Gesamte Dissertation_02112010_elektr_Veroeffentlich
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Aus dem Institut für Klinische Chemie der Universität zu Köln Geschäftsführender Direktor: Universitätsprofessor Dr. K. Wielckens Entwicklung einer Methode zur Malignitätstestung monoklonaler Gammopathien: Anreicherung von Plasmazellen aus peripherem Blut und Bestimmung der Telomerase-Expression Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Martin Schenkel aus Köln promoviert am 3.11.2010 1 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter 1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. K. Wielckens 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich keine Unterstützungsleistungen von anderen Personen erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorliegenden Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Eine auszugsweise Veröffentlichung im Rahmen des Jahreskongresses der Deutschen Gesellschaft für klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin im Jahre 2003 wurde durch das Dekanat zuvor schriftlich genehmigt. Köln, 19.4.2010 (Martin Schenkel) 2 Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden von mir eigenständig, nach vorheriger Anleitung durch Herrn Universitätsprofessor Dr. K. Wielckens mit Unterstützung durch die medizinisch-technische-Assistentin Fr. Dagmar Zech durchgeführt. Beiden Personen möchte ich in diesem Rahmen für die anregenden Gespräche und die außergewöhnlich gute Zusammenarbeit danken. 3 Meinen Eltern gewidmet 4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................... 7 1. Einleitung ................................................................................................................ 9 1.1 Monoklonale Gammopathien ............................................................................ 9 1.2 Das Plasmozytom ........................................................................................... 11 1.2.1 Pathogenese des Plasmozytoms ............................................................. 14 1.3 Der Oberflächenmarker CD 138 ..................................................................... 15 1.4 Telomere und Telomerase .............................................................................. 17 1.5 Telomerasemessung mit dem Lightcycler ....................................................... 19 1.6 Ziel .................................................................................................................. 21 2. Material ................................................................................................................. 23 2.1 Allgemeine Labormaterialien ........................................................................... 23 2.2 Materialien zur Zellkultur ................................................................................. 23 2.3 Materialien zur Immunmagnetischen Separation ............................................ 24 2.4 Durchflussytometrie ........................................................................................ 24 2.5 RNA Isolation .................................................................................................. 24 2.6 Echtzeit PCR ................................................................................................... 25 3. Methoden.............................................................................................................. 27 3.1 Modellsystem .................................................................................................. 27 3.2 Zellkultur ......................................................................................................... 27 3.3 Bereitstellung des Untersuchungsmaterials .................................................... 30 3.4 Isolation der CD 138 positiven Zellen.............................................................. 31 3.5 Die Immunfluoreszenz-Kontrolle mittels Durchflusszytometrie ....................... 33 3.6 Messung der Telomerase ............................................................................... 35 3.6.1 RNA-Isolation ........................................................................................... 36 3.6.2 Polymerase-Chain-Reaction (PCR) am Lightcycler .................................. 37 4. Ergebnisse............................................................................................................ 40 4.1 Charakterisierung der NCI-H929 Zellen und anderer Zelllinien....................... 40 4.2 Entwicklung eines Modells zur Aufreinigung zirkulierender Plasmazellen ...... 42 4.3 Stabilität der h-TERT-mRNA in vivo ................................................................ 42 4.4 Optimierung der Zellseparation ....................................................................... 43 5 4.4.1 Austestung der optimalen MicroBeads-Menge ......................................... 43 4.4.2 Versuch der Sensitivitätssteigerung über Lysieren der Erythrozyten........ 44 4.4.3 Anreicherung der mononukleären Zellen mittels Ficoll 400 ..................... 45 4.5 Optimierung des Telomerase-Nachweises ..................................................... 46 4.6 Bestimmung der optimalen Blutmenge ........................................................... 49 4.7 Aufarbeitungsprotokoll .................................................................................... 50 4.8 Telomeraseexpression bei Gesunden, Patienten mit MGUS und Plasmozytompatienten .......................................................................................... 52 4.8.1 Gesunde Probanden ................................................................................ 52 4.8.2 Plasmozytompatienten ............................................................................. 53 4.8.3 Patienten mit Monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) ............................................................................................................. 55 4.9 Zusammenfassung der Ergebnisse................................................................. 56 5. Diskussion ............................................................................................................ 57 6. Zusammenfassung ............................................................................................... 61 7. Literaturverzeichnis............................................................................................... 63 8. Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 70 9. Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 71 10. Lebenslauf .......................................................................................................... 72 6 Abkürzungsverzeichnis A Adenin BB Blutbild CD Cluster of Differentiation der Zelloberflächenantigene Cl Chlor c-myc Zelluläres Myc-Onkogen CO2 Kohlendioxid cyCD Zytoplasmatischer CD DMSO Dimethylsulfoxid EDTA Ethylendiamintetraacetat FCS Fetal calf serum FITC Fluoreszeinisothiocyanat FRET Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer FSC Forward light scatter G Guanin Hb Hämoglobin Ig Immunglobulin KM Knochenmark Krea-Clearance Kreatininclearance LC Light Cycler LED Light Emitting Diode = Leuchtdiode Lsg. Lösung MACS Magnetic Cell Separation MGUS Monoklonalen Gammopathie unklarer Signifikanz MM Multiples Myelom PBGD Porphbilinogen Deaminase PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Kettenreaktion PE R-Phycoerythrin Prä-B-Zelle Vorläuferzellen der „bone marrow“ Lymphozyten RAS RAS-Proto-Onkogen nach „rat sarcoma“ 7 RPMI-1640 “Roswell Park Memorial Institute” Zellkulturmedium sCD Oberflächen „surface“ CD SSC Sideward light scatter Stk. Stück syn. Synonym T Thymin TERT Telomerase reverse transcriptase Thromb. Thrombozyten 8 1. Einleitung 1.1 Monoklonale Gammopathien Das Krankheitsbild der monoklonalen Gammopathie fällt in der Regel durch eine Anomalie der Serumelektrophorese auf. Hierbei kommt es zur Überproduktion von Immunglobulinen aus einem Plasmazellklon. In der überwiegenden Mehrzahl wird Immunglobulin (Ig) G (60%) sezerniert, gefolgt von IgA und IgM mit 18% und 14%. IgD, IgE, Bence-Jones oder biklonale Gammopathien , die eher selten nachzuweisen sind (1). Monoklonale Gammopathien sind kein seltener Befund: Mit einer Inzidenz von 500 pro 100.000 Einwohner und Jahr können sie bei einer ganzen Zahl von heterogenen Erkrankungen und ebenfalls beim Gesunden auftreten. Sie sind stark altersabhängig, wobei das Risiko mit zunehmendem Alter stark ansteigt. So kann eine monoklonale Gammopathie bei 0,1 - 0,3% der unter 70 jährigen Patienten nachgewiesen werden. Das Risiko steigt zwischen dem 70. und 95 Lebensjahr auf 1 - 3% an, und erreicht bei den >95 jährigen 19%. Abbildung 1: Immunfixation eines Plasmozytompatienten IgG-Gammopathie mit Kappa-Leichtketten-Sekretion Man muss zwischen malignen Formen und nicht maligne verlaufenden Monoklonalen Gammopathien unklarer Signifikanz ( MGUS ) unterschieden. Bezogen auf die Gesamtheit aller monoklonalen Gammopathien entfallen 90% auf die nicht maligne MGUS. Bei Patienten, welche jünger als 40 Jahre sind, sind Gammopathien eher 9 selten und sind fast immer Ausdruck eines malignen Geschehens. Zur Diagnosestellung wird eine Serumelektrophorese durchgeführt, die üblicherweise eine M-artige Konfiguration aufweist und somit auch bildlich als M-Gradient bezeichnet wird. Ergibt sich in der Serumelektrophorese der Anhalt für eine Monoklonalität, wird in der Regel eine Immunfixation durchgeführt, welche einen sicheren Nachweis bis zur Untergrenze von 20-30mg/l ermöglicht. Neben der oben genannten MGUS existieren ebenfalls passagere Gammopathien bei Infekten oder als Begleitgammopathien im Rahmen einer anderen systemischen Erkrankung. Hierbei sind besonders Erkrankungen des hämatopoetischen Systems oder ein Zustand nach Organtransplantationen zu nennen. Die Diagnose einer MGUS darf erst nach sorgfältigem Ausschluss eines Plasmozytoms erfolgen. Dies erfordert neben der bereits erwähnten Labordiagnostik ebenfalls eine radiologische Untersuchung des Skelettsystems und eine Knochenmarksdiagnostik. M-Protein konstant unter 30 mg / l 90 % der M-Proteine gehören der IgG-Klasse an Fehlen einer deutliche Bence-Jones-Proteinurie (< 0,5 g /d) Keine histopathologischen Anomalien der Plasmazellen im Knochenmark Niedriges β2-Mikroglobulin im Serum ( < 3,0 mg / l ) Fehlen von Osteolysen und unauffälliges MRT der Wirbelsäule Fehlen einer Anämie, Niereninsuffizienz oder Hyperkalzämie Verlaufsbeobachtung über ein Jahr ohne maligne Tranformation Tabelle 1: Diagnosekriterien für eine MGUS Im Verlauf von 10 Jahren entwickeln 20 % der Patienten mit einer gesicherten MGUS ein Plasmozytom. Diese „Normanomalie“ ist somit als eine fakultative Präkanzerose zu sehen. In der Arbeit von Kyle (28) konnte ebenfalls ein eindeutiger Zusammenhang zwischen Paraproteinkonzentration und Entartungsrisiko über ein 10-JahresIntervall nachgewiesen werden. 10 Relatives Risiko in % 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Paraprotein [g/dl] Abbildung 2: 10-Jahresrisiko für die Entwicklung eines Plasmozytoms Relatives Risiko für die Entwicklung eines Plasmozytoms in Abhängigkeit von den gemessenen Praproteinkonzentrationen im peripheren Blut (27) 1.2 Das Plasmozytom Der bedeutendste Vertreter der malignen Form der Gammopathie ist das Plasmozytom, auch Multiples Myelom ( MM ) oder Morbus Kahler genannt. Hierbei handelt es sich um eine lymphoproliferative Systemerkrankung bei der es zur monoklonalen Proliferation von Plasmazellen oder deren Vorstufen (B-Lymphozyten in terminaler Differenzierung) kommt. Diese produzieren ein monoklonales Immunglobulin („Paraprotein“) oder dessen Bruchstücke, wobei es häufig zur Sekretion von IgG, IgA, IgD und IgE und/oder deren Bruchstücken mit ähnlicher Verteilung wie bei der MGUS kommt. Die Sekretion von IgM durch ein Plasmozytom ist äußerst selten. Dem gegenüber ist eine übermäßige IgM-Sekretion häufig mit einem Morbus Waldenström assoziiert. Hierbei kommt es ebenfalls zur klonalen Sekretion von Immunglobulinen (IgM) durch plasmazellulär differenzierte B-Lymphozyten, wobei der Krankheitsverlauf deutlich gutartiger ist als bei einem Plasmozytom. Komplikationen durch Metastasierung kommen praktisch nicht vor. Führend bei einem weiteren Voranschreiten sind die Verdrängung der Hämatopoese aus dem Knochenmark und die sich daraus ergebenen Symptome. Eine nur sehr langsam progrediente Form des Plasmozytoms mit weitestgehend stabilen Laborparametern bezeichnet man auch als „smouldering Myeloma“ (Tabelle 2). Neben dem Plasmozytom und der bereits erwähnten Makrog11 lobulinämie Waldenström ist noch die Schwer-Ketten-Krankheit als Differenzialdiagnose zu nennen, die hier nur der Vollständigkeit halber erwähnt wird. Hierbei handelt es sich ebenfalls um eine Systemerkrankung, bei der die schweren Ketten der Immunglobuline in großen Mengen sezerniert werden. Parameter MGUS “smouldering Myeloma” BB [Hb] [Thromb.] normal normal KM-Plasmazellen < 10 % 10 – 30 % > 30 % < 3 g/dl > 3 g/dl, stabil > 3 g/dl, steigend <= 1 g/24h <= 1 g/24h > 1 g/24h normal oft ↓ ↓ Serumkalzium [Ca2+] normal normal oft ↑ Osteolysen nein selten ja nein nein oft Klinische Symptome nein nein Schwäche, Schmerzen 10-Jahres-Verlauf 20-30% → Plasmozy- M-Gradient der Serumelektrophorese BENCE-JONES-Protein Übrige Serum-Ig [IgG],[IgA],[IgM] Niereninsuffizienz [Kreatinin], Krea-Clearance tom stabil Plasmozytom oft Anämie, Panzytopenie möglich aggressiver Verlauf, Chemotherapie erforderlich Tabelle 2: Befunde unterschiedlicher Stufen der Plasmozytomentwicklung Das Plasmozytom ist ein malignes Non-Hodgkin-Lymphom, welches auf einer malignen Transformation und Proliferation von B-Zellen (Plasmazellen) beruht. Es umfasst ca. 1% aller malignen Erkrankungen und 10% aller hämatologischen Malignome. Die Inzidenz beträgt 3 pro 100.000 Einwohner und Jahr mit einem Häufigkeitsgipfel zwischen dem 55. und 75. Lebensjahr. Bezüglich Lokalisation und Wachstum sind ca. 80% der Myelome diffus intramedullär wachsend. Nur 4% besitzen extramedulläre Proliferationsorte. Die mediane Lebenserwartung nach Diagnosestellung liegt zwischen 30 und 40 Monaten, wobei diese stark je nach Lokalisation und Wachstumsverhalten variieren kann. Im Falle eines unreifzelligen Plasmozytoms liegt die mediane Überlebenszeit nach Diagnosestellung nur noch bei 12 – 20 Monaten. Männer erkranken 1,5-mal häufiger als Frauen (4). Die Erkrankung kann verschiede12 ne Phasen durchlaufen. Den Beginn bildet eine inaktive Phase, in der die Tumormasse aus reifen, nicht proliferierenden Plasmazellen besteht. Hierauf folgt die aktive Phase, in der ein kleiner Anteil der Tumormasse von proliferierenden unreifen Plasmazellen (Plasmazellblasten) gebildet wird. Diese geht über in die fulminante Phase, bei der es zur extramedullären Ausbreitung des Tumors kommt und eine Zunahme der undifferenzierten, proliferierenden Plasmazellblasten zu beobachten ist (16). Analog zu diesen pathologischen Veränderungen lässt sich die Einteilung von Durie und Salmon (11) verstehen. Hierbei handelt es sich um eine Stadieneinteilung anhand klinischer Befunde. Stadium I (<0,6 x 1012 Tumorzellen/m2 Körperoberfläche) Erfüllung aller 4 Kriterien: • • • Hb >10 g/dl Serumkalzium normal radiologisch normales Skelett oder nur ein solitär im Knochen lokalisiertes Plasmozytom • Stadium II Stadium III (>1,2 x 1012 Tumorzellen/m2 Körperoberfläche) geringe Konzentration monoklonaler Immunglobuline: IgG <5000 mg/dl IgA <3000 mg/dl • Leichtketten im Urin <4g/24h weder zu Stadium I noch zu II passend Erfüllung eines oder mehrerer der folgenden Kriterien: • • • • Hb <8,5 g/dl Serum-Kalzium erhöht radiologisch fortgeschrittene Osteolysen hohe Konzentrationen monoklonaler Immunglobuline: IgG >7000 mg/dl IgA >5000 mg/dl • Leichtketten im Urin >12g/24h Tabelle 3: Stadieneinteilung nach Salmon und Durie (1975) Einteilung der Plasmozytomstadien nach klinischen Befunden. Es werden zusätzlich noch der Zusatz „A“ bei einem Serum-Kreatininwert <2mg/dl und „B“ bei Serum-Kreatinin >2mg/dl vergeben. Zum Tode führen zumeist Infekte aufgrund der bestehenden Immundefizienz, eine progrediente Niereninsuffizienz, nicht stillbare Blutungen sowie die Folgen der auftretenden Anämie. Die Erkrankung ist in der Regel aufgrund der späten Diagnosestel13 lung und des hohen Alters nicht mehr heilbar. Es lässt sich jedoch bei frühzeitiger Diagnosestellung und aggressiver Therapie (Hochdosis-Chemotherapie mit Knochenmarkstransplantation) eine deutliche Verlängerung des mittleren Überlebens erreichen (14). Dies zeigt, dass eine frühzeitige Diagnosestellung einen erheblichen Einfluss auf die therapeutischen Optionen und die damit verbundene Prognose hat. 1.2.1 Pathogenese des Plasmozytoms Die Ätiologie der Erkrankung ist weitgehend unbekannt. Ionisierenden Strahlen sowie chemische Noxen scheinen für die Pathogenese eine Rolle zu spielen. Es fanden sich gehäuft Fälle einer Plasmozytomerkrankung unter Arbeitern in der Metallindustrie (13) sowie familiäre Häufungen. Die Ursprungszelle des Plasmozytomzellklons ist letztlich ungeklärt. Es wurden Merkmale früher B-Zellen in Plasmozytomklonen wie beispielsweise das Oberflächenmolekül CD 10 gefunden. Daher wurde postuliert, dass dem Plasmozytom ursprünglich die Entartung einer Prä-B-Zelle zu Grunde liegen könnte (31; 21; 46). Diese sind zirkulierende abnorme B-Zellen (Prämyelomzellen), die im Knochenmark oder in lymphatischen Geweben gebildet wurden und sich später wieder im Knochenmark niederlassen. Hier erfolgt nun das eigentliche Tumorwachstum, welches durch verschiedene Zytokine und zelluläre Interaktionen stimuliert wird (24). Hierbei scheint das Interleukin 6 eine besondere Rollen zu spielen. Phänotypisch ähneln Plasmozytomzellen reifen langlebigen Plasmazellen. Untersuchungen des Genoms von Plasmozytomzellen zeigen, dass diese somatisch hypermutierte Ig-Gene besitzen. Daraus folgt, dass die Reifungsphase der somatischen Hypermutation wie bei reifen langlebigen Plasmazellen bereits durchlaufen wurde (2; 50). Ebenso weisen die meisten Patienten Translokationen auf, welche bewirken, dass ein Onkogen unter die Kontrolle eines regulatorischen Gens gelangt. Dieses Onkogen wird anschließend aktiviert. Beim Plasmozytom handelt es sich am häufigsten das Immunglobulin-Enhancer-Gen auf Chromosom 14q31 (ca. 80%). Diese Translokation ist häufig mit einer Translokation von Teilen des Chromosoms 4 (4p16.3; Fibroblast Growth Factor Receptor), Chromosom 6 (6p21; Cyclin D3), 11 (Bcl-1, Cyclin D1), 20 (20p11; maf8), und 16 (16q23; C-maf) vergesellschaftet. Seltener findet man 8q24 (c-myc) und noch seltener 18q21 (bcl-2), 11q23 (MLL-1) sowie 20q11 (maf B) - Translokationen. So wurden unterschiedliche Krankheitsverläufe beschrieben, welche mit bestimmten Genaberationen assoziiert zu sein scheinen. Kau14 salitäten, insbesondere in Bezug auf Begleiterkrankungen, konnten jedoch noch nicht eindeutig identifiziert werden. So findet sich beispielsweise eine verringerte Lebenserwartung in Zusammenhang mit einer Deletion des Chromosoms 13 (Monosomie 13). 1.3 Der Oberflächenmarker CD 138 Der Immunphänotyp von Plasmozytomzellen ist sehr heterogen. Der Plasmozytomzellklon besteht aus einem Kontinuum von Zellen mit unterschiedlichen Charakteristika, abhängig von ihrem Reifegrad, ihrer Wachstumspotenz und dem Stadium der Krankheitsentwicklung. So können entsprechend der Möglichkeit einer gewissen Ausdifferenzierung der Plasmozytomzellen verschiedene Plasmozytomzellpopulationen sogar innerhalb eines Individuums identifiziert werden. Bei CD 138 (syn. Syndecan 1) handelt es sich um eine Heparan-Sulfat-Proteoglycan, welches in der Zellwand terminal differenzierter Plasmazellen und Plasmozytomzellen zu finden ist. Dieser Oberflächenmarker findet sich ebenfalls auf Epithelzellen, Mesenchymzellen sowie auf Lymphozyten während des Reifungsvorganges. Insbesondere im Rahmen von Infektionen, sowie bei einem Teil von MGUS-Erkrankten sind frei zirkulierende Plasmazellen in bis zu 19% der Fälle nachweisbar (26). Diese Plasmazellen sind ebenfalls isolierbar, haben jedoch (noch) keine maligne Transformation durchlaufen. CD138 ist ein Proteoglycan, welches sowohl aus Heparan- als auch aus ChondroitinGlycosaminoglycan (GAG) – Ketten bestehen kann. 15 Abbildung 3: Transmembrane Struktur von CD 138 (n. Wijdenes et al)(53) Die extrazelluläre Domäne besteht aus 5 verschiedenen Glycosaminoglycan-Gruppen. Am CTerminalen Ende erfolgt die proteasevermittelte Signalübertragung. Hauptaufgabe ist neben einer Adhäsionsfunktion die Vermittlung von Proliferationsprozessen. In der älteren Literatur wird der Antikörper gegen CD 138 auch als B-B4 bezeichnet. Seit seiner Entdeckung 1996 durch Wijdenes et al. bieten sich verschiedene diagnostische und zuletzt auch therapeutische Ansätze zur Nutzung dieses Oberflächenmarkers. So wurden neben einer Fluoreszenzmarkierung von CD138Antikörpern, welche auch in unseren Versuchen Verwendung fand, zuletzt eine Verknüpfung an Maytansinoid DM1 (N(2')-deacetyl-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropyl) maytansine) durchgeführt, welches als experimenteller Therapieansatz beim Plasmozytom der Maus angewendet wurde. (48). 16 Einer der am häufigsten vorkommenden weiteren Membranrezeptoren des Plasmozytoms ist das Antigen CD 38, welches in der Regel auf Plasmazellen, Plasmozytomzellen sowie bei der Plasmazell-Leukämie deutlich exprimiert wird, während die Expression auf aktivierten T-Lymphozyten und Monozyten nur schwach ausgeprägt ist . In der untenstehenden Tabelle 4 wurden die wesentlichen Oberflächenmarker der B-lymphozytären Entwicklung dargestellt. Der Oberflächenmarker CD 138 verschwindet erst bei Apoptose von der Zelloberfläche der Plasmazellen. Stammzelle Pro-B-Zelle Prä-B-Zelle Intermediäre B-Zelle Reife B-Zelle Plasmazelle TdT TdT TdT - - - HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR (HLA-DR) CD34 CD34 (CD34) - - - CD19 CD19 CD19 CD19 (+)/- CD20 CD20 CD20 - cyCD22 sCD22 sCD22 sCD22 - CD10 CD10 - - - cyIg sIg sIg cyIg CD5 FMC7 CD38 CD138 Verteilung der physiologisch vorkommenden Oberflächenantigene (modifiziert nach (33) ) cy = cytoplasmatic; s = surface Tabelle 4: Oberflächenmarker der B-lymphozytären Entwicklung 1.4 Telomere und Telomerase Die Endabschnitte humaner Chromosomen werden von Telomeren gebildet, die aus tausendfacher Wiederholung der Sequenz 5’-TTAGGG-3’ bestehen und vor Rekombination und Degradation schützen (5). In normalen somatischen Zellen kommt es bei jeder Zellteilung zum Verlust eines Teils der Telomere. Diese Verkürzung entsteht durch die Tatsache, dass die DNA-Polymerase des Menschen nur von 3’ in 5’Richtung arbeiten kann. Es kommt zur Anlagerung von Okazaki-Fragmenten, wobei 17 am 5’-Ende des komplementären Stranges eine Sequenz nicht amplifiziert werden kann. 3‘ 5‘ Chromosomen-Ende 3‘ 5‘ 3‘ 5´ 5´ 3´ Abbildung 4: Funktionsweise der menschlichen DNA-Polymerase Durch Bildung der Okazaki-Fragmente kommt es am Chromosomen-Ende zum Verlust von Gen-Substanz. Diese replikationsbedingte Telomerverkürzung führt nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen zu instabilen Chromosomen und schließlich zur replikativen Seneszenz. Auslöser für diesen Proliferationsstillstand ist dabei der unzureichende Schutz der Chromosomen durch die zu kurzen Telomere. Im Gegensatz zu differenzierten somatischen Zellen erreichen Stammzellen eine unbegrenzte Teilungsfähigkeit durch die Neutralisierung der replikationsbedingten Telomerverkürzung. In diesen Zellen ersetzt das Ribonukleoprotein Telomerase die verlorenen Sequenzen. Mittels reverser Transkription synthetisiert die Telomerase eine DNA-Kopie seines RNA-Strangs, der ein essentieller Bestandteil des Holoenzyms ist, direkt an das 3’-Ende der Chromosomen. Neben der RNA-Komponente besteht der Telomerasekomplex aus mehreren Proteinen, von denen die Expression der katalytischen Untereinheit TERT (engl. für „telomerase reverse transcriptase“) aktivitätsbestimmend ist. Es besteht die Möglichkeit, die Telomerase über die Enzym-Aktivität oder über eine PCR der Telomerase-codierenden mRNA zu bestimmen. Insbesondere aufgrund der ersten Befunde einer hohen Telomeraseaktivität in Karzinomen (22), nicht aber in normalen Geweben, meinte man einen neuen „Malignitäts“-Marker gefunden zu haben. Es war zwar möglich, Telomerase auch in einigen wenigen nicht malignen Geweben nachzuweisen, doch war die Aktivität hier wesentlich geringer als in ihren jeweiligen malignen Gegenstücken, so dass man die Aktivität der Telomerase in einem 18 Zusammenhang zur malignen Transformation sehen kann. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Forschungsgruppen (6) implizieren, dass ca. 90% aller bekannten Tumore Telomerase in großer Menge exprimieren. In gesunden Plasmazellen ist nie eine Telomeraseaktivität gefunden worden. In unserer Versuchsanordnung benutzen wir daher die Telomerase als Marker für eine maligne Transformation der Plasmazelle (56). Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Plasmozytom-Zelllinien als auch Plasmazellen aus dem Knochenmark Plasmozytom erkrankter Patienten eine deutliche Telomeraseaktivität aufweisen (55). Die aus dem Knochenmark gewonnenen Zellen von Patienten mit einer gesicherten MGUS zeigten im Gegensatz zu isolierten Plasmozytomzellen keine erhöhte Telomeraseaktivität (56). Mehr noch konnte gezeigt werden, dass in einer Untersuchung an 183 Plasmozytompatienten eine hohe Telomeraseaktivität in den Zellen signifikant mit einer erheblich eingeschränkten Prognose vergesellschaftet ist (55). Alle diese genannten Studien wurden jedoch an Knochenmarksaspiraten durchgeführt. Der Nachweis einer Telomeraseexpression bei Tumoren ist zur Zeit Gegenstand intensiver Forschungen. So sind ebenfalls Angriffe auf die Funktion der Telomerase (49) als therapeutische Option im experimentellen Bereich an verschiedenen Zelllinien vielversprechend. 1.5 Telomerasemessung mit dem Lightcycler In dieser Studie benutzten wir das quantitative PCR-System Lightcycler der Firma Roche. Hierbei werden DNA-Fragmente amplifiziert sowie durch Fluoreszenz detektiert und quantifiziert. Die Quantifizierung erfolgt nach folgendem Prinzip: Die Anzahl von PCR-Zyklen zur Erreichung einer bestimmten Produktmenge verhält sich über weite Bereiche proportional zur Menge des Ausgangsmaterials. Die Verwendung von „Hybridisation Probes“ ermöglicht die spezifische Detektion von PCRProdukten, unspezifische Produkte und Primerdimere werden nicht detektiert. Bei den Sonden handelt es sich stets um ein Sondenpaar mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, welches in unmittelbare Nähe (Abstand von 1-10 Basen) zueinander an das PCR-Produkt bindet. Die Donor- oder auch Ankersonde ist am 3´-Ende mit dem Farbstoff Fluoreszein markiert, während die Akzeptor- bzw. Detektionssonde einen roten Farbstoff (LC Red 640 oder LC Red 705) am 5´-Ende trägt. Bei Bindung 19 der Sonden an das PCR–Produkt kommt es zum Fluoreszenz-Resonanz-EnergieTransfer (FRET): Der Farbstoff der Donorsonde wird von der Lichtquelle des Gerätes angeregt und überträgt seine Energie auf den roten Farbstoff, der dann Licht einer anderen Wellenlänge emittiert. Diese Emission wird dann im entsprechenden fluoreszenzdetektierenden Kanal (F2 oder F3) gemessen. Die Fluoreszenz-Emmission wird als Kurve dargestellt, deren exponentieller Anstieg als „Crossing Point“ (CP) bezeichnet wird. Der Vergleich des Proben CP in Zusammenhang mit den CP der Standards lässt eine Quantifizierung der Ausgangs-RNA zu. So ist es möglich, den Telomerasegehalt der Zelle an Hand der exprimierten mRNA zu bestimmen. Alternativ stellt die Verwendung eines TRAP-Assays eine Möglichkeit zur Telomerasemessung dar (22). Hierzu wird ein Proteinextrakt aus lysierten Zellen hergestellt. Anschließend erfolgt die Zugabe der Primer-Nukleotide dATP, dCTP, dGTP, dUTP und eines Primers als künstliches Telomer. Ist im Proteinextrakt Telomerase vorhanden, werden an den Primer typische TTAGGG-Wiederholungseinheiten angehängt. Dieses verlängerte Reaktionsprodukt kann in einer konventionellen PCR mit anschließender Gelelektrophorese nachgewiesen werden. Die detailierte Darstellung der zugrunde liegenden Prozesse der Lightcycler-PCR erfolgt in der Methodik. 20 Abbildung 5: Exemplarische Auswertung eines Lightcycler-Ergebnisses Es wurden 5 Standardreagenzien und eine Probe in eine Lightcycler-PCR gegeben. Es zeigt sich ein regelmäßiger Abstand zwischen den Fluoreszenzkurven der Standards. Die Anzahl an RNA-Kopien in der Probe entspricht der zwischen Standard 3 und 4. Nur eine solche exponentiell ansteigende Kurve darf als positiv gewertet werden. 1.6 Ziel Die Diagnosestellung des Plasmozytoms stützt sich vor allem auf klinische Befunde, die in der Regel erst bei einem erheblichen Ausmaß der Beschwerden erhoben werden. So ist eine Diagnosesicherung ohne Knochenmarksbiopsie oder radiologische Diagnostik skelettaler Osteolysen nicht möglich. Da bei vielen Patienten, die eine monoklonale Gammopathie haben, kein Plasmozytom vorhanden ist, muss es als schwierig angesehen werden, die MGUS – Patienten zu überwachen und frühzeitig eine maligne Transformation der Erkrankung festzustellen. Genau dieses Problem ist der Ansatzpunkt der vorliegenden Arbeit. Wenn es möglich wäre, bereits im Frühstadium eines Plasmozytoms maligne entartete Plasmazellen aus peripherem Blut zu isolieren und mittels der erwähnten genetischen Diagnostik eine entsprechende maligne Transformation nachzuweisen, hätte man einen Labor-Parameter zur Differentialdiagnose zwischen MGUS und Plasmozytom. Wichtige Grundzüge einer solchen neuen Diagnostik müssten - neben der entsprechenden Nachweisbarkeit selbst 21 kleinster maligner Plasmazellmengen - die Verwendung von Vollblut sein. Aus diesen Rahmenbedingungen heraus entwickelten wir eine Methode, die Plasmazellen durch Antikörper gegen CD138 isoliert und Telomerase als Kriterium für die Malignität der isolierten CD138 positiven Zellen benutzt. Da in der Vergangenheit in vielen malignen Zelllinien - insbesondere von Plasmozytomen - Telomerase nachgewiesen werden konnte, formulierten wir die Hypothese, dass der Nachweis von Telomerase in isolierten Plasmazellen einem diagnostischen Verfahren zum Nachweis von Plasmoztyomen dienen könnte. 22 2. Material 2.1 Allgemeine Labormaterialien Eppendorfgefäße 1,5ml und 0,5ml Eppendorf, Hamburg Eppendorf Reference Pipetten Eppendorf, Hamburg EDTA und Heparin Monovetten Sarstedt, Nümbrecht Variofuge RF Heraeus, Hanau 2.2 Materialien zur Zellkultur Einwegpipetten 10 + 25ml Sarstedt, Nümbrecht Verschlusstube 15 + 50ml Sarstedt, Nümbrecht Kulturflasche 50ml mit Filter Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) RPMI 1640 Medium, 500ml Gibco BRL, Eggenstein Mercapthoethanol Lsg. 98%, MW: 78,13 Sigma, Deisenhofen L-Glutamin Gibco BRL, Eggenstein Fetales Kälberserum (CH:4111656x) Gibco BRL, Eggenstein Zellkultur-Bank clean air Med. Tech. Labor, Göttingen Brutschrank 5% CO2, 37°C Heraeus, Hanau Zell-Zähler Z1 LTD Coulter Electronics, Northville (U.K.) Autoclave Integra Bioscience, Fernwald Mikroskop Diavert 97 Leitz, Wetzlar Zentrifuge Megafuge 1.0 Heraeus Sepatech, Hanau Penicillin-Streptomycin Lsg. Gibco BRL, Eggenstein 23 2.3 Materialien zur Immunmagnetischen Separation MACS MS Separation Columns, 25 Stk. Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach CD 138 (Syndecan 1) MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach OctoMACS Magnet Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach Säulenpuffer PBS Sigma, Deisenhofen + 0,5% bovines Serum Albumin Gibco BRL, Eggenstein + 2mM EDTA Sigma, Deisenhofen MACS Multistand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 2.4 Durchflussytometrie FACScalibur Durchflusszytometer Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) CD 138 PE Antikörper 20µl IO Test/Immunotest, Marseille (France) CD 45 FITC 20µl Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) Reagenzgläser 4,5ml Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) Zentrifuge Heraeus, Hanau Lysingsolution 100ml, Konzentrat Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) Rinsesolution 1000ml Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) PBS Sigma, Deisenhofen Ficoll 400 Pharmacia, Upsalla ( Schweden) CellQuest-Software Becton-Dickinson, Franklin Lakes (USA) 2.5 RNA Isolation High Pure RNA Isolation Kit Roche, Mannheim Lyse-/Bindepuffer, 25ml: Roche, Mannheim 24 4,5 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris HCl und 30% Triton X-100(w/v), pH6,6 DNase 1, Lyophilisat: Roche, Mannheim 10 KU lyophilisierter DNase 1. In 0,55 ml Elutionspuffer aufnehmen und allquotiert bei -20° C lagern. DNase Inkubationspuffer: Roche, Mannheim 10 ml DNase Inkubationspuffer, 1 M NaCI, 20 mM Tris-HCI und 10 mM MnCl, pH 7,0 (25° C). Waschpuffer 1: Roche, Mannheim 53 ml Waschpuffer 1 (davon 20ml 100% Ethanol), 5 M Guanidiniumchlorid und 20 mM Tris-HCI, pH 6,6 Waschpuffer 2: Roche, Mannheim 50 ml Waschpuffer 2 (davon 40 ml 100% Ethanol), 20 mM NaCI und 2 mM Tris-HCI, pH 7,5 Elutionspuffer: Roche, Mannheim 30 ml Nuclease-freies, steriles bidest. H2O. High Pure Filtrationsgefäße Roche, Mannheim Polypropylengefäße mit 2 Lagen Glasvlies. Sterilbank Microflow Workstation Nalge Nunc international, Dänemark 2.6 Echtzeit PCR Lightcycler Roche, Mannheim Lightcycler Capillaries (Cat.1909339) Roche, Mannheim Aluminium Kühlblock (Cat. 1909312) Roche, Mannheim Computer P3, Windows NT 4.0 Hewlett Packard, Böblingen 25 LC Carousel Centrifuge Roche, Mannheim Sterilbank Microflow Workstation Nalge Nunc international, Dänemark LightCycler TeloTAGGG hTERT Quanti- Roche, Mannheim fication Kit 26 3. Methoden 3.1 Modellsystem Um unser Vorhaben realisieren zu können, war es zunächst notwendig ein System zu entwickeln, mit Hilfe dessen sich die Methodik optimieren lässt, um selbst kleinste Plasmazellmengen anreichern und untersuchen zu können. Dazu wurden Zellkulturen von Plasmozytomzellen genutzt. Diese Zellen wurden Vollblut beigemischt und in unseren Versuchsablauf gegeben. Die Erzeugung dieser artifiziell hergestellten peripheren Blutprobe eines Plasmozytompatienten ermöglichte die Optimierung der Aufarbeitung und die Bestimmung von Sensitivitätsgrenzen. 3.2 Zellkultur Für die Etablierung der Methode wurden unterschiedliche Zelllinien genutzt. Als definitive Plasmozytom-Zelllinie verwendeten wir NCI-H929. Mit MC/CAR wurde ebenfalls eine dem Plasmozytom sehr verwandte Zelllinie untersucht. Als Kontrollzellen dienten eine Reihe anderer Zelllinien (z.B. Jurkat, U937 und HL 60). Alle Zelllinien wurden gemäß den Richtlinien des Herstellers „American Type Culture Collection“ kultiviert. Bevor die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff genommen wurden, wurde zunächst 500ml RPMI 1640 – Medium (GibcoBRL, Gaithersburg) mit einem FCSAnteil von 10% (50 ml, GibcoBRL, Gaithersburg) hergestellt. Hierzu wurden 5ml einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (GibcoBRL, Gaithersburg) und 5 ml 2mM LGlutaminlösung (GibcoBRL, Gaithersburg) gegeben. Aus dieser Stocklösung wurden 50 ml aliquotiert und auf 37°C vorgewärmt. Ein Zent rifugenröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) wurde mit ca. 13 ml des erst genannten Mediums bereitgestellt. Nach der Entnahme des Kryoröhrchens mit den Zellen aus dem Stickstoff wurde dieses in der Hand leicht angewärmt, so dass sich die Zellen von der Gefäßwand lösten. Die Zellen wurden schnell in das Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugiert. Bei diesem Waschschritt wurde das im Einfriermedium befindliche DMSO stark verdünnt und herausgewaschen. Der Überstand wurde entfernt und der Waschschritt mit dem gleichen Medium wiederholt. Danach wurde das Medium bis auf 1 ml abgenommen, das Pellet resuspendiert und in 50 ml Zellkulturflaschen (Becton-Dickinson, Franklin Lakes) mit 15 ml Zellkulturmedium gegeben (Startkultur). 27 Die fortlaufende Kultivierung der Zellen erfolgte in 50ml Zellkulturflaschen mit 15 ml Zellkulturmedium bei 37°C und einem CO 2-Gehalt von 5% im Brutschrank. Dem Kulturmedium wurden im Falle von NCI-H929 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (SigmaAldrich, USA) und im Falle von MC/CAR zusätzlich 10 Vol % FCS (GibcoBRL, Gaithersburg) zugesetzt. Die Zelldichte in der Kultur betrug 0,5 ×106 – 2 ×106 Zellen pro ml. Bei allen Zellkulturen handelte es sich um Suspensionskulturen. Jeden zweiten Tag erfolgte ein Wechsel des Mediums, indem ca. 5 ml – 15 ml (je nach Zelldichte, Überprüfung unter dem Auflichtmikroskop und mit Hilfe des Zählgerätes) des verbrauchten Mediums mit Zellmaterial abgezogen und frisches Medium äquivalenten Volumens dazugegeben wurde. Für die Vermehrung der Zellen wurden die Kulturen 1:2 oder 1:3 geteilt und das fehlende Volumen mit frischem Medium aufgefüllt. NCI-H929 Morphologie: Lymphatisch Humanes IgA-produzierendes Plasmozytom Quelle: ATCC, USA Rezeptoren: Transferrin, CD38, CD 138 Produkte: Immunglobulin A (IgA) Medium: RPMI 1640 + 2mM Glutamin + 0.05mM 2-Mercaptoethanol (2ME) + 10% Fetales Kälber Serum (FCS). Zielkonzentration der Kultur 2-4 x 105 Zellen/ml; 5% CO2; 37°C. Katalognummer: ATCC CRL 9068; MC/CAR Morphologie: Lymphoblastisch Humanes nicht sezernierendes Plasmozytom Quelle: ATCC, USA Rezeptoren: HLA A1, A33/31, B7, B18, DRw1, DRw2; CD11a +; CD19 +; CD20 + CD28 -; CD38 +, Medium: RPMI 1640 + 2mM Glutamine + Pen.-Strep. + 20% Fetales Kälber Serum (FCS). Zielkonzentration der Kultur 5-10 x 105 Zellen/ml; 5% CO2; 37°C Katalognummer: ATCC CRL-8083 28 U937 Morphologie: Lymphoblastisch Humanes histiozytisches Lymphom Quelle: ATCC, USA Rezeptoren: CD3 -, CD4 +, CD13 (+), CD14 -, CD15 +, CD19 -, CD33 +, CD34 -, CD54 +, CD68 + Medium: RPMI 1640 + 2mM Glutamine + Penicillin.-Streptomycin. + 10% Fetales Kälber Serum (FCS). Zielkonzentration der Kultur 5-9 x 105 Zellen/ml; 5% CO2; 37°C Katalognummer: ATCC CRL 1593 Jurkat Morphologie: Lymphoblastisch Humanes T-Zell Lymphom Quelle: ATCC, USA Rezeptoren: CD2 +, CD3 +, CD4 (+), CD5 +, CD6 +, CD7 +, CD8 -, CD13 -, CD19 -, CD34 +, TCRalpha/beta +, TCRgamma/delta – Medium: RPMI 1640 + 2mM Glutamine + Pen.-Strep. + 10% Fetales Kälber Serum (FCS). Zielkonzentration der Kultur 0,5 - 1,5 x 106 Zellen/ml; 5% CO2; 37°C Katalognummer: ATCC CRL 1990 HL60 Morphologie: Promyelozytär Humane akute promyelozytäre Leukämie Quelle: ATCC, USA Rezeptoren: CD3 -, CD4 +, CD13 +, CD14 -, CD15 +, CD19 -, CD33 +, CD34 -, HLADR – Medium: RPMI 1640 + 2mM Glutamine + Pen.-Strep. + 10% Fetales Kälber Serum (FCS). Zielkonzentration der Kultur 0,5 - 1,5 x 106 Zellen/ml; 5% CO2; 37°C Katalognummer: ATCC CCL 240 29 3.3 Bereitstellung des Untersuchungsmaterials Zur Etablierung der Methode war es notwendig, ausreichend Untersuchungsmaterial mit einer bekannten Konzentration maligner Zellen zur Verfügung zu haben. Daraufhin mischten wir dem peripher abgenommenen Blut gesunder Probanden eine absteigende Menge maligner Zellen (sowohl H929 als auch die übrigen Zellreihen) aus der Zellkultur zu. Hierzu wurde eine entsprechende Menge Zellsuspension abgenommen. Diese wurden mit 1000 U/min für 5 Minuten herunter zentrifugiert und in 100µl PBS resuspendiert auf 1ml EDTA-Vollblut gegeben. Die Konzentrationen der zugesetzten Zellen variierte zwischen 1000 und 0,5 Zellen/µl. Dieses Material ermöglichte uns nun die Methode zunächst auf die größtmögliche Sensitivität hin zu optimieren, bevor es zur Untersuchung von MGUS-Patienten und Plasmozytompatienten kam. Im Falle nativer Patientenproben wurde dem Pat. 2,7ml EDTA-Blut abgenommen und per Eilboten in unser Labor verbracht. Die Eile war aufgrund der zu messenden Genexpression und der zytotoxischen Eigenschaften des EDTA notwendig. Routinemäßig erfolgte ebenfalls eine Serumelektrophorese der eingeschlossenen Patienten. Die Patientenproben der gesichert Plasmozytomerkrankten sowie die der MGUS-Erkrankten wurden uns nach Einverständnis der Patienten durch die Ärzte der Universitätsklinik Köln überlassen. Abbildung 6: Blutausstrich aus Nativblut eines Plasmozytompatienten Hämatoxilin-Eosin Färbung, mit reichlich Lymphozyten, und Plasmozytomzellen 30 3.4 Isolation der CD 138 positiven Zellen Beim MACS-Verfahren („Magnetic Activated Cell Separation“), welches von der Firma Miltenyi 1990 eingeführt wurde, werden supramagnetisierbare Partikel in der Größenordnung von zellulären Makromolekülen (Durchmesser ca. 50 nm) benutzt, welche direkt an Antikörper gebundenen sind. Diese Partikel werden auch als MicroBeads bezeichnet. Die Apparatur zur Zellsortierung besteht aus einer Säule gefüllt mit Stahlwolle, umgeben von einem starken Permanentmagneten. Die markierten Zellen bleiben innerhalb des magnetischen Feldes an der Stahlwolle hängen, wohingegen die unmarkierten Zellen diese ungehindert passieren. Nach Entfernung aus dem Magnetfeld können die markierten Zellen von der entmagnetisierten StahlwolleSäule entfernt werden (33). Zur Verbesserung der Aufreinigung wurden zu Beginn Versuche mit Ficoll 400 durchgeführt, wobei vor der MACS-Separation eine 2:1 Mischung mit Säulenpuffer (100µl Vollblut) über einen Ficoll-Gradienten (20min, 800g) zentrifugiert wurde. Die Lymphozyten, Monozyten und Killerzellen lagerten sich anschließend in der Grenzschicht zwischen Vollblut und Ficoll 400 ab. Diese wurden abpipettiert und in die MACS-Separation gegeben. Erythrozyten, Granulozyten und Zelltrümmer wandern durch die Grenzschicht in das Ficoll. Dieser Ansatz wurde in der Folge aufgrund erheblicher Interferenzen mit der RT-PCR nicht mehr weiterverfolgt. 31 Anti CD 138 Abtrennung von Plasmazellen über MACS™-Säulen M M Paramagnetisches Partikel M M M M M Lyse Abbildung 7: Immunmagnetische Zellseparation System der Firma Miltenyi. CD 138-Antikörper werden an ein 50nm großen Metallpartikel konjugiert. Die Separation erfolgt über einen Permanentmagneten und Stahlwolle Zur Durchführung unserer Versuche wurden jeweils 400µl EDTA-Vollblut genommen, zu welchem 40 µl der CD 138 MicroBead-Lösung hinzu gegeben wurden. Im Anschluss daran folgte ein kurzes Vortexen der Lösungen und die Inkubation gemäß den Empfehlungen der Herstellerfirma: 10 Minuten bei 4° C und 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nun erfolgt ein kurzer Zentrifugationsschritt von 5 Minuten bei 1000rpm, so dass der Überstand abpipettiert werden kann. Das so entstandene Zellpellet wird wieder in 500µl des Säulenpuffers (s.o.) resuspendiert, während zeitgleich die Säulen mit 500µl Säulenpuffer gespült werden. Nach Inkubation und Resuspension trägt man die nun immunmagnetisch markierte Zellsuspension auf eine mit Stahlwolle gefüllte Säule auf. Die gefüllte Säule wird durch einen sie umgebenden Dauermagneten magnetisiert. Die mit MicroBeads beladenen Zellen bleiben an der 32 magnetisierten Stahlwolle haften. Die nicht markierten Zellen passieren die Säule ungehindert und werden am Ende aufgefangen. Die Säulen werden im Anschluss mindestens 4-mal mit 500µl Säulenpuffer gespült, bis die heraustropfende Spülflüssigkeit nicht mehr rötlich tingiert ist. Die so gespülten Säulen werden nun aus dem Magneten entfernt und der Elution zugeführt. Die gebundenen Zellen können nach Entfernung aus der Dauermagnetvorrichtung problemlos wieder von der Säule abgelöst werden. Hierzu gibt man 500µl des Säulenpuffers auf und nutzt den mitgelieferten Stößel zur zügigen Elution mittels Druck. In der Entwicklungsphase der Methode wurden ebenfalls Versuche mit unterschiedlichen Vollblutmengen zwischen 100µl und 500µl, sowie verschieden Inkubationsmengen an CD 138 MicroBeads (10µl – 50µl) durchgeführt. 3.5 Die Immunfluoreszenz-Kontrolle mittels Durchflusszytometrie Das Durchflusszytofluorometer (=FACS-Gerät) ermöglicht die Analyse einzelner Zellen in heterogenen Zellproben unter standardisierten Bedingungen. Die Durchflusszytofluorometrie gestattet die gleichzeitige Messung von mehreren Zellparametern. Durch die Kombination von Laser (=Lichtquelle) und Photodetektoren für Streulicht und Fluoreszenz gelingt es, Aussagen über morphologische und immunologische Eigenschaften von Zellen zu erhalten (54, S. 71). Mit der entsprechenden Software können die Daten analysiert und in Form von Zahlendiagrammen, Histogrammen oder in einem Koordinatensystem als sogenannte „dot plots“ gegeneinander aufgetragen werden (54, S. 87 u. 88). Die Voraussetzung für die Verwertbarkeit der Messung ist eine Probe, die aus Einzelzellen in einer Konzentration von 0,5 bis 20 Mio. Zellen/ml (3; S. 4) bestehen muss. Die Zellen werden nach dem Einbringen des Proberöhrchens über eine Stahlkapillare in die Messküvette gesogen. Durch den Flüssigkeitsstrom der Trägerlösung passieren sie nacheinander den Analysepunkt (54, S. 71). Am Analysepunkt kreuzt der Lichtstrahl des Lasers den Flüssigkeitsstrahl in einem Winkel von 90°. Die hydrodynamische Fokussierun g erlaubt nur dann eine korrekte Erfassung, Analyse und Klassifizierung der Zelle, wenn sie tatsächlich vom Lichtstrahl getroffen wird (54, S. 72 u. 73). Das vorwärts („forward light scatter“ = FSC) und seitwärts („side light scatter“ = SSC) gestreute Licht wird von Photodetektoren gemessen. Der FSC-Detektor steht in gerader Linie zum Lichtstrahl, während 33 der SSC-Detektor im rechten Winkel zum Laser angebracht ist. Die Signale des Vorwärtsstreulichtes geben Informationen über die Zellgröße und Zellaggregation. Durch das im rechten Winkel abgestreute Licht hingegen kann die Zelle bezüglich ihrer Granularität, Dichte und Oberflächenbeschaffenheit beurteilt werden (54, S. 77 u. 78). Das optische Signal der Fluoreszenz angeregt mit Hilfe eines 488 nm ArgonLasers wird von Photodetektoren, die ebenfalls rechtwinklig zum Laserstrahl angeordnet sind, verarbeitet (52, S. 113). Drei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe haben in dem Anregungsbereich des Argon-Lasers ihr Absorptionsmaximum. Es können somit gleichzeitig drei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe benutzt werden (3, S. 6 u. 7). Die von den Photodetektoren aufgenommenen optischen Signale werden, nachdem sie um einen linearen oder logarithmischen Faktor prozessiert worden sind, über einen Analog-Digital-Wandler in digitale Signale umgewandelt (54, S. 86). Von einem spezifischen Signal, vor allem in Bezug auf fluoreszenzmarkierte Antikörper, kann jedoch erst ausgegangen werden, wenn die Ergebnisse in Relation zur Hintergrundsstrahlung und zur Autofluoreszenz betrachtet werden. Die Zelle kann durch diese ausführliche Beschreibung nicht nur in Hinblick auf ihre Morphologie, sondern auch bezüglich ihrer Antigenität und anderer immunologischer Charakteristika klassifiziert werden (54, S. 87). Die Zuordnung zu einer bestimmten Zellart oder Subpopulation wird somit möglich. In unserem Fall wurden zwei verschieden fluoreszierende Antikörper zur Kontrolle des Eluates verwendet. Es wurden ein CD 45 Antikörper, welcher mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) markiert war und ein CD 138 Antikörper mit R-Phycoerythrin (PE) benutzt. Im Rahmen der durchgeführten Versuche wurde das oben genannte Eluat bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Es folgten zwei weitere Waschschritte mit jeweils 500µl PBS und anschließender Zentrifugation mit gleicher Geschwindigkeit. Alternativ gaben wir das Eluat auf einen FicollGradienten (2ml) und wuschen es zweimal mit 500µl PBS. Die Aufreinigung der Probe für die Durchflusszytometrie erfolgte getrennt von der Aufarbeitung für die RNAIsolation. Dies ist dadurch begründet, da es sich um äußerst kleine Mengen von CD 138 positiven Zellen handelt und bei weiterer Teilung der Zellmenge keine differenzierte Beurteilung mehr möglich ist. Anschließend konnte das Zell-Pellet in 100µl PBS resuspendiert und jeweils 10µl der CD 45 und CD 138 Antikörper beigemischt werden. Die Inkubationszeit betrug 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Das Präparationsprotokoll lautet wie folgt: 34 • Proben vortexen • 2 ml verdünnte Lysing-Solution zugeben (1 + 9 verdünnt) • Proben vortexen • 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren • 5 Minuten bei 1400 U/min zentrifugieren • Überstand abkippen • Proben vortexen • 3,5 ml PBS zugeben • Proben vortexen • 5 Minuten bei 1400 U/min zentrifugieren • Überstand abkippen • 200µl PBS-Lösung hinzugeben • Proben bis zum Messen bei + 4°C lagern Die wiederum in 200µl resuspendierte Probe konnte nun am FACScalibur™ gemessen werden. Dies diente als interne Qualitätskontrolle der Immunmagnetischen Zellseparation. 3.6 Messung der Telomerase Die Messung der Telomeraseexpression erfolgt durch den Nachweis der mRNA des Enzyms in den isolierten Plasmazellen. Im Vergleich zu der weitverbreiteten TRAP (Telomeric repeat amplification protocol) Methode, bei der der Telomerasenachweis über die Syntheseleistung des Enzyms erbracht wird, erfolgt der Nachweis mit dem Lightcycler über die Durchführung einer RT-PCR nach cDNA-Synthese. 35 3.6.1 RNA-Isolation Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellpellets in 200µl PBS resuspendiert. Diese Lösung sowie alle anderen benötigten Reagenzien und Gefäße entstammen dem benutzten High Pure RNA Isolation Kit™ der Fa. Roche, Mannheim. Die Gewinnung der Gesamt-RNA aus den isolierten CD138-positiven Zellen erfolgte nach dem Standard-Protokoll des „High Pure RNA Isolation Kit“™. Die Nukleinsäuren werden nach einer Lyse der Zellen an eine Glasfaservlies-Membran gebunden. Zur Entfernung von DNA-Resten wird DNase auf das Vlies gegeben und der Ansatz 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgen mehrere Reinigungsschritte mit den im Kit enthaltenen Waschpuffern 1 und 2 sowie die Elution mit 50µl Elutionspuffer gemäß dem u.g. Protokoll. 1. In 200µl PBS werden die immunmagnetisch isolierten Zellen resuspendiert und anschließend mit 400µl Lysepuffer (4,5 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris-HCl, 30% Triton® X-100 (w/v), pH 6,6) gut vermischt. 2. Probe auf den „High Pure Filter“ eines Filtrationsgefässes pipettieren 3. Zentrifugation (15 s bei 10000 U/min), Durchlauf verwerfen 4. Pro Probe 90µl DNase-Inkubationspuffer (1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 10 mM MnCl2, pH 7) mit 10µl DNase 1 mischen und auf das „High Pure Filter“ pipettieren 5. 60 min Inkubation bei RT 6. Zugabe von 500µl Waschpuffer 1 (5 M Guanidiniumchlorid, 29 mM Tris-HCl, pH 6,6 in Ethanol) 7. Zentrifugation (15 s bei 10000 U/min), Durchlauf verwerfen, Filter-Tube ins gleiche Auffanggefäß setzen 8. Zugabe von Waschpuffer 2 (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5 in Ethanol) 9. Zentrifugation (siehe Punkt 7) 10. Zugabe von 200µl Waschpuffer 2 und Zentrifugation (3 min bei 13000 U/min) 11. Filter-Tube in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß setzen und RNA durch Zugabe von 50µl Elutionspuffer und anschließender Zentrifugation (1 min bei 10000 U/min) eluieren. Sowohl die isolierte mRNA als auch die für die Lightcycler-PCR benötigten Standards wurden bei -70°C gelagert. 36 3.6.2 Polymerase-Chain-Reaction (PCR) am Lightcycler Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR) wurde 1986 von Kary Mullis (34) entwickelt und ist inzwischen Standardverfahren der genetischen Forschung und Diagnostik. Als Ausgangsmaterial dient DNA, welche in unseren Versuchen zunächst über eine reverse Transskriptase aus RNA umgeschrieben werden muss, da es sich um eine Expressionsmessung und somit isolierte mRNA handelt. Amplifiziert wird ein 198 bp langes RNA-Fragment. Der Ansatz wird unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt. Zunächst wird bei 60°C 10 Minuten inkubiert, damit die notwendige cDNA durch die zugesetzte Reverse Transcriptase synthetisiert werden kann. Anschließend wird auf 95°C erhitzt und die DNA-Doppelhelix denaturiert. An die dabei entstehenden Einzelstränge lagern sich bei einer Temperatur unter 60°C die Primer an (Anne aling). Bei 72°C besteht die optimale Temperatur der Taq-Polymerase und es beginnt die DNASynthese. Danach schließen sich die gebildeten komplementären Stränge wieder zu einer Doppelhelix zusammen. An der nun verdoppelten DNA vollziehen sich im nächsten Reaktionszyklus die gleichen Schritte. Nach n-Zyklen entstehen n2 - DNA-Kopien. Die benötigten Substanzen sind Bestandteil des LightCycler TeloTAGGG hTERT Quantification Kit der Fa. Roche, Mannheim. Dieser Kit beinhaltet ebenfalls die Reverse Transskriptase, eine RNA abhängige DNA Polymerase, welche aus den isolierten RNA-Fragmenten cDNA erzeugt. Diese schafft die Voraussetzung zur Durchführung der o.g. PCR. Der Lightcycler führt eine Polymerasekettenreaktion mit anschließender Detektion der PCR-Produkte durch eine fluoreszenzmarkierte DNA-DNA-Hybridisierung durch. Die Gefahr einer Kontamination während des Assays wird durch die Verwendung eines Single-Tube-Formates, d.h. alle Reaktionsabläufe laufen in einem einzigen Reaktionsgefäß ab, minimiert. Der Lightcycler besitzt ein mit Luft getriebenes Heizsystem. Die Luft wird mit einer Geschwindigkeit von 20°C/Sek. erwärmt. Da die Reaktionsgefäße feine Borosilikatkapillaren mit einem großen Verhältnis von Oberfläche zum Volumen sind, wird die Temperatur in der Heizkammer schnell auf den Inhalt der Kapillaren übertragen. Dadurch wird die gewünschte Temperatur schneller als mit einem konventioneller Blockcycler erreicht. Eine PCR mit 42 Zyklen dauert somit nur 45 min. Es kann ein Rotor mit maximal 32 Kapillaren je 20 µl Volumen pro Lauf eingesetzt werden. Der Rotor dreht sich in der Heizkammer und führt so jede Kapillare an der optischen Einheit, dem Fluorimeter, vorbei. 37 Abbildung 8: Aufbau des LightCycler Die Kapillaren werden durch Luftverwirbelungen beheizt oder gekühlt. Nach jedem Zyklus erfolgt die Fluoreszenzmessung durch die Fotodiode Es besteht aus einer fluoreszenzanregenden Lichtquelle (LED, blau 470nm) und drei Fluoreszenz-detektierenden Kanälen, die Licht unterschiedlicher Wellenlänge (Kanal F1: 530nm, Kanal F2: 640 nm und Kanal F3: 705 nm) messen. Durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten Sonden zum PCR-Ansatz werden während der PCR Fluoreszenzsignale gemessen. Eine ständige Beobachtung der bereits produzierten Menge an DNA und der aktuellen Temperatur ist in jedem Schritt der Reaktion einer zeitaufgelösten PCR möglich („Real-Time PCR“ mit online-Detektion). Die Einzelmessungen während jedes PCR-Zyklus lassen quantitative Rückschlüsse über die Menge der in der Probe enthaltenen Targets zu. Das benutzte Kit amplifiziert nicht nur ein Fragment der hTERT, sondern beinhaltet auch Primer zur Amplifikation von Porphobilinogen Deaminase (PBGD). Dieses PBGD bezeichnet man als „Housekeeping Gene“ (HKG). Diese HKG sind für einen Zelltyp relativ konstant und stabil exprimierte Gene, deren Quantifizierung eine interne Qualitätskontrolle der Aufarbeitung ermöglicht. Unter der Annahme, dass Variationen in der Menge der HKG-Transskripte eher durch die Aufarbeitung (RNA-Isolierung, cDNA-Synthese) als durch deren biologische Variabilität bestimmt sind, lassen sich Target-Konzentrationen durch Normierung auf die Transskriptmenge des HKGs abschätzen. Der PCR Ansatz wird in einem Kühlblock mit den speziell für den Lightcycler entwickelten 20µl-Kapillaren an- 38 gesetzt. Die Proben werden jeweils mit hTERT und PBGD Reaktionsmix angesetzt. Die Zusammensetzung einer Kapillare ist wie folgt: 3µl RNA (Patientenmaterial oder Standard) 2µl Detection Mix 2µl Reaction Mix (entweder hTERT oder PBGD Primer) 0,1µl Reverse Transskriptase 13µl H2O 39 4. Ergebnisse 4.1 Charakterisierung der NCI-H929 Zellen und anderer Zelllinien Um einen Einstieg in die Diagnostik des Plasmozytoms zu erlangen, beschäftigten wir uns zunächst mit maligne transformierten Plasmazellen. Wir nahmen die Zelllinie NCI-H929 in Kultur, welche uns von nun an als Positivkontrolle dienen sollte. Zunächst wurde überprüft, ob die kultivierten Zellen tatsächlich CD138 positiv sind, welches für unseren Versuchsaufbau essentiell ist. Desweiteren galt es herauszufinden, ob der durch uns gewählte Malignitätsmarker „Telomerase“ ebenfalls exprimiert wird. Beide Versuche wurden durchgeführt und es zeigte sich, dass es auf der Oberfläche von NCI-H929 deutlich zur Präsentation von CD 138 kam, welches den bisherigen Ergebnissen der Forschung entspricht (50). Abbildung 9: FACS-Analyse eines Probandenblutes Es erfolgt die Charakterisierung der beigemischten NCI-H929 Zellen durch FACS-Analyse nach CD138 PE- und CD45 FITC-Markierung. Die ursprüngliche Konzentration an NCIH929 im Vollblut betrug 100 Zellen/µl. Events gated: 5000. Die übrigen Kolonien stellen die normalen Zelltypen des weißen Blutbildes dar. (e.g. oben links: Lymphozyten) 40 Plasmozytomzellen vermindern in ihrem Reifungsprozess deutlich die CD45Expression. Dies verdeutlicht, dass sich diese Zellen genetisch weiter von den üblicherweise zirkulierenden Lymphozyten entfernt haben (s. Tabelle 5). CD45 wird vorwiegend auf Zellen der lymphatischen und myeloischen Reihe exprimiert. Die ebenfalls durchgeführte RT-PCR zur Feststellung einer Telomeraseaktivität zeigte eine deutliche mRNA Synthese des Bereiches, der die katalytische Einheit hTERT verschlüsselt. Die errechnete normalisierte Telomeraseaktivität in Beziehung zum mit amplifizierten HKG betrug 0,079. Diese dimensionslose Zahl lässt sich nach folgender Formel berechnen: Anzahl Kopien hTERT Normalisierte Telomeraseaktivität = ---------------------------------Anzahl Kopien PBGD Die ausgewählte Zelllinie entspricht dem Profil einer maligne transformierten Plasmazelle. Zur besseren Einschätzung der Eigenschaften wurden ebenfalls die Zelllinien Jurkat, U937, HL60, NC/CAR in Kultur genommen. Zunächst wurden sie bezüglich der relevanten Oberflächenmarker und Expression von Telomerase untersucht. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 5 dargestellt. Zelllinie CD138 CD45 hTERT-mRNA Telo-Aktivität NCI-H929 Positiv Schwach pos. Positiv 0,079 Jurkat Negativ Positiv Positiv 0,06 U937 Negativ Positiv Positiv 0,021 HL60 Negativ Positiv Positiv 0,21 NC/CAR Negativ Positiv Positiv 0,066 Tabelle 5: Normalisierte Telomeraseaktivität verschiedener Zelllinien Hierbei zeigte sich, dass die Zelllinien unserer Erwartung entsprechend alle kein CD138 exprimierten. Wie gemäß der Literatur zu erwarten, haben alle Zelllinien ein 41 deutliches Signal in der RT-PCR erzeugt, obgleich die Telomerase unterschiedlich stark exprimiert wird. Dies zeigt, dass wir unabhängig von der Größe der Telomeraseaktivität einen messbaren Marker haben, der positiv in allen getesteten malignen Zelllinien ist. In den weiteren Versuchen werden wir diese Zellen als Störgrößen verwenden, um zu zeigen, dass unsere Methode selektiv für CD138 positive Plasmazellen ist, und es zu keiner falsch positiven Telomerasemessung durch Verunreinigungen mit ebenfalls telomerasepositiven andersartigen Zellen kommt. 4.2 Entwicklung eines Modells zur Aufreinigung zirkulierender Plasmazellen Zunächst wurden Proben wie in den Methoden beschrieben mit definierten Anteilen an malignen Zellen hergestellt. Hierzu wurde einem gesunden Probanden 10ml EDTA-Blut abgenommen. Die in Zellkultur befindlichen Zellen wurden gezählt und dem Blut wie oben beschrieben zugesetzt. Es fanden Konzentrationen zwischen 3000 Zellen / µl und 0,025 Zellen / µl Verwendung. Die Proben wurden anfangs jeweils mit einer FACS-Analyse kontrolliert, um zu zeigen, dass eine entsprechende Menge an CD138 positiven Zellen in der Probe vorhanden ist (s. Abbildung 9). In diesem Zusammenhang wurden ebenfalls unterschiedliche Leukämie-Zelllinien als Störfaktoren dem Blut beigemischt. Diese brachten keine falsch positiven Ergebnisse am Ende der Aufarbeitung zu Tage. 4.3 Stabilität der h-TERT-mRNA in vivo Da die h-TERT-mRNA mit dem Zelltod schnell abgebaut wird ist es essentiell, die Zellen möglichst vital zu erhalten. Zu diesem Zweck wurden mehrere Versuche unternommen, welche zeigen konnten, unter welchen Bedingungen die verbleibende Zellvitalität am größten ist. Im Rahmen dieser Versuche wurden sowohl die Wartezeiten bis zur Aufarbeitung als auch das dem Vollblut beigemischte Antikoagulans variiert. Der Vergleich wurde mit einer 100 Zellen / µl Konzentration durchgeführt. 42 0,06 0,05 0,04 EDTA 0,03 Heparin 0,02 0,01 0 1h 2h 4h 6h Abbildung 10: Einfluss der Zeit bis zur Aufarbeitung in Abhängigkeit vom Antikoagulans Dargestellt wird die normalisierte Telomeraseaktivität in Abhängigkeit von der Wartezeit nach Probenaufarbeitung. Diese durchgeführte Untersuchung impliziert, dass die Kombination Heparin-Vollblut und eine Aufarbeitung in einem Fenster < 4 Stunden die sinnvollste ist. Es stellte sich jedoch in den vergleichenden Versuchen heraus, dass unter der Verwendung von Heparin-Vollblut die Separationssäulen deutlich häufiger verstopften. Ebenso ergab der Vergleich der Sensitivität eine Nachweisbarkeitsgrenze für 25 Zellen/µl für Heparin-Vollblut. Dies ist nicht verwunderlich, da Heparin einen bekannten Hemmstoff der PCR darstellt. Es wurde daher die Nutzung von EDTA als Antikoagulans bei der Probengewinnung etabliert. Der Transport der Patientenproben wurde sicher unter 2 Stunden gehalten. 4.4 Optimierung der Zellseparation 4.4.1 Austestung der optimalen MicroBeads-Menge Die immunmagnetische Zellseparation ist der erste Schritt der Aufarbeitung welcher die Isolation und weitere genetische Untersuchung CD138 positiver Zellen ermöglicht. Es ist also notwendig, diese Isolation so weit wie möglich zu optimieren. Zunächst wurden jeweils 10µl MicroBeads den Proben zugesetzt. Um die Zellausbeute zu steigern, wurde diese Menge schrittweise gesteigert. Bereits 20µl MicroBeads 43 zeigten eine erheblich bessere Ausbeute. Das Optimum ließ sich bei einer Kombination von 40µl MicroBeads mit 400µl EDTA-Vollblut erreichen. Separiert man die Zellen bei einer Konzentration von 100 malignen Zellen / µl ergeben sich folgende Werte: 1600 1400 1200 1000 800 Events gated /5000 600 400 200 0 10µl Bead 20µl Bead 30µl Bead 40µl Bead Abbildung 11: Anzahl der Separierten Zellen im FACS Verbesserung des Isolationsergebnisses aus der gleichen Stammlösung in Abhängigkeit von der MicroBeads-Konzentration Probenvolumen jeweils 400µl EDTA-Vollblut mit einer Konzentration von 100 Zellen NCI-H929 pro µl Die Erhöhung der MicroBeads-Konzentration steigerte die Sensitivität für den Telomerasenachweis. Es zeigte sich deutlich, dass sich bei höheren MicroBeadsKonzentrationen bis zu zehnmal mehr Zellen aus der gleichen Stammlösung separieren lassen als bei niedrigeren MicroBeads-Mengen (s. Abbildung 11). 4.4.2 Versuch der Sensitivitätssteigerung über Lysieren der Erythrozyten Zur Anreicherung der zu markierenden Zellen vor Applikation auf die Separationssäule wurde versucht, mittels der Lysing-Solution des FACScalibur die Erythrozyten zu lysieren und mit einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt eine Anreicherung der Leukozyten zu erreichen. Diese Lysing-Solution interferierte jedoch erheblich mit der RNA-Isolation, so dass keine mRNA mehr isoliert und transscribiert werden konnte. Es ist davon auszugehen, dass die Zellen durch diesen Lysierungsschritt erheblich angegriffen wurden, so dass zwar ein FACS-Signal gemessen werden konnte, diese 44 Zellen jedoch nicht mehr vital waren. Dieses Verfahren fand in der Folge keine Verwendung mehr. 4.4.3 Anreicherung der mononukleären Zellen mittels Ficoll 400 Zur Anreicherung der Plasmazellen versuchten wir ebenfalls die Reinigung der mononukleären Zellen mittels des Polysaccharids Ficoll 400. Nach Dichtezentrifugation und Inkubation mit CD 138 MicroBeads erfolgte die Separation über die Säulen. Die im Anschluss hieran durchgeführte FACS-Analyse zeigte eine gute Reinigung der Plasmazellen. Allerdings ergab sich eine deutlich reduzierte Sensitivität nach Durchführung der PCR, welche reproduzierbar bei nur 50 Plasmazellen/µl blieb. Die Grenze der Nachweisbarkeit CD138 positiver Zellen alleine in der Durchflusszytometrie mit optimierter Aufarbeitung nach Ficoll lag bei 10 Zellen/µl. Aufgrund der erreichten Sensitivität ohne Ficoll von 0,25 Plasmazellen/µl wurde auf Ficoll in der Folge verzichtet. 45 Abbildung 12: FACS-Analyse isolierter Zellen Gezeigt wird eine FACS-Untersuchung nach Durchlauf der Säulen. Es lag eine Konzentration von 25 Plasmazellen/µl vor. In diesem Ansatz wurden 400µl Vollblut mit 40µl MicroBeads aufgearbeitet. Aufarbeitung ohne Ficoll/Lyse. 4.5 Optimierung des Telomerase-Nachweises Zur weiteren Verbesserung der Sensitivität wurden unterschiedliche Versuche unternommen, um die Qualität und Konzentration der RNA zu erhöhen und die Umschreibung in cDNA zu optimieren. Zunächst wurde lediglich die durch den High Pure RNA Isolation Kit vorgegebene Inkubationszeit mit DNAse erweitert. Wir inkubierten alternativ jeweils für 15, 40 oder 60 Minuten um zu sehen, ob daraus eine Verbesserung des PCR-Ergebnisses resultierte. Wie bei allen unseren Versuchen stellt das Ergebnis in der LightCycler PCR mit einer exponentiellen Fluoreszenzkurve den primären Endpunkt dar. Bezüglich dieses primären Endpunktes brachte die verlängerte DNAse-Zeit keinen Zugewinn im Sinne einer höheren Sensitivität, jedoch wurde die Reproduzierbarkeit positiver RT-PCR-Ergebnisse mit ansteigender Dauer der DNAseBehandlung besser, welches sich durch eine geringere Varianz der Crossing Points darstellte. Aus diesem Grund wurde fortan mit einer verlängerten DNAse-Behandlung von 60 Minuten gearbeitet. Bei der Standardelution der RNA werden 50µl Elutionsvolumen gewonnen. 46 Abbildung 13: Crossing Points in Abhängigkeit von der DNAse-Inkubationszeit Dargestellt werden die Crossing Points der hTERT Amplifikation. Der Versuch wurde jeweils als Doppelansatz durchgeführt. Der Crossing Point ist direkt proportional zur Substratmenge. Abbildung 14: Varianz der Crossing Points eines Doppelansatzes bei unterschiedlichen DNAse-Zeiten Verglichen wurde die Varianz der Crossing Points innerhalb eines Doppelansatzes. Ebenfalls dargestellt wurde die Standardabweichung unter Grundlage eines 95%-Konfidenzintervalls (p<0,01) 47 Eine weitere Überlegung war es nun, die gewonnene RNA höher zu konzentrieren. Zu diesem Zweck fand eine Fällung der RNA mit 100%igem Ethanol über 12 Stunden statt. Am Ende dieser Fällung wurde die RNA sowohl in RNase freiem Wasser als auch in MS2 RNA (aus MS2 Bakteriophagen, Fa. Roche) resuspendiert. Diese Proben wurden ebenfalls im Lightcycler untersucht. Hier zeigte sich jedoch eine Verschlechterung der Sensitivität. Im weiteren Versuchsablauf wurde versucht die Amplifikation selbst kleinster RNA-Mengen sicher zu stellen. Hierzu wurde alternativ zur cDNA Herstellung in Zusammenhang mit dem Telomerase-Kit der Fa. Roche eine Oligo(dT) cDNA-Synthese mit Superscript Reverser Transskriptase der Fa. Life Technologies, Gibco BRL versucht. Auch diese alternative cDNA-Synthese besserte die Sensitivität bezüglich der benötigten Zellkonzentration bis zur positiven Detektion nicht. Alle in diesem Zusammenhang erwähnten Optimierungsverfahren wurden ebenfalls in beliebiger Kombination durchgeführt, wobei keine Kombination besser als die routinemäßig verwendete war. In der endgültig verwendeten Methode kommen somit die leicht modifizierten Protokolle der High Pure RNA Isolation und des hTERT Kits zur Anwendung. Modifikationen betrafen die Inkubationszeit mit Reverser Transskriptase, welche um 5 Minuten auf 15 Minuten verlängert wurde und die Erhöhung der PCR-Zyklen von 45 auf 55 Zyklen. Abbildung 15: Untersuchungsablauf Gezeigt wird eine standardisierte Aufarbeitung der Patientenproben von der Ankunft im Labor bis zur qualitativen und quantitativen Auswertung des PCR-Ergebnisses. 48 4.6 Bestimmung der optimalen Blutmenge Um die Sensitivität der Methode weiter zu steigern und auch geringste Mengen zirkulierender Plasmazellen nachweisen zu können, war es erforderlich zu prüfen, mit welcher Blutmenge die höchste Empfindlichkeit erreicht werden konnte. Hierzu führten wir sowohl Versuche im Modell-System als auch mit Blut von Plasmozytompatienten durch. Als Kontrolle wurde ebenfalls Blut von Gesunden untersucht. Limitierend wirkte sich eine Menge von 500µl Blut auf die Leistungsfähigkeit der Säulen aus. Diese verstopften bei Verwendung größerer Mengen von EDTA-Blut regelmäßig. Aus den Vorversuchen und der Optimierung der Zellseparation ergab sich, dass die eluierte Zellmenge auch in Zusammenhang mit der eingebrachten Menge an MicroBeads steht. In diesem Zusammenhang wurden Versuche mit aufsteigender EDTA-Blutmenge (100 – 500µl) und verschiedenen Beadkonzentrationen durchgeführt. Es zeigte sich, dass das Optimum bei einer Kombination aus 400µl EDTA-Vollblut und 40µl MicroBeads lag. Hierdurch konnte die Sensitivität der Methode von 10 Zellen / µl auf 0,25 Plasmozytomzellen / µl gesteigert werden. Abbildung 16: Sensitivität der Methode (in Zellen/µl) Das Verhältnis von Blutmenge und beigegebener Menge an CD138-Beads verändert die Sensitivität 49 Mit dieser Nachweisbarkeitsgrenze, welche weit unter der durchflusszytometrischen Nachweisbarkeitsgrenze (10 Zellen/µl) liegt, wurde nun die Untersuchung von Patientenproben möglich. Abbildung 17: Sensitivitätstestung mit 400µl Blut und 40µl MicroBeads Versuch mit NCI-H929 Zellen. Die angegebenen Zellzahlen beziehen sich auf maligne Zellen absolut in 400µl EDTA-Vollblut. Ein sigmoidaler Anstieg wurde als positives Signal gewertet. 4.7 Aufarbeitungsprotokoll Damit ergibt sich das folgende Protokoll für den Nachweis von Telomerase in zirkulierenden malignen Plasmazellen: Inkubation mit CD138-MicroBeads: • 400 µl EDTA -Blut mit 40µl MicroBeads CD 138 versetzen. • 10 Min. bei 4° C und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. • Bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugieren und anschließend den Überstand 50 verwerfen. • Das Pellet in 500µl PBS aufnehmen und auf die Säule geben. Säulen: • Bevor die Säulen bestückt werden, mit 500 µl Buffer waschen. • In den Magneten einsetzen. • Zellsuspension vorsichtig auf die Säule geben. • Durchlaufen lassen. • 4 x mit 500µl Buffer waschen. Elution: • Entnehmen der Säule aus dem Magneten. • Zugabe von 500µl Säulen-Buffer • Aufsetzen des Stößels und Elution • Das Eluat bei 1000 U/min 5 Minuten zentrifugieren. • Pellet in 200 µl PBS aufnehmen. RNA-Isolation: Gemäß dem bereits aufgeführten Standardprotokoll High Pure RNA Isolation Kit In Abweichung zur Standardprozedur wurde eine DNAse-Behandlung von 60 Minuten durchgeführt und die reverse Transskriptase über 15 Minuten inkubiert Elutionsvolumen 50µl RT-PCR: Gemäß dem bereits aufgeführten LightCycler Telo TAGGG hTERT Quantification Kit In Abweichung zur Standardprozedur wurde die reverse Transkription über 15 Minuten bei 60°C durchgeführt und die PCR auf 55 Zyklen ausgedehnt. 51 4.8 Telomeraseexpression bei Gesunden, Patienten mit MGUS und Plasmozytompatienten Nach der Methodenentwicklung, welche es ermöglicht, frei zirkulierende Plasmazellen in einer Konzentration bis zu 0,25 Zellen/µl zu isolieren und genetisch zu untersuchen, wurde die Methode an Patientenmaterial erprobt. 4.8.1 Gesunde Probanden Es erfolgte zunächst die Untersuchung gesunder Probanden, welchen jeweils 2,7ml EDTA-Vollblut und 4,7ml Heparin-Serum entnommen wurde. Die Patienten fühlten sich gesund und hatten ein unauffälliges Blutbild beziehungsweise keinen Hinweis auf eine monoklonale Gammopathie in der Gelelektrophorese. Die Patientenproben wurden der immunmagnetischen Zellseparation unterzogen. Die weitere Aufarbeitung erfolgte gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. In der Lightcycler PCR bestätigte sich, dass aus dem peripheren Blut gesunder Patienten keine CD138positiven, Telomerase exprimierenden Zellen isoliert werden können. Insgesamt wurden 20 gesunde Patienten im Alter zwischen 22 und 71 Jahren untersucht. Das mediane Alter lag bei 38,3 Jahren. In keiner der Messungen konnte hTERT-mRNA nachgewiesen werden. Es ließ sich jedoch in 2 Proben gesunder Probanden mRNA des Housekeepinggenes PBGD nachweisen. Dies lässt sich aufgrund der Beobachtung, dass auch bei gesunden Menschen in wenigen Fällen zirkulierende Plasmazellen vorkommen können, erklären (26). Bezüglich der Spezifität der Untersuchung ergibt sich somit ein Wert von 100%. Abbildung 18 zeigt exemplarisch die Aufarbeitung von 5 gesunden Patienten. 52 Abbildung 18: Gesunde Probanden ohne hTERT-Signal Exemplarisch wurden die Fluoreszenzkurven der hTERT PCR aus aufgearbeitetem Vollblut gesunder Probanden gegen eine Positivkontrolle dargestellt. 4.8.2 Plasmozytompatienten Bei den untersuchten Patienten im Alter zwischen 58 und 76 Jahren handelte es sich um Plasmozytome, die mittels Knochenbiopsie gesichert wurden. Keiner dieser Patienten befand sich in einem Plasmazell-Rush. Es wurden insgesamt 16 Patienten mit einem Plasmozytom nach unserer Methode untersucht. Die Aufarbeitung zeigte, dass sich nur in einem Fall keine CD 138 positiven Zellen isolieren ließen. Die Amplifikation im LightCycler ergab, dass in allen isolierten Zellen Telomerase exprimiert wird. Die Telomeraseaktivität variierte hierbei stark zwischen normalisierten Werten von 0,011 und 0,084 je nach Patient. Der Mittelwert lag bei 0,038 (SD ±0,018). 53 Tabelle 6: Telomeraseaktivität bei Plasmozytom- und MGUS-Patienten In dem Falle des Patienten bei dem keine CD138-positiven Zellen isoliert werden konnten, gibt es festzuhalten, dass zu diesem Zeitpunkt eine HochdosisChemotherapie durchgeführt wurde. Die allgemeine Blutbilduntersuchung bei diesem Patienten ergab einen Gesamtleukozytenwert von 973 / µl. Zusammenfassend haben 15 von 16 untersuchten Plasmozytompatienten Telomerase in ihren CD138positiven Zellen exprimiert. Dies ergibt einen relativen Wert von 94 %. 54 20 18 16 14 12 Anzahl der 10 Patienten 8 6 4 2 0 Gesamt hTERT Plasmozytom MGUS Gesunde Abbildung 19: Telomerase-Expression in den verschiedenen Patientengruppen Anzahl der hTERT-positiven Proben in Relation zu der Gesamtheit der untersuchten Proben. Insgesamt wurden 50 Patienten untersucht. 4.8.3 Patienten mit Monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) Es wurde bereits gezeigt, dass gesunde Menschen keine Telomerase exprimierenden Plasmazellen im peripheren Blut besitzen. Die Plasmazellen eines Patienten, welcher an einer „benignen“ monoklonalen Gammopathie erkrankt ist, dürften folglich keine Telomerase exprimieren. Interessant wird das Patientenkollektiv, welches in der Serumelektrophorese bereits einen deutlichen M-Gradienten (> 2g / dl) hat, jedoch noch keine klinischen Symptome eines Plasmozytoms im Sinne einer Knochendestruktion oder Anämie zeigt. Zu diesem Zweck wählten wir Patienten mit einem deutlichen M-Gradienten aus und führten nach erneuter Blutentnahme die oben beschriebene Aufreinigung durch. Die Patienten waren im Alter zwischen 47 und 70 Jahren und wiesen außer einem deutlichen M-Gradienten noch keinerlei Symptome der malignen Erkrankung auf. Es konnte insgesamt das Blut von 14 Patienten mit grenzwertiger Gammopathie gewonnen und analysiert werden. In 6 der Fälle ließ sich nach erfolgter Aufarbeitung eine Telomeraseaktivität nachweisen. Die normalisierten Telomeraseaktivitätswerte schwankten zwischen 0,006 und 0,056 (MW: 0,028, SD: ±0,019). Dies ergibt einen relativen Anteil von 43 % bezogen auf alle hier 55 untersuchten Probanden. In der Gesamtpopulation der an MGUS erkrankten Patienten wird dieser Anteil an Telomerase exprimierenden Probanden deutlich geringer sein, da in unserem Falle nur Probanden untersucht wurden deren Serumelektrophorese bereits deutlich den Verdacht auf ein malignes Geschehen nahe legte. Abbildung 20: LightCycler-Ergebnisse der unterschiedlichen Patientengruppen Vergleich von Plasmozytomerkrankten mit MGUS-Patienten und gesunden Probanden. Die Versuche wurden jeweils als Doppelansatz durchgeführt. Bei Nachweis eines positiven Signals wurde die Probe als positiv gewertet. 4.9 Zusammenfassung der Ergebnisse Eine Erprobung der Methode an insgesamt 50 Patienten (20 Gesunde, 14 MGUS und 16 Plasmozytome) zeigte, dass 100% der Gesunden als Telomerase negativ getestet wurden. Im Falle der MGUS fand sich bei 43% der Fälle eine Telomeraseaktivität, während die Plasmozytome in 94% der Fälle ein positives Ergebnis aufwiesen . 56 5. Diskussion Die Labordiagnostik des Plasmozytoms besteht zurzeit im Wesentlichen aus einem Nachweis einer Paraproteinämie im Serum sowie von Bence-Jones-Proteinen im Urin. Häufig führen diese diagnostischen Maßnahmen jedoch nicht zur Klärung der Frage, ob ein Plasmozytom – vor allem in einem frühen Stadium der Erkrankung oder eine (noch) nicht maligne Form der Gammopathie, die MGUS genannt wird, vorliegt. Daher müssen weitere - zum Teil sehr aufwendige - diagnostische Verfahren wie die Computertomografie und Knochenszintigrafie sowie die Knochenmarkshistologie eingesetzt werden. Wegen des großen Aufwands, der hohen Kosten und der erheblichen Belastung des Patienten wäre es daher wünschenswert, eindeutige Labortests zu entwickeln, die eine sichere Unterscheidung ermöglichen. Das von uns entwickelte Verfahren könnte einen ersten Schritt in Richtung eines Labortests darstellen, der eine Bestimmung der Malignität von Plasmazellen ermöglichen könnte. Für den genetischen Nachweis von malignen Zellen im Blut werden in der Literatur mehrere Verfahrensweisen beschrieben. Hier können im Wesentlichen zwei Ansätze unterschieden werden. Einerseits erfolgte der Nachweis von malignen Zellen direkt über den PCR-Nachweis von Tumormarker-mRNA (CEA, CK 20) - z. B. in Kolonkarzinomen (42) - ohne vorherige Zellanreicherung, welches erhebliche Interferenzen mit den normalen Blutzellen ergab. Andererseits wurden Tumorzellen nach einer spezifischen Aufreinigung auf unspezifische Marker hin untersucht. Andere Isolationstechniken wie eine Zellsortierung über eine Durchflusszytometrie stellen mit einer Ausbeute von 10 - 20 % an lebenden Zellen sowie durch die Benutzung von lysierenden Reagenzien und dem erheblichen technischen Aufwand keine Alternative zu der hier beschriebenen Methode dar (12). Da die Telomerase ein Marker immortaler Zellen ist und daher als Marker für maligne Zellen durchaus geeignet erscheint, wurde in dieser Studie der TelomeraseNachweis eingesetzt. Die Telomerase ist jedoch nicht plasmozytomspezifisch (57). Daher war eine spezifische Anreicherung der Plasmazellen unverzichtbar. Gleichzeitig wird durch die Anreicherung die Sensitivität der Methodik erhöht. Ein vergleichbares Verfahren wurde von der Arbeitsgruppe von Soria et al. zum Nachweis von zirkulierenden Blasenkarzinomzellen (45) etabliert. Hier konnte mittels eines enzymge57 koppelten Immunoassays eine Telomeraseaktivität nachwiesen werden. Als wesentlicher Unterschied zu der hier vorliegenden Arbeit wurde nicht nur ein anderer Zelltyp untersucht, sondern auch ein enzymgekoppelter Immunoassay (Telomeric Repeat Amplifikation Protocol, TRAP, 21) verwendet. Dieser stellt im Gegensatz zu der von uns verwendeten quantitativen Methode einen rein qualitativen Telomerasenachweis dar, der keine Aussage zur individuellen Telomeraseaktivität ermöglicht. Die individuelle Expression der Telomerase bei den untersuchten Plasmozytompatienten zeigte deutliche Unterschiede, so dass es möglicherweise keinen Unterschied macht, ob die Telomerase quantitativ oder nur qualitativ nachgewiesen wird. Allerdings kann aufgrund der fehlenden Nachbeobachtung unseres Patientenkollektives keine Aussage über die Aggressivität und den spontanen Verlauf des Plasmozytoms in Korrelation zur hTERT-Aktivität gemacht werden. Der Versuchsaufbau könnte jedoch zur Einschätzung der Aggressivität einer Transformation genutzt werden, da bereits gezeigt werden konnte, dass eine erhöhte Telomeraseaktivität mit einer erhöhten Krankheitsaktivität vergesellschaftet ist (55). Der durch uns untersuchte Aspekt der Telomeraseaktivität ist zunächst ein qualitativer, dessen weitere Dimension im Rahmen einer weiteren Studie zu klären bleibt. In diesem Sinne sind die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu werten. Die Auswahl der MGUS-Patienten erfolgte anhand Paraprotein-Konzentrationen, welche den Verdacht auf ein Plasmozytom nahe legten, ohne dass dieses bisher jedoch gesichert werden konnte. Dies geschah wohlwissend, dass hier vor allem die Zweifelsfälle untersucht werden sollten, die klinisch von besonderer Bedeutung sind. Bei einer Anwendung auf die Gesamtheit der MGUS-Patienten wird der Anteil der telomerasepositiven Patienten wahrscheinlich deutlich sinken, so dass der durch uns ermittelte Anteil von 43% Telomerase-positiven Fällen keineswegs repräsentativ für die MGUS ist. Trotzdem darf unterstellt werden, dass das Auftreten einer TelomeraseExpression in auf gereinigten CD138 positiven Zellen ein Indiz für eine Transformation sein könnte, ohne aber etwas über die tatsächliche Malignität oder den weiteren Verlauf sagen zu können. Da hier der Schwerpunkt bei der Etablierung der Methodik und weniger bei der Langzeitbeobachtung von MGUS-Patienten lag, kann zurzeit nicht beurteilt werden, mit welcher Wahrscheinlichkeit sich bei den telomerasepositiven MGUS-Patienten ein Plasmozytom entwickelt. Daher ist es zwingend erforderlich, in weiteren Studien das untersuchte MGUS-Kollektiv hinsichtlich der Entwicklung 58 eines Plasmozytoms in Abhängigkeit von einem positiven Telomerasenachweis in den aufgereinigten Plasmazellen zu verfolgen. Für die Entwicklung des Verfahrens ist es essentiell, einen möglichst spezifischen Plasmazellmarker für die Zellanreicherung zu verwenden. Die Frage der Spezifität des hier benutzten Markers CD 138 im Zusammenhang mit einer selektiven Aufreinigung von Plasmazellen lässt sich anhand der Literatur nicht völlig klären. Epithelzellen, Mesenchymzellen sowie Lymphozyten in unterschiedlichen Phasen der Zellreifung exprimieren ebenfalls CD 138 und könnten, so sie frei zirkulieren, mit unserer Methode interferieren (26). Dies scheint jedoch in der Praxis keine Rolle zu spielen. Anhand der untersuchten gesunden Probanden lässt sich zeigen, dass keine CD 138 positiven und gleichzeitig telomerasepositiven Zellen im peripheren Blut aller untersuchten Probanden nachzuweisen sind, obwohl bei einigen CD 138 positive Zellen aufgereinigt werden konnten. Ein interessanter Aspekt weiterer Untersuchungen könnte insbesondere die Auswirkung von verschiedenen Virusinfektionen bezüglich ihrer Interferenz mit der Methode sein. In der Literatur finden sich keine Belege dafür, dass eine Infektion zur Freisetzung CD 138 positiver und telomerasepositiver Zellen führt. Insbesondere virale Erkrankungen wie eine akute Epstein-Barr-Virus oder Zytomegalie-Virus Infektion sollten jedoch in Zukunft diesbezüglich näher untersucht werden. Zirkulierende Plasmazellen werden gelegentlich auch im Rahmen ausgewählter Erkrankungen wie dem systemischen Lupus erythematodes (20) in höheren Konzentrationen freigesetzt. Da wir keine Patienten mit einer derartigen Erkrankung in unserer Methodenerprobung hatten, kann bisher keine Aussage über die Relevanz solcher möglichen Störgrößen gemacht werden. Daten zur Durchseuchung unseres Patientenkollektives im Bezug auf Herpesviridae liegen nicht vor. Eine zukünftige Möglichkeit der Nutzung unserer Methode ist die Kombination verschiedener Marker zur Aufreinigung mit hintereinander geschalteten Reinigungsschritten, um eventuell interferiende Zellen entfernen zu können. Eine andere Weiterentwicklungmöglichkeit würde der Nachweis weiterer genetischer Aberrationen aus dem gewonnenen Material (z.B. die erwähnten Mutationen und Translokationen, s. 59 Seite 12) darstellen, welche möglicherweise eine verbesserte Einschätzung der Aggressivität und der Prognose sowohl bei MGUS- als auch bei Plasmozytompatienten ermöglichen könnte. Die Telomerase ist ein seit langem bekannter Marker, welcher im Lebenszyklus maligner Zellen für die Immortalisierung eine entscheidende Rolle spielt. Für die Diagnostik ist der Marker gut geeignet, weil er durch hochsensitive PCR-Verfahren günstig und schnell zu untersuchen ist. Plasmazellen stellen ein Zellkollektiv dar, das nach der einschlägigen Literatur und eigenen Untersuchungen beim Gesunden keine messbare Telomeraseaktivität aufweist. Der Ansatz, frei zirkulierende (Tumor-) Zellen zu isolieren, ist von etlichen Arbeitsgruppen schon verfolgt worden. In dieser Arbeit werden jedoch zum ersten Mal Plasmazellen aus peripherem Blut isoliert und mit Hilfe der hTERT-RT-PCR untersucht. Auch eine etwaige Störwirkung durch Kontamination mit anderen im Blut zirkulierenden Zellen konnte nicht beobachtet werden. Diese Untersuchungen könnten den ersten Schritt darstellen, die Malignität einer monoklonalen Gammopathie mit Hilfe eines Laborverfahrens zu klären. Durch weitere Optimierung der Aufarbeitung gelang es in der vorliegenden Arbeit bis zu 0,25 Zellen / µl in 400µl Vollblut nachzuweisen Damit ergibt sich die Möglichkeit ein derartiges Verfahren zum Therapiemonitoring, zur Diagnosestellung oder auch zur Pränataldiagnostik bei ganz unterschiedlichen Fragestellungen einzusetzen. Nach Abschluss der Versuche im Jahr 2002 wurde vermehrt durch die Industrie die besondere Problematik der Isolation von mRNA erkannt. Eine erste Arbeit aus dem Jahre 2004 benutzt bereits Vollblut, welches mit einem speziellen nukleinsäurestabilisierenden Entnahmesystem (Paxgene Blood Kit, Quiagen) gewonnen und in eine RTPCR eingesetzt wurde. Insbesondere vor dem Hintergrund des ausgewählten Patientenkollektives ist diese Methode als äußerst vielversprechend zu werten. Es wäre wünschenswert, die hier etablierte Diagnostik in einer randomisierten Studie mit einer Verlaufsbeobachtung der Patienten über viele Jahre anzuwenden. 60 6. Zusammenfassung Monoklonale Gammopathien sind kein seltener Befund: Bei bis zu 2 % der Patienten kann eine derartige Veränderung nachgewiesen werden. Demgegenüber ist das Plasmozytom mit einer Häufigkeit von 3-4 Neuerkrankungen pro 100.000 Einwohner eher selten. Meistens handelt es sich daher bei den Gammopathien um die sog. monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS), die „benigne“ verläuft, aber auch in ein Plasmozytom übergehen kann. Niedrige und stabile Paraprotein-Spiegel, geringe Konzentration an freien Leichtketten im Urin, das Fehlen von renalen Störungen, Anämie oder Hyperkalzämie, geringer Plasmazell-Anteil im Knochenmark etc. sind Befunde, die für eine MGUS sprechen, jedoch fehlen bisher Laborparameter, die eine eindeutigere Abgrenzung der monoklonalen Gammopathien erlauben. Patienten mit MGUS müssen ein Leben lang überwacht werden, um einen möglichen Übergang zu einem Plasmozytom frühzeitig zu erkennen. Daher wäre auch für die Patienten-Überwachung eine Methode sehr hilfreich, die frühzeitig die „maligne Transformation“ anzeigt. Ein Parameter der in malignen Zellen häufig nachgewiesen werden kann, ist die Telomerase. Die bisherigen Befunde bzgl. der Telomerase-Aktivität maligner Plasmazellen sind jedoch uneinheitlich: je nach Studie konnte bei keinem Patienten mit Plasmozytom oder nur bei einem Teil der Plasmozytome signifikante TelomeraseKonzentrationen gefunden werden. Demgegenüber fanden andere Untersucher bei den meisten Patienten eine erhöhte Telomerase-Aktivität bei großer Heterogenität der Konzentrationen. Möglicherweise sind diese Unterschiede im TelomeraseNachweis bedingt durch die analytischen Sensitivität oder der Art der ProbenAufarbeitung. Der spezifische Telomerase-Nachweis setzt allerdings auch voraus, dass die Plasmazellen sicher von anderen Blutzellen getrennt werden können. Mit Antikörpern gegen CD 138 scheint inzwischen ein Werkzeug zur Verfügung zu stehen, das für die Isolierung von Plasmazellen genutzt werden kann. Um zu testen, ob die Telomerase-Konzentration von Plasmazellen als Marker für Malignität und zur Abgrenzung von MGUS und Plasmozytom einsetzbar ist, wurde eine Methode entwickelt, bei der im ersten Schritt Plasmazellen durch Bindung an CD138-Antikörper - gekoppelt an magnetische Mikrobeads - angereichert werden. Nach Extraktion der Gesamt-mRNA wurde die Telomerase mRNA am Lightcycler (Roche) nachgewiesen. Dabei wurde die Technik zunächst mit Hilfe eines Modellsystems auf 61 maximale Sensitivität und Zuverlässigkeit optimiert. Dazu wurden in der Zellkultur gezüchtete humane Plasmozytomzellen dem Blut gesunder Probanden zugemischt und der analytischen Prozedur unterzogen. Nach einer Optimierung des Systems gelang es bis zu 0,25 Zellen/µl aufzureinigen und die Telomerase-mRNA in diesen Zellen nachzuweisen. Die Validierung der Methodik an gesunden Probanden ergab, dass in keinem Fall Telomerase-mRNA nachweisbar war. Demgegenüber zeigten - mit einer Ausnahme alle Patienten mit Plasmozytom einen positiven Befund. Allerdings hatte der einzig Telomerase-negative Patient eine niedrige Leukozytenzahl und stand unter Chemotherapie. Erste Untersuchungen bei Patienten mit grenzwertiger MGUS lassen hoffen, dass die hier beschriebene Methodik die Differentialdiagnose der monoklonalen Gammopathien bereichern und ein zusätzliches Kriterium für die Unterscheidung zwischen MGUS und Plasmozytom darstellen könnte. 62 7. Literaturverzeichnis 1. Axelsson U, Bachmann R, Hallen J, Acta Med Scand. 1966 Feb; 179(2):23547. Frequency of pathological proteins (M-components) of 6,995 sera from an adult population. 2. Bakkus MH, Van Riet I, De Greef C, Van Camp B, Thielemans K, Leuk Lymphoma. 1995 Jul; 18(3-4):221-9. The clonogenic precursor cell in multiple myeloma. 3. 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Wijdenes et al)(53) 16 Abbildung 4: Funktionsweise der menschlichen DNA-Polymerase 18 Abbildung 5: Exemplarische Auswertung eines Lightcycler-Ergebnisses 21 Abbildung 6: Blutausstrich aus Nativblut eines Plasmozytompatienten Abbildung 7: Immunmagnetische Zellseparation Abbildung 8: Aufbau des LightCycler 30 32 38 Abbildung 9: FACS-Analyse eines Probandenblutes 40 Abbildung 10: Einfluss der Zeit bis zur Aufarbeitung in Abhängigkeit vom Antikoagulans 43 Abbildung 11: Anzahl der Separierten Zellen im FACS 44 Abbildung 12: FACS-Analyse isolierter Zellen 46 Abbildung 13: Crossing Points in Abhängigkeit von der DNAse-Inkubationszeit 47 Abbildung 14: Varianz der Crossing Points eines Doppelansatzes bei unterschiedlichen DNAse-Zeiten 47 Abbildung 15: Untersuchungsablauf 48 Abbildung 16: Sensitivität der Methode (in Zellen/µl) 49 Abbildung 17: Sensitivitätstestung mit 400µl Blut und 40µl MicroBeads Abbildung 18: Gesunde Probanden ohne hTERT-Signal 50 53 Abbildung 19: Telomerase-Expression in den verschiedenen Patientengruppen 55 Abbildung 20: LightCycler-Ergebnisse der unterschiedlichen Patientengruppen 56 70 9. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Diagnosekriterien für eine MGUS 10 Tabelle 2: Befunde unterschiedlicher Stufen der Plasmozytomentwicklung 12 Tabelle 3: Stadieneinteilung nach Salmon und Durie (1975) 13 Tabelle 4: Oberflächenmarker der B-lymphozytären Entwicklung 17 Tabelle 5: Normalisierte Telomeraseaktivität verschiedener Zelllinien 41 Tabelle 6: Telomeraseaktivität bei Plasmozytom- und MGUS-Patienten 54 71 10. Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. Köln, den 19.4.2010 (Martin Schenkel) 72
