktion
von systemisch erworbener Resistenz (SAR) in Kartoffelblättern zu frühen Zeitpunkten
systemisch reguliert wird. Dazu wurden Kartoffelblätter mit Pseudomonas syringae pv.
maculicola infiltriert und diese und die darüberliegenden Blätter analysiert. Mit der
Methode des Enhanced bzw. des klassischen Differential Display (DDRT-PCR) war es
möglich, einige cDNA-Fragmente zu isolieren, die differentiell exprimiert werden, wobei
die klassische Methode geeigneter erschien als die Modifikation. Zwei cDNAFragmente, sre 3 und sre 4 (systemisch responsiv), wurden weiterbearbeitet. Die
Expression von sre 3 wird zu frühen Zeitpunkten nach Bakterieninfiltration aktiviert und
dauert bis mindestens 48 h an. In systemischem Gewebe wurde eine geringere aber
ebenfalls differentiell regulierte Transkriptakkumulation mit Hilfe der RT-PCR
festgestellt. Das DDRT-PCR-Fragment sre 3 hybridisiert mit einer 2,8 Kb-Bande im
Northern Blot und mit je zwei Restriktionsfragmenten im Southern Experiment, sodass
man von einem Gen mit geringer Kopienzahl im Genom ausgehen kann. Eine
Klonierung längerer cDNAs blieb ohne Erfolg und die Analyse des genomische
Bereiches ergab ein ungewöhnlich komplexes Muster an invertierten Wiederholungen,
die weder eine kodierende Region noch einen Promotor erkennen ließen.
Das Gen sre 4 ist bereits 6 h nach der Bakterieninfiltration sowohl lokal als auch
systemisch stärker exprimiert und bleibt bis mindestens 48 h auf einem hohen
Expressionsniveau. Außerdem wird die Expression von sre 4 durch die
Signalsubstanzen Salizylat und Abszisinsäure, durch Verwundung, osmotischen Stress
und Kältereize, sowie tagesverlaufsabhängig aktiviert. In Blüten ist es stärker
exprimiert als in alten Blättern und Knollen und dort stärker als in der Sproßachse und
in Wurzeln. In sehr jungen Blättern sind keine sre 4-Transkripte detektierbar. Die
genomische Sequenz des Gens sowie etwa 1 Kb in 5´-Richtung konnten mit Hilfe des
genome walking isoliert und sequenziert werden. In Übereinstimmung mit der
tatsächlich gefundenen Expression enthält der Promotorbereich verschiedene
konservierte Boxen, die unter anderem Licht-, Abszisinsäure-, Salizylat-,
Trockenstress- und Zucker-abhängige sowie circadiane Genregulation vermitteln
können. Außerdem enthält der Promotorbereich zwei sogenannte W-Boxen, die in die
Pathogen- und Elicitorresponsivität von Genen involviert sind und als gemeinsames
Motiv systemisch aktivierter Gene identifiziert wurden.
Das Gen sre 4 kodiert für ein Transkript, das durch alternative Nutzung von 5`Spleißstellen und differentielles Spleißen eines zweiten Introns insgesamt 4 mRNAs
hervorbringt. Das Hauptprodukt kodiert für ein 166 AS großes Protein, das starke
Sequenzhomologien zu glyzinreichen RNA-bindenden Proteinen zeigt, deren Funktion
noch nicht aufgeklärt werden konnte. Die putative Lokalisation im Kern und die
berechnete 3D-Struktur, die verifizierten RNA-bindenden Domänen stark gleicht, legen
die Vermutung nahe, dass sre 4 an genregulatorischen Prozessen beteiligt sein
könnte.
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Die immunologische Analyse von Blattmaterial hat ergeben, dass mit einem Antiserum
gegen ein internes Peptid zwei Proteine detektiert werden können, wobei es sich
möglicherweise um das sre 4-Hauptprodukt Sre-p1 sowie um ein sequenzhomologes
Protein aus Kartoffel handeln könnte. Die anderen drei Transkripte kodieren für kürzere
Proteine, die die oben genannten Domänen z. T. nicht enthalten, weshalb fraglich ist,
ob es sich um funktionelle Proteine handeln kann.
Zur Funktionsanalyse des von Catherine Kistner identifizierten Gens sre 2, das schnell
und transient nach Bakterieninfiltration akkumuliert, wurde eine der identifizierten
cDNAs unter der Kontrolle eines konstitutiv stark exprimierenden Promotors in senseund antisense-Orientierung exprimiert. Der transgene Status sowie die Expression des
Transgens wurde in den transformierten Pflanzen analysiert und eine Auswahl von
Linien wurde in Inokulationsexperimenten untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass
die Nekrosenbildung nach Bakterieninfiltration in sense-Linien deutlich verzögert war,
während antisense-Linien einen Wildtyp-ähnlichen Phänotyp zeigten. Das bakterielle
Wachstum war in sense-Linien höher als in Wildtyp-Pflanzen und in antisensetransgenen Linien, was einen Hinweis darauf gibt, dass es sich bei dem Genprodukt
von sre 2 um einen negativen Regulator der Pflanzenabwehr handeln könnte.