Transformation von Brachypodium distachyon mittels Agrobakterien
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Transformation von Brachypodium distachyon durch Agrobakterien-vermittelten Gentransfer in Sprossbasis-Segmente Bianca Melzer, Carolin Berger, Tilo Guse, Eszter Kapusi, Götz Hensel und Jochen Kumlehn Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben, Pflanzliche Reproduktionsbiologie Brachypodium distachyon, die Zweiährige Zwenke, ist vergleichsweise nahe mit den Triticeen verwandt und besitzt zudem ein sehr kleines Genom (ca. 300Mb 2% der Größe des Weizengenoms), welches seit Oktober 2008 vollständig sequenziert ist und sich somit als Modellpflanze für Getreide des Tribus Triticeae auszeichnet. B. distachyon ist darüber hinaus ein Selbstbefruchter, hat eine kurze Generationszeit und stellt nur geringe Ansprüche an Stellfläche und Entwicklungsbedingungen. Für die Untersuchung von Genfunktionen wird ein effizientes Transformationssystem benötigt. In der hier vorgestellten Studie wird die Verwendung von Sprossbasis-Segmenten als neuartiges Gewebeexplantat für die stabile Transformation von B. distachyon untersucht. Dazu wurden 0,2-0,5 mm dicke Segmente von 1-2 cm langen Primärsprossen reifer, oberflächensterilisierter Körner der Linie Bd21-3 geschnitten und auf Kallusinduktionsmedium im Dunkeln kultiviert. Nach 3-4 Wochen waren an der Oberfläche einiger der entstandenen Kalli somatische Embryonen erkennbar aus denen fertile Pflanzen regeneriert werden konnten. Der Gentransfer erfolgte durch Inokulation von Kallus mit einem hypervirulenten Agrobacterium tumefaciens Stamm. Als Selektionsmarker wurde das Hygromycinphosphotransferase-Gen, und als Reportergene gfp und gus (mit Intron) verwendet. Nach 2-tägiger Co-Kultur auf Acetosyringonehaltigem Medium erfolgte für 7 Tage eine weitere Kallusproliferation auf Medium mit Hygromycin, der eine Übertragung der Kalli auf ebenfalls Hygromycin-haltiges Regenerationsmedium und Kultur im Licht folgte bis bewurzelte Pflänzchen in Erde überführt werden konnten. Der Nachweis von Reportergenaktivität erfolgte sowohl in Kallus und Regeneraten als auch in Keimlingen der T1-Generation, womit die generative Übertragung der rekombinanten DNA und dessen Segregation innerhalb der Nachkommenschaft belegt wurde. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Sprossbasis-Segmente von B. distachyon prinzipiell für die Gewinnung von embryogenem Kallus geeignet sind und nach Inokulation von Kallus mit Agrobakterien stabil transgene Linien hergestellt werden können.
