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Vorlesung Biophysik I - Molekulare Biophysik
W. Kremer
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24.10.
31.10.
07.11.
14.11.
21.11.
28.11.
05.12.
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12.12.
19.12.
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09.01.
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16.01.
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23.01.
30.01.
06.02.
Zelle
Biologische Makromoleküle I
Biologische Makromoleküle II
Nukleinsäuren-Origami (DNA, RNA)
Aminosäuren-Origami (Protein-Nanotechnologie)
Molekulare Motoren
Methoden zur Strukturbestimmung: Magnetische Resonanzspektroskopie I Grundlagen
Magnetische Resonanzspektroskopie II - Mehrdimensionale NMR- Spektroskopie
Magnetische Resonanzspektroskopie III – Proteinstrukturbestimmung,
Dynamik und Bewegung, ESR-Spektroskopie
Röntgenstrukturanalyse I – Streuung von Wellen, Faltungstheorem, Pattersonfunktion,
Phasenproblem
Röntgenstrukturanalyse II - Synchrotonstrahlung, zeitaufgelöste Kristallographie
Röntgenkleinwinkelstreuung
Elektronenmikroskopie I – Elektronenoptik, Kontrastentstehung und Bildinformation
Elektronenmikroskopie II – Kristalline Objekte, Tomographie
Rastertunnel- und Rasterkraftmikroskopie
HPr, ein kleines Protein
Zusätzliche Organisationsebenen
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Sekundärstruktur
Motiv (motif)
Faltungstopologie (Fold)
Architektur (architecture)
Domäne
Tertiärstruktur
Was ist die Struktur eines Polymers (Proteins)?
Grenzfälle: Zufallsknäul (random coil)
Ensemble identischer, starrer Moleküle
Reales Protein: Irgendwo dazwischen…
Cave: Proteinstruktur ist stark abhängig von äußeren
Bedingungen!
Was ist die Struktur eines Polymers (Proteins)?
Ca. 30% aller Proteine im eukaryontischen Genomen sind nicht
kompakt gefaltet.
NMR-Spektroskopie zeigt, dass die meisten Peptide mit
Zufallssequenzen teilstrukturiert sind.
Die Evolution selektiert für einheitlich gefaltete Proteine mit
optimalen Faltungseigenschaften.
Was ist die Struktur eines Polymers (Proteins)?
Auch wohlgefaltete Proteine mit einer einheitlichen
mittleren Struktur zeigen große Abweichungen ihrer
Atompositionen mit der Zeit (oder im Ensemble)
Maß: RMSD (root mean square deviation),
Standardabweichung
N
RMSDi =
2
j
j
(
r
−
<
r
>
)
∑ i
i
j =1
Ni
mit rij der Koordianate des Atoms i in dem Konformer j
MD-Trajektorie für Barnase in
Wasser
α
C -RMSDs
der Barnase in 250 ps
Geometrie einer Polymerkette
r
r
r = ∑ Ii
i
I1
I2
r
Konformation von Biopolymeren
1.
Der Abstand r zwischen den Endpunkten
Für den Abstand der Endpunkte eines Moleküls gilt
r
r
r = ∑ Ii
r r
r r
r r
2
r = r ⋅ r = ∑ I i ⋅ I j = ∑ ai + 2∑ I i ⋅ I j
2
und
i, j
i
i
i< j
mit ai der Länge der Bindung i. Der mittlere quadratische Abstand < r2 > ergibt
sich damit zu
r
2
=
∑
i
a
2
i
+ 2∑
i< j
r r
Ii ⋅ I j
Konformation von Biopolymeren
Wenn a2 das mittlere Quadrat der Länge der einzelnen Kettenglieder darstellt, dann gilt
∑
ai2 = na 2
i
und damit
r
2 1/ 2
r r ⎤
⎡ 2
= ⎢ na + 2∑ I i ⋅ I j ⎥
i< j
⎣
⎦
2 1/ 2
= ⎡⎣ na ⎤⎦
1/ 2
⎡ 2
⎤
= ⎢ na + 2∑ I i I j cos (α ) ⎥
i< j
⎣
⎦
1/ 2
= n ⋅a
Bei einer Gauß‘schen Kette können die Kettenglieder jede beliebige Orientierung einnehmen, sind
also im Mittel um die Bindungslänge a entfernt.
Konformation der Biopolymere
2.
Der Gyrationsradius
Die mittlere quadratische Abweichung der Abstände ρ der Atome zum
Schwerpunkt der Kette ergibt sich mit rij, dem Abstand zwischen Atom i und
Atom j)
R
2
G
1
=
n +1
n
∑
ρ
i=0
2
i
1
=
(n + 1 )2
∑
i< j
rij2
Dieser Gyrationsradius ist, unabhängig von der Form des Polymeren, ein
charakteristischer Parameter des Moleküls. Im Falle einer Gauß‘schen Kette gilt
insbesondere mit dem End-zu-End-Radius r
R
2
G
=
1
6
r
2
,
n →
∞
Konformation der Biopolymere
3.
Einschränkungen durch die Valenzbindung
Die Annahme der statistischen Unabhängigkeit der Kettenglieder zur Beschreibung der Konformation
eines Makromoleküls lässt sich mit sterischen Randbedingungen begründen. Die Summe der mittleren
Skalarprodukte
∑
r r
Ii ⋅ I j
i< j
ist ein Korrelationsterm zwischen den Bindungen. Seine Berechnung erfordert die Festlegung der
Orientierung beider Bindungen i und j unter Berücksichtigung aller dazwischen liegenden Bindungen.
Betrachte dazu folgendes Fragment
Simulated Annealing Lauf eines Proteins
(Peptidhauptkette)
Levinthal Paradox der Faltung
Der Konformationsraum ist zu groß, um die Faltung in
endlicher Zeit erfolgen zu lassen. Wenn man für φ und ψ
jeweils 100 verschieden Winkel zuläßt, ergibt sich für 100
Aminosäuren
N = 100200 Möglichkeiten. Wenn ein Winkel in einer
Pikosekunde abgesucht wird, ergeben sich
t = 10189 s. (1 Jahr = ca 106.5 s)
Realistischer Faltungstrichter mit
zwei Zuständen
ΔG0 :
80 kJ mol-1
ΔG= :
56 kJ mol-1
functional
state 1
functional
state 2
Erweiterung des Landschaftsmodells
Proteindynamik allgemein wird in jüngster Zeit generell als „hopping“
zwischen verschiedenen Zuständen geringer Energie eines Proteins
beschrieben.
< 170Κ
> 170Κ
Beispielhaft gezeigt (als projizierte Krater) sind drei statistische Zwischenzustände. Die
kleinen Kreise in den Kratern symbolisieren lokale Konformationsminima. Bei
Temperaturen unter ca. 170 K können Bewegungen nur zwischen den
Konformationsminima ausgeführt werden, darüber sind auch Übergänge in andere
Zwischenzustände möglich (fette rote Pfeile)
Was liefert uns die NMR?
Untersuchen eines Proteins bei konstanter physiologischer Temperatur
Energie
Temperatur konstant
10%
15%
75%
Entropie
NMR- Messung ist Bildung eines Mittelwerts über alle an einer
bestimmten Temperatur vorhandenen „Zwischenzustände“
eines Proteins. Was man letztlich betrachtet sind
Besetzungswahrscheinlichkeiten
Was liefert uns die NMR?
Untersuchen eines Proteins bei konstanter, aber erhöhter Temperatur
Energie
Temperatur konstant, aber erhöht
5%
45%
50%
Entropie
Die Besetzungswahrscheinlichkeiten ändern sich, die Struktur (die
mittlere aus NMR- Daten generierte Struktur) ändert sich.
Was liefert uns die NMR?
Untersuchen eines Proteins bei kontinuierlicher Temperaturerhöhung
Energie
Temperatur
Vorstellung: Protein wird durch Temperaturerhöhung (Energiezufuhr) in andere
wohlgefaltete Zustände überführt, die am „Grund des Faltungstrichters“ noch
existieren. Man beobachtet jeweils unterschiedliche Mittelwerte.
Bestimmung der räumlichen Struktur
von Objekten
Beugungsmethoden:
- optische Mikroskopie
- Elektronenmikroskopie
- Röntgenkristallographie
- Neutronenkristallographie
=> Wellenlänge λ ∼ d
NMR-Methoden:
- MR-Tomographie
- NMR-Strukturbestimmung
=> Wellenlänge λ
>> d
NMR
Nuclear Magnetic Resonance
Kernmagnetische Resonanz
Kernspinresonanz
Paul C. Lauterbur und Peter Manfield,
Nobelpreis Medizin 2003
Kurt Wüthrich, Nobelpreis Chemie 2002
Richard R. Ernst, Nobelpreis Chemie 1991
Felix Bloch & Eduard Purcell, Nobelpreis
Physik 1952
Magnetische Resonanzmethoden
Elektronenspinresonanz
(ESR)
Kernmagnetische Resonanz
(NMR)
Ungepaarte Elektronenspins
Kernspins
Metallkomplexe
Radikale
Spinlabel
NMR in homogenen Medien
In-vivo-Spektroskopie
NMR-Tomographie und NMRMikroskopie
Das Phänomen der kernmagnetischen Resonanz beruht
auf
r
der Wechselwirkung des magnetischen Moments μ eines
Atomkerns mit einem äußeren magnetischen Feld.
Die Ursache für dieses magnetische Moment
ist der
r
quantenmechanische Eigendrehimpuls J, den einige
Atomkerne haben:
r
J = I (I + 1)h
I: Kernspinquantenzahl (I=0, ½, 1, 1 ½, …6)
Plancksches Wirkungsquantum: h = h 2π
r
r
μ
Der Eigendrehimpuls J und das magnetische Moment
sind verbunden:
r
r
μ = γJ ⇒ μ = γh I (I + 1)
r
γ: gyromagnetisches Verhältnis der jeweiligen Kernsorte
I: Kernspinquantenzahl (I=0, ½, 1, 1 ½, …6)
Plancksches Wirkungsquantum: h = h 2π
Ein großes gyromagnetisches Verhältnis bedeutet eine hohe
Empfindlichkeit des entsprechenden Isotops.
Der Eigendrehimpuls orientiert sich in einem äußeren
Magnetfeld:
→ Komponente in z-Richtung (Feldrichtung) ist ganz- oder
halbzahliges Vielfaches des Planck’schen
Wirkungsquantums
J z = mh ⇒ μ z = mγh
m: magnetische Quantenzahl (-I,…,0,…,+I)
Kernspin = Eigendrehimpuls des Kernes
Der Kernspin J ist gequantelt
< Jz > = m
m = - I, - I + 1, .... , I
Größe der Quantenzahl I:
1H
2H
23Na
I = 1/2
I=1
I = 3/2
Klassisches Bild
⇒ Ein äußeres Magnetfeld führt zur Aufspaltung
der Energieniveaus des betrachteten
Atomkerns:
z.B. 1H: I=1/2 ⇒ zwei mögliche Energieniveaus
m= +1/2, ↑ und -1/2, ↓
Parallel bzw. Antiparallel zum äußeren Hauptfeld
E = - μ B0 = - γI J B0 = - γI m ħB0
für Teilchen mit Spin I = 1/2 (z. B. 1H):
m = - 1/2 oder m = + 1/2
ΔE = E2 – E1 = γI ħB0 = ħω
Resonanzbedingung: ω = γI B0
Larmorfrequenz ist abhängig vom
gyromagnetischen Verhältnis γ und der Stärke des
Feldes:
⇒ für jede Kernsorte verschieden
z.B. 11.4 Tesla Magnetfeld:
1H: 500 MHz
15N: 50 MHz
13C: 125 MHz
Heliumfüllung (alle 3 Mon)
Stickstofffüllung
(jede Woche)
21.14 T supraleitender, gepumpter Magnet
1H-Resonanzfrequenz
900 MHz
Aufbau des 900 MHz Magnetes
Aufbau des 900 MHz Magnetes
Bei einem Feld Bo von 14.1 T ist die Resonanzfrequenz
ν = (1/2π) ω für Protonen (1H) 600 MHz, für 31P 242.9 MHz
Die Fläche unter der Resonanzlinie ist der Anzahl der Spins (→
Konzentration) proportional.
31P
1H
242,9
ν/MHz
600
ν/MHz
1H
NMR Spektrum von Ethanol
CH3-CH2-OH
Ringstromeffekt
3 cos 2 θ − 1
δ R = −C
3
r
Beschreibung des Spinsystems durch
Hamiltonoperator H und Zustandsfunktion |ψ>
Η |ψ> = Ε |ψ>
Kern-Zeeman-WW:
H = -γΙ ħB0Iz = - ωI ħ Iz
Chemische Verschiebung:
H = - (1-σ) γI ħB0Iz = - γI ħBeff Iz = - ωI‘ħIz
Indirekte Spin-Spin-Kopplung:
H = 2π ħJIS Ιζ Sz
1H
NMR Spektrum von GDP in D2O
β
GDP
α
31P
NMR Spektrum von GDP im Komplex mit Ras
β
GDP
freies Mg.GDP
α
1H
NMR Spektrum des Nef-Proteins von HIV-1
500 MHz / 11.75 T
pH-Denaturierung von Nef
Temperaturdenaturierung von Nef
Proteolytische Spaltung von Nef
131 min
0 min
Modell von Nef
Resonanzbedingung:
ω = γI B 0
Wichtige Wechselwirkungen der Kernspins
1. Kern-Zeeman-WW:
Magnetfeldabhängige Energieaufspaltung
Grundlage der klassischen NMR-Spektroskopie
2. Chemische Verschiebung:
Variation der Resonanzfrequenzen durch Elektronenhülle
Selektive Beobachtung einzelner Kernspins,
Strukturinformation
3. Indirekte Spin-Spin-Kopplung:
Kopplung der Kernspins via Bindungselektronen
Chemische Struktur, Winkelinformation
4. Quadrupol Kopplung:
Kopplung der elektrischen Kernquadrupolmomente mit dem elektrischen Feldgradienten
Breite Linien für I > ½ Kerne (z. B. 14N)
5. Dipolare Kopplung:
Direkte magnetische Kopplung der Kernspins
Abstands- und winkelabhängig, wichtigste 3D-Strukturinformation
6. Hyperfein WW:
Direkte magnetische Kopplung zwischen Kernspins und Elektronenspins
Abstands- und winkelabhängig, 3D-Strukturinformation in
Systemen
Präzession der Magnetisierung M im
Magnetfeld B0
dM
= γ IM×B = M×ω
dt
Blochsche Gleichungen
dM
1
1
= γ I M × B − ( M x e x + M y e y ) + ( M 0 − M z )e z
dt
T2
T1
Lösungen:
Bei B0 = Bz = const: Gedämpfte Präzession der
Magnetisierung M um das äußere Magnetfeld B0
Blochsche Gleichungen
Im Laborsystem:
dM
1
1
= γ I M × B − ( M x e x + M y e y ) + ( M 0 − M z )e z
dt
T2
T1
Im mit der Frequenz ω um die z-Achse rotierenden
Koordinatensystem:
dM x '
1
= (ω I − ω ) M y ' − M x '
dt
T2
dM y '
dt
= −(ω I − ω ) M x ' + γ I B1M z −
dM z
1
= −γ I B1M y ' + ( M 0 − M z )
dt
T1
1
M y'
T2
Lösungen im rotierenden Koordinatensystem:
In Anwesenheit des HF-Felds B1 mit Frequenz ω:
Β1 = 2Β1cosωt ex
= B1cosωt ex + B1sinωt ey+ B1cosωt ex – B1 sinωt ey
Im mit der Resonanzfrequenz ω rotierenden
Koordinatensystem Präzession um B1 mit der Frequenz
ω1 = γΙ B1
90o-Impuls: HF-Puls mit Länge t90, t90 = π/(2 γI B1)
T1-Relaxation = longitudinale Relaxation = Spin-Gitter-Relaxation
T2-Relaxation = transversale Relaxation = Spin-Spin-Relaxation
Abhängigkeit der dipolaren Relaxationszeiten von der rotatorischen
Korrelationszeit τR
Große Molekülmassen
breite Resonanzlinien
Resonanzlinie in Lösung: Lorentzlinie
Absorptionsline
Dispersionslinie
Dynamische Prozesse in Proteinen
Bewegungsvorgang
Zeitskala [s]
Vibrations- und Torsionbewegungen
100 ps – 0.1 ps
Lateraldiffusion in Membranen
100 ns – 0.1 ns
Diffusion in Lösung
1 μs - 0.1 ps
Rotationsdiffusion in Lösung
10 μs – 1 ps
Rotation aliphatischer Seitenketten im Protein
0.1 μs – 0.1 ns
Rotation von aromatischen Seitenketten
10 ms – 1 μs
Konformationsänderungen in Proteinen
10 μs – 100 ks
Freisetzung von Substraten bei enzymatischen
1 ms -1 Ms
Reaktionen
Messmethoden
-12
-9
-6
-3
0
3
Relaxation
chem. Austausch, Rex
Echtzeit
Restdipolkopplungen
HN-Austausch
lg
Korrelationszeiten und spektrale Dichten
Korrelationsfunktion G(f(t)) für zeitlich verändeliche Größe f(t)
G (τ ) = ⟨ f * (t ) f (t + τ )⟩
Spektrale Dichte J(ω): Fouriertransformierte von G(τ). Für
G (τ ) = G (0)e −|τ |/ τ c
∞
J (ω ) = ∫ G (0)e −|τ |/τ c e −iωτ dτ
−∞
2τ c
= G (0)
1 + ω 2τ c2
J/s
1/τc
Austausch zwischen zwei Plätzen
mit den Resonanzfrequenzen
ωo – Δω/2 und ωo + Δω/2
Im mit ω0 rotierenden
Koordinatensystem zwei
Grenzfälle:
|Δω τχ| >> 1
|Δω τχ| << 1
Simulation eines Two-Site Austauschs
(a) K = pA/pB =1
(b) K = pA/pB =2
Two possible Ras conformations
Switch I
Switch I
Switch II
Switch II
“Off state”: Ras(wt).Mg2+.GDP
“On state”: Ras(wt).Mg2+.GppNHp
Ras at different temperatures
278K
308K
31P
288K
2
1
β
0
γ
-4
-8
α
278K
-12
ppm
NMR spectra of Ras(wt).Mg2+.GppNHp
at different temperatures
1: seems to be similar to the open
conformation of the “off state”
2: equal to the effector bound (“on”) state
Ras(wt)Mg2+.GppNHp mit Zn2+-Cyclenen
+Χυ2+−χψχλενε
+Ζν2+−χψχλενε
+Χο2+−χψχλενε
2
Zn2+-Cyclen
1
Ρασ (ωτ)
4
0
−4
−8
−12
ππμ
Titration von Ras mit Cu2+-Cyclen
Cu2+-cyclene
3.3mM
1.8mM
31P
0.9mM
0.3mM
β
4
0
α
γ
-4
-8
RasT35A
-12
ppm
NMR Spektren von
Ras(T35A).Mg2+.GppNHp bei 278 K mit
Cu2+-Cyclen in verschiedenen
Konzentrationen
Vorlesung Biophysik I - Molekulare Biophysik
W. Kremer
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24.10.
31.10.
07.11.
14.11.
21.11.
28.11.
05.12.
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12.12.
19.12.
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09.01.
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16.01.
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23.01.
30.01.
06.02.
Zelle
Biologische Makromoleküle I
Biologische Makromoleküle II
Nukleinsäuren-Origami (DNA, RNA)
Aminosäuren-Origami (Protein-Nanotechnologie)
Molekulare Motoren
Methoden zur Strukturbestimmung: Magnetische Resonanzspektroskopie I Grundlagen
Magnetische Resonanzspektroskopie II - Mehrdimensionale NMR- Spektroskopie
Magnetische Resonanzspektroskopie III – Proteinstrukturbestimmung,
Dynamik und Bewegung, ESR-Spektroskopie
Röntgenstrukturanalyse I – Streuung von Wellen, Faltungstheorem, Pattersonfunktion,
Phasenproblem
Röntgenstrukturanalyse II - Synchrotonstrahlung, zeitaufgelöste Kristallographie
Röntgenkleinwinkelstreuung
Elektronenmikroskopie I – Elektronenoptik, Kontrastentstehung und Bildinformation
Elektronenmikroskopie II – Kristalline Objekte, Tomographie
Rastertunnel- und Rasterkraftmikroskopie