Effekte von Levetiracetam auf neurotrophe Hypoxie
Werbung
Aus der Kinder- und Jugendklinik des Universitätsklinikum Erlangen der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg (Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher) Effekte von Levetiracetam auf neurotrophe Hypoxie-induzierbare Faktoren im unreifen Gehirn der Maus unter akuter systemischer Hypoxie Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt 2010 von Julia Schneider geboren in München Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Herr Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler 1. Gutachter: Frau Prof. Dr. med. R. Trollmann 2. Gutachter: Herr Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2010 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .......................................................................................... I Zusammenfassung ........................................................................................ 1 Hintergrund und Ziele................................................................................ 1 Methoden .................................................................................................. 1 Ergebnisse und Beobachtung ................................................................... 2 Praktische Schlussfolgerung ..................................................................... 2 Summary ........................................................................................................ 3 Background and objectives ....................................................................... 3 Methods .................................................................................................... 3 Practical conclusion .................................................................................. 4 1. Einleitung ................................................................................................... 5 1.1. Ursachen und Folgen einer perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns .............................................................................. 5 1.1.1. Inzidenz der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns ..................................................................................................... 5 1.1.2. Ätiologie der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns ..................................................................................................... 6 1.1.3. Klinische Symptome und Prognose der perinatalen hypoxischischämischen Schädigung des Gehirns .................................................... 7 1.1.4. Neuropathologische Folgen und pathophysiologische Mechanismen der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns .......... 9 1.1.4.1. Neuropathologische Folgen ......................................................... 9 1.1.4.2. Pathophysiologische Mechanismen ........................................... 10 1.1.4.2.1. Exzitotoxizität von Glutamat .................................................... 11 1.1.4.2.2. Nekrose ................................................................................... 12 1.1.4.2.3. Apoptose ................................................................................. 13 1.1.5. Experimentelle neuroprotektive Therapieansätze bei der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns ................................. 15 1.2. Endogene Adaptations-Mechanismen bei der perinatalen hypoxischischämischen Schädigung des Gehirns ..................................................... 17 II 1.2.1. HIF-Mechanismus ......................................................................... 17 1.2.2. Zerebrale Regulation der HIF-abhängigen vasoaktiven Faktoren VEGF und iNOS ...................................................................................... 21 1.2.3. Zerebrale Regulation der HIF-unabhängigen Faktoren nNOS, eNOS und Caspase-3 ............................................................................. 28 1.3. Levetiracetam ...................................................................................... 31 1.3.1. Pharmakologische Daten zu LEV.................................................. 32 1.3.2. Wirkmechanismus von LEV .......................................................... 33 1.3.3. Stand des Wissens zu neuroprotektiven Effekten von LEV im Tierexperiment an Ratten........................................................................ 34 1.4. Aufgabenstellung und Zielsetzung ...................................................... 35 2. Material und Methoden............................................................................ 38 2.1. Aufbau und Durchführung des Tierversuchs ....................................... 38 2.2. RNA-Isolation ...................................................................................... 40 2.3. Reverse Transkription ......................................................................... 43 2.4. TaqMan Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ................. 44 2.5. Statistische Auswertung ...................................................................... 50 3. Ergebnisse ............................................................................................... 51 3.1. Einfluss von Hypoxie auf HIF-1-abhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 ............................................................... 51 3.1.1. Genexpression von VEGF im neonatalen Gehirn der Maus unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7 ..................................................... 51 3.1.2. Genexpression von iNOS im neonatalen Gehirn der Maus unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7 ..................................................... 54 3.2. Einfluss von Hypoxie auf HIF-1-unabhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 ................................................... 56 3.3. Einfluss von Levetiracetam auf HIF-1-abhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 unter Normoxie und Hypoxie ..... 62 3.3.1. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1abhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Normoxie ................................................................................................. 62 III 3.3.2. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1abhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Hypoxie .......................................................................................... 62 3.4. Einfluss von Levetiracetam auf HIF-1-unabhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 unter Normoxie und Hypoxie ...................................................................................................... 67 3.4.1. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1unabhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Normoxie ....................................................................................... 67 3.4.2. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1unabhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Hypoxie .......................................................................................... 67 4. Diskussion ............................................................................................... 75 4.1. Bedeutung von Hypoxie als Ursache für perinatale ZNS-Schäden .... 75 4.2. HIF und frühe ZNS-Entwicklung .......................................................... 79 4.4. Effekte von LEV auf essentielle Entwicklungsfaktoren ........................ 87 4.3. Ausblick ............................................................................................... 91 5. Literaturverzeichnis................................................................................. 93 6. Abkürzungen .......................................................................................... 107 7. Abbildungsverzeichnis ......................................................................... 113 8. Tabellenverzeichnis............................................................................... 115 9. Veröffentlichungen ................................................................................ 116 10. Danksagung ......................................................................................... 117 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Die perinatale Hypoxie ist eine der häufigsten Ursachen für Hypoxischischämische Enzephalopathie (HIE). Das Ausmaß und die Prognose der zerebralen Schädigung hängen vom Gestationsalter der Neugeborenen und somit vom zerebralen Reifungsgrad ab. Durch eine perinatale Hypoxie werden außerdem endogene Protektionskaskaden aktiviert, unter denen der Hypoxieinduzierbare Faktor (HIF) die größte Bedeutung hat. Als Transkriptionsfaktor reguliert HIF die Expression einer Vielzahl von Genen. Dazu zählen der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und die induzierbare NOSynthase (iNOS), die in die reaktive Gefäßregulation involviert sind. Ein weiterer wichtiger Faktor der neuronalen Schädigungskaskade ist das proapoptotische Enzym Caspase-3. Zur Therapie einer HIE stehen bislang keine spezifischen neuroprotektiven Behandlungsoptionen zur Verfügung. Levetiracetam (LEV) ist ein Antikonvulsivum der neueren Generation, das tierexperimentell neuroprotektive Eigenschaften zeigte. Daten zu Effekten von LEV auf neurotrophe und vasoaktive HIF-regulierte Faktoren unter Hypoxie im unreifen Gehirn sind bislang in der Literatur nicht verfügbar. Ziel vorliegender Arbeit war die Charakterisierung von zerebralen vasoaktiven und neurotrophen HIF-regulierten Mechanismen infolge akuter systemischer Hypoxie im extrem unreifen Gehirn. Ein weiteres Ziel war die Analyse des Einflusses von Levetiracetam auf die Hypoxie-induzierten neurotrophen und vasoaktiven Faktoren. Methoden Mittels RT-PCR wurden 1) die zerebrale mRNA-Expression von den HIFabhängigen Genen VEGF und iNOS, sowie von den Hypoxie-induzierbaren, HIF-unabhängigen Genen nNOS, eNOS und Caspase-3 unter akuter systemischer Hypoxie (8% O2, 6h) und 2) der Einfluss von LEV (50mg/kg) auf die Expression oben genannter Gene unter Hypoxie und Normoxie analysiert. Die Untersuchungen wurden in zwei unterschiedlichen Entwicklungsstadien 2 (P0, P7) des unreifen Gehirns am Modell der neonatalen Maus durchgeführt. Die statistische Auswertung der ermittelten Daten erfolgte mit der GraphPad PRISM Version 4.0 Software. Ergebnisse und Beobachtung Akute Hypoxie führte zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression von VEGF und zu einer signifikanten Reduktion der mRNA-Expression von iNOS im Alter von P0 und P7. Im Gegensatz dazu wiesen die mittleren mRNA-Konzentrationen von nNOS, eNOS und Caspase-3 unter Hypoxie keine signifikante Veränderung weder im Alter von P0 noch P7 auf. Unter Normoxie zeigte die Gabe von LEV weder zum Zeitpunkt P0 noch P7 eine signifikante Beeinflussung der mRNA-Expression von VEGF und iNOS. Unter Hypoxie stieg im Gehirn der LEV-behandelten Tiere zu beiden Zeitpunkten P0 und P7 die Expression der VEGF-mRNA signifikant an. Die mRNA-Expression von iNOS zeigte nach einer LEV-Therapie unter Hypoxie eine signifikante Reduktion ausschließlich im Alter von P7. Im Gegensatz hierzu kam es zum Zeitpunkt P0 zu keinem signifikanten Abfall der iNOS-mRNA-Expression. Bei den Konzentrationen von nNOS, eNOS und Caspase-3 konnten nach der Gabe von LEV zu keinem Zeitpunkt weder unter Normoxie noch Hypoxie signifikante Veränderungen festgestellt werden. Praktische Schlussfolgerung Zusammenfassend zeigte sich unter akuter Hypoxie eine signifikante Veränderung der mRNA-Expression HIF-abhängiger Faktoren zum Zeitpunkt P0 und P7. Dies unterstützt die These, dass HIF bei der Regulation von zerebraler Hypoxie im unreifen Gehirn eine Schlüsselrolle spielt. Desweiteren zeigte die Gabe von LEV keine wesentliche Beeinflussung der Expression HIF-abhängiger und HIF-unabhängiger Gene. Dies legt nahe, dass LEV weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen signifikanten Effekt auf endogene Protektionsmechanismen des unreifen Gehirns aufweist. Um einen möglichen neuroprotektiven Effekt von LEV unter Hypoxie im unreifen Gehirn der Maus beurteilen zu können, sind weitere Studien geplant. 3 Summary Background and objectives Perinatal hypoxia is one of the most important causes for hypoxic ischemic encephalopathy (HIE). The extention and the prognose of the cerebral damage depend on the gestational age of the newborn and therefore on the cerebral maturation. Perinatal hypoxia also activates endogeneous cascades of protection. The keyregulator of these processes is the hypoxia-inducible factor (HIF). As a factor of transcription HIF regulates the expression of several genes limiting the toxic effects of hypoxia. The vascular endothelial growth factor (VEGF) and the inducible NO-synthetase (iNOS) are parts of these genes. Both are involved in the regulation of the vessels following hypoxic conditions. A further role in the cascade of neuronal damage caused by perinatal hypoxia plays the enzyme csapase-3 which initiates apoptotic mechanisms. Actually there exists no specific neuroprotective therapy to treat the HIE. Levetiracetam (LEV) is an antiepileptic drug of the newer generation that showed neuroprotective attributes in experiments with animals. In the literature are no data available of the effects of LEV on neurotrophic and vasoactive HIF-regulated factors under hypoxic conditions in the premature brain. The objective of the present study was to characterize cerebral vasoactive and neurotrophic HIF-regulated mechanisms following acute systemic hypoxia in the extreme premature brain. Another objective was to analyse the influence of LEV on neurotrophic and vasoactive factors induced by hypoxia. Methods Following expressions of genes were examined by RT-PCR: 1) the cerebral mRNA-expression of the HIF-dependend genes VEGF and iNOS and of the hypoxia-induced but not HIF-dependend genes nNOS, eNOS and caspase-3 under hypoxic conditions (8% O2 for 6 hours) 2) the influence of LEV on the expression of these genes under hypoxic and normoxic conditions. The experiments were carried out in two different development states of the 4 premature brain of the neonatal mouse at P0 and P7. The data were statistically and graphically analysed by GraphPad PRISM version 4.0 Software. Results and observations Acute hypoxia led to a significant increase of the mRNA-expression of VEGF and to a significant decrease of the mRNA-expression of iNOS at P0 and P7. In the opposite of this there was no significant change of the mean mRNAconcentrations of nNOS, eNOS and caspase-3 under hypoxia neither at P0 nor at P7. After a treatment with LEV no significant changes of the expression of the HIF-regulated factors VEGF and iNOS could be detected in normoxia at P0 and P7. Under hypoxia the expression of the VEGF-mRNA increased significantly in the brain of the LEV-treated animals at P0 and P7. The mRNAexpression of iNOS decreased significantly after a treatment with LEV in hypoxia at P7. In contrast to this, no significant decrease of the expression of iNOS-mRNA in hypoxia could be shown at P0. The mean concentrations of the mRNA of nNOS, eNOS and caspase-3 were not changed significantly after a treatment with LEV in normoxia and hypoxia neither at P0 nor at P7. Practical conclusion In conclusion it could be detected a significant change of the mRNAexpression of the HIF-depended factors in acute hypoxia at P0 and P7 which is in consense with the thesis that HIF plays a keyrole in the regulation of cerebral hypoxia in the premature brain. Furthermore, the present study showed no obvious influence of LEV on the expression of HIF-dependend and HIF-undependend but hypoxia-inducable genes. This implies that LEV has no significant effect on the endogenous mechanisms of protection in the premature brain neither in normoxia nor in hypoxia. To ensure a possible neuroprotective effect of LEV in hypoxia in the premature brain further studies are planed. 5 1. Einleitung 1.1. Ursachen und Folgen einer perinatalen hypoxischischämischen Schädigung des Gehirns Die Möglichkeiten der Perinatal- und Intensivmedizin zur Verbesserung von pharmakologischen und technischen Interventionsmöglichkeiten zur Behandlung kritisch kranker Neugeborener entwickeln sich mit großem Fortschritt. Wesentliche Beiträge dabei waren z.B. die Optimierung von Beatmungsmöglichkeiten unreifer Frühgeborener, Medikamente, wie zum Beispiel Antioxidantien, Surfactant-Ersatz oder Kortikosteroide und zukünftig möglicherweise die Anwendung therapeutischer Hypothermie (Lin et al. 2004, Rutherford et al., 2005). Eine besondere Herausforderung stellt vor allem die Optimierung der Versorgung von Frühgeborenen dar. Trotz der fortschreitenden medizinischen Möglichkeiten zur optimalen Versorgung von Früh- und Neugeborenen können während der Perinatalperiode Komplikationen auftreten, die zu zerebraler Hypoxie und zu bleibenden Schäden im neonatalen Gehirn führen. Das zerebrale Schädigungsmuster ist dabei vom Gestationsalter und dem entsprechenden Entwicklungsstadium der Neugeborenen abhängig. Sowohl bei Reifgeborenen, als auch bei Frühgeborenen kommt es im Gehirn zu typischen neuropathologischen Veränderungen unterschiedlicher Form und Lokalisation (Meberg et al., 2004, Rorke, 1992). 1.1.1. Inzidenz der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns Als neonatale Komplikation gilt die perinatale Asphyxie infolge akuter Hypoxie/Ischämie. Es entsteht eine Situation mit gestörtem Gasaustausch, aus dem Hypoxämie, Hypoxie, Hyperkapnie und Azidose resultieren können. Die perinatale Asphyxie ist die häufigste Ursache einer Hypoxischischämischen Enzephalopathie (HIE), welche sich nach einem hypoxischen Ereignis innerhalb von Stunden bis Tagen während der Reperfusionsphase 6 des Gehirns entwickelt. Insgesamt tritt die perinatale Asphyxie bei 2-3 von 1000 Lebendgeborenen auf (Meberg et al., 2004). Die Inzidenz der HIE als Folge liegt bei 1-2 von 1000 Neugeborenen. Die Akutmortalitätsrate ist hoch (20-25%) und bei fast der Hälfte der betroffenen Neugeborenen bleiben chronische neurologische Schäden zurück (Carli et al., 2004, Palsdottir et al., 2007). Bei Frühgeborenen tritt die periventrikuläre Leukomalazie mit einer Inzidenz von ca. 5%, die intra- bzw. periventrikuläre Hirnblutung mit einer Inzidenz von ca. 10 % auf, bei Kindern unter 1500g bis zu 50% (Hack et al., 2000). 1.1.2. Ätiologie der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns Das Risikoprofil für zerebrale Schädigung in der Perinatalperiode unterscheidet sich bei Reif- und Frühgeborenen. Bei Reifgeborenen dominieren Risikofaktoren wie akute Hypoxie und unmittelbare Komplikationen während der Geburt. Die perinatale Hypoxie wird durch eine akut verminderte materno-plazentare oder feto-plazentare Blutversorgung während der Geburt ausgelöst. Verschiedene Ursachen können zugrunde liegen. Am häufigsten sind Nabelschnurkomplikationen, vorzeitige Plazentalösung oder Uterusruptur, woraus eine akute perinatale Hypoxie resultieren kann. Bei Komplikationen der plazentaren Versorgung, wie einer vorzeitigen Plazentalösung oder einer Plazentablutung ist die Sauerstoffversorgung des Kindes akut vermindert mit der Folge einer HIE beim Neugeborenen (Palsdottir et al., 2007). In klinischen Studien wurde beobachtet, dass eine Geburt mittels Vakuumextraktion (22%) bzw. Zange (6%) oder eine Notfallsektio (20%) das Risiko für hypoxisch/ischämische Komplikationen erhöhen (Meberg et al., 2004, Palsdottir et al., 2007). Für Frühgeborene dominieren Risikofaktoren wie hypoxisch/ischämische Ereignisse, maternale Infektionen, pränatale Infektionen, chronische intrauterine Hypoxie und Energiemangel (Berger et al., 1997, Jensen et al., 1992). Postnatale Komplikationen während der Neonatalperiode wie Sepsis, bronchopulmonale Dysplasie, systemische Hypoperfusion und zerebrale 7 Krampfanfälle sind weitere Risikofaktoren (Nelson et al., 1991, Woodward et al., 2006), die die Sauerstoffversorgung des Gehirns gefährden und zu neurologischen Langzeitdefiziten führen können (Rutherford et al., 2005). 1.1.3. Klinische Symptome und Prognose der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns Die HIE ist ein Krankheitsbild aufgrund zerebraler Schädigung infolge perinataler Asphyxie. Insgesamt 20-30% der Neugeborenen mit perinataler hypoxischer Enzephalopathie leiden unter bleibenden Folgeschäden (Carli et al., 2004). Die Ausprägung der klinischen Symptome ist hierbei sehr variabel. Es kann zu neurologischen Störungen wie z.B. Epilepsie, Zerebralparese, Ataxie und senso-motorischen Behinderung in Form von hyperkinetischen Syndromen kommen (Carli et al., 2004, Veelken, et al., 1991). Häufig treten zudem kognitive Defizite, wie verminderte Konzentrationsleistung, Lernschwäche, geistige Retardierung und Verhaltensauffälligkeiten auf (Carli et al., 2004, Woodward et al., 2006). Bei sehr kleinen Frühgeborenen (Geburtsgewicht < 750g) zeigen sich zusätzlich vermehrt Sehstörungen bis hin zur vollständigen Blindheit (Hack et al., 2000). Die HIE wird klinisch-neurophysiologisch mittels Scores (z.B. nach Sarnat und Sarnat, 1976) in drei verschiedene Schweregrade unterteilt (Tab. 1). Tabelle 1 : Klinisch-neurophysiologischer Score nach Sarnat und Sarnat (1976) zur Klassifikation der HIE bei perinataler Asphyxie Leichte HIE (Stadium I) Mittelschwere HIE Schwere HIE (Stadium III) (Stadium II) Bewusstseinslage Hyperexzitabilität Lethargie Koma Motorik muskuläre schwere Hypotonie muskuläre normal Hypotonie 8 Reflexe normal bis leicht leicht bis stark abgeschwächt mittelmäßig abgeschwächt abgeschwächt bis nicht auslösbar Anfälle EEG Dauer keine häufig variabel normal Depression, Burst- hypersynchrone suppression, Aktivität Suppression 2-14 Tage Tage bis <24 Stunden Wochen Dabei ist gerade in der akuten Postasphyxiephase die exakte Bestimmung des Grades der HIE schwierig, da sich die klinischen Symptome erst mit einer Latenz von mehreren Stunden bis Tagen in voller Ausprägung entwickeln. Ein EEG in den ersten 24 Stunden nach der Geburt bietet eine gute Möglichkeit zur Früherkennung einer HIE (Rutherford et al., 2005). Die Ausprägung der morphologischen Schädigung kann mittels MRT, vor allem des Diffusionsgewichteten MRT, innerhalb der ersten Woche erfasst werden (Woodward et al., 2006). Das Auftreten von zerebralen Krampfanfällen gilt als prognostisch ungünstiger Faktor (Rutherford et al., 2005). In einer klinischen Studie von Pisani et al. (2007) wurden die zerebralen Folgen eines Status epilepticus mit vereinzelten Krampfanfällen in der Neonatalperiode verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass ein Status epilepticus vor allem bei Frühgeborenen ein hohes Risiko für neurologische Folgeschäden aufweist. Reifgeborene mit leichter HIE (Stadium I) haben eine fast 100%-ige Wahrscheinlichkeit einer normalen Entwicklung. Bei mittelschwerer HIE (Stadium II) entwickeln sich nur 52% der Kinder normal (Palsdottir et al., 2007). Insgesamt weisen über 30% der Patienten mit mittelgradiger HIE schwere neurologische Defizite auf, 5% der Patienten versterben innerhalb 9 des ersten Lebensjahrs (Carli et al., 2004). Reifgeborene mit schwerer HIE (Stadium III) haben ein sehr hohes Risiko (75%) während der Neonatalperiode zu versterben oder schwerste motorische und kognitive Langzeitdefizite zu erleiden (Carli et al., 2004, Palsdottir et al., 2007). Die entwicklungsneurologische Prognose nach zerebraler Schädigung ist bei Frühgeborenen abhängig vom Stadium der Gehirnentwicklung (Woodward et al., 2006). Die Vaskulogenese findet in der weißen Substanz erst später als in der grauen Substanz statt, wodurch eine inadäquate Gefäß-Autoregulation und eine gesteigerte Fragilität der Kapillaren in der Germinalmatrix bei Frühgeborenen bestehen (Nelson et al., 1991, Milligran, 1980). Dadurch ist es anfälliger für schädigende hypoxische Effekte, die sich bei Frühgeborenen typischerweise als intra- und periventrikuläre Blutungen und periventrikuläre Leukomalazie manifestieren (Meberg et al., 2004). Leichte Blutungen (Grad III) haben eine gute Prognose folgenlos auszuheilen, wohingegen bei schweren Blutungen (Grad III-IV) mit irreversibler Schädigung der Hirnsubstanz und schweren neurologischen Folgen bis hin zur Letalität zu rechnen ist. Eine klinische Studie an Frühgeborenen, in der das Ausmaß der Hirnschädigung mittels MRT erfasst wurde, zeigte eine Korrelation der Schwere der Läsion mit der Prognose (Woodward et al., 2006). Über die Hälfte dieser Kinder haben dauerhafte kognitive und 10-15% davon zusätzlich schwere motorische Störungen (Hack et al., 2000). Das Risiko schwerer Komplikationen steigt mit abnehmendem Geburtsgewicht stark an, wobei die Situation Neugeborener mit weniger als 750g als besonders kritisch gilt (Hack et al., 2000). 1.1.4. Neuropathologische Folgen und pathophysiologische Mechanismen der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns 1.1.4.1. Neuropathologische Folgen Die Lokalisation und das Ausmaß der zerebralen Schädigung hängen vom Entwicklungsstadium des Gehirns ab (Woodward et al., 2006). Im letzten 10 Trimenon ist die Bildung von Neuronen weitgehendst abgeschlossen, wohingegen die Ausreifung von Axonen und Dentriten noch fortdauert und die Synaptogenese gerade erst beginnt (Huttenlocher und Dabholkar, 1997). Nach einem perinatalen Hypoxieereignis können langfristige Veränderungen der neuronalen Migration auftreten. Diese treten im unreifen Gehirn bei Frühgeborenen hauptsächlich in vulnerablen Regionen wie der subcorticalen weißen Substanz, dem zerebralen Cortex, dem Striatum und dem Hippocampus auf (Rorke, 1992). In einem Tiermodell an hypoxischen Mäusen wiesen Neugeborene in sehr frühen Entwicklungsstadien (P3, P4, P6, P11) ein reduziertes Cortexvolumen, Verlust der weißen Substanz und Ventrikulomegalie auf (Curristin et al., 2002). Zudem konnte gezeigt werden, dass perinatale systemische Hypoxie vor allem in frühen Stadien der Gehirnentwicklung langfristig zu neuronalem Zelltod und signifikanter Verzögerung neuronaler Reifungsprozesse, wie der Ausbildung von Axonen, Dendriten und ihrer Synapsen führt (Curristin et al., 2002). Um den hypoxischen Schaden zu limitieren stehen dem Gehirn während der zerebralen Entwicklung Mechanismen zur Neuroregeneration zur Verfügung. Diese Annahme wird durch eine tierexperimentelle Arbeit an Mäusen (P6) unter chronischer postnataler Hypoxie unterstützt, in der eine lang anhaltende, reaktive Neurogenese vor allem im Bereich des Neocortex und in der Periventrikularzone nachgewiesen werden konnte (Yang et al., 2006). Bei Reifgeborenen liegen die Hypoxie/Ischämie-induzierten zerebralen Läsionen typischerweise im Bereich der Basalganglien und des Thalamus sowie cortical und subcortical im Bereich des sensomotorischen Cortex (Rorke, 1992). Es liegt eine selektive Vulnerabilität der neuronalen und glialen Strukturen in diesen Regionen zugrunde. Pathohistologisch handelt es sich um nekrotische und apoptotische Neurodegeneration. 1.1.4.2. Pathophysiologische Mechanismen Morphologisch zeigt sich eine hypoxische Schädigung im neonatalen Gehirn in Form von nekrotischem oder apoptotischem Zelltod. Sowohl klinische Arbeiten (Hack et al., 2000, Woodward et al., 2006) als auch 11 tierexperimentelle Studien (Curristin et al., 2002, Northington et al., 2001) geben Hinweise darauf, dass das Ausmaß der hypoxischen ZNS-Läsion vom Entwicklungsstadium und Typ der betroffenen Zellen, sowie den endogenen metabolischen und hämodynamischen Kompensationsmöglichkeiten abhängt. Tierexperimentelle Arbeiten zum Ausmaß des neuronalen Zelltodes nach zerebraler Hypoxie (Liu et al., 2004, Northington et al., 2001) zeigen, dass der neuronale Zelluntergang einem typischen Schädigungsmuster folgt. Zu Beginn der hypoxischen Schädigung überwiegt, verursacht durch akute Exzitotoxizität, der frühe Zelltod durch Nekrose. Im weiteren Verlauf steht der verzögerte programmierte Zelltod durch Apoptose im Vordergrund. Beide Formen können mit zeitlicher Verzögerung auch parallel auftreten (Liu et al., 2004, Northington et al., 2001). 1.1.4.2.1. Exzitotoxizität von Glutamat Perinatale Hypoxie/Ischämie stimuliert die neuronale Freisetzung von exzitatorischen Faktoren. Vor allem am unreifen Gehirn spielt dabei die Exzitotoxizität des Neurotransmitters Glutamat, der über verschiedene Rezeptoren, hauptsächlich Rezeptoren und jedoch über Non-NMDA-Rezeptoren isoxazol-Propionsäure (AMPA), Kainat) N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)- (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- wirkt (Patneau, 1990), eine Rolle. Während der Gehirnentwicklung werden diese vor allem in vulnerablen Arealen des Gehirns wie dem Striatum oder dem Hippocampus hoch exprimiert. Unter Hypoxie wird Glutamat vermehrt aus den terminalen Axonen freigesetzt und gleichzeitig präsynaptisch vermindert wiederaufgenommen. Dies führt zu einer Akkumulation des Neurotransmitters im synaptischen Spalt (Johnston, 1995). Die Überstimulation der AMPA- und NMDA-Rezeptoren und die daraus resultierende Depolarisierung der Zellmembran verstärken die Exzitotoxizität (Johnston, 1995) über die Erhöhung des intrazellulären Calcium-Gehaltes, die Bildung von neurotoxischem Stickstoffmonoxid (NO) und Peroxynitrit, sowie die Dysfunktion der Mitochondrien. 12 1.1.4.2.2. Nekrose Unter Nekrose versteht man den am lebenden Organismus stattfindenden Zelluntergang aufgrund akuter Schädigung der Zelle. Im Gegensatz zur Apoptose unterliegt die Nekrose keiner transkriptionellen Kontrolle und tritt nur unter pathologischen Bedingungen auf (Liu et al., 2004). Kennzeichnend für die Nekrose ist die Zerstörung der Zellmembran, wodurch eine sekundäre Inflammation hervorgerufen wird. Es werden zwei Arten der Nekrose unterschieden: die konventionelle Zelllyse, die mit einer Schwellung der Zelle und ihrer Organellen bis zur Destruktion einhergeht und die Zellschrumpfung. Während die neuronale Zelllyse direkt im hypoxischischämischen Läsionsgebiet stattfindet (Northington et al., 2001), geschieht die Zellschrumpfung eher in spezifisch vulnerablen und exzitatorischen Hirnregionen wie z.B. dem Neocortex und dem Hippocampus (Liu et al., 2004). Durch Hypoxie kommt es beim nekrotischen Zelltod zur Aktivierung einer Kette von biochemischen Mechanismen, die die zellulären Funktionen stören. Ausgelöst wird auftretenden diese Kaskade durch einen innerhalb ATP-Mangel im zerebralen Cortex, von Minuten der zu einer Funktionsstörung der Na+/K+-Pumpe führt (Berger und Garnier, 1999, Blomgren et al., 2007). Folge sind eine erhöhte extrazelluläre KaliumKonzentration, ein gesteigerter Natrium-Einstrom und eine Depolarisierung der Zellmembran. Letztere hat wiederum einen zellulären Calcium-Einstrom aus den Mitochondrien über die neuronale Zellmembran zur Folge. Durch den erhöhten intrazellulären Ca++-Gehalt werden sowohl die Aktivierung von Endonukleasen, Freisetzung Proteasen, von freien Lipasen, Radikalen, Phospholipasen mitochondriale als auch Dysfunktion die und Ödembildung stimuliert (Berger und Garnier, 1999). Diese Faktoren können direkt durch ihre toxische Wirkung, wie z.B. NO und freie Radikale, oder indirekt über Mikrogliazellen sekundäre Inflammation, z.B. über die Induktion von mit folglicher Produktion neurotoxischer Faktoren wie 13 exzitatorische Aminosäuren, den nekrotischen Zelltod hervorrufen (Blomgren et al., 2007). Die morphologischen Merkmale der Nekrose sind (Liu et al., 2004): • Schwellung oder Schrumpfung der betroffenen Zelle • Destruktion der Zellmembran • Freisetzung des Zytosols und der Organellen • Sekundäre Inflammation 1.1.4.2.3. Apoptose Die Apoptose entspricht einem programmierten Zelltod und spielt sowohl für viele physiologische als auch für pathophysiologische Vorgänge eine wichtige Rolle. Sie wird transkriptionell über pro- und anti-apoptotische Gene reguliert (Banasiak et al., 1998). Der apoptotische Vorgang wird über mehrere unterschiedliche Mechanismen induziert. Dazu zählen Zell- bzw. DNASchädigung, Anstieg der intrazellulären Ca++-Konzentration, Mangel an Wachstumsfaktoren sowie Einfluss bestimmter Zytokine und vieler weiterer Faktoren, wie z.B. UV-, Gammastrahlen und Chemotherapeutika. Typischerweise unterscheidet man zwischen einem intrinsischen und einem extrinsischen System. Der klassische intrinsische Apoptoseweg führt über eine Depolarisierung der Zellmembran zu einer Ausschüttung von pro-apoptotischen Faktoren, wie Cytochrom C, aus den Mitochondrien ins Zytoplasma. Dieses bindet dort an bestimmte Proteine wie dem Apoptose-Proteasen-aktivierenden Faktor (APAF-1) und bildet so den Apoptosom-Komplex, durch den die Initiatorcaspase-9 und folglich mehrere Effektor-Caspasen aktiviert werden (Kumar, 2007, Höffeler, 2004). Dadurch werden Endonukleasen induziert, welche die genomische DNA in DNA-Oligomere fragmentieren. Zusätzlich werden Apoptosefaktoren freigesetzt, die ohne Interaktion mit Caspasen zur direkten Zerstörung der DNA führen. Die entstehenden Zellfragmente werden 14 innerhalb der Zellmembran durch Phagozytose eliminiert, ohne eine sekundäre Inflammation zu verursachen. Die Apoptose kann ebenso über den extrinsischen Weg mittels spezieller Zelltodrezeptoren ausgelöst werden. Dabei binden spezifische Liganden wie der Fas-Ligand an den Rezeptor, der unter anderem zur Familie der Tumornekrosefaktoren (TNF) zählt. Demzufolge kommt es zu einer Formation des Zelltod-induzierenden Proteinkomplexes (DISC), der die InitiatorCaspase-8 und kaskadenartig auch die Caspase-3 aktiviert (Kumar, 2007), die proteolytisch wirkt (Liu et al., 2004). Dadurch wird das Zellgerüst direkt zerstört, wobei die Zellmembran jedoch intakt bleibt. Zum anderen werden inhibierende Proteine der Endonuklease inaktiviert, was zur Fragmentierung der DNA führt. Die morphologischen Merkmale der Apoptose sind (Liu et al., 2004): • Schrumpfung der betroffenen Zelle • Kondensation des Chromatins • Aggregation des Chromatins an der Zellkernperipherie • Aufspaltung des genetischen Materials durch Endonukleasen • intakte Zellmembran im Anfangsstadium • Bläschen-Formation (Blebbing) der Zellmembran im späteren Stadium • Abschnürung von membranumgrenzter Vesikel (apoptotic bodies), die Zellmembranbestandteile und DNA-Fragmente enthalten • Phagozytose der Vesikel durch Makrophagen 15 Zerebrale Ischämie Schwellung, Lyse DNAFragmentierung Nekrose Nekrose Apoptose Zelltod Abbildung 1: Nekrose und Apoptose als Folge zerebraler Ischämie (Chan, 2001). 1.1.5. Experimentelle neuroprotektive Therapieansätze bei der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns Im Falle einer zerebralen Hypoxie gibt es derzeit keine wirksame spezifisch neuroprotektive Behandlung. Neugeborene mit perinataler Hypoxie können bislang nur mit supportiven Maßnahmen therapiert werden (Rutherford et al., 2005). Dies umfasst den Ausgleich einer metabolischen Azidose, die Stabilisierung des Wasserhaushaltes, die Aufrechterhaltung einer ausreichenden Ventilation, die Gewährleistung einer suffizienten Gehirn- und Organperfusion und die Unterbindung von Krampfanfällen. Die Effektivität einer Behandlung nach einem hypoxisch-ischämischen Ereignis ist zeitlich sehr begrenzt (Rutherford et al., 2005), da die Schädigungsmechanismen bereits nach wenigen Stunden induziert werden. Daher ist es wichtig, die Therapie so früh wie möglich einzuleiten. Bestimmte Therapieansätze wirken der durch ein hypoxisches Ereignis ausgelösten Kaskade entgegen, um 16 dadurch das noch vulnerable Gehirn vor den neurotoxischen Effekten zu schützen und einer zerebralen Schädigung vorzubeugen. Dabei soll die Zellmembran stabilisiert, die Überstimulation der Glutamatrezeptoren und der intrazelluläre Calciumanstieg reduziert, die mitochondrialen Dysfunktion verhindert sowie die Bildung von neurotoxischen und anderen schädigenden Faktoren unterdrückt werden (Rees et al., 1998). Eine Studie von Lin et al. (2004) an neonatalen Ratten (P6, P9) mit zerebraler Ischämie beschreibt, dass zum Beispiel der Radikalfänger alpha-Phenyl-Ntert-Butyl-Nitron (PBN) diese Wirkungen aufweist und bei Gabe während eines hypoxischen Ereignisses das Infarktvolumen reduziert und somit neuroprotektiv wirkt. Es zeigte sich in in vitro Studien an neuronalen Zellkulturen (Pringle et al., 1996) und in in vivo Modellen an Ratten (Valentino et al., 1993), dass auch Calciumkanalblocker in hohen Dosen unter Hypoxie neuroprotektive Effekte bewirken. In neuroprotektiven Dosen weisen sie jedoch ein zu hohes Nebenwirkungspotential auf, wie schwere systemische Hypotension (Rees et al., 1998), so dass der klinische Einsatz nicht möglich ist. NMDA-Antagonisten zeigten in tierexperimentellen Studien an 12-24 Monate alten Ratten einen potentiell protektiven Effekt (Ikonomidou et al., 1999, Ikonomidou, et al., 2000). Allerdings schließen die neurotoxischen Nebenwirkungen einen potentiell zukünftigen Einsatz in der Klinik aus. Experimentelle Neuroprotektion durch Inhibitoren der Stickstoffmonoxid (NO)Synthasen ist umstritten. NO ist einerseits neurotoxisch, andererseits in niedrigen Konzentrationen aber auch wichtig für die vaskuläre Adaptation (Vasodilatation) unter Hypoxie und Hypoperfusion (van den Tweel et al., 2005). Eine weitere derzeit aktuelle Möglichkeit, hypoxische zerebrale Schädigung zu begrenzen ist die therapeutische Hypothermie. Mehrere klinische Studien bei Neonaten mit HIE (Debillon et al., 2003, Rutherford et al., 2005) lassen auf mögliche neuroprotektive Effekte sowohl der selektiven Temperaturabsenkung des Kopfes als auch des gesamten Körpers schließen. 17 Dennoch muss das Anwendungsprofil in der Klinik anhand kontrollierter Studien weiter verifiziert werden (Debillon et al., 2003, Rutherford et al., 2005). Die Kombination von PBN und moderater Hypothermie zeigte im Tierexperiment einen signifikanten neuroprotektiven Effekt (Hobbs et al., 2008). Dies bietet eine weitere mögliche Behandlungsmethode bei perinataler HIE. Für alle genannten experimentellen Therapieansätze ist der Einsatz in der Klinik nicht etabliert. Weitere Studien sind erforderlich, um den geeigneten Zeitpunkt für eine therapeutische Intervention nach einem hypoxisch/ischämischen Ereignis, die Dosierung sowie die Dauer der Therapie zu optimieren. 1.2. Endogene Adaptations-Mechanismen bei der perinatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung des Gehirns Durch perinatale Hypoxie des Gehirns werden nicht nur schädigende Mechanismen, sondern auch endogene Protektionskaskaden aktiviert, die die Sauerstoffversorgung des ZNS unterstützen. Diese Mechanismen können unmittelbar nach einem hypoxischen Ereignis oder mit zeitlicher Verzögerung einsetzten (Banasiak et al., 1998, Liu et al., 2004). Eine zentrale Rolle in der Regulation der adaptiven Zellantworten ist die Aktivierung von Genen, deren Transkription durch Hypoxie stimuliert wird. Dazu zählen parakrine Wachstumsfaktoren, sowie metabolische und vasoaktive Systeme (Greijer et al., 2005, Warnecke et al., 2004). Die zelluläre und regionale Empfindlichkeit gegenüber Hypoxie und den Protektionsfaktoren altersspezifischen Entwicklungsstadium des Gehirns hängt dabei vom ab (Curristin et al., 2002). 1.2.1. HIF-Mechanismus Die wichtigste Rolle unter den endogenen zellulären und molekularen Protektionsmechanismen gegenüber zerebraler Hypoxie spielt der Hypoxieinduzierbare Faktor HIF. Dieser reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression einer Vielzahl von vasoaktiven Genen, Wachstumsfaktoren und 18 Genen der Angiogenese, Erythropoese, Glykolyse und Eisenstoffwechsels, um dadurch die Sauerstoffversorgung des der Zelle zu verbessern (Greijer et al., 2005). Folgend einige Beispiele HIF-regulierter Gene: • Erythropoietin (EPO) (Warnecke et al., 2004) • Glykolytische Aldolase-A, Phosphofruktokinase-L, Enolase-1, Pyruvatkinase-M, Lactat-Dehydrogenase-A, Phosphoglyceratkinase-1 (Greijer et al., 2005) • Glucose-Transporter-1 (GLUT-1) (Zagórska und Dulak, 2004) • Eisen-Transportprotein Transferrin (Zagórska und Dulak, 2004) • Vasokonstriktorisches Endothelin-1 (Zagórska und Dulak, 2004) • Adrenomedullin (ADM) (Zagórska und Dulak, 2004) • vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) (Forsythe et al., 1996) • Induzierbare NO-Synthase (iNOS) (Semenza, 2002) Der HIF-Komplex besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit. HIF-1α ist von den bekannten Isoformen der HIFα-Untereinheit am besten charakterisiert. Bisher wurden noch zwei weitere Isoformen entdeckt, die als HIF-2α und HIF3α bezeichnet wurden und strukturell eine hohe Ähnlichkeit mit HIF-1α aufweisen. HIF-2α ist auch als endothelial-PAS domaine-Protein-1 (EPAS-1), HIF-like-factor (HLF) oder HIF-related-factor (HRF) bekannt und wird überwiegend in Endothelzellen in Herz, Lunge, Leber, Niere, Plazenta und Tumorzellen gebildet. Es wird angenommen, dass HIF-2α eine führende Rolle in der Angio- und Vaskulogenese spielt (Warnecke et al., 2004, Wiesener et al., 2001). HIF-3α fungiert als hemmendes Protein der PAS-Domänen (IPAS) und somit als Antagonist des HIF-Systems. Alle drei HIFα-Isoformen sind in ihrer Stabilität sauerstoffabhängig und bilden unter Hypoxie einen Komplex mit HIF-1β (Fandrey et al., 2006, Warnecke et al., 2004). Im hypoxischen Gehirn wird HIF-1α hauptsächlich in Neuronen, Astrozyten und Ependym- 19 Zellen, HIF-2α in Glia- und kapillären Endothelzellen und HIF-3α in PurkinjeZellen des Kleinhirns produziert (Stroka et al., 2001, Wiesener et al., 2001). HIF-1α hat ein molekulares Gewicht von 120 kD und bildet zusammen mit HIF-1β (91-94 kD), auch als aryl-hydrocarbon-receptor-nuclear-translocator (ARNT) bekannt, das Heterodimer HIF-1. Die Amino-Enden beider Untereinheiten bestehen aus einer basischen Helix-Loop-Helix-Struktur (bHLH) mit Per-Arnt-Sim (PAS)-Domänen (Aminosäurensequenzen, in denen die Proteine PER, ARNT und SIM vorkommen), welche die Heterodimerisierung und die Bindung an die DNA regulieren (Semenza, 2004). Das Carboxy-Ende Transaktivierungsdomänen der HIF-1α Untereinheit (TAD) TAD-N und TAD-C weist zwei mit den Aminosäuresequenzen 531-575 respektive 786-826 auf, die durch eine inhibitorische Domäne (ID) getrennt werden (Abb. 2) (Charlier et al., 2002). Sie sind für die Interaktion mit Koaktivatoren wie zum Beispiel dem CREBbinding-protein (CBP) und p300 zuständig. Die sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (ODD) im Carboxy-Terminus der HIF-1α-Untereinheit überlappt mit einer TAD und teilweise mit der ID und liegt innerhalb der Aminosäurensequenz 401 bis 603 von HIF-1α. Abbildung 2: Struktur von HIF-1α (Charlier et al., 2002). HIF-1α und HIF-1β werden ubiquitär und kontinuierlich gebildet. Im Gegensatz zu HIF-1β, ist die HIF-1α-Stabilität sauerstoffabhängig (Stroka et al., 2001). Unter Normoxie wird HIF-1α durch spezifische Prolyl-Hydroxylasen hydroxyliert, wodurch das von Hippel-Lindau (VHL)-Protein an die ODD binden kann (Fandrey et al., 2006, Semenza, 2004). Die Bindung des VHLProteins über seine β-Domäne an den Aminosäureabschnitt 532-585 von HIF1α bewirkt eine Ubiquitinierung von HIF-1α (Semenza, 2004). Dies hat eine 20 Aktivierung des 26S-Proteasoms zur Folge (Abb. 3), welches HIF-1α unter Sauerstoff- und Fe++-Verbrauch degradiert (Fandrey et al., 2006). Zusätzlich schützt eine sauerstoffabhängige Asparagin-Hydroxylierung durch den HIF-1inhibierenden Faktor (FIH-1) vor einer Interaktion mit den transkriptionellen Koaktivatoren CBP und p300. Unter Hypoxie ist die Hydroxylierung der HIF-1α-Untereinheit blockiert, wodurch der Abbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System gehemmt und HIF-1α-Protein stabilisiert wird (Fandrey et al., 2006, Semenza, 2004). Stabilisiertes HIF-1α transloziert in den Nukleus, dimerisiert mit der HIF-1βUntereinheit und bildet so den HIF-1-Komplex. Dieser HIF-1-Komplex bindet mit Hilfe der Koaktivatoren CBP und p300 an hypoxia-responsive-element (HRE)-Sequenzen in der Promotorregion spezifischer Zielgene (Abb. 3) und setzt damit die Transkription der Zielgene in Gang (Greijer et al., 2005, Warnecke et al., 2004). Abbildung 3: HIF-1α als Sauerstoff-Sensor (Fandrey et al., 2006). 21 1.2.2. Zerebrale Regulation der HIF-abhängigen vasoaktiven Faktoren VEGF und iNOS Zu den HIF-abhängigen Zielgenen gehören unter vielen anderen der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) und die induzierbare NOSynthase (iNOS), die in die Gefäßregulation involviert sind. Die frühe Angiogenese ist ein kontinuierlicher Prozess, der für die normale Entwicklung des Gehirns entscheidend ist. Wichtig dabei sind vor allem die Stabilisierung bereits existierender Gefäße (Angiogenese), sowie die Gefäßneubildung (Vaskulogenese) (Neufeld et al., 1999). Während der Gehirnentwicklung bilden sich die Gefäße erst in der grauen Substanz und anschließend in der weißen Substanz aus. Bei zerebraler Hypoxie sind vor allem die Hirnregionen betroffen, in denen die Vaskulogenese noch nicht abgeschlossen ist (Nelson et al., 1991, Milligran, 1980). Als regenerativer Prozess unter Hypoxie sind die reaktive Vaskulogenese und die gesteigerte Gefäßpermeabilität (Schoch et al., 2002) bedeutsam, um die zerebrale Durchblutung und Sauerstoffversorgung aufrecht zu erhalten. In dieser Situation gilt VEGF als einer der wichtigsten Regulatoren (Kaur et al., 2006, Neufeld et al., 1999, Ogunshola et al., 2000, Schoch et al., 2002). VEGF ist ein Heparin-bindendes, Cystein-haltiges Homodimer mit einem molekularen Gewicht von 45 kD. Die beiden Monomere sind über DisulfidBrücken miteinander verbunden. Das basische Glykoprotein wird sezerniert und ist zu zweidrittel an die Zelloberfläche und extrazelluläre Matrix gebunden. Das humane VEGF-Gen besteht aus acht Exons, die durch sieben Introns voneinander abgegrenzt sind, und liegt auf dem Chromosom 6p21.3. Bisher konnten 5 Isoformen differenziert werden, die sich in ihrem Molekulargewicht und biologischen Merkmalen (z.B. der Fähigkeit, Heparin zu binden) unterscheiden, wobei VEGF165 die vorherrschende Form im menschlichen Organismus darstellt (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). Unter Hypoxie bindet der HIF-Komplex an die entsprechende Promotorregion (HRE-Sequenz) im VEGF-Gen und steigert die Transkription, wodurch VEGFmRNA und -Protein vermehrt gebildet wird (Forsythe et al., 1996). Neben der 22 Bindungsstelle für HIF wurden auf dem VEGF-Gen noch weitere Promotordomänen für andere Hypoxie-abhängige Transkriptionsfaktoren wie AP-1, Sp-1, NF-κB und CREB identifiziert (Pagès und Pouysségur, 2005). Die VEGF-Produktion wird sowohl durch Hxpoxie als auch durch eine Vielzahl von inflammatorischen Zytokinen (z.B. TNF-α, IL-1α, IL-6, IGF-1, PGE 2), Wachstumsfaktoren (z.B. TGF-β, FGF, PDGF), Hormonen (z.B. TSH, ACTH, Gonadotropin) und aktivierten Onkogenen induziert (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). Hypoxie bewirkt jedoch nicht nur eine Steigerung der VEGF mRNA Expression, sondern auch eine erhöhte Stabilisierung. Dies geschieht durch die Bindung bestimmter Proteine an eine Sequenz in der nicht-translatierten Region im 3`-Terminus (UTR) der VEGF mRNA. Eines dieser Proteine wurde als humanes Antigen R (HuR) identifiziert, welches an Adenin- und Uridinreiche mRNA-Abschnitte bindet und sie stabilisiert. Die Mehrheit dieser Proteine ist allerdings noch unbekannt. VEGF wirkt vor allem über zwei bestimmte Rezeptoren mit hoher Affinität: den VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1), auch bekannt als fms-like tyrosine kinaseRezeptor (Flt-1), und den VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR-2) bzw. fetal liver kinase-Rezeptor (Flk-1) oder kinase domaine region-Rezeptor (KDR). Beide Rezeptoren, vor allem VEGFR-2, spielen eine Rolle in der Differenzierung und Neuformation von Endothelzellen zu Gefäßen und werden fast ausschließlich in diesen, aber auch in Astrozyten (VEGFR-1) gebildet (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). VEGFR-2 reguliert zusätzlich die mikrovaskuläre Permeabilität, Chemotaxis und anti-apoptotische Proteine und vermittelt damit zytoprotektive Funktionen (Gerber et al., 1998, Neufeld et al., 1999). VEGFR1 und VEGFR-2 gehören der Tyrosinkinase-Rezeptoren-Familie an und sind durch ihre zytoplasmatische zweigeteilte Tyrosinkinase-Domäne und durch sieben Immunglobulin-ähnliche Domänen in ihrem extrazellulärem Abschnitt gekennzeichnet (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). Sobald VEGF an seine Rezeptordomäne (der zweiten und dritten Immunglobulin-ähnlichen Region) bindet, dimerisieren zwei Rezeptoren (an der vierten Immunglobulin-ähnlichen 23 Stelle) und es findet eine Autophosphorylierung der Tyrosinregion des Rezeptors statt (Ferrara, 2004, Zachary, 2003). Daraufhin werden unter anderem bestimmte Enzyme wie die Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3Kinase) (Gerber et al., 1998, Ogunshola et al., 2002) oder die Phospholipase C-γ (PLC-γ) mittels Tyrosin-Phosphorylierung aktiviert. Diese Enzyme phosphorylieren ihrerseits verschiedene intrazelluläre Proteine, die somit aktiviert werden und die Gefäßneubildung stimulieren (Abb. 4). Die Expression dieser Rezeptoren wird sowohl durch Hypoxie als auch durch VEGF selbst induziert (Ferrara, 2004, Zachary, 2003). Vaskulärer Tonus, Permeabilität, Angiogenese Migration, Überleben Migration Überleben Gen-Expression DNA-Synthese Abbildung 4: VEGF-Regulationspfad (Zachary, 2003). 24 Die fundamentale Bedeutung von VEGF für die Angiogenese während der frühen Entwicklung zeigten mehrere tierexperimentelle Studien (Ferrara et al., 1996, Carmeliet et al., 1996, Fong et al., 1995). Mäuse mit homozygoter Deletion des VEGF- bzw. VEGFR-2-Gens/Knock-out-Mäuse verstarben in utero bereits am 8.-10. Gestationstag (Fong et al., 1995). Mit Verlust nur eines VEGF-Allels wiesen Mäuse eine embryonale Letalität am 11.-12. Entwicklungstag auf (Ferrara et al., 1996, Carmeliet et al., 1996). Bei Mutationen des VEGFR-1-Gens oder nach Verabreichung eines VEGF neutralisierenden Mortalitätsrate, Rezeptors zeigten Wachstumsretardierung, fetale Mäuse gestörte eine erhöhte Organentwicklung, Gefäßanomalien und gesteigerte Apoptoseaktivität in Endothelzellen von Herz, Leber und Niere (Gerber et al., 1999). Bei lokaler Applikation von VEGF auf periphere Nervenfasern, zeigte VEGF in einer in vitro Arbeit an Zellkulturen neurotrophe Effekte, indem es die Schwannzellproliferation und die Neovaskularisation förderte (Sondell et al., 1999). Im zentralen Nervensystem wurde in einer in vivo Studie an hypoxischen neonatalen Ratten (P1) die Neuanlage und Ausreifung zerebraler Gefäße mittels VEGF über Astrozyten reguliert (Kaur et al., 2006). In dem Tiermodell von Kaur et al. (2006) wurden P1-Ratten für zwei Stunden in einer hypobaren Hypoxiekammer (Luftdruck 350mmHg, pO2 73mmHg) inkubiert und die Gehirne nach 3 und 24 Stunden, 3, 7 und 14 Tagen untersucht. Es zeigte sich eine aktivierte Expression der mRNA von VEGF, HIF-1, eNos, iNOS und nNOS. Die Proteinkonzentrationen von VEGF und NO lagen in den 7 bzw. 14 Tage alten Ratten wesentlich höher als in den unreiferen Stadien. Unter Hypoxie nimmt in Tiermodellen an Mäusen die gliale VEGF-Produktion innerhalb von Minuten bis Stunden zu und hält während der gesamten Reoxygenierungsphase über Tage an (Jin et al., 2000, Kaur et al., 2006). Dies führt zu einem Anstieg der Angiogenese (Ogunshola et al., 2000) und einer erhöhten Gefäßpermeabiltität (Schoch et al., 2002). Es konnte zudem in vivo und in vitro gezeigt werden, dass die VEGF-Produktion unter Hypoxie auch in Neuronen vor allem in den Regionen des Cortex und Hippocampus gesteigert ist (Jin et al., 2000, Ogunshola et al., 2000, Ogunshola et al., 2002). Dies gilt 25 sowohl für das reife, insbesondere aber für das sich entwickelnde Gehirn, wobei im adulten Hirn die gliale und im unreifen Gehirn die neuronale Expression überwiegt (Kaur et al., 2006, Ogunshola et al., 2000). In einem Tiermodell von Trollmann et al. (2008) für prä- und perinatale Hypoxie an Mäusen konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass die mRNA-Expression von VEGF insbesondere im neonatalen Gehirn gesteigert wird. Es wurden schwangere Mäuse (P20) für 6 Stunden unter 6% O2 inkubiert und anschließend die Plazenten und neonatalen Gehirne untersucht. Es zeigte sich ein zerebraler und plazentarer Anstieg der Proteinkonzentration von HIF. Ebenso konnte eine vermehrte mRNA-Konzentration in den neonatalen Gehirnen und den Plazenten festgestellt werden. VEGF ist nicht nur in die physiologische und protektive Vaskulo- und Angiogenese (Kaur et al., 2006, Neufeld et al., 1999, Ogunshola et al., 2000, Schoch et al., 2002) involviert. Es konnte auch in pathologischen Prozessen, die mit Gefäßneubildung einhergehen, wie zum Beispiel Tumorwachstum, rheumatoide Arthritis, Psoriasis und diabetische Retinopathie, nachgewiesen werden (Borgström et al., 1996, Koch et al., 1994, Okamoto et al., 1997). Eine vermehrte VEGF- und VEGFR-Expression ist ebenso bei malignen hämatologischen Erkrankungen wie Leukämien und Lymphomen bedeutsam (Ferrara, 2004). Aufgrund dieser Erkenntnisse hat VEGF auch als experimenteller Therapieansatz einen hohen Stellenwert (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). Zum einen fungiert VEGF möglicherweise als neuronaler Protektionsfaktor, da tierexperimentell bei zerebraler Ischämie eine gesteigerte VEGF-Produktion das Infarktgebiet verringert hat (Jin et al., 2000). Diese Hypothese wird durch eine Arbeit von pharmakologischer Apoptoserate Ogunshola et Inhibition von auffiel. Als al. konträrer (2002) VEGF bestärkt, eine in gesteigerte therapeutischer Ansatz der nach zerebrale wird die Anwendung eines VEGF-Antikörpers bei onkologischen Erkrankungen (Yuan, et al., 1996) und bei akutem Hirnödem (Ferrara, 2004) diskutiert. 26 In vivo Studien an Mäusen zeigten, dass unter Hypoxie die VEGF-Produktion in Relation zu den Konzentrationen der endothelialen und induzierbaren NOSynthasen steht (Kaur et al., 2006) als Hinweis auf einen möglichen Synergismus zwischen VEGF und NO (Kaur et al., 2006, Neufeld et al., 1999). In einem Tiermodell bei neonatalen Ratten mit Ligatur der rechten A. carotis und anschließender hypoxischer Exposition (8% O2) stieg unter akuter Ischämie und während der frühen Reperfusionsphase die zerebrale NOProduktion im Gehirn mit einer Latenz von 12-48 Stunden an (GonzalezBarrios et al., 2002, van den Tweel et al., 2005). Stickstoffmonoxid (NO) als Mediator und Effektor des Endothels relaxiert die glatte Gefäßmuskulatur, limitiert die Proliferation dieser Zellen, inhibiert die inflammatorisch aktivierten Endothelzellen und reduziert die Expression von Adhäsionsmolekülen für Lympho-, Mono- und neutrophile Granulozyten (Iadecola, C., 1997, Moro et al., 2004). Die Aggregationsneigung der Thrombozyten wird gesenkt (Iadecola, C., 1997, Moro et al., 2004). Somit kann NO in physiologischen Konzentrationen einen positiven Effekt auf die zerebrale Durchblutung bewirken. In neuronalen Zellen wirkt NO auch als Neurotransmitter, hauptsächlich über den NMDA-Rezeptor (Bolaños et al., 1999). Infolgedessen kann angenommen werden, dass NO in die Synaptogenese involviert ist (Bolaños et al., 1999). Neben diesen protektiven Effekten kann NO aber auch neurotoxisch wirken. Dies zeigten tierexperimentelle Studien an Ratten (P12) (van den Tweel et al., 2002) bzw. neonatalen Mäusen (Iadecola et al., 1996), die durch Inhibition von iNOS und nNOS unter systemischer Hypoxie/Ischämie (Ligatur der rechten A. carotis mit anschließender Inkubation bei 8% O2) eine langfristige Neuroprotektion zeigten (Iadecola et al., 1996, van den Tweel et al., 2002). Es sind drei verschiedene NO-Synthasen (NOS) charakterisiert (Iadecola, C., 1997): die induzierbare NOS (iNOS), welche hauptsächlich in Makrophagen, Mikrogliazellen, Neuronen und Astrozyten produziert wird (Moro et al., 2004, Nathan et al., 1994), die endotheliale NOS (eNOS), die überwiegend in Endothelzellen (Nathan et al., 1994) vorkommt und die neuronale NOS 27 (nNOS), die in zentralen und peripheren Nervenzellen gebildet wird (Nathan et al., 1994). Allen drei Formen sind das Substrat L-Arginin und die Produkte NO und Citrullin gemein (Knowles et al., 1989). Die NOS bestehen aus zwei identischen Monomeren, die in eine C-terminale Reduktase-Domäne und eine N-terminale Oxygenase-Domäne aufgeteilt werden können und über Disulfid-Brücken bzw. Zink-Ionen miteinender verbunden sind. Zwischen diesen beiden Regionen liegt die CalmodulinDomäne, die ausschlaggebend für die Struktur und Funktion des Enzyms ist. Das Carboxyl-Ende enthält Bindungsstellen für Kofaktoren wie FAD, FMN und NADPH und das Amino-Ende Bindungsstellen für L-Arginin, Häm und BH4. Die Bindung dieser Faktoren an die NOS bewirkt eine Stabilisierung der aktiven Dimer-Formation (Alderton et al., 2001, Nathan et al., 1994). Insbesondere die iNOS hat eine wichtige Rolle sowohl in der unspezifischen Immunabwehr als auch in der Pathogenese des Zelltodes nach einer zerebralen Hypoxie (van den Tweel et al., 2002). Die iNOS-Aktivität und Produktion wird neben Hypoxie zudem auch durch inflammatorische Faktoren wie LPS, TNF-α, IF-γ und IRF-1 stimuliert (Bolaños et al., 1999). Im Gegensatz zur nNOS und eNOS wird iNOS HIF-1-abhängig exprimiert (Semenza, 2002, Moro et al., 2004). Induzierbare NOS liegt stets an Calmodulin gebunden vor (Alderton et al., 2001), daher ist ihre Aktivität calciumunabhängig und hält über Tage an. Die hierdurch erreichbare intrazelluläre NO-Konzentration kann zytotoxisch wirken und Zelltod und Gewebsschädigung zur Folge haben (Bolaños et al., 1999, Iadecola, C., 1997). Als Mechanismus der Schädigung sind die Bindung an eisenhaltige Enzyme, DNA-Desaminierung und Induktion von Zytokinen bekannt (Iadecola, C., 1997). Außerdem wirkt NO über die Bildung von Peroxiden zytotoxisch, indem es toxisches Nitrotyrosin bildet und die DNA zerstört (Bolaños et al., 1999). Zusätzlich erhöht NO intrazelluläre Cytochrom C-Konzentrationen und aktiviert somit über die Caspase-Kaskade die zelluläre Apoptose (Cheng et al., 2001). 28 1.2.3. Zerebrale Regulation der HIF-unabhängigen Faktoren nNOS, eNOS und Caspase-3 Anders als die iNOS werden endotheliale NO-Synthase (eNOS) und neuronale NO-Synthase (nNOS) konstitutiv im Gehirn exprimiert (Nathan et al., 1994, Knowels et al., 1989) und produzieren in Endothelzellen auch unter Normoxie niedrige Konzentrationen von NO. Ihre Aktivität ist calciumabhängig (Knowles et al., 1989). Durch eine erhöhte intrazelluläre Calcium- Konzentration, z.B. infolge von Hypoxie, wird die Bildung eines CalciumCalmodulin-Komplexes gefördert, der an der entsprechenden Domäne des nNOS- bzw. eNOS-Proteins bindet und das Enzym aktiviert (Gonzalez-Barrios et al., 2002). Diese Effekte treten innerhalb von Minuten nach einem hypoxischen Insult auf, wobei die Aktivierung von eNOS zeitlich früher als die der iNOS einsetzt. Daraus resultiert ein rascher Anstieg der NO-Produktion, die sistiert, sobald der Calciumspiegel wieder abfällt (Moro et al., 2004, Nathan et al., 1994). Neben Calmodulin wird die Aktivität von nNOS und eNOS auch durch Phosphorylierung, NOS-inhibierendes Protein (PIN) und Hitzeschockprotein 90 (HSP 90) reguliert (Alderton et al., 2001). Es wird angenommen, dass neuronales NO in hohen Konzentrationen durch Überstimulation des NMDA-Rezeptors die Glutamat-Exzitotoxizität fördert und über die Bildung von Peroxynitrit toxisch wirkt (Bolaños et al., 1999, Iadecola, C., 1997, Moro et al., 2004). Im Gegensatz dazu gilt der unmittelbare NOAnstieg nach zerebraler Hypoxie durch eNOS als neuroprotektiv, da durch die resultierende Vasodilatation und Hemmung der mikrovaskulären Aggregation bzw. Adhäsion die Perfusion des Gehirns aufrecht erhalten bleibt und dadurch die Neuronen geschützt werden (Bolaños et al., 1999, Iadecola, C., 1997, Moro et al., 2004). Tierexperimentell (Gonzalez-Barrios et al., 2002, van den Tweel et al., 2005) konnte gezeigt werden, dass die nNOS ebenso wie die iNOS in die zerebrale Schädigung nach einem hypoxischen Ereignis involviert sind. Experimente an fetalen Mäusegehirnen (P7) zeigten, dass auch nNOS unter Hypoxie vor allem in vulnerablen Hirnregionen vermehrt aktiviert wird (Gonzalez-Barrios et 29 al., 2002, Muramatsu et al., 2000). Neugeborene Ratten mit perinataler Ischämie, denen Inhibitoren der nNOS und iNOS einzeln oder kombiniert verabreicht wurden, zeigten eine geringere Infarktgröße als nicht-behandelte Tiere (van den Tweel et al., 2002, Iadecola et al., 1996). Gleichermaßen wiesen hypoxische neonatale nNOS-knock-out-Mäuse eine verminderte Schädigung der Neuronen im Cortex und Hippocampus auf (Ferriero et al., 1996). Somit sind protektive und zytotoxische Funktionen von NO und NOSynthasen in physiologischen und pathologischen Prozessen zu bedenken. Ob NO neurotoxisch oder neuroprotektiv wirkt, hängt vom Zelltyp (neuronal, glial oder endothelial) und von seiner Konzentration ab, die wiederum von der Dauer und Schwere der Hypoxie beeinflusst wird (Bolaños et al., 1999, Iadecola, 1997). Ein weiterer wichtiger Faktor der neuronalen Schädigung nach perinataler Hypoxie ist das Enzym Caspase-3, ein Mediator und Initiator von apoptotischen Mechanismen (Blomgren et al., 2007, Liu et al., 2004). Caspase-3 gehört zur Familie der Cystein-Aspartat-spezifischen Proteasen (Caspasen). Bislang gibt es 14 Isoformen des Enzyms. Die Caspasen liegen in den Zellen als inaktive Proenzyme (Procaspasen) vor und werden durch Proteolyse in eine große und kleine Untereinheit zerlegt, die durch Dimerisierung in ihre aktive Tetramer-Form transformieren (Kumar, 2007, Höffeler, 2004). Sie aktivieren dann wiederum weitere Procaspasen, deren Substrate Enzyme sind, die zum kontrollierten Abbau zellulärer Strukturen wie DNA, Proteine und Signalmoleküle führen. Aufgrund unterschiedlicher Funktionen lässt sich die Familie der Caspasen in zwei Hauptgruppen einteilen (Kumar, 2007, Höffeler, 2004). Zum einen in die Initiatorcaspasen, zu denen die Isoformen Caspase-2, -8, -9, -10 gehören und die direkt in Folge des initialen proapoptotischen Signals aktiviert werden. Zum anderen in die Effektor-Caspasen, zu denen Caspase-3, -6, -7 zählen und die durch die Initiator-Caspasen aktiviert werden. Zusätzlich gibt es noch die inflammatorischen Caspasen (Caspase-1, -4, -5, -11). Die Aktivität der Initiator-Caspasen kann durch verschiedene apoptotische Mechanismen 30 ausgelöst werden (Kumar, 2007, Höffeler, 2004). Über die Bindung entsprechender Liganden wie z.B. Fas an spezifische Zelltodrezeptoren kommt es zu einer Formation des Zelltod-induzierenden Proteinkomplexes DISC. Dies führt zur Aktivierung der Initiatorcaspase-8 und kaskadenartig der Caspase-3 sowie weiterer Schlüsselenzyme der Apoptose (Kumar, 2007). Eine weitere Aktivierungsmöglichkeit ist eine vermehrte Cytochrom CFreisetzung aus den Mitochondrien. Daraus resultiert die Bildung des Apoptosoms, welches die Initiatorcaspase-9 und folglich mehrere EffektorCaspasen aktiviert (Kumar, 2007, Höffeler, 2004). Die dritte Möglichkeit der Caspasen-Aktivierung funktioniert mittels zytotoxischer Zellen, die Perforin und Granzym B als Effektoren benutzen, wodurch bestimmte Zielzellen permeabilisiert werden und die intrazelluläre Caspase-3 direkt über entsprechende Bindungsstellen aktiviert wird. Unabhängig vom auslösenden Mechanismus führt die Aktivierung von Effektor-Caspasen zum apoptotischen Zelltod. Caspase-3 als Haupteffektor hat dabei ein besonders breites Wirkungsspektrum. Sie wirkt direkt destruktiv, besitzt die Fähigkeit die Procaspase-9 zu aktivieren, wodurch eine positive Rückkoppelung entsteht, und beeinflusst die Teilungsrate bestimmter Immunzellen (Höffeler, 2004, Kumar, 2007). Die Caspase-3 gilt während der normalen Gehirnentwicklung als Schlüsselenzym für die physiologische Apoptose. Anhand von Tiermodellen konnte gezeigt werden, dass die Expression der mRNA und die Aktivierung von Caspase-3 unter hypoxischen Bedingungen vor allem im unreifen Gehirn ca. 6-48 Stunden nach Hypoxie ansteigt (Blomgren et al., 2007, Liu et al., 2004). Dabei war in fast allen betroffenen Neuronen des Neocortex, Hippocampus und Thalamus eine Zunahme der Expression und Aktivierung von Caspase-3 nachweisbar. Dies zeigte sich ebenso in Astrozyten, nicht jedoch in Mikrogliazellen und Oligodendrozyten (Blomgren et al., 2007, Liu et al., 2004). Zusätzlich konnte eine Hochregulation der Caspasen-8 und -9 in Rattengehirnen nach exzitotoxischer Schädigung nachgewiesen werden (Villapol et al., 2007), die wiederum indirekt einen Anstieg der Caspase-3 bewirkt (Sharangpani et al., 2008, Shimizu et al. 2007). 31 Es wird angenommen, dass Caspasen neben der Induktion von Apoptose noch weitere Funktionen in Zellproliferation, Zellzyklus-Regulation, Zelldifferenzierung und Genexpression haben, die vom Zelltyp und der Umgebung abhängig sind (Shimizu et al. 2007, Villapol et al., 2007). 1.3. Levetiracetam Zerebrale Hypoxie zählt zu den häufigsten Ursachen einer perinatal erworbenen Schädigung des Gehirns. Spezifische neuroprotektive Behandlungsoptionen stehen derzeit nicht zur Verfügung (Rutherford et al., 2005). Problematisch ist, dass zahlreiche Pharmaka, wie z.B. der NMDAAntagonist MK-801, die einen potentiell protektiven Effekt in tierexperimentellen Studien durchaus zeigten, neurotoxische Nebenwirkungen aufwiesen, so dass deren klinischer Einsatz nicht in Frage kommen kann (Ikonomidou, et al., 1999, Ikonomidou et al., 1999, Ikonomidou, et al., 2000). Nach experimentellen Studien können insbesondere am unreifen, sich entwickelnden Gehirn Pharmaka-induzierte neurotoxische Effekte deletär sein mit langfristigen Folgen für die neuronale und gliale Reifung sowie Myelinisierung (Bittigau et al., 2002, Jensen, F., 2006). Obwohl die Datenlage über die neurotoxischen Risiken von Antiepileptika aus klinischen und experimentellen Untersuchungen nicht einheitlich ist, führten Berichte über eine Induktion der apoptotischen Neurodegeneration durch Antiepilepitka im unreifen Rattengehirn (Bittigau et al., 2002) zu kritischen Diskussionen über deren Einsatz in der Neonatologie. Die Experimente der Berliner Arbeitsgruppe Bittigau et al. (2002) zeigten, dass zahlreiche, in der Neonatologie routinemässig eingesetzte Antiepileptika wie Phenobarbital, Diazepam, Clonazepam oder Phenytoin, in klinisch relevanten Dosen zu einer signifikanten Erhöhung der Apoptoserate im Vorderhirn neonataler Ratten führen. Levetiracetam (LEV) ist ein Antikonvulsivum der neueren Generation, das tierexperimentell am Modell des Status epilepticus (Gibbs et al., 2006) oder am Strokemodel bei der adulten Ratte (Hanon et al., 2001, Löscher et al., 1998) neuroprotektive Eigenschaften zeigte. 32 Die Datenlage zu Effekten von LEV am unreifen Gehirn ist limitiert. Bisher gibt es nur eine tierexperimentelle Studie an Ratten im Alter von P0-P21 unter Normoxie, in der Manthey et al (2005) keine erhöhte Apoptoserate nach Verabreichung von Levetiracetam am Gehirn der neontalen Ratte fanden. Daten über die Effekte von LEV auf neurotrophe und vasoaktive Faktoren unter Hypoxie im unreifen Gehirn stehen bislang nicht zur Verfügung. 1.3.1. Pharmakologische Daten zu LEV Levetiracetam (S-α-ethyl-2-oxo-1-pyrrolidin-acetamid) (LEV) ist das S- Enantiomer von Piracetam. Das S-Enantiomer zeigt in Tiermodellen sowohl nach oraler, intraperitonealer als auch nach intra-ventrikulärer Applikation antiepileptische Eigenschaften, wohingegen das R-Enantiomer nur in sehr hohen Dosen schwach wirksam ist. Der Hauptmetabolit von LEV ist so wie die meisten seiner Metabolite primär inaktiv. Man nimmt an, dass LEV nur in seiner unveränderten Form wirksam ist (Klitgaard, 2001, Klitgaard et al., 2003). Im Vergleich zu anderen Antiepileptika treten nach der Gabe von LEV selten und nur nach hohen Dosen, die weit über der antiepileptischen Wirkdosis von LEV liegen, Nebenwirkungen auf (Klitgaard et al., 1998). In Tiermodellen an adulten Ratten wurden ab einer Dosis von 170mg/kg LEV nur geringe Verhaltensauffälligkeiten in Form einer leichten reversiblen Sedierung festgestellt (Gower et al., 1995, Klitgaard et al., 1998). In einer tierexperimentellen Arbeit von Löscher et al. (1993) an 11-12 Wochen alten Ratten zeigten sich Nebeneffekte von LEV wie Muskelrelaxation ab einer Dosis von 54mg/kg und milde Ataxie ab einer Dosis von über 500mg/kg. Interessanterweise berichteten mehrere Arbeitsgruppen (Gower et al., 1995, Löscher et al., 1993, Löscher et al., 1998) über eine leichte Hyperaktivität nach einer klinisch relevanten Dosis von LEV in Tiermodellen. Insgesamt konnte in Ratten und Mäusen eine gute Toleranz gegenüber LEV ohne gravierende neurologische Nebeneffekte bis zu einer Dosis von 1700mg/kg gezeigt werden (Löscher et al., 1993). 33 1.3.2. Wirkmechanismus von LEV Der genaue Wirkmechanismus von LEV ist bislang noch unbekannt. Es wirkt nicht über einen der Hauptmechanismen der gängigen Antiepileptika wie z.B. über den GABAA-Rezeptor, Glutamat-Rezeptoren oder spannungsabhängige Natrium- bzw. Calciumkanäle (Margineanu et al., 2000, Klitgaard et al., 2003). Es ist bekannt, dass LEV im Gehirn reversibel an einen Subtyp des synaptischen Vesikel-Proteins 2 (SV2A) bindet (Lynch et al., 2004), welches ubiquitär in der Plasmamembran von Neuronen vorkommt (Crowder et al., 1999). Der daraus resultierende Effekt, die genauen Funktionen und der molekulare Mechanismus von SV2A sind noch nicht geklärt. Es wird angenommen, dass LEV nur unter pathophysiologischen Bedingungen an SV2A bindet (Lynch et al., 2004). Die Tatsache, dass in Tierexperimenten Mäuse ohne das SV2A-Gen epileptische Anfälle entwickeln (Crowder et al., 1999), während LEV bekanntermaßen antiepileptische Effekte aufweist, impliziert, dass LEV nicht als Antagonist an SV2A wirkt. Man vermutet, dass SV2A elektrische Entladungen inhibiert, die im Rahmen eines epileptischen Anfalls durch synaptische Aktivierung induziert werden (Lynch et al., 2004, Kaminski et al., 2008). Möglicherweise verstärkt LEV durch seine Bindung an das Protein diese Funktion von SV2A. Eine weitere Möglichkeit ist die Interaktion von SV2A mit dem präsynaptischen Protein Synaptotagmin, das als Calciumsensor in der Regulation von caliumabhängiger Exzitotoxizität von synaptischen Vesikeln fungiert und durch SV2A und somit durch LEV beeinflusst wird (Pyle et al., 2000). Es werden noch andere Effekte von LEV diskutiert, wie zum Beispiel die partielle Hemmung von spannungsabhängigen Calciumkanälen vom N-Typ (high voltage aktiviert) und die Reduktion der durch Zink und β-Carbolin hervorgerufenen inhibierenden Wirkung von GABA und Glycin (Margineanu et al., 2000). Es ist jedoch unklar, ob diese Effekte durch SV2A oder über alternative Mechanismen reguliert werden. 34 1.3.3. Stand des Wissens zu neuroprotektiven Effekten von LEV im Tierexperiment an Ratten Viele herkömmliche antiepileptische Medikamente, die als Agonist an GABAARezeptoren, als NMDA-Rezeptor-Antagonisten oder über spannungsabhängige Natrium- oder Calciumkanäle wirken, können vor allem während der Gehirnentwicklung die apoptotische Neurodegeneration triggern und zu Langzeitschäden führen (Bittigau et al., 2002, Kim et al., 2007, Ikonomidou, et al., 1999). Folgen dieser Neurotoxizität sind Störungen der Synaptogense, der Neurotransmission und der Migration und Differenzierung neuronaler Zellen, die hauptsächlich im noch unreifen Gehirn stattfinden (Curristin et al., 2002). Diese Umstände limitieren den klinischen Einsatz ohne Folgeschäden vor allem in frühen Entwicklungsstadien. Levetiracetam (LEV), ein Antikonvulsivum der neueren Generation, zeigte in mehreren Tierexperimenten an Ratten verschiedener Arbeitsgruppen neuroprotektive Eigenschaften (Manthey et al., 2005, Kim et al., 2007, Gibbs et al., 2006, Gibbs et al., 2007, Hanon et al., 2001). Anhand eines Tiermodells an Ratten in verschiedenen Entwicklungsstadien (P0, P3, P7, P14 und P21), die mit einer humanen Entwicklungsphase vom letzten Trimenon bis Ende des zweiten Lebensjahres vergleichbar sind (Dobbing und Sands, 1979), konnte gezeigt werden, dass LEV unter Normoxie keine erhöhte Apoptoserate in vulnerablen Regionen des Gehirns der neontalen Ratte induziert (Manthey et al., 2005). Selbst im unreifen Gehirn zu den Zeitpunkten P0, P3 und P7 löste LEV in einer Dosis von 100 mg/kg keine gesteigerte Neurotoxizität in Form neuronalen Zelltods aus, was neuroprotektive Effekte von LEV vermuten läßt. Dieses Ergebnis wurde durch eine Studie von Kim et al. (2007) unterstützt, in der die potentielle Neurotoxizität von LEV selbst und in Kombination mit anderen Antiepileptika in Rattengehirnen an P8 in höheren Dosen untersucht wurde. Hier zeigte sich, dass LEV alleine in einer Dosis von 250-1000 mg/kg keinen gesteigerten neuronalen Zelltod in den Regionen des Thalamus, Striatums und Cortex induzierte. In Kombination mit herkömmlichen 35 Antiepileptika wies LEV keinen Effekt auf die durch andere Antikonvulsiva hervorgerufene erhöhte Apoptoserate auf. Einen weiteren neuroprotektiven Ansatz von LEV lieferten tierexperimentelle Studien der Arbeitsgruppe Gibbs et al. (2006). Sie konnten am Modell des Status epilepticus in adulten Ratten zeigen, dass eine Behandlung mit LEV während eines Status epilepticus vor mitochondrialer Dysfunktion schützt. Allerdings wurde dazu eine relativ hohe Dosis von 1000mg/kg benötigt, so dass unklar bleibt, ob LEV über die Reduktion der Intensität des Status epilepticus indirekt die Folgen abschwächt oder über einen eigenen Mechanismus neuroprotektiv wirkt. Möglicherweise ist LEV in der Lage, den aufgrund durch oxidativen Stress bedingten Abfall des zellulären Antioxidans Glutathion zu verhindern und dadurch sekundär vor mitochondrialer Dysfunktion und den neurotoxischen Konsequenzen zu schützen. Die Gabe von LEV nach einem Status epilepticus zeigte hingegen keine protektive Wirkung auf die mitochondriale Dysfunktion (Gibbs et al., 2006, Gibbs et al., 2007). In einer Arbeit von Hanon und Klitgaard (2001) am Strokemodell der adulten Ratte wiesen Tiere mit fokaler zerebraler Ischämie, denen LEV verabreicht wurde, ein deutlich vermindertes Infarktvolumen auf, was ebenso neuroprotektive Effekte von LEV vermuten lässt. Mit einer Dosis von 44 mg/kg konnte eine Reduktion um 33% erreicht werden (Hanon et al., 2001). 1.4. Aufgabenstellung und Zielsetzung Vorliegende Studie untersucht Hypoxie-induzierte zerebrale vasoaktive und neurotrophe Regulationsmechanismen des extrem unreifen Gehirns unter akuter systemischer Hypoxie. Dabei konzentriert sich die Arbeit auf die Expression und Dynamik HIF-regulierter und HIF-unabhängiger, Hypoxieinduzierter Gene in sehr frühen Entwicklungsphasen des Gehirns bei Mäusen (P0, P7). Es wird untersucht, inwiefern die Expression dieser Gene im neonatalen Gehirn der Maus durch akute systemische Hypoxie beeinflusst wird. Dabei 36 wird geprüft, ob HIF-regulierte und HIF-unabhängige Gene bereits im extrem unreifen ZNS der Maus als Adaptationsmechanismus unter akuter Hypoxie bedeutsam sind. Als HIF-Zielgene werden in dieser Arbeit insbesondere VEGF und iNOS sowie als HIF-unabhängige Gene nNOS, eNOS und Caspase-3 analysiert. Eine weitere Fragestellung der Arbeit war, inwieweit eine Intervention mit Levetiracetam beeinflusst. die Expression dieser Gene im extrem unreifen Gehirn Hierfür wird die Genexpression mittels TaqMan- Polymerasekettenreaktion am Gehirn der Maus zu den Zeitpunkten P0 und P7 analysiert. Das verwendete Tiermodell entspricht nach Dobbing und Sands (1979) (Abb. 5) im Vergleich zum humanen ZNS einem Entwicklungsstand zu Beginn (23./24.Schwangerschaftswoche (SSW)) bzw. gegen Ende des dritten Trimenon (32.-34.SSW). Dieses Modell wurde gewählt, um ein sehr frühes Stadium der Gehirnentwicklung zu repräsentieren und die Expression vasoaktiver und neurotropher Gene im Sinne endogener Protektionsmechanismen infolge perinataler Hypoxie im extrem unreifen Gehirn untersuchen zu können. Zusätzlich soll der Einfluss von LEV auf diese Gene mit dem Aspekt eines möglichen Therapieansatzes charakterisiert werden. 37 Prozent des adulten Körpergewichts/Zeiteinheit Mensch Affe Ratte Schaf Hase Schwein Meerschwein Definierte Zeiteinheit Alter Geburt Alter Abbildung 5: Vergleich des „Brain growth spurt” innerhalb verschiedener Spezies (Dobbing and Sands, 1979). 38 2. Material und Methoden 2.1. Aufbau und Durchführung des Tierversuchs Die Tierversuche wurden vom Kantonalen Veterinäramt Zürich und von der Regierung Mittelfranken genehmigt. Die Tierexperimente wurden von der Arbeitsgruppen-Leiterin im Labor des Instituts für Veterinärphysiologie der Universität Zürich nach Protokollen des Veterinäramts Zürich durchgeführt. Alle molekularbiologischen Untersuchungen erfolgten im molekularbiologischen Labor der Kinder- und Jugendklinik der Universität Erlangen-Nürnberg. Es wurden C57BL/6 Wildtyp-Mäuse (Lieferant Charles River, Rosenfeld, Deutschland) an den postnatalen Tagen 0 (P0, n=34) und 7 (P7, n=31) systemischer Hypoxie (8 % O2) für 6 Stunden Dauer ausgesetzt. Damit konnte ein Modell der perinatalen Hypoxie bei der Maus, das einem humanen Entwicklungsstadium in der 23./24. SSW (P0) und in der 32.-34. SSW (P7) etabliert werden (Abb. 5). Dafür wurden die jeweils spontan geborenen Tiere am ersten Lebenstag (P0) und am siebten Lebenstag (P7) für sechs Stunden in eine Hypoxiekammer (INVIVO2 1000, Biotrace International, U.K.) mit 8 % Sauerstoff inkubiert (P0: n=34; P7: n=31). Um eine Anpassung der Tiere an die hypoxische Umgebung zu gewährleisten, wurde der Sauerstoffgehalt von 21 % auf 8 % innerhalb einer Stunde in 2 %-Schritten langsam gesenkt, bevor die Tiere für sechs Stunden kontinuierlich unter systemischer Hypoxie inkubiert wurden. Parallel wurden Kontrolltiere im Alter von P0 (n=30) und P7 (n=31) für sechs Stunden in der Kammer unter Raumluft gehalten. Levetiracetam (LEV) (Firma UCB S.A., Preclinical CNS Research, Braine L`Álleud, Brüssel, Belgien) wurde eine Stunde vor der Inkubation in einer Einzeldosis von 50 mg/kg (Injektionsvolumen 0,1 ml) intraperitoneal injiziert. Dies entspricht einer antikonvulsiven Dosis beim Nager (Gower et al., 1995, Löscher et al., 1993). Zum Vergleich erhielt eine jeweilige Kontrollgruppe eine 39 intraperitoneale Injektion mit physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9 %, Injektionsvolumen 0,1 ml). Von den 30 normoxischen Kontrolltieren im Alter von P0 wurden je 10 Mäusen NaCl 0,9 % und LEV appliziert, 10 Tiere erhielten keine Intervention. Von den insgesamt 34 hypoxischen Tieren im Alter von P0 wurden 11 mit NaCl 0,9 % und 13 mit LEV behandelt, 10 Tiere blieben unbehandelt. Von den 31 Kontrolltieren im Alter von P7 unter Normoxie wurde 10 Tieren NaCl 0,9 %, 11 Tieren LEV und 10 Tieren nichts verabreicht. Entsprechend erhielten 10 der 31 hypoxischen Tiere im Alter von P7 NaCl 0,9 %, 11 Tiere LEV und 10 Tiere keine Intervention. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Gesamtanzahl der Tiere der jeweiligen Versuchsgruppen: Tabelle 2: Gesamtzahl der Versuchstiere Normoxie Hypoxie P0 n=30 n=34 unbehandelt n=10 n=10 NaCl 0,9 % n=10 n=11 LEV n=10 n=13 P7 n=31 n=31 unbehandelt n=10 n=10 NaCl 0,9 % n=10 n=10 LEV n=11 n=11 40 Tabelle 3 gibt einen Überblick über die Anzahl der Proben zur Bestimmung der mRNA-Konzentration der jeweiligen Versuchsgruppen: Tabelle 3: Gesamtzahl der Proben für die mRNA-Analysen Normoxie Hypoxie P0 n=18 n=22 unbehandelt n=6 n=6 NaCl 0,9 % n=6 n=7 LEV n=6 n=9 P7 n=20 n=19 unbehandelt n=7 n=6 NaCl 0,9 % n=6 n=6 LEV n=7 n=7 Anschließend wurden die Mäuse mittels CO2-Inhalation und Dekapitation schmerzfrei getötet und die Gehirne unmittelbar ohne Reoxygenierung entnommen. Je 4 Gehirne pro Gruppe wurden für histologische Untersuchungen und Western Blot-Analysen vorgesehen (Analysen sind nicht Gegenstand der vorgelegten Arbeit). Die Gehirne wurden sofort nach Extraktion in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. 2.2. RNA-Isolation Die RNA-Isolation aus Gehirngewebe erfolgte nach der TRIzol-Methode. Die Mäusehirne wurden gewogen und pro 100 mg Gewebe 1 ml TRIzol zugegeben. Danach wurde das Gewebe in einer Gewebemühle mit 20 Hz für zweimal 30 Sekunden homogenisiert und im Anschluss bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Den Homogenaten wurde je 1 ml TRIzol 200 µl Chloroform beigegeben. Nach Mischen für 15 Sekunden wurden die Proben für weitere 2 Minuten bei 41 Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 15 Minuten bei 12 000 Umdrehungen pro Minute (U/min) bei 4 °C zentrifugiert. Für die Phasentrennung wurde der Überstand abpipettiert, pro 1 ml TRIzol 500 µl Isopropanol hinzugegeben, für 20 Minuten auf Eis (4 °C) inkubiert und erneut für 15 Minuten bei 15 000 U/min bei 4 °C zentrifugiert. Das Isopropanol wurde abgekippt und die überschüssigen Reste abgesaugt. Das entstandene Pellet wurde mit 1 ml 75 %-igem Ethanol pro 1 ml Trizol gewaschen und für 15 Minuten bei 15 000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde für 2-3 Minuten getrocknet und restliche Ethanolrückstände abgesaugt. Schließlich wurde das Pellet in 200 µl Diethylpyrocarbonat (DEPC)-Wasser gelöst und die RNA-Konzentration mittels Absorptionsmessung im BIOPhotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dafür wurde zuerst als Leerwert die Extinktion von 80 µl Aqua ad iniectabilia (Aqua a. i.) bei 230 nm, 260 nm, 280 nm und 320 nm gemessen, um das Gerät zu kalibrieren. Von den Proben wurden je 2 µl in 78 µl DEPC verdünnt und anschließend ebenso bei den entsprechenden Wellenlängen gemessen. Der Extinktionswert bei 260 nm gibt den RNA-Gehalt an, der Wert bei 230 nm zeigt die Konzentration von Salzen oder anderen organischen Substanzen. Der Wert bei 280 nm gibt eine mögliche Kontamination mit Proteinen wieder und der Messwert bei 320 nm weist auf eine eventuelle Verunreinigung der Küvette hin. Der Wert bei 260 nm darf 1,0 nicht überschreiten um eine lineare Messung der RNA-Konzentration sicher zu stellen. Die Quotienten 260/280 und 260/230 geben die Konzentration von reiner RNA oder DNA an. Diese Werte sollten 1,9-2,1 respektive 1,6-2,0 betragen. Um den RNA-Anteil optisch sichtbar zu machen wurde zusätzlich eine Gelelektrophorese durchgeführt. Hierfür wurde ein Gel aus 0,5 g Agarose mit 50 ml 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE-Puffer) und 5 µl Ethidiumbromid hergestellt. Währenddessen wurden 2 µl der RNA-Proben mit 1,5 µl 5x TAEBlaupuffer sowie 3 µl destilliertem Wasser (Aqua dest.) vermengt und nach Aushärtung des Gels in die vorgesehenen Taschen pipettiert. Das Gel wurde 42 für 20-30 Minuten bei 80 V an Gleichstrom angeschlossen. Anschließend wurde das Gelkissen unter UV-Licht fotografiert, um die RNA-Banden zu verifizieren. Bis zum weiteren Prozedere der cDNA-Synthese wurde die isolierte RNA bei -80°C tiefgefroren. Tabelle 4 zeigt die für die RNA-Isolation, die photometrische Messung und die Gelelektrophorese verwendeten Substanzen und Geräte: Tabelle 4: Substanzen und Geräte für die RNA-Isolation, photometrische Messung und Gelelektrophorese Produkt/Gerät Firma Ort TRIzol Invitrogen Carlsbad, USA Chloroform (reinst) Merck Darmstadt, Germany Isopropanol Roth Karlsruhe, Germany 75 % Ethanol (Ethanol absolut) Merck Darmstadt, Germany DEPC (Diethylpyrocarbonat) Sigma-Aldrich Steinheim, Germany Gewebemühle: Kugelmühle MM300 Retsch Haan, Germany Zentrifuge: Universal 30RF Hettich Tuttlingen, Germany Braun EppendorfNetheler-Hinz GmbH Melsungen, Germany RNA-Isolation: Photometrische RNA-Mengenbestimmung: Aqua a. i. (Aqua ad iniectabilia) Photometer: BIO Photometer Hamburg, Germany Gelelektrophorese (RNA): Agarose: Seakam LEAgarose Biozym Scientific GmbH Oldenburg, Germany Ethidiumbromid Sigma-Aldrich Steinheim, Germany -Tris-Base: Tris Pufferan Roth Karlsruhe, Germany -Eisessig (100 % Essigsäure) Merck Darmstadt, Germany -EDTA: 0,5 M Na2EDTA Sigma-Aldrich Steinheim, Germany 1x TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA-Puffer): Aqua dest. 43 5x TAE-Blaupuffer: -1x TAE-Puffer (s. oben) -Bromphenolblau (0,4 %) Merck Darmstadt, Germany -Glycerin (50 %) Merck Darmstadt, Germany Hercules, California, USA Stromgeber: POWER PAC 300 Photogerät: UV-Lampe & Kamera Bio-Rad PeqLab Biotechnologie GmbH Erlangen, Germany 2.3. Reverse Transkription Mittels des Enzyms Reverse Transkriptase (M-MLV RT) wurde eine der mRNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert, um diese vervielfältigen zu können. Für die Reverse Transkription wurden kommerzielle Materialien (Tab. 5) nach Angaben des Herstellers benutzt. Dafür wurde zuerst für jede Probe die Menge bestimmt, in der 1 µg RNA enthalten ist. Um eine Gesamtmenge von 8 µl je Ansatz zu erhalten, wurde zu diesen berechneten Probenanteilen entsprechend DEPC hinzu gegeben. Zu Beginn der Reversen Transkription wurde jedem Ansatz für den anfänglichen DNA-Verdau möglicher Rest-DNA 1 µl 10x DNase I-Puffer und 1 µl RNase-freie DNase beigefügt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden jeweils 1 µl DNase Stop-Solution dazu pipettiert und die Proben in einem Thermoblock für 15 Minuten auf 65 °C erhitzt. Währenddessen wurde der Mastermix A angesetzt, der pro Ansatz aus 0,6 µl Randomprimer (0,5 µg/µl), 0,4 µl Oligo Desoxythymidin-Primer (Oligo dtPrimer) (0,5µg/µl) als Startermolekül und 4 µl DEPC besteht. Nach der Zugabe dieser insgesamt 5 µl wurden die Proben erneut im Thermoblock für 5 Minuten auf 70 °C erwärmt und in Folge für 1 Minute auf Eis abgekühlt. In diesem Schritt erfolgte die Hybridisierung des Primers an die RNA-Matrize. Im Anschluss wurden je Ansatz 10 µl des Mastermix B hinzugefügt, der sich aus 5 µl 5x M-MLV-Puffer, 1,25 µl Desoxy-Nukleotidtriphosphat-Mix (dNTP- 44 Mix) (10 mM), 0,5 µl RNase-Inhibitor (40 U/µl), 1 µl Reverse Transkriptase (MMLV RT) (200 U/µl) und 2,25 µl DEPC zusammensetzt. Bei 37 °C wurden die Probengemische im Wärmeschrank für 1 Stunde gelagert und hinterher für eine Minute auf Eis gesetzt. Abschließend wurde die synthetisierte cDNA bei -20 °C tiefgefroren. Tabelle 5: Substanzen und Geräte für die Reverse Transkription Produkt/Gerät Firma Ort -10x DNase I-Puffer Promega Mannheim, Germany -RQ1 RNase-Free DNase Promega Mannheim, Germany Promega Mannheim, Germany -Randomprimer Roche Diagnostics - Applied Science Mannheim, Germany -Oligo dt-Primer (MWG 15T's) MWG Biotech AG Ebersberg, Germany -DEPC (Diethylpyrocarbonat) Sigma-Aldrich Steinheim, Germany - 5x M-MLV-Puffer Promega Mannheim, Germany -RNase-Inhibitor Promega Mannheim, Germany -M-MLV RT Promega Mannheim, Germany -dNTPs (Mix 10 mM) Finnzymes Espoo, Finnland Biometra Göttingen, Germany Reverse Transkription: DNA-Verdau: DNase Stop Solution Mastermix A: Mastermix B: Wärmeblock: Trio Thermoblock 2.4. TaqMan Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Die quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist durch exponentielle Vervielfältigung eines DNA-Fragments unter dem Einfluss einer hitzestabilen DNA-Polymerase (HotGoldStar) eine Möglichkeit, die Expression spezifischer Gene zu untersuchen. In vorliegender Arbeit wurde für jede 45 einzelne der Proben mittels RT-PCR die Expression der Gene VEGF, iNOS, nNOS, eNOS, Caspase-3, PBGD und β-Aktin analysiert. Bei der Methode der RT-PCR wird sich die 5´-3´-Exonuklease-Eigenschaft der Polymerase auf verwendete fluorogene TaqMan-Sonden (taq) (Tab. 6) zu Nutze gemacht. Der zu amplifizierende DNA-Abschnitt wird durch die zwei Primer-Bindungsstellen des forward (for)- und reverse (rev)- Primers (Tab. 6) festgelegt. Innerhalb dieses Bereiches lagert sich die sequenzspezifische Oligonukleotidsonde an, die durch zwei fluoreszente Farbstoffe charakterisiert ist, nämlich dem Reporter-Farbstoff (6-Carboxy-Fluorescein, FAM) am 5’Ende und dem Quencher-Farbstoff (6-Carboxy-Tetramethylrhodamin, TAMRA) am 3’-Ende. Solange die Sonde aktiv ist, überlagert die Fluoreszenz der Quencher-Färbung am 3’-Ende aufgrund der räumlichen Nähe die Emission der Reporterfärbung am 5´-Ende durch einen FluoreszenzEnergietransfer. Während der PCR hybridisiert die TaqMan-Sonde mit den Primern der Zielsequenz. Durch die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Polymerase wird im weiteren Verlauf die hybridisierte Sonde durch Hydrolyse gespalten. Dadurch wird der Fluoreszenz-Energietransfer zwischen Quencher und Reporter unterbunden und die Freisetzung der Reportermoleküle gesteigert. Das fluoreszente Reporter-Signal nimmt mit fortschreitender Spaltung der Sonde zu. Die Änderung der Fluoreszenzen der unterschiedlichen Farbstoffe wird über Laser von einem Spektrophotometer erfasst und mit einer speziellen Software analysiert (Tab. 7). Vor Beginn der PCR wurde die aus den Proben synthetisierte cDNA mit verschiedenen Reagenzien eines standardisierten PCR-Kits (TaqMan Reaction Kit, Eurogentec, Köln, Germany) (Tab. 7) nach Protokoll des Herstellers versetzt und auf eine spezielle Mikrotiter-Platte mit 96 Positionen aufgetragen. In ein Feld wurden insgesamt 25 Mikroliter (µl) des Mixes pipettiert, die sich aus 2,5 µl 10x Reaction-Puffer, 1 µl dNTP-Mix (5 Millimol (mM)), je nach optimierter Konzentration des jeweiligen Gens 1,25-2,5 µl MgCl2 (50 mM), 0,13 µl DNA-Polymerase (HotGoldStar), 0,25 µl Uracil-N- 46 Glycosylase (UNG-Enzym), entsprechende Menge an HPLC, 2,5 µl TaqManSonde (2 Mikromol (µM)), je 2,5 µl des forward- und reverse-Primers (3-9 µM) sowie 2,5 µl cDNA einer Probe zusammensetzten (Tab. 6, Tab. 7). Die Oligonukleotide der jeweiligen Zielregion wurden von der Primer Express Software (Perkin-Elmer Corporation, USA.) unter der Anwendung einheitlicher Auswahlkriterien entworfen, wodurch standardisierte Zyklusbedingungen ermöglicht wurden. Tabelle 6 gibt eine Übersicht über die verwendeten TaqMan-Sonden und Primer der jeweiligen Gene. Tabelle 6: Forward (for)- und reverse (rev)-Primer und TaqMan-Sonden (taq) Gen Sequenzen und Primerkonzentrationen PBGD taq 5’-(FAM)-TCTAGCTCCTTGGTAAACAGGCTCTTCTCTCCA-(TAMRA)-3’ for ACAAGATTCTTGATACTGCACTCTCTAAG (9µM) rev CCTTCAGGGAGTGAACAACCA (6 µM) ßAktin taq 5’-(FAM)-ATCACACCCTGGTGCCTAGGGCG-(TAMRA)-3’ for ATGCTCCCCGGGCTGTAT (6 µM) rev TCACCCACATAGGAGTCCTTCTG (6 µM) VEGF taq 5’-(FAM)-CCATGCCCAGTGGTCCCAGGCTG-(TAMRA)-3’ for GCACTGGACCCTGGCTTTACT (3 µM) rev ACTTGATCACTTCATGGGACTTCTG (3 µM) eNOS taq 5’-(FAM)-TGAGCAGCACAAGAGCTACAAAATCCGA-(TAMRA)-3’ for GGAAATGTCAGGCCCGTACA (9 µM) rev GGTCTGAGCAGGAGACACTGTTG (9 µM) iNOS taq 5’-(FAM)-CGGGCAGCCTGTGAGACCTTTGA-(TAMRA)-3’ for CAGCTGGGCTGTACAAACCTT (3 µM) rev CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG (3 µM) 47 nNOS taq 5’-(FAM)-TCAACTACATCTGTAACCACGTCAAGTACGCCAC-(TAMRA)-3’ for TGCACCACAGCCCATGG (3 µM) rev ATATAGTGATGGCCGACCTGAGG (3 µM) Casp- taq 5’-(FAM)-TTACTCTACAGCACCTGGTTACTATTCCTGGAGAAATTC- 3 (TAMRA)-3’ for AGATACCGGTGGAGGCTGACT (9µM) rev GAACCACGACCCGTCCTTT (6µM) Für jedes zu messende Gen wurde auf der Platte zusätzlich ein vorher bestimmter Standard (Probe bekannter Konzentration) in einer seriellen Verdünnungsreihe (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128) mitgeführt, um eine Standardkurve zu erhalten, auf die sich die gemessenen Werte beziehen. Als aktive Referenz zur Normalisierung der experimentellen Ergebnisse wurden die Housekeeping-Gene Porphobilinogen-Deaminase (PBGD) und β-Aktin koamplifiziert. Zur relativen Quantifizierung wurden dafür die MeanWerte der Zielgene auf die Mean-Werte der nicht regulierten HousekeepingGene bezogen, das bedeutet der Quotient aus den Mean-Werten der Zielgene und Housekeeping-Gene berechnet. Zudem wurde als Negativkontrolle pro Gen in 1-2 Positionen der Platte Aqua dest. gegeben. Für die PCR wurde die befüllte Mikrotiter-Platte kurz anzentrifugiert, gemäß den Angaben der Firma in das TaqMan-Gerät gestellt und die Messung gestartet. Jedes Feld der Mikrotiter-Platte wurde dabei während der Messung innerhalb einer Minute achtmal gemessen. Der eigentlichen PCR ist grundsätzlich ein Zyklus von 2 Minuten bei 50 °C gefolgt von einem 10-minütigen Zyklus bei 95 °C vorgeschaltet, um die zum Schutz vor Kontamination verwendete Uracil-N-Glykosylase (UNG-Enzym) zu inaktivieren und die entstandenen Abfallmoleküle zu zerstören. Zusätzlich wird die zum endgültigen Start der PCR notwendige DNA-Polymerase (HotGoldStar) durch die Inkubation bei 95 °C aktiviert. Nach insgesamt 48 weiteren 40 Zyklen, wobei ein Zyklus je 15 Sekunden bei 95 °C und 60 Sekunden bei 60 °C andauert, ist die PCR beendet. Die während der RT-PCR entstandenen Signale geben die Entwicklung der Fluoreszenz-Emission des Reporter-Farbstoffes wider. Alle erhaltenen Messdaten beziehen sich dabei auf eine Standardkurve. Diese entsteht, indem man die Werte der Standard-Konzentrationen (siehe oben) mit den korrespondierenden Schwellenzykluswerten (CT-Werte) ins Verhältnis setzt. Als Schwellenzyklus (cycle treshold, CT) bezeichnet man den Zyklus, in dem ein bestimmter Schwellenwert überschritten wird, der als die zehnfache Standardabweichung der Hintergrundaktivität (produziert durch das Plastik der Platte und den optischen Vorrichtungen) definiert ist und meist zwischen dem 3.-15. Zyklus detektiert wird. Der Schwellenzyklus ist proportional zur Startkopienzahl der Ziel-DNA, ebenso wie zu der Menge des amplifizierten PCR-Produkts. Die so gewonnenen Daten wurden nach vollständigem Abschluss der RTPCR in einem SDS-File des TaqMan-Gerätes gespeichert und mit der zugehörigen ABI PRISM 7700 Sequece Detection-Software quantitativ analysiert. Zur relativen quantitativen Analyse der Messergebnisse stehen prinzipiell mehrere Optionen zur Verfügung. Mit einer Graphik der Rohdaten kann man den groben Verlauf des Fluoreszenz-Signals während der PCR von einer oder mehreren Positionen nachvollziehen. Je mehr sich die Kurven gleichen, desto besser ist die Qualität der Analyse. Die Multikomponenten-Darstellung zeigt die komplette spektrale Entwicklung jeder involvierten Farbstoff-Komponente einer bestimmten Position im Verlauf der PCR. Dabei äußert sich ein positives Ergebnis mit einem Intensitätsanstieg von FAM und einem Emissionsabfall von TAMRA. Eine weitere Möglichkeit ist die Illustration eines Amplifikation-Plots, der für jede Position 3 verschiedene Darstellungsmethoden ermöglicht. Mit dem CTDisplay wird veranschaulicht, in welchem Zyklus ein Signal erstmals gemessen wurde, d.h. der Schwellenwert überschritten wurde. Aus dem 49 Graph der normalisierten Reporter-Werte (Rn-Wert) wird das Verhältnis des Reporter-Signals zur Emission der passiven Referenz (Farbstoff ROX) verschiedener Positionen über den kompletten PCR-Verlauf ersichtlich. Die lineare und logarithmische Darstellung des ∆Rn-Diagramms zeigen die normalisierten Reporter-Werte abzüglich des Reporter-Signals vor Beginn der PCR unterschiedlicher Positionen während der PCR. Der Experiment-Report fasst alle innerhalb der PCR erhobenen Daten zusammen, liefert Informationen über den Inhalt der belegten Felder einer Mikrotiter-Platte und gibt berechnete CT-Werte, Resultate der Quantifizierungs-Analyse, Mittelwerte und Standardabweichungen an. Für die weitere statistische Auswertung der quantitativ analysierten Daten wurden die gewonnenen Messergebnisse gespeichert und für jedes gemessene Gen ein Ausdruck der Standardkurve, des Amplifikation-Plots (lineare und logarithmische Darstellung des ∆Rn-Diagramms) und des Experiment-Reports erstellt. Tabelle 7 enthält Informationen über die benutzten Reagenzien und Geräte für die RT-PCR: Tabelle 7: Substanzen und Geräte für die Durchführung der TaqMan-RT-PCR Produkt/Gerät Firma Ort Eurogentec Köln, Germany Uracil-N-Glycosylase UNG-Enzym Eurogentec Köln, Germany HPLC Merck Darmstadt, Germany Primer und TaqMan-Sonden: s. Tab. 6 MWG Biotech AG Ebersberg, Germany TaqMan Real-Time PCR: TaqMan Reaction Kit: -10x Reaction-Puffer -50 mM MgCl2 -HotGoldStar -5 mM dNTP-Mix 50 Mikrotiterplatte: Multi "96well" PCR Plates PeqLab Biotechnologie GmbH Zentrifuge: Rotanta 96R Hettich Zentrifugen TaqMan Gerät: ABI PRISM 7700 Sequece Detection-System Applied Biosystems Software: ABI PRISM 7700 Sequece DetectionSoftware Applied Biosystems Perkin-Elmer Primer Express Software Corporation Erlangen, Germany Tuttlingen, Germany Darmstadt, Germany Darmstadt, Germany Massachusetts, USA 2.5. Statistische Auswertung Die erhobenen Daten wurden mit der GraphPad PRISM Version 4.0 Software (GraphPad Software, San Diego, California, USA) statistisch und graphisch ausgewertet. Die Ergebnisse wurden aus den Quotienten der CT-Werte der Zielgene und Housekeeping-Gene (PBGD und β-Aktin) berechnet. Sie werden als Mittelwert (MW) ± Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean, SEM) angegeben. Der statistische Vergleich der MW±SEM erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse (One-way Analysis of Variance, ANOVA). Zum Vergleich wiederholter Messungen unterschiedlich behandelter Gruppen wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse (Two-way ANOVA) mit BonferroniTest angewendet. Ein P-Wert unter 0,05 (p<0,05) wurde als signifikant gewertet. 51 3. Ergebnisse Vorliegende Studie untersuchte mittels RT-PCR 1) die zerebrale Expression der mRNA von den HIF-1-abhängigen Genen VEGF und iNOS, sowie von Hypoxie-induzierbaren, aber HIF-1-unabhängigen Genen nNOS, eNOS und Caspase-3 unter akuter systemischer Hypoxie bei der neonatalen Maus im Vergleich zu normoxischen Kontrolltieren, 2) den Einfluss von LEV auf die Expression oben genannter Gene unter Hypoxie und Normoxie im Vergleich zu unbehandelten bzw. mit NaCl 0,9 %-behandelten Kontrollgruppen. Die Untersuchungen wurden in zwei unterschiedlichen Entwicklungsstadien des unreifen Gehirns der Maus zu den Zeitpunkten P0 und P7 durchgeführt (Abb. 5). 3.1. Einfluss von Hypoxie auf HIF-1-abhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 Um den Einfluss akuter systemischer Hypoxie auf das unreife Gehirn in den Entwicklungsstadien P0 und P7 anhand der mRNA-Expression HIF-1abhängiger Gene (VEGF und iNOS) untersuchen zu können, wurden Versuchstiere direkt nach der Geburt (P0) und am siebten Lebenstag (P7) für sechs Stunden in einer Hypoxiekammer bei 8% O2 inkubiert. Gleichzeitig verblieb zum Vergleich eine Kontrollgruppe unter normoxischen Versuchsbedingungen (Raumluft). 3.1.1. Genexpression von VEGF im neonatalen Gehirn der Maus unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7 Im Vergleich zu den Kontrolltieren konnte ein signifikanter Anstieg der mRNAExpression von VEGF im hypoxischen Gehirn der Mäuse im Alter von P0 und P7 festgestellt werden. Im Alter P0 nahm die Expression um das 1,7-fache, in den P7-Gehirnen um das 9,1-fache zu. Mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 in der Gruppe P0 und p<0,001 in der Gruppe P7 war der Hypoxie-induzierte Anstieg im Vergleich zu den Kontrollen signifikant. 52 Tabelle 8 zeigt den spezifischen mRNA-Gehalt von VEGF in Relation zu der konstanten mRNA-Konzentration des Housekeeping-Gens PBGD (MW±SEM) innerhalb der Untersuchungsgruppe. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich in Bezug auf das zweite Housekeeping-Gen β-Aktin. Abbildung 6 veranschaulicht graphisch die Veränderung der zerebralen VEGF-Expression unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie im unreifen Gehirn der Maus zu den Zeitpunkten P0 und P7. Tabelle 8: Zerebrale mRNA-Expression von VEGF in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. VEGF/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,018±0,002 0,031±0,003 p<0,05 0,096±0,032 0,873±0,070 p<0,001 P7: Keine Intervention 53 P0 MW± ± SEM 0.035 _____________ * VEGF/PBGD 0.030 0.025 Normoxie Hypoxie 0.020 * 0.015 = p<0,05 0.010 0.005 0.000 Normoxie Hypoxie unbehandelt P7 MW± ± SEM 1.00 ______________ *** VEGF/PBGD 0.75 Normoxie Hypoxie 0.50 *** = p<0,001 0.25 0.00 Normoxie Hypoxie unbehandelt Abbildung 6: mRNA-Expression von VEGF unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. 54 3.1.2. Genexpression von iNOS im neonatalen Gehirn der Maus unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7 Verglichen mit den normoxischen Kontrollen führte eine systemische Hypoxie zu einer Reduktion der mRNA-Expression von iNOS in den Gehirnen der Tiere sowohl zum Zeitpunkt P0 als auch P7 (Tab. 9, Abb. 7). Zum Zeitpunkt P0 sank die Expression um das 1,4-fache ab, zum Zeitpunkt P7 um den 4,3-fachen Wert. Damit war die Veränderung der Expression der mRNA von iNOS unter dem Einfluss von Hypoxie, ähnlich wie bei VEGF, in den P7-Gehirnen ausgeprägter als im Alter P0. Die verminderte zerebrale Expression der iNOS-mRNA in den hypoxischen Gehirnen an P0 und P7 war signifikant (p<0,001), sowohl in Bezug zu PBGD als auch zu β-Aktin (Tab. 9). Vergleicht man den Hypoxie-induzierten Anstieg der mRNA von VEGF und iNOS zwischen den Altersgruppen P0 und P7, zeigt sich der Trend, dass die Expression der mRNA von VEGF und iNOS im Alter P7 ausgeprägter als an P0 ist (Abb. 6, Abb. 7). Tabelle 9: Zerebrale mRNA-Expression von iNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. iNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 1,001±0,057 0,733±0,048 p<0,001 1,365±0,083 0,319±0,047 p<0,001 P7: Keine Intervention 55 P0 MW± ± SEM 1.1 _______________ *** 1.0 Normoxie 0.9 Hypoxie iNOS/PBGD 0.8 *** = p<0,001 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Normoxie Hypoxie unbehandelt P7 MW± ± SEM 1.5 ________________ *** Normoxie iNOS/PBGD Hypoxie *** 1.0 = p<0,001 0.5 0.0 Normoxie Hypoxie unbehandelt Abbildung 7: mRNA-Expression von iNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. 56 3.2. Einfluss von Hypoxie auf HIF-1-unabhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 Als HIF-1-unabhängige, Hypoxie-induzierte Gene wurden nNOS, eNOS und Caspase-3 analysiert. Im Gegensatz zu den HIF-1-regulierten vasoaktiven Genen VEGF und iNOS konnte im neonatalen Gehirn der Maus weder im Alter von P0 noch von P7 eine signifikante Veränderung der mittleren mRNAKonzentration der HIF-1-unabhängigen, Hypoxie-induzierbaren Gene nNOS (Tab. 10, Abb. 8), eNOS (Tab. 11, Abb. 9) und Caspase-3 (Tab. 12, Abb. 10) unter Hypoxie festgestellt werden. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen blieben die Werte unverändert. Diese Resultate ließen sich auf beide Housekeeping-Gene PBGD und β-Aktin reproduzieren. Tabelle 10: Zerebrale mRNA-Expression von nNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. nNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,836±0,080 0,737±0,080 p>0,05 0,985±0,136 0,892±0,200 p>0,05 P7: Keine Intervention 57 P0 n.s. ________________ MW± ±SEM nNOS/PBGD 1.00 Normoxie Hypoxie 0.75 n.s. = nicht signifikant 0.50 0.25 0.00 Normoxie Hypoxie unbehandelt P7 MW±SEM 1.25 n.s. ________________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant n N O S /P B G D 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 Normoxie Hypoxie unbehandelt Abbildung 8: mRNA-Expression von nNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. 58 Tabelle 11: Zerebrale mRNA-Expression von eNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. eNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,035±0,016 0,043±0,008 p>0,05 0,362±0,148 0,655±0,089 p>0,05 P7: Keine Intervention 59 P0 MW± ±SEM 0.06 n.s. ________________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant eNOS/PBGD 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 Normoxie Hypoxie unbehandelt P7 eNOS/PBGD MW± ±SEM 0.75 n.s. _________________ Normoxie Hypoxie 0.50 n.s. = nicht signifikant 0.25 0.00 Normoxie Hypoxie unbehandelt Abbildung 9: mRNA-Expression von eNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. 60 Tabelle 12: Zerebrale mRNA-Expression von Caspase-3 in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. Casp-3/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 1,630±0,115 1,672±0,150 p>0,05 1,746±0,141 1,582±0,077 p>0,05 P7: Keine Intervention 61 P0 Casp-3/PBGD MW± ± SEM 2 n.s. ________________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant 1 0 Normoxie Hypoxie unbehandelt P7 Casp-3/PBGD MW± ± SEM 2 n.s. _________________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant 1 0 Normoxie Hypoxie unbehandelt Abbildung 10: mRNA-Expression von Caspase-3 unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. 62 3.3. Einfluss von Levetiracetam auf HIF-1-abhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 unter Normoxie und Hypoxie Um mögliche Effekte von LEV auf HIF-1-regulierte neurotrophe Faktoren im unreifen Gehirn zu detektieren, wurde nach Verabreichung von 50 mg/kg LEV die Expression der mRNA HIF-1-abhängiger Gene (VEGF und iNOS) unter Hypoxie und Normoxie in den ZNS-Entwicklungsstadien P0 und P7 untersucht. Zum Vergleich wurden hypoxische und normoxische Kontrolltiere mit NaCl 0,9 % behandelt oder erhielten keine Behandlung. 3.3.1. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1-abhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Normoxie Unter Normoxie konnte nach Verabreichung von LEV weder zum Zeitpunkt P0 noch zum Zeitpunkt P7 eine signifikante Veränderung der Expression der HIF1-regulierten Gene VEGF (Tab. 13, Abb. 11) und iNOS (Tab. 14, Abb. 12) im Vergleich zu den unbehandelten und mit NaCl 0,9 %-behandelten Kontrolltieren festgestellt werden. 3.3.2. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1-abhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Hypoxie Die Analyse der Genexpression HIF-abhängiger vasoaktiver Faktoren zeigte unterschiedliche Effekte von LEV auf die Expression von VEGF und iNOS unter akuter systemischer Hypoxie. 3.3.2.1. Hypoxie-induzierte mRNA-Expression von VEGF an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam unter akuter systemischer Hypoxie Die durch Hypoxie induzierte Zunahme der Expression der VEGF-mRNA konnte ebenso in den hypoxischen LEV- und NaCl 0,9 %-behandelten Tieren zu beiden Zeitpunkten P0 (p<0,001) und P7 (p<0,01 bzw. p<0,001) 63 beobachtet werden (Tab. 13). Dabei stieg die Expression in den Gehirnen der hypoxischen Mäuse unter dem Einfluss von LEV 3,3-fach im Alter von P0 und 1,9-fach im Alter von P7 an. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich in Bezug zu ßAktin. Tabelle 13: Zerebrale mRNA-Expression von VEGF in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. VEGF/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,018±0,002 0,031±0,003 p<0,05 NaCl 0,9% 0,017±0,001 0,042±0,003 p<0,001 LEV 0,016±0,002 0,053±0,005 p<0,001 Keine Intervention 0,096±0,032 0,873±0,070 p<0,001 NaCl 0,9% 0,286±0,034 0,771±0,043 p<0,001 LEV 0,375±0,127 0,708±0,052 p<0,01 P7: 64 P0 MW± ± SEM 0.06 _________ *** Normoxie Hypoxie VEGF/PBGD 0.05 0.04 ________ *** * = p<0,05 *** = p<0,001 ________ * 0.03 0.02 0.01 0.00 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention P7 MW± ± SEM 1.00 ________ *** ________ *** Normoxie ________ ** VEGF/PBGD 0.75 Hypoxie ** = p<0,01 *** = p<0,001 0.50 0.25 0.00 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention Abbildung 11: mRNA-Expression von VEGF an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. 65 3.3.2.2. Hypoxie-induzierte mRNA-Expression von iNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam unter akuter systemischer Hypoxie Bei den in Hypoxie inkubierten Tieren zum Zeitpunkt P7 konnte nach Verabreichung von 50 mg/kg LEV eine signifikante Reduktion der zerebralen mRNA-Expression von iNOS im Vergleich zu der normoxischen Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Expression der mRNA von iNOS sank um das 2,53-fache (Tab. 14). Im Gegensatz zu diesen Resultaten wurde die herabgesetzte zerebrale Expression der iNOS mRNA nach hypoxischer Inkubation bei den LEVbehandelten Tieren zum Zeitpunkt P0 nicht nachgewiesen. Interessanterweise sank die Expression in den unreifen Gehirnen der LEV-behandelten Tiere im Alter von P0 nach akuter systemischer Hypoxie nicht signifikant im Vergleich zur normoxischen Kontrollgruppe ab (Tab. 14, Abb.12). Eine gleiche Tendenz zeigte sich in Bezug auf das zweite Housekeeping-Gen β-Aktin. Tabelle 14: Zerebrale mRNA-Expression von iNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. iNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 1,001±0,057 0,733±0,048 p<0,001 NaCl 0,9% 0,942±0,053 0,584±0,030 p<0,001 LEV 0,725±0,037 0,688±0,041 p>0,05 Keine Intervention 1,365±0,083 0,319±0,047 p<0,001 NaCl 0,9% 1,209±0,066 0,751±0,085 p<0,001 LEV 1,594±0,090 0,635±0,077 p<0,001 P7: 66 Normoxie Hypoxie *** = p<0,001 n.s. = nicht signifikant P0 MW± ±SEM 1.1 _________ *** _________ *** 1.0 n.s. __________ 0.9 iNOS/PBGD 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention P7 MW± ±SEM 1.75 _________ *** _________ *** Normoxie Hypoxie *** = p<0,001 _________ *** 1.50 iNOS/PBGD 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention Abbildung 12: mRNA-Expression von iNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. 67 3.4. Einfluss von Levetiracetam auf HIF-1-unabhängige Faktoren im unreifen Gehirn der Maus im Alter von P0 und P7 unter Normoxie und Hypoxie Um einen Effekt von LEV auf neurotrophe Faktoren unter dem Einfluss akuter systemischer Hypoxie auf das unreife Gehirn in den Entwicklungsstadien P0 und P7 zu untersuchen, wurde nach i.p.-Verabreichung von 50 mg/kg LEV die mRNA-Expression HIF-1-unabhängiger, Hypoxie-induzierbarer Gene (nNOS, eNOS und Caspase-3) nach hypoxischer Inkubation (8 % O2) analysiert. Zum Vergleich erhielt eine Kontrollgruppe 50 mg/kg LEV unter Normoxie. Zusätzlich wurden hypoxische und normoxische Kontrolltiere mit NaCl 0,9% behandelt oder erhielten keine Behandlung. 3.4.1. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1-unabhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Normoxie Die Expression der mRNA von den HIF-1-unabhängigen, Hypoxie- induzierbaren Genen nNOS (Tab. 15, Abb. 13), eNOS (Tab. 16, Abb. 14) und Caspase-3 (Tab. 17, Abb. 15) hat sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen ohne und mit NaCl 0,9 %-Behandlung nach der Verabreichung von LEV unter Normoxie weder zum Zeitpunkt P0 noch zum Zeitpunkt P7 signifikant geändert. 3.4.2. Einfluss von Levetiracetam auf die mRNA-Expression von HIF-1-unabhängigen Faktoren im neonatalen Gehirn der Maus an P0 und P7 unter Hypoxie Auch unter dem Einfluss von Hypoxie (8 % O2) blieb die zerebrale Expression der mRNA der HIF-1-unabhängigen, Hypoxie-induzierbaren Faktoren nNOS (Tab. 15, Abb. 13), eNOS (Tab. 16, Abb. 14) und Caspase-3 (Tab. 17, Abb. 15) in den Gehirnen der LEV-behandelten Tiere im Vergleich zu den Kontrollen zum Zeitpunkt P0 und P7 nahezu unverändert. Die Ergebnisse in Bezug auf ß-Aktin sind ähnlich. 68 Tabelle 15: Zerebrale mRNA-Expression von nNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. nNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,836±0,080 0,737±0,080 p>0,05 NaCl 0,9% 0,767±0,042 0,741±0,056 p>0,05 LEV 0,698±0,038 0,975±0,068 p>0,05 Keine Intervention 0,985±0,136 0,892±0,200 p>0,05 NaCl 0,9% 0,911±0,055 1,095±0,054 p>0,05 LEV 1,114±0,040 1,256±0,053 p>0,05 P7: 69 P0 n.s. ________ n.s. ________ nNOS/PBGD MW± ± SEM 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant n.s. ________ unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention P7 1.5 nNOS/PBGD n.s. ________ n.s. ________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant n.s. ________ 1.0 0.5 0.0 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention Abbildung 13: mRNA-Expression von nNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. 70 Tabelle 16: Zerebrale mRNA-Expression von eNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. eNOS/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 0,035±0,016 0,043±0,008 p>0,05 NaCl 0,9% 0,074±0,019 0,040±0,006 p>0,05 LEV 0,046±0,004 0,023±0,003 p>0,05 Keine Intervention 0,362±0,148 0,655±0,089 p>0,05 NaCl 0,9% 0,764±0,061 0,819±0,084 p>0,05 LEV 0,796±0,048 0,829±0,079 p>0,05 P7: 71 P0 MW± ± SEM 0.100 Normoxie Hypoxie n.s. ________ n.s. = nicht signifikant eNOS/PBGD 0.075 n.s. ________ n.s. ________ 0.050 0.025 0.000 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention P7 MW± ± SEM 1.00 n.s. ________ Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant n.s. ________ eNOS/PBGD n.s. ________ 0.75 0.50 0.25 0.00 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention Abbildung 14: mRNA-Expression von eNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. 72 Tabelle 17: Zerebrale mRNA-Expression von Caspase-3 in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. Casp-3/PBGD Normoxie Hypoxie Signifikanzniveau P0: (MW±SEM) (MW±SEM) (p) Keine Intervention 1,630±0,115 1,672±0,150 p>0,05 NaCl 0,9% 1,804±0,100 1,557±0,106 p>0,05 LEV 1,702±0,102 1,737±0,118 p>0,05 Keine Intervention 1,746±0,141 1,582±0,077 p>0,05 NaCl 0,9% 2,009±0,142 2,049±0,310 p>0,05 LEV 2,117±0,157 1,888±0,173 p>0,05 P7: 73 Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant P0 n.s. ________ Casp-3/PBGD MW± ± SEM n.s. 2.0 ________ n.s. ________ 1.5 1.0 0.5 0.0 unbehandelt NaCl 0,9% LEV Intervention Normoxie Hypoxie n.s. = nicht signifikant P7 MW ± SEM 3 Casp-3/PBGD n.s. ________ n.s. ________ n.s. ________ 2 1 0 NaCl 0,9% unbehandelt LEV Intervention Abbildung 15: mRNA-Expression von Caspase-3 an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg(kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. 75 4. Diskussion 4.1. Bedeutung von Hypoxie als Ursache für perinatale ZNSSchäden Das Ausmaß einer zerebralen Schädigung als Folge einer perinatalen Hypoxie ist vom Stadium der Gehirnentwicklung abhängig (Curristin et al., 2002, Rees et al., 1998). Im unreifen Gehirn können nach einem perinatalen Hypoxieereignis langfristige Veränderungen der Vaskulogenese, Zelldifferenzierung und Migration auftreten (Curristin et al., 2002, Woodward et al., 2006). Lokalisation und Art der Schädigung sowie die Verfügbarkeit endogener Protektionsmechanismen unterscheiden sich bei Frühgeborenen und Reifgeborenen (Kaur et al., 2006, Rees et al., 1998). Bei Reifgeborenen dominiert durch perinatale Hypoxie die Entwicklung einer hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie (HIE) (Meberg et al., 2004), einem neurologischen Symptomenkomplex, der in unterschiedlichem Maße ausgeprägt und schwere Langzeitschäden zur Folge haben kann. Das klinische Bild reicht von geringer Entwicklungsretardierung bis zu schwersten neurologischen Defiziten. Anatomisch treten die ZNS-Läsionen bei Reifgeborenen vorwiegend in der Parasagittalregion, in den Basalganglien sowie im Thalamus auf (Rorke, 1992). Das makroskopische Bild wird durch den sogenannten Status marmoratus bestimmt, einem weißlich marmorierten Aussehen der Basalganglien durch fokalen neuronalen Zelluntergang mit pathologischer Verdichtung markhaltiger Nervenfasern und Vernarbung (Rorke, 1992). Frühgeborene weisen in der Perinatalperiode typischerweise Komplikationen als Folge der noch unreifen Organsysteme auf. Dabei spielen insbesondere Schädigungen des Gehirns infolge Hypoxie und Ischämie eine Rolle. Betroffene Hirnareale sind bei Frühgeborenen überwiegend die periventrikuläre weiße Substanz (Rorke, 1992). Zerebrale Schäden äußern sich vor allem in intra- oder periventrikulären Einblutungen, periventrikulärer Leukomalazie und zerebralen Insulten (Meberg et al., 2004). Dem liegt eine 76 bei Frühgeborenen bestehende inadäquate Autoregulation und gesteigerte Fragilität der Kapillaren (Nelson et al., 1991, Milligran, 1980) zugrunde. Dies kann zur Ruptur der noch nicht voll ausgereiften und fragilen Blutgefäße und in Folge zu zerebralen Hämorrhagien führen. Aufgrund der mangelnden Autoregulation und unreifen Gefäßversorgung wird die weiße Hirnsubstanz im Gebiet der Seitenventrikel nekrotisch geschädigt, was als periventrikuläre Leukomalazie bezeichnet wird. Außer durch Hypoxie können diese Schäden bei Frühgeborenen auch durch andere Risikofaktoren verursacht werden. Dazu zählen erworbene ZNSLäsionen durch Hyperoxie, Medikamente, Infektionen und Traumata. Die Prognose bezüglich Folgekomplikationen einer zerebralen Schädigung ist bei Frühgeborenen abhängig vom Stadium der Gehirnentwicklung und dem Schweregrad der Läsion. Eine Studie der Berliner Arbeitsgruppe Felderhoff-Müser et al. (2004) zeigte in einem Tierexperiment an neugeborenen Mäusen, dass ein über die physiologische Norm erhöhter Sauerstoffgehalt die apoptotische Neurodegeneration verstärkt. Der Sauerstoff verursachte bei den Mäusen oxidativen Stress, erhöhte die Expression von Neutrophinen und inaktivierte Proteine der endogenen Protektionsmechanismen. Dabei zeigte sich, dass das Gehirn vor allem während der Entwicklungsphase innerhalb der ersten zwei Wochen besonders sensibel auf die Sauerstoff-Toxizität reagiert, was beim Menschen dem letzten Trimenon einer Schwangerschaft entspricht (Dobbing und Sands, 1979). Der schädigende Einfluss von Hyperoxie auf das ZNS wurde auch in einer aktuellen Studie von Gerstner et al. (2008) belegt, in der Ratten zum Zeitpunkt P3, P6 und P10 für 24 Stunden 80%-igem Sauerstoff ausgesetzt wurden. Es zeigte sich bei diesen Tieren eine zerebrale Schädigung in Form von neuronalem Zelluntergang. Dabei wiesen die Gehirne in den frühen Entwicklungsstadien eindeutig größere Schäden auf, als die im reifen ZNS-Stadium, was die erhöhte Anfälligkeit gegenüber Risikofaktoren gerade bei Frühgeborenen widerspiegelt. 77 Zudem werden systemische inflammatorische Mechanismen als Ursache für eine Hirnschädigung diskutiert. Ein hohes Risiko stellen Erkrankungen wie ein mütterliches Amnioninfektionssydrom (Berger et al., 1997) dar. Ebenso sind kindliche entzündliche Prozesse, z.B. im Rahmen einer nekrotisierenden Enterokolitis, mit dem Risiko neurologischer Folgekomplikationen assoziiert (Sonntag et al., 2000, Hintz et al., 2005). In einer klinischen Studie an Frühgeborenen von Hintz et al. (2005) zeigte sich bei Kindern mit nekrotisierender Enterokolitis im Vergleich zu gesunden Frühgeborenen ein erhöhtes Auftreten von Sepsis in der Perinatalperiode. Zudem fiel auf, dass vor allem sehr kleine Frühgeborene (<1000g) eine nekrotisiernde Enterokolitis entwickelten, die einer chirurgischen Intervention bedurften. Verglichen mit medikamentös behandelter nekrotisierende Enterocolitis zeigte sich nach einem chirurgischen Eingriff eine erhöhte Inzidenz von periventrikulärer Leukomalazie sowie eine generalisierte Wachstumsretardierung bei den betroffenen Kindern (Hintz et al., 2005). Ein weiterer Anhaltspunkt für eine inflammatorische Genese zerebraler Schädigung ist der beschriebene Zusammenhang zwischen pränatal erhöhter Konzentration von inflammatorischen Zytokinen im kindlichen Blut und dem gesteigerten Risiko für die Entwicklung einer Zerebralparese (Nelson et al., 1998). Allerdings konnte diese These in einer weiterführenden Studie derselben Arbeitsgruppe, in der der Zusammenhang von erhöhten Zytokinspiegeln im kindlichen Blut und der Entwicklung einer Zerebralparese bei sehr kleinen Frühgeborenen (<32. Schwangerschaftswoche) untersucht wurde, nicht bestätigt werden (Nelson et al., 2003). Als weitere Ursache für zerebrale Schädigungen kommen Schädel-HirnTraumata in Betracht. In einer Studie an Rattengehirnen während der frühen Entwicklungsphase zeigte sich infolge eines Schädel-Hirn-Traumas sowohl eine vermehrte exzitotoxische als auch apoptotische Neurodegeneration (Bittigau et al., 2004). Der apoptotische Zelluntergang trat mit einer Latenzzeit von bis zu mehreren Tagen auf und korrelierte mit dem Entwicklungsstadium des Gehirns invers. Je unreifer das Gehirn war, desto infauster war die neuropathologische Prognose. Dies weist darauf hin, dass das Gehirn in 78 frühen Entwicklungsstufen sehr sensitiv auf exogene Reize reagiert und im Vergleich zum reifen Gehirn anfälliger für schädigende Mechanismen ist. Im Gegensatz zu dem schädigenden Einfluss von schwerer Hypoxie auf das Gehirn zeigten Studien an Tiermodellen mit einer kurzzeitigen präkonditionierenden Inkubation unter milder Hypoxie zytoprotektive Effekte (Bergeron et al., 2000, Zhao et al., 2005). Dafür wurden von der Arbeitsgruppe Zhao et al. (2005) schwangere Mäuse für 30 Minuten milden hypoxischen Bedingungen (Sauerstoffgehalt 15%) ausgesetzt. Um zusätzlich den Effekt einer hypoxischen Präkonditionierung auf eine zerebrale Ischämie untersuchen zu können, wurde bei einem Teil der neugeborenen Mäuse 48 Stunden post partum die linke Arteria carotis ligiert. Es zeigte sich, dass die pränatale Präkonditionierung einen positiven Einfluss auf die Mortalitätsrate hatte. Außerdem wiesen die mit Hypoxie vorbehandelten Tiere ein geringeres Maß an apoptotischem Zelluntergang im Bereich des Cortex und des Hippocampus auf. Keine Auswirkung hatte die pränatale Hypoxie auf die zerebrale Expression von eNOS und nNOS, wohingegen die Expression von iNOS aktiviert wurde. Bergeron et al. (2000) untersuchten am Modell der hypoxischen Präkonditionierung die Expression von HIF-1 im neonatalen Gehirn der Ratte. Die Tiere wurden postnatal für 3 Stunden unter Hypoxie bei 8% Sauerstoffgehalt inkubiert. Zusätzlich wurde der Einfluss von zwei HIF-1stabilisierenden Substanzen (Kobaltchlorid und Desferrioxamin) auf das Ausmaß der ZNS-Läsionen im neonatalen Gehirn untersucht. Die Konzentration von HIF-1α stieg nach intraperitonealer Injektion dieser Substanzen signifikant Präkonditionierung mit 1-3 Stunden nach HIF-1-Stabilisatoren Intervention vor einem an. Die hypoxisch- ischämischen Insult zeigte im Vergleich zu Kontrollen ein protektives Potential. Vorliegende Studie untersuchte Hypoxie-induzierbare zerebrale vasoaktive und neurotrophe Regulationsmechanismen des unreifen Gehirns der Maus infolge akuter systemischer Hypoxie. Dabei konzentriert sich diese Arbeit auf Expression und Dynamik HIF-1-regulierter und HIF-1-unabhängiger, Hypoxie- 79 induzierbarer Gene in sehr frühen Entwicklungsphasen des Gehirns bei Mäusen (P0, P7). Das dafür verwendete Tiermodell entspricht nach dem Modell von Dobbing und Sands (1979) (Abb. 5) im Vergleich zum humanen ZNS einem Entwicklungsstadium zu Beginn (23./24.SSW) bzw. gegen Ende des dritten Trimenon (32.-34.SSW). Gegenstand der Studie ist, inwiefern die Expression dieser Gene im neonatalen Gehirn der Maus durch akute systemische Hypoxie beeinflusst wird. Insbesondere werden in dieser Arbeit die Expression von VEGF, iNOS, nNOS, eNOS und Caspase-3 analysiert, wobei die Genexpression mittels TaqMan-Polymerasekettenreaktion am Gehirn der Maus zu den Zeitpunkten P0 und P7 gemessen wurde. Weiterhin war von Interesse, inwieweit die Expression dieser Gene unter akuter Hypoxie durch eine Behandlung mit Levetiracetam als neuroprotektiver Ansatz im neonatalen Gehirn der Maus beeinflusst wird. 4.2. HIF und frühe ZNS-Entwicklung Im Falle einer zerebralen Hypoxie werden nicht nur schädigende Mechanismen, sondern auch endogene Protektionskaskaden aktiviert, die die Sauerstoffversorgung des ZNS sicherstellen und damit Schädigungen am Gehirn begrenzen. Dabei spielt das HIF-System eine herausragende Rolle (Fandrey et al., 2006, Stroka et al., 2001). Als Transkriptionsfaktor induziert HIF die Expression einer Vielzahl von reaktiven Zielgenen, die durch ihre Effekte die erforderliche Sauerstoffversorgung gewährleisten und den toxischen Mechanismen der Hypoxie entgegen wirken (Greijer et al., 2005, Warnecke et al., 2004). In zahlreichen Tiermodellen, die sich mit endogenen Protektionskaskaden infolge zerebraler Hypoxie beschäftigten, wurde mit chronischer Hypoxie gearbeitet (Curristin et al., 2002, Ogunshola et al., 2000). Die Arbeitsgruppe Curristin et al. (2002) untersuchte die neuropathologischen Schäden durch Hypoxie am Gehirn von Mäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Mäuse wurden postnatal unter 9,5%-iger Hypoxie gehalten und zu den Zeitpunkten P3, P4, P6 und P11 untersucht. Dabei zeigten sich Unterschiede 80 in der zellulären und regionalen Empfindlichkeit gegenüber Hypoxie und den Protektionsfaktoren, abhängig vom altersspezifischen Entwicklungsstadium des Gehirns. So setzte der HIF-1-Mechanismus im unreifen Stadium im Vergleich zum reifen Gehirn erst zeitverzögert ein und die gestörte Synaptogenese sowie Vaskulogenese präsentierte sich ausgeprägter. In dem Modell von Ogunshola et al. (2000) wurden aus Mäusegehirnen zum Zeitpunkt E15 neuronale Zellkulturen angelegt, die unter hypoxischen Bedingungen (Sauerstoffgehalt 10%) für 6 Tage inkubiert wurden. Belegt durch mehrere Untersuchungstechniken zeigte sich in dieser Studie ein signifikanter Anstieg von VEGF in den hypoxischen Neuronen verglichen mit normoxischen Kontrollen. Im Gegensatz dazu sind nur begrenzt Daten über Effekte HIF-abhängiger Mechanismen unter akuter systemischer Hypoxie im unreifen Gehirn verfügbar (Kaur et al., 2006). Stroka et al. (2001) verwendeten in ihrer Studie zur HIF-1-Akkumulation unter Hypoxie 4-6 Wochen alte Mäuse, die bei einem Sauerstoffgehalt von 6% für 1-12 Stunden inkubiert wurden. Es zeigte sich eine erhöhte HIF-1-Protein-Konzentration in einer Vielzahl von Organen, wobei im Gehirn die maximale Konzentration von HIF-1 nach 5 Stunden gemessen wurde. Das neonatale Tiermodell von Kaur et al. (2006) beschäftigte sich mit den Schäden in der periventrikulären weißen Hirnsubstanz nach Hypoxie im neonatalen ZNS der Ratte. Dafür wurden P1Ratten für zwei Stunden in einer hypobaren Hypoxiekammer (Luftdruck 350mmHg, pO2 73mmHg) inkubiert und die Gehirne nach 3 und 24 Stunden, 3, 7 und 14 Tagen untersucht. Es zeigte sich eine aktivierte Expression der mRNA von VEGF, HIF-1, eNos, iNOS und nNOS vor allem im Bereich des Corpus callosum. Die Proteinkonzentrationen von VEGF und NO lagen in den 7 bzw. 14 Tage alten Ratten wesentlich höher als in den unreiferen Stadien. Auffällig war zudem, dass die Neurodegeneration elektronenmikroskopisch hauptsächlich in den Gehirnen mit unreifem Entwicklungsstadium (zwischen 3 Stunden und 7 Tagen) detektiert wurde. 81 Diese Erkenntnisse decken sich mit dem Ergebnis vorliegender Arbeit, nach dem eine HIF-1-abhängige gesteigerte zerebrale mRNA-Expression von VEGF nach akuter systemischer Hypoxie zu beiden Zeitpunkten P0 und P7 beobachtet werden konnte. Die Forscher Dobbing und Sands beschäftigten sich in ihren Studien ausführlich mit dem Hirnwachstum verschiedener Spezies, wie Ratten, Schweinen, Affen und Menschen. Im Zeitintervall P7-P14 befindet sich das Nagergehirn in der Phase des maximalen Wachstums und ist sehr vulnerabel durch äußere Schädigungen (Dobbing und Sands, 1979). Diese Kenntnis ist insbesondere zur Testung der Wirkungen neuroprotektiver Substanzen von großer Bedeutung. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit ist die Fragestellung, inwieweit das HIF-1-regulierte Protektionssystem auch im extrem unreifen ZNS als Adaptationsmechanismus nach akuter systemischer Hypoxie eine Rolle spielt. Dafür wurden jeweils spontan geborene Mäuse am ersten Lebenstag (P0) und am siebten Lebenstag (P7) für sechs Stunden in einer Hypoxiekammer mit 8 % Sauerstoff inkubiert. In dem vorliegenden Modell wurde die Expression der mRNA von den HIF-1-abhängigen Genen VEGF und iNOS, sowie von den hypoxieinduzierbaren, HIF-1-unabhängigen Genen nNOS, eNOS und Caspase-3 nach hypoxischer Inkubation analysiert. Die ermittelten Daten unterstützen die Hypothese, dass das HIF-1-System als Reaktionsmechanismus auf akute systemische Hypoxie durch hypoxischen Stress auch im unreifen Gehirn sehr schnell induziert wird. Als bekannter Regulationsmechanismus unter Hypoxie bindet das HIF-1 Protein an die entsprechende Promoterregion im VEGF-Gen und steigert somit die Transkription der VEGF-mRNA (Forsythe et al., 1996). Zusätzlich bewirkt Hypoxie eine Erhöhung der Stabilisierung von VEGF-mRNA. Sobald VEGF an seine spezifischen Rezeptoren bindet, dimerisieren zwei Rezeptoren und es findet eine Autophosphorylierung statt (Ferrara, 2004, Zachary, 2003). Daraufhin werden bestimmte Enzyme aktiviert (Gerber et al., 1998, Ogunshola et al., 2002), die ihrerseits verschiedene intrazelluläre Proteine aktivieren und somit die Gefäßneubildung stimulieren. Unter Hypoxie 82 bewirkt VEGF, vermittelt über seine spezifischen Rezeptoren, zum einen eine Differenzierung und Neuformation von Endothelzellen zu Gefäßen (Ferrara, 2004, Neufeld et al., 1999). Zum anderen reguliert es zusätzlich die mikrovaskuläre Permeabilität, Chemotaxis und anti-apototische Proteine und vermittelt damit zytoprotektive Funktionen (Gerber et al., 1998, Neufeld et al., 1999). Es gibt aus verschiedenen Studien Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang zwischen erhöhten VEGF-Konzentrationen unter Hypoxie und neuroprotektiven Effekten im ZNS (Jin et al., 2000, Ogunshola et al., 2000). Im peripheren Nervengewebe wirkt VEGF nachweislich direkt neurotroph. Es führte zur Ausbildung von Axonen und Schwannzellproliferation (Sondell et al., 1999). Dies zeigten Sondell et al. (1999) in vitro an Zellkulturen. Dafür wurde humanes VEGF in unterschiedlichen Konzentrationen auf periphere Nervenfasern von adulten Ratten lokal appliziert. Nach 72 Stunden konnte mikroskopisch eine gesteigerte Schwannzellproliferation und Neovaskularisation festgestellt werden. Weiterhin wird VEGF von zerebralen Neuronen in vitro und in vivo produziert (Jin et al., 2000, Ogunshola et al., 2002). Jin et al. (2000) untersuchten im Tierversuch die Expression von VEGF im zerebralen Cortex und Hippocampus nach globaler zerebraler Ischämie. Dafür wurden adulten Ratten die Arteriae vertebralis koaguliert und anschließend die Arteriae carotis für 15 Minuten abgeklemmt. Die Analysen des ZNS fanden zu verschiedenen Reoxygenierungszeitpunkten (4, 24, 72 Stunden) nach globaler Ischämie statt. Es zeigte sich eine gesteigerte Expression von VEGF mRNA und Protein im Hippocampus. Immunhistochemisch konnte VEGF Protein nach Reperfusion in zerebralen Cortex-Zellen, vor allem frontal und parietal, sowie in hippocampalen Neuronen nachgewiesen werden. In einem Nagermodell der chronischen Hypoxie von Ogunshola et al. (2000) wurden Ratten unter 10% Sauerstoff inkubiert, und deren Gehirne in verschiedenen Reifestadien (P3-P33) untersucht. Zum einen konnte immunhistologisch eine gesteigerte Vaskularisation des ZNS in den reiferen Entwicklungsstadien (ab P24) im Vergleich zu den normoxischen Kontrolltieren festgestellt werden. Zum 83 anderen zeigten sich nach chronischer Hypoxie erhöhte Proteinkonzentrationen von VEGF im zerebralen Cortex. Interessanterweise traf dies weniger für das unreife Gehirn (P8- P13) zu, sondern wurde erst im reiferen ZNS (P13-P33) demonstriert. Ausgehend von den Regulationsmechanismen der VEGF-Bildung wurde in vorliegendem Modell eine hypoxieinduzierbare, HIF-1-regulierte Zunahme der VEGF mRNA in den Gehirnen der Versuchstiere hypothetisiert. Nach Inkubation unter Hypoxie konnte ein signifikanter Anstieg der Expression der mRNA von zerebralem VEGF in den extrem unreifen Entwicklungsstadien P0 und P7 festgestellt werden. Der signifikante Anstieg der mRNA-Konzentration von VEGF an P0 und P7 lässt auf eine rasche Aktivierung der vasoaktiven HIF-1-regulierten Mechanismen infolge akuter systemischer Hypoxie bereits in sehr frühen Entwicklungsstadien schließen. Die höhere mRNA-Expression von VEGF zum Zeitpunkt P7 im Vergleich zu P0 unter hypoxischen Bedingungen lässt eine Abhängigkeit der vasoaktiven Reaktion vom Entwicklungsstadium des Gehirns vermuten. Dieser Rückschluss steht in Übereinstimmung mit Daten aus tierexperimentellen Modellen anderer Arbeitsgruppen mit unterschiedlichen Hypoxiebedingungen (Kaur et al., 2006, Jin et al., 2000, Ogunshola et al., 2000). Nach Ergebnissen anderer Studien dominieren in Tiermodellen mit chronischer Hypoxie die angiogenen und vasoproliferativen Effekte von VEGF (Ogunshola et al., 2000). In vorliegender Arbeit konnte ein signifikanter Anstieg der mRNA von zerebralem VEGF in unreifen Gehirnen unter akuter Hypoxie nachgewiesen werden. Dies impliziert eine HIF-1-regulierte Modifikation der Gefäßregulation zur Erhaltung der zerebralen Durchblutung unter akuter systemischer Hypoxie. Zur Erhärtung der Hypothese sind weitere Studien zur Analyse von VEGF in Bezug auf neuroprotektive Mechanismen und Gefäßentwicklung unter Hypoxie im unreifen Gehirn im Langzeitverlauf geplant. Die Literaturbeobachtungen über die Effekte von Hypoxie auf die Aktivität der NOS im sich entwickelnden Gehirn sind widersprüchlich (Gonzalez-Barrios et 84 al., 2002, Muramatsu et al., 2000). In einer tierexperimentellen Arbeit mit transienter unteroplazentarer Ischämie von Gonzalez-Barrios et al. (2002) wurde die Expression der mRNA der NOS-Isoformen im Gehirn fetaler Ratten infolge perinataler Hypoxie untersucht. Um bei den Feten eine transiente Ischämie zu erzeugen, wurden bei schwangeren Ratten mit einem Gestationsalter von 17 Tagen die Arteriae unterinae für unterschiedliche Dauer (0, 5, 10, 15, 20 Minuten) abgeklemmt. Es zeigte sich ein zeitabhängiger Anstieg von NO im zerebralen Cortex der fetalen Ratten mit einem maximalen Wert 24 Stunden nach der Ischämie über die Dauer von insgesamt 48 Stunden. 8 Stunden nach Ischämie zeigten sich mittels PCR erhöhte mRNA-Konzentrationen von nNOS und iNOS. Nach 36 Stunden normalisierten sich die Werte für nNOS mRNA, wohingegen die mRNAKonzentrationen von eNOS anstiegen und von iNOS erhöht blieben. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Anstieg der drei NOS-Isoformen nach transienter Hypoxie im zerebralen Cortex neonataler Ratten biphasisch verläuft und unterschiedlichen Regulationsmechanismen unterliegt. In einer Studie von Zhao et al. (2005) zur pränatalen Hypoxie anhand eines Tiermodells bei Ratten konnte ebenso ein Anstieg der iNOS in den neonatalen Gehirnen festgestellt werden. Am Ende der Tragzeit wurden schwangere Ratten unter 15% Sauerstoff für 30 Minuten inkubiert. 48 Stunden nach der pränatalen hypoxischen Exposition wurde bei einem Teil der Neonaten die linke Arteria carotis ligiert und bei 6% Sauerstoff für 3,5 Stunden gehalten. Es zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Proteinkonzentration von iNOS im fetalen Gehirn nach pränataler Hypoxie, wohingegen die Proteinkonzentrationen von eNOS und nNOS nicht beeinflusst wurden. Im Gegensatz dazu fand sich in einer Arbeit von van den Tweel et al. (2005) eine unveränderte Expression von iNOS nach akuter hypoxischer Ischämie in neonatalen Rattengehirnen. Als Modell für Hypoxie im reifen zerebralen Entwicklungsstadium wurde bei neugeborenen Ratten zum Zeitpunkt P17 die rechte Arteria carotis für 60 Minuten ligiert. Anschließend wurden die Tiere bei 8% Sauerstoff für 90 Minuten inkubiert. Die Expression von nNOS, eNOS und iNOS wurden zu verschiedenen Zeitpunkten (0,5, 1, 3, 6, 12, 48 Stunden) 85 nach akuter Hypoxie gemessen. Es zeigte sich ein Anstieg der nNOS Expression im gesamten Gehirn ohne Seitendifferenz der Hemisphären. Die Expression von eNOS in der ischämischen Gehirnhälfte unterschied sich hingegen zu der Gegenseite. Auf der ligierten Seite zeigte sich 0,5 Stunden nach Hypoxie zunächst eine verminderte Expression von eNOS, gefolgt von einem Anstieg nach 6-12 Stunden. Im Gegensatz dazu, wurde in der kontralateralen Hemispäre eine verminderte eNOS Expression eine und 3 Stunden nach Hypoxie festgestellt. Eine veränderte Expression von iNOS zeigte sich weder zu den verschieden Zeitpunkten nach akuter Hypoxie noch im Seitenvergleich der beiden Hemisphären. Mit vorliegender Arbeit konnte eine signifikante Reduktion der mRNAExpression von iNOS unter Hypoxie sowohl in den Gehirnen an P0 als auch an P7 bei Mäusen detektiert werden. Dahingegen zeigte sich keine Veränderung der zerebralen Expression von eNOS und nNOS mRNA nach akuter systemischer Hypoxie an P0 und P7. Tierexperimentelle Studien am fetalen Gehirn der Ratte zeigten, dass iNOS nach einem hypoxischen Ereignis erst mit Verzögerung von mehreren Stunden vermehrt gebildet wird (Iadecola et al. 1996, Gonzalez-Barrios et al., 2002), abhängig vom Entwicklungsstadium des Gehirns. Die Arbeitsgruppe von Iadecola et al. (1996) analysierte die Expression von iNOS nach Hypoxie anhand eines Tiermodells für transiente fokale zerebrale Ischämie. Dafür wurde bei adulten Ratten für zwei Stunden die Arteria cerebri media einseitig occludiert und das Gehirn postischämisch zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht. Während 6 Stunden nach transienter Hypoxie in keiner der beiden Gehirnhälften iNOS mRNA nachgewiesen werden konnte, zeigte sich nach 12 Stunden eine gesteigerte Expression im ischämischen Cortex, die bis zu 48 Stunden anhielt. In der tierexperimentellen Arbeit mit transienter unteroplazentarer Ischämie bei fetalen Ratten von Gonzalez-Barrios et al. (2002) zeigte sich bereits 8 Stunden nach Ischämie eine vermehrte zerebrale Expression der iNOS mRNA, die auch nach 36 Stunden noch nachweisbar war. 86 In vorliegendem Modell wurden die Mäusegehirne in sehr frühen Entwicklungsstadien (P0, P7) direkt nach hypoxischer Inkubation ohne Reoxygenierung untersucht. Dies könnte eine Erklärung für die diskrepanten Ergebnisse sein. Zudem wird iNOS nicht ausschließlich durch Hypoxie, sondern auch durch andere Faktoren, wie zum Beispiel proinflammatorische Zytokine (Moro et al., 2004) reguliert. Eine Interaktion mit diesen Faktoren in vorliegendem Experiment lässt sich nicht vollständig ausschließen und soll in weiteren Analysen untersucht werden. Mehrere tierexperimentelle Arbeiten an neonatalen Ratten und Mäusen (Ferriero et al., 1996, van den Tweel et al., 2005, Shimizu et al. 2007) belegen, dass nNOS, eNOS und Caspase-3 in die Reoxygenierungsmechanismen nach fetaler Hirnschädigung durch Hypoxie involviert sind. Experimente an fetalen Rattengehirnen zeigten, dass zerebrale NOS unter Hypoxie hauptsächlich in vulnerablen Hirnregionen vermehrt exprimiert werden (Gonzalez-Barrios et al., 2002, Muramatsu et al., 2000). In anderen Arbeiten an Rattenmodellen konnte aufgezeigt werden, dass die Aktivierung und Expression von Caspase-3 unter hypoxischen Bedingungen vor allem im unreifen Gehirn 6-48 Stunden nach Hypoxie ansteigt (Blomgren et al., 2007, Liu et al., 2004). In dem Modell von Liu et al. (2004) wurde bei neugeborenen Ratten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (P7, P15, P26, P60) die linke Arteria carotis ligiert. Anschließend wurden die Tiere für 60 Minuten bei 8% Sauerstoff inkubiert. Es zeigte sich sowohl elektronenmikroskopisch als auch histologisch eine gesteigerte Aktivierung des Caspase-3 Proteins im Neocortex und Hippocampus postischämisch, wohingegen im reifen Gehirn (P15, P26, P60) kaum Enzymaktivität nachweisbar war. In vorliegender Arbeit konnte im unreifen Gehirn weder an P0 noch an P7 eine signifikante Veränderung der mittleren mRNA-Konzentration der HIF-1unabhängigen, hypoxieinduzierbaren Gene nNOS, eNOS und Caspase-3 nach hypoxischer Inkubation festgestellt werden. Diese Daten sind vergleichbar mit einer tierexperimentellen Studie von Zhao et al. (2005), in der durch zerebrale Hypoxie die Expression HIF-1-unabhängiger NOS in den 87 Gehirnen neonataler Ratten nicht beeinflusst wurden. Mittels Western-BlotAnalyse konnte gezeigt werden, dass die Expression des iNOS Proteins mit einer Latenzzeit von 3 Stunden anstieg, die Proteinkonzentration von nNOS und eNOS jedoch keine Veränderung aufwies. Eine mögliche Erklärung für die gegensätzliche Datenlage über die zerebrale Expression Hypoxie HIF-1-abhängiger bezüglich dem und HIF-1-unabhängiger Zeitpunkt und der Faktoren Ausprägung nach könnten unterschiedliche experimentelle Bedingungen sein. Modelle chronischer Hypoxie stehen dem Modell der transienten akuten Hypoxie in vorliegender Studie gegenüber. Zudem ist zu unterscheiden, ob die Expression der Gene direkt postischämisch oder nach einer Reoxygenierungsphase untersucht wurden. Desweiteren kann eine unterschiedliche Sauerstoffkonzentration die Expression beeinflussen. 4.4. Effekte von LEV auf essentielle Entwicklungsfaktoren Aufgrund mehrerer tierexperimenteller Studien an Ratten werden für LEV sowohl unter Normoxie als auch unter Hypoxie neuroprotektive Effekte vermutet. Die Arbeitsgruppe Manthey et al. (2005) untersuchte die neuroprotektive Wirkung von LEV unter Normoxie an unterschiedlich alten neugeborenen Rattengehirnen (P0-21). Es wurde LEV in verschiedenen Dosierungen intraperitoneal verabreicht und die Gehirne 24 Stunden, 48 Stunden und 5 Tage nach Intervention histologisch analysiert. Im Gegensatz zum Antikonvulsivum Sultiam zeigten sich nach der Gabe von LEV in jedem zerebralen Entwicklungsstadium (P0-P21) weder neurodegenerative Veränderungen noch neurotoxische Effekte. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit einer Studie von Kim et al. (2007), in der neonatalen Ratten am postnatalen Tag 8 unterschiedliche Dosen (250-1000 mg/kg) von LEV entweder alleine oder in Kombination mit anderen Antiepileptika unter Normoxie intraperitoneal injiziert wurden. 24 Stunden nach Behandlung wiesen die mit LEV behandelten Gehirne verglichen mit Kontrollen keine erhöhte Apoptose-Rate im Bereich des Thalamus, Striatums und Cortex auf. Auch unter Hypoxie konnte an adulten Nagermodellen neuroprotektive 88 Wirkungen von LEV nachgewiesen werden. Dies zeigte eine Arbeit von Hanon und Klitgaard (2001) am Strokemodell der adulten Ratte mit zerebraler Ischämie. Dafür wurde adulten Ratten LEV in verschiedenen Dosen (5,544mg/kg) intraperitoneal verabreicht. 30 Minuten nach der Intervention wurden die Arteriae carotis ligiert und die Gehirne 24 Stunden später zur Untersuchung entnommen. Die Tiere, denen LEV verabreicht wurde, wiesen ein deutlich vermindertes zerebrales Infarktvolumen auf. In einer Dosierung von 44 mg/kg konnte eine Reduktion um 33% erreicht werden. Einen weiteren neuroprotektiven Ansatz von LEV unter Hypoxie lieferte die Arbeitsgruppe Gibbs et al. (2006, 2007). Am tierexperimentellen Modell des Status epilepticus in adulten Ratten zeigte eine Behandlung mit LEV während eines Status epilepticus schützende Effekte vor mitochondrialer Dysfunktion. Die Ratten wurden für zwei Stunden in einen Status epilepticus versetzt. Nach 15 Minuten erfolgte eine intraperitoneale Gabe von LEV in einer Dosis von 200mg/kg und 1000mg/kg. 44 Stunden nach Beendigung des Status epilepticus wurden die adulten Rattengehirne untersucht. Eine Behandlung mit 200mg/kg LEV zeigte keine wesentlichen Auswirkungen, wohingegen eine Dosis von 1000mg/kg LEV mitochondriale Dysfunktion verhinderte und antikonvulsiv war. Dabei bleibt unklar, ob LEV über einen eigenen Mechanismus neuroprotektiv wirkte oder indirekt über die Reduktion der Intensität des Status epilepticus die neurodegenerativen Folgen reduzierte. Eine mögliche neuroprotektive Wirkung von LEV könnte darin bestehen, die durch oxidativen Stress bedingte Reduktion des zellulären Antioxidans Glutathion zu inhibieren (Gibbs et al., 2006) und dadurch sekundär vor mitochondrialer Dysfunktion und den neurotoxischen Konsequenzen zu schützen. Es existieren bislang keine Daten über Effekte von LEV im unreifen hypoxischen Gehirn. Ebensowenig liegen Daten über den Zusammenhang zwischen LEV und zerebralen vasoaktiven und neurotrophen Systemen unter Hypoxie vor. In vorliegender Arbeit wurde der Einfluss von LEV auf die Expression HIF-1-abhängiger und HIF-1-unabhängiger Gene unter hypoxischen und normoxischen Bedingungen untersucht, um einen möglichen 89 neuroprotektiven Effekt von LEV im extrem unreifen Gehirn (P0, P7) von Mäusen zu detektieren. Unter Normoxie konnte nach Verabreichung von 50mg/kg LEV in P0 und P7 keine signifikante Veränderung der Expression der HIF-1-regulierten Gene VEGF und iNOS und der HIF-1-unabhängigen, hypoxieinduzierbaren Gene nNOS, eNOS und Caspase-3 festgestellt werden. Andere tierexperimentelle Studien berichten über einen neuroprotektiven Effekt von LEV unter Normoxie (Manthey et al., 2005, Kim et al., 2007). Die vorliegenden Resultate lassen darauf schließen, dass LEV keinen relevanten Einfluss auf essentielle vasoaktive und neurotrophe Faktoren unter Normoxie hat, das heißt, essentielle Regulationssysteme nicht vermindert. Die durch Hypoxie induzierte Zunahme der Expression der zerebralen VEGF-mRNA (P0, P7) konnte ebenso in den hypoxischen LEV-behandelten Tieren (P0, P7) beobachtet werden. Eine deutliche Reduktion der mRNA-Expression von iNOS wurde bei den unter Hypoxie inkubierten Tieren zum Zeitpunkt P7 nach Verabreichung von 50mg/kg LEV festgestellt. Die Expression der mRNA der HIF-1-unabhängigen, Hypoxie-induzierbaren Faktoren nNOS, eNOS und Caspase-3 unter Hypoxie blieb auch unter dem Einfluss von LEV (P0, P7) unverändert. Diese Resultate lassen vermuten, dass LEV in der hier verwendeten Dosis von 50mg/kg die Hypoxie-induzierten HIF-1-abhängigen und HIF-1-unabhängigen adaptiven Mechanismen im sich entwickelnden Gehirn nicht wesentlich beeinflusst. In anderen tierexperimentellen Studien zeigten sich neuroprotektive Effekte von LEV in einer Dosis zwischen 44-100 mg/kg (Hanon und Klitgaard, 2001, Manthey et al., 2005). In vorliegender Arbeit wurde die LEV Dosis so ausgewählt, dass keine Nebeneffekte wie Ataxie, Hyperaktivität oder Sedierung zu erwarten waren (Gower et al., 1995, Löscher et al., 1993, Löscher et al., 1998). Es liegt eine Studie vor, die auf einen möglichen Dosis-abhängigen protektiven Effekt von LEV auf die mitochondriale Dysfunktion im Status epilepticus in der adulten Ratte hinweist (Gibbs et al., 2006). Die verwendete Dosis war mit 1000 mg/kg allerdings sehr hoch. Erwähnenswert ist, dass der neuroprotektive Effekt von LEV nur bei Gabe während des akuten Status epilepticus, jedoch nicht später bestätigt 90 werden konnte (Gibbs et al., 2007), so dass die Spezifität dieser Beobachtung fraglich ist. Interessanterweise nahm in der vorliegenden Arbeit die Expression von iNOS mRNA in den unreifen Gehirnen der P0-Tiere unter dem Einfluss von LEV nach akuter systemischer Hypoxie nicht ab. Durch iNOS produziertes NO wirkt in niedrigen Konzentrationen neuroprotektiv (Zhao et al., 2005), da es unter Hypoxie durch Vasodilatation die zerebrale Durchblutung aufrechterhalten kann. Unter diesem Aspekt weist LEV möglicherweise neuroprotektive Effekte unter Hypoxie auf, indem es eine Reduktion der Expression von iNOS mRNA verhindert und somit die Aufrechterhaltung der vaskulären Funktionen im unreifen Gehirn unterstützen kann. Hohe Konzentrationen hingegen wirken zytotoxisch (Bolaños et al., 1999, Iadecola, C., 1997). Diese These wird durch tierexperimentelle Studien mit Inhibitoren der NOS unterstützt. Neonatale Ratten, denen ein NOS-Inhibitor verabreicht wurde, wiesen nach zerebraler Hypoxie ein vermindertes Schädigungsvolumen im Gehirn auf (van den Tweel et al., 2002, Iadecola et al., 1996). In der Arbeit von Iadecola et al. (1996) wurde bei adulten Ratten nach einseitiger Ligatur der Arteria cerebri media und Gabe eines Inhibitors der iNOS 6 Stunden nach Ischämie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen eine Reduktion des neocorticalen Infarktgebiets um 32% beobachtet. Die Arbeitsgruppe von van den Tweel et al. (2002) ligierte in ihrer Studie 12 Tage alten Ratten die rechte Arteria carotis und inkubierte diese Tiere bei 8% Sauerstoff für 90 Minuten. Eine Gruppe erhielt zu Beginn der Reoxygenierungsphase einen Inhibitor von nNOS und iNOS intraperitoneal. 6 Wochen nach der Ischämie konnte histologisch eine verminderte zerebrale Schädigung durch Ischämie nach Verabreichung der NOS-Inhibitoren festgestellt werden. Diese Beobachtung ist in Konsens mit Daten von Ferriero et al. (1996). In dieser Arbeit wiesen neonatale Mäuse mit einer Mutation des nNOS-Gens eine verminderte Destruktion der Neuronen im Cortex und Hippocampus nach zerebraler Hypoxie/Ischämie auf. 91 Potentielle Effekte von Hypoxie auf die Blut-Hirn-Schranke (Rees et al., 1998) oder auf Transportersysteme verschiedener Medikamente (Gu et al., 2004) sind bezüglich einer veränderte Pharmakokinetik von LEV im hypoxischen Gehirn zu bendenken. Unter Hypoxie ist die Blut-Hirn-Schranke für bestimmte Substanzen permeabler (Rees et al., 1998), so dass LEV im Vergleich zu normoxischen Bedingungen im hypoxischen Gehirn möglicherweise in höherer Dosierung ins Gehirn gelangen kann. Eine besondere Rolle spielt dieser Mechanismus im unreifen Gehirn, da in frühen zerebralen Entwicklungsstadien die Blut-Hirn-Schranke noch nicht voll funktionsfähig ist (Nelson et al., 1991) und manche Substanzen ungefiltert passieren können. Weitere Studien sind hierzu erforderlich. Um einen signifikanten Effekt von LEV auf iNOS unter oxidativem Stress in Zusammenhang mit dem Entwicklungsstadium des Gehirns beurteilen zu können, sind weitere Analysen der iNOS mRNA-Expression und iNOS Protein-Kinetik unter akuter Hypoxie geplant. 4.3. Ausblick Vorliegende Studie zeigt, dass das HIF-System als wichtiger adaptiver Regulationsmechanismus unter akuter systemischer Hypoxie bereits im unreifen Gehirn der Maus aktiviert wird. Von besonderem Interesse ist, dass in dem vorliegenden Hypoxiemodell eine differentielle Regulation HIF-1- abhängiger und HIF-1-unabhängiger vasoaktiver und neurotropher Faktoren in sehr frühen Entwicklungsstadien des fetalen Mausgehirns zu beobachten war. Dies spricht für eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber systemischer Hypoxie. Weitere Analysen auf Proteinebene sind zur Differenzierung dieser Zusammenhänge von der Arbeitsgruppe geplant. Im untersuchten Modell wurde die Expression von HIF-1-abhängigen und HIF1-unabhängigen Genen durch LEV nicht beeinflusst. Dies lässt vermuten, dass LEV weder unter Normoxie noch unter Hypoxie einen signifikanten Effekt auf die untersuchten endogenen Protektionsmechanismen des unreifen Gehirns aufweist. Diese Beobachtung ist insofern von klinischer Bedeutung, da LEV somit keine toxische Wirkung auf diese endogene Faktoren zeigt. 92 Dies ist vereinbar mit den günstigen Effekten auf die Apoptoserate im unreifen Gehirn, wie in der Literatur vorbeschrieben. Falls sich die Ergebnisse in weiteren Analysen bestätigen lassen, zum Beispiel auch unter chronischer Behandlung neonataler Mäuse, charakterisiert vorliegende Arbeit damit ein weiteres Merkmal der Effekte von LEV am unreifen Gehirn, die auf molekularbiologischer Ebene noch weitgehendst ungeklärt sind. neuroprotektiven Es bedarf Effekt weiterer von LEV Analysen, unter um einen Hypoxie im Entwicklungsstadium des Gehirns der Maus bewerten zu können. möglichen unreifen 93 5. Literaturverzeichnis 1. Acker, T. und Acker, H., (2004). Cellular oxygen sensing need in CNS function: physiological and pathological implications. JEB, 207: 3171-3188. 2. Alderton, W., Cooper, C., Knowles, R., (2001). Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem. J. 358: 593-615. 3. Banasiak, K. und Haddad, G., (1998). Hypoxia-induced apoptosis: effect of hypoxic severity and role of p53 in neuronal cell death. Brain Res., 797: 295-304. 4. Berger, R. und Garnier, Y., (1999). Pathophysiology of perinatal brain damage. Brain Res. Rev., 30: 107–134. 5. Berger, R., Bender, S., Sefkow, S., Klingmüller, V., Künzel, W., Jensen, A., (1997). Peri/intraventricular haemorrhage: a cranial ultrasound study on 5286 neonates. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 75: 191–203. 6. Bergeron, M., Gidday, J., Yu, A., Semenza, G., Ferriero, D., Sharp, F., (2000). Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain. Ann. Neurol., 48: 285-96. 7. Bittigau, P., Sifringer, M., Genz, K., Reith, E., Pospischil, D., Govindarajalu, S., Dzietko, M., Pesditschek, S., Mai, I., Dikranian, K., Olney, J., Ikonomidou, C., (2002). Antiepileptic drugs and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. PNAS, 99: 15089-15094. 8. Bittigau, P., Sifringer, M., Felderhoff-Mueser, U., Ikonomidou, C., (2004). Apoptotic neurodegeneration in the context of traumatic injury to the developing brain. Exp. Toxic. Pathol., 56: 83-89. 9. Blomgren, K., Leist, M., Groc, L., (2007). Pathological apoptosis in the developing brain. Apoptosis, 12: 993-1010. 10. Bolaños, J. und Almeida, A., (1999). Roles of nitric oxide in brain hypoxia-ischemia. BBA, 1411: 415-436. 94 11. Borgström, P., Hillan, K., Sriramarao, P., Ferrara, N., 1996. Complete inhibition of angiogenesis and growth of microtumors by anti-vascular endothelial growth factor neutralizing antibody: novel concepts of angiostatic therapy from intravital videomicroscopy. Cancer Res., 56: 4032-4039. 12. Carli, G., Reiger, I., Evans, N., (2004). One-year neurodevelopmental outcome after moderate newborn hypoxic-ischemic encephalopathy. J. Paediat. Child Health, 40: 217-220. 13. Carmeliet, P., Ferreira, V., Breier, G., Pollefeyt, S., Kieckens, L., Gertsenstein, M., Fahrig, M., Vandenhoeck, A., Harpal, K., Eberhardt, C., Declercq, C., Pawling, J., Moons, L., Collen, D., Risau, W., Nagy, A., (1996). Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature, 380: 435-439. 14. Caro, J., (2001). Hypoxia Regulation of Gene Transcription. High Alt. Med. Biol., 2: 145-154. 15. Chan, P., (2001). Reactive Oxygen radicals in Signaling and Damage in the Ischemic Brain. J. Blood Flow Metabol., 21: 2-14. 16. Charlier, N., Leclere, N., Felderhoff, U., Heldt, J., Kietzmann, T., Obladen, M., Gross, J., (2002). Hypoxia-induced cell death and changes in hypoxia-inducible factor-1 activity in PC12 cells upon exposure to nerve growth factor. Brain Res. Mol. Brain Res., 104: 21-30. 17. Cheng, A., Chan, S., Milhavet, O., Wang, S., Mattson, M., (2001). p38 MAP kinase mediates nitric oxide-induced apoptosis of neural progenitor cells. J. Biol. Chem., 276: 43320-43327. 18. Crowder, K, Gunther, M., Jones, T., Hale, B., Zhang, H., Peterson, M., Scheller, R., Chavkin, C., Bajjalieh, S., (1999). Abnormal neurotransmission in mice lacking synaptic vesicle protein 2A (SV2A). J. Neurobiol., 96: 15268-15273. 95 19. Curristin, S., Cao, A., Stewart, W., Zhang, H., Madri, J., Morrow, J., Ment, L., (2002). Disrupted synaptic development in the hypoxic newborn brain. PNAS, 99: pp. 15729-15734. 20. Debillon, T., Daoud, P., Durand, P., Cantagrel, S., Jouvet, P., Saizou, C, Zupan, V., (2003). Whole-body cooling after perinatal asphyxia: a pilot study in term neonates. Dev. Med. Child Neurol., 45: 17-23. 21. Dobbing, J. und Sands, J., (1979). Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum. Dev., 3: 79-83. 22. Fandrey, J., Gorr, T., Gassmann, M., (2006). Regulating cellular oxygen sensing by hydroxylation. Cardiovasc. Res., 71: 642-651. 23. Felderhoff-Mueser, U., Bittigau, P., Sifringer, M., Jarosz, E., Korobowicz, E., Mahler, L., Piening, T., Moysich, A., Grune, T., Thor, F., Heumann, R., Bührer, C., Ikonomidou, C., (2004). Oxygen causes cell death in the developing brain. Neurobiol. Dis., 17: 273-282. 24. Ferrara, N., (2004). Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress. Endocrine Rev., 25: 581-611. 25. Ferrara, N., Carver Moore, K., Chen, H., Dowd, M., Lu, L., O`Shea, K., Powell Braxton, L., Hillan, K., Moore, M., (1996). Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature, 380: 439-442. 26. Ferriero, D., Holtzman, D., Black, S., Sheldo, R., (1996). Neonatal mice lacking neuronal nitric oxide synthase are less vulnerable to hypoxicischemic injury. Neurobiol. Dis., 3: 64-71. 27. Fong, G., Rossant, J., Gertsenstein, M., Breitman, M., (1995). Role of Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature, 376: 66-70. 28. Forsythe, J., Jiang, B., Iyer, N., Agani, F., Leung, S., Koos, R., Semenza, G., (1996). Activation of Vascular Endothelial Growth Factor 96 Gene Transcription by Hypoxia-Inducible Factor 1. Mol. Cell. Biol., 16: 4604-4613. 29. Gerber, H., Hillan, K., Ryan, A., Kowalski, J., Keller, G., Rangell, L., Wright, B., Radtke, F., Aguet, M., Ferrara, N., (1999). VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development, 126: 1149-1159. 30. Gerber, H., McMurtrey, A., Kowalski, J., Yan, M., Keyt, B., Dixit, V., Ferrara, N., (1998). Vascular Endothelial Growth Factor Regulates Endothelial Cell Survival through the Phosphatidylinositol 3`-Kinase/Akt Signal Transduction Pathway. J. Biol. Chem., 273: 30336-30343. 31. Gerstner, B., DeSilva, T., Genz, K., Armstrong, A., Brehmer, F., Neve, R., Felderhoff-Mueser, U., Volpe, J., Rosenberg, P., (2008). Hyperoxia causes Maturation-Dependent Cell death in the Developing White Matter. J. Neurosci., 28: 1236-1245. 32. Gibbs, J. und Cock, H., (2007). Administrtion of Levetiracetam after prolonged status epilepticus does not protect from mitochondrial dysfunction in a rodent model. Epilepsy Res., 73: 208-212. 33. Gibbs, J., Walker, M., Cock, H., (2006). Levetiracetam: Antiepileptic Properties and Protective Effects on Mitochondrial Dysfunction in Experimental Status Epilepticus. Epilepsia, 47: 469-478. 34. Gonzalez-Barrios, J., Escalante, B., Valdés, J., León-Chávez, B., Martinez-Fong, D., (2002). Nitric oxide and nitric oxide synthases in the fetal cerebral cortex of rats following transient uteroplacental ischemia. Brain Res., 945: 1, 114-122. 35. Gower, A., Hirsch, E., Boehrer, A., Noyer, M., Marescaux, C., (1995). Effects of levetiracetam, a novel antipileptic drug, on convulsant activity in two genetic rat models of epilepsy. Epilepsy Res., 22: 207-213. 36. Greijer, A., van der Groep, P., Kemming, G., Shvarts, A., Semenza, G., Meijer, G., van de Weil, M., Belien, J., van Diest, P., van der Wall, E., (2005). Up-regulation of gene expression by hypoxia is mediated 97 predominantly by hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1). J. Pathol., 206: 291304. 37. Gu, J ., Berkley, A., Anderson, D., Klitgaard, H., Lu, S., Elashoff, M., Ebert, U., Potschka, H., Löscher, W., (2004). The antiepileptic drug levetiracetam sele ctively modifies kindling-induced alterations in gene expression in the temporal lobe of rats. Eur. J. Neurosci., 19: 334-345. 38. Hack, M., Taylor, H., Klein, N., Mercuri-Minich, N., (2000). Functional limitations and special health care needs of 10- to 14-year-old children weighing less than 750 grams at birth. Pediatrics, 106: 554-560. 39. Hanon, E. und Klitgaard, H., (2001). Neuroprotective properties of the novel antiepileptic drug levetiracetam in the rat middle cerebral artery occlusion model of focal cerebral ischemia. Seizure, 10: 287-293. 40. Hintz, S., Kendrick, D., Stoll, B., Vohr, B., Fanaroff, A., Donovan, E., Poole, W., Blakely, M., Wright, L., Higgins, R., (2005). Neurodevelopmental and Growth Outcome of Extremely Low Birth Weight Infants After Necrotizing Enterocolitis. Pediatrics, 115: 696-703. 41. Hobbs, C. und Oorschot, D., (2008). Neonatal Rat Hypoxia-Ischemia: Long-Term Rescue of Striatal Neurons and Motor Skills by Combined Antioxidant-Hypothermia Treatment. Brain Pathol., 18: 443-454. 42. Höffeler, F., (2004). Die Maschinerie der Apoptose. Biol. Unserer Zeit, 34: 16-23. 43. Huttenlocher, P. und Dabholkar, A., (1997). Regional differences in synaptogenesis in human cerebral cortex. J. Comp. Neurol., 387: 167-178. 44. Iadecola, C., (1997). Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain injury. Trends Neurosci., 20: 132-139. 45. Iadecola, C., Zhang, F., Casey, R., Clark, H., Ross, M., (1996). Inducible Nitric Oxide Synthase Gene Expression in Vascular Cells After Transient Focal Ischemia. Stroke, 27: 1373-1380. 98 46. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J., (1999). Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283: 70-74. 47. Ikonomidou, C., Mosinger, J., Olney, J., (1999). Hypothermia enhances protective effect of MK-801 against hypoxic/ischemic brain damage in infant rats. Brain Res., 487: 184-187. 48. Ikonomidou, C., Stefovska, V., Turski, L., (2000). Neuronal death enhanced by N-methyl-D-aspartate antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 12885-12890. 49. Jensen, A., Klingmüller, V., Künzel, W., Sefkow, S., (1992). Das Hirnblutungsrisiko bei Früh- und Reifgeborenen. Geburt u. Frauenheilkunde, 52: 6–20. 50. Jensen, F., (2006). Developmental factors regulating susceptibility to perinatal brain injury and seizures. Curr. Opin. Pediat., 18: 628-633. 51. Jin, K., Mao, X., Nagayama, T., Goldsmith, P., Greenberg, D., (2000). Induction of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1α by global ischemia in rat brain. J. Neurosci., 99: 577-585. 52. Johnston, M., (1995). Neurotransmitters and vulnerability of the developing brain. Brain Dev., 17: 301-306. 53. Johnston, M., Trescher, W., Ishida, A., Nakajima, W., (2000). Novel treatments after experimental brain injury. Semin. Neonatol., 5: 75-86. 54. Kaindl, A., Asimiadou, S., Manthey, D., v.d. Hagen, M., Turski, L., Ikonomidou, C., (2006). Antiepileptic drugs and the developing brain. Cell. Mol. Life Sci., 63: 399-413. 55. Kaminski, R., Matagne, A., Leclercq, K., Gillard, M., Michel, P., Kenda, B., Talaga, P., klitgaard, H., (2008). SV2A protein is a broad-spectrum anticonvulsant target: Functional correlation between protein binding and 99 seizure protection in models of both partial and generalized epilepsy. J. Neuropharmacol., 54: 715-720. 56. Kaur, C., Sivakumar, V., Ang, S., Sundaresan, A., (2006). Hypoxic damage to the periventricular white matter in neonatal brain: role of vascular endothelial growth factor, nitric oxide and excitotoxicity. J. Neurochem., 98: 1200-1216. 57. Kim, J., Kondratyev, A., Gale, K., (2007). Antiepileptic Drug-Induced Neuronal Cell Death in the Immature Brain Effects of Carbamazepine, Topiramate, and Levetiracetam as Monotherapy versus Polytherapy. J. Pharmacol. Exp. Ther., 323: 165-73. 58. Kim, J., Kondratyev, A., Tomita, Y., Gale, K., (2007). Neurodevelopmental impact of antiepileptic drugs and seizures in the immature brain. Epilepsia, 48: 19-26. 59. Klitgaard, H. und Pitkänen, A., (2003). Antiepiletogenesis, neuroprotection, and disease modification in the treatment of epilepsy: focus on levetiracetam. Epil. Disord., 5: 9-16. 60. Klitgaard, H., (2001). Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia, 42: 13-18. 61. Klitgaard, H., Matagne, A., Gobert, J., Wülfert, E., (1998). Evidence for a unique profile ol levetiracetam in rodent models of seizures and epilepsy. Eur. J. Pharmacol., 353: 191-206. 62. Knowles, M., Palacios, M., Palmer, R., Moncada, S., (1989). Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the solube guanylate cyclase. PNAS, 86: 5159-5162. 63. Koch, A., Harlow, L., Haines, G., Amento, E., Unemori, E., Wong, W., Pope, R., Ferrara N., (1994). Vascular endothelial growth factor. A cytokine modulating endothelial function in rheumatoid arthritis. J. Immunol., 152: 4149-4156. 100 64. Kumar, S., (2007). Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ., 14: 32-43. 65. Lin, S., Rhodes, P., Lei, M., Zhang, F., Cai, Z., (2004). Alpha-Phenyl-ntert-butyl-nitrone attenuates hypoxic-ischemic white matter injury in the neonatal rat brain. Brain Res., 1007: 132-141. 66. Liu, C., Siesjö, B., Hu, B., (2004). Pathogenesis of hippocampal neuronal death after hypoxia-ischemia changes during brain development. J. Neurosci., 127: 113-123. 67. Löscher W, Hönack D, Rundfeldt C., (1998). Antiepileptogenic effects of the novel anticonvulsant levetiracetam (ucb L059) in the kindling model of temporal lobe epilepsy. J. Pharmacol. Exp. Ther., 284: 474-479. 68. Löscher, W. und Hönack, D., (1993). Profile of ucb L059, a novel anticonvulsant drug, in models of partial and generalized epilepsy in mice and rats. Eur. J. Pharmacol., 232: 147-158. 69. Lynch, B., Lambeng, N., Nocka, K., Kensel-Hammes, P., Bajjalieh, S., Matagne, A., Fuks, B., (2004). The synaptic vesicle protei SV2A is the binding site fo the antiepileptic drug levetiracetam. PNAS, 101: 9861-9866. 70. Manthey, D., Asimiadou, S., Stefovaska, V., Kaindl, A., Fassbender, J., Ikonomidou, C., Bittigau, P., (2005). Sulthiame but not levetiracetam exerts neurotoxic effect in the developing rat brain. Exp. Neurol., 193: 497-503. 71. Margineanu, D. und Klitgaard, H., (2000). Inhibition of neuronal hypersynchrony in vitro differentiates levetiracetam from classical antiepileptic drugs. Pharmacol. Res., 42: 281-285. 72. Meberg, A. und Broch, H., (2004). Etiology of cerebral palsy. J. Perinat. Med., 32 (5): 434-439. 73. Milligran, D., (1980). Failure of autoregulation and intraventricular haemorrhage in preterm infants. Lancet, 1: 896–898. 74. Moro, M., Cárdenas, A., Hurtado, O., Leza, J., Lizasoain, I., (2004). Role of nitric oxide after brain ischaemia. Cell Calcium, 36: 265-275. 101 75. Muramatsu, K., Sheldon, R., Black, S., Täuber, M., Ferriero, D., (2000). Nitric oxide synthase activity and inhibition after neonatal hypoxia ischemia in the mouse brain. Dev. Brain Res., 123: 119-127. 76. Nathan, C. und Xie, Q., (1994). Regulation of Biosynthesis of Nitric Oxide. J. Biol. Chem., 19: 13725-13728. 77. Nelson, K., Dambrosia, J., Grether, J., Phillips, T., (1998). Neonatal cytokines and coagulation factors in children with cerebral palsy. Ann. Neurol., 44: 665-675. 78. Nelson, K., Grether, J., Dambrosia, J., Walsh, E., Kohler, S., Satyanarayana, G., Nelson, P., Dickens, B., Phillips, T., (2003). Neonatal Cytokines and Cerebral Palsy in Very Preterm Infants. Padiatric Res., 53 (4): 600-607. 79. Nelson, M., Gonzalez-Gomez, I., Gilles, F., (1991). The search for human telencephalic ventriculofugal arteries. AJNR, 12: 215-222. 80. Neufeld, G., Cohen, T., Gengrinovitch, S., Poltorak, Z., (1999). Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J., 13: 9-22. 81. Northington, F., Ferriero, D., Graham, E., Traystman, R., Martin, L., (2001). Early Neurodegeneration after Hypoxia-Ischemia in Neonatal Rat Is Necrosis while Delayed Neuronal Death Is Apoptosis. Neurobiol. Dis., 8: 207-219. 82. Ogunshola, O., Antic, A., Donoghue, M., Fan, S., Kim, H., Stewart, W., Madri, J., Ment, L., (2002). Paracrine and Autocrine Functions of Neuronal Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in the Central Nervous System. J. Biol. Chem., 227: 11410-11415. 83. Ogunshola, O., Stewart, W., Mihalcik, V., Solli, T., Madri, J., Ment, L., (2000). Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain. Dev. Brain Res., 119: 139-153. 102 84. Okamoto, N., Tobe, T., Hackett, S., Ozaki, H., Vinores, M., LaRochelle, W., Zack, D., Campochiaro, P., (1997). Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. Am. J. Pathol., 151: 28191. 85. Pagès, G. und Pouysségur, J., (2005). Transcriptional regulation of the vascular endothelial growth factor gene- a concert of activating factors. Cardiovasc. Res.; 65: 564-573. 86. Palsdottir, K., Dagbjartsson, A., Thorkelsson, T., Hardardottir, H., (2007). Birth asphyxia and hypoxic ischemic encephalopathy, incidence and ostetric risk factors. Laeknabladid, 93: 595-601. 87. Patneau, D., Mayer, M., (1990). Structure-activity relationships for amino acid transmitter candidates acting at N-methyl-D-aspartate and quisqualate receptors. J. Neurosci., 10: 2385-2399. 88. Pisani, F., Cerminara, C., Fusco, C., Sisti, L., (2007). Neonatal status epilepticus vs recurrent neonatal seizures. J. Neurol., 69: 2177-2185. 89. Pringle, A., Benham, C., Sim, L., Kennedy, J., Iannotti, F., Sundstrom L., (1996). Selective N-type calcium channel antagonist omega conotoxin MVIIA is neuroprotective against hypoxic neurodegeneration in organotypic hippocampal-slice cultures. Stroke, 27: 2124-2130. 90. Pyle, R., Schivell, A., Hidaka, H., Bajjalieh, S., (2000). Phosphorylation of synaptic vesicle protein 2 modulates binding to synaptotagmin. J. Biol. Chem., 275: 17195-17200. 91. Rees, S., Mallard, C., Breen, S., Stringer, M., Cock, M., Harding, R., (1998). Fetal Brain Injury Following Prolonged Hypoxemia and Placental Insufficiency: A Review. Comp. Biochem. Physiol., 119: 653-660. 92. Rorke, L., (1992). Anatomical features of the developing brain implicated in pathogenesis of hypoxic-ischemic injury. Brain Pathol., 2: 211–221. 103 93. Rutherford, M., Azzopardi, D., Whitelaw, A., Cowan, F., Renowdens, S., Edwards, A., Thoresen, M., (2005). Mild Hypothermia and the Distribution of Cerebral Lesions in Neonates With Hypoxic-Ischemic Encephalopathy. Pediatrics, 116: 1001-1006. 94. Sarnat, H. und Sarnat, M., (1976). Neonatal encephalopathy following fetal distress. A clinical and electroencephalographic study. Arch. Neurol., 33: 696-705. 95. Schmidt-Kastner, R., van Os, J., Steinbusch, H., Schmitz, C., (2006). Gene regulation by hypoxia and the neurodevelopmental origin of schizophrenia. Schizophr. Res., 84: 253-271. 96. Schoch, H., Fischer, S., Marti, H., (2002). Hypoxia-induced vascular endothelial growth factor expression causes vascular leakage in the brain. Brain, 125: 2549-2557. 97. Schöning, M. und Kehrer, M., (2005). Frühe Hirnentwicklungfunktionelle und morphologische Grundlagen. Aktuelle Neuropädiatrie: 6779. 98. Semenza, G., (2002). Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. Biochem. Pharmacol., 64: 993-998. 99. Semenza, G., (2004). Hydroxylation of HIF-1: Oxygen Sensing at the molecular level. J. Physiol., 19: 176-182. 100. Sharangpani, A., Takanohashi, A., Bell, M., (2008). Caspase activation in fetal rat brain following experimental intrauterine inflammation. Brain Res., 1200: 136-145. 101. Sharp, F. und Bernaudin, M., (2004). HIF1 and oxygen sensing in the brain. J. Neurosci., 5: 437-448. 102. Shimizu, H., Ohgoh, M., Ikeda, M., Nishizawa, Y., Ogura, H., (2007). Caspase-3-Like Protease Activity-Independent Apoptosis at the Onset of neuronal Cell Death in the Gerbil Hippocampus after Global Ischemia. Biol. Pharm. Bull., 30: 1959-1953. 104 103. Siesjö, B. und Siesjö, P., (1996). Mechanisms of secondary brain injury. Eur. J. Anaesthesiol., 13: 247-68. 104. Sondell, M., Lundborg, G., Kanje, M., (1999). Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth, enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. J. Neurosci., 19: 5731-5540. 105. Sonntag, J., Grimmer, I., Scholz, T., Metze, B., Wit, J., Obladen, M., (2000). Growth and neurodevelopemental outcome of very low birthweight infants with necrotizing enterocolitis. Acta Peadiatrica, 89: 528-532. 106. Stroka, M., Burkhardt, T., Desbaillets, I., Wenger, R., Neil, D., Bauer, C., Gassmann, M., Candinas, D., (2001). HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation under systemic hypoxia. FASEB J., 15: 2445-2453. 107. Taylor, D., Edwards, A., Mehmet, H., (1999). Oxidative metabolism, apoptosis and perinatal brain injury. Brain Pathol., 9: 93-117. 108. Trollmann, R., Strasser, K., Keller, S., Antoniou, X., Grenacher, B., Ogunshola, O., Dötsch, J., Rascher, W., Gassmann, M., (2008). Placental HIFs as markers of cerebral hypoxic distress in fetal mice. AJPR, 295: 1973–1981. 109. Valentino, K., Newcomb, R., Gadbois, T., Singh, T., Bowersox, S., Bitner, S., Justice, A., Yamashiro, D., Hoffman, B., Ciaranello, R., Miljanich, G., Ramachandran, J., (1993). A selective N-type calcium channel antagonist protects against neuronal loss after global cerebral ischemia. Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 7894-7897. 110. van den Tweel, E., Nijboer, C., Kavelaars, A., Heijnen, C., Groenendaal, F., van Bel, F., (2005). Expression of nitric oxide synthase isoforms and nitrotyrosine formation after hypoxia-ischemia in the neonatal rat brain. J. Neuroimmunol., 167: 64-71. 111. van den Tweel, E., Peeters-Scholte, C., van Bel, F., Heijnen, C., Groenendaal, F., (2002). Inhibition of nNOS and iNOS following Hypoxia- 105 Ischaemia Improves Long-Term Outcome but Does Not Influence the Inflammatory Response in the Neonatal Rat Brain. Dev. Neurosci., 24: 389-395. 112. Veelken, N., Stollhoff, K., Claussen, M., (1991). Development of very low birth weight infants: a regional study of 371 survivors. Eur. J. Pediatr., 150: 815–820. 113. Villapol, S., Acarin, L., Faiz, M., Castellano, B., Gonzalez, B., (2007). Distinct Spatial and Temporal Activation of Caspase Pathways in Neurons and Glial Cells after Excitotoxic Damage to the Immature Rat Brain. J. Neurosci. Res., 85: 3545-3556. 114. Warnecke, C., Zaborowska, Z., Kurreck, J., Erdmann, V., Frei, U., Wiesener, M., Eckardt, K.-U., (2004). Differentiating the functional role of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α and HIF-2α (EPAS-1) by the use of RNA interference: erythropoietin is a HIF-2α target gene in Hep3B and Kelly cells. FASEB J., 18: 1462-1464. 115. Wiesener, M., Jürgensen, J., Rosenberger, C., Scholze, C., Hörstrup, J., Warnecke, C., Mandriota, S., Bechmann, I., Frei, U., Pugh, C., Ratcliff, P., Bachmann, S., Maxwell, P., Eckardt, K.-U., (2003). Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs. FASEB J., 17: 271-273. 116. Woodward, L., Anderson, P., Austin, N., Howard, K., Inder, T., (2006). Neonatal MRI to predict neurodevelopmental outcomes in preterm infants. N. Engl. J. Med., 355: 685-694. 117. Yang, Z., Covey, M., Bitel, C., Ni, L., Jonakait, G., Levison, S., (2006). Sustained neocortical neurogenesis after neonatal hypoxic/ischemic injury. Ann. Neurol., 61: 199-208. 118. Yuan, F., Chen, Y., Dellian, M., Safabakhsh, N., Ferrara, N., Jain, R., (1996). Time-dependent vascular regression and permeability changes in established human tumor xenografts induced by an anti-vascular 106 endothelial growth factor/vascular permeability factor antibody. Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 14765-14770. 119. Zachary, I., (2003). VEGF signalling: integration and multi-tasking in endothelial cell biology. Bioch. Soc. Trans., 31: 1171-1177. 120. Zagórska A, Dulak J., (2004). HIF-1: the knowns and unknowns of hypoxia sensing. Acta Biochim. Pol., 51: 563-585. 121. Zhao, P. und Zuo, Z., (2005). Prenatal hypoxia-induced adaption and neuroprotection that is inducible Neurobiol. Dis., 20: 871-880. nitric oxide synthase-dependent. 107 6. Abkürzungen • Abb.: Abbildung • ACTH: adreno-corticotropes Hormon • ADM: Adrenomedullin • AMP: Adenosinmonophosphat • AMPA: α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-Propionsäure • AmpERaseUNG: Uracil-N-Glycosylase • AP-1: aktivierendes Protein-1 • APAF-1: Apoptose-Proteasen-aktivierender Faktor-1 • Aqua ad i.: Aqua ad iniecatbilia • Aqua dest.: destilliertes Wasser • ARNT: Aryl-Hydrocarbon-receptor nuclear translocator (nukleärer Aryl- Hydrocarbon-Rezeptor-Translokator) • ATP: Adenosintriphosphat • BH4: Biopterin • bHLH: basisches Helix-Loop-Helix-Protein • bzw.: beziehungsweise • Ca++: Calcium-Ionen • Casp-3: Caspase-3 • Caspase: Cystein-Aspartat-spezifische Protease • CBP: CREB-binding-protein • cDNA: copy-DNA • CREB: cyclic-AMP-response element-binding-protein (responsives c-AMP- Element-bindendes Protein) • CT: cycle treshold (Schwellenzyklus) 108 • C-terminal: Carboxyl-terminal • DEPC: Diethylpyrocarbonat • DISC: death-inducing signal complex (Zelltod-induzierender Proteinkomplex) • DNA: Desoxyribonukleinsäure • dNTP-Mix: Desoxy-Nukleotidtriphosphat-Mix • E: intraunterines Alter in Tagen • EDTA: Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat • eNOS: endotheliale NO-Synthase • EPAS-1: endothelial- PAS domaine- protein-1 (endotheliales PAS- Domänen-Protein-1) • EPO: Erythropoietin • FAD: Flavin-Adenin-Dinukleotid • FAM: 6-Carboxy-Fluorescein • Fas-Ligand: Zelltodrezeptor-Ligand • FGF: fibroblast growth factor (Fibroblasten-Wachstumsfaktor) • FIH-1: factor inhibiting HIF-1 (HIF-1-inhibierender Faktor) • Flk-1: fetal liver kinase receptor-1 (fetaler Leberkinase-Rezeptor-1) • Flt-1: fms-like tyrosine kinase receptor-1 (fms-ähnlicher Tyrosinkinase- Rezeptor-1) • FMN: Flavinmononukleotid • g: Gramm • GABA: Gamma-Amino-Buttersäure • GLUT-1: Glucosetransporter-1 • HIE: Hypoxisch-ischämische Enzephalopathie • HIF: hypoxic inducible factor (Hypoxie-induzierbarer Transkriptionsfaktor) 109 • HLF: HIF-like-factor (HIF-ähnlicher Faktor) • HPLC: Hochleistungschromatographie-Flüssigkeit • HRE: hypoxia-responsive element (Hypoxie-responsives Element) • HRL: HIF-related-factor (HIF-abhängiger Faktor) • HSP 90: Hitzeschockprotein 90 • HuR: humanes Antigen R • Hz: Hertz • ID: inhibitorische Domäne • IF-γ: Interferon-γ • IGF: Insulin-like growth factor (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor) • IL: Interleukin • iNOS: induzierbare NO-Synthase • IPAS: inhibitory PAS-domaine protein (inhibierendes PAS-Domänen-Protein) • IRF-1: Interferon-regulierender Faktor-1 • K+: Kalium-Ionen • KDR: kinase domaine region receptor (Kinase-Domäne-Rezeptor) • LEV: Levetiracetam • LPS: Lipopolysaccharid • mg: Milligramm • MgCl2: Magnesium-Chlorid • ml: Milliliter • mM: Millimol • mmHg: Millimeter Quecksilbersäule • mRNA: messenger-Ribonukleinsäure • MRT: Magnetresonanztomographie 110 • MW: Mittelwert • Na+: Natrium-Ionen • NADPH: reduziertes Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat • NF-κB: nukleärer Faktor- κB • nm: Nanometer • NMDA: N-Methyl-D-Aspartat • nNOS: neuronale NO-Synthase • NO: Stickstoffmonoxid • NOS: NO-Synthase • N-terminal: Amino-terminal • ODD: oxygen dependent degradation-domaine (sauerstoffabhängige Degradations-Domäne) • Oligo dt-Primer: Oligo Desoxythymidin-Primer • O2: Sauerstoff • P: postnataler Tag • PAS: Per-ARNT-Sim-Sequenz • PBGD: Porphobilinogen-Desaminase • PBN: alpha-phenyl-N-tert-butyl-nitron • PCR: polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) • PDGF: platelet-derived growth factor (Plättchen-Derivat-Wachstumsfaktor) • PGE2: Prostaglandin E2 • PI3-Kinase: Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase • PIN: Protein inhibitor NOS (NOS inhibierendes Protein) • PLC-γ: Phospholipase C-γ • pO2: Sauerstoffpartialdruck 111 • Rn-Wert: normalisierter Reporter-Wert • SEM: standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwerts) • Sp1: spezifisches Protein-1 • SSW: Schwangerschaftswoche • SV2A: synaptisches Vesikel Protein 2A • Tab.: Tabelle • TAD: Transaktivierungsdomäne • TAE-Puffer: Tris-Acetat-EDTA-Puffer • TAMRA: 6-Carboxy-Tetramethylrhodamin • TGF-β: transforming growth factor-β (transformierender Wachstumsfaktor-β) • TNF-α: Tumornekrosefaktor-α • TSH: Thyroidea-stimulierendes Hormon • U/µl: Units pro µl (Einheiten pro µl) • U/min: Umdrehungen pro Minute • UTR: untranslated region (nicht-translatierte Region) • V: Volt • VEGF: vascular endothelial Wachstumsfaktor) • VEGFR-1: VEGF-Rezeptor-1 • VEGFR-2: VEGF-Rezeptor-2 • VHL: von Hippel-Lindau Protein • α: alpha • β: beta • γ: gamma • °C: Grad Celsius growth factor (vaskulärer endothelialer 112 • µg: Mikrogramm • µl: Mikroliter 113 7. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Nekrose und Apoptose als Folge zerebraler Ischämie (Chan, P., 2001). ...................................................................................................... 15 Abbildung 2: Struktur von HIF-1α (Charlier et al., 2002). ............................... 19 Abbildung 3: HIF-1α als Sauerstoff-Sensor (Fandrey et al., 2006). ............... 20 Abbildung 4: VEGF-Regulationspfad (Zachary, 2003). .................................. 23 Abbildung 5: Vergleich des „Brain growth spurt” innerhalb verschiedener Spezies (Dobbing and Sands, 1979)....................................................... 37 Abbildung 6: mRNA-Expression von VEGF unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. ......................................................................... 53 Abbildung 7: mRNA-Expression von iNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. ......................................................................... 55 Abbildung 8: mRNA-Expression von nNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. ......................................................................... 57 Abbildung 9: mRNA-Expression von eNOS unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. ......................................................................... 59 Abbildung 10: mRNA-Expression von Caspase-3 unter Hypoxie im Vergleich zu Normoxie an P0 und P7. .................................................................... 61 Abbildung 11: mRNA-Expression von VEGF an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. .................................................................................................. 64 Abbildung 12: mRNA-Expression von iNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. .................................................................................................. 66 Abbildung 13: mRNA-Expression von nNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. .................................................................................................. 69 Abbildung 14: mRNA-Expression von eNOS an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. .................................................................................................. 71 114 Abbildung 15: mRNA-Expression von Caspase-3 an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg(kg; i.p.) im Vergleich unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................................... 73 115 8. Tabellenverzeichnis Tabelle 1 : Klinisch-neurophysiologischer Score nach Sarnat und Sarnat (1976) zur Klassifikation der HIE bei perinataler Asphyxie........................ 7 Tabelle 2: Gesamtzahl der Versuchstiere ...................................................... 39 Tabelle 3: Gesamtzahl der Proben für die mRNA-Analysen .......................... 40 Tabelle 4: Substanzen und Geräte für die RNA-Isolation, photometrische Messung und Gelelektrophorese ............................................................ 42 Tabelle 5: Substanzen und Geräte für die Reverse Transkription ................. 44 Tabelle 6: Forward (for)- und reverse (rev)-Primer und TaqMan-Sonden (taq) ................................................................................................................ 46 Tabelle 7: Substanzen und Geräte für die Durchführung der TaqMan-RT-PCR ................................................................................................................ 49 Tabelle 8: Zerebrale mRNA-Expression von VEGF in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. .................................................... 52 Tabelle 9: Zerebrale mRNA-Expression von iNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. .................................................... 54 Tabelle 10: Zerebrale mRNA-Expression von nNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. ........................................... 56 Tabelle 11: Zerebrale mRNA-Expression von eNOS in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. ........................................... 58 Tabelle 12: Zerebrale mRNA-Expression von Caspase-3 in Relation zu PBGD unter Normoxie und Hypoxie an P0 und P7. ................................ 60 Tabelle 13: Zerebrale mRNA-Expression von VEGF in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................... 63 Tabelle 14: Zerebrale mRNA-Expression von iNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................... 65 Tabelle 15: Zerebrale mRNA-Expression von nNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................... 68 116 Tabelle 16: Zerebrale mRNA-Expression von eNOS in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................... 70 Tabelle 17: Zerebrale mRNA-Expression von Caspase-3 in Relation zu PBGD an P0 und P7 unter dem Einfluss von Levetiracetam (50mg/kg, i.p.) unter Normoxie und Hypoxie. ........................................................................... 72 116 9. Veröffentlichungen • Trollmann, R., Schneider, J., Keller, S., Strasser, K., Wenzel, D., Rascher, W., Ogunshola, O., Gassmann, M., (2008). HIF-1-regulated vasoactive systems are differentially involved in acute hypoxic stress responses of the developing brain of newborn mice and are not affected by levetiracetam. Brain Res., 1199: 27-36. • Trollmann, R., Schneider, J., Wenzel, D., Rascher, W., Ogunshola, O., Gassmann, M., (2007). Effects of levetiracetam on hypoxia-inducible neuroprotective factors in fetal mouse brain. 5th Joint Meeting of the German, Austrian and Swiss Sections of the International League against Epilepsy, Basel, 16.-19.5.2007. Epilepsia, 48: 53. • Trollmann, R., Schneider, J., Wenzel, D., Rascher, W., Ogunshola, O., Gassmann, M., (2007). Hypoxic stress response in developing mouse brain: effects of levetiracetam (LEV) on HIF-1-dependent vasoactive factors. 11th Congress of the European Federation of Neurological Societies (EFNS), Brüssel, 25.-28.8.2007. Eur. J. Neurol., 14: 239. 117 10. Danksagung Hiermit möchte ich mich besonders bei Frau Prof. Dr. med. R. Trollmann für die Bereitstellung des Themas, die gute Betreuung und Motivation bedanken, die mir die Durchführung der Dissertation ermöglicht haben. Desweiteren möchte ich mich bei Jessica Braun für die freundliche Aufnahme im Labor, die gute Einarbeitung in die experimentellen Untersuchungsmethoden und die tatkräftige Unterstützung bedanken. Besonderer Dank gilt meiner Familie, die mir das Medizinstudium und somit die Dissertation erst ermöglicht und mich in meiner bisherigen Laufbahn jederzeit bestärkt und unterstützt hat.
