14. Trennungsverfahren

Physikalische Grundlagen
der Messmethoden der Zell- und molekularen
Diagnostik
Hydrodynamische Trennungsverfahren
Péter Maróti
Professor für Biophysik, Universität von Szeged, Ungarn.
Lehrbücher:
Biophysik für Mediziner (Herausgeber S. Damjanovich, J. Fidy und J. Szöllősi) Medicina, Budapest, 2008.
Fercher A.F. Medizinische Physik, Springer, Wien, New York 1992.
Haas U.: Physik für Pharmazeuten und Mediziner; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH. Suttgart 2002.
Adam G., Läuger P. und Stark G.: Physikalische Chemie und Biophysik; Springer Verlag Berlin 1988
Beier W.: Biophysik; VEB Georg Thieme Leipzig 1975
Maróti P., Laczkó G.: Bevezetés a biofizikába, JATEPress, Szeged 1998 (Ungarisch)
P. Maróti, L. Berkes, F. Tölgyesi: Biophysics Problems. A Textbook with Answers. Akadémiai Kiadó, Budapest 1998 (Englisch).
P. Maróti: Lasers in Biophysics, Szeged 2012 (Englisch)
Sedimentation;
Analytische Ultrazentrifugation
Sedimentation: Verschiebung von Teilchen (Molekülen) aufgrund von Kräften, die der
Teilchen(Molekülen)masse proportional sind.
Anwendungen der
Sedimentationserscheinungen in
Zellbiologie und molekularen Biologie
Auftrennung (Separation)
gemischter Teilchenpopulationen
Charakterisierung von reinen
Teilchenpräparationen nach
- Größe
- Form und
- Dichte der Teilchen
Große Kräfte zur Auftrennung können mit
Hochgeschwindigkeits- bzw. Ultrazentrifugen erreicht werden. Die
Ultrazentrifugen rotieren sehr schnell - bis
zu 500.000-mal in der Minute und die
Beschleunigungen, die die Teilchen
erfahren, können bis zu 106 g (Million-mal
der Schwerebeschleunigung) erzeugt
werden.
Verschiedene Rotortypen
Die Lage der
Partikelbande
während Rotation
Die Reorientierung der
Banden mit den
Gradienten nach
Stillstand der Rotoren
Festwinkelrotor
Vertikalrotor
Schwenkbecherrotor
Auftrennung der
verschiedenen
Teilchen in Banden
Hydrodynamische Parameter der Molekülen
Größe,
Form,
Molmasse und
Bewegung
Teilchen
Dichte
des
Teilchens
kann man
bestimmen.
Schicht von Lösungsmittel (Wasser)
gebunden durch Hydrodynamik
Stromlinien des Mediums
1. Das spezifische Volumen: Kehrwert der Dichte des anhydrischen Makromoleküls P,
V’P = Volumen/Masse, [VP] = mL/g.
Eiweiße: V’P ~ 0,7 – 0,75 mL/g
Na+ DNA: V’DNA ~ 0,5 – 0,53 mL/g
2. Das partielle spezifische Volumen: Änderung in Volumen per Masse
 V 
 V 


V P  
 M P 
 M P  V 'P
 nP T , p,n
 mP T , p,m
Eiweiße: VP ~ 0,7 – 0,75 mL/g
Wir werden V’P ≈ VP annehmen.
Na+ DNA: VDNA ~ 0,5 – 0,53 mL/g
Für eine binäre Mischung aus makromolekularer Komponente (1 = P) und dem
Lösungsmittel Wasser (2 = L)
V  V P  mP  V L  mL
Hier sind mP und mL die in der Lösung des Volumen V enthaltenen Massen der
Komponenten P bzw. L, die natürlich additiv die Gesamtmasse mt = mP + mL ergeben.
Durch Division des Gesamtvolumens V mit der Gesamtmasse mt, erhalten wir
V
1
 V   V P  P  V L  L
mt

Gibbs-Duham Formel
wobei V das partielle spezifische Volumen der Lösung und χP bzw. χL die
Massenbrüche der Komponenten P bzw. L darstellen.
3. Effektive (wirksame) Masse: die redizierte Masse des Teilchens unter
Berücksichtigung des Auftriebs (aufgrund der Verdrängung des Volumens an
Suspension der Dichte ρ)

mP  mP V P    mP 1  V P  
P
ρ
Volumen
Masse
des verdrängten Wassers

4. Hydration: Das Makromolekül umgibt sich mit einer Hydrathülle und wird als
hydrotisiertes (oder aquatisiertes) Partikel bezeichnet.
P
H2O

mH 2O
mP
mP,h  mP  mH2O  mP  1   
V P,h  V P   V H2O
Die Masse des
hydratisierten Teilchens
Das Volumen des hydratisierten
Eiweißes per Gramm Eiweiß =
das partielle spezifische Volumen
Die Hydrathülle um das Partikel modifiziert (erhöht) die Werte der Masse und des
spezifischen Volumens des Teilchens beobachtet durch hydrodynamische Methode.
Hydrodynamische Eigenschaften einiger Eiweiße
MP
VP
δH2O
(kDa)
(mL/Gramm)
(Gramm H2O/Gramm Protein)
Ribonuclease
13,683
0,728
0,59
1,14
β-Lactogobulin
35
0,751
0,61
1,25
Serumalbumin
65
0,731
0,75
1,31
Hämoglobin
68
0,749
0,69
1,14
Katalase
250
0,73
Tropomyosin
93
0,74
20
3,22
Fibrinogen
330
0,74
10,1
2,34
Kollagen
345
0,695
460
6,8
Myosin
493
0,728
86
3,53
Protein
RS: Stokes-sches Radius (gemesst)
Rmin: Stokes-sches Radius ohne
Hydrathülle (berechnet aus MP und VP)
Rs/Rmin
1,25
Die Abweichung kommt aus
Hydratation
nicht Kugelform
Beide
1. Sedimentation im Schwerefeld der Erde
Die Reibungskraft kompensiert gerade die wirksame Schwerkraft (Gewicht Minus
Auftriebskraft) beim Absinken des Teilchens mit konstanter Geschwindigkeit:
VP  P g  VP  g  6   Rs v
Reibungskraft: 6   Rs v
Auftriebskraft: VP   g
v
Schwerkraft: mP g  VP P  g
gleichmäßige Endgeschwindigkeit
Rs
unter Verwendung der Stokesschen Reibungsformel für
makroskopisches kugelförmiges
Teilchen des Radius Rs und
Volumen
4 Rs3 
VP 
3
Die Sedimentationsgeschwindigkeit des Teilchens im Erdschwerefeld beträgt:
2  g  P    Rs2
v
9 
mP: Masse, VP: Volumen und ρP: Dichte des Teilchens
ρ: Dichte und η: Viskosität des Suspensionsmediums
g: Schwerebeschleunigung der Erde
Sedimentationsgeschwindigkeiten von Zellen
in Erdschwerefeld
2  g  P    Rs2
v
9 
Unter physiologischen Bedingungen haben Säugetierzellen
Die Geschwindigkeit v kann um einen Faktor
Radien:
2,5 μm < Rs < 12 μm
Dichten: 1,05
g/cm3
< ρP < 1,10
g/cm3
20
variiren.
2
(ρ = 1,0 g/cm3)
Unterschiede der Zellsedimentation im Schwerefeld beruhen im wesentlichen auf
Größenunterschieden der Zellen.
Beispiel: Für 3T3-Mausfibroblasten (Rs = 10 μm und ρP = 1,05 g/cm3) bei Sedimentation
im Medium der Dichte ρ = 1,00 g/cm3 und der Viskosität η = 1·10-3 kg·m-1·s-1 ergibt sich
Sedimentationsgeschwindigkeit v ≈ 1 mm/min = 6 cm/Std.
Das ist eine experimentell durchaus brauchbare Sedimentationsgeschwindigkeit.
Anwendung: präparative Auftrennung von Lymphocytenpopulationen. Größere
Teilchen sedimentieren sehr viel schneller: Sephadex-Kügelchen (Rs ≈ 100 μm) für
Säulenchromatographie in Sekunden bis Minuten.
Kleinere Teilchen
wie Proteine (Rs ≈ 5 nm) zeigen dagegen im Erdschwerefeld praktisch keine
Sedimentation.
2. Sedimentationsgleichgewicht im
Zentrifugalfeld
Die Grundlage: optische Beobachtung der Verteilung der Teilchen (Makromoleküle) in
dem Zentrifugalfeld hochtouriger Ultrazentrifugen, das Beschleunigungen (r·ω2)
mehrfachen der Gravitationsbeschleunigung (g) hervorbringt (r·ω2 >> g).
2.1 Das Suspensionsmedium bleibt homogen,
d.h. nimmt an der Sedimentation nicht teil.
Im Sedimentationsgleichgewicht sedimentiert
durch die Zentrifugalwirkung ebensoviel des
gelösten Stoffes wie entsprechend der Diffusion
zurückwandert.
Mit (freier) Energie ausgedrückt: die freie
Energie des Stoffes der Konzentration c ist
1
G (r )  G 0  R T  ln( c)  M P (1  V P   )  r 2 2
2
MP Molmasse des Partikels
VP
Partielles spezifisches Volumen
des Partikels (Kehrwert der Dichte)
Entropische
Energie:
Diffusion
Potentielle Energie im
Zentrifugalfeld
sollte die gleiche Größe überall haben, d.h. ist
unabhängig von r :
dG
dr
0
1 dc  2 r M P (1  V P   )

c dr
RT
Hieraus ergibt sich
(1)
a
r
Diese Gleichung kann zwischen zwei Positionen a und r in der Zentrifugenzelle
integriert werden:
 c(r )   2 M P (1  V P   ) 2
2
ln 


 c(a) 
ln c(r)
ln c(a)
Steigung ~ MP
r2 – a2
2 RT
 (r  a )
Durch Messung der Konzentration entlang der
Zentrifugenzelle sowie der Dichte des
Lösungsmittels ρ, des partiellen spezifischen
Volumens des Teilchens und der Kreisfrequenz
der Zentrifuge ω ergibt sich also die Molmasse
MP des Partikels.
Bei diesem Verfahren spielt der Diffusionskoeffizient (Reibungskonstante) keine Rolle
weil es sich um Gleichgewicht (und um keine Dynamik (Bewegung)) handelt.
Bei sehr hoher Winkelgeschwindigkeit ω des Rotors kann der Gleichgewichtszustand
durch den partikelfreien Überstand und das Partikelsediment am distalen Teil (am
Boden) der Zentrifugalzelle gegeben sein. Man kann jedoch eine niedrigere
Winkelgeschwindigkeit wählen, bei der sich eine räumlich kontinuierliche
Konzentrationsverteilung der makromolekularen Komponente einstellt.
Sedimentationsgleichgewicht mit analytischer Ultracentrifuge
Messung c(r) gegen r mit optischem Method. Man braucht klares Material.
Beispiel: Alkyl hydroxyperoxide reductase (AhpF/AhpC complex) aus S. typhimurium
Hintergrund: Rekombinant Heterodimer wurde hergestellt zur Untersuchung der
Eigenschaften des Elektrontransfers. Das Heterodimer besteht aus zwei
Einheiten: AhpF (Molmasse 34 kDa) und AhpC (Molmasse 55 kDa), die man aus
E. coli genetisch produzieren kann (co-Expression).
Frage: wie groß ist die Molmasse des isolierten Komplex mit enzymatischer
Aktivität?
Versuchsgerät: Beckman Optima analytische Ultracentrufuge. Die optische
Absorption bei 280 nm kann man im Zentrifugenrörchen direkt messen.
Bedingungen: verschiedene Protein Konzentrationen zwischen 3 und 34 μM
Zellvolumen: 115 μL
Partielle spezifisches Volumen: VP = 0.743 mL/g (berechnet)
Dichte der Lösungsmittel: ρ = 1,0058 g/mL (gemeßt)
Temperatur: 20 oC
Drehzahle des Rotors: 8.000, 9.500 und 14.000 rpm
Sammeln der Data (Messung): 8, 10 und 12 Std bei jeder Drehzahl
Biochemistry (2001) 40, 3912-3919
Sedimentationsgleichgewicht von
Alkyl Hydroxyperoxide Reductase (AhpF/AhpC complex) Heterodimer
Optische Dichte (Absorption) bei 280 nm
2
1
dc

r M P (1  V P   )
Nach Gl. (1)

c dr
RT
Die linke Seite kann man umformen
1 dc d ln c  d (ln c)


2r
2
c dr
dr
d (r )
Nach Einsetzung
8.000 rpm
9.500 rpm
MP 
d (ln c)

2 RT
d (r )  2 (1  V P   )
2
Steigung
der Kurve
14.000 rpm
Klare Abweichung vom Gerade, weil
VP nicht Konstante ist.
Result: MP = 86,200 ± 200
Schlußfolgerung: das Enzym besteht aus einer-einer Kopie beider Einheiten
von AhpF (Molmasse 34 kDa) und AhpC (Molmasse 55 kDa).
Sedimentationsgleichgewicht im Zentrifugalfeld
2.2 Zentrifugation im Dichtegradienten
Bei diesem Verfahren verwenden wir
präformierten Gradienten des
Suspensionsmediums, deren Dichten ρ(r) die
Partikeldichte (genauer: ihr reziprokes
partielles spezifisches Volumen) einschließen.
Die zentrifugierten Teilchen werden bei einer
bestimmten Position r0 im Gradienten zur Ruhe
kommen. Man nennt diese Dichte ρ(r0) die
Schwebedichte oder auch (weniger treffend)
die Schwimmdichte (engl. buoyant density) der
makromolekularen Partikel.
Die Form des Dichtegradienten soll in der Nähe der Gleichgewichtsposition (oder sogar
im ganzen Bereich) als lineare Funktion in r beschrieben werden:
wobei α =(dρ/dr) die (konstante)
1
 (r ) 
  r  r0 
Steigung des Gradienten angibt.
VP
Setzen wir diese spezielle Ortsabhängigkeit der Dichte des Mediums in Gl. (1) ein:

 1

 2 r M P 1  V P  
  (r  r0 ) 
1 dc
V P



c dr
RT
Nach Vereinfachung
1 dc
2 r MP 

VP (r  r0 )
c dr
RT
nach Trennung der unabhängigen (r) und abhängigen (c) Veränderlichen zu beiden
Seiten der Gleichung
 2 r0 M P  V P
d ln c  
 d (r  r0 ) 2
2 RT
und nach Integration
c (r )  c (r0 )  e
( r  r0 )2

2 2
wobei
2 
RT
  2 r0 V P  M P
Es ergibt sich eine Gauß-Verteilung der makromolekularen Konzentration mit
bestimmter Bandbreite σ in der Nähe von r0. Die Bande ist um so schärfer, je höher die
Molmasse MP der Makromoleküle und die Zentrifugalbeschleunigung ω2r sind.
Weiterhin wird die Schärfe der Bande von der Steilheit α des Dichtegradienten bestimmt.
Vergleich der Einstellzeiten:
Das Sedimentationsgleichgewicht ist viel schneller (in wenigen Stunden) erreicht als das
Gradientengleichgewichtes (in Tagen). Daher werden praktisch brauchbare Trennungen
auch schon bei nicht vollständig ins Gleichgewicht gekommenen Gradienten erzielt.
3. Sedimentationsgeschwindigkeit im
Zentrifugalfeld
Die Zentrifugenzelle wird mit einer homogenen Suspension gleich großer Partikel gefüllt.
Nach Einschalten der Zentrifuge wird die Teilchensuspension mit konstanter
Winkelgeschwindigkeit ω auf einer Kreisbahn bewegt und eine stationäre
Sedimentationsgeschwindigkeit v wird sehr schnell erreicht charakterisiert durch das
Kraftgleichgewicht:
ω
...
MP
r


M P 1V P   r  2  f  v
wirksame Masse
des Teilchens
Zentrifugalbeschleunigung
Zentrifugalkraft
Reibungswiderstand
Nach Umordnung faßt man die experimentell unmittelbar zugängliche Größe
Sedimentationskoeffizient
S=
Sedimentationsgeschwindigkeit
Zentrifugalbeschleunigung

M P 1V P  
S
f

Die Sedimentationskoeffizient
hängt von drei, experimetell und theoretisch zugänglichen Größen ab:
Molmasse des Teilchens
Kehrwert der Dichte des Teilchens

Einheit: s (Sekunde)
Da in praktischen
Anwendungen meist sehr
kleine S-Werte (von den
Größenordnung 10-13 s)
auftreten, benutzt man
die praktische Einheit
1 Svedberg = 10-13 s.
M P 1V P  
S
f

Man kann messen oder
berechnen (z.B. aus der
Reihenfolge der
Aminosäuren). Bei
Proteinen VP ≈ 0,75 mL/g
Reibungskoeffizient: Form (Gestalt) des Teilchens
Man kann aus unabhängigen Messungen
(Gel Filtration, Diffusion usw.) bekommen.
Bei kugelförmigem Teilchen f = 6 π η Rs
(Stokes’sches Gesetz)
Für Proteine findet man Sedimentationskoeffizienten zwischen 1 und 100 S.
Für Zellorganellen ergeben sich (ihrer Größe entsprechend) wesentlich höhere Werte:
Glycogen ≤ 105 S, Mitochondrien (1...7)·104 S, Kerne (1...10)·106 S,
ganze Zellen (1...10)·107 S
Messung von S mit analytischer Ultracentrifuge:
Wanderung der Grenze
Die Suspension soll anfänglich homogen sein. Im Verlaufe des Sedimentationsvorganges bildet sich vom Meniskus der Füllung der Zentrifugenzelle ausgehend ein
Bereich teilchenfreier Lösung heraus. Die Grenze zwischen diesem Bereich und der
restlichen Teilchensuspension in Abstand r kann (z.B. schlierenoptisch) sichtbar
gemacht werden. Die zentrifugale Wanderung dieser Grenze kann während der
Zentrifugation kontinuierlich zeitlich verfolgt werden.
Nach der Definition von S: S 
und Integration beider Seiten:
dr
dt , Separation der Veränderlichen:
r2
r
ln    S  2  t  t0 
 r0 
r0
t
r
t0
t
Wanderung der Grenze
Rotationsachse
dr
r
wobei r und r0 die Positionen
der Grenze zu den
Zentrifugationszeiten t bzw. t0
sind.
Die graphische Auftragung der experimentellen Daten
ln (r) gegen ω2t sollte eine Gerade ergeben,
und deren Steigung
läßt sich der
ln r
Sedimentationskoeffizienten S
ln r0
unmittelbar
t0
entnehmen.
S  2  dt 
Präparation von zellulären Partikelfraktionen:
Waschen (Reinigung) der groben Sedimente
Nach Homogenisierung eines Gewebes durch Zerreiben oder Zerschlagen und
Aufschwemmung in einer physiologischen Pufferlösung unterwirft man das Homogenat
sukzessiven Zentrifugationsschritten mit zunehmender Zentrifugalbeschleunigung. Bei
jedem Schritt trennt man sorgfältig (durch Absaugen oder Dekantieren) den Überstand
vom Sediment.
Abschätzung der notwendigen Zeiten zur Sedimentation bestimmter Partikel aus einem
dr
Zellhomogenat.
f
dr
M P 1V P  
dt


dt
S   2 
M P 1V P    2 r
f
r
Die maximale Sedimentationszeit tmax benötigen diejenigen Teilchen, die vom oberen
Meniskus bei r = ra bis zum Boden bei r = re des Zentrifugenröhrchens wandern müssen

tmax 


f

re

M P 1V P   

2 
ra

re
dr
f

ln
r M P 1  V P     2 ra


Mit dieser Gleichung kann man beispielweise die Sedimentationszeit kugelförmiger
Teilchen des Radius Rs berechnen; für diese ist VP = 4πRs3/3 und f = 6πηRs:
tmax
re
9


 ln
2
2
2  P     Rs 
ra
Beispiel:
tmax 
re
9


ln
2  P     Rs2  2
ra
Diese Gleichung ist recht brauchbar, weil eine Kugelgestalt in sehr vielen Fällen
wenigstens näherungsweise vorausgesetzt werden kann.
Ribosomen (Rs ≈ 8 nm, ρP = 1,6 g/cm3) benötigen in einem Sedimentationsmedium der
Dichte ρ = 1 g/cm3 und der Viskosität η = 0,001 kg·m-1·s-1 für die Sedimentation von
ra = 5 cm bis re = 10 cm bei ω/2π = 30.000 min-1 eine Zeit tmax = 8.230 s ≈ 2,3 Std.
Durch Vergleich solcher Rechnungen
für Fraktionen von Partikeln
verschiedener Größe und Anteile
dieser Fraktionen in verschiedenen
Bereichen des
Sedimentationsraumes kann man
auch das Ausmaß möglicher
gegenseitiger Kontaminationen der
Fraktionen bei verschiedenen gWerten und Zeiten abschätzen.
Zirückgelegter Abstand (rel. Einheit)
Beispiel: Messung des S-Wertes von GlpF,
Glycerol Transport Facilitator protein aus E. coli
mit Protein Standard
S=
Nativ
Tetramer
MP (1-VP)
f
Empirische Korrelation der S Werte von
verschiedenen wasserlöslichen Protein
Standard aufgrund der
Sedimentationsgeschwindigkeiten in
5-20% Sucrose Dichtegradient.
Zur Beachtung: weder  noch f sind
Konstante. Die verschiedene Proteine
haben verschiedene hydrodynamische
Parameter.
Sedimentationskoeffizient, S (Svedberg)
PNAS (2001) 98, 2888-2893
Standard Method zum Erhalten Molmasse der Makromoleküle
Sedimentationsdaten für Proteine und Viren bei 20oC
unendliche Verdünnung
S020,W
Temperatur 20oC
(Svedberg, 1/s)
in Wasser
(cm2·s-1)
(cm3·g-1)
VP
(g·mol-1)
MP
Sedimentationskoeffizient in S
Sedimentationskoeffizient von
DNA und BSA (Bovin Serum Albumin)
DNA
BSA
Konzentration (g/100 cc)
Die S-Werte
von DNA
hängen sehr
stark von der
Konzentration
der Lösung ab.
Deswegen das
Method ist
nicht äußerst
geeignet zur
Untersuchung
von DNA.
„Zwei dimensionale” Auftrennung
Dichtegradient
Sedimentationsgleichgewicht
Einige Partikel kann man bloß
aufgrund der Differenzen der
S-Werte nicht separieren.
Sediment
Differentiale Sedimentation
Kombination

S M P 1V P  

D
RT
von

Sedimentation

M P 1V P  
S
f
Vorteil: die Reibungskoeffizient
fällt aus!
Zwei Beispiele für Anwendung der Kombination von
Sedimentation und Stokes Radius: Experimentelle
Bestimmung von MP.

und Diffusion
RT
D
f
f  6    Rs
Theoretically: der Stokes-Radius
(Rs) kann man aus TranslationDiffusion Messungen bekommen.
In Wirklichkeit aber Gel Filtration
oder molekulare Kromatographie
sind benutzt.
Beispiel 1. Dissoziation von Hämoglobin bei niedrigen pH
Experiment: bei Übergang vom hohen zu
niedrigen pH Wert nimmt die Molmasse MP ab.
Erklärung: die TETRAMER Form von
Hämoglobin dissoziert zu MONOMER (oder
Mischung von DIMER) Formen.
pH
nimmt ab
D (107 cm2s-1)
D
Abnehmende pH macht
S/D
S/D
S (Svedberg)
- den Sedimentationskoeffizient
(S) kleiner und
- den Diffusionskoeffizient (D)
größer bzw. den Stokes Radius
(Rs) kleiner.
D ist umgekehrt proportional
mit Rs und S ist linear
proportional mit MP/Rs. Das
Verhältnis S/D ist linear
proportional mit MP wenn VP
eine Konstante ist.
4x
S
RT
D
6   Rs
S

M P 1V P  
6   Rs


S M P 1V P  

D
RT

Beispiel 2. Ausdehnung von BSA bei säurigen pH
MP bleibt unverändert während
Säuern (Acidifikation) und nur der
Stokes Radius ändert sich (nimmt
zu).

Stokes Radius nimmt zu
S/D
S/D

M P 1V P  
S
6   Rs

S (Svedberg)
RT
D
6   Rs
Die Änderungen sind sehr ähnlich:
beide Proteinen bewegen sich
(sedimentieren) viel langsamer bei
niedrigem pH Wert aber die Ursachen
sind völlig verschieden: Hämoglobin
fällt zu Teilen, BSA dehnt sich aus.
D
S
D (107 cm2s-1)

S M P 1V P  

D
RT
pH nimmt ab
Gel Chromatographie
Polymer Partikel
des Gels
Kleinere
Moleküle treten
den wässrigen
Innenraum des
Partikels ein.
Andere
(trennende)
Moleküle
Größere
Moleküle
können
können nicht
eindringen, sie
bleiben außen.
Gel Chromatographie
Die Moleküle gelöster Stoffe werden aufgrund ihrer Größe
(ihres hydrodynamischen Volumens) getrennt. Der
Trennungseffekt beruht auf unterschiedlichen
Diffusionsvolumina für unterschiedlich große Moleküle. Die
porösen Polymere der stationären Phase erlauben
kleineren Molekülen einzudringen, wodurch sich das ihnen
zur Verfügung stehende Diffusionsvolumen vergrößert und
sich somit die Retentionszeit verlängert. Kleine Moleküle
werden demnach stärker zurückgehalten als große, denen
nur Zwischenräume zwischen dem Polymergranulat
zugänglich sind und die daher schneller durch die Säule
fließen. Daher sind große Moleküle in den früheren
Fraktionen des Eluats, während kleinere Moleküle später
eluieren.
Gleichgewicht von zwei Effekten (Kräften):
- Lösungsmittelfluß und
- Partition in die stationären Phase des
Gelpartikels
oder
Partikel
in der stationären
Phase des Matrix
Lösungsmittelfluß
Wir müssen die Elutionsvolumen messen; Ve, oder 
Vo
Ve
Vi
Das erhaltene Elutionsvolumen liegt zwischen zwei Grenzen
Vo = Elutionsvolumen der völlig ausgedrängten Moleküle
Vi = Elutionsvolumen der völlig aufgenommenen Moleküle
Elutionsvolumen
 =
Ve - Vo
Vi - Vo
Geschwindigkeit des Partikels
Geschwindigkeit des Lösungsmittels
σ ist das Maß wie der Innenraum des Gelpartikels
für das untersuchten Molekül zugänglich ist
  0.9
Kleines Molekül
  0.1
Großes Molekül
Zugängliches Volumen im
Matrix
 hängt von der Größe und Gestalt des Moleküls ab
Ve - Vo
 =
Vi - Vo
Volumen des Innenraumes
des Gelpartikels
Das Elutionsvolumen bzw. σ bestimmt den Stokes Radius des Makromoleküls.
Bei Eichung der Gel Chromatographie, die Standarde werden lieber nach
Molmassen als nach Stokes Radii ausgewählt. Die Gestalt und das spezifische
Volumen des geprüften Moleküls soll mit der Form und dem spezifischen
Volumen der Standarde übereinstimmen.
Beispiel: Elution kugelförmiger Proteine mit Sephadex G-200
In Experimenten, die Retardation des Makromoleküls in Gel Filtration
Chromatographie zeigt ausgezeichnete Korrelation mit dem Stokes Radius
bestimmt mit Hilfe der Diffusion.
Wenn die Standarde und die unbekannte Makromoleküle die selbe Gestalt
haben, dann – und nur dann – die Gel Filtration Chromatographie gibt gute
Schätzung der Molmasse. Allerleie Abweichungen von der Kugelform
resultieren größeren Stokes Radius, d.h. wir bekommen den Maximum Wert
des Stokes Radius mit diesem Method.
Sucrose
Vi
1
3.0 völlig aufgenommen
cyt c
2.5
BSA

2
globulare
(kugelförmige)
Proteine
Katalase
Dextran blau 0
Vo
1.5
1.0
104
105
log (Molmasse)
106
Ve
Vo
völlig ausgeschlossen
Beispiel: Activer Transport mit Hilfe von außen Membran
Proteinen und TonB in E. coli
Erforderlich zum Ferric Ion Transport
durch Ferrichrome Komplex
FhuA Transport Protein
Das aktive Transportsystem ist zum
TonB gekoppelt.
Das TonB Protein ohne das N-Terminal
Membrane Anchor wird ausgedrückt und
karakterisiert:
ein His-tag am N-Terminus begünstigt die
Isolation and Reinigung von H6-’TonB in
einem einziegen Schritt.
Das erhaltene Protein ist wasserlöslich
und die berechnete Molmasse beträgt
MP ≈ 24.880
Science (1998)282,2202-
TonB
Gel (Size Exclusion) Chromatographie von H6-TonB
mit Superose 12 Säule
Totales Volumen: Vi = 21 ml
gemesst durch Elution von
NaNO3
Experimentelle
Resultate
Verdrängtes (Void) Volumen: V0 = 7,3 ml
gemesst durch Elution von
Dextran blau 2000
Kalibration (Eichung) gegen Rs
Rs = 4,1 nm
Thyroglobulin Rs = 8.6 nm; Ve = 8.8 ml
Ferritin Rs = 6.3 nm; Ve = 10.7 ml
Katalase Rs = 5.2 nm; Ve = 11.7 ml
Aldolase Rs = 4.6 nm; Ve = 12.0 ml
Bovine Serum Albumin Rs = 3.5 nm; Ve = 12.5 ml
Ovalbumin Rs = 2.8 nm; Ve = 13.4 ml
Chymotrypsinogen Rs = 2.1 nm; Ve = 14.9 ml
RNase Rs = 1.75 nm; Ve = 15.5 ml
Journal of Bacteriology, May 2001, p. 2755-2764, Vol. 183, No. 9
H6-TonB
Sedimentationsgeschwindigkeit
Sedimentationsgleichgewicht
Gel Chromatographie
Messung: S20,w = 1.4 S
Berechnung von MP
 = 1.007 g/ml
 = 1.04 Poise
V = 0.7376 ml/g
(aus Sequence)
Rs = 4.1 nm
(aus Gel Filtration)
Rs = MP(1 - V)/6NS20,w
MP = 28.000
MP = 30.000
0.8 mg/ml Protein
18.000 rpm in der
Nacht bei 20oC
Steigung = MP(1-V)
 = 1.007 g/ml
V = 0.7376 ml/g
Rs = 4,1 nm
Berechnung Rmin =
(3MPV/4N)1/3 = 1,9 nm
(Kugel ohne Hidration mit
MP = 24.900 (Sequence)
Das Molekül ist äußerst
asymmetrisch
Schlußfolgerung:
H6-TonB bildet Monomer in Lösung
Rs/Rmin = 2.1
Gestalt des Proteins TonB
mit der Annahme von
0,3 Gramm H2O/Gramm Protein Hydration
Rmin = 2.0 nm
Rs/Rmin = 2
Das entspricht zu einem Drehellipsoid mit
Axialverhältnis von 15:1
240 Å x 16 Å
TonB wandert aus der inneren
(zytoplasmischen) Membran (CM) zu
der äußeren Membran (OM) im
periplasmischen Bereich (PP) des
Bakteriums.
Elektrophorese
Elektrophorese
Wanderungsrichtungen der Ionen
Gleichspannung, U
d
Elektrophorese bezeichnet die Wanderung großer
elektrisch geladener Teilchen (Proteine, ganze
Zellen) durch einen als Trägermaterial dienenden
Stoff unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes.
Negativ geladene Moleküle (Anionen) wandern zur
positiv geladenen Anode und
positiv geladene Moleküle (Kationen) wandern zur
negativ geladenen Kathode.
Die Wanderungsgeschwindigkeiten verschiedener Ionen hängen von deren Ladung,
Form und effektiver Größe sowie von der Lösungsumgebung und von der Stärke des
elektrischen Feldes ab.
1) Die einfachste (naivste) Beschreibung: Wenn die auf die Teilchen wirkende Kraft q·E
(q = e⋅z, wobei z ist die Anzahl der Ladungen an einem Molekül, E = U/d ist die
Feldstärke) gleich der Reibungskraft f·v ist, beobachtet man eine konstante
Wanderungs-geschwindigkeit v = q·E/f. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist somit
proportional der angelegten Spannung. Als charakteristische Grösse für die Mobilität des
Moleküls führt man die elektrophoretische Beweglichkeit ein:
μ=
Wanderungsgeschwindigkeit
Elektrische Feldstärke
=
q
f
Der Reibungskoeffizient f hängt sowohl von der Masse und der Form des wandernden
Moleküls als auch von der Viskosität des umgebenden Mediums ab.
Beispiel: Das Protein Albumin hat eine elektrophoretische Beweglichkeit von
μ = 4·10-9 m2 V-1 s-1 bei pH = 4. Mit einer Spannung U = 2000 V und einer Laufstrecke
von d = 20 cm ergibt sich hieraus eine Wanderungsgeschwindigkeit von
v = 4·10-5 m s-1 = 14,4 cm h-1 auf dem Gel.
2) Eine bessere Beschreibung. Die exakte Berechnung von elektrophoretischen
Beweglichkeiten ist komplizierter, da
- der effektive Wert der elektrischen Ladung eines wandernden Moleküls (q) von seinem
hydrodynamischen Verhalten und seinen Solvatationsbedingungen abhängt,
- die genaue Form des Moleküls unbekannt ist und
- das Teilchen und die (entgegengesetzt geladene) Ionenwolke in entgegengesetzten
Richtungen und mit verschiedenen Geschindigkeiten (v und v’) wandern.
Die Ionenwolke wird an der Vorderseite
des Teilchens ständig wieder neu
gebildet. Auf dieser Weise kommt es zu
einer zusätzlichen hydrodynamischen
Bremsung des Teilchens duch die
umgebende Ionenwolke dessen Radius
ist durch die Debye-Länge (λD) gegeben.
v
 E D
E

Beweglichkeit
η: Viskosität des Mediums, σE: „elektrophoretisch wirksame” Ladungsdichte auf der Teilchenoberfläche.
Elektrophoretische Beweglichkeit
Wenn der kleinste Krümmungsradius des Teilchens größer ist als die Dicke λD der
Ionenwolke (diffuse Doppelschicht), dann

 E D

Die elektrophoretische Beweglichkeit ist i)
proportional zu „elektrophoretisch wirksame”
Ladungsdichte auf der Teilchenoberfläche σE, ii)
umgekehrt proportional zur Viskosität η des Mediums
und iii) wächst linear mit der Debye-Länge λD an.
Ad i) Im allgemeinen ist σE verschieden von der eigentlichen Ladungsdichte σ des
Teilchens. Dies hängt u.a. damit zusammen, daß wegen Oberflächenrauhigkeiten ein
Teil der Gegenionen bei der Wanderung des teilchens mitgeschleppt wird, wodurch der
Absolutbetrag der wirksamen Ladungsdichte verkleinert wird.
Ad iii) Das erklärt sich daraus, daß bei kleinem λD, d.h. bei eng dem Teilchen
anliegender Ionenwolke die hydrodynamische Bremsung (die „extra Kraft”) groß wird.
Die Beweglichkeit kann man auch mit dem Zeta-Potential ausdrücken:
0 r



Physikochemischer Hintergrund:
Ionen in Coulombscher Wechselwirkung
Die elektrisch geladene Lösungsmittelmoleküle und
Ionen der Elektrolyt stehen in Wechselwirkung
miteinander kontrolliert duch das Coulombsche
Gesetz der Elektrostatik. Jedes Ion befindet sich im
Zentrum einer Wolke aus entgegengesetzt geladenen
Ionen (durch Kreise angedeutet).
Nachfolgen:
1) Abschirmung der elektrostatische Wirkung der
Ionen (Elektrode). Die Ionenwolken (und die
Lösungsmittelmoleküle) als Dielektrikum schwächen
die Coulombschen Wechselwirkungen ab und
schirmen die Ladung des Ions (Elektrode) ab. Die
karakteristische Länge der Abschirmung (DebyeℓD
Länge λD) wird als Radius der Ionenwolke betrachtet.
2) Räumliche Verteilung der Ionen. Obwohl die Ionen in der Lösung sich gleichmäßig
verteilen (siehe die Abbildung), die Verteilung wird nicht mehr gleichmäßig in der
direkten Umgebung des ausgewählten Ions (Elektrode) bleiben, worauf die thermische
Bewegung zu einer stärkeren Verteilung der Ionen führt.
Grundfrage: wie verteilen sich die Ionen um eine Elektrode oder um ein ausgewähltes
(Zentral)ion?
Ionenverteilung um eine Elektrode in
Elektrolytlösung
Ionenverteilung um ein zentrales Partikel in Lösung
Positiv geladenes Gegenion
Negativ geladenes Co-Ion
Schubebene
Negativ geladenes
Zentralion
Stern Doppelschicht
mit fest gehaltenen
Gegenionen
Diffuse Schicht mit frei
beweglichen Ionen
Ions im Gleichgewicht
mit der Lösung
Debye-Länge
Gouy-Chapman-Modell
•
•
•
•
Grundfrage: Wie verteilen sich die Ionen um eine geladene Platte (Elektrode)?
Grundidee: zwei gegenläufig Prozesse
Das elektrostatische Feld der Elektrode (oder zentrales Ions) zieht entgegengesetzt
geladene Ionen an
Die Molekularbewegung zerstört immer wieder jede Ordnung
Das elektrische Potential φ(x) hängt von der Ladungsdichte ρ(x)
selbst ab:
2
d  x 
dx 2

 x 
 r 0
Poisson-sche Gleichung
abgeleitet aus dem Gaussschen Gesetz der Elektrostatik
Potential, φ [mV]
Trotz aller Kompliziertheit: näherungsweise ist die Lösung
der Gleichungen rein exponentiell:
 x 
 x   0  exp   
 D 
mit der Debye-Länge:
I:
2 N A e2 I
D 
 r 0 kT
Abstand, x [nm]
λD
NA: Avogadro Konstante
e: elementare Ladung
ε: Dielektrizitätskonstante
kT: Boltzmann Faktor
I: Ionenstärke der Lösung:
1
I   zi2  ci
2 i
zi : Ladungszahlen der Ionensorten
ci : Konzentrationen der Ionensorten in der Lösung
Gouy-Chapman-Modell
Zusammenhang zwischen Flächenladungsdichte σ und Grenzflächenpotential φ0
Analogie zwischen einem Plattenkondensator und einer elektrischen Doppelschicht
Die für einen Plattenkondensator gültige Beziehung
zwischen Feldstärke E und Ladungsdichte σ
  0 r  E
Kann auf die Doppelschicht übertragen werden,
sofern E = -dφ/dx die Feldstärke unmittelbar an der
Wand (x = 0) eingesetzt wird:
 d 

 dx  x0
   0  r  
Der exponentielle Verlauf des Potentials ist schon bekannt:

x 

 D 
und die gesuchte Beziehung lautet:
 x   0  exp  
 D
0 
0 r
oder
E D

0 r
Zeta-Potential
Trägermaterials
Die verschiedene Trägermaterials meist gequollene Gele aus Agarose oder
Polyacrylamid führen zu unterschiedlichen Ionen-beweglichkeiten. Die
Polymermoleküle des Gels bilden ein mehr oder weniger engmaschiges,
dreidimensionales Netzwerk.
Gele aus Polyacrylamid werden durch PolyAgarose-Gele sind relativ
merisation von Acrylamid hergestellt. Sie weisen
groß-porig (150 nm bei 1%
wesentlich kleinere Poren auf (3–6 nm). Die
und 500 nm bei 0,16 %
Porengröße hängt von der AcrylamidGelen).
konzentration und dem Vernetzungsgrad ab.
Schema der Herstellung des
Polyacrylamid Gels aus
ungeordneter (random) Struktur.
Übergang aus verdünnter Polymer
Lösung (A) durch konzentrierte
Lösung (B) zu Gel (C).
--o– Punkt für Kreuzverbindung
Unbekanntes Protein
Molmasse Standarde
Proteinlösung
Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung
analysiert mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE)
Richtung der Wanderung
--●-- Punkt für Anschluß
Anwendungen: 1. Blutbild,
Elektrophorese von Blut Serumproteinen, diagnostische
Aussagemöglichkeiten
Die Untersuchung der Serumproteine ist bei
chronisch-entzündlichen Erkrankungen, Verdacht
auf monoklonale Gammopathie bzw.
Plasmozytom und Verdacht auf Antikörpermangel
(humoraler Immundefekt) wichtig.
Anwendungen: 2. Ferguson Analyse
Empirisch wurde für die (relative) Beweglichkeit folgender Zusammenhang gefunden:
log   log 0  K R  cGel
mit μ0, der elektrophoretischen Beweglichkeit ohne den zurückhaltenden Matrixeinfluss
des Gels (cGel = 0), KR bezeichnet die Retention durch Reibung und cGel beschreibt die
prozentige (%) Konzentration des Trägermaterials.
μ0 hängt vom q (Ladung) und Stokes Radius (Gestalt) des Moleküls ab.
KR hängt nur vom Stokes Radius, aber nicht vom q ab.
In den Ferguson-Plots wird dieser Zusammenhang graphisch ersichtlich.
1
log μ
kleine Makromoleküle mit hoher Ladung
2 kleine Makromoleküle mit geringer Ladung
3
cGel (%)
grosse Makromoleküle mit hoher Ladung
und grosser Steigung
Anwendungen der Ferguson Analyse:
die Östrogenrezeptoren
Östrogenrezeptoren sind Steroidrezeptoren, die durch das Steroidhormon
Östrogen aktiviert werden.
log μ
Steigung
cGel (%)
KR
√KR
?
KR
Rs
Mp
Stokes Radius, Rs (nm)
Markierung der Rezeptoren auf dem Gel durch Verbindungversuch mit radiomarkierten Östrogen Analogen.
Gereinigtes Material ist nicht erforderlich.
Die Molmasse MP aus Stokes Radius Rs kann man nur mit Annahme der kugelförmigen Gestalt berechnen.
Anwendungen der Ferguson Analyse:
SDS-Protein Komplexe
Zum Trennmedium auf Plyacrylamidbasis kommt noch SDS (Natriumdodecylsulfat). Dieses
anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro Gramm Protein
binden ungefähr 1,4 Gramm SDS, sodass die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung
aufweisen. Die negativen Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was
zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der Proteine führt. Dies
erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn die längeren
Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere Proteine. Das SDS umgibt das
linearisierte Protein mit einer näherungsweise ellipsoiden Hülle. Die Eigenladungen der Proteine
sind unter der SDS-Beladung vernachlässigbar.
Vorteile: 1) Die verschiedene SDS-Protein
Komplexe haben die gleiche Gestalt. Der selbe
Zusammenhang ist gültig zwischen dem Stokes
Radius Rs und der Molmasse MP bei jedem Protein:
KR in Ausdruck von Ferguson hängt von der
Molmasse ab.
Schematische Darstellung einer Micelle
aus Peptidkette und SDS-Molekülen.
2) Größere Proteine bilden längere Komplexe mit
mehr Ladungen (q) und größere Retention durch
log   log 0  K R  cGel
Reibung (f). Die Ladungen und Größe der SDSProtein Komplexe ändern sich proportioniert.
unabhängig
abhängig
Die Änderungen von q und f werden im Verhältnis
von der
μ0 = q/f ausgeglichen, deswegen μ0 hängt nicht von
der Molmasse ab.
Molmasse
Der Fixwert von μ0 ermöglicht den Stokes Radius Rs
mit Gebrauch von einem Gel und Standarden zu bestimmen.
Es reicht nur ein einzieges Gel zu
benutzen um Rs (mit Standarden)
zu bekommen.
Man kann Rs aus einem Gel
NICHT erhalten.
verschiedene
μ0 Werte
erhöhter Stokes
Radius, Rs
elektrophoretische
Wanderung
schnell
der gleiche
μ0 Wert
langsam
0 1
5
% acrylamid
10
größere Steigung erhöhter Stokes
Radius, Rs
log μ
0 1
5
% acrylamid
10
Es ist nicht erforderlich die
Gelkonzentration zu ändern.
NATIVE PROTEINE
SDS-PROTEIN KOMPLEXE
Weil alle SDS-Protein Komplexe die gleiche Gestalt besitzen,
aus dem Stokes Radius Rs kann man die Molmasse MP erhalten.
Hausaufgaben
1) In einer Zentrifuge befinde sich eine Suspension einheitlich kleiner Teilchen.
Bei einer Rotationsfrequenz von 1 000 Hz beträgt ihre Sedimentationsgeschwindigkeit 2 mm/min. Welchen Wert hat diese, bei Verdoppelung der
Rotationsfrequenz?
2) In einer Zentrifuge rotiert eine kleine Masse im Abstand 9,8 cm um die
Zentrifugenachse mit einer Winkelgeschwindigkeit 100 1/s.
a) Wievielmal größer ist ungefähr die auf die Masse wirkende
Radialbeschleunigung (Zentrifugalbeschleunigung) als die
Fallbeschleunigung?
b) Wie groß ist die Bahngeschwindigkeit der Masse?
3) Wie lange dauert es, bis ein E. -coli Bakterium mit der Dichte 1,10 g/mL und
dem Radius 1 μm unter der Einwirkung des Gravitationsfeldes der Erde in
Wasser (Dichte 1 g/mL und Viskosität 1·10-3 Ns/m2) 1 cm sedimentiert?
Hausaufgaben
4) Bei der Sedimentation von Ribonuklease in einer Ultrazentrifuge wurde bei
einer Drehfrequenz von 52.400 min-1 der Abstand r der Phasengrenze der
sedimentierenden Moleküle in Abhängigkeit von der Zeit t gemessen:
t (min)
r (cm)
0
5,908
32
5,980
64
6,045
96
6,112
Berechnen Sie mit Hilfe dieser
Meßwerte näherungsweise die
Sedimentationskonstante S!
5) Die relative Molekülmasse M und die Dichte ρ von Pepsin und Urease
betragen
M (Da) ρ (g/mL)
Bestimmen Sie daraus den
Pepsin
37 000
1,33
Radius r der sphärischen
Makromoleküle unter
Urease 480 000
1,37
Vernachlässigung der Hydration.
Hausaufgaben
6) In 0,25 M Sucroselösung werden Rattenleber-Mitochondrien suspendiert. Bei
0oC hat diese Sucroselösung eine Dichte von 1,035 g/mL und eine Viskosität
von 0,0231 g·cm-1·s-1. Die Dichte der Mitochondrien in dieser Lösung bei 0oC
ist 1,100 g/mL. Wie lange muß man mindestens bei 0oC und 8.000 min-1
Drehzahl zentrifugieren, damit die Mitochondrien vom oberen Meniskus (ra = 5
cm von der Rotationsachse) auf den Boden des Zentrifugenröhrchens (re = 10
cm von der Rotationsachse) absinken? Die Mitochondrien können
näherungsweise als kugelförmige Teilchen mit dem Radius 1 μm angesehen
werden, die das Stokessche Reibungsgesetz befolgen.
Hausaufgaben
7) In einer KCl-Lösung sei in x-Richtung ein Konzentrationsgradient vorhanden. An der
Stelle x betragen die KCl-Konzentration 0,1 M und der Konzentrationsgradient von KCl 1
M/cm. Wie groß mußte man am Ort x die elektrische Feldstärke machen, damit dort der
Transport von K+ verschwindet?
8) Wie groß ist die Ionenstärke einer Lösung, die 0,1 M NaCl und 0,1 M CaCl2 enthält?
9a) Das Kulturmedium einer Zellkultur besitze einen pH-Wert von 7,0 und eine
Ionenstärke von 0,1 M. Die Zelloberfläche ist negativ geladen mit der Ladungsdichte von
einer Elementarladung pro 10 nm2. Man berechne den pH-Wert an der Zelloberfläche!
b) Unter diesen Bedingungen wird die elektrophoretische Beweglichkeit der Zellen
gemessen. Welchen Weg legt eine Zelle einer Feldstärke von 10 V/cm in 1 min zurück?
Man setze hier das elektrophoretische ζ-(Zeta)Potential näherungsweise dem
Grenzflächenpotential φ0 gleich.
(Debye-Länge 1,0 nm, Dielektrizitätskonstante des Wassers 80, Dielektrizitätskonstante
des Vakuums 8,85·10-12 Cb·V-1·m-1, Elementarladung 1,6·10-19 Cb, Viskosität des
Mediums 1,0·10-3 kg ·m-1 ·s-1, Temperatur 298 K.)