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RD-100i
OSNA® – die neue Generation der
Sentinellymphknoten-Analyse
bei Brustkrebs
www.sysmex.de
RD-100i
OSNA® – die neue Generation der
Sentinellymphknoten-Analyse bei Brustkrebs
Die Sentinellymphknoten-Biopsie (SLNB) hat sich in den
letzten Jahren als das operative Verfahren der Wahl bei
klinisch nodal-negativen Patientinnen mit primärem Mammakarzinom etabliert. Die intraoperative Analyse des Sentinellymphknotens (SN) erfolgt üblicherweise über den Schnellschnitt oder die Imprint-Zytologie mit anschließender
HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin). Diese histopathologischen
Methoden besitzen jedoch eine eingeschränkte Sensitivität,
da während der Operation nur ein geringer Teil des Lymphknotengewebes untersucht werden kann. Es besteht daher
ein beträchtliches Risiko, falsch-negative Ergebnisse zu
generieren. Metastasen werden erst später bei der postoperativen Aufarbeitung des Lymphknotengewebes detektiert.
OSNA® (One Step Nucleic Acid Amplification) ist ein neuer
diagnostischer Ansatz, der bereits vielfältig in der Routine
Einsatz findet. Erstmals wird die Untersuchung des gesamten
Lymphknotens innerhalb des intraoperativen Zeitrahmens
ermöglicht. Auf diese Weise liegt bereits während des
chirurgischen Eingriffs ein zuverlässiges Ergebnis vor, auf
dessen Basis klinische Entscheidungen getroffen werden
können. Somit können eine erhebliche Anzahl von ZweitOperationen und weitere histologische Untersuchungen
vermieden werden.
Klinische Validierungsstudien und deren Ergebnisse
Innerhalb einer japanische Multicenterstudie ergab die
Analyse mit OSNA® bei pN0-Patientinnen (144 analysierte
Lymphknoten) eine Spezifität von 100 % (Tabelle 1).
Pathologische Untersuchung
n =144
OSNA®
positiv
negativ
Makro
Mikro
–
(++)
0
0
0
(+)
0
0
0
(–)
0
0
144
Spezifität: 100 % (95% C.I.: 0.935 ~ 0.993)
275 – 300
250 – 275
225 – 250
200 – 225
175 – 200
150 – 175
125 – 150
96.7 %
100 – 125
Spezifität
50 – 75
95.6 %
75 – 100
Sensitivität
25 – 50
96.5 %
Cut-off-Wert
0 – 25
Konkordanzrate
Ergebnisse einer Spezifitätsstudie
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
k.D.
Die Analyse von insgesamt 2313 Lymphknoten hat für die
OSNA® Methode folgende Daten ergeben:
Bei dieser Studie zur Spezifität des OSNA®-Verfahrens lag
die Anzahl der CK19 mRNA-Kopien deutlich unter dem
Cut-off-Wert des OSNA®-Assays. Somit ist es extrem unwahrscheinlich, dass mit OSNA® falsch-positive Ergebnisse generiert werden (Abb. 4).
Anzahl der Lymphknoten
Das OSNA®-Verfahren wurde in mehreren multizentrischen
Studien in verschiedenen Ländern evaluiert [1–5]. In all
diesen Studien wurde die Methode mit einer sehr ausführlichen histopathologischen Untersuchung verglichen.
Dazu wurden die Lymphknoten mit einem speziellen
Schneidgerät in vier Scheiben von 1 oder 2 mm Dicke
geschnitten. Jeweils zwei alternierende Scheiben wurden
mit OSNA® analysiert, und die anderen beiden Scheiben
für die histologische Begutachtung verwendet. Hierfür
wurden Paraffinschnitte in fünf Stufen im Abstand von
100, 200 oder 250 μm angefertigt.
CK19 mRNA (Kopien/μL)
Abb. 4 Verteilung der CK19 mRNA-Kopienzahl von 144 Lymphknoten von
60 pN0-Patientinnen
Die Ergebnisse aller klinischen Studien zeigen, dass CK19
mRNA ein ausgezeichneter molekularer Marker zur
Detektion von Lymphknotenmetastasen beim Mammakarzinoms ist. Darüber hinaus belegen sie, dass der Assay
als diagnostisches Verfahren zur Analyse des Sentinellymphknotens bei Patientinnen mit Mammakarzinom-Patientinnen
sehr gut geeignet ist.
OSNA® ist CE-zertifiziert und entspricht in vollem Umfang
den Anforderungen der Richtlinie 98/79/EG für In-VitroDiagnostika. Der Test ist somit europaweit für den routinemäßigen Einsatz in der klinischen Diagnostik zugelassen.
Tabelle 1 Die Analyse von 144 Lymphknoten von 60 pN0-Patientinnen ergab
eine Spezifität von 100 %
Referenzen
[1] Tsujimoto M et al. (2007): One-Step Nucleic Acid Amplification for
Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer
Patients. Clin Cancer Res 13(16). 4807.
[4] Tamaki Y et al. (2009): Molecular detection of lymph node metastases
in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step
nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : 2879 – 84.
[2] Visser M et al. (2008): Intra-operative rapid diagnostic method based on
CK19 mRNA expression for the detection of lymph node metastases in
breast cancer. Int. J. Cancer. 122.2562.
[5]Snook KL et al. (2010): Multicentre evaluation of intraoperative
molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma.
Br J Surg, DOI: 10.1002/bjs.7347.
[3] Schem C et al. (2009): One Step Nucleic Acid Amplification – a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. Virchows Arch. 454.203.
[6] Frère-Belda MA et al. (2012): Diagnostic performance of one-step nucleic acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection in breast cancer patients. Int J Cancer. 2012 May 15 : 130(10) : 2377 – 86.
Fortschrittliche Technologie
OSNA® ist ein weitestgehend automatisierter molekularer
Assay. Das Reaktionsverfahren basiert auf einer speziellen
Technologie zur Amplifikation von Nukleinsäuren (RTLAMP*) und ermöglicht die Bestimmung der Cytokeratin
19 (CK19) mRNA-Expression. CK19 ist ein Epithelzellmarker und in Lymphknotengewebe normalerweise nicht
vorhanden. Die Expressionsrate der CK19 mRNA korreliert
mit der Größe der metastatischen Herde. Die Auswertung
der Analyseergebnisse erfolgt auf der Grundlage einer
Standardkurve mit drei Kalibratoren unterschiedlicher
Konzentrationen.
Auswahl des Markers
Es konnten sieben Marker identifiziert werden, die eine
hohe Expressionsrate bei Metastase-positiven Lymphknoten
zeigten, hingegen in negativen Lymphknoten eine sehr
geringe Expressionsrate aufwiesen. In einem zweiten Schritt
wurden mit diesen Markern weitere Tests an einer größeren
Anzahl von Lymphknoten durchgeführt (Abb. 2).
Dabei erwies sich CK19 als der am besten geeignete Marker.
Aufgrund seiner hohen Expressionsrate in metastatischen
Lymphknoten und der niedrigen Expressionsrate in metastasefreien Lymphknoten besitzt er eine hohe Sensitivität, als
auch die Möglichkeit, klar zwischen positiven und negativen
Lymphknoten zu differenzieren.
Im Rahmen der Entwicklung des OSNA®-Verfahrens wählte
Sysmex 45 infrage kommende Marker aus einer öffentlichen
Genexpression-Datenbank aus. Auswahlkriterien waren
eine hohe mRNA-Expressionsrate in Brustgewebe, bei gleichzeitig minimaler oder gänzlich fehlender Expression in
normalem Lymphknotengewebe. Das Expressionsrate dieser
mRNA-Marker wurde bei histopathologisch positiven und
negativen Lymphknoten evaluiert (Abb. 1 a+b).
Untersuchung von 45 mRNA-Markergenen
+–
+–
+–
+–
+–
+–
CK19FOXA1SPDEF CEA MGB1TACSTD2
+–
MUC1
FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (SAM pointed domain containing ETS transcription
factor), CEA (carcinoembryonic antigen), TACSTD2 (tumor associated calcium signal
transducer 2), MGB1 (mammaglobin1), MUC1 (mucin1)
Abb. 2 Expression von mRNA-Markern in histopathologisch positiven und
negativen Lymphknoten
Abb. 1 a Verhältnis der mRNA-Expression zwischen histopathologisch
positiven und negativen Lymphknoten
Abb. 1 b Expression der einzelnen mRNA-Marker in histopathologisch
positiven Lymphknoten
*RT-LAMP = Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification
lizensiert von Eiken Chemical CO., LTD
RT-LAMP
Bei der innovativen Amplifikationstechnologie RT-LAMP
handelt es sothermes Reaktionsverfahren, das Vorzüge
gegenüber konventionellen PCR-Methoden aufweist.
Die Amplifikationsreaktion läuft in nur 16 Minuten ab
und erfordert keine vorherige Aufreinigung der RNA.
Die Vorgehensweise bei der Probenvorbereitung und das
spezielle Primerdesign, zielen auf eine hohe Spezifität
und die Vermeidung falsch-positiver Ergebnisse ab.
Der Reaktionsverlauf wird im RD-100i, einem automatisierten Real-Time System, in Echtzeit überwacht und ausgewertet. Je nach Anzahl der zu untersuchenden Sentinel-Lymphknoten (max. 4 Proben) liegen die Ergebnisse nach etwa 30
bis 45 Minuten vor (Abb. 3).
Das RT-LAMP-Verfahren verwendet sechs unterschiedliche
Primer. Sie sind so ausgewählt, dass eine Amplifikation
von CK19-Pseudogenen oder deren Transkripten verhindert
und zugleich die Reaktion des Assays beschleunigt wird.
LAMP Primer
Weiterhin verhindert die Präzipitation der DNA bei niedrigem pH-Wert (3,5) des Puffers zur Probenaufbereitung,
sowie die isotherme Reaktionstemperatur von 65 °C eine
unerwünschte Amplifikation genomischer DNA.
Abb. 3 Real-Time-Monitoring der Reaktion
Alle erforderlichen Reagenzien sind gebrauchsfertig.
B1
B2
5’
3’ Target RNA
3’
5’ cDNA
Für die Identifizierung des Sentinellymphknotens eingesetzte blaue Farbstoffe oder kolloidale Radioisotope haben
keinen Einfluss auf den Ablauf der OSNA®-Reaktion.
F2
F1
L1
F1: Forward Primer 1
F2: Forward Primer 2
B1: Backward Primer 1
B2:Backward Primer 2
3’
5’
L1: Loop Primer 1
L2: Loop Primer 2
oder :DNA Domäne
oder:komplementäre
Domäne
L2
n
Isothermes Reaktionserfahren bei 65 °C
n
Sehr schnelle Amplifikationsreaktion (16 Minuten)
n
Keine Aufreinigung der RNA erforderlich
Keine unerwünschte Amplifikation von
Pseudogenen oder genomischer DNA
n
Hohe Spezifität durch den Einsatz von sechs Primern
n
Technische Spezifikationen
Gerät
Genamplifikations-Detektorsystem RD-100i
Methode
OSNA® (One Step Nucleic Acid Amplification)
Analyseparameter
CK19 mRNA
Technologie
RT-LAMP (Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification)
Detektionsverfahren
Trübungsmessung. Veränderung der Lichtdurchlässigkeit des Reaktionsansatzes in Abhängigkeit
vom Reaktionsgrad und der gebildeten Menge des Präzipitats Magnesiumpyrophosphat
Ergebnisparameter
CK19 Q (CK19 Qualitatives Ergebnis)
CK19 (CK19 Risetime)
CK19 C (CK19 mRNA-Konzentration)
Durchsatz
4 Proben/Analysenlauf
Volumen der Gewebeprobe
50 – 600 mg
Probevolumen
2 μL
Reagenzien
Homogenisierungsreagenz LYNORHAG
Amplifizierungskit LYNOAMP BC
Alle Reagenzien sind gebrauchsfertig
Speicherkapazität
2000 Probenergebnisse
Qualitätskontrolle
Positiv- und Negativkontrolle
180 Datenpunkte je QC-Datei
Schnittstellen
Host-Computer (RS232, LAN)
Drucker (USB)
Gewicht
ca. 66 kg
Abmessungen(B x H x T)
596 x 548 x 622 mm
SNCS optional, mit Sysmex Service Agent und online Fernzugriff.
Vertrieb Deutschland: Sysmex Deutschland GmbH
Bornbarch 1, 22848 Norderstedt, Deutschland · Telefon +49 40 534102-0 · +49 40 5232302 · [email protected] · www.sysmex.de
Vertrieb Österreich: Sysmex Austria GmbH
Odoakergasse 34–36, 1160 Wien, Österreich · Telefon +43 1 4861631 · Fax +43 1 486163125 · [email protected] · www.sysmex.at
Vertrieb Schweiz: Sysmex Suisse AG
Tödistrasse 50, 8810 Horgen, Schweiz · Telefon +41 44 718 38 38 · Fax +41 44 718 38 39 · [email protected] · www.sysmex.ch
EU Bevollmächtigter: Sysmex Europe GmbH
Bornbarch 1, 22848 Norderstedt, Deutschland · Telefon +49 40 52726-0 · Fax +49 40 52726-100 · [email protected] · www.sysmex-europe.com
Hersteller: Sysmex Corporation
1-5-1 Wakinohama-Kaigandori, Chuo-ku, Kobe 651-0073, Japan · Telefon +81 78 265-0500 · Fax +81 78 265-0524 · www.sysmex.co.jp
Die für Ihre Region zuständige Sysmex Niederlassung finden Sie unter www.sysmex-europe.com/contacts
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ZE000294.DE.C.09/15
Änderungen des Designs sowie Spezifikationsänderungen basierend auf fortschreitender Produktentwicklung behalten wir uns vor.
Solche Änderungen werden bei Neuauflagenerscheinungen bestätigt und anhand des neuen Ausstellungsdatums verifiziert.