Kriterien für die Einteilung von Vektoren

Molekulare Virologie
Virus-Vektoren
LMU
(Virale) Vektoren -Systeme und Einsatzfelder
RNA-/DNA-Vektoren im Vergleich
http://www.nature.com/nrg/journal/v4/n5/fig_tab/nrg1066_F2.html
Molekulare Virologie
RNA-Vektoren
LMU
Virale RNA-Vektoren
LMU
a) RNA in Funktion einer m-RNA:
Proteinexpression (Vakzine, toxisches Protein,
therapeutisches Genprodukt, ...)
b) RNA als unmittelbar wirkende Substanz:
keine Translation (z.B.: Transfektion von Aptameren)
keine Integration (Ausnahme HIV, ...)
transiente Expression
hohe Kurzzeitexpression
hohe Virustiter
viele Zelltypen
Wirkort: meist Zytoplasma
?!
Virale Vakzine Vektoren basierend auf RNA-Viren
RNA - Inhibition
(
)
famulok.chemie.uni-bonn.de/people/mayer/Vorlesung/RNA%20Biochemie%208.pdf -
famulok.chemie.uni-bonn.de/people/mayer/Vorlesung/RNA%20Biochemie%208.pdf -
Aptamere
famulok.chemie.uni-bonn.de/people/mayer/Vorlesung/RNA%20Biochemie%208.pdf -
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Ribozyme gene therapy involves the
following steps:
1. Delivery of RNA strands engineered to
function as ribozymes.
2. Specific binding of the ribozyme RNA
to mRNA encoded by the mutated gene
3. Cleavage of the target mRNA,
preventing it from being translated into a
protein
Antisense RNA
http://learn.genetics.utah.edu/content/tech/genetherapy/gtapproaches
/
Antisense-RNA - Fomivirsen (Vitravene)
Fomivirsen ist ein AntisenseOligonukleotid und ein Arzneistoff,
welcher als Virostatikum zur Behandlung
von Infektionen mit dem Cytomegalievirus
(CMV) bei Immundefizienz, wie AIDS
eingesetzt wird.
Fomivirsen ist ein 21mer Antisense-RNA
Phosphorthioat-Oligonukleotid (ISIS
2922)[1] mit einer komplementären
Sequenz zur mRNA, der major
immediate-early (MIE) transkriptionalen
Einheit des humanen Cytomegalievirus
(CMV). Durch die Bindung der aRNA an
die komplementäre mRNA wird die
Translation dieser viralen mRNA blockiert
und damit die Genexpression der Proteine
der IE2-Region (IE2), IE86 und IE55,
verhindert.[2]
Fomivirsen war das erste AntisenseOligonukleotid das von der FDA
zugelassen wurde.
The first FDA-approved antisense drug. Structure of the 21-mer phosphorothioate,
fomivirsen (brand name Vitravene, illustration from [223]). The patient target group for this
drug is rather small, and it was taken off the market by the manufacturer in 2002 due to poor
sales
famulok.chemie.uni-bonn.de/people/mayer/Vorlesung/RNA%20Biochemie%208.pdf -
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siRNA
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RNA-Transfer in Zellen
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ss-RNA (+)-Vektoren
Rabiesvirus
http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/Students/spring2006/Jameson/rabies%20structure.bmp
The neuroinvasiveness of the virus results
from its ability to migrate to the central
nervous system (CNS) through retrograde
axonal transport and transynaptic spread.
Rabies virus spreads from the
postsynaptic site to the presynaptic site
via receptor-mediated endocytosis. In
retrograde axonal transport, the
ribonucleoprotein complexes of the virus
are carried by direct attachment to a
dynein motor or by encapsulation in
vessicles attached to a dynein motor.
The rabies virus genome
gsbs.utmb.edu/microbook/ch061.htm
Neuronal tracing of rabies virus
The construction of the RV full-length cDNA vector (pHEP5.0-CVSG) was described
previously (Inoue et al., 2004). Three recombinant RV-vectors were newly generated for
dual viral tracing by inserting transgenes: the LacZ gene which encodes for β-galactocidase
(β-gal) or the gene for green fluorescent protein (GFP) variants, into the multiple insertion
site of the virus vector genome (Figure 2). To create a vector which expresses either β-gal
or the yellow fluorescent protein named Venus (Nagai et al., 2002), a PCR fragment of LacZ
cDNA (Invitrogen, USA) and Venus cDNA containing the Sbf I site, open reading frame, and
Sac II were amplified and inserted into the same site of pHEP5.0-CVSG, respectively.
http://cms.frontiersin.org/content/10.3389/neuro.05/001.2009/html/fnana-03-001/images/article/image_n/fnana-03-001-g002.gif
http://cms.frontiersin.org/content/10.3389/neuro.05/001.2009/html/fnana-03-001/fnana-03-001.html
Interference studies of double-infected neuron cells
To evaluate the ability of
the rabies virus vectors to
infect a cell in which an
ongoing infection exists,
two vectors expressing
different reporter proteins,
rHEP5.0-CVSG-β-gal and
rHEP5.0-CVSG-Venus,
were applied to the same
culture dish at different
time intervals. First, 300 μl
of rHEP5.0-CVSG-Venus
(1.0 × 107 focus-forming
units (FFU)/ml) was
applied. After a certain
time delay (0 h, 2 h, 6 h,
12 h), 300 μl of rHEP5.0CVSG-β-gal (1.0 × 107
FFU/ml) was applied.
Retroviral Vectors
• Based on:– Murine leukaemia virus (MLV)
– Lentiviruses such as HIV, SIV, FIV
– Mouse mammary tumour virus (MMTV)
– Foamy/spuma viruses
Retroviral Genome
R U5
Viral RNA
U3 R
gag
pol
env
gag
pol
env
Reverse
Transcription
Integration
Proviral DNA
LTR
U3 R U5
LTR
U3 R U5
Retroviral Vector Principle
Retrovirus
LTR
ψ
env
pol
gag
LTR
U3 R U5
Retroviral Vector
LTR
U3 R U5
ψ
gene
LTR
U3 R U5
Packaging Construct
U3 R U5
gag
pol
env
Packaging Cells
Retroviral Vector
LTR
ψ
gene
U3 R U5
gag
pol
LTR
U3 R U5
env
Recombinant Virus
Safety features for replication incompetent vectors
•ProCon Vectors
•
•
Deletion of U3 of
the 3’ LTR
Insertion of
Inducible/Tissue
Specific Promoter
TG
U3 RU5
TG
mRNA
U3R U5
U3 RU5
Promoter
R U5
TG
•
Replacement of
Viral Promoter
Promoter
RU5
TG
Promoter
RU5
Mrochen et al., (1997) J.Mol.Med. 75, 820
Risks associated with Retroviruses
• Insertional
Integration Leading
to
– Gene disruption
(tumour suppressor)
– Gene activation
(proto-oncogene)
DNA (Virus) Vektoren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration
Nackte DNA
Replikationsdefiziente Viren
Replikationskompetente Viren
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – nackte DNA
Transfektion
Physikalische Transfektionsmethoden
1)
Nadel Injektion in Gewebe / Inhalation
2)
Hydrodynamischer Gentransfer
3)
Mikroinjektion in Nukleus
4)
„Gene Gun“ Transfer
5)
Elektroporation
Kondensation
Chemische Transfektionsmethoden
Positive Ladung
1)
Kalziumphosphat Co-Präzipitation
(Membranfusion)
2)
Kationische Polymere
3)
Kationische Lipide („non-bilayer forming“)
4)
Liposomen („bilayer forming“)
Transfektionsmethoden mit „nuclear localization signals“
Geringe Effizienz des Gentransfers
Einbringen von Vektoren in Zellen
Transfektion
- artifizielles Einbringen von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen
- Kunstwort aus TRANSformation + InFEKTION
- DNA-Aufnahme durch die Zelle in Form von Salz-Präzipitaten oder
als membrangängige Micellen
Calzium-Phosphat-Methode
Liposomen-Methode
www.rz.uni-karlsruhe.de/~dc29/zoologie2/vorlesungsmat/EB1/070207/Protein-Dateien/Protein.ppt
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – Replikationsdefiziente Viren
Transduktion
Beibehaltung der Mechanismen der Ausgangsviren zur
Infektion (Transduktion) von Zielzellen
Dadurch: sehr hohe Effizienz des Gentransfers
Zusammenbau in z.T. komplexen Produktionssystemen
Häufig immunogen (humorale und zelluläre Immunantwort)
Nicht-integrierende Vektoren sind nur „transient“
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
1) Administration – Replikationskompetente Viren
Infektion
Basieren auf attenuierten bzw. genetisch modifizierten
replikationskompetenten Viren
Anwendung (Studien) v.a. in der Therapie von Tumoren
(onkolytische Viren) und in der DNA Vakzinierung
Kriterien für die Einteilung von Vektoren:
2) Replikation
Kein Mechanismus zur Replikation vorhanden
Verlust des Vektors während der Zellteilungen !
transiente Expression eines Transgens
Achtung: nicht mehr oder selten teilende Zellen !!!
(Indirekte) Replikation nach Integration ins Wirtschromosom
stabile Expression eines Transgens
Mechanismen der episomalen Replikation vorhanden
stabile Expression eines Transgens
Kopienzahl des Vektors ?
Zellzyklus (MCM2-7) abhängige Replikation
-
(mini chromosome maintenance) ?
Plasmidreplicons:
Nicht-virale Plasmidreplicons und künstliche Chromosomen:
1)
Historisch: Vektoren für die Hefe
2)
Vektoren für Säugetierzellen
Virale Plasmidreplicons:
1)
Das Simian Virus 40 (SV40) Plasmidreplicon
2)
Das Papillomavirus (HPV / BPV) Plasmidreplicon
3)
Das Epstein-Barr Virus (EBV) Plasmidreplicon
4)
„Substituted“ EBV Plasmidreplicons
Administration als „nackte“ (Plasmid-) DNA
Virale Plasmidreplicons:
Das Simian Virus 40 (SV40)
5300 bp
Familie: Polyomaviren
40 nm großes, ikosaedrisches Kapsid
Nicht umhüllt
Zirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (5300 bp)
MCM 2-7 unabhängige Replikation
(T-Antigen ist replikative Helikase)
Virale Plasmidreplicons:
Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
ab 1976
Model für die Untersuchung:
- der eukaryontischen DNA Replikation
- der Chromatinstruktur (Nukleosomen)
- der Genregulation („cis acting“ Enhancer)
- des alternativen „splicing“
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nein
Nukleäre Retention
Kopienzahl
Kopienzahl
100-1000
DNA Replikation
SV40 ORI + T-Antigen
Virale Plasmidreplicons:
Das SV40 („high copy number“) Plasmidreplicon
heute
Anwendung in der Biotechnologie:
- Plasmidvektoren mit SV40 ORI und Promoter in cis
- Zellinien mit T-Antigen (293T, COS etc.) in trans
Immortalisierung (Transformation) von primären Zellen
via T-Antigen („libraries“ !)
Das T-Antigen:
- Bindung an SV40 ORI
- MCM 2-7 unabhängige, replikative Helikase
- Virales Onkoprotein (Inaktivierung von p53 und pRB)
- Immunogene Eigenschaften
Virale Plasmidreplicons:
Papillomaviren (HPV / BPV)
Familie: Papillomaviren
55 nm großes, ikosaedrisches Kapsid
Nicht umhüllt
Zirkulares, doppelsträngiges DNA Genom (7900 bp)
MCM 2-7 unabhängige Replikation
(E1 ist replikative Helikase)
Virale Plasmidreplicons:
Das BPV („intermediate copy number“) Plasmidreplicon
1980
piggy back
Chromosom
E2
E1
MCM 2-7 Abhängigkeit
Nukleäre Retention
Kopienzahl
DNA Replikation
Nein
(E1 +) E2 – Chromsom
(Kopienzahl)
~ 50 - 150
BPV ORI + E1 + E2
Virale Plasmidreplicons:
Das Epstein-Barr Virus (EBV)
172 kbp
ori P
ori lyt
IR:
inverted repeat
TR: terminal repeat
U:
unique region
ori P: latenter (Plasmid) Ori
ori lyt: lytischer ORI
Familie: Herpesviren
160 nm großes, umhülltes Virus
Ikosaedrisches Kapsid
Doppelsträngiges DNA Genom (172 kbp):
- Linear im Virion
- Zirkular nach Rezirkularisierung im Zellkern
MCM 2-7 abhängige latente Replikation (ori P)
MCM 2-7 unabhängige lytische Replikation (ori lyt)
ori lyt
Virale Plasmidreplicons:
Das EBV („low copy number“) Plasmidreplicon
Latenz-ORI: ori P
1985
Nukleäre Retention
EBNA1
FR 24 x
Chromosom
EBNA
DS 4 x EBNA
ORC / MCM 2-7
piggy back
FR
FR:
family of repeats (24 x)
DS:
dyad symmetry element (4 x)
DS
EBNA1
ORC / MCM2-7 – Rekrutierung
Replikation
MCM 2-7 Abhängigkeit
Ja
Nukleäre Retention OriP (FR) + EBNA1 - Chromosom
Kopienzahl
~10
DNA Replikation
OriP (DS) + EBNA1
RNA-/DNA-Vektoren im Vergleich
img.medscape.com/.../540/632/nf540632.tab1.gif
LMU
Fazit: RNA-/DNA-Viren:
RNA-Viren:
in der Regel transient
(Ausnahme: Retro-/Lentiviren),
z.T: onkolytisch
eher geringe Verpackungskapazität
DNA-Viren:
z.T. transient oder persistierend
z.T. onkolytisch
in der Regel eher größere Verpackungskapazität
wenn persistierend, dann Langzeitexpression