Nachweis gentechnisch veränderter Pflanzen in

Dr. Ivo Meier-Wiedenbach
Nachweis gentechnisch veränderter Pflanzen in
Lebensmittelproben mit Hilfe der Real-Time PCR
Die kommerzielle Nutzung von gentechnisch veränderten Organismen nimmt global zu, der Warenverkehr im Lebensmittelbereich wächst und es fehlt eine einheitliche International Regelung zur Kennzeichnung dieser Produkte. BIOTECON
Diagnostics bietet mit den foodproof® GMO Kits ein einfaches, validiertes Testverfahren für die genaue Kontrolle nationaler Richtlinien an.
Weltweit werden in 29 Ländern
auf über 160 Mio. Hektar kommerziell gentechnisch veränderten Organismen (GVO, eng. GMO) angebaut, das entspricht nahezu 10 %
der globalen Ackerfläche. Zu diesen
Ländern zählen unter anderem die
USA, Brasilien, Argentinien, Indien,
China, Australien und Spanien. Im
Mittelpunkt der Grünen Gentechnik stehen dabei Baumwolle, Mais,
Reis, Soja und Raps. So waren 2009
über 77 % der gesamten Sojaernte GVO, bei Baumwolle 49 %,
bei Mais 26 % und bei Raps 21 %.
Dabei gibt es große regionale Unterschiede: In den USA und Argentinien sind über 80 % des angebauten Mais gentechnisch verändert, in Brasilien sind es 60 %. In
der EU liegt der Anteil bei nur 2 %.
Im Sinne des Verbrauchers sieht
die EG-Verordnung Nr. 1829/2003
vor, dass aus GVO bestehende,
diese enthaltende oder daraus her-
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gestellte Lebens- oder Futtermittel
entsprechend mit dem Hinweis „gentechnisch verändert“ oder „aus genetisch verändertem (z.B. Mais) hergestellt“ gekennzeichnet werden.
Auch nicht für den Verzehr gedachte
GVO, z.B. Saatgut von gentechnisch
veränderten Pflanzen (einschließlich
Schnittblumen) oder gentechnisch
veränderte Zierfische müssen gekennzeichnet werden.
Ausgenommen sind Produkte, die
zufällige oder technisch unvermeidbare Spuren von GVO oder daraus hergestelltem Material enthalten. Der relative Anteil, unterhalb
dessen eine Kennzeichnung nicht
mehr erforderlich ist, beträgt dabei 0,9 %. Für andere Länder gibt
es ähnliche Vorgaben und Grenzwerte, z.B. 1 % relativer GVO-Anteil in der Schweiz, 4 % in Brasilien
und 5 % in Japan. Viele Länder besitzen diesbezüglich keine Vorga-
ben, z.B. ist in den USA eine Kennzeichnung freiwillig.
zusätzlich eine sehr genaue Quantifizierung durchgeführt werden.
Daher gewinnen sichere Nachweismethoden zur Kontrolle dieser gesetzlichen Richtlinien in der Lebensmittelindustrie zunehmend an Bedeutung, die sowohl zugelassene, als
auch nicht zugelassene GVO nachweisen und quantifizieren können.
Um den genauen Gehalt an GVO in
einer Probe zu bestimmen, müsste
auf jedes einzelne Event (Event ist
die Bezeichnung für eine stabile Integration ins Genom des Organismus) hin untersucht werden. Bei
der mittlerweile großen Anzahl an
Events am Markt wäre dies extrem
aufwändig und teuer.
Die am besten geeignete Methode
zum Nachweis von Veränderungen
am Erbgut ist die Real-Time PCR. Sie
ist sehr spezifisch, sensitiv und reproduzierbar. Die dabei zu untersuchende DNA ist ein relativ robustes Molekül, das physikalische
und chemische Belastungen während des Produktionsprozesses gut
übersteht und daher auch im Endprodukt nachweisbar ist. Schwierigkeiten kann es alleine bei hochprozessierten Produkten, wie z. B.
Öle und Mehle, geben. Außerdem
kann mit Hilfe der Real-Time PCR
Um den analytischen Aufwand möglichst gering zu halten, ist ein vorgeschaltetes Screening der Proben
daher äußerst sinnvoll. Mit einem
Screening nach nur vier häufig in
der Gentechnik verwendeten Elementen können bereits ca. 95 %
aller GVO eingeschlossen werden.
Diese Elemente sind der 35S Promotor des Blumenkohlmosaikvirus
(Cauliflower Mosaic Virus, CaMV
35S), die FMV-Promotor Sequenz
des Braunwurzmosaikvirus (Figwort
Event
P-35S
T-NOS
bar
FMV
Pflanze
GTS 40-3-2
+
+
-
-
+
MON 89788
-
-
-
+
+
A2704-12
+
-
-
-
+
Bt11
+
+
-
-
+
Bt176
+
-
+
-
+
CBH-351
+
+
+
-
+
GA 21
-
+
-
-
+
MIR604
-
+
-
-
+
MON 810
+
-
-
-
+
MON 863
+
+
-
-
+
NK 603
+
+
-
-
+
T25
+
-
-
-
+
TC1507
+
-
-
-
+
GS40/90
+
-
-
-
+
GT200/GT73
-
-
-
+
+
MS8xRf3
-
+
+
-
+
Oxy235
+
+
-
-
+
T45
+
-
-
-
+
+
-
+
-
+
-
-
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
+
-
+
Soja
Mais
Raps
Reis
LLRice62
Zuckerrübe
H7-1
Kartoffel
EH92-527-1
Baumwolle
LLCotton25
Tabelle 1: Real-time PCR Resultate mit verschiedenen zertifizierten Referenz-Materialien verschiedener GVO Events mit Hilfe des 4-Target-Kits
(35S, Nos, bar und FMV) foodproof® GMO Screening Kit. +: PCR Positiv, -: PCR Negativ
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foodproof® GMO Bt176 Quantification Kit jetzt auch mit 5‘ Nuclease
Sonden. Es wird das crylA(b) Genfragment nachgewiesen, welches
die Resistenz gegenüber Fraßschädlingen vermittelt. Zur Mengenbestimmung wird gegen das Referenzgen, in diesem Fall das Gen der Invertase, ivr1, gemessen.
Abb. 1: Ein typischer Real-Time PCR Lauf mit dem foodproof® RR Soya Quantification Kit.
Oben: Kurven der Kalibriergeraden (braun), der Positivkontrolle (grün), Negativkontrolle (violett) und zweier Proben (rot). Unten: Kalibriergerade, erstellt als Verdünnungsreihe aus dem mitgelieferten Standard.
Mosaic Virus, FMV), der Terminator
T-NOS des Nopalin Synthase Gens
aus dem Bakterium Agrobacterium
tumefaciens und das bar Gen des
Bodenbakteriums Streptomyces hygroscopicus, welches eine Resistenz
gegen Herbizide vermittelt. Events
wie Soja MON89788 (Roundup
Ready 2 Yield) und die Zuckerrübe H7-1, welche in der EU freigegeben sind, enthalten zum Beispiel
den FMV 35S Promoter (siehe Tabelle 1). Im nachfolgenden Verfahren kann dann gezielt eine Identifikation bzw. Mengenbestimmung
durchgeführt werden.
Mit den foodproof® GMO Kits von
BIOTECON Diagnostics steht eine
validierte, einfache und sichere Methode zur Messung von GVO in
Nahrungsmitteln zur Verfügung.
Mit Hilfe der Real-Time PCR können manipulierte Pflanzen nachgewiesen und quantifiziert werden.
Das Multiplex 4-Target foodproof®
GMO Screening Kit ermöglicht eine
Überprüfung der in der grünen Gentechnik am Häufigsten verwende-
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ten Elemente 35S, NOS, bar und
FMV in aufbereiteter DNA aus Nahrungsmitteln. Dadurch werden ca.
95 % aller gentechnisch veränderten
Pflanzen erfasst. Enthalten ist zusätzlich ein Nachweis für ein ubiquitär in Pflanzen vorkommendes
Gen, um die Qualität des Probenmaterials zu bestimmen. Ebenfalls
enthalten ist eine interne Amplifikationskontrolle (IAC). Für die Validierung des Kits wurden mehrere
Referenzmaterialien getestet (Tabelle 1), ebenso wie mögliche Kreuzreaktionen mit Bakterien, Hefen,
Pilzen und unmodifizierten Pflanzen. Demnach ist der Test 100 %
spezifisch.
Für eine Event spezifische Quantifizierung bietet BIOTECON Diagnostics mehrere Lösungen: Den
foodproof® GMO 35S Maize Quantification Kit, den foodproof® GMO
Bt176 Maize Quantification Kit und
den foodproof® GMO Soya RR
Quantification Kit.
Mit dem foodproof® GMO 35S Maize Quantification Kit kann mit Hilfe
des CaMV 35S Promotor der Gehalt
an GVO in Mais ermitteln werden.
Dieser Promotor ist in den wichtigsten Mais-Events zu finden, u.a.
in Bt11, Bt176, MON810, MON863
und NK603. Alle Maissorten, die
diesen 35S Promoter enthalten,
können nachgewiesen und deren
Gehalt in der Nahrungsmittelprobe
bestimmt werden. Finale Ergebnisse
einschließlich Aufarbeitung, DNAExtraktion und PCR erhält man in
weniger als zwei Stunden.
Für den spezifischen Nachweis des
von Syngenta produzierten Bt-Mais
mit dem Event 176 (Bt176, Handelsname NaturGard™ KnockOut™,
OECD Nr. SYN-EV176-9) bietet BIOTECON Diagnostics als Neuheit das
Für die Quantifizierung von
Roundup-Ready®-Soja, auch bekannt als Event GTS40-3-2, gibt
es das foodproof® GMO Soya RR
Quantification Kit. Roundup Ready
Soja trägt ein Gen, dass für das Enzym CP4 EPSPS (5-Enolpyrovylshikimate-3-Phosphat Synthase aus
Agrobacterium sp., Stamm CP4)
kodiert, welches eine Toleranz gegen Glyphosat-haltige Herbizide
(z.B. Roundup) vermittelt. Roundup
Ready Soja wird durch das DNAFragment der CaMV 35S-Promoter Sequenz und das Chloroplasten
Transit Signal Sequenz aus Petunia
hybrida nachgewiesen. Als Referenzgen dient das Lektin-Gen Le1.
Die PCR-Schnelltests zur relativen
Quantifizierung von GMO haben
eine hohe Sensitivität: Selbst geringe
Konzentrationen von nur 0,1 % des
gentechnisch veränderten Matewrials lassen sich nachweisen. Mit
Hilfe einer Standardreihe aus der
mitgelieferten Calibrator-DNA kann
einfach eine relative Mengenbestimmung durchgeführt werden. Zusätzlich wird ein Schutz vor Kreuzkontamination durch den Einsatz
von Uracil-N-Glycosylase geboten.
Zur Aufarbeitung unterschiedlicher
pflanzlicher Lebensmittelproben und
DNA-Extraktion empfiehlt sich das
bewährte foodproof® GMO Sample
Preparation Kit. Finale Ergebnisse
einschließlich Aufarbeitung, DNAExtraktion und PCR erhält man in
weniger als zwei Stunden.
BIOTECON Diagnostics GmbH
Hermannswerder 17 • 14473 Potsdam
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