Intelligente Sonde zur ultra-sensitiven Detektion von

Klinische Diagnostik | Analytik | Technologie-Angebot
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Intelligente Sonde zur ultra-sensitiven Detektion von H2O2
Anwendungsgebiete:
In der klinischen Diagnostik ist eine schnelle und sensitive
Detektion von H2O2 von grundlegender Bedeutung, weil
viele der zu untersuchenden Substanzen indirekt durch die
Bestimmung der Menge an gebildetem H2O2 in Oxidasekatalysierten Reaktionen detektiert und/oder quantifiziert
werden. Eine verbleibende Herausforderung stellt die
Quantifizierung von H2O2 dar, das bei vielen wichtigen
Anwendungen nur in geringen Mengen entsteht, z.B.:
- ELISA und anderen Immunoassays
- Zell-basierte Assays
- Nahrungsmittel- & Umweltanalysen
Innovation:
Vorteile:
20-fach höhere Sensitivität im Vergleich zu
Standardverfahren
funktioniert mit jedem standard-PeroxidaseSubstrat, z.B. chromogenen (TMB, ABTS),
fluoreszierenden (Amplex red) oder lumineszierenden (Luminol) Substraten
Verwendung von Standard-Equipment möglich,
z.B. 96er Multiwells, Photometer, Pipettierroboter
schnelle, einfache und kostengünstige Detektion
bzw. Quantifikation von Analyten
Darstellung einer möglichen Anwendung:
Durch die neuartige Technologie wird die Sensitivität der
H2O2-Detektion signifikant verbessert. Dies trifft vor allem
auf Anwendungen zu, die auf Peroxidase-katalysierter
Oxidation von chromogenen (TMB, ABTS), fluoreszierenden (Amplex Red) oder lumineszierenden (Luminol)
Substraten basieren.
Was die Technologie so einzigartig und besonders macht
ist die Neuerung, dass im Gegensatz zu konventionellen
Verfahren das ohnehin in nur geringen Mengen gebildete
H2O2 gar nicht erst als Co-substrat selbst verwendet wird.
Denn dann würden auch nur geringe Mengen eines
(farbigen) Indikators wie TMB gebildet werden, was sich nur
ungenau quantifizieren lässt. Stattdessen werden die
wenigen verfügbaren H2O2 Moleküle dazu benutzt, um ein
hoch effizientes Enzym zu aktivieren, welches seinerseits
der eigentliche Schlüsselfaktor für die Signalamplifikation
ist. Bei dem Enzym handelt es sich um eine kommerzielle
Meerrettich-Peroxidase (HRP), die allerdings solange durch
ein chemisch blockiertes, nicht-funktionelles Hämin-Molekül
inaktiv bleibt, bis das Hämin durch das H2O2 in seine
funktionelle Form überführt wird, wodurch letztlich auch die
Peroxidase aktiviert wird. Anschließend kann die
gemessene Peroxidase Aktivität (z.B. Katalyse von
chromogenen Substanzen wie Tetramethylbenzidin (TMB))
direkt korreliert werden zur ursprünglichen Konzentration an
H2O2 in der ursprünglichen Probe (z.B. ELISA).
Abbildung 1:
(A) Gezeigt ist ein konventioneller ELISA mit einem Antigen
(das in sehr geringen Mengen vorliegen kann), gebunden
zwischen einem 1. und 2. Antikörper. An letzteren ist eine
Oxidase (z.B. Glucose-Oxidase) gebunden, die die
Oxidation eines Substrats (z.B. Glucose) katalysiert und
dabei gleichzeitig geringe Mengen an H2O2 produziert.
(B) Wenige H2O2 Moleküle genügen, um den blockierten
Hämin Co-Faktor zu aktivieren und in Folge dessen auch
die Peroxidase.
(C) Die so aktivierte Peroxidase amplifiziert nun das Signal
in einer detektierbaren/quantifizierbaren Menge, z.B. durch
Katalyse einer chromogenen (hier mit TMB), fluoreszierenden oder lumineszierenden Farbreaktion.
Copyright © 2009 Technologie-Lizenz-Büro (TLB) der Baden-Württembergischen Hochschulen GmbH
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Intelligente Sonde zur ultra-sensitiven Detektion von H2O2
20-fach erhöhte Sensitivität:
Abbildung 2 stellt die Detektion von variierenden Konzentrationen von H2O2 bei Verwendung von TMB als Substrat
dar. Die Detektionsgrenze liegt bei mindestens 50 nM (50
fMol). Das entspricht einer 20-fach höheren Sensitivität
Technologietransfer
Die TLB GmbH sucht Lizenznehmer oder Käufer zur
Vermarktung dieser neuen und bahnbrechenden
Technologie im Bereich der klinischen Diagnostik und
Analytik.
verglichen mit konventionellen chromogenen Assays:
Dies ist eine Erfindung der Universität Heidelberg.
0,1
(dA360/dt) /
min
0,08
Patent Portfolio
Eine europäische (EP) und eine internationale (PCT)
Patentanmeldung wurden bereits hinterlegt.
EP 1990347 A1
WO 2008 135139 A1
0,06
0,04
0,02
c(H2O2) / nM
0
0
50
200
400
600
800
Abbildung 2: Lösungen mit dem Analyten (verschiedene
Konzentrationen von H2O2) und dem amplifizierenden
Reagenz (blockierter Hämin Co-Faktor + inaktive
Peroxidase) wurden für 40 min. bei pH 7,5 in einer
Mikrotiterplatte inkubiert. 1 µL aus dieser Mixtur wurde in
100 µL einer Standard-Substrat-Lösung für ELISA mit TMB
bei pH 4,0 überführt. Anschließend wurde die zeitabhängige Zunahme der 360 nm Absorption (dA/dt) für 2
min. verfolgt.
Hier können Sie sich eine kurze Videosequenz (2
Minuten) über die Funktionsweise und Anwendung der
Technologie ansehen:
download:
ww.tlb.de à Technologie-Angebote à Life Sciences
à Medizin/Pharma
a) "video sequence_intelligent probe.mov" (für Apple
und Windows Systeme (benötigt Apple quicktime video
player))
b) "video sequence_intelligent probe.avi" (für Windows
Systeme)
Weitere Informationen über "Quantifizierung von H2O2":
Dr. Daniel Veith
[email protected]
Technologie-Lizenz-Buero (TLB)
der Baden-Wuerttembergischen Hochschulen GmbH
Ettlinger Straße 25 | 76137 Karlsruhe | Germany
Tel.: +49-(0)721-79004-0 | Fax: +49-(0)721-79004-79
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