Praktikumsskript zum Neurobiologischen Praktikum I

-Skript zum Praktikum Spezielle Biowissenschaften
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Institut für Klinische Neurobiologie
05. bis 09. November 2012
Bitte Laborkittel mitbringen und
leeren USB Stick !!!
Treffpunkt am 05.11.2012 um 8:50 Uhr am Eingang von Haus E4, Versbacherstr. 5
Zusammenfassungen der Vorträge
Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner
Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka
Hippokampus, Dr. Blum
Synaptologie, Dr. Götz
Ionenkanäle, Prof. Villmann
Kursprogramm
Zellkultur Teil
Immunohistochemischer Teil
Ionenkanäle und Elektrophysiologie
Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner
Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen
entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor
(NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im
Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden,
für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der
Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen,
darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel
bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem
sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger
konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser „physiologische“ Zelltod nicht
endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen
Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die
Identifikation und Reinigung (zusammen mit S. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve
growth factor (NGF).
Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von
Gewebeextrakten, die NGF enthielten
NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF,
NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der NeurotrophinFamilie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das
Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante
(KD) von 10-12 M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind
Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch
NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet.
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Abb.2: Schematische Darstellung der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk
Rezeptoren und den p75NTR Rezeptor.
Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor
(p75NTR), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (KD 10-9 M) bindet. Aufgrund der
hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (KD von 10-12M) ist verständlich,
dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca.
die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten.
Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen:
NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation
sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische
Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf -Motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von
sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer
Neurone.
Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen
in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3.
postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen
gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv
zugrunde gehen.
Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben,
sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.B. die Injektion von NGF
bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer
erhöhten Sensibilität.
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Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen
bei langsamleitenden sensorischen Neuronen
Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der NeurotrophinFamilie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu
diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die
neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor
(LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ
spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann
aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und
motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion
steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen
verbessern.
So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen
Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung
sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von
Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion.
Extrazelluläre Matrix
Der Extrazellulärraum erfüllt nicht nur Aufgaben für die Stabilität der Architektur des Nervensystems,
sondern ist auch aktiv in Regelprozesse einbezogen, die die Funktionalität von Glia- und Nervenzellen
beeinflussen. Diese Regelmechanismen spielen gerade für Neurone eine große Rolle. Verschiedene
Bestandteile der extrazellulären Matrix sind für das Auswachsen von Nervenfasern von großer
Bedeutung, und sie beeinflussen die Funktionalität von synaptischen Verbindungen. Neben den
klassischen Matrixmolekülen wie Fibronectin, Laminin und Collagen, die über Integrin-Rezeptoren
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Signale in den Nervenzellen vermitteln, enthält die extrazelluläre Matrix eine Reihe von Bestandteilen,
die als klassische Signalmoleküle über Tyrosinkinaserezeptoren Differenzierung, Zellwanderung,
Überleben, Axonwachstum und synaptische Aktivität beeinflussen. Dazu gehören einerseits an Heparin
gebundene Wachstumsfaktoren, zum anderen Signalmoleküle, die Axonwachstum stimulieren bzw.
blockieren, aber auch Proteine wie Agrin, die eine wesentliche Rolle bei der Bildung spezifischer
Synapsen, z.B. an der neuromuskulären Endplatte spielen.
Empfohlene Literatur:
Albert, Bray, Lewis et al: Molecular Biology of the Cell, 3. Auflage 1994, Kapitel IV/19, Cell Junctions,
Cell Adhesion, and the extracellular Matrix S. 949-1011
Literatur:
Alberts: Molecular Biology of the Cell:
Kapitel 21: Cellular mechanisms of development
Kandel (4. Auflage)
Part VIII: Develoment of the Nervous System.
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Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka
Motorische Hirnrinde:
Repräsentationsfelder und Verteilung kortikaler Motorneurone im Gyrus Präcentralis
Projektion von der motorischen Großhirnrinde zum Rückenmark
Das Rückenmark hat vom Großhirn unabhängige Schaltkreise
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Projektion vom Rückenmark zum Muskel
Kleinhirn:
Spino- 2
cerebellu
3
Cerebrocerebellum
Cerebrocerebellum
3
1
Vestibulocerebellum
Das Kleinhirn (Cerebellum) besteht aus einem unpaarigen Mittelteil (Vermis) und Kleinhirnhemisphären.
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Die Gliederung kann nach verschiedenen Gesichtspunkten erfolgen:
• Nach phylogenetischen Aspekten in das Archicerebellum, das Palaeocerebellum und das
Neocerebellum.
•
Makroanatomische Einteilung entsprechend transversalen Fissuren in den Lobus anterior der
durch die Fissura prima vom Lobus posterior getrennt ist, und der wiederum durch die Fissura
posterolateralis vom Lobus flocculo-nodularis
• Nach Verbindungen und funktionellen Aspekten in das
Spinocerebellum (Bewegungsausführung, ~Lobus anterior)
Cerebrocerebellum (Bewegungsplanung, ~Lobus posterior) und das
Vestibulocerebellum (Gleichgewichtssteuerung, ~Lobus flocculo-nodularis)
•
Gliederung des Kleinhirns entsprechend transversalen Fissuren in 10 Folien, die mit römischen
Ziffern von I bis X bezeichnet werden.
Im Kleinhirn unterscheidet man wie im Großhirn zwischen Rinde und dem Mark mit den zentralen
Kernen. Die Rinde schickt ihre Efferenzen in die Kleinhirnkerne.
Im Cerebellum gibt es 5 verschiedene Neuronentypen, 2 afferente Fasertypen sowie Gliazellen
Basalganglien
Die Funktion wird indirekt über den Kortex vermittelt, neuronale Schaltkreise der Basalganglien
entwerfen komplexe Erregungsmuster, sie dienen der Einleitung (Initiierung) und der Erleichterung
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(Fazilitation) von Willkürbewegung, zugleich werden ungewollte oder unwillkürliche Bewegungen
unterdrückt.
Axonaler Transport und Motoneuronerkrankungen
Die Fortsätze von motorischen Nervenzellen des Rückenmarks können beim erwachsenen Menschen
oft Längen von ca. 1 Meter erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere
Strukturelemente transportieren, um die Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten,
insbesondere den präsynaptischen Kompartimenten in der Axonterminale aufrecht zu erhalten.
Verschiedene Proteine, aber auch mRNAs werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und
Dendriten transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw.
dendritischer Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen
Mechanismen dieses Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt.
Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen
Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin
und dient, in Axonen, vor allem dem axonalen Wachstum sowie synaptischen Plastizitätsprozessen.
Beim gegenläufigen retrograden Transport werden Substanzen durch das Axon zum Zellkörper
befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper
transportiert werden, darunter Rezeptoren für neurotrophe Faktoren mit ihren Liganden. Nach der
Geschwindigkeit kann man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden.
Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der
intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen
beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität
der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin.
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Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den retrograden bzw. den
anterograden Transport.
Störungen des axonalen Transport beim Menschen oder bei der Maus sind eine der möglichen
Ursachen für Motoneuronerkrankungen, und treten, als Ursache oder sekundär bei fast allen Formen
dieser Erkrankungen auf. Motoneuronerkrankungen sind degenerative Erkrankungen der Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die
Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete
Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der
ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das
Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn).
Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links
Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein
sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von
α und β Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im
Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen
Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assoziierten Protein p-Tau vor.
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Wildtyp
Mutante
p-Tau
Tubulin
Overlay
Abbildung: Verteilung von p-Tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von
isolierten Motoneuronen.
Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei
Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.B. Loa und Cra Mäuse).
Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu
Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste
Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmnPhänotyp zu mildern.
+ CNTF
Kontroll
Pmn Maus ohne CNTF
Literatur:
Fundamental Neuroscience, second edition
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Aufbau von und Reizleitung an Synapsen, Dr. Götz
Tiere nehmen Reize der Umgebung wahr und reagieren darauf in ihrem Verhalten, z. B. durch
Bewegungen. Eine sehr große Zahl von Nervenzellen oder Neuronen (etwa 1011 beim Menschen) ist an
der Erfüllung dieser Leistung beteiligt. Die Hauptaufgaben der Neurone sind Empfang, Integration und
Weiterleitung von Information als elektrisches oder chemisches Signal. Die Neurone sind durch
Kontaktstellen, Synapsen, untereinander oder mit anderen Zelltypen, wie z. B. Muskelzellen,
verschaltet. Der Begriff Synapse wurde von Charles Sherrington eingeführt, um die Kontaktregion zu
beschreiben. Neurale Schaltkreise werden strukturell durch Axone, Dendriten und die sie verbindenden
Synapsen definiert. Neuronale Fortsätze haben in der Regel eine hohe Dichte an Synapsen. Ein
typisches Neuron besitzt etwa eintausend synaptische Verbindungen. Ermöglicht wird dies durch die
komplexe Struktur von Nervenzellen mit ihren ausgeprägten Fortsätzen und der damit verbundenen
großen Oberfläche. Bei Neuronen mit langen Axonen kann die Oberfläche sogar Millionen von µm2
betragen. Eine hohe Zahl an Synapsen kann auch durch weit verzweigte Dendritenbäume und deren
axonale Kontakte zustande kommen, wie es z. B. bei den Purkinjezellen mit ihren etwa 200.000
Synapsen der Fall ist.
Abbildung. Weitverzweigter Dendritenbaum im Kleinhirn (Cerebellum). Im Cerebellum bildet jede
Purkinjezelle viele Tausend Parallefasesynapsen aus, und zwar in einen hochgradig verzweigten
Dendritenbaum, welcher Synapsen mit den Axonen (Parallelfasern) der Körnerzellen (granule cells)
bildet. Bild aus Wong und Ghosh, Nature Reviews Neuroscience, 3, 803-812, 2002.
Synapsen werden je nach Form der Erregungsübertragung und Art der Erregung in elektrische und
chemische Synapsen untergliedert. Die große Mehrheit der Synapsen im Gehirn sind chemische
Synapsen, d. h., sie setzen Neurotransmitter frei, um eine Reizantwort in der postsynaptischen Zelle
auszulösen. Man unterscheidet erregende von hemmenden Neurotransmittern. Der wichtigste
erregende Neurotransmitter im Gehirn ist Glutamat (exzitatorische Synapse). Die wichtigsten
hemmenden Transmitter im ZNS sind Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und Glyzin (inhibitorische
Synapse). Andere Transmitter sind Noradrenalin, Acetylcholin, Dopamin, Serotonin. Acetylcholin
vermittelt zum Beispiel die Erregungsübertragung zwischen Nerv und Muskel an der neuromuskulären
Endplatte.
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Im Fall der elektrischen Synapse erfolgt die Erregung der postsynaptischen durch die präsynaptische
Nervenzelle durch eine direkte strukturelle Verbindung, sog. gap-junction Kanäle. Der synaptische Spalt
misst nur rund 3,5 nm. Elektrische Synapsen arbeiten verzögerungsfrei. Die Erregungsübertragung
kann in beide Richtungen laufen. Sie kommen vor allem dort vor, wo eine schnelle Reizübertragung
notwendig ist, wie z. B. in der Vertebratenretina oder dem Lidreflex.
Abbildung. Struktur und molekulare Organisation von Zell-Zell-Kanälen (gap junctions). Zell-ZellKanäle werden zwischen gegenüberliegenden Membranen von zwei benachbarten Zellen ausgebildet.
Jeder Halb-Kanal, auch Connexon genannt, besteht aus sechs Connexin Untereinheiten und bildet eine
Pore aus, durch die Ionen und kleine Moleküle bis zu einer Masse von 1.000 Da passieren können. Bild
aus Bloomfield und Völgyi, Nature Reviews Neuroscience, 10, 495-506, 2009.
Im Unterschied zur elektrischen Synapse gibt es bei der chemischen Synapse keine strukturelle
Verbindung zwischen dem prä- und postsynaptischen Neuron. Alle chemischen Synapsen besitzen ein
präsynaptisches Terminal. Diese spezialisierten Vergrößerungen können entweder am Ende des Axons
(Endknöpfe oder Boutons terminaux) oder auch entlang des Axonschafts (Boutons en passant)
lokalisiert sein. Im Gehirn gibt es auch Synapsen zwischen Axonen und zwischen Dendriten. Die
postsynaptische Region (post-synaptic density) ist durch den synaptischen Spalt (etwa 20-40nm weit)
vom präsynaptisches Terminal getrennt. Die Mehrheit der glutamatergen exzitatorischen Synapsen im
Gehirn ist in dendritischen Dornfortsätzen (englisch spines) lokalisiert. Diese wachsen oft mit einem
schmaleren Hals aus der Dendritenoberfläche empor und enden mit einem mehr oder weniger
voluminösen Kopf, in dem sich auch die zugehörige Synapse befindet. Die Dornfortsätze bilden sich
während der Entwicklung aus und werden später bis ins adulte Alter reizabhängig verändert. Um bei der
Synapsenbildung die präsynaptische aktive Zone in Nachbarschaft zur Postsynapse räumlich korrekt
ausbilden zu können, werden vielfältige Signale benutzt. So wird z. B. von Motoneuronen Agrin
freigesetzt, welches einen Transmembranrezeptor auf den Muskelzellen aktiviert und so das Klustern
von Acetylcholinrezeptoren in der neuromuskulären Endplatte induziert.
Um einen Reiz zu übertragen, setzt die Präsynapse Neurotransmitter aus synaptischen Vesikeln frei.
Die synaptischen Vesikel sind an Stellen lokalisiert, die man „aktive Zonen“ nennt. Ein präsynaptisches
Aktionspotential führt zum Kalzium (Ca2+)-Einstrom nach Öffnung spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle in
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der aktiven Zone. Die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt dann zur Fusion der
Vesikel mit der präsynaptischen Membran und dementsprechend der Neurotransmitter-Freisetzung in
den synaptischen Spalt. Die Neurotransmitter diffundieren durch den synaptischen Spalt und binden an
passende Rezeptoren der postsynaptischen Zellmembran. Neurotransmitter-Rezeptoren sind
zusammen mit mehr als 500 anderen Proteinen in der „postsynaptischen Dichte“ (postsynaptic density)
konzentriert. Die Bindung der Neurotransmitter an postsynaptische Rezeptoren führt zur Aktivierung von
Ionenkanälen, wodurch sich das Membranpotential in der postsynaptischen Zelle ändert.
Abbildung. Glutamaterge Synapsen des Gehirns. In der aktiven Zone befinden sich Vesikel mit dem
Neurotransmitter Glutamat. Die präsynaptische Region ist vom Dornfortsatz im postsynaptischen
Dendriten durch einen Synapsenspalt getrennt. In der postsynaptischen Membran des Dendriten
befinden sich Glutamatrezeptoren (AMPA, α-amino-3-hydroxy-5-methlisoxazole-4-propionic acid, und
NMDA, N-methly-D-aspartate, Rezeptoren), die von Gerüstproteinen zusammengehalten werden und
die „postsynaptische Dichte“ (postsynaptic density) bilden. Synaptische Aktivität setzt Glutamat in den
Synapsenspalt frei. Dadurch wird der NMDA Rezeptor aktiviert; durch den Einstrom von Ca2+-über den
NMDA Rezeptor kann sich die Morphologie und Stärke der Synapse verändern. Bild aus Cohen und
Greenberg, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 183-209, 2008.
Der Ca2+-Einstrom über den NMDA Rezeptor verändert sowohl lokal die Synapse als auch die
Transkription von Genen und die Synthese von Proteinen, die stabil die neuronale Funktion verändern
können. Im adulten Gehirn stattfindende Schaltkreisveränderungen werden durch den Begriff der
funktionellen und strukturellen synaptischen Plastizität beschrieben. Hiermit wird das Phänomen erfasst,
dass eine Stimulation von Neuronen die Stärke der synaptischen Übertragung verändern kann. Diese
Änderungen können sowohl durch Änderungen der Morphologie als auch der Physiologie der Synapse
verursacht werden. Die am besten untersuchten Formen dieser Reiz-abhängigen Anpassung der
Synapsenstärke ist die sog. Hebb'scher Plastizität, die LTP (long-term potentiation) und LTD (long-term
depression) umfasst. Man glaubt, dass die bei der synaptischen Plastizität verstärkten, neu gebildeten
oder verschwindenden Synapsen die Basis für Langzeitgedächtnis und Lernvorgänge sind. LTP und
LTD der synaptischen Aktivität werden kurzfristig durch lokale Synapseneffekte gesteuert, z. B. die
Lokalisierung der AMPA Rezeptoren in der Synapse oder außerhalb der Synapse. Dies gilt ebenso für
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die Verteilung der NMDA Rezeptoren, da synaptische NMDA Rezeptoren Signalwege des neuronale
Überlebens aktivieren, während extrasynaptische Lokalisierung Signalwege aktiviert, die zum Zelltod
führen können. Eine Fehlverteilung der NMDA Rezeptoren wird als ein möglicher molekularer
Pathomechanismus bei der Huntington´schen Erkrankung diskutiert.
Langfristige Änderungen der Synapsenstärke erfolgen dadurch, dass der Ca2+-Einstrom Signalwege
aktiviert, die die Expression von Genen im Zellkern reguliert. Die aktivitätsgesteuerte Expression von
mRNA und Proteinen erlaubt es, dass der Zellkern die Synapsen verändern kann. Als ein Beispiel sei
hier der selektive Transport der mRNA für den Wachstumsfaktor BDNF (Brain-Derived Neurotrophic
Factor) in den Dornfortsatz des Dendriten erwähnt. Die Translation der BDNF mRNA erfolgt
aktivitätsabhängig im Dornfortsatz, wodurch das BDNF Protein freigesetzt wird und über die Bindung an
präsynaptische BDNF-Rezeptoren die Präsynapse verändern kann (sog. retrograder Signalweg).
Literatur:
Principles of Neural Science, 4th Edition. Herausgeber Eric R. Kandel, James H. Schwartz,
Thomas M. Jessell. McGraw-Hill, New York.
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Neuronale Schaltkreise für die Untersuchung synaptischer Plastizität: der Hippocampus und das
Kleinhirn (Dr. Blum)
„When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or persistently takes part in
firing it, some growth process or metabolic change takes place in one or both cells such that A’s
efficiency, as one of the cells firing B, is increased“ (Donald Hebb, 1949)
Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt. Adaptive Prozesse
an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und räumlich synchronisierten
Informationsflusses über Synapsen, spielen eine bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von
Lernen und Gedächtnis.
Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und Gardner-Medwin erstmals das
Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term potentiation). In ihren Experimenten konnten die
Autoren zeigen, dass wiederholte, zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen
eine signifikante und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis
hervorrufen.
Erstbeschreibung der LTP.
In Folge einer kurzen, aber intensiven
synaptischen Reizung werden die
aktivierten
Synapsen
zwischen
Neuronen langanhaltend verstärkt. In
dem gezeigten Experiment wurde
durch
das
Auslösen
von
Aktionspotenzialserien
auf
den
Axonen des Tractus perforans (PP)
die glutamaterge Synapse der
Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD)
so stark gereizt, dass die Effizienz der
synaptischen
Transmission
im
dendritischen
Bereich
der
Körnerzellen,
als
auch
die
Erregbarkeit
der
Körnerzellen
langfristig gesteigert war.
Der definierte „starke Gebrauch“ von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare Änderungen
hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden PostSynaptischen Potentialen
(EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung an das Hebb’sche Postulat aus dem Jahr 1949
werden aktivitätsabhängig modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch
Hebb’sche Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur
Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien eines neuronalen
Korrelats des Gedächtnisses erfüllt.
Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen Plastizität sind die des
Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind strukturell einfach aufgebaut und
verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in situ und in vitro Bedingungen und erlauben
zumindest punktuell eine Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer
Ebene und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene.
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Hippocampus
Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen Gedächtnisses (Fakten,
Ereignisse, räumliche Zusammenhänge) und vermittelt auch Kontext-abhängige Elemente des Lernens.
Die hippocampale Formation Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu ammonis; CA) und in
dem Zellband (Gyrus dentatus, AD). Synaptische Plastizität kann im Hippocampus auf zwei Ebenen
untersucht werden: (1) ausgehend von der Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises
des Hippocampus; (2) ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden
hippocampalen Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese.
Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen Cortex, die ihre
Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus
dentatus verbinden. 2. Synapse: Die Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit
Pyramidenzellen in der CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog.
Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region.
Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen molekularen
Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3-CA1 (Schafferkollaterale-CA1)
beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen postsynaptischen ionotropen Glutamatrezeptor (Typ
NMDA) und ein postsynaptisches Ca2+ Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen
Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen, dass
synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein präsynaptisches
Ca2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente trägt. Die Kommunikation
der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch
häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine
wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der
Induktion von LTP eine funktionelle Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln
kann. Die molekularen Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des
Proteins BDNF erklären können, sind jedoch umstritten.
Adulte Neurogenese im Hippocampus
Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus dentatus
(subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier entstehen aus teilungsfähigen
Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im
Jahr 2008 konnte nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende
neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren.
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Körnerzellen, die sich im
adulten Gyrus dentatus
neu gebildet haben. Die
Zellen wurden mit einem
Virus markiert, der nur in
teilungsfähigen Zellen zum
Ausdruck kommt und so die
Entwicklungs-linie
der
hippocampalen Stammzellen
darstellen kann. Bild aus:
Toni et al. 2008
Kleinhirn und synaptische Lernvorgänge
Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle –Kontrolle der Halte- und Stützmotorik, der
Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur, sowie ballistischer Bewegungen.
Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen
gewissen Verlust bewegungsbezogener kognitiver Funktionen. Eine Besonderheit der
Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des afferenten und
efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und
Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die
Bewegung eingreift. Die Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige
ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2) kein klassisches
Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den Transmitter GABA. Die Projektion
der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer
zentralen Struktur des motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an
Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD
(Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch koordinierte
Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der Parallelfaser zur Purkinjezelle in
ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und somit das Feintuning des cerebellären outputs
bestimmt. Tiermodelle, bei denen diese spezifische synaptische Übertragung gestört ist, zeigen in
Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und des motorischen
Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie.
Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei Typen von Ca2+
Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ
initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische
Ca2+ Kanäle. (2.) Ein langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR1)
die Freisetzung von Ca2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung von Ca2+ aus
dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der Plasmamembran, die erneut eine
lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken. Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte TrpIonenkanäle (Trp, transient receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die
man häufig auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3 als
maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt. Mausmodelle denen
dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein
natürlich vorkommendes Mausmodell mit motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im
Gen, das für den Kanal TrpC3 kodiert.
18
Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen, physiologischen
und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses Wissen erlaubt ein besseres Verständnis
klinischer Phänomene und hilft bei der Entwicklung neuartiger Therapien.
Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und
Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre
Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten
Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen
der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An
Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von
zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern
(CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF
pairing).
Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD
führen, sind gut beschrieben und bieten eine
experimentelle Grundlage zur Untersuchung der
molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität.
Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu 175.000
Synapsen zu Parallelfasern und bis zu 26.000 zu
Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass
postsynaptische Ca2+ Signale in einzelnen
Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der
Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere
Forschungen haben einen Mechanismus der
synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig
von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist.
Literatur:
*Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen.
Milner, Squire & Kandel (1998) Cognitive Neuroscience and the study of memory. Neuron 20: 445 ff.
Ito M. (2002) The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Rev Neurosci 3:
896-902.
19
Ionenkanäle, Prof. Villmann
Die außerordentliche Komplexität des menschliches Gehirns ist begründet durch seinen komplizierten
Aufbau, die Vielfalt seiner Funktionen wie Wahrnehmung und Bewegungskontrolle sowie Gedächtnis.
Zusätzlich unterteilt man in verschiedene Organisationsebenen von Genen, über Moleküle, Zellen,
Zellsysteme bis zum Verhalten des Organismus. Die neurobiologischen Fragestellungen nähern sich
dem in ausschnitthaften spezialisierten Vorgehen ähnlich einem Puzzle, wodurch in einem
überschaubaren engen Bereich möglichst viel über die Funktion des Nervensystems herausgefunden
und dann zur Rekonstruierung der globalen Zusammenhänge benutzt wird.
Während neurotrophe Faktoren für die Entstehung und Erhaltung neuronaler Faserverbindungen
unentbehrlich sind, übermitteln Neurotransmitter die neuronale Erregung von Nervenzelle zu
Nervenzelle. Exzitatorische (erregende) sowie inhibitorische (hemmende) Neurotransmitter binden an
entsprechende Ionenkanäle, die integrale Membranproteine darstellen. Diese sind nicht einfach Löcher
in der Membran, sondern hochspezialisierte Tunnelproteine, die (1) Ionen transportieren, (2) spezifische
Ionen erkennen und selektieren und sich spezifisch (3) als Folge eintreffender elektrischer,
mechanischer oder chemischer Signale öffnen bzw. schließen. Dabei kann die Flussrate bis zu 100
Millionen Ionen pro Sekunde durch einen einzigen Ionenkanal betragen!
Ionenkanal
spannungs-gesteuert
liganden-gesteuert
mechanisch gesteuert
Stimulus
Veränderung der Spannung
chem. Transmitter
Veränderung von
Druck und Dehnung
Tabelle 1
Spannungsgesteuerte und ligandengesteuerte Ionenkanäle
Stimulus der
Ionenkanäle
spannungsgesteuert
ligandengesteuert
ionotrop
Beispiele
metabotrop
exzitatorisch
inhibitorisch
cAMP gekoppelt
IP3, DAG,
Arachidonsäure
gekoppelt
Tyrosinkinasen
NO, CO,
Stimulation von
cGMP Synthese
spannungsgesteuerte Na+
Kanäle
Glutamatrezeptoren
GABA Rezeptoren
Glutamatrezeptoren
Glutamatrezeptoren
TrkA, TrkB,
TrkC, p75
passieren
Membran
spannungsgesteuerte K+
Kanäle
nikotinischer
Acetylcholinrezeptor
Glycinrezeptoren
-adrenerger
Rezeptor
Insulinrezeptor
sehr kurze
Halbwertzeit
einwärts rektifizierende K+
Kanäle
5HT3 Rezeptor
zwei Porendomänen K+
Kanäle
spannungsgesteuerte
Ca2+ Kanäle
Serotoninrezeptoren
muskarinischer
Acetylcholinrezeptor
Dopaminrezeptoren
Histaminrezeptoren
keine Bindung an
Rezeptoren,
direkter Effekt auf
benachbarte
Zellen
Die Signalübertragung an der chemischen Synapse findet zwischen prä- und postsynaptischen
Neuronen statt. Neurotransmitter werden in Vesikeln im präsynaptischen Neuron gespeichert. Durch
einen elektrischen Impuls, das Aktionspotential, fusionieren die Vesikel mit der präsynaptischen
Membran und schütten ihren Inhalt durch Exozytose in den synaptischen Spalt aus. An diesem
Prozess, den man in mehrere Phasen unterteilt: (I) docking, (II) priming, (III) fusion, release und (IV)
recycling, sind zahlreiche Protein-Protein-Interaktionen (SNARE-Proteine) beteiligt (siehe Abbildung 1).
Nach Diffusion über den synaptischen Spalt, löst die Bindung des Neurotransmitters an den Rezeptor
eine Konformationsänderung aus, die letztlich zur Öffnung des Ionenkanals führt. Diesen
Transduktionsprozeß bezeichent man als „gating“ des Kanals. Dadurch wird es dem Aktionspotential
ermöglicht zur nächsten Nervenzelle überzuspringen - „jump the gap“.
20
Die Forschung der letzten 15 Jahre
führte zur detaillierten Aufklärung
des
Fusionsund
Freisetzungsprozesses
von
Neurotransmittern.
Maßgeblich
daran
beteiligt
ist
die
Forschungsgruppe um Thomas C.
Südhof (Standford University);
Brose et al., Science 1992,
Ushkaryov et al., Science 1992;
Schoch et al., Nature 2002;
Tabuchi et al., Science 2007;
Kaeser et al., PNAS 2012.
http://www.hhmi.org/research/investigators/sudhof.html
Abb. 1
Doch was genau passiert nach Bindung des Liganden an den Rezeptor? Wie sehen diese membranassoziierten Proteine aus und wie durchspannen sie die Membran (Abb.2)?
Abb. 2 Verschiedene
Familien besitzen
ähnliches Design. (A)
spannungsgesteuerte
Na+-, K+-, Ca2+-Kanäle,
(B) einwärtsrektifizierende K+ Kanäle,
(C) Zwei-Poren K+Kanäle, (D)
Nach Klonierung der Ionenkanäle zwischen 1980 und 2000 führten biochemische und
molekularbiologische Experimente zu einem deutlich verbesserten Verständnis von Struktur und
Funktion von Ionenkanälen so z.B. zum „Ball and Chain“ Modell für spannungsgesteuerte Ionenkanäle
(Abb.2).
21
Abb. 2 (nach Bezanilla, Physiological Reviews, 2000). Spannunsgesteuerte Ionenkanäle besitzen
Spannungssensoren (Transmembrandomäne 4), die sich durch den hohen Anteil basischer Aminosäuren
entsprechend der Ladung ihrer Umgebung in der Membran bewegen (siehe Wechsel von closed nach open).
Dadurch wird eine Konformationsänderung verursacht, der „Ball“ (Domäne im N-terminus) bewegt sich zur
Ionenkanalpore und verschließt diese (Wechsel von open zu inactivated). Das erregte Neuron kann für eine
bestimmte Zeit nicht erneut aktiviert werden – Refraktärzeit.
Doch erst durch das Aufklären der Kristallstrukturen ist es möglich bzw. wird es möglich sein, diese
Konformationsänderungen bis in den atomaren Bereich hinein zu beschreiben (Abb. 3).
Abb. 3 (nach Bocquet et al., Nature 2009). Aufsicht auf prokaryotische Cys-Loop Rezeptoren (A=GLIC aus
Gloebacter violaceus und B=ELIC Erwinia chrysanthemi) sowie Seitenansicht der Ionenkanaldurchmesser.
Helixrückgrat und Seitenketten die in die Pore hineinragen: Hydrophobe, polare und negativ geladene
Aminosäuren sind gelb, grün und rot dargestellt. C, Sequence Alignment der Ionenkanalporen verglichen mit
nikotinischem Acetylcholinrezeptor (nAChR) 1. D, Porendurchmesser.
Mit Hilfe von elektrophysiologischen Messmethoden wie der Patch-Clamp Technik war/ist es möglich,
die Eigenschaften von Ionenkanälen zu beschreiben. Für die Entdeckung dieser Methode erhielten die
deutschen Wissenschaftler Bert Sakmann und Erwin Neher 1991 den Nobelpreis für Medizin. Die
verschiedenen Konfigurationen und der prinzipielle Aufbau sind in Abb. 4 dargestellt.
Auf kleinste Veränderungen von Reizen aus der Umwelt so z.B. die Reaktion von Rezeptoren im Auge
auf ein einzelnes Photon aus dem Licht, oder ein einziges Molekül eines Geruchsstoffes auf Rezeptoren
im olfaktorischen System müssen Nervenzellen schnell reagieren, indem die starken Veränderungen in
den elektrischen Potentialdifferenzen über die Membranen von Nervenzellen weiterleiten. Während
eines Aktionspotentials wechseln die Membranpotentiale mit bis zu 500V /s. Die Verarbeitung dieser
22
Signale wird über Ionenkanäle vermittelt. Somit ist ziemlich klar, dass Störungen in der
Signalweiterleitung unweigerlich mit pathophysiologischen Veränderungen im zentralen Nervensystem
einhergehen was am Beispiel motorischer Bewegungsstörungen näher erläutert werden soll.
Abb.4 Durch Ansaugen der Zelle an die Patch-Pipette entsteht eine hochohmige Verbindung (im Gigaseal)
zwischen der Membran und der Pipette (aus Borosilikatglas). Dies nennt man die „cell attached“ Konfiguration.
Diese Konfiguration erlaubt es, den Membranfleck der intakten Zelle, auf ein bestimmtes Potential zu klemmen.
Durch Anlegen eines kurzzeitigen Pipettenunterdrucks, wobei die Verbindung zwischen dem Rand der
Spitzenöffnung der Patch-Pipette und der Membran nicht leidet, wird die „whole-cell“- Konfiguration hergestellt.
Somit wird die gesamte Zellmembran auf das angelegte Potential der Spannungsklemme gebracht. Es gibt noch
zwei weitere Konfigurationen, welche Messungen an von der Zelle abgetrennten Membranfetzen ermöglichen.
Die „inside-out“-Konfiguration entsteht, wenn man aus der „cell-attached“ Konfuguration mit einem Ruck die
Patch-Pipette von der Zelle wegreißt. Bei der „outside-out“-Konfiguration startet man mit der „whole-cell“Konfiguration, wobei die Pipette langsam von der Zelle weggezogen wird.
Störungen in der inhibitorischen Neurotransmission
Inhibitorische Neurotransmitter sind -Aminobuttersäure (GABA) und Glycin. Während Glycin der
wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Hirnstamm und im Rückenmark ist, besitzt GABA eine
weitaus größere Bedeutung in höheren Hirnarealen wie z.B. dem Hippocampus. Glycin/GABA gefüllte
Vesikel schütten nach Einstrom von Ca2+ Ionen in die Präsynapse als Folge der Aktivierung
spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle ihren Inhalt in den synaptischen Spalt aus. Glycin bindet an
Glycinrezeptoren, was zu einem Chlorid-Einstrom in die Zelle führt. Diese Rezeptoren werden über das
Ankerprotein Gephyrin an der postsynaptischen Membran verankert (Abb. 5). Mutationen in den Genen
welche für die verschiedenen Glycinrezeptor  und  Untereinheiten kodieren, gehen beim Menschen
sowie bei Nagern mit motorischen Bewegungsstörungen einher. Diese werden als postsynaptische
Komponente der motorischen Bewegungsstörung Hyperekplexie diskutiert. Die Ursache ist in der
fehlenden Feedback-Kontrolle (siehe Bild Projektion Rückenmark-Muskel, Dr. Jablonka) der erregten
Motorneurone zu suchen, so dass ein Ungleichgewicht zwischen Exzitation/Inhibition vorliegt. Durch
eine Übererregung des Muskels kommt es zur Muskelsteifheit. Weiterhin können die Defekte auch in
präsynaptischen Proteinen vorliegen z.B. führen Mutationen im Glycintransporter 2 ebenso zu
Hyperekplexie (zweithäufigste Ursache dieser Erkrankung). Außerdem kann eine derartige
Bewegungsstörung auch durch Autoimmunantikörper hervorgerufen werden (Abb.5), die die Funktion
des Ionenkanals beeinflussen. Der genaue Mechanismus ist bislang unbekannt.
23
Abb. 5 Inhibitorische Synapse.
GlyRA
adulter
Rezeptor
Komplex aus 2 und 3
Untereinheiten.
GlyRN
=
neonataler GlyR Komplex,
extrasynaptisch bestehend aus
2 Untereinheiten, homomerer
Komplex. Verankerung über
Gephyrin. VIAAT = vesicular
inhibitory
amino
acid
transporter,
mGluR
=
metabotroper
Glutamatrezeptor, GABAB =
metabotroper GABA-Rezeptor,
GlyT1/2 Glycintransporter.
Literatur:
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
From Molecules to Networks (Byrne and Roberts), first edition 2004
Patch-Clamp-Technik (Numberger/Draguhn), Spektrum Verlag 1996
24
Neurobiologie Kursprogramm
Uhrzeit
Gruppe 1
08.30
Montag 05.11
Dienstag 06.11.
Mittwoch 07.11.
Donnerstag 08.11.
Freitag 09.11.
Hippokampus
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Waschen der
Schnitte
Synaptologie
Ionenkanäle
09.00
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippokampus
Synaptologie
Ionenkanäle
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Konfokale Bilder
Mausperfusion
Waschen der
Schnitte
Auswertung Internalisierung
DRG-Präparation,
Tier-OP
Mausperfusion
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
11.00
DRG-Präparation,
Tier-OP
Gewebe
einbetten,
DRGs fixieren
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
11.30
Zellkultur DRGs
Pause
DRGs fixieren
Waschen und
Eindeckeln
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Modulator
Inkubation
10.30
12.00
Pause
Pause
12.30
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Waschen und
Eindeckeln
Waschen und
Eindeckeln
13.00
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Waschen und
Eindeckeln
13.30
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Blocken,
Pause
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Histologie
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
Ephys Demo
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
SP2
Mikroskopieren
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
09.30
10.00
14.00
14.30
15.00
Live-CellImaging, AG
Blum
15.30
Live-CellImaging, AG
Blum
Live-CellImaging, AG
Blum
16.00
16.30
Mausperfusion
Histologie
Histologie
Pause
25
Modulator
Inkubation
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Fixieren
Eindeckeln
Ephys-Demo
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
Auswertung Internalisierung
Uhrzeit
Gruppe
2
08.30
Montag 05.11
Dienstag 06.11.
Mittwoch 07.11.
Donnerstag 08.11.
Freitag 09.11.
Hippokampus
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Synaptologie
Ionenkanäle
09.00
10.00
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
Mausperfusion
Synaptologie
Ionenkanäle
DRG-Präparation,
Tier-OP
Zellen fixieren
DRG-Präparation,
Tier-OP
Zellen fixieren
DRG-Präparation,
Tier-OP
Abschlußbesprec
hung
Zellkultur DRGs
Abschlußbesprec
hung
Waschen und
Eindeckeln
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Modulator
Inkubation
10.30
Mausperfusion
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
11.00
Mausperfusion
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
11.30
Gewebe einbetten,
Pause
Pause
Waschen und
Eindeckeln
Modulator
Inkubation
Pause
12.30
Gewebe schneiden
Waschen und
Eindeckeln
Zellkultur DRGs,
PC12
13.00
Gewebe schneiden
Waschen und
Eindeckeln
13.30
Gewebe schneiden
Pause
14.00
Blocken,
Pause
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Fixieren
Eindeckeln
Ephys-Demo
Live-CellImaging, AG
Blum
Live-CellImaging, AG
Blum
Live-CellImaging, AG
Blum
12.00
14.30
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
Ephys Demo
15.00
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Histologie
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
Konfokale Bilder
15.30
Histologie
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
Auswertung Internalisierung
16.00
Histologie
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
Auswertung Internalisierung
16.30
Histologie
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
SP2, Cerebellum
und
Hippokampus
SP2
Mikroskopieren
09.30
Hippokampus
Waschen der
Schnitte
Waschen der
Schnitte
26
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Uhrzeit
Gruppe
3
08.30
Montag 05.11
09.00
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
Nervenzellen,
Gliazellen,
extrazelluläre
Matrix
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Rezeptor
Internalisierung,
Labeln
Hippokampus
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Modulator
Inkubation
09.30
10.00
10.30
11.00
11.30
12.00
Dienstag 06.11.
Mittwoch 07.11.
Donnerstag 08.11.
Freitag 09.11.
Hippokampus
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Motorik
(Kleinhirn,
Basalganglien,
Rückenmark)
Mausperfusion
Synaptologie
Ionenkanäle
Synaptologie
Ionenkanäle
Waschen der
Schnitte
Auswertung
DRG-Präparation,
Tier-OP
DRG-Präparation,
Tier-OP
Mausperfusion
Waschen der
Schnitte
Auswertung
DRG-Präparation,
Tier-OP
Mausperfusion
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Abschlußbesprec
hung
Zellkultur DRGs
Gewebe
einbetten, DRGs
fixieren
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Abschlußbesprec
hung
Pause
Pause
DRGs fixieren
Waschen und
Eindeckeln
Live-CellImaging, AG
Blum
Pause
Pause
Waschen und
Eindeckeln
Live-CellImaging, AG
Blum
Live-CellImaging, AG
Blum
12.30
Modulator
Inkubation
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Waschen und
Eindeckeln
13.00
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Waschen und
Eindeckeln
Zellkultur DRGs,
PC12
Gewebe
schneiden
Pause
Zellkultur DRGs,
PC12
Zellkultur DRGs,
PC12
Blocken,
Pause
14.30
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Rezeptor
Internalisierung,
Fluoreszenz
Markieren
Fixieren
Eindeckeln
Ephys-Demo
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
15.00
Ephys Demo
Zellkultur DRGs,
PC12
15.30
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
cLabs – virtuelle
Rezeptoren
Konfokale Bilder
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cerebellum und
Hippoc. Schnitte
Histologie
13.30
14.00
16.00
16.30
Auswertung Internalisierung
Auswertung Internalisierung
Histologie
Histologie
27
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2, Cerebellum
und Hippokampus
SP2 Mikroskopieren
Einführungs-Vorlesungen
05. bis 09. November: Beginn Montag 05. Nov. 9.00 Uhr, HS MSZ, Versbacherstr.5, 97078
Würzburg
Treffpunkt am 05.11.2011:
8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5
Montag, 05. 11. 2012
9:00 Uhr
Ionenkanäle, Prof. Villmann
Abschlussbesprechung
Dienstag, 06. 11. 2012
8.30 Uhr
Synaptologie, Dr. Götz
Mittwoch, 07. 11. 2012
8.30 Uhr
Nervenzellen, Gliazellen, extrazelluläre Matrix, Prof. Sendtner
Donnerstag, 08. 11. 2012
8.30 Uhr
Motorik (Kleinhirn, Basalganglien, Rückenmark), Dr. Jablonka
Freitag, 09. 11. 2012
8:30 Uhr
Hippokampus, Dr. Blum
Für den praktischen Teil werden die Studenten in drei Gruppen
aufgeteilt (2x 7 und 1x 6 Studenten).
28
ZELLKULTUR TEIL
Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung Signale von neurotrophen Faktoren
und extrazellulären Matrixproteinen (siehe Vorlesung Prof. Sendtner).
Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw.
Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixproteinen zu untersuchen, werden primäre
sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 8-9 Tage alten Hühnchenembryonen oder
von 12-14 Tage alten Mausembryonen isoliert und unter den unten genannten Bedingungen kultiviert.
I. Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs)
I. Vorbereitung
1. Lösungen

F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml
Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat,
60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf pH 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g
NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS
zugeben, steril filtrieren

Phosphate buffered saline; PBS

1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN)
2. Kulturschalen
a) Am Vortag:
Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer pH 8,35) über Nacht bei
4°C beschichten
b) Vor der Präparation:
- 3x mit HBSS waschen
- Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in
HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml)
3. Im Labor vorbereiten
Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln
und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS
29
II. Präparation
-
E13 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale
gesammelt
Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen
Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt, die Haut entfernt und das Rückenmark
freipräpariert.
Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des Muskels laufen, abgetrennt.
DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln
Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS
überführen.
III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone)
-
-
DRGs mit 1 ml Pipette aus der Petrischale aufsammeln, dabei leicht schwenken (damit nichts
hängen bleibt) und in 15 ml Röhrchen sammeln.
Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml
reduzieren.
50 µl 1 % Trypsin dazugeben und leicht schwenken.
30 min bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml.
Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen
Neurone).
15 ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen.
Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben.
2 h bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen.
8 min bei 400 g zentrifugieren.
Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren
Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate
auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension)
Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111
absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration)
zugeben.
Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben.
IV. Kultur
Kulturmedium: F14 + 10% HS, Inkubation bei 37°C und 5% CO2
Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor.
Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen
ausplattiert.
30
II. In vitro Analyse des Proliferations- und Differenzierungspotentials embryonaler
neuraler Stammzellen der Maus.
Das Nervensystem von Säugetieren entsteht aus dem Neuroektoderm, das in Neuralrohr und
Neuralleiste strukturiert wird. Aus diesen Strukturen entstehen sowohl Nervenzellen als auch
Stützzellen (Glia). Neurale Stammzellen können sowohl in Nervenzellen als auch Glia differenzieren, im
Gegensatz zu späteren neuronalen Stammzellen, deren Differenzierungspotential auf Nervenzellen
beschränkt ist. Frühe neurale Stammzellen bilden das Neuroepithel; sie proliferieren durch
symmetrische Zellteilungen. Unter bestimmten Stimuli können sie alternativ durch asymmetrische
Zellteilung sich selbst erneuern, wobei die zweite Tochterzelle in ein postmitotisches Neuron
differenziert.
Im Praktikumsteil sollen Zellkulturtechniken für neurale Stammzellen erlernt werden, um die Signale für
Mitose und Differenzierung untersuchen zu können. Dazu generieren Sie adhärente Kulturen neuraler
Stammzellen, die aus Mäuseembryonen gewonnen wurden, behandeln sie mit Wachstumsfaktoren
(EGF und bFGF) und analysieren die Zellproliferation. In einem zweiten Versuchsansatz untersuchen
Sie die Differenzierung neuraler Stammzellen zu Neuronen.
Kultur embryonaler neuraler Stammzellen der Maus.
Neurale Stammzellen können entweder als Neurosphären in serumfreiem Neurobasal-Medium mit dem
Supplement B27 und den beiden Wachstumsfaktoren EGF (20 ng/ml) und
Fibroblastenwachstumsfaktor-2 (FGF-2 oder bFGF, 10 ng/ml) kultiviert werden. Alternativ wachsen sie
adherent auf Zellkulturplastik, wenn zusätzlich Heparin (5µg/ml) zum Medium zugegeben wird.
Ziel 1:
Nachweis der neuronalen Differenzierung und des Zellüberlebens unter differenzierenden Bedingungen.
Dazu werden 10.000 Zellen auf beschichteten Glasplättchen in 4-well Zellkulturschalen (Nunc #14444)
ausgesät. Dies ermöglicht die Lebendbeobachtung ebenso wie Immunfärbungen (zum Nachweis z. B.
der Apoptose, etc.) nach der Fixierung der Zellen. Nach 24 h Inkubation werden die Schalen
mikroskopiert und Photos gemacht. Dann werden die adhärenten Zellen einmal mit PBS gewaschen
und mit 4% PFA in PBS fixiert.
Ziel 2:
Nachweis des EGF und bFGF Effekts auf die Proliferation. Dazu werden 10.000 Zellen auf
beschichteten Glasplättchen in 4-well Zellkulturschalen (Nunc #14444) ausgesät. 2 Stunden später
erfolgt die Zugabe der Wachstumsfaktoren. Zum Nachweis der Proliferation wird der
Zellproliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU) zugegeben. Nach 24 h Inkubation werden die
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Schalen mikroskopiert und Photos gemacht. Dann werden die adhärenten Zellen einmal mit PBS
gewaschen und mit 4% PFA in PBS fixiert.
Well 1
Well 2
Well 3
Well 4
kein Faktor
EGF (Endkonzentration 20ng/ml)
bFGF (Endkonzentration 10ng/ml)
EGF plus bFGF
Durchführung:
Als erstes werden die 10mm Gläschen, die bereits am Vortag mit Poly-D,L-Ornithin beschichtet wurden,
mit Laminin beschichtet (siehe DRG Versuch). Die Wachstumsmedien für Differenzierung und
Proliferation werden angesetzt. Jede Gruppe befüllt eine 4 Well-Platte für den Proliferationsansatz und
eine weitere Platte für die Differenzierung. Die neuralen Stammzellen sind auf 3-cm Schalen der Firma
Falcon kultiviert. Es wird in einer Sterilwerkbank gearbeitet und wie folgt verfahren:
- Medium absaugen
- Vorsichtig mit 2.5ml PBS waschen
- 1ml PBS zugeben
- 40µl 1% Trypsin zugeben
- Schale vorsichtig schwenken und 2 min im Brutschrank inkubieren
- Im Mikroskop die Ablösung der Zellen von der Schale prüfen
- 40µl 1% Trypsininhibitor und 500µl Neurobasal/B27 zugeben
- Zellen durch „Triturieren“ mit einer blauen Spitze/Pipette dissoziieren
- In ein 15ml Falconröhrchen überführen
- Zentrifugation 1.400rpm, 4min, RT
- Überstand absaugen (verwerfen)
- Zum Zellpellet 500µl Neurobasal/B27 zugeben und lösen (5-mal triturieren)
- Erneute Zentrifugation 1.400rpm, 4min, RT
- Überstand absaugen (verwerfen)
- Zum Zellpellet 500µl Neurobasal/B27 zugeben und lösen (10-mal triturieren)
- Zellzahl bestimmen (Neubauer Zählkammer)
- Ggf. Photo davon machen
- Berechnen der benötigten Zellmenge (µl) pro well
- Mischen von Medium mit den Zellen (=>Zellsuspension)
- Aussäen von 500µl Zellsuspensiopro Well, dazu wird vorher die Laminin-Lösung abgesaugt.
- Ggf. Zugabe der Faktoren gemäß Schema
- Ggf. Zugabe des Zellproliferationsmarkers Bromodeoxyuridine (BrdU, Endkonzentration von
BrdU im Medium 10μM)
Kulturmedium:
Neurobasal Medium, Gibco 21103
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2% B27, Gibco #17504-044
100 U/ml Penicillin
10 μg/ml Streptomycin
1% Glutamax
1% MEM Non-essentaial amino acids, Gibco 11140
Wachstumsfaktoren (Stammlösungen):
20 ug/ml EGF
10 ug/ml FGF-2
Turnover von Rezeptorproteinen und Basics der Elektrophysiologie
Nach Translation im Cytoplasma werden Rezeptorproteine über die Kompartimente ER, ER-Golgi
intermediäres Kompartiment, cis-, trans- Golgi zur Plasmamembran transportiert. Ihre Degradation
erfolgt nach Endozytose über den endosomalen/lysosomalen Abbau oder nach Ubiquitinierung über das
Proteasom. Außer Markierung durch Ubiquitin kann intrazelluläre Phosphorylierung des
Ionenkanalproteins, eine posttranslationale Modifikation, ein Signal für eine Internalisierung des
Proteins sein. Diese lässt sich im Zellkulturmodell durch die Zugabe von Aktivatoren bestimmter
Proteinkinasen untersuchen.
Die Untersuchung von Rezeptor Turnover in der Plasmamembran ist nicht nur ein wichtiges Kriterium
zur Aufklärung der Pathomechanismen bei Hyperekplexie, wo im Patienten identifizierte rezessive
Mutationen mit einer gestörten Biogenese einhergehen, sondern ist auch bei Autoimmunerkrankungen
von Bedeutung. Eine verstärkte Internalisierung von Rezeptorproteinen ist bei Myasthenia gravis
(nAChR) oder Panencephalitis (NMDAR) beobachtet worden.
Inhibitorische Glycinrezeptoren besitzen in intrazellulären Domänen zahlreiche Erkennungssequenzen
für Proteinkinasen. Bislang konnte eine Phosphorylierung nur für die Proteinkinase C (PKC) gezeigt
werden. Stimuliert man Zellen mit PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat), einem hochaffinen Modulator
der PKC, wird der Glycinrezeptor nach Aktivierung der PKC phosphoryliert und verstärkt internalisiert.
Diese Internalisierung hat eine Verringerung der Zelloberflächenexpression zur Folge und führt daher zu
einer verminderten inhibitorischen Neurotransmission. Ziel des Versuches ist es, die verstärkte
Internalisierung nach Zugabe des positiven Modulators PMA zu verfolgen.
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Zur Untersuchung der Internalisierungsraten von Glycinrezeptoren werden kultivierte HEK293 (humane
embryonale kidney) Zellen mit der entsprechenden Plasmid-DNA, die für den humanen Glycinrezeptor
1 kodiert, 24h vor Versuchsbeginn transfiziert. Die Kontrolle der Transfektionseffizienz wird mit
HEK293 Zellen, die parallel mit GFP (green fluorescent protein) transfiziert wurden, überprüft.
I.
Versuchsvorbereitung
-
II.
HEK293 Zellen werden auf 3 cm Kulturschalen mit 4 Deckgläschen mit einer Dichte von
180.000 Zellen pro Schale ausgesät
nach 24h werden die Zellen nach der Calciumphosphatpräzipitationsmethode (Chen
and Okayama 1987) transfiziert
nach 18h werden die Zellen mit Vollmedium (MEM Medium + Zusätze FCS, L-Glu,
Pen/Strep) gewaschen
nach wieder 24h wird der Internalisierungsassay durchgeführt
Versuchsdurchführung
-
-
III.
Zellen auf eine mit Parafilm beschichtete feuchte Kammer überführen
mit Erstantikörper (mab2b, 1:500 in Vollmedium verdünnt, pro Deckgläschen 50 µl) auf
Eis 30 min inkubieren
vorsichtiges Waschen mit Extrazellulär Puffer (ECS physiologischer Puffer der für
elektrophysiologische Messungen verwendet wird), d.h. vorsichtiges Eintauchen, so
werden überschüssige Antikörper-Reste entfernt
jetzt Inkubation mit erstem secondary Antikörper durchführen, wieder 30 min auf Eis
(goat-anti-mouse Cy3, 1:500 in Vollmedium verdünnen), OHNE LICHTEXPOSITION!!
Zellen wieder vorsichtig 3x waschen mit ECS-Puffer
Modulator in Vollmedium verdünnt zugeben (200 nM PMA)
jetzt Zellen für 20 min und 40 min bei 37ºC inkubieren (Zellkulturschrank)
INTERNALISIERUNG bei 37ºC!
Zellen wieder 3x waschen (ECS-Puffer)
mit zweiten secondary Antikörper inkubieren (donkey-anti-goat-DyLight 488; 1:500 in
Vollmedium) für 30 min auf Eis IM DUNKELN!!
Zellen 3x vorsichtig in PBS waschen
Zellen mit 4% PAFA 4%Sucrose PBS für 5 min Raumtemperatur fixieren
Zellen 2x mit PBS waschen, 1x mit VE Wasser
Zellen mit Aqua-mount bzw. Mowiol einbetten und im Kühlraum unter Ausschluss von
Licht trocknen lassen
Versuchsauswertung
-
jede Gruppe wertet mindestens 10 Zellen pro Zeitpunkt (0 min, 20 min, 40 min) nach
Aufnahme am konfokalen Mikroskop aus
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(+) Modulator
Klon transfiziert
GlyRa1 wt
Zelle #
0 min PMA
(-) Modulator
0 min ohne
20 min PMA 40 min PMA Modulator
20 min ohne
Modulator
40 min ohne
Modulator
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mittelwert
SD
- anschließend wird anhand der Tabelle die Auswertung mit einem Balkendiagramm graphisch
dargestellt (Vergleich PMA und unbehandelt)
IV. Ergänzende Protokolle und Material
Transfektion mit HBS-Puffer:
OPTIONAL
-
0.1xTE bei 37ªC warm stellen
folgende Lösungen zusammen pipettieren, Reihenfolge beachten:
(fett-gedruckte Zahlen gelten für 3 cm Schalen)
10 µl /2 µl DNA (aus 1 µg/µl stock) für 10cm/3cm Schale
10 µl /1 µl GFP-DNA (aus 1 µg/µl stock) für 10cm/3cm Schale
430 µl /87 µl 0.1x TE -Puffer
50 µl /10µl CaCl2 (2.5 M) Endkonzentration 125mM
gut mischen !
500 µl/100µl 2x HBS (tropfenweise zugeben
Schütteln und abzentrifugieren und 20 min bei RT (oder schnelle Methode 1 min bei 37 ªC) inkubieren (bei Falcon
tubes 2 min)
Mischung tropfenweise zu den Zellen geben und Präzipitatbildung im Mikroskop überprüfen
Schalen über Nacht in 5 % CO2-Brutschrank inkubieren, 37ºC.
Zellen nach ca. 24h 2x mit Vollmedium waschen.
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2x HBS Puffer:
50 mM HEPES (1.19 g)
12 mM Dextrose (Glucose) (0.237 g)
10 mM KCl (0.075 g)
280 mM NaCl (1.63 g)
1.5 mM Na2HPO4 x 2H2O (0.0267 g)
mit H2O auf 100 ml auffüllen, pH 6.95 WICHTIG mit NaOH
Elektrophysiologische Messungen
Die physiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen lassen sich mit Hilfe elektrophysiologischer
Ableitungen beschreiben. Wie bereits erwähnt, können Mutationen im Glycinrezeptor zu einer
verminderten Zelloberflächenexpression führen. Dies kann mit einer reduzierten Kanalleitfähigkeit
einhergehen, ebenso können aber auch die Kanaleigenschaften wie die Desensitisierung (Kanal
schließt in Anwesenheit des Agonisten/Liganden) des Ionenkanals verändert sein. Diese
Veränderungen werden am elektrophysiologischen Setup mit Hilfe der Patch Clamp Technik
demonstriert. Dazu werden HEK293 Zellen 24h vor Messbeginn mit Plasmid-DNA, die für den humanen
Glycinrezeptor 1 Wildtyp sowie den Punktmutanten P250T und S231R transfiziert (P250T führt zu
einer schnelleren Desensitisierung, S231R zu einer deutlich reduzierten Maximalstromantwort).
Anschließend sollen verschiedene Ableitsituationen virtuell mit Hilfe des Computer-Programms cLabsNeuron untersucht werden. Zunächst werden Simulationen zu den Basisfunktionen neuronaler
Membraneigenschaften mit ihren elektrischen Equivalenten wiederholt.
Im Ionenkanal-Modul werden die ‘gating’ Mechanismen sowie die pharmakologischen Eigenschaften
spannungsgesteuerter Na+- und K+ -Kanäle verdeutlicht. Die virtuelle Membran wird de-/repolarisiert und
der Einfluß auf den Ionenstrom beobachtet.
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IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL
Die Antikörperfärbungen an hippokampalen und cerebellären Gewebeschnitten von jungen und adulten
Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof.
Sendtner, Dr. Jablonka, Dr. Blum).
Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in
der Kleinhirnrinde einer adulten und einer postnatalen Maus (Tag 5-8) untersucht und dokumentiert
werden, um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des
Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und mit konfokaler Mikroskopie
ausgewertet.
Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst
präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten
Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es
möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen.
Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben.
Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert
werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die
Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden.
Herstellung von „free floating sections„ mit dem Vibratom
Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird
freipräpariert. Nach einer kurzen Postfixation wird das Gewebe in Agarose eingebettet und mit einem
Vibratom in 50-80 µm dicke Scheiben geschnitten.
Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (4 % in der Pufferlösung PBS, pH 7.4,
PFA) eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme
werden inaktiviert, das Gewebe wird härter und kann gelagert werden.
Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%-iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers
entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann.
Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und mit einem Skalpell oder einer
Rasierklinge vorgeschnitten, so dass die interessante Gewebeseite exponiert wird (siehe Vorlesung).
Schneiden: Der getrimmte Gewebeblock wird entsprechend dem
Klingenverlauf des Vibratoms auf einem Probenhalter mit
Sekundenkleber festgeklebt. Der Probenhalter wird im Vibratom
befestigt. Die vibrierende Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit
PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte werden mit
einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS
pH 7.4, gesammelt. Die Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub
des Probenhalters reguliert.
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Indirekte Fluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen und Antigenen mit Antikörpern
Zellen werden zunächst mit einem Detergenz (z.B. Triton X100, Tween 20) während des Blockings
permeabilisiert, um den Antikörpern den Zugang zum Zytoplasma zu ermöglichen. Dann werden die
Erstantikörper auf den Schnitt gegeben. Dabei ist wichtig, dass die beiden Antikörper in Tieren
unterschiedlicher Gattungen produziert worden sind, z.B anti-Parvalbumin im Kaninchen (polyklonal)
und anti-SMI-31 (monoklonal) in der Maus. Nach einem Waschgang bleiben nur dort Antikörper zurück,
wo sie an ihr jeweiliges Antigen gebunden sind - also die einen an den Purkinje-Zellen und
Interneuronen, die anderen an den Axonen. Nun werden die Zweitantikörper zugegeben, die gegen
Antikörper der Tiere gerichtet sind, von denen die Erstantikörper stammen. Die anti-KaninchenZweitantikörper sind mit einem roten Fluorochrom konjugiert (z.B. Cy3, Dylight 549, Alexa 549), die antiMaus-Zweitantikörper tragen ein grünes Fluorochrom (Alexa 488, Dylight 488). Diese
Sekundärantikörper werden fast immer durch Immunisierungen von Ziegen (goat) oder Esel (donkey)
mit IgG-Fraktionen der Erstantikörperspezies induziert und aus deren Serum gereinigt. Nach
Abwaschen der nicht-gebundenen Antikörper kann nun mit dem Fluoreszenzmikroskop oder einem
konfokalen Laserscanning-Mikroskop die Verteilung der Immunfärbung im Gewebeschnitt untersucht
werden. Dabei muss das optische System so eingerichtet sein, dass Anregungs- und Emissionslicht der
beiden Fluorochrome gut voneinander getrennt sind. Nur dann ist eine getrennte Darstellung der beiden
Signale möglich.
Blockierung: Mit PBS + BSA 10 % + Triton X-100 0,1 % werden unspezifische Bindungsstellen im
Gewebe abgeblockt und Fette + Eiweiße aus Zellmembranen herausgelöst. Dadurch wird das Gewebe
eingängiger für den Antikörper und somit eine bessere Färbung erzielt. 45 minbis 1 h bei RT sollten bei
dieser Schnittdicke ausreichen.
In der gesamten Prozedur kann BSA auch durch Serum ersetzt werden. Hier wird bevorzugt Serum
verwendet, welches der Spezies der Sekundärantikörper entspricht.
1. Antikörper: Der Erstantikörper, welcher spezifische Proteine erkennt, wird in PBS + BSA + Triton X100 verdünnt und 4 h bei RT oder über Nacht bei 4° C mit dem Gewebe inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wird 3-4x 10 min mit PBS gewaschen, um den überschüssigen, nicht gebundenen
Antikörper zu entfernen. Achtung: ungebundener Antikörperüberschuß führt zu hohem Background.
2. Antikörper: der unspezifische Zweitantikörper, welcher den Erstantikörper erkennt und an diesen
bindet, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Dieser wird ebenso in PBS + BSA + Triton X-100
verdünnt, zupipettiert und für 1 1/2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder 3x mit PBS gewaschen
und das Gewebe auf ein Objektträger gezogen. Fluorezenzgefärbte Schnitte werden in einem
Einbettmedium (hier Aquafluomount) eingedeckelt und mit Nagellack umrandet. Die Färbungen können
im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden.
Warum welcher Puffer:
Phosphat oder Tris-Puffer um einen für Antikörper-Antigen günstigen pH-Wert zu erhalten.
BSA oder Serum zum Blockieren unspezifischer Interaktionen.
38
Tween 20, Triton X-100 oder andere Detergenzien um die Diffusion zu verbessern, unerwünschte
unspezifische, insbesondere hydrophobe Bindungen abzuschwächen, und um das Eindringen der
Antikörper in die Zellen zu erleichtern.
Um ein rasches Ausbleichen der Fluorochrome durch freie Radikale zu vermindern, werden „anti-fade„
oder „anti-bleaching„ Reagentien im Einbettmedium eingesetzt. Das Einbettmedium muss in seinem
Brechungsindex an den der Deckgläser angepasst sein..
Fluorophore
Absorptionsmax. (nm)
Emissionsmax. (nm)
Cyanine, Cy2
492
510
Fluorescein, FITC
492
520
Alexa 488 / Dylight 488
495
510
Indocarbocyanine, Cy3
550
570
Alexa 549 / Dylight 549
550
570
Aminomethylcoumarin, AMCA
350
450
Texas Red, TR
596
620
Indodicarbocyanine, Cy5
650
670
39
Calbindin is a calcium-binding protein belonging to the troponin C superfamily. Calbindin
immunoreactivity was detected by immunohistochemistry in the kidney, pancreatic islets, and brain. Two
different proteins presenting calbindin immunoreactivity, one of molecular mass 28 kD and the other of
29 kD, were identified in the central nervous system. Both molecular species are present in the brain of
all vertebrates except fish.
Parvalbumin, a high affinity calcium-ion binding protein, is expressed in high levels only in fastcontracting muscles and at lower levels in brain and several endocrine tissues. In the hippocampus it is
an excellent marker for interneurons, the so called PV+ fast spiking basket cell and it labels dendrites,
the soma and the axonal projections.
SMI 31 stains phosphorylated neurofilament. It reacts broadly with thick and thin axons and some
dendrites, but not Purkinje cell dendrites! Nerve cell bodies and other cells and tissues are unreactive
except for peripheral axons.
NF: Cytoplasmic intermediate filaments (IF) can be divided into 5 subclasses based on their biochemical
properties, immunologic specificity and tissue distribution: keratin, filaments in epithelial cells, vimentin
filaments in cells of mesenchymal origin, desmin in muscle cells, glial filaments in astrocytes, and
neurofilaments in neurons. The different types of intermediate filament proteins share common
structural features. Neurofilaments are composed of 3 neuron-specific proteins with apparent molecular
weights of 68,000 (called NF-L for light), 125,000 (NF-M for medium), and 200,000 (NF-H for heavy) on
SDS-gel electrophoresis. The different sequence data show that the intermediate filament proteins
contain a similar alpha-helical domain of conserved length capable of forming coiled-coils.
GFAP: Glial fibrillary acidic protein is an intermediate-filament (IF) protein that is highly specific for cells
of astroglial lineage. The predicted amino acid sequence indicated that GFAP shares structural
similarities with other IF proteins found in nonepithelial cell types. Considerable sequence divergence in
the amino-terminal region of GFAP suggested that the tissue-specific functions of this IF protein may be
mediated through this region of the molecule. GFAP is a useful marker of astroglia, but is not a general
marker for astroglia in the CNS.
NeuN reacts with most neuronal cell types including granule cells of the cerebellum and the
hippocampus but not with precursors in proliferative zones. Staining is strongest in nuclei. No staining of
Purkinje cells!
Doublecortin is a marker of immature neurons. In the adult, it is preferentially expressed in neurogenic
niches of the lateral ventricle or the subgranular zone of the hippocampus (hilus).
40
1st antibody
Cerebellum
Maus
Monoclonal
Polyclonal
adult
Parvalbumin 1:1000
Neurofilament 1:200
P8-10
Parvalbumin 1:1000
Neurofilament 1:200
adult
Neu N 1:400
Calbindin 1:1000
P8-10
Neu N 1:400
Calbindin 1:1000
adult
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
P8-10
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
adult
Neu N 1:400
Doublecortin 1:400
adult
Neu N 1:400
Parvalbumin
adult
Neu N 1:400
Neurofilament 1.200
adult
Neu N 1:400
GFAP 1:50
Hippocampus
1:1000
Spinal Cord
2nd antibody
Anti-mouse: Donkey-anti-mouse IgG Dylight 549 1:600
Anti-rabbit: Donkey anti-rabbit IgG Dylight 488
1:600
41
Immunohistochemistry of the vibratome sections
•
After vibratome sectioning, slices are stored in 1x PBS, pH 7.4
•
blocking: PBS / horse serum 10% / Triton X-100 0,3 % / 0.1 % Tween 20 -> 45 min. / RT /
shaker (alternative: BSA 10%)
•
1st antibody: PBS / 10% horse serum / 0,1 % Triton X-100 / 0,1% Tween 20 -> overnight /
+4°C / shaker
•
washing: PBS, 0.1 % Triton X-100, 0,1 % Tween 20 -> 3 x 10-15 min / RT / shaker
•
2nd antibody: PBS / 10% horse serum / 0,1 % Triton X-100 / 0,1% Tween 20 -> 60 - 90 min.
/ RT / shaker / dark
•
washing: 1x PBS, 0.1 % Triton X-100, 0,1 % Tween 20 -> 3 x 15 min. / RT / shaker / dark
(DAPI during last washing step in PBS (2mg/ml Stock solution, 1/5000, 5 min)
•
washing: 1x PBS, 1 x 5 min. / RT / shaker / dark
•
mounting: Aqua-Fluomount -> +4°C
42
Struktur und Klassifizierung von Antikörpern
Antikörper werden als Antwort auf die Präsenz fremder Moleküle produziert. Vor allem werden sie von
Plasmazellen produziert und zirkulieren durch Blut und Lymphe. Antigen-Antikörper Komplexe werden
durch Phagozytose durch Makrophagen entfernt. Antikörper bilden eine große Familie von
Glykoproteinen, mit gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften: Funktionell werden sie
durch ihre Eigenschaft definiert, gleichzeitig Antigene und spezialisierte Zellen oder Proteine des
Immunsystems zu binden. Strukturell gesehen, bestehen sie aus einer oder mehr Kopien einer Yförmigen Einheit, welche aus 4 Polypeptiden besteht: 2 „light chain„ und 2 „heavy chain„ Molekülen.
Es gibt 5 Klassen: IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterschieden durch die Zahl der Untereinheiten und des
Typs des „heavy chain„ Polypeptids:
IgG
IgM
IgA
IgE
IgD
Heavy Chain
Light Chain
oder
oder
oder
oder
oder
Struktur
Valenz
2
10
2, 4 oder 6
2
2
Konzentration
im Serum
8-16 mg/ml
0,5-2 mg/ml
1-4 mg/ml
10-400
ng/ml
0-0,4 mg/ml
Funktion
Sekundäre
Immunantwort
Primäre
Immunantwort
Schutz der Schleimhäute Schutz
gegen
Parasiten
?
Der IgG-Typ ist am häufigsten (siehe Tabelle) und soll daher näher beschrieben werden: IgG Moleküle
besitzen 3 Protein-Domänen. 2 davon sind identisch und bilden die Arme des Ys. Jeder dieser Arme
43
enthält eine Antigen-Bindungsstelle. Die 3 Domänen können durch Proteasen-Verdau mit Papain
getrennt werden. Die beiden Antigen-bindenden Domänen heißen auch Fab Fragmente (fragment
having the antigen binding site) während die Domäne an der Basis in die Immun-Regulation involviert
ist als Fc-Domäne bekannt ist (fragment that crystallizes). Die heavy chains haben ein
Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton, die light chains ca. 25.000 Dalton. Die IgG-Moleküle werden
nach ihrere Sequenz wiederum in verschiedene Unterklassen geteilt. Bei der Maus z.B. in IgG1, IgG2a,
IgG2b und IgG3.
Die Region eines Antigens, welches durch einen Antikörper gebunden wird, ist ein „Epitop„. Diese
Epitope sind Oberflächenstrukturen aus direkt benachbarten Aminosäuren (mindestens 6) oder aus
getrennten Sequenzen, die nur im gefalteten Polypeptid beisammen liegen. Die Antigen-Antikörper
Interaktion ist nicht-kovalent und reversibel. Die Affinität ist ein Maß für die Stärke der Interaktion und
beschreibt die Menge an Antikörper-Antigen Komplexen im Equilibrium. Entscheidend für dieses
Equilibrium ist die Diffusionsrate (abhängig von Gewebe, Dicke und Einbettung) und die Affinität
(abhängig vom Antikörper).
44
Herstellung von Antikörpern: Als Antigene werden entweder gereinigte Proteine oder synthetisch
hergestellte Peptide verwendet.
Polyklonale Antikörper: Das Antigen wird in ein geeignetes Tier injiziert (Kaninchen, Maus, Ratte,
Ziege, Hamster, Meerschweinchen, Huhn). Durch wiederholte Injektionen („boost“) wird die
Immunreaktion verstärkt. Aus dem entnommenen Blut wird Serum gewonnen. Dieses Serum oder
daraus gereinigte Antikörper werden verwendet (Vor allem IgGs). Bis zu 1mg/ml (=10% der IgGs)
Antigen-spezifische Antikörper sind möglich.
Monoklonale Antikörper: Aus immunisierten Mäusen werden Antikörper-sekretierende Zellen mit
Myelomzellen fusioniert. Die entstehenden Hybridomyzellen werden als einzelne Klone gezüchtet und
die Qualität und Spezifität der monoklonalen Antikörper getestet.
Vorteile: Spezifisch, homogen und unbegrenzte Produktions-Menge.
Nachteil: Aufwendige Herstellung der Hybridomazelllinien.
45