Transformation von Brachypodium distachyon mittels Agrobakterien

Werbung
Transformation von Brachypodium distachyon durch
Agrobakterien-vermittelten Gentransfer in Sprossbasis-Segmente
Bianca Melzer, Carolin Berger, Tilo Guse, Eszter Kapusi, Götz Hensel und
Jochen Kumlehn
Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK)
Gatersleben, Pflanzliche Reproduktionsbiologie
Brachypodium distachyon, die Zweiährige Zwenke, ist vergleichsweise nahe
mit den Triticeen verwandt und besitzt zudem ein sehr kleines Genom (ca.
300Mb  2% der Größe des Weizengenoms), welches seit Oktober 2008
vollständig sequenziert ist und sich somit als Modellpflanze für Getreide des
Tribus Triticeae
auszeichnet.
B. distachyon ist darüber hinaus ein
Selbstbefruchter, hat eine kurze Generationszeit und stellt nur geringe
Ansprüche an Stellfläche und Entwicklungsbedingungen. Für die Untersuchung
von Genfunktionen wird ein effizientes Transformationssystem benötigt. In der
hier vorgestellten Studie wird die Verwendung von Sprossbasis-Segmenten als
neuartiges Gewebeexplantat für die stabile Transformation von B. distachyon
untersucht. Dazu wurden 0,2-0,5 mm dicke Segmente von 1-2 cm langen
Primärsprossen
reifer, oberflächensterilisierter Körner der Linie Bd21-3 geschnitten und auf
Kallusinduktionsmedium im Dunkeln kultiviert. Nach 3-4 Wochen waren an der
Oberfläche einiger der entstandenen Kalli somatische Embryonen erkennbar aus
denen fertile Pflanzen regeneriert werden konnten.
Der Gentransfer erfolgte durch Inokulation von Kallus mit einem
hypervirulenten Agrobacterium tumefaciens Stamm. Als Selektionsmarker
wurde das Hygromycinphosphotransferase-Gen, und als Reportergene gfp und
gus (mit Intron) verwendet. Nach 2-tägiger Co-Kultur auf Acetosyringonehaltigem Medium erfolgte für 7 Tage eine weitere Kallusproliferation auf
Medium mit Hygromycin, der eine Übertragung der Kalli auf ebenfalls
Hygromycin-haltiges Regenerationsmedium und Kultur im Licht folgte bis
bewurzelte Pflänzchen in Erde überführt werden konnten. Der Nachweis von
Reportergenaktivität erfolgte sowohl in Kallus und Regeneraten als auch in
Keimlingen der T1-Generation, womit die generative Übertragung der
rekombinanten DNA und dessen Segregation innerhalb der Nachkommenschaft
belegt wurde.
Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Sprossbasis-Segmente von B.
distachyon prinzipiell für die Gewinnung von embryogenem Kallus geeignet
sind und nach Inokulation von Kallus mit Agrobakterien stabil transgene Linien
hergestellt werden können.
Herunterladen
Explore flashcards