Claudia Schierbaum WS 04/05 Löffler / Petrides: Biochemie

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Proteine
Claudia Schierbaum
WS 04/05
Löffler / Petrides: Biochemie & Pathobiochemie,
7.Auflage, Springer-Verlag Berlin
Kapitel 3.4 und 3.5
Faltung, Fehlfaltung und Denaturierung
von Proteinen
• Denaturierung und Renaturierung von Proteinen
• Denaturierungsfaktoren
• Faltungscode/ Faltung von Proteinen
• Krankheiten, die durch fehlgefaltete Proteine
verursacht werden
• Kompensationsmechanismen
• Methoden zur Strukturbestimmung von
Proteinen
Proteine können denaturiert und
renaturiert werden
•
Denaturierung = Zerstörung sämtlicher Strukturebenen
mit Ausnahme der Primärstruktur;
immer mit einem Funktionsverlust verbunden
•
Reversible Denaturierung - bei kleinen Proteinen möglich
Beispiel: Ribonuclease
Entfaltung und somit Denaturierung durch Behandlung mit einem
Überschuß an Thiolen in Gegenwart hoher Harnstoffkonzentrationen.
Nach Entfernung von Harnstoff und Mercaptoethanol durch Dialyse
spontane Renaturierung.
Fazit: sämtliche Informationen für die Ausbildung der Raumstruktur
von Proteinen sind in der Primärstruktur enthalten
Irreversible Denaturierung
Meist durch chemische Veränderungen verursacht
• Desaminierung von Asparagin und
Glutaminseitenketten
• Oxidation von Cysteinen und Methioninen
• Glycosylierung von Lysinseitenketten
• Racemisierung von Aspartaten
Denaturierungsfaktoren
Maßnahmen, welche die für die Aufrechterhaltung der
Raumstruktur benötigten Wechselwirkungen zerstören
• Temperatur : Hitzedenaturierung häufiger als
Kältedenaturierung
• Organische Lösungsmittel, z.B. Alkohol
• chaotrope Salze (Harnstoff, Iminoharnstoff):
führen in hoher Konzentration zur Solubilisierung
des hydrophoben Kerns
• pH-Änderungen, z.B. Trichloressigsäure, Perchlorsäure,
Uranylessigsäure
• Zusatz von Schwermetallsalzen: Denaturierung durch
Koagulation
Faltung, Faltungscode
• Faltungscode ist weitgehend unbekannt
Ursache: Keine sichere Bestimmung der dreidimensionalen
Struktur von Proteinen aus der Aminosäuresequenz
möglich
1. Konformationsraum ist extrem groß
2. das globale Minimum der freien Enthalpie der nativen
Struktur ist sehr flach und kaum spezifisch
• Schematische Darstellung durch das Modell des
Faltungstrichers (folding funnel),
das die freie Enthalpie im konformationell zugänglichen Raum
darstellt.
Reduzierung des multidimensionalen Konformationsraumes auf
zwei Dimensionen.
Faltungsvorgang
U
I
N
X
Xn
•
•
•
•
•
U = ungefalteter Zustand
N = native Struktur
Xn = aggregierte und ausgefallene Faltungsintermediate (X)
X = Faltungsintermediate, die nicht auf dem Faltungsweg liegen
und die Faltung verzögern
I = Zwischenzustand oder ganzes Ensemble von verschiedenen
konformationellen Zuständen. Geschmolzener Tropfen (molten
gobule): einige Sekundärstrukturelemente vorhanden, der
hydrophobe Kern ist noch hydratisiert
Levinthalsches Paradox
• Der Konformationsraum von Proteinen ist
viel zu groß, um in endlicher Zeit mit großer
Wahrscheinlichkeit die native Struktur zu
finden
• Es besteht keine Notwendigkeit, während
der Faltung alle möglichen Konformationen
anzunehmen
Krankheiten
• Alzheimersche Krankheit
• Creutzfeld-Jakobsche-Krankheit
• BSE (bovine spongioform encephalopathy)
Ursache:
fehlgefaltete Proteine, die sich zu
amyloidartigen Fibrillen zusammenlegen.
Beobachtung: Übergang vom α-helicalen Zustand zur
β-Faltblattstruktur.
Kompensationsmechanismen
•
Spezialisierte proteolytische Systeme, z.B. Proteasomen und
Lysosomen
•
Ausfällung: Bildung großer,stabiler Aggregate oder Polymere,
die ab einer gewissen Größe ausfallen
•
Spezifische Enzyme, z.B. Peptidy-Propyl-Isomerase, ProteindisulfidIsomerasen
Beschleunigung faltungsverzögernder Vorgänge
•
Chaperone: Gruppe von Proteinen ohne spezifische katalytische
Funktion
Bindung von Faltungintermediaten I oder fehlgefalteten
Proteinen X
Verhinderung der Aggregation
Beschleunigung der richtigen Faltung durch
Destabilisierung der Zwischenzustände
Methoden zur Strukturbestimmung von
Proteinen
Dreidimensionale Struktur von Proteinen ist
nicht aus der Aminosäuresequenz ableitbar
Daher: Experimentelle Bestimmung der
dreidimensionalen Struktur
1. Röntgenstrukturanalyse/
Röntgenkristallographie
2. NMR-Spektroskopie
Röntgenstrukturanalyse /
Röntgenkristallographie
• Wichtigste Methode zur Untersuchung der
räumlichen Struktur von Proteinen
• Voraussetzung: das zu untersuchende
Protein muss als Einkristall vorliegen
• Limitierung: manche Proteine sind schwer
bzw. überhaupt nicht zu kristallisieren
Röntgenstrukturanalyse
Vorgehensweise:
• Gewinnung eines Kristalls, zunehmend mit Hilfe von
Kristallisationsrobotern
• Isolierung des Proteinkristalls
• Bestrahlung mit monochromatischen Röntgenstrahlen
• Röntgendetektoren liefern Diffraktionsbilder
• Ermittlung der Phasen der elektromagnetischen
Strahlung durch isomorphe Ersetzung, d.h.
Schwermetallderivate der Proteine werden zusätzlich
zum nativen Protein kristallisiert und analysiert
• Strukturberechnung
NMR-Spektroskopie
• Relativ neue Methode
• Bestimmung der Konformation gelöster Proteine
• Vorteil: Analyse unter quasiphysiologischen
Bedingungen ohne Kristallisation
• Vorgehensweise: Strukturberechnung anhand
der strukturabhängigen Wechselwirkungen
zwischen den magnetischen Momenten der
Kernspins der im Protein enthaltenen Atomkerne
• Limitierung: nur für Moleküle bis zu einer
Molekülmasse von etwa 100 kDa geeignet
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